FUNDACIN UNIVERSITARIA DE SAN GIL

UNISANGIL

PRACTICA
No. 4


CUANTIFICACIN DE MICROORGANISMOS
POR TURBIDIMETRA

.
Fundacin Universitaria de San Gil UNISANGIL, Ciencias Naturales e Ingeniera
Ingeniera Ambiental
Yopal, Colombia


Resumen En esta cuarta prctica que se
realiz en el laboratorio, fue una serie de ensayos
los cuales consistan en la utilizacin del
espectrofotmetro para as poder lograr
cuantificar la cantidad de bacterias contenidas en
cada una de las muestras que vamos analizar, con
este mtodo lograremos saber la cantidad de
bacterias que hay por medio de la luz que es
absorbida por los microorganismos, los cuales son
sometidos a una luz plenamente programada. Para
llevar a cabo la prctica se necesit 10 tubos de
ensayo en los cuales se les suministraron 1 ml de
cloruro de bario con la ayuda de una pipeta de 10
ml, el paso siguiente fue agregarle el volumen
determinado de cido sulfrico, con ayuda del
espectrofotmetro el cual fue calibrado con un
tubo de ensayo que contena agua destilada, para
finalmente poder registrar los valores de densidad
ptica en las abscisas, el nmero aproximado de
bacterias representado y registrado en una tabla de
datos. Se diluyeron las muestras para que el
equipo registrara datos concretos, al colocar cada
muestras se calibro el equipo antes de realizar la
medicin utilizando el agua destilada como un
blanco, se determin las concentracin de la
muestra problema de la densidad ptica.




Palabras clave - Cuantificacin,
microorganismos, espectrofotmetro y turbidez

Abstract In this fourth practice held in the
laboratory, was a series of tests which consisted of
the use of the spectrophotometer in order to be
able to quantify the number of bacteria contained
in each of the samples that we analyzed , this
method will achieve namely no amount of bacteria
by means of light that is absorbed by the
microorganisms , which are subjected to light
fully programmed . To conduct practice needed 10
test tubes which were provided with 1 ml of
barium chloride with the aid of a 10 ml pipette ,
the next step was to add the specific volume of
sulfuric acid, using the spectrophotometer which
was calibrated with a test tube containing distilled
water , to finally record the optical density values
on the abscissa , the approximate number of
bacteria represented and recorded in a data table .
Samples were diluted so that the team recorded
facts, to place each sample was calibrated
equipment prior to measurement using distilled
water as a blank , we determined the concentration
of the test sample optical density .

Keywords - Quantification, microorganisms,
and turbidity spectrophotometer.





I. INTRODUCCION

Los mtodos directos de cuantificacin de
microorganismos permiten establecer la poblacin
total de microorganismos existentes, tienen la
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ventaja de ser rpidos aunque no es posible
diferenciar a las clulas vivas de las muertas.
Entre estos mtodos tenemos la turbidimetra y el
conteo de clulas.

TURBIDIMETRA

La determinacin de la turbidez (turbidimetra) es
un mtodo prctico para controlar el crecimiento
bacteriano. Cuando las bacterias se multiplican en
un medio lquido este se torna turbio o nebuloso
por las clulas. El instrumento utilizado para
medir la turbidez es un espectrofotmetro. En el
espectrofotmetro un haz de luz se transmite a
travs de una suspensin bacteriana a una clula
fotoelctrica. Cuando la cantidad de bacteria
aumenta, menos luz alcanza la clula fotoelctrica.
Este cambio de luz se registra en la escala del
instrumento como porcentaje de transmisin.
Tambin se puede determinar como una medicin
logartmica del instrumento denominada
absorbancia o como un valor derivado del
porcentaje de transmisin.
La absorbancia se utiliza para graficar el
crecimiento bacteriano. Cuando las bacterias estn
en fase logartmica de crecimiento o de
declinacin la representacin de la absorbancia
frente al tiempo forma una lnea casi recta. Si las
lecturas de la absorbancia son compatibles con el
recuento en la placa del mismo cultivo esta
correlacin se puede utilizar en estimaciones
futuras del nmero de bacterias obtenidas
directamente por turbidimetra. Para que puedan
visualizarse las primeras trazas de turbidez debe
haber ms de un milln de clulas por mililitro y
se precisan de 10 a 100 millones por mililitro para
que la suspensin se vuelva lo bastante turbia
como para ser medida en un espectrofotmetro.
Por lo tanto la turbidimetra no es un mtodo til
para medir la contaminacin de lquidos por un
nmero relativamente pequeo de bacterias.
En una suspensin microbiana la cantidad de
microorganismos est directamente relacionada
con la turbiedad o densidad ptica

RECUENTO MICROSCPICO

Un volumen conocido de muestra es depositado
en un portaobjetos especial para cuenta

(hemacitmetros), cmaras de Petroff-Hauser,
Neubauer o de Helber; estas consisten de
portaobjetos excavados y cuadriculados que
facilitan el recuento por unidad de superficie y de
volumen. Con la cuantificacin de
microorganismos a travs del tiempo es posible el
representar grficamente el crecimiento
microbiano. La curva presenta distintas fases:
Fase de latencia lag: perodo de
adaptacin de un microorganismo a un
nuevo medio de cultivo,
Fase exponencial o logartmica: aumento
regular de la poblacin que se duplica a
intervalos regulares de tiempo (td).
Fase estacionaria: cese del crecimiento
por agotamiento de nutrientes, por
acumulacin de productos txicos, etc,
Fase de declinacin o muerte: el nmero
de clulas que mueren es mayor que el
nmero de clulas que se dividen.
Las propiedades de un microorganismo
dependern de la fase de la curva en que se
encuentren (por ejemplo la produccin de
antibiticos se lleva a cabo en la fase estacionaria)



II. MATERIALES Y
METODOS

Materiales.
Espectrofotmetro.
1. Gradilla
10 Tubos De Ensayo
1. Pipetas de 1 y 10 ml
1. Asa de siembra.

Reactivos:
Solucin salina
Cultivo de bacterias
Solucin de cloruro de bario 1%
cido sulfrico 1%




III. METODOLOGIA

Escala de McFarland
1. Marcamos los tubos con los nmeros indicados
en la tabla.
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2. Con la pipeta de 1ml, agregamos a cada uno de
los tubos el volumen de bario indicado en la tabla.
3. Con la pipeta de 10ml, agregue a cada tubo los
volmenes correspondientes de cido sulfrico.
4. Con el espectrofotmetro determine la OD de
las diferentes mezclas. Para ello calibrar el aparato
con un tubo que contenga agua destilada.
5. Graficar las lecturas, colocando en la ordenada
(eje y) los valores de OD registrados y en las
abscisa (eje x) el nmero de bacterias (U.F.C/ml)
calibrado en la escala de McFarland
6. Completar la tabla indicada consultando el
valor de densidad ptica terica para cada uno de
los tubos.
7. Graficar las OD tericas y las experimentales
de cada solucin Vs las U.F.C equivalentes para
cada solucin mostradas en la tabla, esto con el
propsito de comparar las grficas.


IV. Lectura de muestra problema:

1. Determinar la densidad ptica de la
muestra problema. Diluir de ser
necesario, si el equipo no registra un dato
concreto.
2. Calibrar el equipo antes de realizar la
medicin, generando un blanco a partir
de agua destilada estril.
3. Determinar la concentracin de la
muestra problema a travs de la
determinacin de su densidad ptica y su
ubicacin en la grfica construida en el
aparte anterior, determinando las
U.F.C/ml que le corresponden.





ANEXOS FOTOGRAFICOS:

Fig. 1. Tenemos los 10 tubos de ensayos
previamente esterilizados y marcado cada uno
correspondientemente



Fig. 2. Utilizacin de los reactivos para las
mezclas de cada uno de los tubos de ensayo.






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Fig. 3. Se le agrego la mezcla de los reactivos con
los ml exigidos en cada uno de los tubos de
ensayo.

Fig. 4. El tubo de ensayo utilizado en el
espectrofotmetro con el agua destilada para la
calibracin adecuada.



Fig. 5. Tubos de ensayo con el respectivo
contenido de las solucin.




Fig. 6. Calibracin del espectrofotmetro y
seguidamente colocando las diluciones para as
poder cuantificar la turbiedad de las respectivas
muestras.


V. ANALISIS Y DISCUSIN DE
RESULTADOS

En trminos generales podemos notar que
mientras aumenta la cantidad de unidades
formadoras de colonia, hay un aumento de igual
forma de la densidad ptica experimental.
Tuvimos que repetir varias veces el experimento,
unas 4 veces, se repiti el mismo procedimiento
desde la primer muestra en el tubo de ensayo,
porque siempre notbamos que disminua en la
nmero 4, lo cual nos obliga a realizar de nuevo el

procedimiento. Siempre se tom los datos de
forma ascendente en la parte terica y descendente
en la experimental. Como lo demuestra la grfica.


cido sulfrico (SO
4
H
2
) = 94,5 ml

V
1*
C
1
= V
2 *
C
2

V
1
= V
2 *
C
2 =
100ml*0,01
C
1
0, 96

= 1, 04 ml SO
4
H
2
para una
concentracin100ml=1%


Cloruro de Bario

1 gr/100 ml

Cl 100 ml
X 10 ml

X = 10/100 = 0,1 gr a este se le agrega 10 ml de
agua destilada.



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TUBO Cl
2
Ba 1% SO
4
H
2
1% U.F.C/ml O.D
Terico
O.D Experimental
1 0,1 9,9 3,00E+08 0,147 74,3
2 0,2 9,8 6,00E+08 0,294 50,7
3 0,3 9,7 9,00E+08 0,325 47,5
4 0,4 9,6 1,20E+09 0,350 40,1
5 0,5 9,5 1,50E+09 0,372 42,2
6 0,6 9,4 1,80E+09 0,465 34.5
7 0,7 9,3 2,10E+09 0,510 31.0
8 0,8 9,2 2,40E+09 0,601 25.0
9 0,9 9,1 2,70E+09 0,613 24,3
10 1 9 3,00E+09 0,698 20,0
Tabla 1. Se registraron los datos obtenidos en el laboratorio en una tabla, como lo peda la gua.



















Grfica y Tabla 1. Comparacin de los
resultados de la escala terica experimental y
experimental.

1. EXISTEN DIFERENCIAS ENTRE
TURBIDIMETRA Y
ESPECTROFOTOMETRA, EN QU
CONSISTEN?

La espectrofotometra es el mtodo de anlisis
ptico ms usado en las investigaciones
biolgicas. El espectrofotmetro es un
instrumento que permite comparar la radiacin
absorbida o transmitida por una solucin que
contiene una cantidad desconocida de soluto, y

0
10
20
30
40
50
60
70
80
t
u
b
o

1
t
u
b
o

2
t
u
b
o

3
t
u
b
o

4
t
u
b
o

5
t
u
b
o

6
t
u
b
o

7
t
u
b
o

8
t
u
b
o

9
t
u
b
o

1
0
Escala de Mc
farland
experimental
Escala de Mc
Farland teorica
Escala de Mc
Farland
experimental
Escala de
Mc Farland
terica
tubo 1 74,3 0,147
tubo 2 50,7 0,294
tubo 3 47,5 0,325
tubo 4 40,1 0,35
tubo 5 42,2 0,372
tubo 6 34,5 0,465
tubo 7 31 0,51
tubo 8 25 0,601
tubo 9 24,3 0,613
tubo 10 20 0,698
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una que contiene una cantidad conocida de la
misma sustancia La turbidimetra mide la
disminucin de la luz transmitida a travs de una
suspensin de partculas utilizando para ello un
espectrofotmetro (detector en la misma direccin
del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar
para soluciones concentradas (para que haya una
buena disminucin de la luz transmitida)

VI. CONCLUSIONES

Mientras aumenta la cantidad de U.F.C
aumenta de igual manera la densidad
ptica experimental.

El mtodo de McFarland se basa
principalmente en la medicin de la
cantidad de luz dispersa o transmitida a
travs de un cultivo bacteriano, lo cual
debe ser realizado correctamente, para
que los resultados no varen, si estos son
alterados varan proporcionalmente.

Podemos observar que por medio de la
Escala de McFarland y por
espectrofotometra, creamos una recta de
patrn, de forma que podamos detectar la
concentracin de nuestras diluciones
bacterianas, la escala se basa en la
capacidad de precipitacin del cloruro de
bario en presencia de cido sulfrico.

Se establecieron los objetivos prcticos
donde determinamos que para lograr un
mtodo adecuado de cuantificacin por el
mtodo de McFarland, hay que tener en
cuenta algunas variables para realizar
adecuadamente el mtodo y prevenir
errores.


VII. BIBLIOGRAFIA

1) http://docencia.izt.uam.mx/smk/233155/p
racticas/Practica%206.pdf
2) http://es.scribd.com/doc/15957855/8-
Cuantificacion-de-microorganismos-por-
turbidimetria
3) http://perso.wanadoo.es/sergioram1/espe
ctrofotometria.htm

4) http://es.scribd.com/doc/54885577/Turbi
dimetria-y-Nefelometria
5) http://www.upct.es/~minaeees/analisis_a
guas.pdf
6) http://www.iacinternacional.com.ar/index
.php/productos/reactivos/inmunoturbidim
etria/turbidimetria-vs-nefelometria.
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