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Gastr Latinoam 2006; Vol 17, N 2: 249-252

(1)
Laboratorio de Biologa Molecular. Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
Diagnstico serolgico y virolgico
de la hepatitis C y B: Aspectos prcticos
Gabriela Muoz G.
(1)
SEROLOGIC AND VIROLOGIC DIAGNOSIS OF HEPATITIS B AND C INFECTION:
PRACTICAL
MDULO 6: HEPATITIS VIRAL I
Diagnstico de virus hepatitis B y C
El uso de tests virolgicos en el estudio de
las hepatitis virales se ha convertido en una
herramienta esencial para el diagnstico de es-
tas infecciones, el lineamiento de las decisio-
nes teraputicas y para la evaluacin de la
respuesta al tratamiento antiviral.
Si bien ambos agentes producen un cuadro
clnico similar, tratndose de dos virus con ca-
ractersticas genmicas y estructurales dife-
rentes; la aproximacin para su estudio de la-
boratorio ser diferente en cada caso y de-
pender de la etapa de la infeccin, del uso o
no de tratamiento antiviral y de las herramien-
tas diagnsticas disponibles y sus limitaciones.
En trminos generales, existen 2 etapas en
el estudio de las hepatitis virales por los virus
B y C: la primera es el estudio diferencial que
nos dar el diagnstico etiolgico y la se-
gunda se refiere al monitoreo y seguimien-
to de los pacientes agudos/crnicos, que nos
permitir evaluar la persistencia o evolucin a
la cronicidad, as como el pronstico de seve-
ridad del dao y de respuesta al tratamiento
antiviral.
Diagnstico etiolgico y seguimiento
Los tests virolgicos para el estudio de am-
bos agentes se pueden dividir en dos grandes
aproximaciones: a) tests serolgicos (mar-
cadores serolgicos) para el estudio de anti-
cuerpos y/o antgenos, los que utilizamos prin-
cipalmente para la identificacin inicial del agen-
te etiolgico y/o la evaluacin de la etapa de la
infeccin y b) tests moleculares para el es-
tudio cualitativo y/o cuantitativo del RNA o
DNA viral y su tipificacin. El uso de cada
uno de ellos tiene sus indicaciones precisas,
que dependern del agente que estamos estu-
diando y de la informacin que requiere el
clnico en un momento determinado de la in-
feccin.
Virus hepatitis C (VHC)
Es un virus perteneciente a la familia Flavi-
viridae, gnero hepacivirus, que contiene un
RNA monohebra de polaridad positiva de 9,4
Kb, el cual se ha logrado identificar y estudiar
fundamentalmente a travs de tcnicas de bio-
loga molecular. Se conoce su estructura gen-
mica en su totalidad, a partir de la cual se han
desarrollado todas las tcnicas de laboratorio
en la actualidad disponibles.
El estudio de la infeccin por VHC se reali-
za inicialmente a travs de la deteccin de los
anticuerpos anti VHC (tipo IgG), mediante tc-
nicas inmunoenzimticas. La sensibilidad de
stas es mayor del 98%, y permite detectar
una seroconversin entre las 4 y 10 semanas
post infeccin (tests de 2 y 3 generacin).
Pese a la alta sensibilidad, estos ensayos pre-
sentan limitaciones relacionadas con el agente
y la condicin del husped:
a) No permite discriminar entre los sujetos con
infeccin aguda, crnica o pasada con re-
cuperacin. Los anticuerpos perduran de por
vida en los pacientes crnicos y por ms de
18-20 aos en aquellos que se recuperan,
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G. MUOZ G.
ya sea en forma espontnea (20-30% de
casos) o post tratamiento antiviral.
b) Seroconversin tarda: no permite la detec-
cin precoz de una infeccin aguda.
c) Falsos positivos: en poblacin sana y de bajo
riesgo como donantes de sangre y pacien-
tes con autoinmunidad.
d) Falsos negativos: en pacientes inmuno-com-
prometidos (VIH, hemodializados).
e) Traspaso transplacentario: no discrimina en-
tre una infeccin del recin nacido y los
anticuerpos maternos.
En cada uno de estos casos particulares, as
como en todos los sujetos/pacientes donde se
detecte un anti-VHC positivo, es necesario de-
terminar la presencia de viremia circulante.
Esta se realiza mediante la deteccin de RNA
viral cualitativa (PCR) y nos permite evaluar
la existencia de replicacin viral activa y con-
firmar una infeccin activa o pasada por VHC.
Por lo tanto, el estudio de VHC por PCR es-
tar indicado en todo paciente o sujeto anti -
VHC positivo y en los casos de dudas diag-
nsticas antes descritos. Adems, por su alta
sensibilidad (< 100 copias de RNA/ml, < 50
UI/ ml) es de gran utilidad para la deteccin
precoz de una primo-infeccin (deteccin a
partir de 2 semanas post infeccin), y para la
evaluacin post tratamiento antiviral, cuando
la sensibilidad del mtodo sea superior a la de
los mtodos de cuantificacin viral disponibles.
La deteccin cuantitativa de RNA (carga
viral, cuantificacin) y el estudio de genotipo
viral (genotipificacin) estn indicados en los
casos agudos o crnicos que sern sometidos
a terapia antiviral. El primero de ellos permite
evaluar el pronstico de una respuesta virol-
gica: a mayor carga viral basal, menor proba-
bilidad de una respuesta sostenida. El estudio
del genotipo viral, por otro lado, constituye un
factor importante en la determinacin de una
respuesta antiviral favorable: los genotipos 2 y
3 presentan una tasa de respuesta virolgica
sostenida mayor que aquellos pacientes infec-
tados con el genotipo 1. Por lo anterior, cono-
cer el genotipo de VHC permitir definir la
duracin del tratamiento, dependiendo de la
cepa circulante en cada paciente (24 48 se-
manas, respectivamente). El estudio de labo-
ratorio de los genotipos virales se realiza por
diferentes mtodos, todos ellos igualmente es-
pecficos y comparables a nivel de genotipo (1
a 6). Algunos de ellos permiten adems
subtipificar (1a, 1b, 2a, etc), lo cual, desde el
punto de vista clnico no tiene mayor signifi-
cancia.
La respuesta al tratamiento antiviral se eva-
la considerando una carga viral basal (pre-
tratamiento) y al menos una carga viral al tr-
mino de ste y a las 24 semanas post trata-
miento. Se considera una buena respuesta al
tratamiento antiviral si se obtiene una carga
viral indetectable al trmino del tratamiento y
una carga viral indetectable y/o RNA cualita-
tivo negativo a las 24 semanas (respuesta viral
sostenida). Adicionalmente, se ha determinado
que una carga viral temprana (respuesta viral
precoz) , con cada de 2 log 10 o ms a las 4
12 semanas intra-tratamiento, permite evaluar
precozmente la probabilidad de obtener una
respuesta virolgica sostenida al trmino de la
terapia.
Debido a que el objetivo de la terapia antiviral
es la eliminacin del virus circulante en san-
gre, el estudio virolgico post tratamiento de-
biera considerar el mtodo de deteccin cuali-
tativo o cuantitativo que presente los menores
lmites inferiores de sensibilidad, adems de
presentar un amplio rango de linearidad (lmi-
tes inferior y superior de deteccin amplio y
reproducible).
Los mtodos de cuantificacin de VHC co-
merciales presentan 2 limitantes importantes:
tienen diferentes lmites de deteccin y an no
poseen un denominador comn de medicin,
por lo tanto no son equivalentes ni compara-
bles. Si bien todos ellos son igualmente confia-
bles, es aconsejable utilizar el mismo mtodo
para el seguimiento individual de cada pacien-
te, y no utilizar factores de correccin para
equiparar las unidades de medicin.
Los mtodos ms utilizados para la cuan-
tificacin viral son aquellos que utilizan la am-
plificacin del RNA (PCR competitiva; PCR
en tiempo real) o la amplificacin de seales
(DNA ramificado, bDNA). Los primeros tie-
nen un rango dinmico de 600-850.000 UI/ml
y de 30-200.000.000 UI/ml, respectivamente.
El bDNA (Versant 3a generacin) se expresa
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en copias/ml (rango 3.200-40 millones) y la
versin anterior de este ensayo en equivalen-
tes genmicos/ml (rango desde 200 mil).
Finalmente, dado que todos estos mtodos
se basan en la acumulacin exponencial de
productos amplificados/seales, los nmeros
absolutos expresados en ellos son referenciales
y la evaluacin de una cada significativa de
una carga viral debe ser evaluada siempre en
funcin de la diferencia en logs en base 10.
Virus hepatitis B
Es un virus DNA de doble hebra parcial,
semicircular, con envoltura, perteneciente a la
familia Hepadnaviridae. Presenta 3 sistemas
antignicos principales: el antgeno de superfi-
cie (HBsAg) en su estructura ms externa, deri-
vado de los genes S, Pre-S 1 o Pre-S 2-, el
antgeno Core HBcAg, derivado del gen C) y
el antgeno e (HBeAg, gen pre-Core). Cada
uno de ellos dar origen a anticuerpos espec-
ficos (anti-HBs, anti- HBc IgM, anti-HBc to-
tal, anti-HBe). La presencia o ausencia de cada
uno de estos marcadores estar asociada a
diferentes etapas de la infeccin por VHB.
La deteccin positiva del antgeno de super-
ficie y del anticore IgM, nos orienta en la ma-
yora de los casos al diagnstico de una infec-
cin aguda por VHB. Ambos marcadores apa-
recen precozmente y perduran detectables en
la sangre entre 3 y mximo 6 meses, respecti-
vamente. La persistencia de HBsAg por ms
de 6 meses determina la condicin de infec-
cin crnica por este agente, la cual se acom-
paa generalmente de un anticore total positi-
vo y un anticore IgM negativo. El estudio del
antgeno e nos permite diferenciar entre una
baja (e negativo) y una alta replicacin viral (e
positivo), y ste se negativiza precozmente du-
rante el curso de una infeccin aguda, apare-
ciendo el anti-HBe (seroconversin).
La deteccin positiva de anti-HBs es indi-
cador de recuperacin de la infeccin e inmu-
nidad (natural o post vacunacin), apareciendo
tardamente post desaparicin del antgeno de
superficie (alrededor de 6 meses) cuando hay
resolucin y no detectndose, en general, en
los portadores crnicos.
La deteccin cualitativa de DNA viral (PCR)
es otra herramienta de laboratorio que sera
de utilidad, siendo su mayor indicacin frente
a dudas diagnsticas de un resultado falso po-
sitivo de HBsAg (hemodializados, autoinmu-
nidad) o negativo de anti-HBc (inmunodepre-
sin).
Infeccin crnica por VHB
En los casos de infeccin crnica por este
agente, los tests virolgicos han pasado a ser
de gran apoyo para evaluar el pronstico de
dao heptico y la evolucin de la infeccin
natural o post tratamiento. El sistema HBeAg/
anti HBe permite evaluar la magnitud de la
replicacin viral e indirectamente evaluar la
respuesta al tratamiento antiviral en un pa-
ciente antgeno e positivo. La seroconversin
en estos casos es indicador de una disminu-
cin de la replicacin viral, objetivo ltimo del
tratamiento. Se sabe adems, que la positividad
del antgeno e se relaciona estrechamente con
la carga viral medida a travs de los mtodos
moleculares, siendo sta > a 100.000 copias/
ml en promedio. Este ltimo ensayo permite
diferenciar a los pacientes infectados entre
aquellos con infeccin crnica activa o inacti-
va ( > < a 100 mil copias respectivamente).
La cuantificacin de VHB es el examen de
eleccin para el monitoreo de la terapia antiviral,
considerndose una buena respuesta la cada
de 2 o ms log10 entre una carga viral basal y
una 2 medicin durante o post trmino del
tratamiento. Permitir adems, detectar aque-
llos casos de infeccin con mutantes pre-core
(hasta 40% en zonas de alta endemia) donde
existe ausencia de antgeno e, a pesar de una
alta carga viral y detectar la aparicin de mu-
tantes resistentes a antivirales (aumento signi-
ficativo de la carga viral).
Los ensayos de cuantificacin de VHB tie-
nen las mismas limitaciones descritas para el
VHC, en cuanto a rangos de deteccin y uni-
formidad en las unidades de medicin. La ten-
dencia mundial es unificar todos estos ensayos
en un sistema comn de UI/ml.
Los ensayos cuantitativos para VHB deben
ser de gran sensibilidad y con amplios rangos
DIAGNSTICO SEROLGICO Y VIROLGICO DE LA HEPATITIS C Y B: ASPECTOS PRCTICOS
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de deteccin para poder evaluar correctamen-
te la respuesta antiviral en estos pacientes,
puesto que de ello depende la mantencin, sus-
pensin o cambio de una terapia determinada.
Existen en la actualidad varias alternativas, a
nivel mundial, que cumplen con estas caracte-
rsticas pero pocas de ellas disponibles en nues-
tro pas. El mtodo de PCR en tiempo real
(Taqman Cobas) es uno de los ensayos de
eleccin por su alta sensibilidad y mayor linea-
ridad: rango de 30 a 110 millones de UI/ml,
desplazando al PCR competitivo (Monitor, ran-
go 1.000 a 40 millones de copias/ml).
Otros estudio moleculares
Se describen al menos 7 genotipos diferen-
tes para VHB (A-G), cuya distribucin difiere
en las distintas regiones geogrficas, los cua-
les se han relacionado con mayor severidad y/
o menor respuesta al tratamiento. Si bien an
se discute su importancia clnica, existen va-
rios mtodos para su estudio: enzimas de res-
triccin (RFLP), hibridacin reversa, secuen-
ciacin directa.
Estudio de mutaciones
Las mutaciones descritas en el VHB son
de diferentes tipos, cada una de las cuales
tiene una aproximacin clnica diferente y para
las cuales existen hoy en da ensayos comer-
ciales para su estudio: mutantes pre-core/core
promotor; mutantes resistentes a terapia (gen
Pol); mutantes del antgeno de superficie, aso-
ciadas a vacuna (gen S). Las dos primeras se
han relacionado con mayor dao heptico, me-
nor respuesta y/o alta replicacin viral.
Con la creciente disponibilidad de diferentes
alternativas de tratamiento contra el VHB, nue-
vos ensayos moleculares van adquiriendo ma-
yor relevancia, especialmente para la detec-
cin precoz de mutantes resistentes a lami-
vudina (YMDD, hibridacin reversa). Su estu-
dio estara indicado en los tratamientos prolon-
gados con este antiviral, detectndose precoz-
mente la mutacin previo al aumento de la
carga viral.
Los mtodos comerciales de hibridacin
reversa tambin permitiran estudiar las muta-
ciones a nivel de pre-core, cuya indicacin an
no est claramente definida desde el punto de
vista clnico.
Bibliografa
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Correspondencia a:
Gabriela Muoz Gmez
Seccin Gastroenterologa. Hospital Clnico Universidad
de Chile.
Santos Dumont 999.
E-mail: gmunoz@redclinicauchile.cl
G. MUOZ G.