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PRACTICA: CUANTIFICACIN DE PROTENAS,

MTODO DE BIURET.


INTRODUCCIN
Las protenas ocupan un lugar de mxima importancia entre las molculas
constituyentes de los seres vivos (biomolculas). Prcticamente todos los
procesos biolgicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de
molculas (Berg et al, 2008).
Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una
tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una
protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una
preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para
muchos otros propsitos. Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de
protenas. Muchos de estos mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de
las protenas para absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados
qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes
(Segal, 2005).

La reaccin de biuret es una reaccin coloreada (violeta) debida a la formacin
de un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen ms de un
enlace peptidico, como las proteinas (Cambell et al, 2006):

Figura 1: Reaccin de Biuret.
La curva de patrn es un mtodo de qumica analtica empleado para medir la
concentracin de una sustancia en una muestra por comparacin con una serie
de elementos de concentracin conocida. Se basa en la existencia de una
relacin en principio lineal entre un carcter medible (por ejemplo la
absorbancia en los enfoques de espectrofotometra) y la variable a determinar
(la concentracin). Para ello, se efectan diluciones de unas muestras de
contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento
de una funcin matemtica que relacione ambas; despus, se lee el mismo
carcter en la muestra problema y, mediante la sustitucin de la variable
independiente de esa funcin, se obtiene la concentracin de esta. Se dice
pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva
patrn, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la
concentracin (Harris, 2003)

OBJETIVO GENERAL
Aplicar un mtodo colorimtrico para determinar la concentracin de protena
en una muestra problema.
OBJETIVOS PARTICULARES
- Aprender el manejo del espectrofotmetro y su aplicacin en los
mtodos colorimtricos.
- Aprender el empleo de una curva patrn para la determinacin de la
cantidad de molculas presentes en una muestra, en este caso de
protenas.
- Determinar la concentracin de protenas en una muestra de leche,
utilizando el mtodo de Biuret.
HIPTESIS
Si se mide la absorbancia a 540 nm de una muestra coloreada con el reactivo
de Biuret sta ser proporcional a la concentracin de protena de dicha
muestra.


MATERIAL Y MTODO
Primero, se dispuso a tomar la casena y macerar con ayuda de un mortero con
pistilo, despus se peso para ocupar 0.1g para una solucin de 1:10, al no
disolverse bien se le agregaron gotas de hidrxido de sodio hasta llegar a la
homogenacin deseada, tambin se realizo la solucin de leche 0.05ml para una
solucin 1:20 y se disolvieron en agua; Al mismo tiempo se calentaba agua
hasta llegar a una temperatura de 50
0
C a 55
0
C.
A continuacin, se separaron 24 tubos de ensaye en dos grupos de 12 A y B
los seis primeros se utilizaron para obtener la curva patrn y los otros seis
para obtener la curva problema esto en los dos grupos, el tubo 1 se ocup como
blanco, al tubo 2 0.1ml, al 3 0.2ml, al 4 0.4ml, al 5 0.8ml, al 6 1.0ml de albumina
srica bovina (BSA) con concentracin de 10 mg/ml, respectivamente.
En seguida, los tubos 7 con 0.25ml y 8 con 0.5ml de casena, el 9 con 0.25ml y
el 10 con 0.5ml de sobrenadante, el 11 con 0.25 ml y el 12 con 0.5ml de leche
diluida, (todo esto obtenido en la prctica anterior); a todos los tubos se les
agrego Cloruro de Sodio al 0.9% con diferente cantidad de 2.9ml al 2, 2.8ml al
3, 2.6ml al 4, 2.2ml al 5 y 2ml al 6. Para tener una solucin de 3ml y reactivo
de Biuret con la misma cantidad de 3 ml, as logramos una solucin de 6ml, se
homogenizo la solucin por medio de un agitado tipo vortex. (Solamente al tubo
1 se le agregaron 3 ml de reactivo de biuret y 3 ml de NaCl)
Despus de tener todos los tubos con la solucin se colocaron en un vaso de
precipitados de 1000 ml con agua caliente y se dejaron durante 10 minutos
aproximadamente (hasta lograr tonalidades de azul cielo a violeta), al termino
del tiempo se colocaron en agua a temperatura ambiente, hasta lograr que se
enfriara la solucin.
Posteriormente se realizo la cuantificacin de la solucin por medio de un
espectrofotmetro a 540 nm de los tubos A y B, entre cada medicin se
lavaban las celdas; al tener todas las mediciones se dispuso a realizar la curva
obtenida.




RESULTADOS
Los valores de absorbancia obtenidos con el espectrofotmetro a 540 nm para
cada una de las 12 soluciones se muestran a continuacin (solamente se
muestran los tubos A y no los duplicados):

Tabla 1: Valores de absorbancia de cada una de las muestras.

Tubo No. Solucin * Protena (mg)
Absorbancia
a 540 nm
1 3 ml NaCl, 0 Blanco
2 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl 1 0.034
3 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl 2 0.071
4 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl 4 0.142
5 0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl 8 0.277
6 1 ml BSA y 2 ml NaCl 10 0.345
7 0.25 ml casena y 2.75 ml NaCl ? 0.079
8 0.5 ml casena y 2.5 ml NaCl ? 0.198
9 0.25 ml sabrenadante y 2.75 ml NaCl ? 0.221
10 0.5 ml sobrenadantey 2.5 ml NaCl ? 0.240
11 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl ? 0.044
12 0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl ? 0.068
*A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret.


Con los valores de la tabla anterior, tubos dos a seis, se realiz la grfica 1, de
la curva patrn de protena, obtenida por el mtodo de regresin lineal de
mnimos cuadrados; donde las abscisas (x) representan la concentracin en mg
de protena, y las ordenadas (y) los valores de la absorbancia de cada
concentracin.

Figura 2: Curva patrn de protena.


La determinacin de la cantidad de protena en las muestras problema, tubos
siete a doce, se obtuvo con el valor de la absorbancia obtenida por el
espectrofotmetro para cada muestra (tabla 1), mediante la interpolacin de
estos valores en la curva patrn (figura 3) y despejado los valores respectivos
de x de la ecuacin de la recta (y= mx + b) tal como se muestra a continuacin
(tabla 2):

y = 0.0344x + 0.0017
R = 0.9998
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

a

5
4
0

n
m

Proteina (mg)


Figura 3: interpolacin de los valores de absorbancia de las muestras
problemas en la curva patrn.

De acuerdo a la figura anterior, la cantidad aproximada de protena en las
muestras problema, de la siete a la doce, seria: 2.35, 5.7, 6.2, 6.9, 1.05 y 1.9
mg, respectivamente.

La determinacin de la cantidad de protena en las muestras problema
despejando los valores de x de la ecuacin de la recta (y = 0.0344X +0.0017)
quedara:



Tabla 2: determinacin de la cantidad de protena utilizando
la ecuacin de recta.

Tubo No. Absorbancia (y) a 540 nm Protena (mg)
7 0.079 2.218
8 0.198 5.706
9 0.221 6.375
10 0.240 6.927
11 0.044 1.229
12 0.068 1.927

Tomando en cuenta los factores de disolucin, por cada mililitro de muestra se
obtiene la siguiente tabla:

Tabla 3: Concentracin de protena en las muestras problema.

Tubo No. Protena (mg) Factor de disolucin Protena (mg/ml)
7 2.218 4x100 887.2
8 5.706 2x100 1141.2
9 6.375 4x10 225
10 6.927 2x10 138.54
11 1.229 4x20 98.32
12 1.927 2x20 77.08


A continuacin se resumen los resultados finales en la siguiente tabla:
Tabla 4: resultados finales de la concentracin de protena
Tubo
No.
Solucin *
Protena
(mg)
Protena
(mg/ml)
Absorbancia
a 540 nm
1
3 ml NaCl,
0 0 Blanco
2
0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl
1 10 0.034
3
0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl
2 10 0.071
4
0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl
4 10 0.142
5
0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl
8 10 0.277
6
1 ml BSA y 2 ml NaCl
10 10 0.345
7
0.25 ml casena y 2.75 ml NaCl
2.218
887.2
0.079
8
0.5 ml casena y 2.5 ml NaCl
5.706
1141.2
0.198
9
0.25 ml sabrenadante y 2.75 ml NaCl
6.375
225
0.221
10
0.5 ml sobrenadantey 2.5 ml NaCl
6.927
138.54
0.240
11
0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl
1.229
98.32
0.044
12
0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl
1.927
77.08
0.068
*A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret.

DISCUSIN
De acuerdo a los resultados finales (tabla 4) obtenidos en la determinacin de
la concentracin de protena en las muestras de casena, sobrenadante y leche
diluida, que aunque no son los esperados, pues, la concentracin de protenas
tendra que ser mayor en la leche diluida que en el sobrenadante y los valores
de la concentracin de cada muestra problema iguales entre s, no se descarta
este mtodo de cuantificacin de protenas, pero es recomendable utilizar los
materiales de laboratorio correctos para hacer las diluciones y ser precisos,
mas aun exactos, en la medicin de volmenes.
El sobrenadante consiste en una suspensin a la cual se le ha eliminado la mayor
cantidad de protenas contenidas en la leche, por lo que su concentracin de
protena tendra que ser mejor que el de la leche pura.

CONCLUSIN
Efectivamente, aplicando el mtodo Biuret se puede determinar la
concentracin de protena en una o varias muestras problema, que resultan al
interpolar los valores de absorbancia en una curva patrn originada a partir de
concentracin de protena conocida.


BIBLIOGRAFA
Berg, J.M.; John, L.T.; Lubert, S. (2008) Bioqumica. 2 ed. Revert, Barcelona.

Segal, C. (2005) Manual de prcticas de biologa molecular de la clula.
Editorial publidisia.
Cambell, P.N.; Smith, A.d.; Peters, T.J. (2006) Bioqumica ilustrada:
bioqumica y biologa molecular en la era posgenmica. Masson, Espaa.

Harris, D.C. (2003). Quantitative chemical analysis. San Francisco: W.H.
Freeman.

ANEXO (CUESTIONARIO)
1.- describa que es el espectrofotmetro y para que sirve.
Sirve para calcular las concentraciones de las distintas sustancias en funcin
de la absorcin del color. Tcnicas de bioqumica y biologa moleculas.freifelder
David. Editorial reverte.2003

2.- mencione que es un espectro de absorcin y las diferentes longitudes de
onda del espectro.
La espectroscopia de absorcin es la medida de la cantidad de luz absorbida
por un compuesto en funcin de la longitud de onda de la luz. En general, se
irradia una muestra con una fuente de luz y se mide la cantidad de luz
transmitida a varias longitudes de onda, utilizando un detector y registrando el
fenmeno en una grafica. Tcnicas de bioqumica y biologa
moleculas.freifelder David. Editorial reverte.2003
3.- defina con sus propias palabras que es una curva patrn.
Son las medidas conocidas en orden ascendente que sirven de gua para ajustar
una solucin problema.
4.- cuales son las ventajas y las desventajas, de emplear los reactivos de
biuret para cuantificar protenas explique.
Dentro de las ventajas del reactivo de Biuret es que es bastante especfico
para protenas, muestra pocas interferencias y es barato. Y la desventaja es
que es poco sensible.
5.- mencione cual es la razn de que en el mtodo de biuret la absorbancia de
una protena se lea a una longitud de 540 nm.
El color violeta caracterstico se presenta a esa longitud la cual se da por la
coordinacin de un tomo de cobre con cuatro tomos de nitrgeno. El
complejo se basa en la desprotonacin de los grupos amida para formar el
enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre
el metal y los pares de electrones libres de los tomos de oxigeno y de
nitrgeno del pptido. Tcnicas de bioqumica y biologa moleculas.freifelder
David. Editorial reverte.2003

6.- explique si una curva patrn puede ser empleada para cuantificar sustancias
diferentes a las protenas y cual seria la diferencia con estas.

7.- Cul es la finalidad de utilizar un tubo como blanco? Mencione si siempre
se utiliza agua como blanco.
Tomar la medida de la cual parte la curva patrn, no siempre se utiliza agua
como blanco, si no una mezcla concentrada de la sustancia con la cual se esta
trabajando. Tcnicas de bioqumica y biologa moleculas.freifelder David.
Editorial reverte.2003


8.-realice una curva patrn con los datos de absorbancia y protena obtenidos
en una determinacin hipottica:
Se realizo una solucin estndar de albmina (10mg/ml).
Los valores de absorbancia referidos se determinaron por duplicado.
9.-con los datos obtenidos en el ejemplo anterior, determina la ecuacin de la
recta que representa la curva patrn.

10.- basndose en la curva patrn y la ecuacin de la lnea recta, determine la
cantidad de protena en MG/ml de las siguientes muestras, cuyos valores de
absorbancia se indican






11.- elabore una lista de 5 compuestos que se podran cuantificar empleando
una curva patrn, y menciona que importancia tiene determinar la cantidad de
dichos compuestos.

a) inmunoglobulinas. Mal funcionamiento inmunolgico
b) hemoglobina. Una concentracin baja produce anemia.
c) insulina. Una concentracin baja produce diabetes.
d) fibrilinas. La falta de esta produce deformacin en los huesos.
e) seroalbumina. Su falta produce deformaciones.

Bioquimica.berg Jeremy.editorial reverte.2008