OPTIMIZACION DEL PROCESO DE FERMENTACION PARA PRODUCIR BACILLUS THURINGIENSIS

ORGANISM0 Y MEDIO DE CULTIVO:

Clulas de Bacillus thuringiensis.
Para la preservacin de la cepa, esta se siembra por estra aproximadamente cada 2 meses
en medio LB, a 29 'C por 48 horas. Se inocula con una asada, un matraz Erlenmeyer de 500 ml
con 100 ml de medio a29 "C y 200 rpm por 12 horas, usndose el 10% de inoculo en los pasos
siguientes.
(Luthy P. y ~bersold H.R. 1981).
A) FERMENTACIONES A NIVEL MATRAZ DE 500mL.
Se llevaron a cabo fermentaciones bajo las siguientes condiciones de cultivo: temperatura a 29
"C, agitacin 200 RPM, y pH de 7.2-7.3 con un volumen de operacin de 100mL. Se hicieron
cinticas de crecimiento, tomando muestras a diferentes intervalos de tiempo y se midieron
los siguientes parmetros: Densidad ptica (590 nm), pH, muestras al microscopio teidas con
cristal violeta para la observacin de clulas vegetativas, esporas y cristal.
(Luthy P. y ~bersold H.R. 1981).
B) FERMENTACIONES A NIVEL DE FER- MENTADOR DE 2 L.
Las fermentaciones se llevaron a cab0 en un fermentador de 2 L. Las condiciones de cultivo
fueron las siguientes: temperatura de 29 C, agitacin 800 RPM, con 2 impulsores Rushton,
aireacin de 1 VVM, control de pH entre 7.0 y 7.5 durante todo el crecimiento con KOH y
H
3
PO
4
. Se hicieron cinticas del crecimiento, tomando muestras a diferentes tiempos y
midiendo los siguientes parmetros: Densidad 6ptica (590 nm), pH, oxgeno disuelto, mL
residuales de KOH y H
3
PO
4
1 N, y observacin al microscopio de muestras teidas con cristal
violeta para ver la formacin del cristal, conteo de esporas y clulas vegetativas con la cmara
de Neubauer.
(Luthy P. y ~bersold H.R. 1981).
C) FERMENTACIONES A NIVEL FERMENTADOR DE 14 L.
Para este nivel se desarrollaron los experimentos en un fermentador marca NBS, modelo
MF14 con 3 impulsores de 6 paletas Tipo Rushton. Las condiciones de cultivo fueron las
siguientes: Temperatura 29 " C, agitacin 400 y 600 RPM, aireacin 0.8 y 1.2 VVM y pH
controlado a 7.0 y sin control. Se llevaron a cabo cinticas de crecimiento tomando muestras
cada dos horas y se midieron los siguientes parmetros: Densidad ptica, pH, oxgeno disuelto
y conteo de clulas vegetativas, esporas y bacilos con la cmara de Neubauer.
Para ambas fermentaciones se cuantifica el azcar residual por el mtodo del cido 1,2,3
dinitrosalicilico (DNS),
(Summer et. a1 1935.)
Para realizar la optimizacin del medio de cultivo y condiciones de operacin, se plante una
serie de 3 experimentos por medio de un diseo experimental por el mtodo de B. Wilson,
donde se variaron 3 componentes del mismo. Se tom como base el medio de cultivo
reportado en la tabla 1, el cual se obtuvo en base a una revisin bibliogrfica (6, 14, 15, 16) y a
las concentraciones de sales que se requieren para la propagacin de la cepa a nivel
laboratorio.
Como primer diseo experimental se decidi probar niveles bajos y altos de los siguientes
nutrientes: Pur de tomate 10 y 20 g/L, glucosa 25 y 30 g/L y harina de soya 10 y 20 g/L.
La respuesta (Velocidad de Crecimiento) se tom como D.O. a 590 nm considerando
solamente la fase exponencial (12 horas). 3 Se hizo un segundo diseo experimental 2 en
donde se probaron 3 parmetros: agitacin
(400 y 600 RPM), aireacin (0.8 y 1.2 VVM) y
pH (con control y sin control).
MEDIO DE CULTIVO BASE







Ajustar el pH, con KOH 3 N, a 7.2. Los medios se esterilizan a 121C durante 15 minutos.
(Arcas J; Yantorno 0. y Ertola R. 1987).
RESULTADOS Y DISCUSION DEL MEDIO DE CULTIVO BASE
Para el medio de cultivo base reportado en mate- riales y mtodos, el tiempo de crecimiento y
producci6n del cristal era hasta de 56 horas y el rendimiento bajo durante 1as 48 horas de
crecimiento (5x10~ espJm1); biomasa de 1.4 g/L. (peso seco). Adems la glucosa no se
consume totalmente durante las 56 horas de crecimiento, por lo que se piensa que hay una
asincrnia en el proceso de esporulacin, alargndose.
La optimizacin del medio de cultivo y condiciones de operaci6n, se plante6 como se describe
en la seccin de materiales y mtodos.
Se probaron niveles altos y bajos de los siguientes nutrientes: Pur de tomate, glucosa y harina
de soya. Se decidi utilizar el pur de tomate como sustituto del licor de maz, harina de
pescado, o extracto de levadura (son los que reporta la bibliografa como fuente de nitrgeno),
debido a que estos ltimos son difciles de conseguir y son costosos. El pur de tomate se
consigue fcil y es de bajo costo. En cuanto al uso de la harina de soya, se encontr en
reportes de la Universidad de Nuevo Len, que utilizando cepas similares, han encontrado
producciones elevadas de bioinsecticidas.
(Arcas J; Yantorno 0. y Ertola R. 1987).
El medio ptimo de produccin para Bacillus thuringiensis, fue el siguiente:

MEDIO DE CULTIVO
BASE.
g/l
KH
2
P0
4
6.8
MgS0
4
.7H
2
O 0.12
ZnS0
4
. 7H
2
O 0.014
MnS0
4
.H
2
O 0.0016
FeS0
4
.7H
2
O 0.028
CaC
12
.4H
2
O 0.11
Bacto-triptona 7.0
Glucosa 3.0


MEDIO BE CULTNO PTIMO
Componente g/l
Glucosa 5.0
Harina de soya 6.0
Pur de tomate 40
KH
2
P0
4
2.5
CaC0
3
1.0
MgS0
4
-7H
2
O 0.00011
MnS0
4
-H
2
O 0.04
FeS0
4
-7H
2
O 0.028
CaC
12
-4H
2
O 0.030

Ajustar el pH, con NaOH 1 N. a 7.0. Los medios se esterilizan a 121C durante 15 minutos (15lb
de presin).
Se obtuvieron los siguientes resultados, Tabla 1, donde se vara la agitacin, aireacin y el
control del pH. El anlisis de los resultados nos permite llegar a las siguientes conclusiones,
Tabla 2.
a) Cuando se analizan los efectos promedio, se observa que hay ms significancia sobre la
agitacin, lo cual nos indica que hay que subir ms los RPM. Cuando se analiza la aireacin se
ve que hay ms significancia sobre este que en el pH que es el que menor significancia tiene,
segn el efecto promedio.
b) La interaccin de 2 factores nos dice que hay mayor significancia entre la agitacin y la
aireacin. La agitacin y el control de pH tienen poco efecto sobre el estudio, as mismo que la
aireacin y el control de pH.
c) Finalmente; cuando se estudia la interaccin de 3 factores, se alcanza a notar que la
combinacin de los 3 parmetros no tienen mucha significancia entre si sobre el estudio
realizado.
(Arcas J; Yantorno 0. y Ertola R. 1987).

*Respuesta: esporas/mL a las 24 horas de fermentacin. En esta tabla se puede ver que se
tienen mejores resultados cuando se trabaja a 600 rpm.

E1 = Velocidad de agitacin.
E2= Velocidad de aireacin.
E3 = pH control sin control.
Efectos promedio: Efecto que se tiene sobre la variable de lo que se est midiendo.
Interaccin de 2 factores: Es la combinacin que existe entre dos variables.
Interaccin de 3 factores: Es la combinacin entre las variables.

(Arcas J; Yantorno 0. y Ertola R. 1987).

Bibliografa:
-Luthy P. y ~bersold H.R. (1981). The entomocidal toxins of
Bacillus thuringiensis. Pharmacol. Ther. 13, 257.
Arcas J; Yantorno 0. y Ertola R. (1987). Effect of high
concen- tration of nutrients on Bacillus thuringiensis.
Cultures. Biotech- nol. Lett. 9, 105-110.