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AISLAMIENTO MICROBIANO:

TCNICAS DE AISLAMIENTO
M G . S O N I A H E R R E R A S A N C H E Z
16/06/2014
MI CROBI OL OGI A
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INTRODUCCION(1)
En la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se
encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas.
Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de
sus propiedades, es necesario separar unos de otros y
trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axnicos
o puros.
Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene un slo tipo
de microorganismo y que procede generalmente de una sola
clula; el crecimiento de sta origina, en medio slido, una
masa de clulas fcilmente visible que recibe el nombre de
colonia.
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INTRODUCCION(2)
Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin
microbiana mixta, se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento,
que fueron desarrolladas durante el siglo XIX.
En un principio, Lister utiliz diluciones seriadas en medio lquido con
esta finalidad, pero la presencia de contaminacin, es decir, de
microorganismos no deseados, dificult el aislamiento.
La escuela de Robert Koch introdujo los medios slidos,
complementados con agar, y las placas de Petri en Bacteriologa,
permitiendo as la separacin fsica de las colonias sobre la superficie del
medio de cultivo o en el interior del mismo.
El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies
microbianas
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METODOS DE AISLAMIENTO
Para aislar clulas individuales, los microorganismos han de
ser diluidos, debido al gran numero en que normalmente estn
presentes.
La dilucin se realiza, normalmente, por uno de los siguientes
sistemas:
Siembra por estra en placa
Vertido en placa
Extensin en placa.
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Para que se pueda contar el nmero de
colonias en la placa debe estar entre 30 y 300.
A) EXTENSIN EN SUPERFICIE CON CAYADO (1)
Depositar sobre la superficie de
una placa con agar nutritivo una
gota 0,1 mL de una determinada
dilucin del cultivo de
microorganismos problema y
extenderlo con ayuda del cayado,
previamente esterilizado, en todas
las direcciones hasta que est
completamente seco. Incubar la
placa, en posicin invertida, a la
temperatura deseada (durante 24,
48 72 horas) segn el tipo de
microorganismo.

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Siembra por extensin en
superficie para recuento
A) EXTENSIN EN SUPERFICIE CON CAYADO (2)
La posicin invertida evitar que el agua de condensacin se deposite
sobre la superficie del medio, dificultando la obtencin de colonias aisladas.
Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente
el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el
volumen de muestra sembrado.
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B) ESTRA MLTIPLE EN SUPERFICIE
Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de
microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la placa con
agar nutritivo, en forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no daar el
agar.
Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada previamente, se
extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras. Este proceso se
repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas
siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en
posicin invertida.
Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que
contenga un elevado nmero de bacterias.
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C) DILUCIN EN MASA (1)
En una placa de Petri vaca se deposita un pequeo volumen conocido de
muestra y a continuacin se aade el medio de cultivo (agar nutritivo)
fundido y atemperado aproximadamente a 45C. Se mezclan ambos por
rotacin suave de la placa. De esta forma los microorganismos se
distribuirn de forma homognea en el medio de cultivo, permitiendo el
desarrollo de colonias separadas por todo el agar.
Otra variacin de esta tcnica consiste en inocular el medio de cultivo,
fundido y atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen
de la muestra. La homogeneizacin de la muestra y el medio de cultivo se
realiza por rotacin del tubo entre las manos, antes de verterlo sobre la
placa.

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C) DILUCIN EN MASA (2)
En ambos casos, trs homogeneizacin, se dejan enfriar las placas
hasta que se solidifique el medio y posteriormente se incuban a la
temperatura adecuada (siempre en posicin invertida).
Aunque con esta tcnica se obtienen colonias aisladas, generalmente
slo se utiliza para determinar el nmero de microorganismos viables
en una muestra, cuando stos son anaerobios facultativos o
microaerfilos.

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RESULTADOS
A) EXTENSIN EN SUPERFICIE
Tras el perodo de incubacin se examinarn las placas. Las colonias
aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se
ha realizado de forma correcta. Podrn diferenciarse las colonias de
acuerdo a su tamao, forma, color, textura, etc.
Esta tcnica de siembra, adems de permitir que se distingan las colonias
por su morfologa, permite el recuento de microorganismos viables.
La expresin de este recuento se hace en "unidades formadoras de
colonias" (UFC) ya que cada una procede de un slo microorganismo (o
de un grupo de microorganismos, pues en algunos casos stos tienden a
formar agregados). A partir de las colonias aisladas, los microorganismos
pueden transferirse a otros medios de cultivo para su estudio.
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B) POR ESTRA MLTIPLE EN SUPERFICIE
Tras la incubacin, se observarn las colonias aisladas en alguna
regin de la placa inoculada. Con esta tcnica se logra la separacin de
los microorganismos que se encuentran en un cultivo mixto, o bien que
proceden de m u e s t r a s h o m o g n e a s , pero en las que existe
un elevado nmero.
En las zonas donde existen colonias aisladas se puede estudiar la
morfologa colonial.
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C) DILUCIN EN MASA
Aparecen las colonias distribuidas por toda la masa
del agar. Aquellas que estn en la superficie tendrn
distintas caractersticas, dependiendo del tipo
microbiano, mientras que las colonias que se
desarrollan en el interior, bajo la superficie del agar,
tienen forma lenticular, aunque los microorganismos
que formen las distintas colonias sean de distinto tipo.
Por tanto, las colonias que aparecen en la profundidad
del agar son siempre biconvexas y no se diferencian
unas de otras por su morfologa.
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ASPECTOS COMUNES DE COLONIAS MICROBIANAS
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AISLAMIENTO A PARTIR DE TEJIDO VEGETAL
A partir del tejido vegetal enfermo es posible aislar a los patgenos.
Se busca tomar trozos de la zona de avance para incrementar las chances de aislar al
patgeno.
Los trozos de tejido vegetal se someten a una desinfeccin superficial.
En el caso de bacterias es posible macerar un trozo de tejido afectado y luego sembrar
Sembrando trozos de tejido vegetal de la zona de avance del patgeno .
Ej: a partir de frutos afectados
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AISLAMIENTO A PARTIR DE TROZOS DE TEJIDO
VEGETAL
Trozos de tejido afectado de la zona de avance son sembrados en medio de cultivo (ej.
Madera)
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AISLAMIENTO A PARTIR DE TEJIDO VEGETAL
Sembrando trozos de tejido vegetal de la zona de avance del patgeno
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AISLAMIENTO DE BACTERIA A PARTIR DEL
TEJIDO INFECTADO
Tocando con el ansa en la zona de avance de la infeccin es posible
aislar la bacteria.
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AISLAMIENTO DIRECTO A PARTIR DEL SIGNO.
Cuando la muestra vegetal presenta signo es posible tomar una
pequea porcin del mismo y sembrar en una placa con medio de
cultivo.
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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL
SUELO
Esquema de la metodologa utilizada para aislar a partir de suelo.
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