CLONACIN

Clonacin
Produccin de un gran nmero de copias
de una regin de ADN (fragmentos o
genes) o de ADNc
Clula anfitriona
Clonacin
Acelular Celular
PCR
Objetivos
de la
clonacin
Amplificacin
Secuenciacin
Estudio de estructura de cido nucleicos
Estudio de homologa entre especies
Identificacin de mutaciones; por ej. asociadas a
enfermedad
Expresin
Estudio del proceso de transcripcin y
traduccin
Estudio de regulacin (promotores)
Produccin de
protena o ARN
(formas normales
o alteradas)
Para su identificacin
Para su estudio (propiedades funcin)
Para aplicarla (produccin comercial),
diagnstico, teraputico, nutricin,
industria.
Ingeniera de protena con alteraciones
de sus propiedades (para estudio o
aplicacin)
Etapas
1. Preparacin del inserto de ADN a clonar
2. Preparacin del vector
3. Unin del fragmento de ADN al vector
4. Introduccin del ADN recombinante en una
clula anfitriona
5. Propagacin celular y seleccin del clon con el
gen de inters
6. Anlisis del gen clonado
Preparacin del inserto de ADN a clonar
Preparacin del inserto de ADN a clonar
Hibrido ARNm:ADNc
Transcriptasa inversa
---GAUUGCAAUCG----AAAAAAAA
---GAUUGCAAUCG----AAAAAAAA
TTTTTTTTT
---GAUUGCAAUCG----AAAAAAAA
---CTAACGTTAGC----TTTTTTTTT
---GAUUGCAAUCG----AAAAAAAA
CCCCC---CTAACGTTAGC----TTTTTTTTT
CCCCC---CTAACGTTAGC----TTTTTTTTT
CCCCC---CTAACGTTAGC----TTTTTTTTT
ARNm
Cola poli A
Cebador oligo dT
5 3
5 3
3
5
dNTPs
5 3
3 5
Transferasa terminal (aade al extremo 3)
CTPs
Hidrlisis alcalina (degrada slo el ARN)
5 3
3 5
Oligo dG + dNTPs DNApolI
GGGGG---GATTGCAATCG----AAAAAAAA
ADNc monocatenario
ADNc bicatenario
Preparacin del inserto de ADN a clonar
3 5
3 5
ADN
* VECTORES
* ENZIMAS
* PREPARACIN DEL INSERTO
* METODO DE TRANSFORMACIN
* SELECCIN DE CLONES
vector
DNA
recombinante
Enzima de
restriccin
Ligasa
Etapas
1. Preparacin del inserto de ADN a clonar
2. Preparacin del vector
3. Unin del fragmento de ADN al vector
4. Introduccin del ADN recombinante en una
clula anfitriona
5. Propagacin celular y seleccin del clon con el
gen de inters
6. Anlisis del gen clonado
Vector de clonacin
Un vector es una molcula de ADN de tamao
pequeo, fcil de aislar y caracterizar, con
secuencia y mapa de restriccin conocidos.
Deben ser fciles de introducir en una clula
anfitriona y una vez all deben tener capacidad
de REPLICACIN AUTNOMA.
Muchos sitios de restriccin
Por lo menos un gen marcador que permita
distinguir cuales clulas llevan el ADNr
Vectores de clonacin y de expresion
Vectores de clonacin
Vectores de clonacin
Plsmidos
lacZ
polylinker
amp
pUC18
2686pb
ori
EcoRI
SacI
KpnI
SmaI
BamHI
XbaI
SalI
PstI
SphI
HindIII
Vectores de clonacin
Plsmidos
ADN
* VECTORES
* ENZIMAS
* PREPARACIN DEL INSERTO
* METODO DE TRANSFORMACIN
* SELECCIN DE CLONES
vector
DNA
recombinante
Enzima de
restriccin
Ligasa
Vectores de clonacin
Virus
Vectores de clonacin
Virus
Vectores de clonacin
Quimeras: Csmidos
Combina las ventajas de plsmidos y fagos
El fragmento plasmdico proporciona las
caractersticas de tamao pequeo, circularidad,
un origen de replicacin, sitios de restriccin,
marcadores seleccionables y la propagacin en
bacterias como si fueran plsmidos
El fragmento del fago proporciona las
secuencias cos que permite el
empaquetamiento en cpside vrica
Vectores de clonacin
Cromosomas artificiales
BACs: contienen genes que reducen su
capacidad de copia, es mas estable y no
sufre reordenamientos
YACs: contiene secuencias de
centrmero, telmeros y un origen de
replicacin.
Etapas
1. Preparacin del inserto de ADN a clonar
2. Preparacin del vector
3. Unin del fragmento de ADN al vector
4. Introduccin del ADN recombinante en una
clula anfitriona
5. Propagacin celular y seleccin del clon con el
gen de inters
6. Anlisis del gen clonado
Unin del fragmento de ADN al vector:
Formacin del ADNr
Etapas
1. Preparacin del inserto de ADN a clonar
2. Preparacin del vector
3. Unin del fragmento de ADN al vector
4. Introduccin del ADN recombinante en una
clula anfitriona
5. Propagacin celular y seleccin del clon con el
gen de inters
6. Anlisis del gen clonado
Introduccin del ADN recombinante en una
clula anfitriona
Clula anfitriona: procariota
Escherichia coli
Fcil de obtener
Fcil manipulacin
Fcil de multiplicar
Se conoce su gentica
Introduccin del ADN recombinante en una
clula anfitriona
Clula anfitriona: eucariota
Saccharomyces cerevisiae
Mas difciles de obtener y mantener, se utilizan con fines especficos como anlisis
de la regulacin gnica y expresin de protenas
Clulas individuales
Crecimiento rpido y econmico,
manipulables
Organizacin eucariota
De inters biotecnolgico por su capacidad
de expresin y maduracin de protenas
Mtodos de introduccin del ADNr
Etapas
1. Preparacin del inserto de ADN a clonar
2. Preparacin del vector
3. Unin del fragmento de ADN al vector
4. Introduccin del ADN recombinante en una
clula anfitriona
5. Propagacin celular y seleccin del clon con el
gen de inters
6. Anlisis del gen clonado
Propagacin celular y seleccin del clon con
el gen de inters
Deteccin y seleccin del clon con el gen de
inters
Mtodos de hibridacin
Mtodos inmunoqumicos
Mtodos genticos o de seleccin fenotpica.
Genes que codifican una protena detectable
Genes de resistencia a antibitico
Genes que complementan defectos nutricionales
Deteccin y seleccin del clon con el gen de
inters
Expresin gnica
UN EJEMPLO.
Cmo hago para obtener una
secuencia de un gen desconocido?
Lacasa
I IV III II 5
3
PCR-inversa
Genotecas
PREGUNTAS???