UNIVERSIDAD DE COLIMA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS Y AGROPECUARIAS

Biolixiviacin de minerales sulfuro-ferroso en jales:
aislamiento y caracterizacin de cultivos puros y mixtos
de microorganismos involucrados

TESIS


Que para obtener el grado de
Doctor en Ciencias: rea Biotecnologa


Presenta


Argelia Jurez Alcaraz

Asesores: Dr. Jos Gerardo Lpez Aguirre
Dr. Marcos Gustavo Monroy Fernndez


agosto de 2004
I
INDICE


Pgina
ndice de figuras V
ndice de cuadros IX
ndice de plantillas XI
Abstract XVII
Resumen XVIII
I INTRODUCCIN 1
I.1 El problema 3
I.2 Hiptesis 4
I.3 Objetivo general 4
II. ANTECEDENTES 5
2.1 Microorganismos quimiolitotrficos presentes en los procesos de
biolixiviacin 5
2.2 Microorganismos heterotrficos presentes en los procesos de biolixiviacin 9
2.3 Sinergismo en bacterias acidoflcas 12
2.4 Lixiviacin microbiana 13
2.5 Mecanismos de accin bacteriana 15
2.6 Sustratos de energa 16
2.6.1 Pirita (FeS
2
) 16
2.6.2 Hierro 17
2.6.3 Azufre 18
III. MATERIALES Y MTODOS 21
3.1 Localizacin de las determinaciones analticas 21
3.2 Sitio de muestreo 21
3.3 Procesamiento de las muestras de suelo 22
3.4 Procesamiento de las muestras de agua 24
3.5 Proceso de muestras de jales 24
3.5.1 Medicin del contenido de humedad 25
3.6 Determinacin del pH de las muestras 25
3.7 Medios de cultivo para aislamiento de microorganismos en
condiciones de medio mnimo de crecimiento 27
3.7.1 Condiciones y adaptacin de los microorganismos en los sustratos 28
3.7.2 Aislamientos en medios slidos selectivos 30
3.8 Medicin del crecimiento celular 32
II
3.8.1 Cuantificacin de los microorganismos 32
3.9 Caracterizacin de cepas 34
3.10 Bioensayos 35
3.10.1 Determinacin de la actividad de los microorganismos en substrato
estril y no estril 35
3.10.2 Crecimiento de los microorganismos aislados en el substrato con jal y
dos diluyentes en diferentes condiciones 35
3.10.3 Oxidacin del ion Fe (II) a Fe (III) presentes en los jales a travs de los
cultivos puros y mixtos 36
3.10.4 Oxidacin de los minerales sulfurosos presentes en los jales con cultivo
mixto de microorganismos 37
3.10.5 Capacidad oxidativa de la mezcla de microorganismos 38
3.11 Mediciones usadas para determinar la oxidacin de los minerales
sulfurosos 38
3.11.1 Determinacin de la acidez 38
3.11.2 Determinacin del in sulfato 40
3.11.3 Determinacin de Fe (II) y Total 41
3.11.3.1 Medicin del Fe(II) por titulacin 42
3.11.3.2 Medicin del Fe(II) con orto-fenantrolina 43
3.11.3.3 Determinacin del Fe total 45
3.11.4 Determinacin de protenas totales solubles 46
3.12 Observacin microscpica del crecimiento celular de las cepas aisladas 48
3.13 Determinacin de la concentracin de azufre durante la biolixiviacin 48
3.14 Biolixiviacin de los minerales sulfurosos de los jales 49
3.14.1 Condiciones experimentales 49
3.14.2 Diseo experimental 50
lV. RESULTADOS 53
4.1 Sitio de muestreo 53
4.2 Caracterizacin qumica de muestras de suelo 53
4.3 Caracterizacin fsico-qumica de muestras de agua 58
4.4. Determinacin de la humedad de muestras de jales 59
4.5 Caracterizacin qumica de jales 60
4.6 Determinacin del pH de jales y suelo 61
4.7 Aislamiento de microorganismos en condiciones de medio mnimo de
crecimiento 62
4.8 Condiciones y adaptacin de microorganismos al substrato 64
4.8.1 Microorganismos quimiolitotrficos 64
4.8.2 Microorganismos heterotrficos 66
4.9 Caracterizacin fenotpica de cepas aisladas 69
III
4.10 Bioensayos para determinar condiciones en la biolixiviacin de minerales
sulfurosos 93
4.10.1 Actividad de los microorganismos en substrato estril y no estril 93
4.10.2 Condiciones de crecimiento de los microorganismos aislados en el
substrato con jales y diluyente distinto 97
4.10.3 Oxidacin de Fe (II) por cultivos mixtos y puros en presencia de jales 102
4.10.4 Estudio comparativo de la capacidad oxidativa de cultivos puros y
mixtos 104
4.11 Biolixiviacin de jales por comunidades microbianas seleccionadas 108
4.11.1 Descripcin de la evolucin de parmetros indicadores 108
4.11.2 Anlisis estadstico (ANOVA y Prueba de medias deTukey) 113

V. DISCUSION 119

VI CONCLUSIONES 127

VII. LITERATURA CITADA 129

VIII ANEXOS 151

XVII
Bioleaching of sulfur-ferrous minerals in jales: isolation and
characterization of pure and mixed culture of the involved
microorganisms

ABSTRACT

Pure and mixed bacterial cultures were evaluated in vitro, in terms of their
lixiviation capacity of mineral substratum originated from an iron mine at Minatitln,
Colima. A diverse chemiolitotrophic and heterotrophic microbiota was observed in the
acid mine drainage and soil. pH values as low as 1.2 were registered, favoring the
development of acidophilic microorganisms. The physiological characterization of 13
microbial isolates showed that those identified as Thiobacillus sp., Penicillium sp. and
Rhodotorula sp. were predominant and showed the greater oxidation capacity. The
oxidative capacity of this three isolates was measured in mono and mixed cultures.
To evaluate the oxidative rate of the isolates, measures were recorded each five days
during a period of forty days. The evaluated oxidation parameters were: pH, redox
potential, sulfate ion concentration, dissolved Fe (II) and Fe (III), and total microbial
protein and free cells concentration. Three treatments jales was used as an energy
source in all treatments, in the first treatment jale was the only energy source. The
second treatment ferrous sulphate was added, and in the last one ferrous sulphate
and yeast extract were added. The best results for mixed culture were obtained in the
third treatment, where the oxidation rate of sulfur mineral was of 2.0 mg h-1 Fe (II),
compared with 1.5 mg h-1 Fe (III) for the monoculture.
These results contribute to the knowledge on biodiversity of acid mine
drainage, where deposited sulfur minerals are used (and oxidized) by microorganisms
as an energy source. Also, these results increase our understanding on acid
ecosystems. Where the importance of the heterotrophic, acidophilic microbial activity
has been shown, but until now, poorly considered.
XVIII
R E S U M E N

Se evalu el efecto de cultivos puros y mixtos de microorganismos sobre la
biolixiviacin de sustratos minerales con contenidos de sulfuros, procedentes de
depsitos residuales (jales) de una mina de fierro, en Minatitln, Colima. En este
estudio, se encontr una biodiversidad de microorganismos quimiolitotrficos y
heterotrficos acidoflicos, provenientes del DAM (Drenaje cido de Minas), jales y
suelo de la mina. En los sitios bajo estudio, se obtuvieron valores bajos de pH de 1.2,
lo que favorece las condiciones para el desarrollo de los microorganismos
acidoflicos. De acuerdo a la caracterizacin fisiolgica realizada sobre 13 cultivos de
microorganismos acidoflicos, los caracterizados como Thiobacillus sp, Penicillium sp
y Rhodotorula sp fueron los que predominaron y que tuvieron mayor actividad
oxidativa. Para estos tres cultivos de microorganismos, se midi su capacidad
oxidativa; as como para su combinacin, reportada como cultivo mixto. El tiempo
para probar la capacidad y velocidad oxidativa de los microorganismos aislados en
matraces agitados, fue de cuarenta y cinco das con mediciones de los parmetros
indicadores de la reaccin cada cinco das. Los parmetros utilizados como
indicadores de la oxidacin fueron: pH, potencial rdox, acidez, concentracin de
iones sulfato, Fe(II) y Fe(III) disueltos, as como las protenas totales y la
concentracin de microorganismos libres. Para evaluar la capacidad oxidativa de los
distintos cultivos aislados, se utilizaron tres fuentes de energa diferentes, donde los
jales fueron el substrato comn para las tres, usndolo en uno de los tratamientos
como nica fuente de energa. En las dos restantes, adems se adicion sulfato
ferroso como una de las fuentes y sulfato ferroso mas extracto de levadura en la
segunda. Este ltimo substrato como fuente de energa, fue el que mejor result para
los cultivos mixtos. Bajo estas condiciones de fuente de energa, la capacidad y
velocidad de oxidacin de los minerales sulfurosos fue mayor para el cultivo mixto
(2.0 mg.h
-1
Fe(II)) en comparacin a los cultivos puros (1.5 mg.h
-1
).
Estos resultados amplan el conocimiento sobre la biodiversidad que existe en
el drenaje cido de minas, donde son depositados minerales sulfurosos y que son
empleados por los microorganismos durante la oxidacin como fuente de energa.
XIX
Tambin, se aumenta el conocimiento sobre la ecologa y sistemas extremadamente
cidos, donde ha sido demostrada la importancia de la actividad de los
microorganismos hetertrofos acidoflicos, hasta ahora poco valorada en este tipo de
sistemas.
I INTRODUCCION


Desde los aos 40s, fue demostrado que entre los procesos implicados en la
oxidacin de minerales sulfurosos, existen reacciones biolgicas que involucran la
actividad de microorganismos. En particular se ha reconocido a bacterias de la especie
Thiobacillus ferrooxidans, por su habilidad para acelerar la disolucin oxidativa de
minerales sulfurosos presentes en materiales residuales de minas, lo que incrementa la
generacin de acidez producto de la oxidacin de algunos minerales sulfurosos (Colmer
y Hinfle, 1947; Colmer et al., 1950). Este hallazgo ha sido importante no solo para la
economa industrial (con la aplicacin de los procesos de biolixiviacin), sino tambin
para aminorar los efectos del impacto ambiental controlando la actividad de estos
microorganismos (Matschullat et al., 1999). Por lo que, la biotecnologa se considera en
la actualidad, como una alternativa de solucin a problemas que incluyen al impacto
ambiental (Hall, 1998; Deshayes, 1992; Tiedje, 1997).
El ambiente extremadamente cido, puede ser completamente natural. Sin
embargo, la influencia antropognica (directa y/o indirecta) tambin ha influido en el
incremento de la acidez en diferentes ambientes, ocasionado en parte por los residuos
mineros depositados o arrastrados en los medios circundantes. La mayora de los sitios
extremadamente cidos en el mundo, tiene su origen principalmente en la actividad
humana, adems de las minas de carbn y metales. Una variedad de actividades
microbianas genera acidez, esto incluye a la nitrificacin y la formacin y acumulacin de
cidos orgnicos, debido al proceso de fermentacin como producto del metabolismo
aerobio. Sin embargo, el origen del medio ambiente extremadamente cido y aerobio, se
asocia comnmente a la desigual oxidacin microbiana de especies reducidas de azufre
[azufre elemental (S), azufre sulfuro (S
2-
), tiosulfato (S
2
O
3
2-
), etc.)| y de fierro (Fe
2+
)
(Johnson, 1998; Johnson y Halberg, 2003).
El futuro fsico-qumico del ambiente extremadamente cido es importante.
Mientras que la solubilidad de oxianiones metales (tales como el molibdato) tiende a ser
mas bajo en soluciones cidas que en neutrales, los de metales catinicos (tales como
2

aluminio y muchos metales pesados) son generalmente mayores. Debido a que las
concentraciones de metales solubles tienden a ser mucho mayor en las reas vecinas de
pH mayores. Los tipos de metales pesados presentes en algunos ambientes
extremadamente cidos, son dictados por la geoqumica local; una concentracin alta de
los metales se pueden originar directamente en la oxidacin de los minerales sulfurados
o en el desgaste acelerado del mineral, el cul sucede bajo condiciones de extrema
acidez (el aluminio desde el desgaste de los minerales arcillosos). Tambin pueden
encontrarse en medios ambientes extremadamente cidos, elevadas concentraciones de
elementos metaloides solubles, de los cuales el ms importante, desde el punto de vista
ecotoxicolgico, es el arsnico, que se encuentra en varios minerales sulfurados tales
como la arsenopirita (FeAsS) y realgar (AsS) (Tuovinen et al., 1994; Boult et al., 1997;
Bruneel et al., 2003).
La produccin del llamado drenaje cido de minas (DAM) por alteracin meterica
de los residuos de la industria minera, es considerada como uno de los ms grandes
problemas de contaminacin ambiental asociada a las actividades mineras y
metalrgicas (Ferris et al., 1989; Crundwell, 2003). Los procesos qumicos y biolgicos
que se dan en este tipo de medios, pueden ser el detonador de una serie de reacciones
de oxidacin inicialmente especficas del azufre de los minerales sulfurosos, como la
pirita (FeS
2
). La formacin de cido sulfrico, es el producto terminal de estas reacciones
qumicas y biolgicas (Colmer, 1947).
Los componentes biticos de ambientes extremadamente cidos (pH<3) en la
naturaleza, por ejemplo en algunas zonas geotermales, son predominantemente
microbiolgicos, reconocindose hoy en da microorganismos, acidoflicos obligados, que
no son solo generadores de condiciones de acidez, sino tambin son considerados como
una alternativa para remediar ambientes alterados (Tichy et al, 1998). Debe reconocerse
que aun cuando se han aislado arqueas, bacterias, hongos, levaduras, protozoarios y
algas en sitios con residuos mineros (Garca et al, 2001), las bacterias son los
microorganismos predominantes en sitios cidos a extremadamente cidos (Gonzalez-
Toril et al., 2003). Por tanto, la mayora de estas investigaciones se han interesado sobre
bacterias que oxidan el fierro y que favorecen la movilidad (disolucin) de metales txicos
a partir de procesos biolgicos de oxidacin de minerales sulfurosos, lo cual es una de
3

las causas primarias de la contaminacin por DAM (Johnson et al., 1979; Walton y
Jonson, 1992). Debe subrayarse que aunque los microorganismos acidoflicos que
oxidan al azufre y fierro de minerales sulfurosos, con frecuencia se agrupan sobre la base
de su temperatura ptima de crecimiento (Harrison, 1984), sin embargo tambin se han
clasificado por su capacidad de oxidar de manera especfica a las especies de azufre o
de fierro (Rawlings, 1997).
Las cinticas y los mecanismos de la oxidacin microbiana de minerales
sulfurosos, principalmente la pirita, han sido un foco de atencin, desde hace varias
dcadas, debido a la importancia econmica de la biolixiviacin y los daos al medio
ambiente asociados con la alteracin de los minerales ricos en pirita (Tuovinen, 1972;
Rawlings y Silver, 1995; Brierley, 2001).

1.1 EL PROBLEMA

Uno de los efectos es la generacin del DAM en el ambiente, el cual lo ha
propiciado la industria minera. Este, se considera como uno de los ms graves
problemas de contaminacin ambiental, y es atribuido al sector minero de metales
preciosos (Au, Ag), base (Pb, Zn, Cu) y siderrgicos (Fe). Los procesos qumicos y
biolgicos que se dan en los residuos de este tipo de actividades, pueden propiciar que
se desencadene una serie de reacciones de oxidacin de minerales sulfurosos como la
pirita y pirrotita. La formacin de cido y la disolucin de metales txicos, son el producto
generado de estas reacciones qumicas y biolgicas (Rawlings, 1997).
Los microorganismos que habitan estos ambientes de residuos mineros
aprovechan las reacciones de oxidacin de los sulfuros, as como con las reacciones
qumicas de disolucin cida, oxidativas y no oxidativas, aunque para ello entran en
competencia con otros tipos de microorganismos. Difcilmente una sola especie de
microorganismos domina en este tipo de ambientes, por lo que la produccin de las
condiciones contaminantes es generalmente producto de la evolucin en el tiempo y en
el espacio de la abundancia y actividad de distintos tipos de microorganismos (Jerez,
1997; Johnson y Roberto, 1997; Rawlings, 1997).

4

1.2 Hiptesis

La generacin de DAM identificada en los residuos de una operacin minera que
actualmente explota mineralizaciones de xidos de fierro, es producto de la oxidacin de
minerales sulfurosos presentes en los residuos. La biolixiviacin de los minerales
sulfurosos es el principal proceso involucrado en la generacin de DAM, siendo este
proceso ms eficiente en presencia de cultivos mixtos de microorganismos, en
comparacin con cultivos puros aislados de los mismos jales.

1.3 Objetivo General

Evaluar el efecto de cepas microbianas quimiolitotrficas y heterotrficas, aisladas
desde depsitos residuales de minas de hierro, sobre el proceso de disolucin oxidativa
de los minerales sulfurosos presentes en estos jales.
Objetivos especficos.
- Aislar y caracterizar a los microorganismos presentes en depsitos
residuales con alto contenido de pirita, que favorecen el proceso de
disolucin de fierro y de produccin de cido.

- Evaluar el proceso de biolixiviacin del fierro por oxidacin de especies de
minerales sulfurosos, en presencia de cultivos puros y mixtos aislados a
partir de los depsitos residuales.


5

II ANTECEDENTES


El conocimiento de la interaccin de las comunidades microbianas con los
minerales ha favorecido el desarrollo de procesos de biolixiviacin. Se entiende por
biolixiviacin a los procesos que involucran la disolucin de minerales por la accin
directa e indirecta de microorganismos (Dispirito et al., 1983). En estos procesos un
nmero grande de metales que constituyen minerales insolubles, son transformados en
formas solubles como resultado de alguna actividad microbiana (Ingledew, 1982).

2.1 Microorganismos quimiolitotrficos presentes en los procesos de
biolixiviacin

Un detallado modelo de evolucin orgnica, es el enfoque de desarrollo que
enfatizaron Huber y Wachtershuser (1997), Wachtershuser et al. (1998), donde,
propusieron con base en el descubrimiento de ecosistemas de quimioautotrfcos cerca
de sistemas hidrotermales marinos, que la vida inici con nutricin quimioautotrfica
sobre superficies de pirita situadas en medio ambiente volcnico o hidrotermal.
Sobre la superficie de la pirita, podran haberse formado secuencialmente, lpidos,
pptidos y cidos nucleicos con los productos, modificndose las reacciones primarias.
Este proceso de crecimiento y retroalimentacin, ejemplificado en la formacin de lpidos
en las membranas y clulas, caracteriza especialmente el enfoque de desarrollo.
Tambin fue postulado una dinmica interrelacin entre el organismo y el medio
ambiente, con cambios ambientales transitorios (ej: pH y salinidad) induciendo
potencialmente alteraciones a largo plazo en los primeros organismos (Wachtershuser,
1992).
Segn esta teora, la fuente de energa es irreversible y de reaccin altamente
endergnica de FeS y H
2
S para producir FeS
2
(Edwars, 1998). Las reducciones
equivalentes generadas en estas reacciones son usadas para llevar pequeos enlaces
aninicos (ej: glicerato) a travs de una serie compleja de reacciones bioqumicas. Un
reciente enfoque de la teora es la temprana emergencia de una forma ancestral del
6

camino de la A-Co reductiva. Esta coenzima ancestral esta investigada como la inicial
directamente adherida hacia la superficie del mineral pasando de un substrato a otro
(Edwars, 1998).
Las poblaciones microbianas pueden encontrarse en hbitats naturales de
alteracin natural o biolixiviacin industrial, cuando se implica algn proceso de xido-
reduccin y/o de disolucin de metales (Bryant et al., 1983; Harrison, 1984: Norris et al.,
1990 Herbert, 1992; Jhonson y Hallberg, 2003). Las actividades de oxidacin de
compuestos reducidos de azufre y fierro, son las ms conocidas, destacndose por ello a
las especies bacterianas de los gneros Thiobacillus y Leptospirillum (Norris et al., 1990).
Aunque la actividad de estos microorganismos puede ser el centro de las reacciones de
disolucin de metales y de produccin de cido en hbitats naturales, la estimacin de
sus niveles de actividad puede ser un medio de prevencin del resultado de la
biolixiviacin (Norris et al., 1990; Bosecker, 1997; Bosecker, 2001; Hallberg y Jhonson,
2003).
Los jales, minerales sulfurosos presentes en los depsitos residuales de procesos
de extraccin en las minas, pueden contener concentraciones menores a traza de una
gran cantidad de metales, tales como Mn, Cu, Ag, Cd, Cr, Ni, Zn, As y Fe. Estos metales
ocurren en su mayora como sulfuros minerales, como pirita FeS
2
, pirrotita FeS,
arsenopirita FeAsS, calcopirita FeCuS
2
y esfalerita ZnS, por mencionar slo algunos, los
cuales pueden ser lixiviados por procesos qumicos y biolgicos (Rawlings, 2002).
Las bacterias del gnero Thiobacillus son las ms estudiadas en este tpico. Esta
clase de bacterias, pertenecen a la familia Pseudomonadaceae, son Gram negativo,
aerobios (el oxgeno es el receptor final de electrones en la cadena respiratoria),
mesfilos (temperatura ptima de crecimiento 25 a 35C), bacilos cortos no esporulados,
que generalmente se encuentran aislados o en ocasiones en pares. En esta familia de
microorganismos, se reportan tambin bacterias hetertrofas que tienen afinidad por el
fierro y azufre como aceptor de electrones. Tanto en las bacterias quimiolittrofas como
hetertrofas, la aceptacin de electrones, produce molculas de ATP que son
aprovechadas para su metabolismo (Bergeys, 1974; Kelly, 1979).
Las especies del gnero Thiobacillus, toman la energa necesaria para su
crecimiento y desarrollo a partir de la oxidacin de compuestos inorgnicos de hierro y
7

azufre. En cuanto a carbono, lo toman del dixido de carbono que lo utilizan como sillares
de construccin para sus estructuras celulares (Ingledew, 1982). Thiobacillus thiooxidans,
desempea un papel importante en las reacciones de oxidacin del azufre presente en la
pirita durante la biolixiviacin de compuestos sulfurosos procedentes de minas de fierro
(Torma, 1977). La diferencia fundamental entre las dos bacterias T. ferrooxidans y
T.thiooxidans generalmente es reconocida por la inhabilidad de la segunda para oxidar el
hierro ferroso y sulfuros minerales (Torma, 1985 a).
Apel et al., (1980) y Matin et al., (1982), realizaron estudios con los gradientes
durante la oxidacin del ion ferroso y encontraron que, cuando hay un gradiente en el
medio externo de T. ferrooxidans y T. acidophillus, el medio interno de la clula an es
neutro o cercano de la neutralidad. Esto ha sugerido que el gradiente de pH (4.5) podra
ser usado por las bacterias para realizar la fosforilacin oxidativa (Cox et al., 1977). Por
otro lado, los protones estn asociados con la cadena respiratoria que es la responsable
de aportar H
+
y ser consumido en la reaccin de oxidacin (Cox y Brand, 1984).
El sistema de oxidacin del in ferroso en T. ferrooxidans est asociado con el
contenido de lipopolisacridos fuera de la membrana envolvente de la clula (Holts et al.,
1974; Rojas-Chapana y Tributsch, 2001). Esto fue determinado por medio de fijacin
qumica y congelacin a travs de fragmentacin celular (Pereverzev et al.,1981).
Adems, por medio de mecanismos directos de adhesin se midi, la caracterstica
hidrofbica que tiene la pirita con respecto a T, ferrooxidans y T. thiooxidans. En el
trabajo de Ramrez et al., (1997) encontraron mayor capacidad hidrofbica en T.
thiooxidans que T. ferrooxidans. Estos mecanismos, son factores importantes debido a
que se incrementan las posibilidades de adhesin de los microorganismos hacia los
minerales sulfurados.
Por otra parte, Guay y Silver (1975) evidenciaron que T. acidophillus fue capaz de
crecer en ambos medios, hetertrofo y quimioauttrofo. Esta especie se aisl desde un
cultivo de T. ferrooxidans. Tambin Johnson et al., (1992), encontraron bacterias
hetertrofas acidoflicas con capacidad de oxidar el hierro, tales como Sphaerotilus,
Leptothrix spp., ambas hetertrofas obligadas. Las dos modalidades nutricionales en un
mismo hbitat de crecimiento para diferentes microorganismos, garantiza se realicen de
manera armonizada los procesos de oxidacin.
8

Markosyan (1972), aisl de los depsitos de sulfuro a Leptospirillum ferrooxidans.
Mas adelante, Rawlings y Kusano (1994), tambin aislaron y caracterizaron a la especie
T. ferrooxidans y comprobaron su capacidad para oxidar al sulfato ferroso a sulfato
frrico, produciendo suficiente fuente de energa para su crecimiento
Bacterias hetertrofas acidoflicas del gnero Thiobacillus tienen la capacidad de
oxidar y crecer sobre el sulfuro de hidrgeno (Harrison, 1984). Sin embargo, el camino
para producir tetrationato cuando crecen sobre tiosulfato fue caracterstico en bacterias
quimiolittrofas obligadas tales como: Thiobacillus tepidarius, T. neapolitanus, T,
ferrooxidans y T. thiooxidans y especies facultativas como: T. acidophilus y T. aquaesulis
(Kelly et al., 1997).
La adsorcin de las bacterias sobre la superficie de los metales es posible gracias
a la produccin de productos polimricos, que a su vez sirven de medio de transporte
para agentes bioqumicos oxidantes y en particular del ion frrico (Gherket et al., 1998;
Rojas-Chapana and Tributch, 2001). Se reconoce que los sitios de adsorcin preferidos
seran los sitios libres de cationes, los cuales son propensos a la oxidacin de azufre a
travs de los mecanismos de oxidacin va tiosulfato o polisulfuros (Sand et al., 2001).
La caracterstica particular que tienen estos microorganismos es que se adhieren
a la superficie de los minerales sulfurosos para promover la oxidacin del azufre del
sulfuro (Tributsch, 2001). Por ejemplo, ya se ha tenido evidencia, mediante
observaciones al microscopio electrnico de barrido, de la presencia de diferentes
gneros de bacterias sobre la superficie de pirita y marcasita, favoreciendo las bacterias
la aparicin de poros de corrosin producto de la disolucin oxidativa del mineral que se
ve orientada por la estructura cristaloqumica del sulfuro (Edwars et al., 2001).
Por otro lado Merson y Kline (1983), Dispirito et al. (1983), reportaron que las
bacterias que intervienen en los procesos de biolixiviacin como T. ferrooxidans se
pueden adherir a la pirita en pocos minutos. El proceso de adhesin an se est
estudiando, para entender mejor los mecanismos por los cuales se adhieren a los
minerales sulfurosos. Se sabe por ejemplo, que intervienen mecanismos de naturaleza
fisicoqumica de superficie (carga superficial y tensin superficial), pero tambin de
naturaleza microbiolgica (formacin de exopolimeros y la afinidad por las especies
superficiales) (Sand et al., 2001). Sin embargo, en los estudios realizados por Ohmura et
9

al., (1993) demostraron que la adhesin de la bacteria sobre la pirita, disminuy
significativamente cuando aumenta la concentracin del in ferroso.
La oxidacin biolgica directa del sulfuro produce sulfato y cido sulfrico al
oxidarse el azufre de su forma reducida (-2) hasta su forma ms oxidada (+6), de
acuerdo a la reaccin general mencionada en el trabajo de Nordstrom (1982):
+ +
+ + + + H SO Fe O H O FeS
bacterias
2 2
2
7
2
4
2
2 2 2

Este proceso permite tambin, que posteriormente inicie el proceso que involucra
la oxidacin tambin biolgica de los iones Fe (II) a iones Fe (III), de acuerdo a la
reaccin:
O H Fe O H Fe
bacterias
2
3
2
2
2
1
4
1
+ + +
+ + +

El ion frrico [Fe(III)] as generado, es entonces responsable de la oxidacin
qumica tanto de la pirita como de los otros sulfuros (Leduc y Ferrony, 1994):
+ +
+ + + e S 2 Fe 2 Fe FeS
2 3
2

+ + +
+ + + + e S Fe Me Fe MeS
2 2 3
(donde, Me = metal, como Pb, Zn, Cu, Cd, etc.)
Aun cuando los mecanismos de reaccin que controlan la oxidacin de los
sulfuros, no han sido bien determinados, la mayora de los autores coinciden que la
funcin de las bacterias es la de iniciar el proceso de oxidacin del sulfuro, para
posteriormente verse privilegiado un mecanismo qumico de oxidacin va el ion frrico
(Crundwell, 2003., y Rohwerder et al., 2003). Esto es, al inicio se privilegia el mecanismo
directo de oxidacin del sulfuro, donde involucran la presencia y actividad de los
microorganismos catalizadores de la oxidacin de los sulfuros (Silverman, 1967), lo cual
propicia la generacin de DAM en los depsitos de jales de las minas que contienen
minerales sulfurosos, tales como pirita (FeS
2
), pirrotita (FeS), calcopirita (CuFeS
2
) y
arsenopirita (FeAsS).
2.2 Microorganismos heterotrficos presentes en los procesos de
biolixiviacin

La mayora de los ambientes extremadamente cidos contienen relativamente
bajas concentraciones (< 20 mg l
-1
) de carbono orgnico disuelto y por lo tanto los
microorganismos pueden ser clasificados como oligotrficos. La produccin primaria en
10

los sitios en los cuales no recibe luz del sol (ejemplo profundidades abandonadas de
minas) estan basadas exclusivamente sobre tipos de nutricin autotrfico-quimiolitotrfico
y se vincula inexorablemente a la oxidacin de compuestos de azufre reducido y del
hierro ferroso (Johnson, 1998). Se han obtenido por investigaciones continuas
conocimientos importantes dentro del rea de la microbiologa sobre los quimiolitorficos
acidofilicos y se conocen muchos detalles fisiolgicos y bioqumicos de algunos de estos
procariotas. La bacteria ms notable que oxida el azufre y el hierro es Thiobacillus
ferrooxidans (Leduc y Ferroni, 1994).
La mayora de los acidoflicos que oxidan el azufre y el fierro son observados como
autotrficos a travs de su habilidad para asimilar carbono orgnico se ha demostrado
con algunos de estos (ej. Utilizacin de cido frmico por T. ferrooxidans (Pronk et al.,
1991|). Otros procariotas pueden catalizar oxidaciones diferentes al hierro y/o
compuestos de azufre reducido (CsAR) son ya sea mixotrficos o son otro tipo de
heterotrfico obligado. En estos medios ambientes extremadamente cidos que estn
iluminados, la produccin primaria puede estar mediada por medio de acidoflicos
fototrficos. La mayora de estos son microalgas eucariota e incluye formas unicelulares y
filamentosas y diatomeas (Brake et al., 2001).
En las aguas del drenaje de las minas, tambin se han encontrado
microorganismos hetertrofos que tienen la capacidad de oxidar a los minerales de
azufre residual y que resultaron ser eficientes en este proceso (Smith y Hoare, 1977;
Wichlacz y Unz, 1981). Asimismo, Johnson y McGinnes (1991), hallaron bacterias
hetrotrficas acidoflicas que reducen el in frrico a in ferroso. Adems en 1992
(Johnson et al 2001), aislaron y caracterizaron bacterias heterotrficas acidoflicas,
capaces de oxidar el in ferroso y Johnson et al. (2001), demostraron el importante papel
que desempean los cultivos puros y mixtos con microorganismos heterotrofos en la
biolixiviacin, as como la importancia de su biodiversidad (Kennedy y Gewin, 1997;
Konhauser, 1998), por lo que se ha reportado en esos medios ambientes, una
biodiversidad microbiana mesoflica y acidoflica importante para usarlos en los procesos
de biolixiviacin de los minerales sulfurados (Johnson, 1991).
Se han reportado algunos microorganismo mesoflicos, acidoflicos y fototrficos
como Euglena spp., Chlorella spp., Chlamydomonas acidophila, Ulothrix zonata y
11

Klebsormidium fluitans. Sin embargo, Euglena spp., puede crecer en forma heterotrfica
y sin luz y se ha reportado que se encuentra a valores de pH de cero (Mann et al., 1987).
Como tambin, se aislaron algas, en condiciones naturales que tuvieron la capacidad de
absorber uranio (Mann y Fyfe, 1985; Brake et al., 2001) Pueden ser aislados,
microorganismos hetertrofos que viven en medios extremadamente cidos. Estos se
pueden aislar y estar adaptados a basureros y confirmar el alcance mayor o menor del
carbn originado como filtrado o por los productos lticos desde los quimiolitotrficos
acidoflicos. Los acidoflicos hetertrofos incluyen: bacterias, arqueas, hongos levaduras y
protozoarios.
Algunos procariotas hetertrofos acidofilicos tienen un papel directo sobre la oxido
reduccin del fierro (Rimstidt y Vaughan, 2003). Estos incluyen oxidadores del fierro
como Ferromicrobium acidophilus (Johnson y Roberto 1997) los cuales parecen usar la
energa desde la oxidacin del fierro para soportar el crecimiento, y varios
microorganismos parecidos a Acidiphilium los cuales pueden usar el hierro frrico como
aceptor final de electrones. Existen algunas especies de arqueas moderadamente
termoflica como Picrophilus que tienen reportado el pH mas bajo para su crecimiento
(~0.7) de todos los microorganismos arquea conocidos (Schleper et al., 1995).
Tambin se han reportado numerosos eucariotas que habitan en medios ambientes
extremadamente cidos. Las Rhodotorulas spp., son levaduras frecuentemente
encontrada y aisladas desde aguas de drenajes cidos de minas y levaduras que
pertenecen a otros gneros Candidas, Cryptococcus, tambin se han aislado y descrito
(Schleper et al., 1995). Se han aislados hongos filamentosos desde este medio cido tan
hostil considerandose a la mayora como hongos acidoflicos. Algunas especies se han
reportado que viven a pH 0 como Aconitum cylatium, Trichosporon cerebriae y una
especie de Cephalosporium sp (Schleper et al., 1995). Tambin se han encontrado
protozoarios en los medios ambientes relacionados con los lixiviados de drenajes cidos
de minas y se ha reportado que a nivel de laboratorio estos organismos oxidan a los
minerales sulfurados. Estos protozoarios son flagelados como EutreptialBodo spp.,
ciliados como Cinetochilium spp. y amibas como Vzhlkampfia sp. (Johnson, 1998).
El potencial redox del acoplamiento hierro frrico/ferroso (+770 mV a pH 2) implica
que para muchos organismos, el hierro ferroso es su nica fuente de energa (cepas de
12

Leptospirillum ferrooxidans y Thiobacillus ferrooxidans) y el oxgenos es, sobre las bases
termodinmicas, el nico aceptor de electrones factible (Johnson, 1998).| Sin embargo
los microorganismos quimiolitotficos y mixotrficos pueden usar al azufre y como
compuestos de azufre reducido (CSR) como donadores de electrones (Thiobacillus spp.,
Sulfobacillus spp y numerosas arqueobacterias). En terora pueden acoplar su oxidacin
a la reduccin del hierro frrico como lo describieron, Rohwerder et al., (2003):
+ + +
+ + + + H Fe HSO O H Fe S
bacterias
7 6 4 6
2
4 2
3
(314 kJ.mol
-1
a pH 2)

2.3 Sinergismo en bacterias acidoflicas

Las modalidades nutricionales son relevantes en la asociacin de
microorganismos y el sinergismo es una de ellas. Esta asociacin se ha manifestado en
cultivos de bacterias acidoflicas, provenientes de minas con sulfuros. Arkasteyn et al.,
(1980), encontraron este tipo de asociacin con T. ferrooxidans y T. acidophilus, al
beneficiarse el primero por la presencia del segundo cuando se eliminan compuestos
orgnicos como cidos orgnicos y aminocidos.
En pruebas piloto de biolixiviacin en continuo de concentrados ricos en
arsenopirita, realizadas durante ms de un ao, se utilizaron dos cepas aisladas de T.
ferrooxidans y T. thiooxidans (Collinet y Morin, 1990). Por otro lado, Battaglia et al.,
(1994), tambin aislaron dos cepas diferentes de Leptospirillum, las cuales se
encontraron mezcladas con T. ferrooxidans y T. thiooxidans en substratos de pirita
cobaltfera. Tambin, cuando Johnson y Kelson (1983) quisieron aislar Thiobacillus
ferooxidans, se encontraron que en los subcultivos haba microorganismos hetertrofos
acompaantes.
Adems, Bacelar-Nicolau y Johnson (1999), demostraron, que la biolixiviacin de
pirita fue ms significativa con mezclas de bacterias hetertrofas y quimiolittrofas que
oxidan el fierro y azufre que con cultivos puros. Esta asociacin pone en evidencia, una
relacin de sinergismo.
Por otra parte, se ha manifestado sinergismo con Thiobacillus thiooxidans y T.
ferrooxidans, cuando desciende el pH neutro del medio a pH cido, por la oxidacin de
los compuestos ocasionada por la primera e inicia el crecimiento de la segunda bacteria
13

(Takeuchi y Suzuki, 1994). Se ha tratado de aclarar la resistencia que tienen algunas
bacterias hacia la acidez a travs de los estudios realizados por Myriam et al., (1999), con
las bacterias T. ferrooxidans y Sulfolobus acidocaldarius, las cuales tienen un valor
comn de pH 4.2, aunque Sulfolobus es una bacteria termfila extrema. La resistencia de
ambas especies al medio cido, parece ser propiciada por enzimas relacionadas
directamente con el complejo citocromo bc
1
.
Se ha descrito en varias ocasiones que se mejora la oxidacin del mineral cuando
las poblaciones son mixtas. Los co-cultivos de L. ferrooxidans y los oxidadotes de azufre
T.thiooxidans o T. caldos (termfilos moderados) ha mostrado causar mas eficiente la
disolucin de la calcopirita que en los cultivos solos (Norris, 1990). El proceso de
sinergismo, propicia sincrona metablica a las bacterias termofila moderada Sulfobacillus
spp y A ferooxidans que oxidan el azufre. En este caso, cuando los cultivos se
mezclaron, mostraron una oxidacin rpida del hierro ferroso. Adems, sin materiales
orgnicos extraos mejor los niveles de dixido de carbono como tal como lo report
Norris (1990) para cultivos puros. Esto fue explicado a travs de A. ferrooxidans, la cual
tuvo un valor mas bajo en la oxidacin del hierro para inducirle un mecanismos de alta
afinidad y para absorber el dixido de carbono, abasteciendo carbono orgnico fijado
para el mas eficiente oxidador del hierro S. therrmosulfidooxidans, que tuvo una limitada
capacidad para tomar dixido de carbono desde el aire. Esta asociacin de dos o mas
microorganismos acidoflicos ha resultado ser mas eficientes en sus actividades
metablicas complementarias (ejemplo en trminos de formacin de productos) que en
organismos solos.

2.4 Lixiviacin microbiana

Se entiende por lixiviacin a la operacin que consiste en separar sustancias
solubles de compuestos insolubles (Wilderman, 1991). La lixiviacin microbiana o
biolixiviacin de la pirita, es especialmente til en la industria minera para la extraccin de
metales preciosos como el oro y base como el cobre, zinc y cobalto, por lo que se ha
considerado como una alternativa vlida para el desarrollo de los pases (Acevedo et al.,
1993). En este proceso, se forman preferentemente sulfatos durante la oxidacin, lo que
14

facilita separar a las sustancias insolubles que no tienen valor econmico. Los
microorganismos Thiobacillus ferrooxidans, son los ms estudiados en relacin con la
biolixiviacin de concentrados sulfurosos, dado su predominio en este tipo de sistemas,
aunque Leptospirillum ferrooxidans ha demostrado tambin ser particularmente til
(Lundgren y Silver, 1980).
El proceso de biolixiviacin de la pirita ocurre muy rpido, aproximadamente
500,000 veces ms veloz que la lixiviacin qumica por la presencia del oxgeno (Kelly,
1997), lo que hace evidente la eficiencia del proceso, sobre todo cuando participan
ambos microorganismos (Thiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum ferrooxidans) (Pronk
et al., 1991).
La lixiviacin es un proceso til, especialmente para las minas donde se
encuentran los sulfuros de metales base, ya que los sulfatos que se forman ocasionados
por el proceso mencionado, son solubles en agua y los metales pueden recuperarse en
solucin (cobre y cobalto) o bien en forma slida (precipitados de hierro y/o arsnico)
(Wilderman, 1991). La mayor parte de los sulfuros metlicos son oxidados
espontneamente (por la presencia del oxgeno), pero como se mencion arriba, su
velocidad de reaccin es mucho menor que en presencia de los microorganismos.
El proceso de lixiviacin de los metales por oxidacin de minerales con la ayuda
de microorganismos, depende de factores fsicos, qumicos y biolgicos (Bosecker, 1997;
Meruane y Vargas, 2003). Aunque la eficiencia de la reaccin de oxidacin depende de
las condiciones del medio ambiente, tambin es altamente dependiente de la eficiencia
de la actividad microbiana y de la naturaleza cristaloqumica de los minerales portadores
de la fuente de energa (azufre y/o metales). Por ejemplo, de acuerdo al trabajo reportado
por Free et al. (1991), las clulas bacterianas seran adsorbidas sobre la superficie del
mineral, formando un sistema electroqumico en el cual los electrones procedentes de la
superficie catdica del mineral se desplazaran hacia el receptor final de electrones, el
oxgeno atmosfrico.

15

2.5 Mecanismos de accin bacteriana

Los mecanismos de la interaccin bacteriana con la pirita estn sujetos a muchos
debates y controversias, sin embargo, propicia inters en conocerlos tanto por el aspecto
comercial como el relacionado al impacto ambiental. Como se mencion anteriormente,
de manera general se reconocen dos mecanismos generales de reaccin: la oxidacin
directa y la indirecta (Hutchins et al., 1987). El mecanismo de oxidacin directa es
producto de la adhesin de la bacteria al sulfuro, con la reaccin general:
+ +
+ + + + H SO Fe O H O FeS
bacterias
2 2
2
7
2
4
2
2 2 2

Por otra parte, es conocido que la pirita es disuelta por iones frricos, formando
iones ferrosos y que Thiobacillus ferrooxidans cataliza la oxidacin de iones ferrosos
hacia la regeneracin de frricos (mecanismo indirecto). Silverman y Erlich (1964)
propusieron las siguientes reacciones para este mecanismo:
O H Fe O H Fe
bacterias
2
3
2
2
2
1
4
1
+ + +
+ + +

+ + +
+ + + + H SO Fe O H Fe FeS 16 2 15 8 14
2
4
2
2
3
2

Ms adelante, Mustin et al., (1992), mostraron que las capas superficiales de la
pirita pueden ser fuertemente modificadas durante la lixiviacin bacteriana. El ion ferroso
es reducido a in frrico sobre la superficie de la pirita, asumiendo que este proceso es
controlado por la acumulacin de Fe (II) y Fe (III), postulando las siguientes reacciones
qumicas:
+ +
+ + + + e H SO Fe O H FeS 15 16 2 8
2
4
3
2 2

+
+ + e S Fe FeS 2 2
2
2

O H e H O
2 2
2 4 4 + +
+

+ + +
+ + + + H SO Fe O H Fe FeS 16 2 15 8 14
2
4
2
2
3
2

Aun cuando en este sistema se menciona que los otros sulfuros tambin pueden
ser oxidados va un mecanismo directo, por ejemplo a travs de la reaccin general:
) ( 4 2 ) (
2
a
bacteria
s
MeSO O MeS +
16

un metal pesado bivalente (p.e., Pb, Cd, Zn,etc.). En este caso, el mecanismo
indirecto est representado por una disolucin oxidativa va ion frrico (Sand et al., 1995;
Sand et al., 2001):
+ + + +
+ + + + +
2 2
4
2
2
3
8 8 4 8 Fe H SO Me O H Fe MeS
o una disolucin cida no oxidativa va los protones:
S H Me H MeS
2
2
2 + +
+ +

donde el H
2
S se oxida va bacteriana a azufre elemental o sulfato.
La funcin indirecta de las bacterias acidoflicas, es entonces producir de manera
continua sulfato frrico (Fe(SO
4
)
3
) acuoso, el cual es conocido como un agente
fuertemente oxidante (Dutrizak y Mac Donald, 1974).
Por otra parte, Torma y Sakaguchi (1978), encontraron que la relacin directa
entre la tasa de extraccin del metal (dM
2+
/dt) y la solubilidad del sulfuro mineral (K
sp
)
est directamente relacionada, es decir, la tasa de extraccin del metal es ms rpida
cuando el producto de solubilidad del mineral de sulfuro es ms elevado. Esto es:
dM
2+
/dt= K
ps
= k [M
2+
] [S
2-
] donde
dM
2+
/dt =tasa de extraccin del metal
K
ps
= solubilidad del mineral sulfuro es un factor de proporcionalidad.

2.6 Sustratos de energa

2.6.1 Pirita (FeS2)

La pirita es un mineral que posee como frmula qumica FeS
2
, por lo que
tericamente contiene 53.3% de S y 46.7% de Fe; sin embargo, puede contener
concentraciones menores (<1%) a traza (<100ppm) de algunos otros metales, entre los
que destacan Ni, Co, Cu, Zn, Sb, Au y As. La presencia de estos elementos en solucin
slida dentro de la estructura cristaloqumica de la pirita, modifica sus propiedades
semiconductoras, lo que favorece o inhibe sus propiedades de oxidacin. Adems, los
cristales de pirita pueden presentar inclusiones microscpicas a submicroscpicas de
otros sulfuros minerales, tales como calcopirita, galena o arsenopirita, lo cual tambin
puede modificar sus propiedades oxidativas. Debe mencionarse que la pirita es el ms
17

abundante de los sulfuros minerales, presentndose en casi todos los depsitos de
mineralizaciones polimetlicas (Nagaoka et al, 1999).
Es de color amarillo latn con tinte verdoso, brillo metlico y raya color negro
verdoso. La pirita posee un peso molecular de 119.98. Su estructura cristalina es cbica.
Su punto de fusin es de 1171 C, mientras que su temperatura de descomposicin es
<687 C. Su densidad es de 5.0 g cm
-3
con una dureza de 6-6.5 mohr (Lowson, 1982).
De acuerdo a los resultados de Nagaoka et al, (1999), la pirita tiene un valor de potencial
zeta (electrocintico) superior de +28 mv a valores de pH menores de 3.0, un ngulo de
contacto de 83.8 y un cambio de energa libre (AG) de 5.58 erg / cm
2
. El potencial
redox de la pirita en solucin es de 600 a 650 mv/ESH (Fowler y Crundwell, 1998).

2.6.2 Hierro

El hierro y el azufre son nutrientes esenciales para el desarrollo de
microorganismos. No se encuentran fcilmente disponibles en el medio ambiente
terrestre o acutico, por lo que los microorganismos han desarrollado varias estrategias
para adquirirlos. Tambin se protegen as mismo por el efecto txico del potencial de
iones. La mejor estrategia de muchos organismos para adquirir iones, incluye la
produccin y utilizacin de siderforos tales como heme, transferin, lactoferin y la
reduccin del Fe (III) a Fe (II) con el subsiguiente transporte de Fe(II) (Guerinot, 1994).
Valores altos de Fe
3+
/Fe
2+
en efluentes de minas y lixiviados, frecuentemente son
indicativos de actividad biolgica, tal como el mecanismo natural de oxidacin del hierro
en lixiviados o drenajes cidos (pH 1 a 2). La oxidacin del hierro por Thiobacillus
ferrooxidans fue estudiada por Ingledew (1982), Cox y Brand (1984), donde demostraron
que la mitad de las reacciones involucradas en esta oxidacin, estn acopladas en la
cadena del transporte de electrones.
+ +
+ e Fe Fe
bacterias 3 2

O H e H O
2 2
2 4 4 + +
+

O H Fe O H Fe
bacterias
2
3
2
2
2
1
4
1
+ + +
+ + +

18

El crecimiento de T. ferrooxidans bajo condiciones ptimas de pH es de 2.0 y la
actividad de oxidacin del hierro incluye, un rango de condiciones desde el medio
ambiente cido, hasta la pared celular y el periplasma de la clula. Estas condiciones se
realizan a travs de la neutralidad relativa del citosol de la clula, cuando el oxgeno se
ha reducido (Rawlings, 1997).
Desde 1982 a 1986, Ingledew propuso que los electrones son transferidos desde
el exterior de la pared celular va, una capa polinuclear de Fe (III) hacia el periplasma. La
protena con cobre, rusticianina, presenta niveles significativos dentro de la clula (5% del
total de protena), inicialmente lo propuso como el aceptor de electrones primario. Es
poco lo que se ha publicado sobre la composicin de la cadena respiratoria y su
operacin en las especies microbianas como T. ferrooxidans, que oxidan el hierro desde
la lixiviacin de minerales de sulfuro.
Se ha discutido la generacin de energa basada sobre el acoplamiento
quimiosmtico por oxidadores de hierro acidoflicos (Ingledew, 1982; Cox y Brand, 1984).
Existe un gradiente natural de H
+
a travs de la membrana celular como resultado del
crecimiento cido acoplado al medio ambiente con las condiciones naturales presentes
dentro del citosol celular (Cox y Brand, 1984).
En el caso de T. ferrooxidans, la concentracin de H
+
es controlada por el
consumo de protones en la reduccin de oxgeno en la superficie interna de la
membrana, ligado a la oxidacin del hierro. La actividad de la citocromo oxidasa se ha
reportado encontrarse a un lado del periplasma (Kai et al., 1989)

2.6.3 Azufre

Los mecanismos del azufre que se llevan a cabo para ser utilizados como fuente
de energa, son variados. Estos compuestos son usados como donadores de electrones,
para el crecimiento quimiolitotrfico y autotrfico aerobio de las bacterias. La mayora de
las reacciones los llevan hacia los sulfatos (Friedrich, 1998). Con relacin a los sulfuros
metlicos como FeS
2
, MoS
2
y WS
2
son qumicamente atacados por los iones
hexahidratados de hierro (III), generando tiosulfato y azufre elemental, el cual es oxidado
19

hasta H
2
SO
4
. Otros sulfuros metlicos son atacados por iones hierro (III) y por protones
resultando formacin de azufre elemental va polisulfuro como intermediario.
Estas reacciones por lo general son realizadas con T. thiooxidans en los procesos
de biolixiviacin de los sulfuros de metales (Schippers y Sand, 1999). Se acepta que, en
el camino bioqumico de la oxidacin de azufre, generalmente se llevan a cabo
reacciones complejas con la participacin de especies de Thiobacillus, en los
compuestos de azufre (Kelly, 1988b). En los Cuadros 1 y 2 se dan algunas reacciones
donde participa el azufre y sus enzimas respectivas. El sulfito (SO
2-
3
) representa a un
intermediario central. El tiosulfato es convertido hacia sulfito y polisulfuro o azufre. La
reaccin es mediada por la actividad de la enzima rhodanasa en los Thiobacillus
acidoflicos. Se ha demostrado en estas bacterias que la oxidacin del tiosulfato a
tetrationato (S
4
O
2-
6
), fue acoplada hacia la oxidacin fosforilativa (Lundgren et al., 1986).
De acuerdo a Kelly (1988 b; 1989; 1990), no todas las enzimas ni los
componentes del transporte de electrones en los caminos han sido caracterizados y
algunas reacciones quedan en supuestos. En el mismo Cuadro 1, se presentan la mitad
de las reacciones que son frecuentemente usadas como substratos para el crecimiento
de Thiobacillus.

Cuadro 1. Reacciones involucradas en el camino bioqumico de la oxidacin
de compuestos de azufre inorgnico por Thiobacillus (Kelly, 1988 b).
Compuesto Reaccin Enzima
Sulfuro S
2-
+ 3H
2
O SO
3
2-
+6H
+
+6e
-
Sulfito reductasa
Azufre S+O
2
+H
2
O SO
3
2-
+2H
+
Azufre oxigenasa
Sulfito SO
3
2-
+H
2
O O
4
2-
+2H
+
+2e
-
Sulfito: cito c Oxidoreductosa
Adenil Sulfato SO
3
2-
+ AMP APS + 2e
-
APSreductasa
APS +P
i
SO
4
2-
+ ADP ADPsulfurilasa
APS +PP
i

SO
4
2-
+ATP ATPsulfurilasa
Tiosulfato S
2
O
3
2-
+ CN
-

SO
3
2-
+SCN
Tiosulfato- azufre transferasa
(rhodanasa)
2S
2
O
3
2-


S
4
O
6
2-
+2e
-

Tiosulfato cito c
oxidoreductasa
S
2
O
3
2-
+ 2e
-
SO
3
2-
+ S
2-
Tiosulfatoreductasa
Tritionato S
3
O
6
2-
+H
2
O

SO
4
2-
+S
2
O
3
2-
+2H
+
Tiosulfatohidrolasa

20

Cuadro 2. Donadores de electrones en la oxidacin de compuestos de azufre
inorgnico (Kelly,1988 b).
Donador de electrn Reacciones
Sulfuro S
2-
+ 4H
2
O SO
4
2-
+ 8H
+
+8e
-

Azufre S + 4H
2
O SO
4
2-
+ 8H
+
+ 6e
-

Tiosulfato S
2
O
3
2-
+ 5H
2
O 2SO
4
2-
+ 10H
+
+ 8e
-

Tetrationato S
4
O
6
2-
+ 10H
2
O 4SO
4
2-

+ 20H
+
+14e
-

Tritionato S
3
O
6
2-
+ 6H
2
O 3SO
4
2-
+ 12H
+
+8e
-

Pirita FeS
2
+ 8H
2
O 2SO
4
2-
+ Fe
2+
+ 16H
+
+ 14e
-


Fue correlacionada la eficiencia de la lixiviacin con respecto a la actividad de
algunas enzimas clave, relacionadas con el metabolismo de compuestos de azufre. Las
enzimas involucradas fueron: sulfuro oxidasa, tiosulfato oxidasa y rhodanasa (Cwalina et
al., 1988).
Los microorganismos que participan en los ciclos biogeoqumicos, conllevan un
complejo enzimtico para movilizar a los elementos como el azufre. Este funcionamiento
no se realiza de manera independiente, puesto que su interrelacin e interaccin son
importantes, sobre todo en lo que concierne al desempeo microbiolgico involucrado en
estos mecanismos.
Por ejemplo, se demostr que especies de Beggiatoa y Thiovulum estn
adaptadas para reducir el sulfato a sulfuro de hidrgeno (Jorgensen, 1982). Por otro lado,
los resultados de los cultivos puros de bacterias Desulfuromonas en un ambiente con
suficiente sulfuro de hidrgeno tienen la capacidad de reducirlo a sulfato (Pfennig y
Widdel, 1982). Otras especies de bacterias pueden obtener energa para su crecimiento
y mantenimiento de azufre elemental (Brune, 1989).


21

III MATERIALES Y MTODOS
Los mtodos empleados en este trabajo, se reportan grficamente por medio de
un diagrama de flujo en la Fig 1. Ah se observa el tipo de tratamiento, anlisis y/o
experimento que fue realizado para las muestras estudiadas.

3.1 Localizacin de las determinaciones analticas

El trabajo de investigacin y algunas de las determinaciones analticas del
experimento, se realizaron en el Laboratorio de Biotecnologa del Posgrado de la
Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias (FCBA) de la Universidad de Colima
Campus Tecomn, Col. Los anlisis qumicos de soluciones y muestras solidas se
realizaron en el Laboratorio del Consorcio Minero Benito Jurez, Pea Colorada, en
Minatitln, Col.; en el Laboratorio de APASCO en Tecomn, Col. y en el Laboratorio del
Instituto de Metalurgia de la Universidad Autnoma de San Luis Potos en San Luis
Potos, S.L.P.

3.2. Sitio de muestreo

Para desarrollar este trabajo, se realiz el muestreo de la presa de jales en una
mina que procesa y concentra minerales de xidos de hierro. Para el muestreo de suelos,
se seleccionaron los lugares cercanos del espejo de agua de la presa de jales donde se
observaron evidencias de mayor actividad microbiana. Esto se refiere al pH,
conductividad elctrica, olor (por desprendimiento de H
2
S) y color del suelo. Las
muestras de suelo y agua, utilizadas para aislar y caracterizar a los microorganismos
concernientes a este trabajo, se obtuvieron de la misma presa. Se ubic geogrficamente
el lugar donde se tomaron las muestras con un GPS (Sistema de Posicin Geogrfica)
19 21 07 N y 104 04 21 W. Las muestras de agua consistieron en agua cida
recuperada del drenaje principal de la presa, mientras que las muestras slidas
consistieron en muestras de pulpa con alta concentracin de pirita, de jales, sedimentos y
suelo compactados por los mismos jales. En cada punto de muestreo se tom un
volmen de un litro para muestras de agua y aproximadamente un kilogramo para
22

muestras slidas. El muestreo de suelo y agua fue realizado durante los meses de
marzo, mayo y septiembre de 2001. Se eligieron estos meses con la finalidad de
escoger, entre ellos, la temporada de mayor densidad de poblacin microbiana en
funcin de las condiciones climticas del sitio. Las muestras de pirita se obtuvieron de la
misma mina como concentrado de flotacin rico en pirita.
En la Fig 1 se muestra el diagrama de flujo, que indica los procedimientos
metodologicos que se realizaron, desde la toma de las muestras, hasta llegar a medir y
comprobar la capacidad oxidativa de los microorganismos aislados, tanto con los cultivos
puros como con los mixtos.

3.3 Procesamiento de las muestras de suelo

Las muestras de suelo se tomaron en la rivera de la presa de jales hasta una
profundidad de 20 cm, empleando una pala metlica con recubrimiento anticorrosivo, y
se depositaron en botes de plstico de poliuretano, previamente lavados con detergente
libre en fosfatos y enjuage con agua destilada. Las muestras fueron deshidratadas en el
invernadero a 35 2C durante 8 das para evitar la oxidacin de las muestras.
Posteriormente se trituraron con una quebradora de quijadas (Herzog tipo BB-2), fueron
molidas finamente (Herzog HSM-100M) y tamizadas (Tamiz Tall Mont) a 149 m tamao
del dimetro del poro. Enseguida se pasaron por un molino para obtener partculas ms
pequeas (30 y 70m). Finalmente se pasaron a un homogenizador (Willy A Bachofen
AG Maschinenfabrik Utengasse) a 70 rpm durante 30 minutos.
El paso siguiente fue determinar la presencia de minerales en 10 g de muestra
homognea, por medio del Espectrmetro de fluorescencia y rayos X (Fluorescence
Spectrometry PHILIPS PW 2400-X ray). Para su medicin fue trazada la curva de
calibracin de cada uno de los elementos a los que se les estim su concentracin. Los
rangos en porcentaje, que se utilizaron fueron de 0 a 50, para el hierro total; 0 a 40 xido
de slice; xido de aluminio 0 a 30; xido de calcio 0 a 20: xido de magnesio 0 a 10 y
fsforo 0 a 5 (ASTM, 1990).


23































Figura 1. Diagrama de flujo de metodologas y experimentos utilizados en el proyecto

Muestreo de presas
de jales (suelo, agua y jales)
Medicin en el sitio
de parmetros fisicoqumicos
pH
Potencial rdox
Conductividad
Preparacin de muestras
Aguas Suelos Jales
Sin tratamiento
Anlisis Qumicos:
Sulfato,
Fe(II), Fe(III)
Aislamiento de
microorganismos
Acidificado
(HNO
3
2:1)
Anlisis Qumicos:
Metales disueltos
Activacin de los
microorganismos sobre
sustrato estril y no estril
Determinacin de las condiciones
de crecimiento de microorganismos
aislados en jal y dos diluyentes
Medicin de la capacidad de oxidacin
de minerales sulfurosos en jales, con
cultivos puros y mixtos
Comprobacin de la capacidad de
oxidacin de minerales sulfurosos en
jales con cultivos mixtos y puros
Digestin cida
en microondas
Anlisis Qumicos:
Metales
Bioensayos
24

3.4 Procesamiento de las muestras de agua

En el momento de la toma de muestras, se realizaron las determinaciones de de
pH (pH-metro marca Corning modelo 340), Eh (marca Mettler Toledo modelo InLab501
Redox 0-80 C Electrolyte 9811) y conductividad elctrica (marca Orion Modelo 126).
En cada punto se recogieron dos submuestras de agua, se filtraron a 0.45 m y
una de ellas se acidific con HNO3 concentrado (en relacin muestra: acido de 2:1) para
evitar la oxidacin y precipitacin de los elementos a medir. En las submuestras
acidificadas se midi la presencia de Ca, Mg, Na, K, Fe, Al, Si, Mn, Ni y Co empleando un
ICP-AES (Termo Jarrel Ash Atom Scan 25). La medicin del ion SO
4
2-
se realiz por
turbidimetra y el Fe (lI) por el mtodo de o-fenantrolina (Herrera et al., 1989).
Las muestras que precipitaron, fueron digeridas con HCl concentrado en horno de
microondas (CEM-18D). Antes de ser analizadas por el espectrmetro de rayos X (PN
2400 X ray), se procesaron previamente de la siguiente forma: se mantuvieron por 24
horas en un invernadero a 29 1C. Posteriormente, fueron trituradas con un molino de
discos (HERZOG tipo H5M100 H), para pasar a un extractor de polvo (Pulverizar MeDB
y Bico). Se utiliz 10 g de muestra y que fue previamente molida en un molino de balas
(Mini Milli Philips). De esta forma se obtuvo una pastilla que fue colocada en el
espectrmetro para su lectura. Las concentraciones se obtuvieron en porcentajes a
travs de las curvas de calibracin.

3.5 Procesamiento de muestras de jales

Se tom un kilogramo de jales en diferentes puntos de la presa considerando la
cercana o lejana del espejo de agua. Se conservaron en bolsas negras de polietileno,
las ms secas y las ms hmedas en botes sellados hermticamente. Se almacenaron
por 24 horas a 4C en una cmara fra, despus de esto se pusieron a secar en el
invernadero a una temperatura 30 C. Posteriormente se lavaron con agua destilada (5
veces), para volver a secarlas a la misma temperatura durante 8 das. Luego, se
trituraron, molieron y pulverizaron a 30 y 70 m de dimetro (equipo HERZOG).
Posteriormente, se ley el contenido de los minerales presentes.
25

3.5.1 Medicin del contenido de humedad

Se realiz esta determinacin de acuerdo a Morgan (1941). Las muestras se
mantuvieron a 105C durante 48 hrs. hasta obtener un peso constante en las muestras.
En el caso de las muestras de jales, se tomaron 15 muestras (n=15). La humedad
gravimtrica fue el resultado de dividir el peso del agua entre el peso del suelo y
multiplicado por cien.

3.6 Determinacin del pH de las muestras

Se tomaron muestras de suelo (9) y agua (5) en diferentes puntos de la presa de
jales y en 3 diferentes fechas en marzo, mayo y septiembre con el fin de conocer la
evolucin del pH ocasionado por microorganismos en relacin a las diferentes
condiciones climticas. Adems, se realizaron algunas observaciones respecto a la
evolucin de algunas caractersticas superficiales del suelo y agua (Cuadros 3 a 5): por lo
que se ubicaron los muestreos con un GPS para tomar en los mismos puntos en las
diferentes fechas. La determinacin del pH del agua fue directa y la del suelo se realiz a
travs de una relacin de suelo: agua (2: 1).
Cuadro 3 Caractersticas aparentes de las muestras de agua y suelo, obtenidas de
la presa de jales (Minatitln, Col.).
Muestra Caractersticas Aparentes
1 Agua (color rojo)
2 Suelo de la mina (piedra y suelo)
3 Suelo (lodo de color rojo)
4 Suelo (lodo color amarillo)
5 Agua presa de jales (fondo del suelo rojo)
6 Agua presa de jales (precipitados de azufre)
7 Agua presa de jales (color amarilla)
8 Agua presa de jales (color amarilla)
9 Suelo presa de jales(color blanco)
10 Suelo (color crema)
11 Suelo (en montaa de jales)
12 Suelo (color rojo y verde)
13 Suelo (precipitados de suelo de azufre)
14 Suelo de rizoosfera de plantas acuticas
26

Cuadro 4. Caractersticas aparentes de las muestras de agua y suelo, obtenidas de la
presa de jales (Minatitln, Col.).
Muestra Caractersticas Aparentes
1 Agua de color rojo con produccin de burbujas
2 Suelo de la mina (piedra y suelo)
3 Suelo lodo de color rojo, verde y caf con olor H
2
S.
4 Suelo amarillo con caolin.
5 Agua de color rojo
6 Agua de color verde fondo con precipitados de azufre
7 Agua color rojo olor a H
2
S y pica al tocarla
8 Agua de color amarilla.
9 Suelo color blanco.
10 Suelo color blanco.
11 Suelo de la montaa de jales.
12 Suelo color verde con precipitados de azufre pica al tocarla.
13
Suelo color verde con precipitados de azufre y frrico, pica al tocarla, las suelas de zapatos
burbujeaban por el cido
14 Suelo de rizoosfera color rojo y burbujas en el agua.

Cuadro 5. Caractersticas aparentes de las muestras de agua y suelo, obtenidas de la
presa de jales (Minatitln, Col.).
Muestra Caractersticas
1 Agua (color rojo)
2 Suelo de la mina (piedra y suelo)
3 Suelo (lodo de color rojo)
4 Suelo color rojo con olor a H
2
S pica al tocarla.
5 Agua fondo del suelo rojo.
6 Agua de color amarillo hay muchas gramineas y burbujea en la superficie del agua.
7 Agua con precipitados de azufre y frrico
8 Agua color amarilla.
9 Suelo color blanco.
10 Suelo color crema.
11 Suelo de la montaa de los jales.
12 Suelo color rojo y verde y pica al tocarla.
13
Suelo con precipitados de azufre y pica al
tocarla, las suelas de zapatos burbujeaban
14 Suelo de la rizoosfera de plantas acuticas de color rojo y verde.
27

3.7 Medios de cultivo para aislamiento de microorganismos en condiciones de
medio mnimo de crecimiento

Los medios de cultivo que se usaron fueron de Silverman y Lundgren (1959) y de
Johnson (1995), para aislar microorganismos quimiolitotrficos en un medio mnimo de
sales (MMS), con FeSO
4
. 7H
2
O como fuente de energa y con las proporciones en
gramos por litro de las sales que se describen (Cuadro 6): 3.5 (NH
4
) SO
4
; 0.116 KCl;
0.058 K
2
HPO
4
; 0.058 MgSO
4
.H
2
O y 0.00168 Ca(NO
3
)
2
. Esta solucin fue inicialmente
preparada en 420 mL de agua destilada. Se ajust el pH a 2.0 con H
2
SO
4
10N y se
esteriliz en autoclave. Despus de que la solucin se enfri, se combin con 580 mL de
solucin FeSO
4
. 7H
2
O (74.674 g) en agua destilada y filtrada (0.45 m), ajustando el pH
a un valor de 2.0. Cuando se combin la solucin se obtuvo al final una concentracin de
15 g de Fe
2+
por litro (Cuadro 6).



Cuadro 6. Medio de cultivo 9K para microorganismos quimiolitotrficos (Silverman y
Lundgren, 1959).
Solucin A g/L
(NH
4
)
2
SO
4
3.0
KCL 0.1
K
2
HPO
4
0.5
MgSO
4
.7H
2
O 0.5
Ca(NO
3
)
2
0.01
H
2
O destilada 700mL
Solucin B
FeSO
4
.7H
2
O 74.674
H
2
O destilada 300mL
pH 2.0

El crecimiento de los microorganismos tanto quimiolitotrficos como hetertrofos
en medio lquido (para su adaptacin a las condiciones de crecimiento diseadas), se
condujo rutinariamente en tubos de ensaye de 18 X 150 mm y en matraces Erlenmeyer
de 500 mL conteniendo 15 y 300 mL de los medios y se agitaron a 125 y 200 rpm
28

respectivamente (Orbiat Shaker Lab-Line y LabLine Incubator Shaker) por 8 das a 32
2C. Se identific la fase logartmica de crecimiento de los microorganismos para
cosecharlos, lavarlos y suspenderlos en medios frescos con MMS y FeSO
4
para los
quimiolittrofos y MMS ms FeSO
4
y extracto de levadura para los hetertrofos, de
acuerdo a las formulaciones que se mencionan en los Cuadros 6 y 7. En cada uno de los
sets realizados, se verificaron las condiciones de las clulas y de las colonias
correspondientes con los microscopios: estereoscpico y de transmisin. Enseguida,
estos cultivos frescos, fueron utilizados para asegurar su adaptacin a los medios de
cultivo usados como sustratos.
El pH de los medios de cultivo se ajust con H
2
SO
4
10 N. Se esterilizaron por
separado las soluciones A y B. Las soluciones A en autoclave a 15 lbs.pulg
-2
durante 15
minutos y las soluciones B, por medio del filtro millipore de 0.22 m, una vez que la
solucin A descendi a temperatura ambiente, se mezcl con la solucin B.

Cuadro 7. Medio de cultivo para microorganismos heterotrficos (Johnson, 1995)
Solucin A g/L
(NH
4
)
2
SO
4
3.5
KCL 0.116
K
2
HPO
4
0.058
MgSO
4
.7H
2
O 0.058
Ca(NO
3
)
2
0.00168
H
2
O destilada 420mL
Solucin B
FeSO
4
.7H
2
O
Extracto de levadura
10mM
0.02%(p/v)
H
2
O destilada 580mL
pH 2.0

3.7.1 Condiciones y adaptacin de los microorganismos en los sustratos

Los tubos y matraces seleccionados para esta etapa, fueron los que presentaron
intensa turbidez, cambio de color y disminucin del pH comparado con los controles.
Para lograr la adaptacin de los microorganismos que se aislaron en los medios
29

selectivos, se adicion un inculo (1 X 10
3
clulas/mL) a cada una de las muestras
obtenidas de la siguiente manera: a las muestras de suelo de 20 g, que se tomaron en
las cercanas del agua de la presa de jales, as como a las muestras de 10 g de pirita
extrada por flotacin y a las muestras de 20 g de los jales de la presa, se les adicion
200 mL de MMS. Finalmente, a las muestras de 200 mL de agua cida directa del
drenaje de la mina, se evit la adicin MMS. Todas las muestras estuvieron contenidas
en matraces Erlenmeyer de 500 mL. Los matraces se agitaron a 200 rpm durante 36
horas. Enseguida se tom una alcuota de 10 mL de cada matraz para inocularla a un
nuevo set con los mismos contenidos anteriores en fresco. Despus de 36 horas se
renov nuevamente el medio, pero en esta ocasin se les adicion a matraces
independientes FeSO
4
. 7H
2
O; S; S
2
O
3
2-
; o FeSO
4
7H
2
O + extracto de levadura, como
fuente de energa para aislar tanto a los microorganismos quimiolitotrficos como a los
hetertrofos, de acuerdo a su necesidad energtica.
Se ajust el pH a un valor de 2.0 con H
2
SO
4
10 N. Las condiciones de incubacin
que se dieron a los cultivos para propiciar la produccin de biomasa de su desarrollo,
fueron a 30 2 C y 200 rpm (en un agitador orbital con temperatura controlada, Lab-
Line) hasta que el color del medio cambi de verde original hasta el rojo parduzco
caracterstico de la presencia de ion frrico (~ 50 das). Este cplor, es ocasionado por la
oxidacin del Fe(II) en los medios con FeSO
4
. 7H
2
O (Johnson, 1995); o del color azul al
amarillo por la oxidacin del azufre para los casos donde se adicion a los medios que
contuvieron slo azufre como fuente de energa (Germida, 1997).
Se hicieron dos repeticiones de cada muestra. Este proceso se repiti 3 veces,
hasta que se logr mantener a los microorganismos adaptados a las condiciones
establecidas como medio de cultivo, energtico y de crecimiento. Durante este proceso
se midi el pH y conductividad elctrica (CE en mmhos/cm) y la densidad de
microorganismos con la cmara de Neubauer (Lumycite, Proper, Manufactoring Co. Inc.
Long Island, N.Y.) a intervalos de 24 horas. Las mediciones se realizaron para observar
las condiciones de crecimiento de los microorganismos as como su capacidad de
oxidacin al substrato.

30

3.7.2 Aislamientos en medios slidos selectivos

El medio slido equivala al medio en MMS, empleando agarosa como agente
gelificante (Sigma, St. Louis. Mo), descrito por Yates y Colmes (1987). La agarosa Sigma
Tipo II es considerada como un agente gelificante optimo para el crecimiento de
microorganismos quimiolitotrficos y acidfilos, dado que no contiene compuestos
orgnicos en su formulacin y por su resistencia fsica a las condiciones cidas (Dziurla,
1995). Las clulas fueron sembradas en cajas Petri de acuerdo a los procedimientos
modificados de Harrison (1984). Para sembrar a los microorganismos sobre los medios
solidificados, se cosecharon las clulas desde el crecimiento en su fase logartmica, se
lavaron dos veces con una solucin amortiguadora (pH 2.0) y se efectuaron diluciones
seriadas con MMS (libre de FeSO
4
). Se tom de las diluciones 0.1 mL y se adicion a 3.0
mL de agarosa que fue preparada en fresco y mantenida a 55 C.
Posteriormente, se agit en un vortex hasta que descendi la temperatura a 35 C.
Inmediatamente, las clulas se distribuyeron sobre las placas o cajas Petri conteniendo
de 10 a 15 mL del medio slido (agarosa) con la formulacin de Silverman y Lundgren
(1959). Enseguida, se reposaron las placas por 5 a 6 horas para permitir la solidificacin
del medio adicionado. Se incubaron invertidas las placas a 32 2 C durante 8 a 10 das
hasta la visibilidad de las colonias (este procedimiento se realiz para aislar a los
microorganismos quimiolitotrficos).
Para aislar en medio slido a los microorganismos hetertrofos, el procedimiento
fue similar al mencionado arriba, solo que, se emple la formulacin manejada por
Johnson (1995) para especies de Thiobacillus y Sulfolobus. La formulacin empleada es
la que se describe en la tabla 7. Adems, se us agar de soya tripticaseina (AST), agar
sabouraoud con extracto de levadura de acuerdo a Germida (1997), para especies
eucariota como hongos y levaduras.
A la par, una vez adaptadas las cepas de microorganismos a las condiciones del
medio ambiente y al substrato, de los matraces se tomaron 500 L y se sembraron en
los diferentes medios modificados. Despus, se utiliz como medio gelificante agar agar
libre de residuos orgnicos (Merck) o agarosa, ms las sales en las concentraciones de
acuerdo a Silverman y Lundgren, (1959) y se enriquecieron con diferentes fuentes de
31

energa. Estos medios se modificaron de acuerdo a la fuente de energa y consistieron en
lo siguiente:
+ Medio AE: agar agar con extracto de levadura y 0.03 g de azul de bromotimol
(como indicador del cambio del pH);
+ Medio AgT: agarosa y tiosulfato de sodio (5.0 g/L) y azul de bromofenol (0.005g);
+ Medio AF: agar agar y sulfato ferroso (70 g/L) y verde de bromocresol (0.003g);
+ Medio AgF: agarosa mas sulfato ferroso y azul de bromofenol misma proporcin
que se mencion atrs.
La tcnica que se us para su siembra fue la de dispersin con varilla (Gavin y
Cummings, 1989). Las cajas se incubaron a 302 C hasta la aparicin de colonias. La
seleccin de las colonias se hizo de acuerdo a la descripcin mencionada por Silverman
y Ludgren, (1959); Kelly y Trafford et al., (1973); Sand et al., (1992); y Johnson et al.,
(1992) para Thioobacillus ferroxidans, T.thiooxidans y Acidiphilum sp; Leptospirillum
ferooxidans, Sphaerotilus sp, respectivamente. Adems, para seleccionar los
microorganismos hetertrofos, fue de acuerdo a Germida (1997) y de acuerdo a
descripcin de Domsch et al (1993) y Alexopoulos et al., (1996). Una vez seleccionadas
las colonias, se resembraron nuevamente por la misma tcnica de estra y con los
medios selectivos mencionados arriba en cajas Petri, para confirmar la pureza de las
especies elegidas a travs de las colonias caracterizadas.
Los aislamientos fueron purificados por siembras repetidas a partir de una colonia
pura sobre el medio slido para evitar o eliminar, en su caso, cualquier contaminante. A
partir de las colonias seleccionadas se sembr un inculo de ~ 1 X 10
3
clulas/mL en
matraces de 500 mL con 100 mL del medio MMS y con los medios modificados, pero sin
gelificante, para usarlo en medios lquidos. Se incubaron y agitaron los matraces en las
condiciones de adaptacin antes mencionadas. Se realiz por triplicado cada uno de los
tratamientos.
La observacin microscpica se hizo con un microscopio binocular de transmisin
a 100 X y objetivo de inmersin. Tambin se realizaron observaciones con un
microscopio invertido Olympus 70. Las clulas se tieron con una solucin cida con
cido ctrico 0.5 N de cristal violeta y safranina (Fowler et al., 1999). El proceso de
adaptacin y seleccin de las cepas aisladas fue repetido tres veces
32

3.8 Medicin del crecimiento celular

Una vez aisladas, seleccionadas y purificadas las colonias de microorganismos
que crecieron en los medios de cultivo selectivos, fueron monitoreados a intervalos de 24
horas con la finalidad de obtener las curvas de crecimiento. Este proceso se llev a cabo,
con un espectrofotmetro (Spectronic 21D, Milton, Roy, Rochester, NY), de acuerdo al
mtodo usado por Stanbury (1988) y LaCombe y Lueking (1990). Se tom la lectura de la
absorbancia a una longitud de onda de 500 nm (DO
500
). Se tomaron 5 mL de los medios
de cultivo y fueron filtrados a travs de papel filtro Whatman No 42 (dos veces) a vaco
con equipo de Millipore. Este proceso tuvo como finalidad eliminar las partculas
minerales de la solucin. Consecutivamente, de los filtrados se transfiri 1.0 mL a tubos
eppendorf de 1.5 mL.
Enseguida, se centrifug a 11.000 x g durante 10 minutos en una centrfuga
(Eppendorf) y se obtuvo el paquete celular. Despus de la decantacin, se adicion 2.0
mL de solucin amortiguadora de citratos 0.05M a un pH de 2.8, 3.0 y 3.5 para bacterias
y para hongos y levaduras respectivamente. Del cctel de microorganismos, se tom un
volumen de 500 L del medio basal. De la suspensin se determin el blanco usando las
sales base (MMS) como referencia. Todas las determinaciones que se realizaron fueron
por duplicado. La DO
500
de 0.2 correspondi a una densidad de clulas de 10
9
clulas
por mL aproximadamente y la concentracin de protenas totales del cultivo,
correspondi a 53 g/mL. De esta forma se obtuvo el logaritmo del porcentaje de la
tramitancia de la concentracin celular, contra el tiempo transcurrido. Dicha lectura estuvo
sujeta a la curva de calibracin que se realiz previamente. El proceso se repiti dos
veces.

3.8.1 Cuantificacin de los microorganismos

El conteo directo del nmero de clulas totales, se realiz por medio de la cmara
de Neubauer (Lumycite, Propper, Manufacturing Co Inc. Long Islan, NY). Se tomaron
alcuotas desde las muestras a intervalos de tiempo y realizaron diluciones. Los 100 L
de muestra que se tom de cada alcuota, fueron teidos con safranina acidificado con
33

cido ctrico 0.5 N (Fowler et al., 1999), con la finalidad de realizar el contraste en la
clula y diferenciar los precipitados frricos que se formaron por la oxidacin. Por otro
lado, se regener la produccin de biomasa, cuidando el substrato electroqumico a
travs de la medicin del POR (Magnin et al., 1998).
La tcnica para estimar las poblaciones microbianas que se us para las muestras
del suelo fue la del NMP de acuerdo Alexander (1982), parar determinar el nmero de
microorganismos totales. Se emplearon medios selectivos tanto para microorganismos
hetertrofos como para quimiolitotrficos, ya que sta tcnica tambin se pudo usar para
identificar subespecies de microorganismos quimiolitotrficos y heterotrficos, tal como lo
mencionan Southam y Beverdige (1992). Los medios selectivos para esta estimacin
fueron los mencionados para bacterias, levaduras y hongos nativos.
Para cuantificar a los microorganismos hetertrofos que oxidan al azufre as como
al tiosulfato el procedimiento que se us fuel el de Lawrence y Germida (1988). En este
procedimiento se aplic la tcnica del NMP y empleando indicadores reductores para
detectar el cambio de pH cuando se present el vire, ocasionado por la acumulacin de
protones durante el metabolismo de los microorganismos que utilizaron a los elementos
mencionados como fuente de energa.
La tcnica consisti en adicionar una dilucin de 0.1 mL de la muestra del suelo
en tubos de ensaye con tapn de baquelita con capacidad 10 X100 cm a 2.0 mL de caldo
soya tripticaseina (CST) a una concentracin de 1/10. La turbidez se ley como resultado
positivo. Los microorganismos hetertrofos que oxidaron al S y produjeron tiosulfato se
indic por el cambio de color del substrato al reaccionar el indicador azul de bromocresol
debido al cambio del pH.
Se utiliz como medio bsico CST y 1% (v/v) de Flor de Azufre (FA) como fuente
de energa. La suspensin FA es de color crema-amarillo con un contenido de azufre de
50 a 70% p/v, en partculas de 1-2 m de dimetro (Chemical Co. Inc., Houston). Este
lquido se lav dos veces con agua destilada y se esteriliz en autoclave. Se ajust el pH
del medio de 2.0 a 2.5 para adicionarlo a los tubos. Los tubos control que contenan CST
+ FA sin inocular, se incubaron para detectar resultados falsos positivos (como
produccin de tiosulfato desde los componentes o por oxidacin qumica). Los tubos se
34

incubaron en una agitadora rotatoria (130 rpm) para asegurar su crecimiento aerobio a
302 C durante 5 das.
Para el crecimiento de hongos y levaduras se eligi el medio de cultivo selectivo
agar Czapek Dox y agar Saboraud con 1% de extracto de levadura respectivamente el
pH se ajusto de 3.0 a 3.5 (Germida, 1997). Los medios de cultivo usados fueron Difco.
Para la medicin de la produccin de tiosulfato, se us el mtodo colorimtrico por
la produccin de tiocianato frrico de Nor y Tabatabai (1976). El mtodo consisti en
adicionar 2 gotas de KCN 100 mM y despus de 15 minutos se agregaron 4 gotas de
CuCL
2
.2H
2
O 330 mM y 2 gotas de una solucin de Fe (NO3)
3
.9 H
2
O 250mM y HNO
3

3100mM. La formacin de un color caf indic la presencia de tiosulfato y tetrationato.
Cuando se omiti adicionar CuCL
2
2H
2
O, solamente indic la presencia de tetrationato.
Todos los anlisis se realizaron 3 veces. El conteo se llev a cabo de acuerdo a la tabla
de Cochran (1950) para 10 diluciones y 5 tubos por dilucin. La sensibilidad de esta
tcnica fue de aproximadamente 10 g ml
-1
de tiosulfato.
Los tubos que resultaron positivos a las pruebas, se seleccionaron y se utilizaron
para sembrar por estra alcuotas de 500 L, sobre los medios slidos selectivos de la
dilucin respectiva para obtener colonias aisladas nuevamente.

3.9 Caracterizacin de cepas

Las cepas obtenidas a partir de la seleccin sobre los medios selectivos, se
caracterizaron a travs de los siguientes parmetros analticos: 1) crecimiento de hongos,
bacterias, levaduras y actinomicetos en los medios de cultivo selectivos, para el
crecimiento de microorganismos heterotrficos y quimiolitotrficos que se identificaron
por la aparicin de colonias incoloras y pigmentas, as como por la presencia de
precipitados de hidrxido frrico, color caf rojizo respectivamente (Ramsay et al., 1988;
Kelly y Wood, 2000); 2) actividad oxido-reduccin del mineral a travs de la estimacin de
los iones frricos y ferrosos de la solucin; 3) caractersticas morfolgicas de las colonias
sobre medio slido, 4) tincin Gram de las clulas, 5) temperatura, pH y conductividad
elctrica durante el desarrollo de las clulas, 6) cambio de color de acuerdo al indicador
7) desprendimiento de cido sulfhdrico y cido sulfrico , 8) determinacin de protenas
35

totales (Bradford, 1976), y 9) morfologa celular, agrupacin y presencia de esporas y
flagelos.

3.10 Bioensayos

3.10.1 Determinacin de la actividad de los microorganismos en substrato
estril y no estril

Las condiciones de pH, tamao de la partcula del jal, agitacin, temperatura, que
se establecieron para probar la reaccin de los microorganismos hacia el substrato (jal)
estril o no esterilizado, fueron las mismas que se usaron en el ensayo 2, donde se us
1.0 gramo de jal en tubos con tapn de baquelita; la determinacin de Fe(ll) se realiz por
el mtodo de o-fenantrolina y se emplearon 72 horas de incubacin. Las alcuotas para
realizar las lecturas del Fe(ll) se hicieron a las 0, 24, 48, 60 y 72 horas. El proceso de
esterilizacin de los ingredientes de MMS y el jal, se realiz por un lado, en autoclave a
15 lb.pul
-2
durante 10 minutos y por filtracin el SF a travs de un filtro con 0.45 m el
tamao del poro.
Se utilizaron tres tubos por cada medio y se repiti el experimento dos veces. Los
valores expresados en las grficas son los promedios. El substrato que se emple para
las dos pruebas fue el siguiente: EL =extracto de levadura; SF = sulfato ferroso.
- Control o testigo que consisti en jal y MMS
- Cultivo puro en MMS
- Cultivo mixto en MMS
- Cultivo puro en MMS, EL y SF
- Cultivo mixto en MMS, EL y SF

3.10.2 Crecimiento de los microorganismos aislados en el substrato con jal y
dos diluyentes en diferentes condiciones.

El ensayo consisti en probar el crecimiento de los cultivos de microorganismos
puros y mixtos, basados esencialmente en la oxidacin del sulfato ferroso (SF) como
36

fuente de energa presente en 1.0 g de jal (70 m dimetro de partcula) lavado durante
24 horas, utilizando como diluyente 20 mL ya sea agua o con MMS (Medio Mnimos de
Sales). Los tubos con tapn de baquelita de 10X150 cm, se agitaron a 150 rpm durante
36 horas a 30 2 C. Se ajust el pH a 2.0 con H2SO4. 1.0 N.
El inculo de microorganismos fue de 500 L. La concentracin del sulfato ferroso
se midi por el mtodo de dicromatometra o por ortofenantrolina (turbidimetra) de
acuerdo a la concentracin. Las sales del MMS se esterilizaron en autoclave a 15 lb/pul2
y el SF fue filtrado a travs de un filtro millipore con poro de un dimetro de 0.2 m
(Millipore Co. Bedford, MA). Enseguida se mezclaron los substratos que lo requirieron.
Se destinaron tres tubos por cada substrato usado. Adems se repiti dos veces este
ensayo y reportndose las cifras como promedio. Para probar la eficiencia del
crecimiento tanto de los cultivos puros como mixtos, as como las fuentes de energa, se
usaron los substratos siguientes:
Utilizando agua como diluyente:
Muestra No
1 Jal y cultivo mixto
2 Cultivo mixto y (SF) presente en el jal
3 Cultivo mixto, (SF) en el jal y extracto de levadura
6 Cultivo puro, (SF) presente en el jal.
7 Cultivo puro, (SF) presente en el jal y extracto de levadura

Utilizando agua y MMS (Medio Mnimo de Sales) como diluyente:
Muestra No
4 Cultivo mixto y (SF) adicionado
5 Cultivo mixto, (SF) adicionado y extracto de levadura
8 Cultivo puro, (SF) adicionado.
9 Cultivo puro, (SF) adicionado y extracto de levadura

3.10.3 Oxidacin del ion Fe (ll) a Fe(lll) presentes en los jales a travs de los
cultivos puros y mixtos
37

El experimento efectuado en este ensayo, fue con la finalidad de evaluar la
capacidad de oxidar el Fe(ll) a Fe(lll) por los microorganismos aislados y seleccionados.
Para valorar su habilidad en la adaptacin y desarrollo en las condiciones establecidas
del substrato. A matraces Erlenmeyer de 500 mL conteniendo 300 mL de MMS y 40 g/L
de FeSO
4
.7H
2
O |8000 mg/lL de Fe(ll)|, se les agreg 5% de jal (p/v) (previamente lavado,
secado, molido en partculas de 70m de dimetro, homogeneizado y esterilizado en
autoclave). El inculo inicial del cultivo puro fue de 1.0 X 10
3
y la misma cantidad para el
cultivo mixto. Se ajust el pH a 2.0 con H
2
SO
4
1.0 N. Se agitaron los matraces a 200 rpm
en un agitador rotatorio con temperatura controlada a 30 2 C durante 50 das. Las
alcuotas para realizar las mediciones se tomaron cada 5 das. La determinacin del Fe
(ll) se realiz por el mtodo de titulacin con dicromato de potasio valorado 0.1N y 0.01N
(Vogel, 1960) y para medir el (Fe(lll), se obtuvo de la diferencia entre el Fe total menos
Fe(ll). El Fe total se determin por Absorcin Atmica (Perkin Elmer 3110) de acuerdo
ASTM (1992).

3.10.4. Oxidacin de los minerales sulfurosos presentes en los jales con
cultivo mixto de microorganismos

Este experimento se realiz para determinar la actividad oxidativa de los minerales
sulfurosos presentes en los jales y con la intervencin del cultivo mixto de
microorganismos. Las condiciones del medio de crecimiento para el cultivo fue el que a
continuacin se describe: en matraces Erlenmeyer de 500 mL que contenan 300 mL de
una solucin compuesta por MMS, 10 g/L de Fe(ll) que se determin por titulacin con
dicromato de K valorado 0.1N al igual que el Fe(lll) que inici 0.2 mg/L. Se adicion
tambin 0.2% de extracto de levadura (Jonson et al., 2001). Adems, se adicion 5%
(p/v) de jal (previamente lavado, secado, molido quedando partculas de 70 de dimetro
y homogeneizado). El potencial de xido reduccin (POR) tambin se midi con un
electrodo (Mettler Toledo) el cual se registro inicialmente con 400 mV/SCE. El inculo de
microorganismos inicial fue de 1000 clulas /mL. Se ajust el pH del medio a 2.2 con
H
2
SO
4
1.0 N. Los matraces se agitaron a 250 rpm en un agitador rotatorio a 30 1 C
durante 15 das de incubacin.
38

3.10.5. Capacidad oxidativa de la mezcla de microorganismos

Se realiz otro ensayo para comprobar y mantener la capacidad oxidativa que
tuvo la mezcla de microorganismos de acuerdo a los substrato utilizados. El experimento
tuvo un periodo de 45 das de incubacin. Las condiciones de crecimiento como
temperatura, pH y agitacin fueron las mismas que se han mencionado. Los 300 mL del
substrato estuvieron contenidos en matraces Erlenmeyer de 500 mL. El inculo inicial fue
de 1000 clulas /mL. Se utiliz como fuente de energa, ya sea, sulfato ferroso (SF),
extracto de levadura (EL) o jal de la presa. Todos los bioensayos (cinco), estuvieron bajo
un diseo experimental completamente al azar, los datos fueron sometidos a un anlisis
de promedios de tres repeticiones.

3.11 Mediciones usadas para determinar la oxidacin de los minerales
sulfurosos

Se determin la actividad de xido-reduccin por las caractersticas especficas de
los microorganismos durante su crecimiento en los medios de cultivos. Tambin, la
actividad de oxido-reduccin se fue observando de acuerdo a las reacciones qumicas
sobre los substratos en los que se encontraron. Estas se estimaron con las
determinaciones de los parmetros que enseguida se mencionan y que se
correlacionaron con la produccin de biomasa durante el proceso

3.11.1 Determinacin de la acidez

La tcnica usada en esta determinacin se bas en la Norma Oficial Mexicana
NOM-041-SSA1-(1993). De acuerdo con sta acidez, es la capacidad cuantitativa del
agua para reaccionar con los iones hidroxilo a un pH determinado. Para evitar las
interferencias debido a la posible presencia de cloro residual, el cul puede ocasionar la
decoloracin de la fenolftaleina y anaranjado de metilo, se adicion tiosulfato de sodio 0.1
N en una cantidad ligeramente superior al equivalente.
39

Se midi por titulacin con una solucin valorada de NaOH 0.094 2 N libre de CO
2

y una solucin de biftalato de potasio (KHC
8
H
4
O
4
) 0.05N. Se titul un volumen de
muestra que produjo un gasto de la solucin estandarizada de hidrxido de sodio menor
de 25 mL. Se adicion 0.2 mL (equivalente a 5 gotas) de la solucin indicadora de
fenolftalena, y en las muestras sospechosas con presencia de cloro residual se adicion
0,05 mL de solucin de Na
2
S
2
0
3
0,1 N antes de agregar el indicador. Se agit la muestra
en agitador magntico (Vanomag Electronicrher Multipoint HP 6) a 50 rpm. El punto final
de la titulacin se alcanz cuando apareci un ligero color rosa con la adicin de 3 a 4
gotas de fenoftaleina a 5.0 mL de la muestra, a pH de 4,6.
Los clculos se obtuvieron de acuerdo a la siguiente expresin:
Acidez mg de CaCO
3
/L = A x B x 50 000 mL de la muestra
En donde: A = mililitros de la solucin NaOH gastados
B = normalidad de la solucin de NaOH
Para determinar el vire de las muestras del experimento durante la titulacin, se
opt por obtener el punto de equilibrio entre el hidrxido de sodio y el sulfato ferroso, para
lo cual se elabor la curva correspondiente (Fig 2).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 0.5 0.8 1 1.5 1.8 2 2.5 3 3.6 4.1 4.5 5.2 5.5 6 6.6 7
mL NaOH 0.094N
p
H
P.E

Fig. 2. Punto de equilibrio (P.E.) de las soluciones de hidrxido de Fe y sulfato
ferroso para determinar su acidez por el mtodo de titulacin.

Este procedimiento se hizo utilizando al NaOH valorado (0.094 N), como solucin
titulante para la muestra y registrando el pH a los diferentes volmenes del hidrxido. De
40

acuerdo a los resultados obtenidos, el punto de equilibrio se di a los 2.5 mL. Al adicionar
este volumen result el vire. Este procedimiento se realiz tres veces.

3.11.2. Determinacin del in sulfato

La tcnica se fundament en que el in SO
4
2-
est distribuido ampliamente en la
naturaleza y puede estar presente en aguas naturales en concentraciones que varan de
algunos g/L hasta algunos g/L. Las aguas residuales de la industria minera contribuyen
gradualmente en el aumento del SO
4
2-
, debido a la oxidacin de la pirita. Los sulfatos de
sodio y magnesio ejercen una accin catrtica.
El mtodo que se utiliz para esta medicin fue el turbidimtrico de acuerdo a la
ASTM (1999), se bas en la precipitacin del in SO
4
2-
en medio cido con BaCl
2
.2H
2
O
para formar cristales de sulfato de bario en una suspensin, cuya absorbancia es
proporcional a la concentracin del mismo en la solucin. Esta concentracin se
determin por medio del espectrofotmetro y se compar con una curva de calibracin.
Con esta tcnica se pudieron determinar rangos desde 1 hasta 60 mg/L. Las muestras
que rebasaron estas cifras se diluyeron para estar en condiciones de leerlas y se
multiplicaron por el factor de dilucin.
Los reactivos que se usaron fueron cristales de BaCl
2
.2H
2
O de 20 a 30 mallas,
grado analtico. Adems se utiliz la solucin acondicionadora, que consisti en mezclar
50mL de glicerina con una solucin de 30mL de HCl concentrado, 300mL de agua
destilada, 100mL etanol al 95% y 75 g de NaCl. La solucin estndar de sulfatos (SSS)
se prepar con Na
2
SO
4
.anhidro 0.1479 g/L.
Las muestras fueron filtradas cuando se detect turbidez y se mantuvieron a una
temperatura de 30 C. Se tom 1.0 ml de la muestra y se llev a volumen de 100 mL.
Enseguida se pas este volumen a un matraz Erlenmeyer de 250 mL para adicionarle 5.0
mL de la solucin acondicionadora. Se aadi 0.3 g de BaCl
2
y agit por 1 minuto de
manera continua hasta la lectura a velocidad constante. Se midi la absorbancia por un
periodo no mayor de 4 minutos. Para el blanco se utiliz el procedimiento anterior, solo
que se sustituy con agua destilada el volumen de muestra. La lectura se realiz con un
41

espectrofotmetro Spectronic a una longitud de onda de 420nm. En cada determinacin,
el procedimiento se repiti tres veces: (mL de SSS = 0.1 mg de SO
4
-2
)
Clculos: Convertir a mg/L de in sulfato empleando la curva de calibracin (Fig 3).

y = 0.076x + 0.0117
R
2
= 0.9953
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 1 2 3 4 5 6
concentracin (mg/L)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

(
4
2
0
n
m
)

Fig. 3. Curva de calibracin del in sulfato concentracin de 0 hasta 6mg/L

3.11.3 Determinacin de Fe (ll) y Total

Para la valoracin del ion ferroso en solucin se utiliza el mtodo
dicromatomtrico, en el cul, el dicromato de potasio en solucin cida oxida a las sales
ferrosas de acuerdo a la ecuacin siguiente (Vogel, 1960):
Cr
2
O
7
-2
+ 14H
+
+ 6Fe
+2
2Cr
+3
+ 6Fe
+3
+ 7H
2
O
El dicromato de potasio es una sal de alta pureza, lo que permite por pesada
directa preparar soluciones de normalidad conocida sin necesidad de titular
posteriormente. Para su valoracin se utiliza FeSO
4
(NH
4
)
2
SO
4
.6H
2
O, comnmente
llamada sal de Morh. Puesto que una solucin normal de dicromato, resulta ser muy
concentrada para usos volumtricos, se usan soluciones decimonormales, como en la
mayora de los mtodos de oxido-reduccin.
El indicador usado para la titulacin de iones ferrosos con dicromato de potasio,
fue la difenilamina. Con este indicador, se espera un producto de oxidacin color azul o
42

violeta verde. Este color, ser de acuerdo al agente oxidante y su concentracin. En el
caso particular del dicromato de potasio, la coloracin ser violeta.


3.11.3.1. Medicin del Fe (II) por titulacin

Para la determinacin de Fe
+2
se llevaron a cabo dos procedimientos de acuerdo
a la concentracin del sulfato ferroso contenidos en los tratamientos del experimento. Por
titulacin para concentraciones mayores (8.0 ppm) de acuerdo a Vogel (1960) y por
colorimetra, a concentraciones menores (de 0.2 a 8.0 ppm) de acuerdo a Herrera et al
(1989). Para el procedimiento en el caso de cuantificar el in Fe
+2
por titulacin, se
requiri de los siguientes reactivos: K
2
Cr
2
O
7
0.1N; H
2
SO
4
5M; H
3
PO
4
, 85%; y como
indicador dfenilamnina, 1%.
Para determinar la concentracin del in ferroso se tom 5 mL de la muestra y se
trat con 10 gotas de cido fosfrico, 10 gotas de cido sulfrico 5 M y 5 a 10 gotas de
difenilamina como indicador. La titulacin se llev a cabo con dicromato de potasio
valorado (con sulfato ferroso amoniacal 0.1N y 0.01N segn la concentracin de la
muestra). Se tom en consideracin el vire, cuando cambi el color del verde a violeta
oscuro. Cada mililitro de dicromato de potasio reaccion con un equivalente de fierro. Es
decir, 1 mL de K
2
Cr
2
O
7
0.1N es igual a 0.05584 g de Fe
+2
. Se utiliz la equivalencia
calculada del dicromato de potasio de acuerdo a la normalidad empleada. La valoracin
fue la siguiente: 1mL K
2
Cr
2
O
7
0.0993N fue igual a 5584.9 mg Fe
+2
/L por lo que 1mL
K
2
Cr
2
O
7
0.0094N correspondi a 524.9 mg Fe
+2
/L
Finalmente, para calcular la concentracin del in ferroso, se multiplic la cantidad
de mL gastados en la titulacin por el equivalente qumico, y dividido entre los mililitros de
muestra utilizada.
Se tomaron 5 ml de la muestra en un matraz Erlenmeyer de 125 mL y se
adicionaron 5 ml de cido sulfrico, mezclando lentamente. Enseguida, se agreg 5 mL
de cido fosfrico y 5 gotas del indicador, se mezcl lentamente y se procedi a titular
con una solucin valorada de K
2
Cr
2
O
7
al 0.1N.

43

3.11.3.2. Medicin del Fe (II) con orto-fenantrolina

Este procedimiento fue utilizado solamente en los casos donde no se adicion
sulfato ferroso a los tratamientos del experimento. Con esta tcnica se pudo medir la
concentracin del in ferroso debido a que se forma un complejo de Fe (II) con 1,10-
fenantrolina |Fe(C
12
H
8
N
2
)
3
2+
| como se muestra en la Fig 4. Con el espectrofotmetro se
midi la absorbancia de esta solucin colorida, se grafic el espectro para determinar el
mximo de absorcin y se adicion una solucin de hematoxilina como solucin
reductora. Debido a esta mezcla se form un complejo de acuerdo a la siguiente reaccin
(Fig 4):
4Fe
3+
+ 2NH
2
OH 4Fe
2+
+ N
2
O + 4H
+
+ H
2
O

Fig. 4. Formacin del complejo por la reaccin del in ferroso con orto-fenantrolina

Este complejo es de color rojo anaranjado y con el exceso de fenantrolina, se
elimina la interferencia de Cu
2+
y Ni
2+
por reduccin previa de Fe
3+
presente en la
solucin. Para la determinacin, se tom una alcuota de 0.1 mL de muestra diluida hasta
concentraciones de 100 ppm de ferroso. Se adicion 0.1 mL de hidroxilamina, 0.4 mL de
fenantrolina. Enseguida se llev al aforo con agua destilada hasta 2.5 mL. La longitud de
onda que se utiliz fue de 510 nm y se realizaron las lecturas en un espectrofotmetro
(Spectronic 21D, Milton Roy, Rochester NY). Se tom la lectura contra el blanco y se
utilizaron las mismas cantidades y reactivos, en la misma secuencia que se midieron las
muestras, excepto cuando se us agua en lugar de la muestra. Se utilizaron celdas con
un trayecto luminoso de 1 cm. Se diluy la muestra hasta una concentracin de 100 ppm
de ferroso. Se adicion 0.4 mL de solucin de 1,10-fenantrolina y se agit en un vortex.

1,10-fenantrolina

3(1/3Fe
2+
) +
Tris(1,10-
fenantrolina)hierro(II)
44

Se afor a 2.0 mL con agua destilada con agitacin continua y se ley la absorbancia a la
misma longitud de onda
Se implement la curva de calibracin con una solucin patrn de sulfato de
amonio ferroso (NH
4
)
2
Fe(SO
4
)
2
6 H
2
O a la concentracin de 0.1 M (Fig 5). La curva se
realiz por triplicado.

R
2
= 0.9999
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.2 0.67 1.12 1.57 2 2.4 2.9 3.36 3.8 4.25
[Fe2+] (ppm)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

(
5
1
0

n
m
)

Fig. 5. Curva de calibracin del in Fe(ll) realizada para medir la concentracin
por medio del espectrofotmetro con luz visible.

Los clculos se realizaron de la siguiente forma:
B
dilucin A a Absorbanci
Fe

=
+
25
] [
2

Donde: A = intercepto
B = Pendiente;
A y B se determinan por calibracin

3.11.3.3. Determinacin del Fe total

Para la cuantificacin de la concentracin del fierro soluble total en los
tratamientos para medir la lixiviacin de los minerales sulfurosos fueron determinados
45

con el espectrofotmetro de absorcin atmica (Perkin Elmer 3110 Atomic Absortion
Spectrometer).
El mtodo que se us para determinar la concentracin del fierro disuelto y del
fierro recuperable total en las muestras de agua, as como las muestras usadas para
medir la biolixiviacin de los minerales presentes en los jales usados en los tratamientos,
fue el que indica la ASTM (1990).
Este mtodo se aplic para rangos de 0.05 a 5.0 mg/L de fierro. El rango pudo ser
estimado a concentraciones mayores de 5.0 mg/L por medio de diluciones de la muestra.
El fierro disuelto se determin por medio de atomizacin directa de la muestra sin
pre tratamiento. La recuperacin total del fierro fue atomizando la muestra, seguido de
una digestin de cido ntrico y filtracin. Se requiri del espectrofotmetro de absorcin
atmica, con lmpara de ctodo hueco multielemento para fierro y se emple una
longitud de onda de 248.3 nm.
La solucin estandar de fierro consisti en disolver 1.0 g de fierro puro en 100 mL
de HCL (dilucin 1:1) con la ayuda del calentamiento. Enseguida se enfri y diluy en un
1 L con agua destilada (1 mL = 1.0 mg de fierro). La solucin estndar de fierro, se
disolvi 100 mL de la solucin estandar de fierro hasta 1 L con agua destilada la
concentracin final qued 1.0 mL = 0.1 mg de fierro. El combustible que se us fue el
acetileno.
Para la estandarizacin se prepararon 100 mL de cada uno de los blancos y al
menos 4 soluciones estndares para agrupar el rango de concentracin de fierro
esperado de las muestras a ser analizadas, por medio de la dilucin la solucin de fierro
estndar con HNO
3
(1:500). Se midieron los tiempos de cada uno de los estndares de la
prueba para ser ejecutado el anlisis. Se aspir el blanco y el estndar y anot la lectura
que registr el equipo. Se aspir HNO
3
(1:500) entre cada estndar para calibrar el
equipo de manera continua.
Se prepar una curva analtica de absorbancia contra concentracin para cada
uno de los estndares y se calcul el coeficiente de regresin. Se midieron 100 mL de
muestra acidificada bien mezclada dentro de un matraz de 125 mL, se adicionaron 5 mL
de HCL a cada una de las muestras. Se calentaron las muestras sobre un bao de vapor
46

o un plato caliente en una campana bien ventilada hasta que el volumen se redujo de 15
a 20 mL asegurndose de que la muestra no llegara a ebullicin.
Se enfriaron y filtraron las muestras a travs de un filtro de textura fina, (se lav el
cido con papel ceniza) dentro de un matraz volumtrico de 100 mL: se lav el papel filtro
dos o tres veces con agua y ajust el volumen.
Se aspiraron cada uno de los filtrados y a la muestra acidificada se le determin
su absorbancia o concentracin a 248.3 nm. Se aspir con HNO
3
(1:500) entre cada una
de las muestras. Los clculos para la concentracin de fierro total en las muestras se
dieron en miligramos por litro de fierro de acuerdo a la curva que se prepar y el equipo
automticamente emiti las lecturas de acuerdo a la calibracin.
Para la determinacin del ion Fe (lll) se obtuvo de la diferendia del Fe (Total)
menos Fe (ll)

3.11.4. Determinacin de protenas totales solubles

La determinacin de protenas totales solubles que se utiliz fue la propuesta por
Bradford (1976) y se aplic el protocolo 2.3 (Mricosay Procedure Bio Rad Proteine
Assay), con el fin de encontrar la fase logartmica de crecimiento de los microorganismos
y correlacionarla con la produccin de biomasa. En esta fase, los microorganismos son
muy activos y es donde se encuentra la mayor densidad de poblacin necesaria para
reducir el tiempo del proceso de lixiviacin de los minerales sulfurosos. En algunas
ocasiones no se manifestaron las colonias. Se realiz la determinacin independiente de
protenas para bacterias, hongos, levaduras y lo que se consider como actinomiceto.
Para la determinacin de protenas totales, se prepar inicialmente la curva de
calibracin (se repiti tres veces), para medir la concentracin de clulas presentes en los
diferentes tratamientos que se realizaron es este experimento.
Se prepararon cinco diluciones de un estndar de protenas, los cuales fueron
representativos para la prueba de protenas. El rango lineal para el ensayo de la tcnica
se utiliz suero de gama globulina como estndar. Se realizaron curvas con rangos de 5
a 10, 10 a 20 y 20 a 40g de protena por mL. Se tomaron 2,400 L de la muestra en un
tubo de ensaye seco y limpio de13 x 100 mm (por triplicado). Se adicionaron 600 L del
47

reactivo colorante concentrado (Dye Reagent Concentrate) y se agit vigorosamente en
un vortex, se incub por 5 minutos en un cuarto fro. Enseguida se ley en un
espectrofotmetro (Spectronic 21 D, Milton Roy, Rochester N Y), usando una cubeta de
polistreno de 1cm. La absorbancia de las muestras se ley a una longitud de onda de
595nm (DO
595
). El blanco se prepar de la misma forma solo que la muestra se sustituy
con agua desionizada. El valor de la concentracin se obtuvo directamente de la curva de
calibracin y se registraron las medias (Fig 6).
R
2
= 0.9751
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 5 10 15 20 25 30
CONCENTRACION (ug/mL)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

(
5
9
5
n
m
)

Fig. 6. Curva de calibracin realizada para medir la concentracin de las
proteinas totales (Bradford, 1976)

Pendiente = 0.019281113
Ley de Beer A= abc
a = absortividad (mL/g cm)
b = tamao de la celda (cm)
c = concentracin (g/mL)
bc
A
a = donde b = 1cm; pendiente
c
A
=
a= 0.019281113 mL/g cm
ab
A
c =
48

3.12. Observacin microscpica del crecimiento celular de las cepas
aisladas

Para observar el crecimiento celular durante la biolixiviacin, se us un
microscopio binocular de transmisin, con 1000X. La muestra se prepar de la siguiente
manera: se tomaron 25L del cultivo lquido enriquecido con crecimiento bacteriano de
las cepas caracterizadas y se adicionaron 2.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos
0.2 M, sacarosa 0.3 M y EDTA 1 M (Kusano, 1992); se agit dos veces durante 2 min a
3000 rpm. El precipitado se resuspendi en agua destilada y se tom una asada. Se hizo
un frotis que se ti con Gram acidulado con H
2
SO
4
0.01N, donde fue observado el nivel
de crecimiento (Fowler et al., 1999).
Tambin se observ el crecimiento de las colonias por medio de un microscopio
invertido Olympus Ok 70 a 600 X, para describir las caractersticas morfolgicas de las
colonias tpicas de bacterias que se desarrollaron en los medios selectivos
seleccionados. Estos concentrados son los que se observaron durante el experimento de
la biolixiviacin de los minerales sulfurosos presentes en los jales.

3.13. Determinacin de la concentracin de azufre durante la
biolixiviacin

Se determin el porcentaje de azufre y carbono. Las mediciones de estos dos
parmetros, se realizaron con cada una de los tratamientos y en cada intervalo del
tiempo (cada cinco das). Se us un analizador de azufre y carbono (ELTRA CS 2000).
Las muestras se mantuvieron en un horno (Thelco Laboratory Oven Precision Scientific)
a 105 C durante 12 hrs para evitar la humedad. A las muestras se les adicion como
acelerador 1.3 g de hierro finamente molido (Leco for sulfur determination) y 1.7 g de
tugsteno granulado (Sistema analtico Eltra).
El anlisis consisti en fundir la muestra en un horno a 1400C. La combustin y
fusin de los minerales a estas temperaturas, propiciaron el desprendimiento del azufre y
carbono como gas. Este fue captado por medio de una trampa interna, que envi una
seal al detector para ser interpretada por el analizador a travs del software del equipo.
49

La concentracin de los dos elementos fue registrado en el equipo en unidades
porcentuales. Previamente se calibr el equipo y realiz una curva de calibracin con
estndares certificados por ISO (Leco Corporation). El equipo se calibr con los
estndares: Sulfur 0.30 0.02, Sulfur 0.99 0.02 y Sulfur 1.95 0.02, con la finalidad de
que las mediciones estuvieran en alguno de estos rangos. En todos los casos se usaron
controles y se repitieron las mediciones dos y tres veces en algunos casos.
Para cada determinacin en cada perodo de tiempo, se obtuvo el promedio de
tres repeticiones y la desviacin estndar. El equipo se calibr cada 25 a 27 mediciones
con estndares (Holderbank, marca estndar para calibrar el Eltra-2000) 1.68 0.08, 1.69
0.08, 1.68 0.08, intervalo de confianza 0.03/100g. Para las muestras (Leco
Corporation), Sulphur 0.30 0.02, Sulphur 0.99 0.02 y Sulphur 1.95 0.02, tambin se
obtuvo el promedio y la desviacin estndar de cada calibracin.

3.14. Biolixiviacin de los minerales sulfurosos de jales

La descripcin de este mtodo cubre los procedimientos para determinar la
velocidad de biolixiviacin de los minerales sulfurosos presentes en los jales, tales como
la pirita, calcopirita, pirrotita y otros minerales sulfurosos presentes en los jales a travs
de los microorganismos que participaron en el proceso.

3.14.1. Condiciones experimentales

Para probar la actividad oxidativa de los microorganismos nativos por medio del
proceso de biolixiviacin se realizaron experimentos en condiciones definidas por los
resultados obtenidos por los bioensayos. El experimento empez el 4 de enero del 2002
y termin el 18 de febrero del mismo ao. La duracin del experimento fue de 46 das. La
medicin inicial se realiz el mismo da y las siguientes mediciones se realizaron cada
cinco das, es decir, un total de 10 determinaciones por ensayo. Las alcuotas que se
tomaron para realizar las mediciones tuvieron un volumen de 25 mL a cada una de las
muestras. El experimento se dise para analizar 18 tratamientos diferentes con tres
repeticiones cada uno, por lo que se tuvieron 54 matraces en total. Las condiciones
50

generales a las que se acondicionaron fueron las siguientes: Los contenidos se
mantuvieron en matraces Erlenmeyer de 500 mL, 5% de jal que se sec y mantuvo a
0.75 % de humedad (n=15). Se tamiz para obtener partculas de 70 de dimetro y se
adicion 300 mL de medio mnimo de sales (MMS) de acuerdo a Silverman y Ludgren
(1956)
A los tratamientos que contenan sulfato ferroso como fuente de energa, se les
adicion 8056 mg/L del in Fe (ll) y 13, 811 del in sulfato y 0.02% a los tratamientos que
se les adicion extracto de levadura. El pH inicial fue de 2.008, ORP 200mV, y 0.03%
de acidez. Adems, la concentracin de microorganismos para todos los tratamientos
excepto para el testigo fue de 1 x 103 clulas /mL y de protenas totales 0.14 g/L. El
contenido de azufre se encontr en 1050 mg/L. Los matraces se mantuvieron en una
agitadora orbital (a 200 rpm), a una temperatura controlada de 302C respectivamente
Todas las determinaciones se repitieron tres veces.

3.14.2. Diseo experimental

El diseo experimental contempl, 18 tratamientos con tres repeticiones cada uno,
de los cuales se midieron las siguientes variables: fierro total, fierro ferroso, fierro frrico,
pH, nmero de clulas por mL, concentracin del in sulfato, protenas totales y
concentracin de S. El diseo experimental realizado en este trabajo fue tipo factorial
6x3x3 (seis clases de microorganismos, tres medios de cultivo y tres repeticiones). Los
datos se sometieron al anlisis de varianza y prueba de diferenciacin de medias de
Tukey (P<0.05) (Garca et al., 2001) con el programa estadstico SAS (SAS, 1988). Antes
de realizar el experimento final se realizaron tres ensayos de cada medicin en este
mismo diseo, para estandarizar las tcnicas que se aplicaron en el trabajo. Cada
tratamiento tuvo tres repeticiones rotuladas.
En el Cuadro 8, se observa el diseo del experimento. Durante cada experimento
se tomaron 9 alicuotas cada 5 das. El tiempo de muestreo fue determinado con base a
las cinticas de bioensayos reportados por estudios previos realizados en matraces
agitados (Bacelar-Nicolau y Johnson, 1999). Para llegar a este diseo experimental, se
mejoraron las condiciones ptimas de crecimiento de los microorganismos (al eliminar los
51

sustratos nutritivos donde hubo crecimiento limitado y como consecuencia su fuente de
energa), adems, los tiempos de muestreo fueron reducidos (Tonniazo, 1998).

Cuadro 8. Diseo experimental realizado con jales de la Presa de jales (9x3x3=54
matraces)
No. Experimento Simbolo Signififcado
1 TCN1 Testigo, consorcio natural sin fuente de energa
2 TCN2 Testigo, consorcio natural y sulfato ferroso
3 TCN3 Testigo, consorcio natural, sulfato ferroso y extracto de levadura
4 M1 Cultivo mixto sin fuente de energa
5 M2 Cultivo mixto y sulfato ferroso
6 M3 Cultivo mixto, sulfato ferroso y extracto de levadura
7 CP1 Posible Thiobacillus sp. sin fuente de energa
8 CP2 Posible Thiobacillus sp. y sulfato ferroso
9 CP3 Posible Thiobacillus sp., sulfato ferroso y extracto de levadura
10 CP1 Posible Penicillium sp. sin fuente de energa
11 CP2 Posible Penicillium sp. y sulfato ferroso
12 CP3 Posible Penicillium sp., sulfato ferroso y extracto de levadura
13 CP1 Posible Rododotorulla sp. sin fuente de energa
14 CP2 Posible Rododotorulla sp. y sulfato ferroso
15 CP3 Posible Rododotorulla sp., sulfato ferroso y extracto de levadura
16 CMS1 Consorcio de microorganismos seleccionados y sin fuente de energa
17 CMS2 Consorcio de microorganismos seleccionados y sulfato ferroso
18 CMS3 Consorcio de microorganismos seleccionados, sulfato ferroso y extracto de levadura

Las mediciones que se realizaron en el experimento fueron las siguentes:

- pH y ORP por medio de los electrodos correspondientes
- Acidez a travs de titulacin con fenoftaleina
- Sulfatos (SO
4
2-
) por el mtodo espectrofotmetrico
- Ferroso por titulacin con dicromato de potasio y/o por espectrofotometra con
orto-fenantrolina
- Fierro total por medio de absorcin atmica
- Protenas totales por el mtodo de Bradford (1976)
- Conteo de microorganismos con la cmara de Neubauer
- Azufre y carbono a travs del Eltra C S 2000.

52






















53
lV. RESULTADOS
4.1 Sitio de muestreo
En las plantillas 1 a 4, se presentan las fotografas de los lugares donde fueron
tomadas las muestras de jales, suelo y agua, a partir de las cuales fueron aislados
posteriormente los microorganismos en el laboratorio. El material (muestras slidas y
acuosas) colectado fue sustancial para obtener a los microorganismos nativos, trabajo
realizado con el fin de estudiar el proceso de biolixiviacin de los minerales sulfurosos
contenidos en la presa de jales mineros muestreados. En algunas de estas figuras
pueden observarse las evidencias de la actividad microbiana, traducida a travs de la
presencia de precipitados frricos (Plantillas 2 a 4) y de azufre elemental (Fig b Plantilla 2
y Figura a Plantilla 4), ambos productos de la oxidacin de pirita.

4.2 Caracterizacin qumica de muestras de suelo
En el Cuadro 9 se reportan los contenidos qumicos de las muestras de suelo
tomadas en la rivera de la presa de jales. Se observa que existe una diferencia en el
contenido de cada elemento o compuesto analizado por tipo de muestra, pero sobresale
que los dos elementos ms abundantes son hierro y azufre, lo cual sugerira la presencia
de sulfuros de fierro (como pirita FeS
2
o pirrotita FeS), aunque dado que el contenido de
fierro es mayor que el azufre, seguramente tambin existe algun oxido de fierro. Esto se
comprueba en el anlisis mineralgico.
Cuadro 9. Composicin qumica de las muestras de suelo cercano a presas de jales
(Minatitln, Col.)
Elemento
analizado
Contenido
1
por Muestra
1 2 3 4 5 6 7 8 promedio
Fe total (%) 42 6.6 42.3 28.2 15.7 49.0 27.2 22.4 24.45
S total (%) 0.77 27.84 3.02 11.61 33.16 9.8 20.58 20.2 15.87
SiO
2
(%) 29.54 5.63 7.64 15.08 < 14.56 9.75 9.4 13.08
Al
2
O
3
(%) 6.25 1.17 2.20 2.8 < 2.9 3.03 6.4 3.53
CaO (%) 12.54 6.99 5.39 7.82 2.82 1.30 7.49 7.2 6.35
MgO (%) 5.3 7.39 0.07 1.48 5.11 1.87 0.75 0.4 2.79
P total (%) 0.79 0.38 0.004 0.104 0.010 0.131 0.115 0.3 0.19
1
Valores promedio de los resultados de tres repeticiones analticas.

54

55

56

57

58
Caracterizacin fisico-qumica de muestras de agua

El anlisis qumico realizado a las muestras de agua, se reporta en el Cuadro 10.
Durante el periodo de estudio se registraron valores de pH del agua fue bajo (2.1) y
valores de potencial redox entre 150 y 780 mV/ESC. No obstante la mayora de las
aguas fueron fuertemente cidas (pH entre 2.5 y 3.5) y oxidantes (Eh entre 600 y 750
mV/ESC), condiciones caractersticas del DAM. En general, estas muestras de agua se
caracterizaron por la presencia elevada de Fe y SO
4
2-
disueltos, los cuales seguramente
han sido derivados de la oxidacin de minerales sulfurosos; mientras que la disolucin de
Si, Al, Ca y Mg, puede explicarse por la disolucin cida de silicatos minerales tambin
presentes en este tipo de mineralizaciones (Cuadro 10).
Cuadro 10. Composicin qumica de las aguas de las orillas de la presa de jales.
Variable Media
1
DS
1
Min Max
pH 3.03 1.40 2.0 6.9
CE (mS cm
-1
) 3.15 1.25 0.80. 6.51
Eh (mV/ESC) 544 147 140 780
SO
4
2-
(mg.L
-1
) 2602 1458 424 7404
Ca (mg.L
-1
) 352.6 114.1 50.7 602.5
Mg (mg.L
-1
)

140 70.6 14.6 370
Na (mg.L
-1
)

18.2 6.6 4.6 53.2
K (mg.L
-1
)

5.7 2.2 0.7 19.0
Si (mg.L
-1
)

13.2 10.4 1.6 54.0
Al (mg.L
-1
)

43.00 62.01 <0.05 450.00
Fe (mg.L
-1
)

395.50 432.37 <0.01 1592.00
Fe(II) (mg.L
-1
)

327.08 375.75 <0.01 1463.00
Mn (mg.L
-1
)

49.62 30.47 1.30 148.70
Zn (mg.L
-1
)

3.18 2.95 <0.01 17.00
Ni (mg.L
-1
) 2.38 1.42 <0.01 8.60
Co (mg.L
-1
) 2.09 1.24 <0.01 6.60
Cu (mg.L
-1
) 0.33 0.55 <0.01 5.61
Cd (mg.L
-1
) 16.3 22.1 <0.05 141
Pb (mg.L
-1
) 2.8 5.2 <0.05 92.3
1
Valores promedio para las muestras de las tres campaas de muestreo.
En algunos puntos se encontraron concentraciones promedio de 1600 mg/L Fe,
7500 mg/L SO
4
2-
, 450 mg/L Al, 54 mg/L Si, 602 mg/L Ca y 370 mg/L Mg. Como

59
consecuencia de esta concentraciones de iones disueltos, estas aguas presentan valores
elevados de conductividad elctrica (entre 800 y 6500 S/cm), lo que representa una
concentracin de 15 a 20 mayor que las aguas naturales de la zona.
Por otro lado, la concentracin del Fe disuelto en la mayora de las aguas es mas
bajo que lo que puede esperarse suponiendo la relacin molar SO
4
2-
: Fe derivada de la
oxidacin de la pirita (2:1), debido a la rapidez con la que el Fe
2+
es oxidado, hidrolizado y
precipitado (como hidrxidos frricos). Este hecho, se reflej en la intensa formacin de
precipitados frricos que tapizaron gran parte de los fondos de los canales y de la laguna
y coloracin roja del agua, siendo adems confirmado por el valor del potencial rdox,
que refleja el dominio del ion frrico en el sistema.
4.4. Determinacin de la humedad de muestras de jales
Se reportan resultados en el Cuadro 11, del contenido de humedad en muestras
de suelo y jales analizadas, para utilizarlas en el experimento final de biolixiviacin con
diferentes clases de microorganismo, siendo el valor promedio de 0.31%. Esto refleja el
bajo contenido de humedad al momento de muestreo, sin embargo, su contenido es
variable en funcin de la epoca del ao.

Cuadro 11. Contenido de humedad en las muestras de jales.
No. Humedad (%)
1 0.44
2 0.33
3 0.35
4 0.35
5 0.35
6 0.36
7 0.28
8 0.31
9 0.26
10 0.28
11 0.26
12 0.29
13 0.24
14 0.30
15 0.25
Promedio 0.31



60
4.5. Caracterizacin qumica de jales
A continuacin se dan los resultados del anlisis qumico de las muestras de
jales que se tomaron en las diferentes fechas. De acuerdo con estos resultados, en la
muestra J 3 fue donde se encontr la mayor cantidad de azufre, as como de fierro, en
comparacin en el resto de las muestras (J 1 y J 2). Esto hace suponer que la muestra J -3
presenta el mayor contenido de sulfuros de fierro. Con respecto a la muestra J 4 fue la de
mayor contenido de fierro pero con una mnima cantidad de azufre, lo cual hace suponer
la mayor abundancia de xidos de Fe en comparacin a los sulfuros de Fe (Cuadro 12).
Estos resultados fueron determinantes para seleccionar las muestras a las cuales, fueron
tratadas posteriormente para aislar a los microorganismos que se usaron en este
experimento. Adems, se apoy elegir la muestra con los datos provenientes de los
resultados del anlisis de los parmetros fsico qumicos que se dan enseguida.
Cuadro 12. Concentracin de los elementos y xidos mayores presentes en los jales
Muestras

P
(%)
S
(%)
Fe
(%)
Al
2
O
3

(%)
CaO
(%)
MgO
(%)
SiO
2

(%)
J -1 0.13 6.94 26.26 4.915 5.186 1.339 17.064
J -2 0.158 5.649 25.56 5.361 5.83 1.663 18.549
J -3 <l.d. 29.877 54.36 0.255 0.133 0.122 0.315
J -4 0.0285 0.003 66.65 0.98 0.655 0.40 2.25
Se midi con 10.0 g de muestra jales. Los valores son el resultado del promedio de tres repeticiones

Adems fue analizada una muestra compsito de jales por metales y oxidos
mayores, con el fin de identificar la presencia de metales potencialmente txicos al
ambiente en los jales (Cuadro 13). Se aprecia que esta muestra contiene
concentraciones cercanas o menores de 100 mg/Kg de Cr, Ni, As, Se y Pb, elementos
txicos considerados en la Norma Oficial Mexicana que controla a los residuos
industriales (NOM-052-ECOL/1993). Sin embargo, se desconoce sobre su potencial
movilidad sobre las condiciones de exposicin al ambiente. Para determinar esto, se
requiere realizar una prueba con el procedimiento establecido por la NOM-053-
ECOL/1993.


61
Cuadro 13. Concentracin de metales potencialmente txicos al ambiente y xidos
mayores, presentes en una muestra compsito de jales.
SiO
2

(%)
Fe
(%)
Al
2
O
3

(%)
CaO
(%)
MgO
(%)
K
2
O
(%)
Na
2
O
(%)
36.4 20.0 9.74 6.4 1.67 1.2 6.4
Cu
(ppm)
Pb
(ppm)
Zn
(ppm)
Cr
(ppm)
Ni
(ppm)
As
(ppm)
Se
(ppm)
493 18 63 29 103 21 7

4.6. Determinacin del pH de jales y suelos
Los resultados de las determinaciones del pH de las muestras de suelo y jales, realizadas
en tres fechas diferentes, se reportan en el Cuadro 14. En esta tabla se comparan los
valores obtenidos del pH de pasta de suelos y jales con el pH medido directamente en el
agua del espejo de las presas de jales, o bien, en escurrimientos derivados de los
mismos jales.
Cuadro 14. Resultado de la apariencia y el pH de las muestras en tres fechas
diferente tomadas de la presa de jales, Minatitln, Col.
Muestras
pH por muestreo
08-Marzo-
2000
18-Mayo-
2000
13-Sept.-
2000
Agua (color rojo) 5.9 2.3 2.4
Agua presa de jales (precipitados de azufre) 2.0 2.5 1.6
Agua presa de jales (color amarilla) 3.5 2.0 2.1
Agua presa de jales (color amarilla) 3.8 1.2 4.0
Agua presa de jales (fondo del suelo rojo) 3.8 5.7 1.5
Suelo de la mina (piedra y suelo) 6.8 6.7 6.8
Suelo (lodo de color rojo) 4.0 2.0 2.5
Suelo (lodo color amarillo) 4.2 2.4 2.5
Suelo presa de jales(color blanco) 7.0 3.0 5.1
Suelo (color crema) 6.5 3.1 3.4
Suelo (en montaa de jales) 6.8 6.9 6.9
Suelo (color rojo y verde) 2.0 1.2 2.0
Suelo (precipitados de suelo de azufre) 1.9 1.2 1.5
Suelo de rizosfera de plantas acuticas 6.0- 5.7 5.6
Los valores son el resultado de los promedios de tres repeticiones


62
Durante los meses de mayo y septiembre se obtuvieron los valores de pH ms bajos,
tanto en suelos y jales, como en muestras de agua, seguramente por la combinacin de
dos efectos: (i) la mayor temperatura promedio; y (ii) el incremento de la precipitacin
pluvial, que provoca el lavado de los iones H
+
disueltos en la interfase mineral.
Otras muestras presentaron precipitaciones verdes y con fuerte olor a H
2
S, las cuales
tambin tuvieron pH menor de 2.0. Las muestras que tuvieron los valores de pH ms
cidos, presentaron caractersticas particulares, especialmente las del suelo. Estas
contenan precipitados de azufre elemental y oxidrxidos frricos.
Adems, se observ escasa vegetacin en las zonas aledaas a la presa,
compuesta de algunos bejucos y carrizos son los que tambin se destacaron. Se tom
pH de la rizoosfera de estas plantas y result con los valores de 6.0, 5.7 y 5.59 en marzo,
mayo y septiembre, respectivamente.
4.7. Aislamiento de microorganismos en condiciones de medio mnimo de
crecimiento
Los medios de cultivo que se destinaron para el crecimiento de microorganismos
en diferentes muestras, sean quimiolitotrficos o heterotrficos, se adaptaron a la fuente
de energa de la que se compuso el medio de cultivo especfico. En el caso de los
quimiolitotrficos, se utilizaron compuestos reducidos de fierro y azufre, mientras que en
el caso de los hetertrofos se adicionaron fuentes de carbono, como extracto de levadura
y otros medios de cultivo con compuestos orgnicos (Czapeck y Saboraud). La
apariencia del medio de cultivo fue un indicador del crecimiento de los microorganismos,
a travs de la turbidez manifestada, comparada con el testigo y por otro lado, el cambio
de color del medio, ocasionado por la presencia del Fe(lll) debido a la oxidacin del
sulfato ferroso. Adems, la disminucin del pH durante la prueba, fue otro factor
complementario para detectar el desarrollo y actividad de los microorganismos. Se pudo
detectar tambin que de diferentes muestras que se usaron para probar la asimilacin del
ferroso, no todas resultaron exitosas en esta funcin. Los resultados de esta comparacin
se reportan en el Cuadro 15.

63
En las muestras marcadas con los nmeros 2, 7 y 10, expresaron una tendencia
similar en la disminucin del Fe(ll) hasta llegar a cifras cercanas acero, en un perodo de
10 horas. La muestra 1 no mostr una disminucin significativa en la concentracin de
Fe(II) con respecto a la concentracin inicial. El resto de las muestras tuvieron una
tendencia variable en la disminucin de Fe(II) en el rango de 30 a 65% de disminucin.
Por ello, se eligieron las primeras muestras mencionadas para iniciar el proceso de
adaptacin y aislamiento de microorganismos, dada su mayor capacidad de oxidacin
del ion ferroso. Debe mencionarse que la oxidacin qumica del Fe(II) sera mnima en
estas condiciones y en estos perodos de tiempo, por lo que su oxidacin se atribuye a la
oxidacin biolgica.
Cuadro 15 Evolucin de la concentracin de ion ferroso en pruebas con muestras de
suelo y agua para determinar la capacidad oxidativa de microorganismos
quimiolitotrficos
No. muestra
Tiempo de incubacin (horas)
2 4 6 8 10
1 14.8 14.0 14.6 14.6 14.0
2 14.4 5.3 3.0 0.0 0.0
3 14.8 9.2 9.3 9.0 8.5
4 14.6 9.8 8.3 8.0 5.0
5 14.4 10.2 10.0 7.0 6.7
6 14.4 12.3 12.0 11.2 10.9
7 14.0 6.0 4.3 3.0 0.2
8 14.4 11.0 9.0 6.0 5.0
9 14.4 10.0 10.0 10.0 10.0
10 14.4 9.0 8.3 5.0 2.0


Con relacin a las muestras que adems de sulfato ferroso se les adicion
extracto de levadura, se tuvo una actividad parecida a las anteriores, esto es una
disminucin en la concentracin conforme se incrementa el tiempo de prueba. Por lo que,
tambin se manifest una tendencia al consumo y seguramente oxidacin del Fe(ll), pero
no en la misma proporcin ni en las mismas muestras. Bajo estas condiciones, hubo una
mayor disminuacin para las muestras 1, 5, 6 y 9 (Cuadro 16). Por el contrario, las
muestras 2, 3, 4, 7 y 10 manifestaron tener menor aceptacin del in Fe (ll) como fuente
de energa, en presencia del extracto de levadura. En las figuras de la Plantilla 5, se

64
presentan fotografas de la apariencia de las pulpas al trmino de las pruebas, donde se
observa la produccin de ion frrico (por su coloracin rojiza).
Cuadro 16. Evolucin de la concentracin de ion ferroso en pruebas con muestras de
suelo y agua para determinar la capacidad oxidativa de microorganismos
heterotrficos
No.
muestra
Tiempo de incubacin (horas)
2 4 6 8 10 12
1 17.2 15.3 13.2 11 7.8 5
2 17.8 16.9 15 13.8 13 13
3 17.7 17 16.1 15 14.6 13.4
4 17.4 16 16.2 16 15.9 15.7
5 17.6 10.2 9.2 8.1 6.7 4.1
6 17.8 10.7 8.1 5.3 2.3 0.9
7 17.5 16 16 15.4 14.1 12.8
8 17.5 11 9 9 9 9
9 17.2 10 9 5.2 3.9 1.2
10 17.4 17 16.5 15.5 15 15


4.8. Condiciones y adaptacin de microorganismos al substrato
4.8.1 Microorganismos quimiolitotrficos
Una vez que se obtuvieron los resultados de la actividad y crecimiento de los
microorganismos provenientes de las muestras de suelo aledaos a la presa de jales, en
presencia de diferentes fuentes de energa, se procedi a estudiarlos respecto a su
adaptacin al substrato mineral soporte (jales y suelos). En esencia, se trabaj primero
con los cultivos que tuvieron mayor oxidacin del in Fe (ll) en ausencia de extracto de
levadura, descartndose las muestras donde se observ menor capacidad de oxidacin
del ion ferroso. El proceso de adaptacin, consisti entonces en resembrar repetidas
veces a los cultivos en substratos frescos similares durante la fase logartmica del
crecimiento.
Este estudio se realiz con las muestras 2, 4, 7 y 10, las cuales permitieron obtener cifras
mximas de crecimiento de 5x10
8
, 2x10
5
, 2.3x10
7
y 5x10
5
clulas /mL,

65

66
respectivamente (al final de la fase logartmica del crecimiento), en presencia de jales
como substrato mineral. Los mayores incrementos de clulas se obtuvieron a los 30 das
de incubacin para las muestras 2 y 7, mientras que en las muestras 4 y 10 no se
observ una clara tendencia de crecimiento exponencial (figura 7). En las muestras de
suelo y en presencia de sulfato ferroso, se observ un significativo menor crecimiento
microbiano para el cultivo 2, mientras que para el cultivo 7 se tuvo un ligero incremento,
en comparacin a las pruebas con jales como substratro (figura 8).
0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
15 20 25 30 40
Tiempo (d)
C
e
l
u
l
a
s

/
m
L

(
X

1
0
6
)
m-2
m-7
m-10
m-4

Fig. 7. Crecimiento de microorganismos quimiolitotrficos en los cultivos
realizados en presencia de jales y sulfato ferroso.
El resultado para las muestras 4 y 10 en suelos, fue similar que para jales. Por ello, se
seleccionaron los cultivos 2 y 7, los cuales proceden de suelos de mina y agua cida,
respectivamente (Tabla 3).
4.8.2 Microorganismos heterotrficos
En las figuras 9, 10 y 11 se reporta el crecimiento de microorganismos
heterotrficos (bacterias, hongos y levaduras) como Unidades Formadoras de Colonias
por mililitro (UFC.mL
-1
), para tres diferentes medios de cultivo. Con respecto a las

67
0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
15 20 25 30 40
Tiempo (d)
C

l
u
l
a
s

/
m
L

(
X
1
0
6
)
m-4
m-10
m-2
m-7

Fig.8. Crecimiento de microorganismos quimiolitotrficos en los cultivos
realizados en presencia de suelos y sulfato ferroso (los valores son el
resultdado del promedio de tres muestras).

bacterias, que crecieron en un medio orgnico e inorgnico (FeSO4, S y extracto de
levadura), as como los hongos que se desarrollaron en medio orgnico (czapek,
sabouraud y extracto de levadura), combinado con flor de azufre y las levaduras en el
mismo medio que los hongos, se observ una fase de adaptacin parecida que dur
aproximadamente 36 das, mantenindose la fase estacionaria a partir de los 72 das de
incubacin. Cabe mencionar que los hongos y levaduras se mantuvieron en una
incubadora durante la medicin del crecimiento a 25C y las bacterias a 32C.
Las poblaciones de hongos, bacterias y levaduras que se seleccionaron,
estuvieron detectadas entre los rangos de 1x10
5
a 1x10
9
UFC.mL
-1
(Figuras 9 a 11).
Como se observa en la Fig 9, la proliferacin de colonias de bacterias fue de 4.5x10
5
en
el medio MMS (Silverman y Lundgren, 1959). Sin embargo, el crecimiento de hongos y
levaduras en medio de cultivo con fuente de carbono y flor de azufre (J ohnson, 1995;
Germida, 1999) fue de 3.5x10
7
y 3.5x10
9
UFC.mL
-1
, respectivamente (Plantillas 25 a 28
en anexo).


68
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0 12 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo (d)
U
F
C

x

1
0

6


Fig. 9. Crecimiento de bacterias heterotrficas en medios de cultivo orgnico e
inorgnico FeSO4, S y complementado con extracto de levadura (los
valores son el resultdado del promedio de tres muestras).

0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
12 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo (d)
U
F
C

x

1
0
7

Fig. 10. Crecimiento de hongos en medio de cultivo que contiene czapek y
sabouraud, flor de azufre y complementado con extracto de levadura
(los valores son el resultdado del promedio de tres muestras).

4.9 Caracterizacin fenotpica de cepas aisladas
La caracterizacin de las cepas de microorganismos aislados tanto del agua como
del suelo y jales, se bas principalmente en su desarrollo y proliferacin, dependientes de

69
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 12 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo (d)
U
F
C

X

1
0
9

Fig. 11. Crecimiento de levaduras en medio de cultivo que contiene medios
Czapek y sabouraud, flor de azufre y complementado con extracto de
levadura (los valores son el resultdado del promedio de tres muestras).

las distintas formulaciones utilizadas como fuentes de energa en medios de cultivo
selectivos, tanto lquidos como slidos.
Debe mencionarse que la tcnica del aislamiento de microorganismos a partir de
una colonia a travs de los medios de cultivo enriquecidos fue exitosa en este trabajo.
Las caractersticas descriptivas de las colonias de bacterias quimiolitotrficas obtenidas,
se presentan en el Cuadro 17. La descripcin de las caractersticas que se reportan en
dicho Cuadro, nos indica que se tratan efectivamente de bacterias acidoflicas, auttrofos,
aerobias y quimiolitotrficas. En las plantillas 6 a 12, se presentan aspectos de las
colonias y clulas de bacterias quimiolitotrficas que crecieron en medios inorgnicos en
presencia de alguna fuente reducida de azufre (plantillas 6 y 7) o de sulfato ferroso
(plantillas 8 a 11).
Debe sealarse que la caracterizacin fenotpica slo fue realizada sobre colonias
plenamente individualizadas, debido a su capacidad de manifestarse como colonia
individualizada independiente del consorcio de origen. Ejemplo de ello, son las colonias
de bacterias quimiolitotrficas que crecieron slo en presencia de tiosulfato de sodio o de

70
sulfato ferroso como nica fuente de energa, a los valores de pH acidos (<2.0) del
sistema en estudio.
Las bacterias que crecieron slo en presencia de tiosulfato de sodio o sulfato
ferroso como nica fuente de energa son consideradas como quimiolitotrficas estrictas,
teniendo la capacidad de oxidar las especies reducidas de azufre y hierro,
respectivamente. En el caso de estas bacterias, las colonias aisladas podran tratarse de
especies del gnero Thiobacillus o Leptospirillum (Rawlings, 1997). A partir de la
caracterizacin fenotpica de las bacterias aisladas en medio slido, se reconoci al
menos el aislamiento de Thiobacillus thiooxidans para colonias creciendo exclusivamente
sobre tiosulfato de sodio (figura c de Plantilla 5 y Fig a de Plantilla 12) y de Thiobacillus
ferrooxidans (Figs a y b de plantilla 10) o Leptospirillum ferrooxidans (Fig b de Plantilla
12) para bacterias creciendo exclusivamente sobre sulfato ferroso como fuente de
energa.







71

72

73

74

75

76

77

78
Cuadro 17. Caractersticas descriptivas de microorganismos quimiolitotrficos
desarrollados en medio lquido y slido, de acuerdo a Ramsay et al.,
1988; Kelly y Wood, 2000 y que se tomaron de muestras de suelo y agua
de la presa de jales
Caractersticas CEPA 1 CEPA 2 CEPA 3
MORFOLOGA
Clulas pequeas
redondeadas o
bacilos cortos, en
pares, 0.8X2.4 m
Pleomorfos tipo
viroide espirilados
Bacilos cortos
REPRODUCCIN Divisin binaria Divisin binaria Divisin binaria
COLONIA
En medio Fe(II),
esfricas color
naranja, cubiertas con
hidrxido frrico <1
mm
En medio de Fe(II)
esfricas color
naranja, depsitos de
compuestos frricos >
1mm
En medio con
tiosulfato, bordes
lobulados, redondos
verdes con centro rojo
>1mm.
MEDIO LQUIDO
En medio con Fe(II),
cambia el color
ambar, por oxidacin
del Fe. Con pirita
cambia a turbio verde
amarillo
En medio con Fe(II),
cambia al color
ambar. Por oxidacin
del Fe, con pirita
cambia a turbio verde
amarillo
En medio con S se
volvi turbio y
polvoriento
TINCIN Gram negativo Gram negativo Gram negativo
NUTRICIN Auttrofa Auttrofa Auttrofa
RELACIN C/OXIGENO Aerobia Aerobia Aerobia
FUENTE DE ENERGA
Fe(II), S, Tiosulfato
pirita
Fe(II), S, Tiosulfato,
pirita
Fe(II), S, Tiosulfato
pirita
FUENTE DE CARBONO CO
2
CO
2
CO
2

TEMPERATURA,
0
C 29

2
0
C 29

2
0
C 29

2
0
C
pH 2.0 a 2.5 2.0 a 2.5 2.0 a 2.5
FUENTE
AISLAMIENTO
Agua Agua Suelo
OLOR MEDIO
SLIDO
H
2
SO
4
H
2
SO
4
H
2
S y H
2
SO
4

OLOR MEDIO
LIQUIDO
H
2
SO
4
H
2
SO
4
H
2
SO
4


Adems de estas bacterias quimiolitotrficas estrictas, se realiz el aislamiento de
bacterias creciendo en presencia de un medio de cultivo con sulfato ferroso y extracto de
levadura, por lo que deben tratarse de bacterias hetertrofas facultativas, entre las que se
distinguen algunas del gnero Acidophillium y algunas especies del gnero Thiobacillus,
por ejemplo T. acidophilus y T. cuprinus (Rawlings, 1997). La evidencia de que estas
bacterias emplean el sulfato ferroso como fuente de energa es la aparicin de
precipitados frricos (Plantillas 13 a 15), por lo que el extracto de levadura, debe ser

79

80

81

82
utilizado slo como el materia de construccin para la biosntesis de estructuras
celulares.
Adems de las bacterias quimiolitotrficas y heterotrficas facultativas que recin
se mencionaron, tambin se aislaron algunos hongos y levaduras, esto es
microorganismos heterotrficas que crecieron inicialmente en medios de cultivo con
sulfato ferroso y extracto de levadura. Enseguida, su aislamiento y confirmacin fueron
realizados en presencia de medios de cultivo especficos: agar sabouraud y czapek para
crecimiento de hongos; y agar sabouraud con extracto de levadura para crecimiento de
levaduras. En el Cuadro 18 se describen las caractersticas ms sobresalientes de los
que se eligieron para el experimento. Lo anterior correspondi a la caracterizacin
basada nicamente en propiedades fenotpicas, basndose en los aspectos
mencionados en el captulo de materiales y mtodos.
En las plantillas 16 a 18 se presentan las colonias de hongos que se manifestaron
originalmente en el medio con sulfato ferroso y extracto de levadura, mientras que en la
plantilla 19 se observan colonias tipo fngico que crecieron en presencia de tiosulfato de
sodio. Todas estas colonias fueron aisladas a partir del consorcio recuperado de la presa
de jales, tanto de los jales como del agua ah depositada. Como se present en el
Cuadro 18, se reconocieron al menos 5 posibles especies fngicas diferentes
(Aspergillus, Cryptococcus, Mucor, Penicillium y Rhizopus), distinguindose sus colonias
caractersticas en los medios slidos especficos (Plantillas 16 a 19).
A partir de estas colonias, se realizaron subcultivos repetidos para tener la certeza
de su pureza con el fin de mantenerlos como cepas puras para su posterior identificacin
y empleo en pruebas. Las imgenes de la plantilla 20 presentan la conservacin de las
cepas fngicas purificadas.
En las plantillas 21 y 22, se presentan imgenes de colonias de levaduras
Saccharomyces sp. y Rhodotorula sp., que fueron aisladas y purificadas a partir del
consorcio proveniente de los jales cidos (pH <2). Estas colonias crecieron
exclusivamente sobre sulfato ferroso y extracto de levadura, sin evidencias en los
medios slidos de tener capacidad de oxidar el ion ferroso a frrico, de ah que su

83

84

85

86

87

88

89
































90
importancia en este trabajo sea su sinergismo con el resto de microorganismos (bacterias
y hongos) que crecieron en estos medios.
Es importante tambin mencionar, que se identificaron algunos protozoarios, aun
cuando el experimento se mantuvo permanentemente en oscuridad. Solo se trabaj con
ellos cuando se utiliz el consorcio de origen. En la plantilla 23 se presentan algunas
fotomicrografas de estos eucariotas.
Cuadro 18. Caractersticas descriptivas de las colonias de microorganismos
hetertrofos obligados, identificados en este trabajo.
Posible especie de
microorganismos
Caracterstica del hbitat
Aspergillus nger
pH 2.3 a 6.0 de 29 a 30 C. Se encontraron en agua cida y en el
suelo que present color verde. Colonias tpicamente negras. Los
conidiforos largos y ramificados aproximadamente de 1.5 a 3.0
mm (Domsch et al., 1993).
Cryptococcus sp
Se encontr en el agua y suelo donde se registr el pH de 1.2 a 1.9.
El color de las colonias fue verde. Se observaron hifas septadas,
formaron esclerocios (Alexopoulos, 1996).
Mucor racemosus
El pH fue de 2.5 a 2.8. Se encontr en el suelo, present colonias
de color gris. El esporangiforo oscuro. Las clamidosporas se
observaron globosas y las zigosporas que se detectaron mas
grandes. (Domsch et al., 1993).
Penicillium italicum
En pH 2.9, encontrado en aguas rojas y suelo verde en la orilla de la
presa. La colonia cuando joven se dio verde pero al envejecer
cambi al color gris verdoso. Muy ramificadas se observaron hifas
aseptadas (Domsch et. al., 1993)
Rhizopus stolonifer
Se encontr en el suelo con un pH de 3.0. Colonias de color negro y
las zigosporas tambin negras. Hifas ramificadas y formaron
esclerocios.
Rhodotorula sp
El pH registrado en el suelo de color verde donde se encontr
fue de 2.0. Las colonias fueron de color anaranjado debido a los
pigmentos carotenoides de que son caractersticas estas
levaduras. El color se mantuvo constante hasta los 25 das
cambiando al gris cuando envejecieron.

No se hizo ningn tipo de caracterizacin para estos microorganismos. Sin
embargo, se observ con frecuencia durante los conteos, la presencia de protozoarios
as como algunos tipos de Amoebas. Adems de todos los microorganismos arriba
citados, se observaron algunos microorganismos filamentosos que crecieron en
presencia de sulfato ferroso, tanto como fuente de energa nica, como en presencia de
extracto de levadura (Plantilla 24).

91

92































93
Tanto en los protozoarios, como los microorganismos filamentosos, no existi una
evidencia de formar colonias en los medios slidos, identificados exclusivamente como
individuos en los medios lquidos. Para ambos tipos de microorganismos, no se realiz
alguna caracterizacin fisiolgica, aunque ya se han reportado evidencias de su
presencia en este tipo de ambientes cidos (Bacelar-Nicolau y J ohnson, 1999).

4.10 Bioensayos para determinar condiciones en la biolixiviacin de
minerales sulfurosos

4.10.1 Actividad de los microorganismos en substrato estril y no estril
Se realizaron pruebas con los cultivos puros (Thiobacillus sp.) y mixtos (mezcla de
Thiobacillus sp., Rhodotorula sp. y Penicillium sp.) en presencia de un medio mnimo de
sales (MMS), en ausencia y presencia de sulfato ferroso y extracto de levadura, utilizando
los jales como sustrato mineral, donde se compar el efecto de la esterilizacin del
sustrato con el fin de diferenciar la capacidad oxidativa de ambos cultivos. Los resultados
de estas pruebas se reportan en el Cuadro 19, donde se observa para los cuatro distintos
bioensayos una mayor oxidacin del ion ferroso en los cultivos con el sustrato estril,
aunque el contenido inicial de sulfato ferroso es superior para las pruebas donde se
adicion extracto de levadura y sulfato ferroso.
Aun cuando se observa que el porcentaje de oxidacin del Fe (II) para casi todos
los cultivos en sustrato no estril es similar al reportado para la prueba control (~26%), lo
cual significara ningn efecto en la oxidacin del ion ferroso por la presencia de los
cultivos puros y mixto en los sustratos no estril, en realidad si existe un efecto positivo
de la presencia de los microorganismos presentes en ambos cultivos (puro y mixto). Se
observ que al comparar la velocidad de oxidacin del ion ferroso (expresada en mg.h
-1
),
se comprueba que en presencia del MMS la velocidad de oxidacin del Fe(II) se
incrementa de 3 a 20 veces en comparacin a la prueba control, mientras que en
presencia del medio con extracto de levadura y sulfato ferroso, la velocidad de oxidacin
se incrementa de 78 a 260 veces en comparacin a la prueba control (Cuadro 19).



94
Cuadro 19. Valores iniciales y finales del in Fe (ll) en cada tratamiento para las
comparaciones con cultivo mixto y puro con distintas fuentes de energa.

Condiciones
Concentracin
inicial (mg/L)
Concentracin final
(mg/L)

Oxidacin de Fe(II)
(%)
Velocidad de
oxidacin de
Fe(II) (mg.h
-1
)
Control
stril 0.05 0.037 26 1.8*10
-5

no estril 0.05 0.036 28 1.9*10
-5

Cultivo puro (Thiobacillus sp.) en MMS
Estril 0.35 0.09 74 3.6*10
-4

no estril 0.30 0.18 40 1.7*10
-4

Cultivo mixto en MMS
Estril 0.20 0.07 65 1.8*10
-4

no estril 0.20 0.16 20 5.5*10
-5

Cultivo puro (Thiobacillus sp.) en MMS con extracto de levadura y sulfato ferroso
Estril 3.98 2.60 35 1.9*10
-3

no estril 3.60 2.60 28 1.4*10
-3

Cultivo mixto en MMS con extracto de levadura y sulfato ferroso
Estril 4.27 0.89 79 4.7*10
-3

No estril 4.21 3.10 27 1.5*10
-3


Debe mencionarse que en las pruebas donde no se adicion sulfato ferroso (tanto
bioensayos control como cultivos con MMS), el Fe (II) inicial es aportado por los jales.
Adems, se observ que no existe un mayor aporte del ion ferroso por la esterilizacin
del sustrato. En todos los casos, fueron evidentes las tendencias de disminucin en la
concentracin de Fe (II) en solucin conforme se incrementa el tiempo de reaccin (Fig.
12 a 16), cuando se esteriliz el medio y adems se adicion sulfato ferroso y extracto de
levadura el consumo fue significativamente mayor (Fig. 16). Como tambin se demostr
en el Cuadro 19, se observ una oxidacin similar del ferroso, tanto con los cultivos puros
como con los mixtos (Fig. 13 y 14). Sin embargo, cuando se adicion el sulfato ferroso y
extracto de levadura fue notablemente ms oxidado en presencia del cultivo mixto (Fig.15
y 16).

95
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0 24 48 60 72
Tiempo (h)
F
e
r
r
o
s
o

(
m
g
/
L
)
no estril
estril

Fig. 12. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) en el control en condiciones
estril y no estril.



0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0 24 48 60 72
Ti empo (h)
F
e
r
r
o
s
o

(
m
g
/
L
)
no estril
estril

Fig. 13. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) con el cultivo puro (Thiobacillus sp.)
en medio mnimo de sales (MMS).



96
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 24 48 60 72
Tiempo (h)
F
e
r
r
o
s
o


m
g
/
L
no estril
estril

Fig. 14. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) con el cultivo mixto en medio
mnimo de sales.




0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
0 24 48 60 72
Tiempo (h)
f
e
r
r
o
s
o


(
m
g
/
L
)
no estril
estril

Fig. 15. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) con el cultivo puro (Thiobacillus
sp.) en medio mnimo de sales, extracto de levadura y sulfato ferroso.


97
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
0 24 48 60 72
Tiempo (h)
f
e
r
r
o
s
o

(
m
g
/
L
)
no estril
estril

Fig. 16. Evolucin de la concentracin de Fe (ll con el cultivo mixto en medio
mnimo de sales, extracto de levadura y sulfato ferroso.


4.10.2 Condiciones de crecimiento de los microorganismos aislados en
el substrato con jales y diluyente distinto

Esta serie de bioensayos fue realizado para demostrar el efecto de dos diluyentes
diferentes: agua acidulada y medio 9K, ambos a pH de 2, realizndose para los cultivos
puros y mixtos en presencia de jales. Adems del diluyente, se evalu su efecto en
presencia y ausencia de sulfato ferroso como fuente de energa, con y sin extracto de
levadura.
En la Fig. 17, se presentan los resultados cuando se utiliz agua como diluyente,
con los cultivos puros (Thiobacillus sp.), mixto (mezcla de Thiobacillus sp., Rhodotorula
sp. y Penicillium sp.) y consorcio, sin sulfato ferroso adicionado como fuente de energa
inorgnica. Se observa que no existe una disolucin adicional de ion ferroso a partir de
los jales para las cinco pruebas reportadas. La concentracin inicial de Fe(II) disuelto al

98
poner en contacto los jales con el agua acidulada, disminuye de 2 a casi 1.3 mg/L,
obtenindose el mejor resultado para el consorcio en presencia de extracto de levadura.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0 2 5 8 12 36
Tiempo (h)
f
e
r
r
o
s
o

(
m
g
/
L
)
1
2
3
6
7

Fig. 17. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) muestra de jales con cultivo mixto
y cultivo puro, empleando agua acidulada como diluyente: (1) control para
el cultivo mixto; (2) con extracto de levadura y cultivo mixto; (3) con
extracto de levadura y consorcio; (6) control para el cultivo puro; (7) con
extracto de levadura y cultivo puro.

En la Fig. 18 se presenta el bioensayo equivalente, empleando al medio 9K como
diluyente. Los resultados fueron similares a los obtenidos para el agua con los cultivos
puro y mixto, mientras que para el consorcio con extracto de levadura, la disminucin en
la concentracin del ion ferroso fue aun mayor (de 2 a 0.2 mg/L). Entonces, comparando
los diez tratamientos, la mejor condicin fue con medio 9K como diluyente y consorcio
como grupo microbiano (90% de potencial oxidacin de ion ferroso), aunque a muy bajas
concentraciones de ion ferroso (<2 mg/L), por lo que era necesario confirmar esto con
mayores concentraciones de sulfato ferroso (con y sin extracto de levadura).


99
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 2 5 8 12 36
Tiempo (h)
f
e
r
r
o
s
o


(
m
g
/
L
)
1
2
3
6
7

Fig. 18. Evolucin de la concentracin de Fe (ll), muestra de jales con cultivo
mixto y cultivo puro, empleando medio 9K como diluyente: (1) control
para el cultivo mixto; (2) con extracto de levadura y cultivo mixto; (3) con
extracto de levadura y consorcio; (6) control para el cultivo puro; (7) con
extracto de levadura y cultivo puro.

Cuando se adicion sulfato ferroso como sustrato energtico, la concentracin
inicial de este ion fue superior: 1500 mg/L para la prueba con agua acidulada y 15000
mg/L para el medio 9K. En las nuevas series de bioensayos con adicin del sulfato
ferroso, no se experiment la presencia del consorcio, puesto que este ya haba
demostrado su mayor capacidad para oxidar el ion ferroso, sobre todo en presencia del
medio 9K con extracto de levadura. En cambio, en estas nuevas series, se tratara de
comparar el efecto del ion ferroso para los cultivos mixto y puro. En las Figs. 19 y 20, se
presentan las tendencias de la disminucin del ion ferroso cuando se us,
respectivamente, agua y medio 9K como diluyentes. Cuando se emple agua como
diluyente, se obtuvo un comportamiento similar para las pruebas con cultivo puro +
extracto de levadura, as como para el cultivo mixto, con y sin extracto de levadura (40%
de disminucin, segn Fig. 19).


100
0
200
400
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1000
1200
1400
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0 2 5 8 12 36
Tiempo ( h )
f
e
r
r
o
s
o


(
m
g
/
L
)
4
5
8
9

Fig. 19: Evolucin de la concentracin de Fe (ll), muestra de jales con cultivo
mixto y cultivo puro, empleando agua acidulada como diluyente: (4)
cultivo mixto y sulfato ferroso; (5) cultivo mixto, sulfato ferroso y
extracto de levadura; (8) cultivo puro y sulfato ferroso; (9) Cultivo puro,
extracto de levadura y sulfato ferroso.

0
2000
4000
6000
8000
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0 2 5 8 12 36
Tiempo (h)
f
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r
r
o
s
o

(
m
g
/
m
L
)
4
5
8
9

Fig. 20. Evolucin de la concentracin de Fe (ll), muestra de jales con cultivo
mixto y cultivo puro, empleando medio 9K como diluyente: (4) cultivo
mixto y sulfato ferroso; (5) cultivo mixto, sulfato ferroso y extracto de
levadura; (8) cultivo puro y sulfato ferroso; (9) Cultivo puro, extracto de
levadura y sulfato ferroso.


101
Por otro lado, en la Fig. 19 se observa que el substrato que contena cultivo mixto,
sulfato ferroso y extracto de levadura en medio 9K, la disminucin de la concentracin de
ion ferroso fue significativamente mayor que el resto de los tratamientos. La disminucin
del in ferroso se aceler rpidamente a partir del quinto da, obtenindose un consumo
del 87 % del total del ferroso al inicio presente.
Si se considera que en las condiciones del sistema en estudio, la disminucin del
ion ferroso es provocada por su oxidacin a ion frrico, el Cuadro 18 reporta las
velocidades de oxidacin para estos 9 tratamientos. Con ello se confirma que la mayor
velocidad de disminucin en la concentracin de Fe(II) disuelto se obtuvo con el cultivo
mixto en presencia del medio 9K (7.6X10
+2
mg.h
-1
), sulfato ferroso y extracto de levadura
(Cuadro 20). Debe sealarse que esta velocidad mxima se obtuvo en los perodos
iniciales de la cintica, mientras que en ausencia del medio 9K, la mxima velocidad de
disminucin de Fe(II) se obtuvo hacia el final de la cintica (6.5*10
+1
mg.h
-1
). Dado que
estos bioensayos demostraron que el cultivo mixto presenta los mejores resultados en la
disminucin de Fe(II), la cual se asocia a su oxidacin en ion frrico, enseguida slo se
realizaron experimentos con este cultivo, haciendo comparacin de eficiencia con el
cultivo puro. Adems, tambin de estas pruebas se propone slo el empleo de medio 9K
como diluyente y extracto de levadura y sulfato ferroso como sustratos energticos.
Cuadro 20. Velocidad mxima de oxidacin del ion ferroso (mg.h
-1
) en presencia de
jales, para microorganismos, en funcin de la presencia de sulfato
ferroso y extracto de levadura y dos diluyentes distintos.
Tipo de
Microorganismo
Agua acidulada como diluyente Medio 9K como diluyente
Sin FeSO
4
Con FeSO
4
Sin FeSO
4
Con FeSO
4

Sin
extracto
Con
extracto
Sin
extracto
Con
extracto
Sin
extracto
Con
extracto
Sin
extracto
Con
extracto
Consorcio de
microorganismos
- 7.5E-2 - - - 1.9E-1 - -
Puro (Thiobacillus
sp.)
2.5E-2 2.0E-2 6.1E+1 4.6E+1 5.7E-2 6.2E-2 3.3E+2 3.7E+2
Mixto (Thiobacillus
sp. Penicillium sp. y
Rhodotorulla sp.)
1.5E-2 6.3E-2 8.3E0 6.5E+1 9.7E-2 4E-2 3.0E+2 7.6E+2




102
4.10.3 Oxidacin de Fe(II) por cultivos mixtos y puros en presencia de
jales

Fue evidente la adaptacin de los cultivos de microorganismos al substrato
preparado. En un primer experimento no se adicion extracto de levadura, por lo que no
hubo carbono orgnico como fuente de energa. Se compararon cultivos puros
(Thiobacillus sp.) y mixtos, en presencia de los minerales sulfurosos presentes en los
jales y del sulfato ferroso que se adicion como fuente de energa. Se puede observar en
la Fig. 21 que se increment de manera logartmica la biomasa en ambos tipos de cultivo.
Aunque el cultivo mixto super el nmero de microorganismos con respecto al puro. Sin
embargo, en ambos cultivos se observa el mayor incremento durante los 20 a 35 das de
incubacin.
0
1000
2000
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0 10 15 20 25 30 35 40 45 50
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10000000
100000000
c

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/
m
L
Fe(II) para cultivo mixto Fe(III) para cultivo mixto
Cultivo Mixto (cel/ml) Cultivo Puro (cel/ml)

Fig. 21. Oxidacin de Fe(II) a Fe(III) y evolucin del crecimiento de los
microorganismos en cultivo puro (Thiobacillus sp.) y cultivo mixto.

Por otro lado, tambin se evidenci un incremento en la concentracin de Fe(lll),
mientras que la concentracin de Fe(ll) disminuy de manera proporcional conforme se

103
incrementa el tiempo de la prueba (Fig. 21). Aun cuando en esta grfica no se
presentan los resultados para la oxidacin del Fe(II) correspondiente al cultivo puro, se
obtuvo una muy lmitada oxidacin del ferroso por estos microorganismos.
En seguida se realiz una prueba adicionando extracto de levadura y el sulfato
ferroso. Los resultados de este experimento, confirmaron que la actividad microbiana
favoreci la disminucin de la concentracin de Fe(ll), incrementndose al mismo tiempo
la concentracin de Fe(lll) (Fig. 22). Debe sealarse que el pH de la pulpa descendi de
2.0 hasta 0.9. Con respecto a la actividad de los microorganismos en este substrato, se
manifest un aumento importante de la biomasa. El inculo inicial fue de 1*10
3

clulas.mL
-1
, alcanzando una concentracin de 4X10
9
clulas.mL
-1
en periodo
estacionario (a seis das de incubacin) (Fig. 23).
0
2
4
6
8
10
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tiempo (d)
F
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(
I
I
)

y

F
e
(
I
I
I
)
,


g
/
L
Fe(II)g/l Fe(III)g/l

Fig. 22. Cintica de la oxidacin de Fe(II) en presencia de jales con cultivo mixto.

Los microorganismos que se desarrollaron en este substrato fueron
microorganismos hetertrofos y quimiolitotrficos (cultivo mixto), ya que el aporte de
sulfato ferroso y el extracto de levadura seguramente funcionaron como fuente de
energa para la proliferacin celular. Cabe sealar que el cultivo de microorganismos que
se us en este experimento, es el que ya se ha seleccionado y adaptado al substrato
empleado en los experimentos anteriores.

104
En la Fig. 23 se observa tambin que despus de alcanzar su periodo estacionario
de crecimiento entre 5 y 10 das despus de inoculacin, la concentracin de
microorganismos en suspensin disminuy significativamente.
1000
10000
100000
1000000
10000000
100000000
1000000000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tiempo (d)
C

l
u
l
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s

/
m
L

Fig 23. Cintica de crecimiento de microorganismos en el cultivo mixto con
sulfato ferroso y extracto de levadura como fuente de energa

4.10.4 Estudio comparativo de la capacidad oxidativa de cultivos puros y
mixtos
Dado que el cultivo mixto presentaba mejor capacidad oxidativa del Fe(II), y
considerando que este cultivo mixto est constituido por una mezcla de los cultivos puros
identificados como Thiobacillus sp., Penicillium sp. y Rhodotorula sp., se procedi a
realizar cinticas de oxidacin del ion ferroso en presencia de los cultivos puros bajo las
condiciones de crecimiento determinadas como ideales para el cultivo mixto, esto con el
fin de distinguir cual de los microorganismos tiene mayor capacidad de oxidacin en la
mezcla.
Bajo las condiciones de las pruebas, el crecimiento de los microorganismos
(expresado en celulas.mL
-1
), fue mayor para el cultivo identificado como Thiobacillus sp.,
el cual creci de 1*10
3
a 1*10
5
, mientras que el crecimiento de Penicillium sp. y

105
Rhodotorula sp., fue apenas menor de 5 veces la concentracin inicial de clulas (fFigs.
24 a 26). La oxidacin del ion ferroso fue mayor para los cultivos puros de Thiobacillus
sp. y Penicillium sp., quienes promovieron la disminucin de la concentracin de Fe(II) de
8000 mg.L
-1
hasta menos de 3000 mg.L
-1
en 45 das (Figs. 24 y 25). En cambio, el cultivo
de Rhodotorula sp., present una menor capacidad de oxidacin de Fe (II), de 550 a 300
mg.L
-1
(Fig. 26).
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
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8000
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F
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(
l
l
)

m
g
/
m
L
microorganismos [Fe(II)]
Velocidad promedio de
oxidacin = 1.5 mg/h

Fig. 24. Crecimiento del cultivo puro de Thiobacillus sp en presencia de sulfato
ferroso y extracto de levadura, as como su evolucin en la
concentracin de Fe(II) disuelto.
1
10
100
1000
10000
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (d)
c
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4000
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F
e
(
I
I
)
,

m
g
/
L
microorganismos Fe(II)
Velocidad promedio de
oxidacin = 1.5 mg/h

Fig. 25. Crecimiento del cultivo puro de Penicillium sp en presencia de sulfato
ferroso y extracto de levadura, as como evolucin en la concentracin
de Fe(II) disuelto.


106
Enseguida se realizaron nuevamente bioensayos con la mezcla de cultivos puros
de los cultivos de Thiobacillus sp., Penicillium sp., y Rhodotorula sp., en los mismos
tiempos y condiciones que las tres pruebas anteriores, con fuentes de energa diferentes
y empleando a los jales como un sustrato comn.
1
10
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1000
10000
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (d)
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300
400
500
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F
e
(
I
I
)
,

m
g
/
L
microorganismos Fe(II)
Velocidad promedio de
oxidacin = 1.5 mg/h

Fig. 26. Crecimiento del cultivo puro de Rhodotorula sp en presencia de sulfato
ferroso y extracto de levadura, as como evolucin en la concentracin
de Fe (II) disuelto.
1.00E+00
1.00E+02
1.00E+04
1.00E+06
1.00E+08
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1.00E+12
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
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F
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I
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)
,

m
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/
L
Microorganismos Fe(ll)
Velocidad
promedio de

Fig. 27. Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de Fe(II) para la
mezcla de microorganismos (Thiobacillus sp, Penicillium sp y Rhodotorula
sp.), utilizando sulfato ferroso con extracto de levadura como fuente de
energa.



107
1.00E+00
1.00E+02
1.00E+04
1.00E+06
1.00E+08
1.00E+10
1.00E+12
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (d)
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I
I
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,

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L
Microorganismos Fe(ll)
Velocidad
promedio de

Fig. 28. Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de Fe(II) para la mezcla de
microorganismos (Thiobacillus sp, Penicillium sp y Rhodotorula sp.), utilizando
sulfato ferroso sin extracto de levadura como fuente de energa.

En la figura 29 se observa la cintica de microorganismos que result con los jales
como nica fuente de energa. Expresa resultados con diferencia significativa comparada
con las dos pruebas anteriores. La produccin mxima de clulas por mL que se obtuvo
fue de 1X10
5
, es decir, 6 y 4 ordenes de magnitud menor que con sulfato ferroso +
extracto de levadura y sulfato ferroso sin extracto de levadura, respectivamente.
Seguramente consecuencia del limitado crecimiento microbiano, la concentracin inicial
de Fe(ll) disminuy slo de 540 a 350 mg.L
-1
, al final del tiempo de incubacin (Fig. 29).
1.00E+00
1.00E+02
1.00E+04
1.00E+06
1.00E+08
1.00E+10
1.00E+12
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ti empo (d)
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7000
8000
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F
e
I
I

(
p
p
m
)
Microorganismos Fe(ll)

Fig. 29. Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de Fe(II) para la
mezcla de microorganismos (Thiobacillus sp, Penicillium sp y
Rhodotorula sp.), sin fuente de energa adicional, slo sulfuros
presentes en jales.


108
A travs de estos bioensayos, se pudieron detectar las tendencias de la oxidacin
del ion ferroso y del crecimiento microbiano para tres diferentes combinaciones de
fuentes de energa: (i) medio 9K con jales, sulfato ferroso y extracto de levadura; (ii)
medio 9K con jales y sulfato ferroso; y (iii) medio 9K con jales. La mayor proliferacin de
microorganismos que se dio a travs del tiempo fue para el primer bioensayo, es decir,
cuando se utiliz jales, sulfato ferroso y extracto de levadura (Figs. 27 a 29). En este
caso, el crecimiento celular alcanz hasta 1X10
11
clulas.mL
-1
, a lo cual se asocia una
disminucin en la concentracin de Fe(II) de 8000 hasta 500 mg.L
-1
(Fig. 27). Al utilizar
jales y sulfato ferroso, tambin se expres un importante crecimiento celular, aunque slo
alcanz una concentracin de 1X10
7
clulas.mL
-1
a los 20 das de incubacin,
disminuyendo la concentracin de Fe (II) de 7762 a 2000 mg.L
-1
(Fig. 28).
4.11 Biolixiviacin de jales por comunidades microbianas
seleccionadas

4.11.1 Descripcin de la evolucin de parmetros indicadores

Se realizaron pruebas de biolixiviacin de los jales sulfurosos con los distintos
tipos de microorganismos y en presencia de distintas fuentes de energa (sulfato ferroso y
extracto de levadura). Los resultados de este estudio compararativo se reportan
grficamente en las Figs. 30 a 32, donde se presentan los principales indicadores de la
actividad microbiana tomando como base los productos de reaccin del sistema en
estudio.
En las tres comparaciones realizadas en funcin de la fuente de energa (jales,
jales+sulfato ferroso y jales+sulfato ferroso+extracto de levadura), la evolucin de los
parmetros analizados en los bioensayos testigo (sin adicin de microorganismos),
demuestra que efectivamente en todos los casos existe una influencia de la actividad
microbiana, comparado con su respectivo testigo (Plantilla 29 del anexo).
En todos los bioensayos, se observ un incremento en la biomasa (expresada
aqu por el nmero de celulas en suspensin) entre el perodo 15 a 35 das (Figs. 30a,
31a y 32a). Despus de este perodo, en la mayora de los ensayos se observ una
disminucin en el nmero de clulas. Esto fue confirmado por el ensayo de la
concentracin de protenas totales (Figs. 30b, 31b y 32b).

109
En cuanto al pH, tambin se observ una evolucin similar para todos los
bioensayos, esto es, una disminucin conforme se incrementa el tiempo de la cintica, de
los valores iniciales cercanos de 2 hasta valores de pH ligeramente inferiores de 1 a los
45 das (Figs. 30c, 31c y 32c). Slo en la serie de pruebas con sulfato ferroso como
fuente de energa, se observa una tendencia de la acidez asociada a la evolucin del pH,
esto es, incremento de la acidez con la disminucin del pH (Figs. 30e, 31e y 32e). En
cambio, para las pruebas con jales y jales+sulfato ferroso+extracto de levadura, no se
observa un comportamiento asociado entre el pH y la concentracin de la acidez en la
pulpa. De una manera similar, la evolucin de la concentracin de ion sulfato es irregular
en la mayora de los bioensayos, aunque para los ltimos tres muestreos se observ una
tendencia de incremento (Figs. 30f, 31f y 32f).
El potencial rdox de las pulpas durante las pruebas mostraron una tendencia
normal para los sistemas de oxidacin de minerales sulfurosos, esto es, un incremento
hasta potenciales cercanos de 600 mV/SCE (equivalente a 840 mV/SHE), aunque en los
tres casos, se observ un mayor incremento en el potencial rdox para las pruebas con
el consorcio (Figs. 30d, 31d y 32d).
En el caso del anlisis de Fe total, se observ para los bioensayos donde se
adicion ion ferroso una tendencia a la disminucin en la concentracin de Fe (Figs. 30g
y 31g), en cambio donde no se adicion el Fe (II) y el nico sustrato energtico fueron los
sulfuros de los jales, si se observ una tendencia al incremento en la disolucin de este
metal (Figs. 32g). A diferencia de este comportamiento no esperado del Fe total para los
bioensayos con el Fe(II), la concentracin del ion ferroso si present una tendencia
normal a la esperada, esto es, una disminucin en su concentracin, atribuida a su
oxidacin a ion frrico (Figs. 30h, 31h y 32h).

110
1,00E+00
1,00E+02
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5 10 15 20 25 30 35 40 45
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CMS M Th P R T

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F
e
(
l
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m
g
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L
CMS M Th P R T

h

Fig. 30. Evolucin de los parmetros indicadores de la actividad microbiana durante la
biolixiviacin de los jales en presencia de sulfato ferroso como fuente de energa: (a)
concentracin de clulas en suspensin; (b) protenas totales; (c) pH; (d) potencial
rdox; (e) acidez; (f) concentracin de sulfato disuelto; (g) concentracin total de Fe
disuelto; y (h) concentracin total de ferroso disuelto.
CMS =Consorcio de microorganismos seleccionados; M =cultivo mixto (Thiobacillus sp.,
Penicillium sp. y Rhodotorula sp.; Th =cultivo puro de Thiobacillus sp., P =cultivo puro de
Penicillium sp.; R =cultivo puro de Rhodotorula sp.; T =testigo.

111
1,00E+00
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+08
1,00E+10
1,00E+12
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
C

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CMS M Th P R T

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0,5
1
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5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
p
H
CMS M Th P R T

c

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tiempo (das)
A
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(
%
)
CMS M Th P R T

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5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ti empo (d)
F
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t
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3
6
9
12
15
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
P
r
o
t
e

n
a
s

T
o
t
a
l
e
s


(
u
g
/
m
L
)
CMS M Th P R T

b

0
200
400
600
800
5 10 15 20 25 30 35 40 45
ti empo (das)
O
R
P

(
m
V
/
S
C
E
)
CMS M Th P R T

d

0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 5 10 15 20 25 30 35 40
tiempo (das)
i
o
n

S
u
l
f
a
t
o

(
m
g
/
L
)
CMS M Th P R T

f

0
10000
20000
30000
40000
50000
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
F
e

(
l
l
)


m
g
/
L
CMS M Th P R T

h

Fig. 31. Evolucin de los parmetros indicadores de la actividad microbiana durante la
biolixiviacin de los jales en presencia de sulfato ferroso y extracto de levadura como
fuente de energa: (a) concentracin de clulas en suspensin; (b) protenas totales; (c)
pH; (d) potencial rdox; (e) acidez; (f) concentracin de sulfato disuelto; (g)
concentracin total de Fe disuelto; y (h) concentracin total de ferroso disuelto.
CMS =Consorcio de microorganismos seleccionados; M =cultivo mixto (Thiobacillus sp.,
Penicillium sp. y Rhodotorula sp.; Th =cultivo puro de Thiobacillus sp., P =cultivo puro de
Penicillium sp.; R =cultivo puro de Rhodotorula sp.; T =testigo.

112
1,00E+00
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+08
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
C

l
u
l
a
s
/
m
L
CMS M Th P R T

a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (d)
p
H
CMS M Th P R T

c
0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
A
c
i
d
e
z

(
%
)
CMS M Th P R T

e

0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo(das)
F
e

T
o
t
a
l

(
m
g
/
L
)
CMS M Th P R T



0
3
6
9
12
15
5 10 15 20 25 30 35 40 45
ti empo (das)
P
r
o
t
e

n
a
s

T
o
t
a
l
e
s


(
u
g
/
m
L
)
CMS M Th P R T

b
0
200
400
600
800
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
O
R
P

(
m
V
/
S
C
E
)
CMS M Th P R T

d
0
500
1000
1500
2000
5 10 15 20 25 30 35 40 45
ti empo (das)
i
o
n

s
u
l
f
a
t
o

(
m
g
/
L
)
CMS M Th P R T

f

0
50
100
150
200
250
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
F
e

(
l
l
)


m
g
/
L
CMS M Th P R T

h
Fig. 32. Evolucin de los parmetros indicadores de la actividad microbiana durante la
biolixiviacin de los jales como nica fuente de energa: (a) concentracin de clulas en
suspensin; (b) protenas totales; (c) pH; (d) potencial rdox; (e) acidez; (f)
concentracin de sulfato disuelto; (g) concentracin total de Fe disuelto; y (h)
concentracin total de ferroso disuelto.
CMS =Consorcio de microorganismos seleccionados; M =cultivo mixto (Thiobacillus sp.,
Penicillium sp. y Rhodotorula sp.; Th =cultivo puro de Thiobacillus sp., P =cultivo puro de
Penicillium sp.; R =cultivo puro de Rhodotorula sp.; T =testigo.

113
4.11.2 Anlisis estadstico (ANOVA y Prueba de medias de Tukey)
Se presenta el anlisis de la separacin de prueba de medias que se realiz
para conocer el efecto de las diferentes clases de microorganismos sobre las variables
medidas durante el proceso de biolixiviacin de los jales. Los resultados de los anlisis
de varianza se reportan en el Cuadro 21, mientras que aquellos de las pruebas de
medias en los Cuadros 22 a 24.
En el Cuadro 22, se muestra que el valor del pH mas bajo (1.58) fue con el
consorcio de microorganismos seleccionados (CMS) y ms alto con el testigo (2.58).
Caso contrario sucedi con el potencial rdox (ORP), mientras la cifra ms alta se dio
en CMS la ms baja fue en el testigo. De la misma forma, las concentraciones del in
sulfato ms elevadas se dieron en el CMS y con Penicillium sp y la menor en el
testigo. Con respecto a la acidez, la mayor concentracin tambin se manifest en el
CMS (84.19), enseguida con Thiobacillus, seguida de la mezcla de microorganismos
as como con Penicillium y Rhodotorula y la ms baja en el testigo. Sin embargo, la
concentracin de clulas ms destacada, se evidenci con la mezcla de
microorganismos; posteriormente en el CMS, le siguieron con cifras similares
estadsticamente los cultivos de Thiobaciilus, Penicillium y Rhodotorula, siendo la ms
baja con el testigo.
En Cuadro 22 se pone en evidencia, a travs de la separacin de medias, los
efectos de los microorganismos sobre el resto de las variables. En el caso de la
concentracin de proteinas totales, los valores ms elevados fueron para el CMS, la
mezcla de microorganismos y el cultivo puro de hongos, mientras que los valores ms
bajos fue para la muestra testigo.
En cuanto a los resultados de los iones Fe (ll), la mayor concentracin se
manifest en el testigo, le siguieron los cultivos puros de Rhodotorula sp, Penicillium
sp y Thiobacillus sp., mezcla de microorganismos, y finalmente la muestra con menor
concentracin de ferroso fue el CMS. Contrariamente, las concentraciones mas
elevadas del Fe (lll), estuvieron en CMS y le siguieron con cifras estadsticamente
iguales la mezcla de microorganismos, cultivos puros de Thiobacillus sp, Penicillium
sp, Rhodotorulla sp y finalmente el mas bajo estuvo en el testigo.

114
Por lo que se refiere a las concentraciones de azufre, de acuerdo al anlisis, la
evidencia reflej que la concentracin mas elevada fue en el CMS, le siguieron los
cultivos de hongos, Thiobacillus sp y Rhodotorula sp, teniendo la lectura menor para el
testigo.

Cuadro 21. Valor de F calculada por anlisis de varianza de las interacciones,
aplicando los resultados de pruebas de biolixiviacin con
distintos microorganismos seleccionados.
Fuente de
variacin
Grados de
libertad
ORP
(mV)
In Sulfato
(mg/L)
Acidez
(%)

pH
Azufre
(mg/L)
Tratamientos 163
Microorga-
nismos (M)
5 90.23*** 10.20*** 88.50*** 249.94*** 31.43***
Fuente de
energa (C)
2 19.38*** 721.83*** 1469.42*** 560.62*** 737.42***
Tiempo (T) 8 254.18*** 170.53*** 485.14*** 90.84*** 83.08***
Repeticin (R) 2 1.17 NS 0.13 NS 0.27 NS 4.73 NS 0.20 NS
M*C 10 8.93*** 41.10*** 14.81*** 76.66*** 4.74***
M*T 40 6.40*** 66.96*** 7.74*** 4.85*** 9.05***
C*T 16 4.91*** 15.02*** 26.87*** 8.99*** 7.96***
M*C*T 80 1.98*** 16.53*** 3.93*** 2.36*** 2.18***
Error 322
CME 2948.915 17099.8 0.01027700 0.0454436 521690
C.V. (%) 11.24407 13.13519 14.70812 11.65991 18.34778

Fuente de
variacin
Grados
de
libertad
Fe (ll)
(mg/L)
Fe(lll)
(mg/L)
Fe Total
(mg/L)
Microorganismos
(Clulas/mL)
Protenas
totales
(g/L)
Tratamientos 163
Microorganismos
(M)
5 52.48*** 179.97*** 202.79*** 3515.71*** 11.05***
Fuente de
energa (C)
2 1652.16*** 5182.50*** 1307.48*** 455.76*** 23.83***
Tiempo (T) 8 114.71*** 17.58*** 85.88*** 1136.72*** 27.67***
Repeticin (R) 2 1.10 NS 1.34 NS 0.03 NS 0.95 NS 1.96 NS
M*C 10 25.00*** 135.86*** 6.43*** 40.09*** 10.42***
M*T 40 5.95*** 8.81*** 75.30*** 50.78*** 6.49***
C*T 16 30.82*** 49.51*** 11.90*** 17.61*** 2.61 NS
M*C*T 80 4.05*** 5.26*** 4.83*** 7.99*** 3.92***
Error 322
CME 0.0571378 0.0152755 0.0598543 0.062253 0.1438972
C.V. (%) 10.61148 3.878380 8.463365 3.487970 40.39052
CME = Cuadrado medio del error. CV =Coeficiente de variacin.
NS = No significativo *** Significativo al 1%



115
Cuadro 22. Efecto de los microorganismos sobre las variables medidas
durante la biolixiviacin de los jales
Tipo de
microorganismos
pH ORP
(mV)
In Sulfato
(mg/L)
Acidez
(%)
Microorganismos
(clulas/mL)
C. M. S. 1.58 c
1
565 a 1031.2 a 84.19 a 6.41E+07 b
Mezcla (B, H y L) 1.66 bc 485 b 982.8 b 66.58 c 3.05E+08 a
Bacterias
(Thiobaciillu sp)
1.72 b 493 b 928.3 c 75.10 b 3.64E+07 c
Hongos (Penicillium
sp)
1.74 b 496 b 1031.0 a 67.75 c 3.98E+07 c
Levaduras
(Rhodototurulla)
1.66 bc 473 b 958.0 bc 67.80 c 3.92E+07 c
Testigo (CN) 2.58 a 386 c 645.0 d 52.13 d 7.49E+03 d

Tipo de
microorganismos
Protenas
totales
(g/L)
Fe (ll)
(mg/L)
Fe (lll)
(mg/L)
Fe (Total)
(mg/L)
Azufre
(mg/L)
C.M S. 8.0 a
1
345.4 d 3278.8 a 3624.2 a 4631.1 a
Mezcla (B, H y L) 7.8 a 788.44 c 1902.2 b 2690.6 cd 3770.6 c
Bacterias
(Thiobaciillu sp)
5.0 b 987.0 bc 1839.4 b 2928.5 c 3963.0 bc
Hongos (Penicillium
sp)
7.0a 1089.0 b 1837.8 b 3299.4 b 4134.8 b
Levaduras
(Rhodototurulla)
5.6 b 1467.0 b 1687.8 b 2674.8 d 3859.2 bc
Testigo (CN) 1.9 c 1573.0 a 959.0 c 2531.8 d 3261.0 d
1
Medias entre columnas seguidas con la misma letra son estadsticamente iguales (Tukey 0.05).
C M S =Consorcio de Microorganismos Seleccionados
B H L =Bacterias Hongos Levaduras
CN =Consorcio Natural



Asimismo, fue analizada la fuente de energa como factor de variacin sobre
las mismas variables (Cuadro 23). Es decir, que se analiz el efecto de los
tratamientos sin fuente adicional de energa (solo jales), con sulfato ferroso y sulfato
ferroso con extracto de levadura como fuentes de energa. El pH ms bajo fue donde
se utiliz el sulfato ferroso con extracto de levadura y ms alto en donde no se
adicion ninguna fuente de energa. El ORP ms elevado fue obtenido para el cultivo
sin fuente de energa, mientras que el ms alto para el cultivo con sulfato ferroso. Por
otro lado, tanto en las variables in sulfato y acidez, como en los microorganismos, los
comportamientos fueron similares, ya que las cantidades ms grandes se
manifestaron en el sulfato ferroso con extracto de levadura que en los otros factores.


116
Cuadro 23. Efecto de la biolixiviacin de los minerales de sulfuro de los jales
con las tres diferentes fuentes de energa
Fuentes de
energa
pH
ORP
(mV)
In Sulfato
(mg/L)
Acidez
(%)
Microorganismos
(clulas/mL)
Sin fuente de
energa
2.27
1
a 462 b 677.86 c 34.0 c 4.90E+06 c
Sulfato ferroso 1.68 b 498 a 1132 b 81.8 b 1.73E+07 b
Sulfato ferroso y
Extracto de
levadura
1.52 c 488 a 1176 a 91.0 a 3.34E09 a

Fuentes de
energa
Protenas
(g/L
Fe (ll)
(mg/L)
Fe(lll)
(mg/L)
Fe (Total)
(mg/L)
Azufre
(mg/L)
Sin fuente de
energa
5.0
1
c 37.87 c 489.4 c 527.3 c 2163 c
Sulfato ferroso 6.1 b 2304.9 a 2359.5 b 4664.4 a 4950 a
Sulfato ferroso y
Extracto de levadura
8.5 a 782.0 b 2902.0 a 3683.0 b 4780 b
1
Medias entre columnas seguidas con la misma letra son estadsticamente iguales (Tukey 0.05).

En el Cuadro 24, se observa la evolucin que manifestaron las variables
estudiadas en el experimento a travs del tiempo. A travs de estos resultados se
confirma de manera estadstica a las tendencias de la evolucin del proceso de
oxidacin microbiana de los minerales sulfurosos presentes en los jales: disminucin
del pH y de la concentracin de ion ferroso disuelto; mientras que el ORP, acidez,
concentracin de ion sulfato, frrico y nmero de clulas, incrementaron con el avance
de las cinticas. Con relacin al Fe total, los valores ms altos se dieron durante los
primeros veinte das y la concentracin fue disminuyendo con el tiempo hasta los
cuarenta y cinco das de incubacin. Esta disminucin en la concentracin de hierro
disuelto, debe estar asociada a la formacin de jarosita
6 4 3
) )( ( OH SO KFe , que fue
observada como producto de la fase slida, a partir de los treinta y cinco das de
incubacin, en los tratamientos donde se usaron los cultivos mixtos. Este compuesto
no fue detectado en ningn otro tratamiento (Plantilla 30 del anexo).
De acuerdo a los resultados del anlisis del experimento, se observ que, las
diferencias que se obtuvieron en las concentraciones de las distinas variables
medidas, desde el origen del experimento, hasta los cuarenta y cinco das de
incubacin, fueron positivos y altamente significativas.


117
Cuadro 24. Efecto del tiempo de reaccin en la biolixiviacin de los jales con
las tres diferentes fuentes de energa (se consideran los
resultados de todas las pruebas, incluyendo distintas fuentes de
energia y distintos cultivos).
Tiempo de
incubacin
pH
ORP
(mV)
In Sulfato
(mg/L)
Acidez
(mg/L)
Microorganismos
(clulas/mL)
5 2.25
1
a 272 e 735.10 e 27.81 f 5.06E+07 bc
10 2.15 a 296 e 778.26 de 27.81 f 6.04E+07 b
15 1.95 b 466 d 829.44 d 46.82 e 4.74E+07 c
20 1.82 c 522 c 837.24 d 55.01 d 1.21E+09 a
25 1.81 c 530 c 959.14 c 77.26 c 1.15E+09 a
30 1.79 cd 551 bc 1046.90 b 86.40 b 1.02E+09 a
35 1.67 de 586 a 1073.69 b 91.78 b 1.80E+06 d
40 1.65 e 567 ab 1312.03 a 9834 a 5.24E+05 e
45 1.32 f 553 bc 1388.08 a 97.53 a 1.25E+04 f

Tiempo de
incubacin
Protenas
(g/L)
Fe (ll)
(mg/L)
Fe (lll)
(mg/L)
Fe (Total)
(mg/L)
Azufre
(mg/L)
5 2.8 c
1
2.8954 a 2.3514 g 3.2864 a 3703.4 cd
10 4.8 b 2.7144 b 2.4859 f 3.2731 a 3511.2 e
15 7.3 ab 2.4141 c 2.7252 e 3.2185 b 3134.2 f
20 11.8 a 2.1524 d 2.8597 d 3.2129 bc 3050.1 f
25 11.0 a 2.1180 d 3.0211 c 3.2053 bc 3972.4 cd
30 8.4 a 2.0994 de 3.0842 bc 3.1646 cd 5955.6 a
35 7.8 ab 2.0277def 3.1455ab 3.1253 cd 4584.9 b
40 7.6 ab 1.9631 ef 3.1460 ab 3.1041 e 4070.9 b
45 1.9 c 1.8884 f 3.1974 a 3.0905 e 3446.9 e
1
Medias entre columnas seguidas con la misma letra son estadsticamente iguales (Tukey 0.05).



119
V DISCUSIN

En este trabajo se realiz el muestreo de residuos, agua y suelos en una
presa de jales donde se depositan residuos que contienen minerales sulfurosos,
adems de xidos de hierro y silito-aluminatos. En este sitio se identificaron
ambientes cidos, tanto en el agua como en suelo, alcanzando valores de pH hasta
de 1.20, favorecindose entonces las condiciones para el desarrollo de
microorganismos acidoflicos que catalizan la oxidacin de los sulfuros como fuente
de energa. El anlisis del cuadro 10 donde se reporta la composicin de las aguas,
denota la generacin de DAM, dados los valores de pH y potencial rdox reportados,
adems de la alta concentracin de Fe y SO
4
disueltos. Incluso, en el caso del Fe, la
mayor proporcin es ion ferroso (82% en promedio), lo que sugiere reacciones del
tipo (Sand et al., 2001):

H SO Fe O H O FeS
ismos microorgan
2 2
2
7
2
4
2
2 2 2
(1)
Mientras que la presencia de los elementos alcalinotrreos (Ca, Na, etc.),
debe ser precisamente resultado de la disolucin cida de los silito-aluminatos, por
reacciones del tipo (Blowes y J ambor, 1994):
Muscovita:
4 5 2 2 2 2 10 3 2
) (
2
3
2
3
) ]( [ OH O Si Al K O H H OH O AlSi KAl

(2)
Albita:
4 5 2 2 4 4
2
2 8 3
) (
2
1
2
2
9
OH O Si Al SiO H Na O H H O NaAlSi

(3)
El pH de los suelos, jales y aguas reportados durante los tres muestreos, es
tambin indicativo de la generacin de DAM, lo cual se confirma por la coloracin
rojiza puesta en evidencia en la mayora de los escurrimientos que derivan de la
presa de jales. La coloracin rojiza, debe ser consecuencia de la hidrlisis del ion
frrico producido durante el DAM, de acuerdo a las reacciones (Sand et al., 2001):
O H Fe H O Fe
ismos microorgan
2
3
2
2
2 4 4 4

(4)

H OH Fe O H Fe 3 ) ( 3
3 2
3
(5)
Sin embargo, en algunos puntos de muestreo, se detectaron precipitados de
coloracin verde, acompaados de olores caractersticos de H
2
S. Esto, podra ser

120
consecuencia de la disolucin cida de la pirrotita (Fe
1-X
S), el segundo sulfuro de
hierro caracterstico de estas mineralizaciones:
S H Fe H FeS
2
2
2

(6)
Por ms de cinco dcadas se han estudiado a los microorganismos
acidoflicos que participan en los procesos de oxidacin de sulfuros, enfocndose los
estudios la mayor parte del tiempo hacia los quimiolitotrficos, particularmente a
Thiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum ferrooxidans. Sin embargo, en estudios
recientes, se han identificado una mayor variedad de microorganismos en estos
ambientes cidos, entre los que se incluyen varias especies de hetertrofos,
reconocindose incluso que algunos de estos juegan un papel importante en la
oxidacin de los sulfuros y la conservacin de los ambientes cidos (Baker et al.,
2003).
La caracterizacin de las muestras de suelo y agua, as como la composicin
de los jales, demuestra que se tienen las condiciones para la proliferacin de
microorganismos que emplean los componentes minerales como fuente de energa o
que propician el ambiente para su desarrollo. Por ello, se realiz un trabajo de
aislamiento y caracterizacin de microorganismos recuperados del sitio en estudio,
donde predominan ambientes cidos, esto con fin de evaluar su capacidad de oxidar
las especies reducidas de hierro o azufre.
El aislamiento y cultivo de los microorganismos se realiz manteniendo
condiciones similares a las de su ambiente de procedencia con el fin de asegurar su
actividad metablica. Gracias a ello, se pudo obtener un consorcio de
microorganismos a partir del cual se aislaron y seleccionaron cultivos de bacterias,
hongos, levaduras y otros eucariotas, todos ellos con capacidad para crecer en el
medio cido. De estos cultivos, fue posible seleccionar y caracterizar fenotpicamente
aquellos que mostraron una mejor adaptacin a las condiciones de cultivo,
destacndose bacterias posibles Thiobacillus sp., hongos posibles Penicillium sp. y
levaduras posibles Rhodotorula sp.
Adems, se demostr la capacidad por disolver minerales que tienen los
microorganismos hetertrofos acidoflicos con los que se trabaj, de una manera
similar a lo reportado por varios autores (Rezende et al., 1999; Brandl et al., 2001;
Gross y Robbins, 2000; Miadokova et al.,.2000; Schneegurt et al., 2001), para la

121
biolixiviacin de minerales empleando microorganismos hetertrofos. Al parecer la
presencia de microorganismos hetertrofos, tienen inferencia metablica en el DAM,
aun cuando los niveles de carbono orgnico sean bajos. Este hecho coincide con los
resultados del trabajo que realizaron Bacelar-Nicolau y J ohnson (1999).
Sin embargo, tambin se demuestra aqu que la diversidad de
microorganismos es muy amplia en este ambiente cido, contrario a lo esperado, de
que los microorganismos quimiolitotrficos tipo Thiobacillus sean los ms
abundantes.
Desde el inicio del trabajo, se demostr que los microorganismos hetertrofos
tienen tanta capacidad para aprovechar la oxidacin del ion ferroso, como los
quimiolitotrficos (fig. 6 y 7), de ah que se haya decidido encontrar las mejores
condiciones para mejorar el crecimiento y actividad oxidante por tipo de
microorganismo (bacterias, hongo o levadura) y para el cultivo mixto.
La oxidacin de especies reducidas de hierro y azufre realizada por bacterias,
ya fue demostrada por Blais et al, (1993). En este trabajo se mostr la correlacin
entre el incremento de biomasa y de la concentracin de iones sulfato y Fe(II), as
como un decremento en el pH en los tratamientos donde se adicion cultivo de
microorganismos. Esto se explica por las reacciones (1) y (4), caractersticas de
estos ambientes (Sand et al., 2001).
En este trabajo de tesis, se observ para casi todos los bioensayos realizados
una tendencia general similar de la evolucin de los parmetros indicadores de la
oxidacin del ion ferroso y la produccin de cido, que resultan de las tres reacciones
anteriores: disminucin de la concentracin de Fe(II), disminucin del pH, incremento
de acidez, proliferacin celular, incremento de potencial rdox e incremento de las
concentraciones en solucin de Fe(III) y SO
4
2-
.
El descenso del pH de 2.0 a 1.3 y la produccin de sulfato, ocurrieron
simultneamente a travs del tiempo. Al final de los experimentos, virtualmente todo
el Fe(II) ha sido oxidado a la forma Fe(IIl). Esto no se observ en los controles (no
inoculados), durante los 45 das de incubacin, lo que confirma el papel importante
que realizan los microorganismos. En un ambiente cido donde existe la presencia
de microorganismos, el ion ferroso formado durante la oxidacin de la pirita (FeS
2
)
presente en los jales sulfurosos, posiblemente sea una de las causas que incremente

122
la velocidad de oxidacin biolgica de estos minerales, al favorecerse la produccin
de Fe (III) y la consecuente oxidacin frrica del sulfuro:

H SO Fe O H Fe FeS 16 2 15 8 14
2
4
2
2
3
2
(7)
La velocidad de oxidacin est sujeta en esencia a las condiciones del medio
ambiente, puesto que los microorganismos deben encontrar las condiciones de
sustrato (en este caso, ion ferroso o pirita), de temperatura y de humedad. Como se
observ en este trabajo, durante mayo y septiembre, fueron los meses donde se
obtuvo el pH mas bajo, esto es, donde hubo mayor produccin de H
+
, generados por
la actividad microbiana, puesto que en estos meses se tienen condiciones climticas
ms favorables para la proliferacin de los mismos (temperatura, humedad y aporte
de nutrientes). Un resultado similar tambin fue reportado por Haack y Warren
(2003).
En este caso, los microorganismos con los que se trabaj, fueron aquellos que
se manifestaron sobre un material slido y adems, los que se mantuvieron
presentes cada vez que se realiz el sub-cultivo a partir de la colonia en la resiembra
a material nutritivo fresco. Caso que no se repiti con numerosos microorganismos
que se visualizaron en medio lquido y microscopio.
Sin duda alguna, los micro-nutrientes sugeridos por Silverman y Ludgren
(1959) para microorganismos quimiolitotficos y por J ohnson (1995) para
hetertrofos fueron exitosos para el aislamiento de ellos en este trabajo. Es
importante sealar que la cuantificacin de los microorganismos de ambas
modalidades nutricionales se realiz con los que se encontraron en solucin y los
que crecieron en medios slidos. Debido a que se ha sugerido, que durante la
oxidacin de los compuestos reducidos de azufre en la biolixiviacin (sulfuros
minerales), es mediada por la reduccin de los iones Fe (lll) a Fe(II), lo cual es
importante en la participacin de polmeros extracelulares de microorganismos y la
proliferacin de biopelculas sobre el soporte mineral (Tributsch, 2001). La formacin
de estos biopolmeros permite a los microorganismos adherirse a los substratos
sulfurosos para realizar la oxidacin de los compuestos, generando fuentes de
energa para su metabolismo (Sand et al., 1995; Ingledew, 1982).
Cuando se realizaron los bioensayos para elegir a los microorganismos ms
eficientes en la oxidacin, los que aqu destacaron fueron los identificados como

123
posibles Thiobacillus, Penicillium sp y Rhodotorula sp. (figuras 24 a 26). Esta
actividad oxidativa de los microorganismos mencionados, ya ha sido citada por otros
trabajos, donde hacen referencia de su eficiencia no solo para oxidar al hierro, sino
tambin por su capacidad para tolerar concentraciones altas de metales, que para
muchas especies incluyendo al hombre, son txicas (Schneegurt et al., 2001; Gross
y Robbins, 2000; Rezende et al., 1999; Acharya et al., 2003). Adems, los cultivos
mixtos con hetertrofos acidoflicos, en la actualidad se estn considerando como el
futuro para los procesos de biolixiviacin (Ehrlich, 2001).
En las reacciones de oxidacin, tuvieron un papel importante, ya que estos
fueron integrantes del consorcio de microorganismos seleccionado (CMS), adems
de los protozoarios (Plantilla 23 en anexo), que ya se han reportado tener un papel
importante en estas reacciones (J ohnson y Rang, 1993; Brake et al., 2001), tambin
las bacterias, hongos y levaduras, Aspergillus sp, Mucor sp y Saccharomyces sp,
ademas de Penicillium sp, Rhodotorula sp, Thiobacillus ferrooxidans y T. thiooxidans.
A lo que se le puede atribuir en su funcionalidad sinergtica destacada con respecto
al resto de microorganismos. Adems de estos, en el agua cida tambin se
encontraron microorganismos muy similares a los descritos por Bacelar-Nicolau y
J ohnson (1999), los que denominaron serpentines cidos (Plantilla 24 en anexo).
Por otra parte, las concentraciones altas de acidez no solo son producto de la
concentracin de protones, por la oxidacin de la pirita o por la oxidacin del Fe (ll) a
Fe (lll) y posterior hidrlisis de este ltimo, sino tambin por la acumulacin de los
compuestos cidos formados como resultado metablico de los microorganismos
hetertrofos, tales como cido ctrico, cetoglutrico, frmico y lctico atribuido a
hongos y levaduras (Burgstaller y Schinner, 1993). Estos compuestos cidos, se
encuentran en la solucin en forma no disociada, no producen inhibicin para los
microorganismos quimiolitotrficos, reportndose que de esta forma son
transportados a travs de la membrana celular. Cuando estn internamente en el
citoplasma, se disocian para ser utilizados por la clula en sus procesos biosintticos
(Alexander et al., 1987).
La explicacin del porque se obtuvo mayor oxidacin en el medio esterilizado
y no en los no esterilizados, fue posiblemente porque los jales (usados como
substratos) estuvieron sometidos a un proceso de deshidratacin intensa a

124
temperatura menor de 40 C, para eliminar la mayor cantidad de microorganismos
mesoflicos nativos. Adems, al someter a los jales a mayores temperaturas en
medio acuoso, durante la esterilizacin, se produce una oxidacin qumica superficial
de los minerales sulfurosos produciendo iones ferrosos (Mustin et al., 1992), que al
adicionar el sulfato ferroso, incrementa la concentracin del Fe(ll) en solucin y por lo
tanto la disponibilidad para los microorganismos en la prueba (Tonniazo, 1998). Una
vez agotada la fuente de energa, los microorganismos pasaran a obtenerla de los
minerales sulfurosos, a los cuales tienen que adherirse para iniciar el proceso
oxidativo.
Fue evidente la adaptacin de los microorganismos aislados en estudio hacia
los substratos adicionados, puesto que la velocidad de oxidacin durante el
experimento de biolixiviacin final fue significativamente mas rpida (6.62 mg.h
-1
) que
cuando se sometieron al proceso de adaptacin a las diferentes fuentes de energa
(1.5X10
-3
mg.h
-1
).
La comprensin de las reacciones qumicas que se dieron en el sistema,
podran explicarse de la manera siguiente: la contaminacin del agua puede ser
provocada por la intemperizacin fsica y qumica de los sulfuros en los depsitos de
jales. El principal mineral proveedor de energa acumulado en los jales, es la pirita,
por lo que el nivel de acidez y la concentracin de metales contaminantes en el
drenaje de las minas pueden estar directamente correlacionados con la cantidad de
pirita que se encuentre en el rea de los depsitos y la actividad de los
microorganismos. Los procesos geoqumicos implicados en la oxidacin de la pirita,
producen iones ferrosos e hidrgeno, as como electrones disponibles para los
microorganismos como fuente de energa (reaccin 1). Enseguida, tanto el ferroso
como el hidrgeno son oxidados nuevamente para producir iones frricos (reaccin
4). Los iones frricos con el agua producen hidrxido frrico y nuevamente protones
(5). Al combinarse la pirita con el in frrico y el agua, producindose in ferroso,
sulfato y buena proporcin de protones y electrones para utilizarlos como fuente de
energa durante el transporte de electrones (7). Cuando se combina el hidrxido
frrico con el sulfato en solucin se obtienen hidroxi-sulfatos frricos, de acuerdo a la
reaccin (8).
O H SO OH Fe SO H OH Fe
2 4
2
4 3
2 ) ( 2 ) (

(8)

125
Cuando el ion frrico formado como producto de la oxidacin del ferroso se
combina con el agua vuelve a producir hidrgenos que acumulados con las
reacciones anteriores, incrementando la concentracin de estos iones y ocasiona
que el pH del agua disminuya.
Una prueba de los resultados de estas reacciones que se puede mencionar en
este trabajo, fue la formacin de jarosita
6 4 3
) )( ( OH SO KFe , como producto de la fase
slida de los precipitados que se obtuvieron, donde se trabaj con los cultivos mixtos
(Plantilla 30 en anexo). El hidrxido frrico, precipitado cristalizado llamado tambin
hidroxi-sulfato, cuando lleg a su punto de saturacin, al incrementarse
sustancialmente la oxidacin del sulfato ferroso. Este precipitado, tambin se ha
encontrado en las aguas residuales de las minas por la oxidacin del Fe (ll) (Ivarson
y Sojak, 1978; Bigham, 1990).
La accin definitiva de los microorganismos en las reacciones de precipitacin
y solucin qumica, an no esta clara. Lo que si est claro, es que existe un amplio
espectro de microorganismos con requerimientos de energa tambin muy amplia. Lo
que se traduce, en un panorama importante y prometedor para continuar estudiando
sus procesos biolgicos en aras de prevenir y mejorar las condiciones ambientales,
as como mejorar los proceso biolgicos de lixiviacin en la recuperacin o extraccin
de los metales y la posibilidad de disminuir los costos al mejorar la actividad
microbiana.
Por otro lado, los microorganismos ms abundantes en la solucin de las
operaciones de biolixiviacin de los jales, que se encontraron en este trabajo, fueron
los hetertrofos acidoflicos, donde se incluyeron bacterias, hongos, levaduras y
protozoarios. Estos hallazgos ya se han reportado en trabajos anteriores por Ehrlich
(1963), Lpez-Archilla et al., (1995); J ohnson y Roberto (1997); Marchand y
Silverstein (2002); Marchand y Silverstein (2003). En estas investigaciones se
observ, que el ataque de los minerales sulfurosos pudo haberse ocasionado por la
presencia del cido sulfrico, generado desde el azufre por Thiobacillus thiooxidans,
pero tambin, por los cidos orgnicos generados por los hetertrofos.
Esta hiptesis concuerda con los resultados en este trabajo, debido a que
podra ser la explicacin respecto a los valores altos de acidez (>80%) obtenidos en
los resultados con el consorcio de microorganismos seleccionado. De aqu, que

126
podran dirigirse ms investigaciones, fundamentalmente hacia la lixiviacin de
xidos de minerales, minerales sulfurosos, carbonatos y silicatos presentes en los
jales.
Sin duda, como lo demuestra este trabajo, la actividad combinada de
microorganismos quimiolitotrficos y heterotrficos puede mejorar la oxidacin de la
pirita, por lo que se abre una nueva rea de oportunidad para este tipo de cultivos.
A partir de los resultados presentados y de la discusin arriba descrita, se
confirma la importante influencia de la actividad microbiana en la generacin de DAM
observado en la presa de jales donde se recuperaron las muestras para el
aislamiento de los microorganismos. Entonces, la prevencin de la generacin de
DAM puede realizarse inhibiendo la actividad oxidativa microbiana, lo cual puede
efectuarse: (i) adicionando agentes biolgicos o qumicos inhibidores de la actividad
microbiana, por ejemplo, sulfato de cobre o plata; o (ii) impidiendo el transporte de
oxgeno hacia el sistema, lo cual se logra cubriendo los residuos con agua o con una
cubierta de suelo impermeable. De estas opciones, la hasta ahora ms practicada es
el recubrimiento de los jales dada su mayor factibilidad tcnica y econmica.
Por otra parte, el aislamiento de estos microorganismos con capacidad para
promover la oxidacin de los sulfuros de hierro, abre una nueva rea de oportunidad
para estudiar su potencial empleo en procesos industriales de biolixiviacin. Sin
embargo, un estudio en este sentido debe aun comprender la evaluacin de su
capacidad oxidativa bajo condiciones de mximo rendimiento (alto contenido de
slidos y mayores limitaciones de sustrato).










129
CONCLUSIONES


Se realiz un muestreo de residuos (jales), suelos y agua de proceso en un
sitio minero con evidencias de generacin de Drenajes cidos de Mina (DAM), con el
propsito de evaluar el efecto de bacterias nativas quimiolitotrficas y heterotrficas
procedentes de los depsitos residuales sobre el proceso de disolucin oxidativa de
minerales sulfurosos presentes en los jales y por tanto, en la produccin de
condiciones de acidez del medio.
En este trabajo se obtuvieron inicialmente las condiciones para aislar y
caracterizar algunos de la gran diversidad de microorganismos que conforman la
comunidad microbiana en un ambiente extremadamente cido (pHs <2). A travs
del estudio de los productos de reaccin, se reconocieron algunas de las reacciones
de oxidacin de minerales que favorecen las condiciones cidas del medio, donde
los microorganismos participan de manera particular. Se demostr que la oxidacin
de los minerales sulfurosos presentes en los jales, puede llevarse a cabo en estos
ambientes extremos mediante mecanismos que combinan efectos tanto qumicos
como biolgicos.
A travs del trabajo, se diferenci la capacidad oxidativa de los
microorganismos aislados del Fe (ll) a Fe (lll), tanto de manera independiente cmo
en cultivos puros, mixtos y en un consorcio seleccionado. Se demostr que las
reacciones biolgicas, son catalizadas por la presencia de los microorganismos,
comprobando la importancia de la actividad bioqumica, la cual se vio favorecida por
el crecimiento y actividad bioqumica complementaria de los microorganismos
quimiolitotrficos y heterotrficos.
Se concluye que al conocer esta parte de su naturaleza biolgica, se puede
asumir que, cuando proliferan estos microorganismos, se favorecen reacciones
oxidativas en presencia de especies reducidas de azufre y hierro, lo cual provoca la
conversin de los ambientes cidos. Esta situacin puede ayudar a que se liberen
metales en la solucin, o bien a quedarse sobre la superficie mineral, lo cual puede
provocar situaciones con potencial de impacto como contaminante ambiental. Este
130
proceso qumico-biolgico que se propicia en el sistema, no es favorable para la
mayora de las comunidades biolgicas, incluyendo al hombre.
Tambin, se concluye que la pirita presente en los jales, sirvi como fuente de
energa, al liberar electrones durante la oxidacin del Fe (II) al estado Fe (III), para el
crecimiento de los cultivos microbianos nativos. Lo que demostr, que aunque de
manera lenta segn las condiciones del medio ambiente, tanto la actividad oxidativa
de los compuestos reducidos de azufre y hierro, el incremento a la acidez como el
descenso del pH siguen su curso Con esto, se demostr el rol importante que tienen
los microorganismos nativos en el cambio de condiciones en sus nichos ecolgicos.
Por otra parte, cuando se adicion sulfato ferroso y extracto de levadura como
fuente de energa, se aceler significativamente la actividad oxidativa. Concluyendo
que al oxidar los compuestos de hierro en el ambiente y si existe la presencia de
compuestos orgnicos y son empleados para su desarrollo, el ambiente resultara
ms cido y por lo tanto con mayor riesgo de toxicidad.
El estudio se concret en aislar, caracterizar y evaluar la capacidad oxidativa
de algunos microorganismos quimiolitotrficos y heterotrficos nativos durante el
proceso de biolixiviacin y en cultivos continuos. Por lo que, sera importante realizar
la identificacin de los microorganismos que se mantuvieron como cepas y seguir
evaluando sus capacidades oxidativas con concentrados de hierro.
Adems, se requiere la substancial bsqueda de formulaciones con
contenidos nutricionales especficos que puedan estar disponibles para los diferentes
microorganismos nativos de este tipo. Principalmente, para que se desarrollen y
manifiesten sobre un medio slido con mayor eficiencia. Lo que permitira conocerlos
mejor al realizar pruebas ms sensibles metablicamente para identificar su fenotipo
a travs de las observaciones microscpicas.
Sera importante probar al consorcio de microorganismos nativos de la presa
de jales, en la biolixiviacin de sus contenidos sulfurosos a travs de columnas y en
condiciones fsico-qumicas controladas. Tambin este estudio, aporta informacin
relevante sobre la velocidad de oxidacin de los substratos, de acuerdo a los cultivos
de microorganismos en prueba, a la concentracin de lixiviados en los jales as como
a sus diferentes fuentes de energa adicionadas.
131
Vll LITERATURA CITADA


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