Moran Paola

1.
INTRODUCCIN
Salto de seccin (Continua)

La propagacin de plantas consiste e efectuar su multiplicacin por medios tanto
sexuales como asexuales. La reproduccin asexual, consiste en la propagacin
empleando partes vegetativas de la planta original, es posible porque cada clula de
la planta contiene la informacin gentica necesaria para generar una nueva planta,
esta caracterstica se conoce como totipotencia celular (HARTMANN y KESTER,
1995).

Dentro de los mtodos asexuales, se tiene la propagacin de cultivos in vitro tales
como cultivo de vulos, embriones, semillas, polen, esporas, cultivos de pice, micro
injertos, clulas y tejidos.

La micropropagacin, consiste en producir plantas a partir de porciones muy
pequeas de ellas, de tejidos o clulas cultivadas aspticamente en un tubo de
ensayo o en otro recipiente, donde se puedan controlar estrictamente las
condiciones del ambiente y la nutricin (HARTMANN y KESTER, 1995). Estos
sistemas de propagacin requieren de instalaciones como laboratorios y personal
adiestrado para la realizacin de las labores.

Esta tcnica se ha convertido en una alternativa importante dentro de los mtodos
convencionales de propagacin en una amplia gama de especies (HARTMANN y
KESTER, 1995), y se compone de cuatro etapas secuenciales: establecimiento,
proliferacin o multiplicacin, enraizamiento y aclimatacin (BOUTHERIN y BRON,
1994).

Una planta que se ha originado in vitro, difiere en muchos aspectos de las que se
forman in vivo (PIERIK, 1990), ya que sus condiciones tanto ambientales como del
sustrato, la luz, nutricin, son muy diferentes. Adems es importante sealar que el
crecimiento in vitro es hetertrofo e in vivo auttrofo.
El ambiente in vitro, con una alta humedad relativa, bajo o nulo intercambio
gaseoso, escasez de CO
2
durante casi todo el perodo, produccin de etileno y baja
densidad fotosinttica, induce perturbaciones en las plantas desarrolladas bajo esa
condicin. Despus de transferir las plantas al ambiente ex vitro, las plantas tienen
que corregir todas esas anormalidades para aclimatizarse al nuevo ambiente, ya
sea en invernadero o campo (KADLECEK et al., 2001). Por otra parte, la anatoma
de la hoja es influenciada por la luz y la humedad, diferencindose anatmicamente
de las originadas in vivo (BRAINERD et al., 1981).

Debido a esto, la aclimatacin es un factor importante en la posterior supervivencia
de la planta, ya que es una etapa crtica dentro del proceso, en la que se produce la
mayor prdida. En ella se debe comenzar reduciendo gradualmente la humedad
relativa, para permitir con esto adems del cierre estomtico, una mejor formacin
de cutcula y disminuir la prdida de agua. Por otra parte, para tener mejores
resultados en el establecimiento in vivo es necesario el desarrollo radicular in vitro
(PIERIK, 1990).

La disminucin de la humedad relativa al interior del tubo de cultivo y con ello el
incremento de la ventilacin, parece tener un mayor efecto en vid, reforzando el
funcionamiento estomtico y con esto permitir un mejor control de la prdida de
agua por parte de las hojas (GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO, 2001).

Existen varios informes que detallan las etapas in vitro de las vides, pero se ha dado
una escasa atencin a la etapa de la aclimatacin. Comparado con otras especies
leosas, la sobrevivencia de las vides micropropagadas es relativamente baja
(THOMAS, 1998).

En cuanto al cerezo, diversos son los estudios realizados a nivel mundial en
bsqueda de nuevas variedades y portainjertos. La propagacin in vitro, ha surgido
como una alternativa importante dentro de la multiplicacin de patrones. Es por ello
interesante el estudiar el comportamiento de esta especie, durante la etapa ms
complicada de la micropropagacin, la aclimatacin, para generar antecedentes y
facilitar el proceso a futuro.

Es por ello, que en este estudio se propone, mediante la preaclimatacin en cmara
de crecimiento, con el uso de sellos en los frascos de cultivo, permitir una mayor
ventilacin y la disminucin gradual de la humedad relativa, para as disminuir el
estrs hdrico sufrido por las plantas al momento del trasplante, mediante un mejor
funcionamiento estomtico y aumentar con esto la sobrevivencia in vivo, permitir
una aclimatacin ms fcil y hacer ms comercial el proceso.

Adems, se realizar un estudio histolgico de hoja en vid, para analizar la
evolucin de los estomas en los estados secuenciales de la propagacin in vitro,
para entender desde un punto de vista descriptivo su funcionamiento, y cmo
influyen en la tasa de sobrevivencia durante la aclimatizacin.

Objetivos:

1.- Evaluar distintos sistemas de sellado en la preaclimatacin de plantas de vid y
cerezo Gisela 5 propagadas in vitro, que conduzcan a una adecuada etapa de
aclimatizacin.

2.- Evaluar la sobrevivencia de las plantas de vid y cerezo Gisela 5 propagadas in
vitro preaclimatadas, en la etapa de aclimatizacin.

3.- Analizar mediante el uso de fotografas de cortes histolgicos, la condicin en la
que se presentan los estomas en cada uno de los estados secuenciales de la
propagacin in vitro de vid.

2. REVISIN BIBLIOGRFICA.

2.1. Cultivo in vitro:

El trmino cultivo in vitro se aplica a todo cultivo bajo cristal en medio asptico, pero
incluye diversas tcnicas cuyos mtodos y fines son muy diferentes. La tcnica
general consiste en tomar un fragmento de tejido vegetal, colocarlo en un medio
nutritivo y provocar (gracias a un equilibrio adecuado de los elementos del medio)
directamente o tras manipulacin el desarrollo de una plntula. El conjunto de estas
operaciones se desarrolla en condiciones estriles y se seguir por una
aclimatacin en medio tradicional (BOUTHERIN y BRON, 1994).

El cultivo in vitro es gracias a una propiedad de las clulas vegetales llamada
totipotencia celular, que significa que: toda clula vegetal viva con ncleo, capaz,
cual fuere su especializacin del momento, de reproducir fielmente la planta entera
de la cual proviene. Cada clula posee entonces la totalidad del patrimonio gentico
de la planta (BOUTHERIN y BRON, 1994).

HARTMANN y KESTER (1995) sealan una clasificacin general de los sistemas
de cultivo in vitro, utilizando sistemas aspticos y este es el siguiente: cultivo de
meristemas, microinjertos, pices de tallos, cultivo de tejidos o clulas (callos,
protoplastos, etc), cultivo de anteras, polen, vulos, embriones, semillas y esporas.

2.2. Micropropagacin:

El fin de la micropropagacin es el de reproducir en gran cantidad plantas idnticas
al pie madre, y no teniendo la micropropagacin influencia sobre la calidad sanitaria
de la planta propagada, es indispensable poseer como punto de partida un material
sano (BOUTHERIN y BRON, 1994).
Dentro de las ventajas sealadas por MARGARA (1988), permite propagar un gran
nmero de especies difciles de multiplicar, a menudo por los mtodos clsicos
puede realizarse con un nivel de proliferacin elevado en un estado precoz de
desarrollo, con frecuencia esta propagacin in vitro se une a la lucha fitosanitaria, ya
que las plantas obtenidas, son usualmente libres de virus, bacterias, hongos
parsitos, y constituyen un material de calidad.

Por su parte, BOUTHERIN y BRON (1994), sealan otras ventajas como mejorar la
seleccin, ya que a partir de un individuo notable, se puede comercializar
rpidamente un clon interesante, garanta de homogeneidad, adems limita o
suprime los pies madre y por consiguiente libera superficies de invernadero y
permite la programacin de cultivos a lo largo de todo el ao, o la produccin en
perodos muy precisos, sin que el nmero de pies madre o su estado por reposo
vegetativo tengan influencia y por ltimo, la formacin de un banco de genes que
podrn conservar especies o cultivares que ofrezcan un inters agronmico,
hortcola, industrial, ecolgico, etc.

THOMAS y SCHIEFELBEIN (2001) destacan la posibilidad de guardar stocks
durante aos, sin la prdida de potencial de multiplicacin con una serie de
subcultivos y el retorno de plantas normales al campo con caractersticas de adulto.

En cuanto a las desventajas MARGARA (1988) indica que se puede obtener
variantes distintas a la planta madre por su morfologa o fisiologa, la necesidad de
usar determinados tejidos para una especie dada, ya que se debe acudir a los
tejidos aptos para sintetizarlos en forma natural. Por su parte BOUTHERIN y BRON
(1994), mencionan el costo como desventaja ya que en una planta in vitro es ms
elevado que el de aquella multiplicada por mtodos tradicionales. Sin embargo, este
inconveniente se compensa con frecuencia con una ganancia de productividad, el
riesgo de mutacin porque la tasa de variabilidad es ms elevada, por ltimo, las
dificultades de xito, cierto nmero de vegetales se multiplican fcilmente in vitro,
otros permanecen rebeldes a esta tcnica, en especial en las especies leosas.
2.3. Propagacin in vitro:

2.3.1. Establecimiento

La vid es propagada convencionalmente usando estacas de madera dormante (36 a
46 cm de largo) recolectadas durante el invierno. Estas son plantadas durante la
primavera en contenedores, para posteriormente ser trasplantadas a la via. Este es
un proceso lento y limitado por estacionalidad para la propagacin de nuevos
cultivares, y la introduccin de nuevas especies exticas. Por esto, la
micropropagacin en vid, ha ofrecido un gran potencial para su multiplicacin en
cuanto a rapidez y la posibilidad de guardar stock de cultivos durante aos, sin la
prdida del potencial de multiplicacin (THOMAS y SCHIEFELBEIN, 2001).

LEWANDOSKI (1991) seala que las tcnicas para la propagacin de varias
especies y cultivares de Vitis incluyen organognesis y la proliferacin de brotes
axilares. Por su parte SAFFIE (2002), MESA (2001) y RAVINDRA y THOMAS
(1995), sealan el uso de segmentos nodales para micropropagacin.

Este mtodo de segmentos nodales ha producido un xito apreciable en muchas
plantas diferentes, entre ellas Vitis rupestris (PIERIK, 1990).

Con respecto al cerezo, MUNA et al. (1999), DAL ZOTTO y DOCAMPO (1997),
MILLER et al. (1982) y SNIR (1982), y utilizaron pices de yemas obteniendo muy
buenos resultados en el establecimiento y las fases sucesivas de la propagacin in
vitro de cerezos. Por otro lado DRADI, VITO y STANDARDI (1996) usaron
segmentos nodales que se comportaron satisfactoriamente.

PIERIK (1990) seala que el cultivo de segmentos nodales, consiste en el
aislamiento de una yema, junto con una porcin de tallo, para obtener un brote a
partir de una yema. Este es el mtodo ms natural de propagacin in vitro, ya que
tambin puede aplicarse in vivo. Cada una de las yemas que se encuentran en las
axilas de las hojas idnticas a las del pice del tallo, pueden ser aisladas sobre un
medio nutritivo, intentndose as su desarrollo in vitro.

Para el caso de vid, el establecimiento in vitro de los segmentos nodales, se realiza
en un medio de sales de MURASHIGE y SKOOG (1962) con macronutrientes y
micronutrientes reducidos a tres cuartos, ajustado a pH 5,3 (MESA, 2001).

2.3.2. Proliferacin

En cuanto a la proliferacin en vid, esta se realiza en base a un medio de sales de
MURASHIGE y SKOOG (1962) con la sal NH
4
NO
3
, reducida a la mitad y el resto de
las sales reducidas a tres cuartos, adicionando Tiamina (0,4 mg/l), BAP (1,1 mg/l),
NaH
2
PO
4
(170 mg/l), Myoinositol (100 mg/l), Sulfato de adenina (80 mg/l), Sacarosa
al 3%, y ajustado a pH 5,7 (MESA, 2001).

Con respecto a cerezo Gisela 5, la proliferacin se realiza en base a un medio de
sales de MURASHIGE y SKOOG (1962), suplementado con 0,5 mg/l de AIB y 1,5
mg/l de BAP (CCERES, 2004; VARGAS, 2003).

2.3.3. Enraizamiento

El enraizamiento in vitro de vid se realiza en base a un medio de sales de
4
NO
3
las sales reducidas a tres cuartos, adicionado con Tiamina (0,4%), AIA (0,2 mg/l),
NaH
2
PO
4
(150 mg/l), Myoinositol (25 mg/l), sacarosa al 1%, y todo esto ajustado a
pH 5,7 (MESA, 2001).

El enraizamiento en cerezo Gisela 5, tambin se realiza en base a sales de
MURASHIGE y SKOOG (1962) con una concentracin mineral reducida a la mitad
suplementado con 1 mg/l de AIB (CCERES, 2004).

PIERIK (1990) indica que un desarrollo pobre del sistema radical hace que el
crecimiento in vivo se haga muy difcil, especialmente cuando hay una elevada
transpiracin. Es de vital importancia que las plantas in vitro pierdan la menor
cantidad de agua posible, cuando pasan a condiciones in vivo.

El suministro de agua tambin podra estar limitado desde que estudios histolgicos
han demostrado una anatoma anormal de la raz en plantas crecidas in vitro (FILA
et al., 1998).

2.4. Aclimatizacin:

Aclimatacin y aclimatizacin son trminos que describen el proceso de adaptacin
de un organismo a un cambio ambiental. Aclimatacin es el proceso regulado por la
naturaleza y aclimatizacin el regulado por el hombre (BRAINERD y FUCHIGAMI,
1981).

La aclimatizacin de plantas in vitro a las condiciones naturales, es un paso crtico
para muchas especies y requiere tiempo e instalaciones caras que restringen la
aplicacin comercial de los procesos de micropropagacin. Estas plantas muestran
un rpido marchitamiento cuando se transfieren a condiciones de invernadero, por lo
tanto debe mantenerse una humedad relativa alta en el nuevo ambiente, para no
daar los mecanismos que mantienen el volumen de agua en la planta (FILA et
al.,1998).

Por su parte RAVINDRA y THOMAS (1995) sealan que la aclimatacin o
endurecimiento de plantas de cultivos in vitro, es el paso ms crtico en la
micropropagacin y que la supervivencia de vides micropropagadas es
relativamente baja comparada con otras especies leosas.

Los frascos, tubos de ensayo y matraces necesitan ser cerrados para impedir su
deshidratacin e infeccin, pero por otro lado, tiene que ser posible el intercambio
gaseoso con el exterior, para evitar una falta de oxgeno o el exceso de gases
producidos como el CO
2
y el etileno (PIERIK, 1990). ZOBAYED, ARMSTRONG y
ARMSTRONG (2001) explican que la principal caracterstica del ambiente gaseoso
in vitro, en un sistema convencional de cultivo de tejido es la alta humedad relativa,
gran fluctuacin diurna de la concentracin de CO
2
y la acumulacin de etileno y de
otras sustancias txicas, esto debido al restringido intercambio areo entre el tubo
de cultivo y el ambiente.

Tradicionalmente el cultivo de tejidos ha involucrado recipientes cerrados con
plantas creciendo heterotrficamente, en un medio con agar que contiene una
fuente de carbono. Para mejorar la aclimatacin de las plantas in vitro debe
proporcionrseles un ambiente que se parezca al in vivo, especialmente durante la
etapa III. Para estimular fotoautotrofa, se reduce la concentracin de hidratos de
carbono en el medio, se incrementa la intensidad de luz y se eleva la concentracin
de CO
2
. Adems, es importante normalizar el ambiente gaseoso en los vasos de
cultivo cerrados, ya que stos difieren muy notablemente del ambiente, y puede
provocar cambios significativos en el crecimiento y en la fisiologa de la planta. Los
valores de CO
2
son del orden de 0 12%, es decir menores a 10 ppm y los de la
acumulacin de etileno de 3 l/l, adems de una humedad relativa cercana al 100%
(MURPHY et al.,1998), en cambio los valores existentes en la atmsfera de CO
2
,
bordean los 350 ppm (PUC, 2003).

Las concentraciones de etileno en los tubos de cultivo pueden afectar el crecimiento
in vitro de las plantas (SANTAMARA et al., 2000).

Las plantas cultivadas in vitro, tienen generalmente la cutcula escasamente
desarrollada, debido a la alta humedad relativa (90% - 100%). Como consecuencia,
cuando se transfiere la planta al suelo, se produce una transpiracin cuticular extra,
ya que la humedad del aire en condiciones in vivo es ms baja (PIERIK, 1990).

Por otra parte, PIERIK (1990) seala que las hojas de una planta producida in vitro,
son frecuentemente finas, blandas y fotosintticamente poco activas, adems tienen
las clulas en empalizada que son las que deben utilizar la luz, ms pequeas y en
menor cantidad. Indica adems que los estomas pueden no ser suficientemente
operativos, y permanecer abiertos al trasplantarse al suelo, originando un importante
estrs hdrico en las primeras horas de aclimatacin.

Una complicacin extensa a la produccin comercial en vid, ha sido la pobre
aclimatacin y el establecimiento de plantitas en el invernadero (SWART y
LINDSTROM, 1986).

THOMAS (1998) demuestra que la aclimatacin de las plantas in vitro es a menudo
difcil porque ellas poseen tallos y hojas suculentas, debido a la alta humedad dentro
del vaso de cultivo, y el agua libre en el medio.

FILA et al. (1998) sealan que la aclimatacin puede ser mejorada modificando el
microambiente durante el desarrollo in vitro, por ejemplo reduciendo la humedad
relativa que causa un endurecimiento de la planta, mejorando los resultados durante
el trasplante. Tambin con el aumento de la tasa de CO
2
en los tubos de cultivo o
aumentando las intensidades de luz, para producir el establecimiento autotrfico in
vitro.

GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO (2001) indican que el costo de la fase de
aclimatacin es generalmente considerable. Es por ello que los procedimientos que
lleven a un endurecimiento de la planta en la ltima etapa de la micropropagacin,
con menores costos de labor y equipamiento facilitan este manejo y para esto se
recomienda el uso de tubos con baja humedad relativa.

2.4.1. Anatoma de las plantas cultivadas in vitro y su influencia sobre la
aclimatizacin

El ambiente in vitro es conocido por inducir modificaciones morfolgicas, anatmicas
y fisiolgicas en las plantas micropropagadas. Esas plantas son generalmente
susceptibles a la deshidratacin rpida cuando se exponen a baja humedad relativa
(GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO, 2001).

Por su parte RITCHIE, SHORT y DAVEY (1991) indican que las plantas
micropropagadas son cultivadas bajo altos niveles de humedad relativa, causando
anormalidades morfolgicas, particularmente en el estoma y la cutcula, produciendo
un alto porcentaje de mortalidad en la transferencia al invernadero.

BRAINERD y FUCHIGAMI (1981) sealan que las hojas de plantas
micropropagadas pueden tener menos cera epicuticular, clulas en empalizada ms
pequeas, y ms espacios areos en el mesfilo.

2.4.1.1. Factores morfolgicos que influyen en la aclimatizacin

BRAINERD et al. (1981) demuestran que la anatoma de la hoja es influenciada por
la luz y la humedad. Las hojas desarrolladas a altas intensidades de luz tienen
clulas en empalizada en mayor cantidad y ms grandes que aquellas en
condiciones de sombra, situacin que se asemeja al de las plantas in vitro. Las
hojas desarrolladas en baja humedad relativa tienen espacios intercelulares
pequeos. Las plantas crecidas en alta humedad relativa tienen un pobre desarrollo
de cera epicuticular, y altas tasas de transpiracin en aire seco.
Plantas creciendo bajo condiciones heterotrficas in vitro, tienen bajas tasas de
fotosntesis. Esto es debido a las bajas intensidades de luz, bajas concentraciones
de CO
2
(INFANTE, MAGNANINI y RIGHETTI, 1989) y la inhibicin de la fotosntesis
por la alta concentracin de azcar en el medio. No obstante, despus de
transferirlas a las condiciones ex vitro, la mayora de las plantas micropropagadas
desarrollan un aparato fotosinttico funcional, aunque el aumento en la intensidad
de la luz no es linealmente traducido en un incremento de la fotosntesis (KOZAI,
1991).

En las plntulas in vitro, la respuesta a la fotosntesis en condiciones de luz, es
similar a la de las plantas de sombra, caracterizadas por tasas fotosintticas y de
compensacin de luz bajas y puntos de saturacin tambin bajos. La anatoma de
las hojas es de acuerdo con las caractersticas fisiolgicas mencionadas, ya que el
efecto de la luz en el desarrollo del mesfilo, principalmente en el parnquima en
empalizada, es ciertamente el factor determinante anatmicamente. Sin embargo,
las deficiencias en las estructuras de los cloroplastos (desarrollo de grana), el nivel
bioqumico y la baja en la actividad de la Rubisco, tambin contribuyen a limitar la
actividad fotosinttica (AMANCIO, REBORDAO y CHAVES, 1999).

AMANCIO, REBORDAO y CHAVES (1999) adems confirman que cuando las
plantas son transferidas a condiciones in vivo, a radiaciones ms altas, puede
ocurrir estrs de luz, incluyendo la fotoinhibicin, la fotooxidacin de la clorofila, lo
ltimo siendo revelado por clorosis y manchas secas que aparecen en la hoja. No
obstante, algunas especies toleran mayores radiaciones que aquellas in vitro, sin
mayor estrs. El control y la optimizacin de la luz, es entonces esencial para la
aclimatizacin satisfactoria, aumentar la tasa de sobrevivencia y el desarrollo de
nuevas estructuras. Por otra parte, existe la evidencia que un alto nivel de azcar en
las clulas puede inhibir la sntesis de clorofila.

Los factores limitantes para la fotosntesis de plantas cultivadas in vitro, son la baja
concentracin de CO
2
en la atmsfera del tubo de cultivo y la baja intensidad de luz.
El aumento simultneo de estos factores generalmente hace posible mejorar la
actividad de la fotosntesis in vitro. Sin embargo, las investigaciones de este tipo
para vides, no son muy abundantes. La tasa de fotosntesis aumenta con la
intensidad de la luz, pero hay variantes entre cultivares, es as como bajo varias
intensidades de luz la fotosntesis es baja en Riesling italiana, comparada con
Dimiat. (SLAVTCHEVA y DIMITROVA, 2000).

La captacin de CO
2
neto por parte de las plantas in vitro, es pequea debido a la
baja tasa de ste dentro del tubo de crecimiento. Es ms, los azcares que se
suplementan al medio de crecimiento pueden causar una inhibicin extensa de la
fotosntesis. Al aumentar la tasa de CO
2
y/o las intensidades de iluminacin en el
tubo de cultivo, se produce un establecimiento autotrfico en las plantas in vitro. Sin
embargo estas tcnicas son de poco uso comercial debido a su alto costo (FILA et
al., 1998).

VAN HUYLENBROECK y DEBERGH (1996), indican que lo importante en las
plantas in vitro, son las reservas de hidratos de carbono para superar el estrs del
trasplante. Con un balance positivo del carbono es posible producir nuevas hojas
funcionales, ya que el trasplante causa un cambio en la asignacin de materia seca
entre el tallo y las hojas en vid, se forman ms hojas y menos tallo, esto tambin es
corroborado en manzano por DIAZ-PEREZ, SHACKEL y SUTTER (1995).

Investigaciones recientes han mostrado que el estrs del trasplante es debido
primeramente al estrs hdrico, el cual puede ser combatido exitosamente por
algunas especies de plantas con alta humedad despus del trasplante. La pobre
formacin de cera epicuticular y cuticular, y el reducido control estomtico
comparado con las plantas control aclimatizadas en invernadero, contribuye a la
desecacin de las plantas transferidas (DONNELLY y VIDAVER, 1984).

La prdida de agua en plantas micropropagadas durante la aclimatacin, se ha
atribudo principalmente al mal funcionamiento de los estomas y a una reducida
deposicin de cera epicuticular (GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO, 2001).

2.4.1.2. Cutcula

BRAINERD y FUCHIGAMI (1981) sealan que el estrs hdrico de las plantas
cuando son transferidas a baja humedad relativa, ha sido atribuido al pobre
desarrollo de la cera cuticular y epicuticular.

SUTTER y LANGHANS (1979), determinaron que la estructura de la cera
epicuticular, aumenta en hojas de plantas micropropagadas de clavel durante 2,5
semanas en el invernadero. GROUT y ASTON (1977) observaron que una
considerable y evidente capa de cera epicuticular, en ambas superficies de hojas
de Brassica oleracea, 10 das despus de transferirlas desde un cultivo asptico a
baja HR. Estos desarrollos de cera son parte del proceso de aclimatizacin. El
desarrollo de cera ocurre a los 10 das o ms despus de transferirlos, pero no
explica la diferencia en el contenido relativo de agua o el porcentaje de agua perdida
entre un cultivo de manzano cultivado aspticamente y aquellos despus de cuatro
o cinco das de exponerlos a 30 a 40% de humedad relativa.

La deposicin de la cera epicuticular, es un factor importante en el retardo de la
deshidratacin de la hoja, sta es reforzada al disminuir la humedad relativa
(RITCHIE, SHORT y DAVEY, 1991).

GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO (2001) observaron que la cantidad de cera
de la hoja en plantas in vitro era baja, anormalmente estructurada y qumicamente
diferente de la cera de las plantas crecidas en invernadero. Adems, evaluaron la
presencia de cera epicuticular de la superficie adaxial de la hoja, para determinar si
la prdida de agua era influenciada por la cantidad de cera o por un problema
estomtico, concluyendo que la mayora del agua se perdi a travs de la superficie
adaxial debido a un cierre estomtico imperfecto.

La deshidratacin de las hojas a travs de la cutcula de la superficie adaxial es
relativamente baja. Bajo sus condiciones experimentales una reduccin de la HR
parece tener mayor efecto en vid, reforzando el funcionamiento estomtico y esto
permite un mejor control de la prdida de agua de las hojas (SUTTER, 1984).

2.4.1.3. Estomas

BRAINERD y FUCHIGAMI (1981) determinaron que la proporcin de prdida de
agua de plantas micropropagadas de manzano, se relacion inversamente al
porcentaje de cierre estomtico.

BRAINERD et al. (1981) observaron que el agua perdida de hojas de plantas
provenientes de cultivos aspticos de ciruelo cv. Pixy ocurri desde la superficie
abaxial, donde se encuentran localizados los estomas.

GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO (2001) indican que las vides crecidas en el
campo, tienen hojas hipoestomticas, es decir tienen los estomas confinados
principalmente en la superficie abaxial.

BRAINERD y FUCHIGAMI (1981) observaron que un corto tiempo de aclimatizacin
con humedad, involucra un cambio en el funcionamiento estomtico, y ocurre en
menos de cinco das despus de exponerlo a esta baja humedad relativa. Otro
tiempo ms largo de aclimatizacin involucra desarrollo de cera, y reorientacin de
los cloroplastos, y esto ocurre despus de 10 a 14 das.

BRAINERD y FUCHIGAMI (1981) y SUTTER y LANGHANS (1979) y han sugerido,
sin embargo, que la lenta respuesta estomtica puede contribuir tambin al estrs
hdrico en plantas micropropagadas removidas desde el ambiente de cultivo.

ROMANO, NORONHA y MARTINS-LOUCAO (1992) demuestran que los estomas
de las plntulas in vitro estn levantados, alrededor de las clulas de guarda
comparados con los normales que son elpticos, y con las clulas de guarda
hundidas.

RITCHIE, SHORT y DAVEY (1991) sealan que el mal funcionamiento de los
estomas, es debido a la anormal disposicin de las clulas de guarda.

La incapacidad de los estomas de cerrarse completamente, la mnima reduccin de
las aperturas de las clulas de guarda en las hojas de crisantemo, y remolacha
cultivadas bajo humedad relativa reducida es consistente con los resultados
publicados por SHORT y ROBERTS (1987) y WARDLE, DOBBS y SHORT (1983).

2.4.1.4. Races

El equilibrio del agua en tejidos de plantas micropropagadas no solo depende de
regular la transpiracin, sino de un suministro adecuado de agua a las races. Es por
esto que las plantas cultivadas en agar tienen pobres conexiones raz-tallo, la
estructura de la raz alterada, la absorcin y transporte del agua es negativo. La
captacin de agua por parte de las races, junto con la prdida de agua por los
pices, es de importancia primaria para el mantenimiento del equilibrio del agua
durante la aclimatacin de las plantas crecidas in vitro. Adems indican que el
suministro de agua podra estar limitado, desde que estudios histolgicos han
mostrado una anatoma de raz anormal en las plantas in vitro (FILA et al., 1998).

VGVARI (2001) mostr que las races de plantas propagadas in vitro,
generalmente pierden sus pelos radicales durante la aclimatizacin, pero estas
races son todava importantes porque las nuevas races desarrolladas son
totalmente funcionales a partir de ellas.

2.5. Tcnicas de preaclimatacin:

Las plantas micropropagadas de vid, son generalmente susceptibles a la rpida
deshidratacin cuando se exponen a una humedad relativa reducida y requieren un
costoso procedimiento de aclimatacin.

Con la ventilacin se reduce la humedad relativa dentro del vaso, pero tambin la
acumulacin de gases como CO
2
y etileno.

MURPHY et al. (1998) demostraron que con la inclusin de aperturas en los tubos
de cultivo, redujeron la frecuencia estomtica y la apertura del estoma en
Delphinium. Se estableci un beneficio positivo de la ventilacin en el crecimiento
de esta especie, pero es claramente importante determinar si el factor crtico es el
aumento en el movimiento del agua a travs de la planta, o si es la reduccin en la
concentracin de algn componente gaseoso por debajo de una concentracin de
estrs.

El usar aberturas en los tubos durante la fase III, en el enraizamiento, reduce la
densidad y apertura de los estomas, por consiguiente, una probable explicacin a la
mejor sobrevivencia en la aclimatizacin por el mejoramiento en la estructura y
funcin estomtica (SANTAMARA et al., 2000).

WARDLE, DOBBS y SHORT (1983) sealan que la reduccin en el nivel de
humedad de la atmsfera dentro del tubo de cultivo, puede obviar la necesidad de
un perodo de aclimatacin. Algunas especies de plantas crecidas por mtodos in
vitro, pueden ser aclimatadas con niveles reducidos de humedad relativa dentro de
cinco das, esto sera beneficioso en la produccin a gran escala de plantas, para
eliminar el tiempo de consumo y la labor intensiva de la fase de aclimatacin.

ZIV y HAVELY (1993) y DEBERGH y MAENE (1981) sealan que reducir la
humedad relativa de los frascos de cultivo es un factor clave en la prevencin de la
vitrificacin, pero tambin disminuye el crecimiento de las plantas.

THOMAS (1998) utiliz sachet plsticos en la aclimatacin, como barrera para el
aire reduciendo as el efecto de la deshidratacin, as como la prdida de agua en la
planta y en el medio. Concluy que tres semanas con el sachet cerrado y una con el
sachet abierto, era suficiente para completar la aclimatacin de plantas de vid in
vitro con una humedad de 68-75%.

FIGUEROA (2003) con cubiertas de polipropileno, consigui disminuir la humedad
relativa al interior de los tubos de cultivo, teniendo en consideracin que, segn la
literatura, el papel aluminio mantiene una humedad relativa al interior del tubo de
cultivo cercana al 100%. Al preaclimatar, utilizando cubiertas de polipropileno, se
logr una mejor aclimatacin de las plantas in vitro de violeta africana que al utilizar
cubiertas de papel aluminio, ya que se disminuy la mortalidad obteniendo plantas
terminadas de gran desarrollo.

2.6. Morfologa estomtica:

La transpiracin es la prdida de agua en la planta en forma de vapor. Aunque una
pequea cantidad del vapor de agua se puede perder a travs de aberturas
pequeas denominadas lenticelas, en la corteza del tallo y ramas jvenes, la mayor
proporcin (ms del 90%) se escapa por las hojas (SNCHEZ-DIAZ y
AGUIRREOLEA, 2000).

La atmsfera se encuentra tan alejada de la saturacin de agua, que la planta corre
peligro de deshidratacin, es por esto que la cutcula sirve como barrera efectiva a
la prdida de agua (SNCHEZ-DIAZ y AGUIRREOLEA, 2000).

Los mismos autores sealan que la cutcula es un depsito creo dispuesto en
varias capas, que recubren la superficie externa de una hoja tpica. Debido a que
estas ceras cuticulares son muy hidrfobas, ofrecen una resistencia muy elevada a
la difusin, tanto de agua lquida como de vapor de agua procedente de las clulas
subyacentes.

La integridad de la epidermis y de la cutcula que la recubre, es interrumpida por los
estomas.

SNCHEZ-DIAZ y AGUIRREOLEA (2000) sealan que los estomas proporcionan a
las plantas un mecanismo fundamental para adaptarse a un ambiente
continuamente cambiante, permitiendo el intercambio fsico activo entre las partes
areas de la planta y la atmsfera. El papel fundamental de los estomas es la
regulacin de la prdida de agua (transpiracin) y la absorcin de CO
2
(asimilacin
fotosinttica del carbono). Adems explican que los factores ms importantes que
afectan la transpiracin son: radiacin, dficit de presin de vapor del aire,
temperatura, velocidad del viento y suministro de agua, y entre los factores propios
de la planta figuran: rea foliar, estructura y exposicin foliar, resistencia estomtica
y capacidad de absorcin del sistema radical.

En cuanto a morfologa estomtica, WARDLE, DOBBS y SHORT (1983) realizaron
un estudio en crisantemo (Chrysanthemun X moriflorum Ramat.) y coliflor (Brassica
oleracea L.) con remocin de epidermis de la superficie abaxial de las hojas
manifestando que las plantas in vitro tienen los estomas abiertos, debido a la alta
humedad relativa que presenta la condicin in vitro.

SANTAMARA et al. (2000), indican que normalmente los estomas cierran como
respuesta a altas concentraciones de CO
2
, pero esto no ocurre in vitro, donde en
tubos sellados, la densidad estomtica y la apertura de los estomas son mayores
que en las plantas que crecen bajo condiciones in vivo.

ZOBAYED, ARMSTRONG y ARMSTRONG (2001) observaron que la densidad
estomtica en coliflor, era significativamente alta en plantas cultivadas en tubos
hermticos, disminuyendo al aumentar la ventilacin en los tubos.

Otros autores como WETZEN y SOMMER (1982) concuerdan con esto, y se
demostr en Liquidambar que la densidad estomtica en hojas micropropagadas,
era significativamente alta con respecto a las de hojas de plantas cultivadas en
campo.

SCIUTTI y MORINI (1993), indicaron que la densidad estomtica aument
notablemente en hojas de plantas de ciruelo crecidas bajo la condicin in vitro, por
el aumento de la humedad relativa en la atmsfera de cultivo.

SANTAMARA et al. (2000), explican que la mayor sobrevivencia de las plantas de
Delphinium, en tubos ventilados, es debido a que reduce la densidad y la apertura
de los estomas, mejorando la funcin estomtica.

3. MATERIALES Y MTODOS

Los ensayos se realizaron entre agosto del 2003 y agosto del 2004, en el
Laboratorio de Propagacin Profesor Gregorio Rosenberg de la Facultad de
Agronoma de la Pontificia Universidad Catlica de Valparaso, ubicada en la calle
San Francisco s/n, La Palma, Provincia de Quillota, V regin.

3.1. Obtencin y cuidado del material:

El material utilizado correspondi a brotes de vid (Vitis vinifera L.), de los que se
extrajo segmentos nodales de la regin apical y media obtenidas en febrero del
2004, desarrolladas al aire libre en la Estacin Experimental ubicada en La Palma,
Quillota.

Los dimetros de estas secciones nodales fueron de 5 mm para la regin apical y 8
mm para la regin media (MESA, 2001).

La desinfeccin de este material, se realiz con Benlate ms Captan en una
concentracin de 1,8 g/l de cada uno, los cuales se sumergieron en esta solucin
durante cinco minutos.

Posteriormente, las plantas se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1,5% ms
una solucin de cido ascrbico 500 mg/l y cido ctrico 500 mg/l, ms Tween 20
por 10 minutos en un matraz Erlenmeyer, y se trasladaron a cmara de flujo laminar
donde se les someti a tres enjuagues con agua bidestilada con antioxidante.

En cuanto al cerezo Gisela 5, las plantas se obtuvieron de un ensayo anterior
(CCERES, 2004), las cuales se encontraban desde diciembre del 2003 en un
medio de proliferacin.
Los medios de cultivo se prepararon en base a soluciones madre stock, con agua
bidestilada para las diluciones. La formulacin mineral est en base a medio de
sales de MURASHIGE y SKOOG (1962) con macronutrientes y micronutrientes
reducidos a tres cuartos.

El pH se ajust a 5,3 con alcuotas de cido clorhdrico 0,1 N o hidrxido de Potasio
0,1 N, para bajar o elevar respectivamente el pH.

En cuanto a vid, el medio de proliferacin se prepar en base al medio de sales de
4
NO
3
las sales reducidas a tres cuartos, ajustado a pH 5,7.

Respecto a cerezo Gisela 5, el medio se prepar en base a un medio de sales de
MURASHIGE y SKOOG (1962), suplementado con 0,5 mg/l de AIB y 1,5 mg/l de
BAP (CCERES, 2004).

El medio de enraizamiento en vid se prepar en base al medio de sales de
4
NO
3
las sales reducidas a tres cuartos, ajustado a pH 5,7.

Respecto al cerezo Gisela 5, el medio se prepar en base a sales de MURASHIGE
y SKOOG (1962) con una concentracin mineral reducida a la mitad suplementado
con 1 mg/l de AIB (CCERES, 2004).

3.2. Establecimiento de explantes:

Para la etapa de establecimiento y proliferacin de explantes se utiliz tubos de
vidrio de 37 ml, con 10 ml de medio por unidad. El sellado correspondi a un
cuadrado de papel aluminio de 25 cm
2
, y sobre ste vitafilm. Posteriormente los
tubos fueron esterilizados en un autoclave a 121 C por 15 minutos.
Despus en cmara de flujo laminar, se procedi a sembrar en cada tubo un
segmento nodal. Los dimetros de estas secciones nodales fueron de 5 mm para la
regin apical y 8 mm para la regin media, y en cmara de flujo se redujeron a
microestacas de 10 a 15 mm de longitud con un nudo cada una (MESA, 2001).

Despus se llev a cmara de crecimiento con temperatura y luminosidad
controlada.

3.3. Enraizamiento de explantes:

Para el enraizamiento, las microestacas de vid fueron repicadas a frascos de 150
ml, con 40 ml de medio por unidad. Con respecto a cerezo Gisela 5, el repique fue a
frascos de similar volumen (FIGURA 1).

Posterior al enraizamiento, las plantas se preaclimataron. Se esper un
enraizamiento de 25 das para vid, y de 30 das para cerezo. En cuanto a la
preaclimatacin, para el caso de vid, las plantas se mantuvieron slo cinco das bajo
esa condicin debido al severo estrs hdrico que stas sufrieron. En cuanto a
cerezo, las plantas se mantuvieron 10 das, debido a que comenzaron a presentar
en algunos casos, deshidratacin en algunas hojas apicales.

FIGURA 1. Planta micropropagada de cerezo Gisela 5, en la etapa de
enraizamiento.

3.4. Ensayo 1: Reduccin de la humedad relativa con el uso de sellos de
polipropileno y papel filtro en la etapa de preaclimatacin.

En este ensayo se evaluaron el uso de tres sellos para el cierre de los frascos de
cultivo, para reducir la humedad relativa al interior de stos.

En el caso de vid, se realizaron tres tratamientos, con distintos sistemas de sellado,
con 20 repeticiones cada uno, estos sellos presentaban diferentes texturas y
porosidades para aumentar el grado de ventilacin en el interior de los frascos, y
con ello la disminucin de la humedad relativa. Los tratamientos fueron los
siguientes:

T0: Control con papel de aluminio
T1: Sello de polipropileno en tres capas
T2: Sello de papel filtro Whatman 1 o MFS N2

Estas cubiertas de polipropileno, se obtuvieron de las mascarillas empleadas en los
pabellones quirrgicos, y se componen de tres telas de polipropileno de distintos
colores y porosidades, las cuales se dimensionaron en cuadrados de 7 cm
2
y se
pesaron en una balanza electrnica marca Precisa, para poder determinar as,
mediante el peso una equivalencia en porosidad (FIGURA 2). La tela superior que
es de color verde pes 90 mg, la tela intermedia, de color blanco 100 mg, y por
ltimo, la inferior, tambin de color blanco 130 mg.

En cuanto al papel filtro, este correspondi al denominado Whatman 1 con su
correspondiente equivalencia en MFS N2, con un gramaje de 125 g/m
2
, y una
velocidad de filtracin de 80 seg.

La ventaja que presentaron estos sellos, es la posibilidad de ser esterilizados. La
esterilizacin se realiz en una estufa de calor seco a 105 C, por un perodo de 48
hr.

FIGURA 2. Planta micropropagada de vid, en la etapa de enraizamiento con sello de
polipropileno.

En cuanto al cerezo Gisela 5, tambin se realizaron tres tratamientos con 30
repeticiones cada una, con los mismos sellos anteriormente descritos.

Las plantas de ambos ensayos, tras pasar 25 y 30 das respectivamente en un
medio de enraizamiento, se procedi en cmara de flujo laminar al cambio de sello,
para el caso de las plantas en tratamiento control, se les renov el sello con papel
aluminio, para con esto provocar un mnimo intercambio gaseoso durante esta labor.
En cuanto al tratamiento 1 y 2, se retir el sello de aluminio y se procedi a
cambiarlo por el sello correspondiente. Luego, los frascos fueron sellados por el
borde con vitafilm, con el fin de afirmar los sellos y teniendo la precaucin de no de
cubrir la superficie (FIGURA 3).

Posteriormente los frascos se almacenaron en cmara de crecimiento, con
temperatura y luminosidad controlada por un perodo inicial de 20 das, para
posteriormente ser aclimatadas en sustrato.

Durante los das de enraizamiento, preaclimatacin y finalmente en la aclimatacin,
se midieron los siguientes parmetros:

Altura de la planta, dimetro de la planta, nmero de hojas con una lmina superior
a 8 mm, nmero total de hojas (n), color de hojas, altura del medio de cultivo (mm)
para determinar su agotamiento, vitrificacin, y porcentaje de enraizamiento, se
consider raz aquella que presentara como mnimo 3 mm de largo.

Para la evaluacin del color del explante en vid, se utiliz la tabla Munsell
(MUNSELL, 1998), asignando un nmero a cada color de explante:

1: 7,5 GY 4/4 (color verde oscuro)
2: 7,5 GY 5/8 (color verde caracterstico de la especie)
3: 5 GY 7/10 (color verde-amarillo)
4: 5 Y 8/6 (color amarillo-caf)

FIGURA 3. Plantas micropropagadas de cerezo Gisela 5, con sus distintos sellos, en
la cmara de crecimiento.

Para la evaluacin del color del explante en cerezo, tambin se utiliz la tabla
Munsell (MUNSELL, 1998), asignando un nmero a cada color de explante:

1: 5 GY 4/8 verde oscuro
2: 5 GY 5/6 verde de la especie
3: 5 GY 6/8 verde claro
4: 5 GY 7/8 verde amarillo

Para evaluar el grado de vitrificacin, fue utilizada una escala, asignando una
calificacin a cada estado del explante:

1: Explante sin vitrificacin
2: Explante con 50% de vitrificacin
3: Vitrificacin total del explante

El diseo fue conducido con un Diseo completamente al azar (DCA).

En las variables cuantitativas, altura de la planta, dimetro de la planta, nmero de
hojas con una lmina superior a 8 mm, nmero total de hojas, altura del medio de
cultivo, y porcentaje de enraizamiento, se realiz un anlisis de varianza, para
determinar el efecto de los tratamientos, en caso de existir efecto de stos, se aplic
un test de separacin de medias de Tukey, con un 95% de confianza.

En cuanto a la variable cualitativa vitrificacin, esta se contrast con un Test de
Tukey, debido a que la escala asignada a cada estado del explante correspondi a
una graduacin, en donde cada estado es mejor que el anterior.

En cuanto a la variable cualitativa color, como no cumpli con las caractersticas
anteriormente citadas, se contrast con el Test no paramtrico de Kruskal-Wallis.

3.5. Aclimatizacin:

Al transcurrir los das de preaclimatacin, las plantas fueron retiradas de la
condicin in vitro, para ser trasladadas al sustrato, en invernadero.

Las plantas se retiraron de la condicin in vitro, y sus races se lavaron
cuidadosamente, para retirar restos adheridos de agar, y evitar con esto la
proliferacin de patgenos en el sustrato. Posteriormente se sumergieron en una
mezcla de Benlate ms Captan, con una concentracin de 1,2 g/l respectivamente
por tres minutos.

Para el trasplante se utiliz como contenedores, vasos de plumavit de 230 ml, los
cuales fueron lavados y asperjados con una solucin de hipoclorito de sodio a 1%.
En la base de estos contenedores se realiz cuatro perforaciones, para con ello
favorecer el drenaje. Posteriormente, se procedi a llenar los contenedores a dos
tercios de su capacidad con una mezcla de sustrato, previamente esterilizado en
autoclave durante 1 hora con 1,1 bar de presin y 121 C. El sustrato correspondi a
40% de tierra de hoja, 14% de tierra y 46% de arena.

Posteriormente, se reg los contenedores y se trasplant con mucho cuidado la
planta proveniente de la condicin in vitro, cuidando de no destruir races en caso de
que stas estuvieran presentes.

A continuacin, se cubrieron los contenedores con bolsas de polietileno
transparente de 10 * 15 cm, para mantener una alta humedad relativa, en las cuales
cada cinco das, se realiz un corte en uno de los extremos de la bolsa, para as a
los 20 das retirar completamente la bolsa. Transcurrido este tiempo se realiz la
ltima medicin de las plantas.

En esta medicin, se evalu el porcentaje de sobrevivencia, la altura de las plantas
(mm), el dimetro de las plantas (mm), el nmero de hojas con una lmina superior
a 8 mm, el nmero total de hojas y el color (FIGURA 4).

3.6. Seguimiento de estomas en las etapas secuenciales in vitro:

De cada etapa secuencial in vitro, establecimiento, proliferacin, enraizamiento,
preaclimatacin (con sello de polipropileno y papel filtro) e in vivo, se realiz un
estudio histolgico para analizar la evolucin estomtica.

Se tom diversas hojas, y se procedi a fijarlas en FAA que consisti en solucin de
5 ml de formalina, 5 ml de cido actico glacial, y 90 ml de alcohol etlico al 70%.

En cuanto a las hojas tomadas en la etapa de preaclimatacin, en estas se esper
tres das, para proceder a fijarlas. Se esper este tiempo, ya que en condiciones
experimentales, las plantas a los cinco das de preaclimatacin, presentaron una
severa deshidratacin, y este tipo de muestras deshidratadas completamente no
servan.

Estas muestras fueron analizadas en el laboratorio de Histologa, perteneciente a la
Pontificia Universidad Catlica de Valparaso, donde se sigui el siguiente
procedimiento:

1. Fijacin en FAA durante 48 hr.

2. Deshidratacin en una serie de alcohol etlico en solucin acuosa a distintas
concentraciones crecientes, porque la idea es que estos disolventes
intermediaros se mezclen con el fijador pero que no reaccionen con l.

3. Inclusin en parafina slida en estufa a 56 C.

FIGURA 4: Plantas de cerezo Gisela 5, en la etapa de aclimatizacin.

4. Preparacin del bloque de parafina.

5. Corte del bloque en micrtomo de 10 .

6. Montaje en un portaobjeto.

7. Tincin con Safranina y verde luz.

8. Observacin al microscopio.

4. PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS

4.1. Ensayo 1: Reduccin de la humedad relativa, con el uso de sellos de
polipropileno y papel filtro en vid y cerezo en la etapa de preaclimatacin.

En el anlisis de varianza efectuado a los cinco das de enraizamiento in vitro en
vid, con un error del 5%, se determin que no existi efecto de las cubiertas sobre
las variables medidas, esto puede haberse debido al corto tiempo transcurrido entre
el cambio de sello y la medicin. En esta especie, no pudo realizarse mediciones
posteriores, debido a la severa deshidratacin que sufrieron las plantas con la
ventilacin provocada por los cambios de sellos, y debi cubrirse nuevamente los
frascos para evitar la muerte de las plantas.

El anlisis de varianza (P=0,05), permiti determinar que no existi efecto de los
cambios de sellos sobre la altura de las plntulas de vid (CUADRO 1).

Esto concuerda con CASSELS y ROCHE (1994) y J ACKSON et al. (1991), ya que
bajo condiciones de ventilacin en los tubos de cultivo, no obtuvieron un aumento en
el crecimiento en S. tuberosum, Rosa, Dianthus sp, Gerbera y Ficus. Por su parte
WARDLE, DOBBS y SHORT (1983) sealan que las plantas de Brassica oleracea,
cultivadas en tubos ventilados, mostraron un reducido crecimiento. Adems, SHORT
y ROBERTS (1987) indican que al reducir la humedad relativa en tubos ventilados
en plantas micropropagadas de crisantemo, se redujo notoriamente el crecimiento
de las plantas.

Esto no concuerda con lo sealado por COURNAC et al. (1991) y BLAZCOV et al.
(1989), y que demostraron el aumento del crecimiento de las plantas, como
resultado de la mejora de la ventilacin dentro de los vasos de cultivo en
Chenopodium rubrum y Solanum tuberosum.
CUADRO 1. Efecto de las cubiertas, sobre la altura de las plantas (mm) in vitro de
vid, a los cinco das de enraizamiento in vitro.

Tratamiento Altura (mm) a los 5 das
T0 Control 15,13 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno 15,61 a
T2 Cubierta con papel filtro 15,11 a
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, segn Test de Tukey (P=0,05).

En cuanto a cerezo, el anlisis de varianza, realizado en este caso en dos fechas, a
los cinco y a los 10 das de enraizamiento in vitro, se determin (P=0,05) que no
existi efecto de los tratamientos en la altura de las plantas a los cinco das, con
respecto a los resultados obtenidos a los 10 das, estos siguieron la misma
tendencia estadstica, aunque se observ un pequeo aumento en los valores
promedio (CUADRO 2). Esto tambin puede haberse debido al corto perodo
transcurrido entre una medicin y otra, impidiendo respuesta diferencial por parte de
las plantas.

CUADRO 2. Efecto de las cubiertas, sobre la altura de las plantas (mm) in vitro de
cerezo Gisela 5, a los cinco y 10 das de enraizamiento in vitro.

Tratamiento
Altura (mm)
a los 5 das
Altura (mm)
a los 10 das
T0 Control 11,62 a* 11,88 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno 11,75 a 12,03 a
T2 Cubierta con papel filtro 11,23 a 11,52 a

En cuanto a la variable dimetro para vid, al realizar el anlisis de varianza, a los
cinco das de enraizamiento (P=0,05), se determin que no existi diferencia
significativa con ninguno de los tratamientos aplicados (CUADRO 3).

CUADRO 3. Efecto de las cubiertas, sobre el dimetro (mm) de las plantas in vitro
de vid a los cinco das de enraizamiento in vitro.

Tratamiento Dimetro (mm) a los 5 das
T0 Control 1,26 a*

En cerezo, al realizar el anlisis de varianza a los cinco y 10 das de enraizamiento
(P=0,05), tampoco existi diferencia significativa con ninguno de los tratamientos
aplicados (CUADRO 4). En ambos casos, esto tambin pudo haberse debido al
corto tiempo transcurrido entre el establecimiento de los sellos y la primera
medicin, y en el caso de cerezo adems entre una medicin y otra.

CUADRO 4. Efecto de las cubiertas, sobre el dimetro (mm) de las plantas in vitro
de cerezo Gisela 5, a los cinco y 10 das de enraizamiento in vitro.

Tratamiento Dimetro (mm) a
los 5 das
Dimetro (mm) a
los 10 das
T0 Control 2,12 a* 2,14 a*

El anlisis de varianza en vid, realizado a los cinco das de enraizamiento para las
variables nmero de hojas con una lmina superior a 8 mm y nmero total de hojas,
determin que no existe diferencia significativa entre los tratamientos (CUADRO 5).

En cuanto a cerezo, para ambas variables, medidas el da cinco y el da 10 de
enraizamiento, al realizar el anlisis de varianza, tampoco se determin diferencia
significativa entre los tratamientos (CUADRO 6), pero a los 10 das de
enraizamiento en el tratamiento con cubierta de papel filtro, se apreci una
disminucin en el nmero de hojas con una lmina superior a 8 mm, debido a la
desfoliacin de algunas hojas que sufrieron algunas de las plantas, sin afectar esto
en la diferencia estadstica significativa.

Por su parte SANTAMARA et al. (2000), sealan que en Delphinium se obtuvo una
menor rea foliar en tubos con mayor ventilacin. Por el contrario RITCHIE, SHORT
y DAVEY (1991), demostraron que en tubos de cultivo ventilados, se promovi un
incremento en el nmero de hojas y en la superficie foliar de plantas crecidas in
vitro. Esto coincide con SMITH (1991), quin indic que al disminuir la humedad
relativa al interior del tubo de cultivo, observ una disminucin en la longitud del
tallo, y un aumento en el rea de la hoja en crisantemo, rosa y vid.

CUADRO 5. Efecto de las cubiertas, sobre el nmero de hojas con una lmina
superior a 8 mm, y nmero total de hojas, en las plantas in vitro de
vid, a los cinco das de enraizamiento in vitro.

Da 5

Tratamiento
N hojas con lmina
superior a 8 mm
N total de hojas
T0 Control 2,7 a* 4,4 a*

CUADRO 6. Efecto de las cubiertas, sobre el nmero de hojas con una lmina
superior a 8 mm, y nmero total de hojas, en las plantas in vitro de
cerezo Gisela 5, a los cinco y 10 das de enraizamiento in vitro.

Da 5 Da 10

Tratamiento
N hojas con
lmina
superior a 8
mm
N total de
hojas
N hojas con
lmina
superior a 8
mm
N total de
hojas
T0 Control 9,17 a* 9,97 a* 9,33 a* 9,97 a*
T1 Cubierta con sello de
polipropileno
9,53 a 10,63 a 9,63 a 10,93 a
T2 Cubierta con papel filtro 8,0 a 9,67 a 7,97 a 9,53 a

El test de Tukey (P=0,05), realizado para la variable altura del medio de cultivo, en
vid a los cinco das de enraizamiento, demostr que existen diferencias significativas
entre los tratamientos. En el CUADRO 7, se puede observar que el mayor
agotamiento ocurri en los tubos con mayor ventilacin, en los tratamientos con
cubierta con sello de polipropileno y con cubierta de papel filtro.

CUADRO 7. Efecto de las cubiertas, sobre la altura del medio de cultivo (mm), en
las plantas in vitro de vid, a los cinco das de enraizamiento in vitro.

Tratamiento
Altura del medio de cultivo
(mm) a los 5 das
T0 Control 19,86 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno 17,82 b
T2 Cubierta con papel filtro 17,26 b

Por su parte en el CUADRO 8, en que se evalu el efecto de las cubiertas sobre la
altura del medio en cerezo, en los das cinco y 10 de enraizamiento, el Test de
Tukey (P=0,05), tambin demostr que existen diferencias significativas entre los
tratamientos.

CUADRO 8. Efecto de las cubiertas, sobre la altura del medio de cultivo (mm), en
las plantas in vitro de cerezo Gisela 5, en el da cinco y 10 de
enraizamiento in vitro.

Tratamiento
Altura del medio
de culti vo (mm) a
los 5 das
Altura del medio
de culti vo (mm) a
los 10 das
T0 Control 16,49 a* 16,17 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno 15,55 b 13,43 b
T2 Cubierta con papel filtro 15,33 b 13,34 b

MURPHY et al. (1998) observaron que la prdida de peso del medio, se deba a la
ganancia en peso de la planta, y a la evapotranspiracin, pero en tubos ms
ventilados, la ganancia en peso por parte de la planta era reducida y la prdida en
peso del medio era casi cinco veces mayor, que en tubos sellados con papel
aluminio.

La variable vitrificacin al ser analizada con el anlisis de varianza para el caso de
cerezo (CUADRO 9), no present diferencia significativa entre los tratamientos. En
cuanto a vid, estos datos no se analizaron estadsticamente, porque las plantas no
presentaron vitrificacin.

SHORT y ROBERTS (1987) indican que el reducir la humedad relativa al interior de
los frascos de cultivo, es un factor clave en la prevencin de la vitrificacin, pero
tambin disminuye el crecimiento de las plantas.

CUADRO 9. Efecto de las cubiertas, sobre la vitrificacin, en las plantas in vitro de
cerezo Gisela 5, en el da cinco y 10 de enraizamiento in vitro.

Tratamiento
Vitrificacin a los
5 das
Vitrificacin a los
10 das
T0 Control 1,03 a* 1,03 a*
* Letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre los tratamientos,
segn Test de Tukey (P=0,05).

La variable color, a los cinco das de enraizamiento en vid, al ser analizada con el
test no paramtrico de Kruskal-Wallis (P=0,05) demostr diferencias estadsticas
significativas. El nmero asignado a cada color de explante correspondi a 1: 7,5
GY 4/4 (color verde oscuro), 2: 7,5 GY 5/8 (color verde caracterstico de la especie),
3: 5 GY 7/10 (color verde amarillo), y 4: 5 GY 8/6 (color amarillo caf). En el
tratamiento control, las plantas presentaron el color verde caracterstico de la
especie (7,5 GY 5/8), segn la tabla MUNSELL (1998), representado por el valor
2,45. Los otros tratamientos presentaron un color verde amarillo (5 GY 7/10), muy
cercano al amarillo caf (5 Y 8/6), representados por el valor 3,7 en el tratamiento
con cubierta de sello de polipropileno y 3.95 en las plantas con cubierta de papel
filtro, debido a que estas plantas se vieron fuertemente estresadas por el cambio en
la ventilacin de los frascos (CUADRO 10).

En cuanto a cerezo, el nmero asignado a cada color de explante correspondi a 1:
5 GY 4/8 (color verde oscuro), 2: 5 GY 5/6 (color verde de la especie), 3: 5 GY 6/8
(color verde claro) y 4: 5 GY 7/8 (color verde amarillo). En este ensayo no hubo
diferencia estadstica significativa entre los tratamientos a los cinco y 10 das de
enraizamiento, a los cinco das se mantuvo el color de las plantas en los tres
tratamientos, representado por el nmero 2,4 que corresponde al color verde
caracterstico de la especie 5 GY 5/6 MUNSELL (1998), a los 10 das de
enraizamiento el color se mantuvo, representado por los valores 2,4 en el
tratamiento control y en el con cubierta de papel filtro, y 2,53 en el tratamiento con
sello de polipropileno (CUADRO 11).

CUADRO 10. Efecto de las cubiertas sobre el color, en las plantas in vitro de vid, en
el da cinco de enraizamiento in vitro.

Tratamiento Color a los 5 das
T0 Control 2,45 b*
segn Test de Kruskal-Wallis (P=0,05).

CUADRO 11. Efecto de las cubiertas sobre el color, en las plantas in vitro de cerezo
Gisela 5, en el da cinco y 10 de enraizamiento in vitro.

Tratamiento Color a los 5 das Color a los 10 das
T0 Control 2,4 a* 2,4 a*

Para evaluar el enraizamiento se aplic un test de comparacin de proporciones
(P=0,05), en cuanto a vid, existe diferencia significativa entre tratamientos,
obtenindose un menor porcentaje de enraizamiento en los tratamientos con frascos
ventilados. En cuanto a la sobrevivencia, no se determin diferencia estadstica
significativa (CUADRO 12).

La presencia de races in vitro, es una condicin muy importante, ya que estas
influyen en la sobrevivencia posterior de las plantas, aunque hay controversias al
respecto, por un lado DEBERGH y MAENE (1981), sealan que las races
producidas in vitro, moran despus del trasplante a condiciones de invernadero, y
eran completamente reemplazadas por nuevas races ex vitro, a diferencia de lo
dicho por APTER, DAVIES y MC WILLIAMS (1993), quienes sealan que en
microestacas de Trachelospermun asiaticum enraizadas in vitro, sus races no eran
reemplazadas, sino que sobrevivan al trasplante y a la aclimatizacin, y al comparar
morfolgicamente las conexiones xilemticas entre la raz y tallo, de races in vitro y
ex vitro, descubrieron que estaban igualmente desarrolladas. Esto tambin es
corroborado por MIRANDA (1996), al comparar morfolgicamente races in vitro e in
vivo, en dos portainjertos de ctricos, ya que observ una conexin xilemtica
continua entre la raz neoformada in vitro y el tallo.

CUADRO 12. Efecto de las cubiertas sobre el porcentaje de enraizamiento a los
cinco das, en las plantas de vid in vitro, y la sobrevivencia, a los 21
das despus de la aclimatizacin en sustrato.

Tratamiento
Enraizamiento (%)
a los 5 das
Sobrevi vencia (%)
(21 das despus de
aclimatizacin en sustrato)
T0 Control 45 a* 25 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno 15 b 10 a
T2 Cubierta con papel filtro 15 b 30 a
* Letras iguales indican que no existe diferencia significativa entre los tratamientos,
segn Test de Comparacin de Proporciones (P=0,05).

En cerezo no se determin diferencia estadstica significativa en el porcentaje de
enraizamiento entre los tratamientos, y tampoco en la sobrevivencia (CUADRO 13).

Se puede inferir de manera preliminar, que una planta enraizada in vitro, tendra un
mayor xito ex vitro, ya que el mayor porcentaje de enraizamiento en cerezo influy
positivamente en la mayor sobrevivencia de las plantas despus de ser
trasplantadas a sustrato, a diferencia de vid, en que un bajo porcentaje de
enraizamiento, signific una baja sobrevivencia de las plantas.

CUADRO 13. Efecto de las cubiertas sobre el porcentaje de enraizamiento a los
cinco y 10 das, en las plantas de cerezo Gisela 5 in vitro, y la
sobrevivencia, a los 21 das despus de la aclimatizacin en sustrato.

Tratamiento
Enraizamiento
a los 5 das
(%)
Enraizamiento
a los 10 das
(%)
Sobrevi vencia (%)
(21 das despus
de aclimatizacin
en sustrato)
T0 Control 63,3 a* 66,6 a* 60 a*
T1 Cubierta con sello de
polipropileno
70,0 a 73,3 a 60 a
T2 Cubierta con papel filtro 66,6 a 73,3 a 56,7 a
* Letras iguales indican que no existe diferencia significativa entre los tratamientos,
segn Test de Comparacin de Proporciones (P=0,05).

En cerezo y en vid, no hubo relacin entre la ventilacin de los tubos y la
sobrevivencia, a diferencia de lo reportado por MURPHY et al. (1998), en
Delphinium, donde la sobrevivencia de plantas micropropagadas mejor en los
tratamientos con tubos ventilados, pero si concuerdan con este mismo autor en la
especie Hosta, en que no hubo efecto de la ventilacin en la sobrevivencia.

Por su parte, FAULKS y MUDGE (1996) y THOMAS (1998) sealan que la
sobrevivencia de las vides micropropagadas, comparada con otras especies
leosas, es relativamente baja.

Al analizar el efecto de los tratamientos sobre la altura de la planta en cerezo
(CUADRO 14), no se encuentra diferencia estadstica significativa, esto se mantiene
con respecto a las mediciones anteriores en esta variable.

En cuanto al efecto de los tratamientos en el dimetro (mm), estos tampoco
presentan diferencia estadstica significativa, esto tambin se mantiene con respecto
a la medicin anterior en esta variable (CUADRO 15).

CUADRO 14. Efecto de los tratamientos en la altura (mm) de plantas
micropropagadas de cerezo Gisela 5, a los 21 das de
aclimatizacin en sustrato.

Tratamiento
Altura de las plantas (mm) a los 21
das de aclimatizacin
T0 Control 12,1 a*
los tratamientos, segn Test de Tukey (P=0.05).

CUADRO 15. Efecto de los tratamientos en el dimetro (mm) de las plantas
micropropagadas de cerezo Gisela 5, a los 21 das de aclimatizacin
en sustrato.

Tratamiento
Dimetro de las plantas (mm) a
los 21 das de aclimatizacin
T0 Control 2,4 a*

Con respecto al nmero de hojas con una lmina mayor a 8 mm, y el nmero total
de hojas en plantas micropropagadas de cerezo, no se determin diferencia
estadstica significativa entre los tratamientos (CUADRO 16).

En cuanto a la variable color, esta tampoco present diferencia estadstica
significativa entre tratamientos, representada por el valor promedio 3,3 en el
tratamiento control, 3,4 en el tratamiento con sello de polipropileno y 3,23 en el
tratamiento con papel filtro, que corresponde al nmero tres asignado al color 5 GY
6/8, MUNSELL (1998) que es el color cercano al verde claro (CUADRO 17).

CUADRO 16. Efecto de los tratamientos en el nmero de hojas con una lmina
superior a 8 mm, y el nmero total de hojas, en plantas
micropropagadas de cerezo Gisela 5, a los 21 das de aclimatizacin
en sustrato.

Tratamiento
N hojas con lmina
mayor a 8 mm a los 21
das de aclimatizacin
N total de hojas a los
21 das de
aclimatizacin
T0 Control 6,59 a* 6,64 a*

CUADRO 17. Efecto de los tratamientos en el color de cerezo Gisela 5, a los 21 das
de aclimatizacin en sustrato.

Tratamiento
Color a los 21 das de
aclimatizacin en sustrato
T0 Control 3,3 a*

4.2. Anlisis de cortes histolgicos, en las distintas etapas secuenciales in
vitro, e in vivo de vid, mediante el uso de fotografas:

4.2.1. Etapa de establecimiento

En los cortes histolgicos obtenidos del material vegetal colectado y fijado en esta
condicin, se pudo observar estomas abiertos, completamente desarrollados, pero
tambin se apreci una gran cantidad de estomas ms pequeos y cerrados
(FIGURA 5). Esto pareciera contraponerse a lo propuesto por diversos autores, que
menciona que en la condicin in vitro, los estomas de las hojas permanecen
abiertos, pero es claro que el estoma pasa por un perodo de formacin o
maduracin que finaliza con un estoma completamente desarrollado. Son WARDLE,
DOBBS y SHORT (1983) quienes proponen una categorizacin de estas etapas en:
a) aparicin de la clula madre de las de guarda, b) clula madre dividida pero sin
poro evidente, c) formacin evidente del poro y d) estoma completamente
desarrollado.

Siendo sta la primera etapa de la propagacin in vitro, era muy probable encontrar
estomas inmaduros en los cortes histolgicos, siendo stos los que se observaron
de menor tamao y cerrados. Estos posteriormente se desarrollan y se mantienen
durante las etapas siguientes de la propagacin.

4.2.2. Etapa de proliferacin

En esta etapa ms avanzada de la micropropagacin, los estomas pertenecientes a
las hojas formadas en la condicin in vitro ya se encuentran completamente
maduros, encontrndose todos en la etapa de estoma completamente desarrollado,
con poro claramente visible, de acuerdo a la clasificacin definida por WARDLE,
DOBBS y SHORT (1983). Debido a la condicin de alta humedad relativa (cercana
al 100%) los estomas desarrollados en la condicin in vitro son ineficientes en su
capacidad de cerrar el poro, concordando con lo observado por GRIBAUDO,
NOVELLO y RESTAGNO (2001). Es por esta condicin, que todos los estomas
observados mostraban sus estomas completamente abiertos. (FIGURA 5).

4.2.3. Etapa de enraizamiento

Los estomas observados en los cortes histolgicos, en las plantas de vid, en esta
etapa, muestran la misma condicin que presentaba en proliferacin, dado que se
encuentran en las mismas condiciones anteriormente descritas, es decir, estomas
completamente maduros y abiertos (FIGURA 5).

4.2.4. Etapa de preaclimatacin

Transcurridos los tres das de preaclimatacin y al observar los cortes histolgicos
obtenidos a partir del material vegetal fijado proveniente de esta condicin se pudo
apreciar que un porcentaje bajo de estomas se mostraba alargado, no totalmente
turgente. GRIBAUDO, NOVELLO y RESTAGNO (2001) mencionan que los estomas
desarrollados en una condicin de baja humedad relativa o en una condicin ex vitro
son ms alargados, pero debido a que este no es el caso, ya que son estomas
formados en una condicin in vitro y expuestos a una menor humedad relativa
ambiental, el aparente alargamiento sera por una prdida del agua contenida en las
clulas de guarda provocada por la alta demanda ambiental, debido a su bajo
potencial hdrico atmosfrico (FIGURA 5).

4.2.5. Etapa in vivo

En estos cortes histolgicos, se observ estomas en los distintos estados de
madurez, lo que es normal para una planta mantenida en la condicin ex vitro,
adems de estomas cerrados y abiertos (FIGURA 5).

Existen varias condiciones que dificultan el aprovechamiento de la tecnologa de
anlisis de imgenes en el seguimiento de la condicin estomtica durante las
distintas etapas de la propagacin in vitro. La primera deriva de la flexibilidad natural
que tienen las hojas de la vid, que dificultan, en gran medida, la obtencin de cortes
longitudinales con el micrtomo por lo que la mayora de los cortes analizados
fueron hechos de manera transversal. La segunda condicin est relacionada con la
anterior y corresponde a la caracterstica mencionada por GRIBAUDO, NOVELLO y
RESTAGNO (2001) acerca de las hojas de la vid que presentan una condicin
hipoestomtica (estomas slo en el enves). En conjunto estas dos situaciones
impiden realizar una adecuada determinacin de la densidad estomtica en un rea
conocida debido a que los estomas se encuentran concentrados en una parte de la
imagen (enves), siendo el resto un espacio vaco y no repartidos en una zona
amplia, que corresponda en un 100% a la superficie de la hoja, como la que se
observara en un corte longitudinal. Esto es alterado tambin por los objetivos
instalados en el microscopio ptico, ya que el objetivo de 10X entrega una imagen
muy general en la que es difcil distinguir claramente la morfologa de la hoja y el de
40X entrega un campo de visin reducido. Un objetivo intermedio permitira un mejor
anlisis de las imgenes.

Por ltimo, si bien es cierto que los programas de anlisis de imgenes permiten,
luego de un ajuste de la escala realizar mediciones muy precisas, pudiendo
fcilmente entregar mediciones en micrones (m), la gran variacin entre los
tamaos y formas de los estomas, hacen que la precisin no sea til para efectos de
anlisis de una muestra fijada, sino que sera necesario hacer un seguimiento de
cmo van madurando y desarrollndose individualmente los estomas en el tiempo.

Esto es corroborado por FILA et al. (1998) en observaciones microscpicas de
impresiones epidermales de hojas in vitro, que demostraron una alta heterogeneidad
en las dimensiones de los estomas, y esto podra asociarse con la funcionalidad
tambin heterognea.

FIGURA 5. Plantas micropropagadas de vid en las etapas de A) establecimiento, se
observan estomas de menor tamao cerrados y estomas de mayor
tamao abiertos; B) proliferacin, se observan totalmente abiertos; C)
enraizamiento, se observan completamente maduros y abiertos; D)
preaclimatacin con sellos de mascarilla, se observan completamente
desarrollados y abiertos; E) preaclimatacin con sellos de papel filtro,
ac tambin se observaron estomas abiertos y algunos de forma
alargada y F) Estomas de plantas in vivo, se observan distintos estados
de madurez.

B A
D C
E F
5. CONCLUSIONES

Las pruebas estadsticas no mostraron diferencias significativas entre los distintos
sistemas de sellado en la etapa de preaclimatacin aplicados a plantas de vid y
cerezo Gisela 5.

Debido a lo anterior, no habra necesidad de aplicar mtodos de preaclimatacin a
ninguna de estas especies.

Al preaclimatar, no se logr aumentar la sobrevivencia de las plantas de vid y cerezo
micropropagadas.

Al analizar, mediante el uso de fotografas de cortes histolgicos, la condicin en la
que se presentaban los estomas en cada una de las etapas secuenciales, se
determin que en todas las etapas in vitro, los estomas se encontraron abiertos, y
en la etapa in vivo, se apreci una alta heterogeneidad entre estomas cerrados y
abiertos.

6. RESUMEN

En el Laboratorio de Propagacin Profesor Gregorio Rosenberg, de la Facultad de
Agronoma de la Pontificia Universidad Catlica de Valparaso, ubicada en la calle
San Francisco s/n, la Palma, Provincia de Quillota, V Regin, se evalu distintos
sistemas de sellado en la etapa de preaclimatacin de plantas de vid (Vitis vinifera
L.) y cerezo (Prunus cerasus x Prunus canescens) Gisela 5 propagadas in vitro, y
posteriormente se evalu la sobrevivencia de estas plantas en la etapa de
aclimatizacin.

Como explante, en la etapa de establecimiento, se utiliz segmentos nodales, los
que posteriormente fueron repicados en las etapas de la micropropagacin. Los
ensayos de preaclimatacin se realizaron durante la etapa de enraizamiento in vitro.
Como medio de enraizamiento para vid se trabaj con un MS (MURASHIGE y
SKOOG, 1962), con la sal NH
4
NO
3
, reducida a la mitad y el resto de las sales
reducidas a tres cuartos, adicionado con tiamina (0,4%), AIA (0,2 mg/l), NaH
2
PO
4

(150 mg/l), Myoinositol (25 mg/l), sacarosa al 1%, y todo esto ajustado a pH 5,7
(MESA, 2001). En cuanto a cerezo, el medio de enraizamiento tambin se realiz en
base a sales de MURASHIGE y SKOOG (1962) con una concentracin mineral
reducida a la mitad suplementado con 1 mg/l de AIB (CCERES, 2004).

En el ensayo para ambas especies por igual, se realiz tres tratamientos, el primero
correspondiente al control con papel de aluminio, el segundo con sellos de
polipropileno en tres capas y el tercero con un sello de papel filtro Whatman 1 o
MFS N2, posteriormente los frascos se sellaron por la parte lateral con vitafilm,
para afirmar las cubiertas.

Para ambos casos, no hubo diferencia estadstica significativa en la sobrevivencia
de las plantas al aplicar los tratamientos.

Al analizar, mediante fotografas los cortes histolgicos en vid, en las distintas
etapas secuenciales, se observ en todas las etapas in vitro, los estomas abiertos, y
en la etapa in vivo, una alta heterogeneidad entre estomas abiertos y cerrados.

7. ABSTRACT

In the Professor Gregorio Rosenberg Propagation Laboratory, at the Agronomy
Faculty of the Pontificia Universidad Catlica de Valparaso, La Palma, province of
Quillota, V region, different seal systems for the pre-acclimation stage of grapevine
(Vitis vinifera L.) and Gisela 5 cherry (Prunus cerasus x Prunus canescens) in vitro
propagated plants were evaluated and later, the survival of these plants, in the
acclimatization stage, was analyzed.

As an explant, in the establishment stage, nodal segments were used, which were
later divided in the micropropagation stages. The preacclimation tests were carried
out during the in vitro rooting stage. As a rooting medium for the grapevine, an MS
(MURASHIGE and SKOOG, 1962) was used, with the salt NH
4
NO
3
reduced to one
half strength and the rest of the salts reduced to three quarters of their original
strength, additional thyamine (0,4%), IAA (0,2 mg/l), NaH
2
PO
4
(150 mg/l),
Myoinositol (25 mg/l), and sacarose (1%), all adjusted to a pH of 5,7 (MESA, 2001).
For cherry, the rooting medium was also made based on the MURASHIGE and
SKOOG (1962) salts, with a mineral concentration reduced by half and adding 1 mg/l
of IBA (CCERES, 2004).

For experiments on both species, there were 3 treatments: the first was a control,
with aluminium foil, the second used polypropylene seals, and the third one used
Whatman 1 or MFS N2 filter paper seals. Later on the jars were sealed, on the side,
with vitafilm, in order to secure the covers.

In both cases, there was no significant statistical difference on the plant survival after
application of the treatments.

When analyzing, by photograph, the histological cuts of the grapevines, in the
different sequential stages, it was seen that, during all of the in vitro stages, stomata
were open and that during the in vivo stages, there was a high heterogeneity
between open and closed stomata.

8. LITERATURA CITADA

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Moran Paola

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