Espectroscopas UV-Visible e Infrarroja de molculas poliatmicas.

1. Introduccin.
En espectroscopia se estudian las interacciones de la radiacin electromagntica (luz
con la materia. Entre los fenmenos !ue producen estas interacciones est"n la
absorcin# emisin $ dispersin de luz por la materia.
%a ma$ora de nuestra informacin e&perimental sobre los ni'eles de energa de los
"tomos $ molculas pro'iene de la espectroscopia. ( ni'el molecular# las diferentes
tcnicas espectroscpicas tambin nos permiten conocer las estructuras moleculares
(conformaciones# longitudes $ "ngulos de enlace# las frecuencias moleculares de
'ibracin# descubrir la composicin de una muestra# seguir la concentracin de especies
reacti'as en funcin del tiempo en una reaccin !umica# determinar intermedios de
reaccin $ un largo etc.
En este blo!ue utilizaremos tres tcnicas diferentes) absorcin ultra'ioleta-'isible (UV-
'isible# emisin de fluorescencia $ absorcin infrarroja (I* para caracterizar la
fotofisico!umica de un alcaloide denominado nor+armano de gran inters
farmacolgico cu$a presencia se +a detectado en diferentes tipos de plantas e incluso en
el cuerpo +umano. %a estructura de este compuesto se muestra en la figura 1. Est"
compuesta de un anillo piridnico deficiente en electrones , unido a otro anillo indlico
con e&ceso de electrones ,. %as interesantes propiedades fotofsica !ue este deri'ado
presenta son debidas a cambios fotoinducidos en la distribucin electrnica !ue
originan un fuerte incremento en la basicidad del n-cleo piridnico en el primer estado
electrnico e&citado $ !ue# consecuentemente# modifican la reacti'idad de esta
molcula.

.ig. 1.- Estructura del /or+armano
%a tcnicas de absorcin $ emisin de luz en la regin UV-'isible se encuadran dentro
de la espectroscopia electrnica $ la tcnica de absorcin I* se encuadra dentro de la
espectroscopa de 'ibracin.
0ediante la absorcin $ la emisin de radiacin en la regin UV-'isible
caracterizaremos los espectros de absorcin $ fluorescencia de las dos formas !ue
pueden e&istir (neutra $ catinica en disolucin acuosa en el inter'alo de p1 entre 1 $
12. 3btendremos el rendimiento cu"ntico de fluorescencia de la forma catinica $ la
constante de acidez de este alcaloide una 'ez protonado# tanto en el estado fundamental
como en el primer estado e&citado. Utilizando la espectroscopia de absorcin infrarroja
obtendremos la constante de formacin de un complejo de tipo /1-, entre este
alcaloide $ el deri'ado fenantreno.

1
Este blo!ue se realizar" en tres sesiones $ consta de un fundamento terico $ de una
metodologa e&perimental para cada una de las tcnicas utilizadas# as como# de tres
pr"cticas
2 Fundamento Terico
4.1 Espectroscopa Electrnica.
El estudio de los espectros electrnicos# adem"s de permitir e&plicar los colores de las
sustancias# tambin proporciona importante informacin sobre los estados e&citados de
las molculas. %a distribucin electrnica de una molcula determina las propiedades
fsicas $ !umicas de sta# de esta manera# puede ocurrir !ue reacciones !ue se
producen foto!umicamente (estado e&citado# no lo +agan trmicamente (estado
fundamental# $a !ue son el resultado de una distribucin electrnica diferente en la
molcula producto de la e&citacin.
4.1.1 Espectros de absorcin UV-'isible.
%a energa total de una molcula es el resultado de las interacciones atracti'as entre el
n-cleo $ los electrones# repulsi'as electrn-electrn $ n-cleo-n-cleo# 'ibraciones de los
n-cleos# rotacin nuclear e interacciones magnticas resultantes de los spines de los
electrones $ n-cleos. *esol'iendo la ecuacin de ondas podramos conocer el 'alor de
esta energa# sin embargo# en la pr"ctica# esto es imposible $ es necesario recurrir a
apro&imaciones. 5i suponemos !ue los n-cleos $ electrones son masas puntuales $
despreciamos las interacciones spin-rbita $ otras interacciones relati'istas# mediante la
apro&imacin de 6orn-3ppen+eimer podemos separar la funcin de onda molecular
como un producto de funciones de onda electrnica $ nuclear. Esta apro&imacin se
basa en !ue los electrones se mue'en muc+o m"s r"pidamente !ue los n-cleos $ es una
buena apro&imacin# considerar a los n-cleos fijos mientras los electrones realizan sus
mo'imientos. 7e esta manera# podemos separar la funcin de onda molecular en un
producto de funciones de onda electrnica $ nuclear. 8or otro lado# un tratamiento
similar para la funcin de onda del mo'imiento nuclear demuestra !ue sta puede
separarse en funciones de onda rotacional# 'ibracional. Esta separacin se basa en !ue la
'ibracin molecular es muc+o m"s r"pida !ue la rotacin molecular# por lo !ue
podemos usar una separacin internuclear media para calcular el momento rotacional de
inercia. 8or tanto# aun!ue la siguiente ecuacin no es e&acta $a !ue conlle'a las
apro&imaciones anteriormente descritas# podemos considerar la energa total de una
molcula como la suma de las energas electrnicas# 'ibracional# rotacional $
traslacional. E
total
9 E
elect
: E
'ibr
: E
rot
: E
trasl

%os 'alores relati'os de estas energas son importantes. %as energas implicadas en los
cambios de las distribuciones electrnicas de las molculas son del orden de 'arios
electrn-'oltios (1eV e!ui'ale a unos ;222 cm
-1
por tanto los espectros electrnicos
aparecen en las regiones del 'isible $ ultra'ioleta del espectro electromagntico !ue se
e&tienden desde unos 1<222 cm
-1
para la luz roja +asta 41222 cm
-1
para la luz azul $
unos =2222 cm
-1
para la ultra'ioleta. %as transiciones 'ibracionales corresponden a
absorciones en la regin del infrarrojo (sobre 122 cm
-1
a 1222 cm
-1
. %as transiciones
rotacionales corresponden a la absorcin en la regin de microondas (sobre 2.2> cm
-1
a
12 cm
-1
. (s# la separacin entre los ni'eles de energa electrnicos es muc+o ma$or
4
!ue la separacin entre ni'eles 'ibracionales# $ sta# a su 'ez es muc+o ma$or !ue la
separacin entre ni'eles rotacionales (figura 4. 7e esta manera# a ni'el molecular# una
transicin electrnica siempre ir" acompa?ada de transiciones 'ibracionales !ue a su
'ez 'an acompa?adas de rotacionales. @omo la energa traslacional no +ace mas !ue
sumar una cantidad constante a la energa total# las frecuencias de una transicin 'ienen
dadas por +A 9 (EB
elec
- EBB
elec
:(EB
'ib
- EBB'ib
:
(EB
rot
- EBB
rot
donde cada trmino entre
parntesis es sustancialmente menor !ue el trmino precedente.

.ig.4.- Es!uema energtico de separacin de ni'eles.
Tipos de transiciones electrnicas en molculas poliatmicas. %a solucin de la parte
electrnica de la ecuacin de ondas da los ni'eles de energa (orbitales $ las
distribuciones electrnicas apro&imadas para unas determinadas coordenadas nucleares.
Es costumbre# aun!ue no es rigurosamente cierto# situar los electrones en orbitales
moleculares $ considerar la absorcin de luz como una transicin uni-electrnica entre
orbitales. 8odemos +acer una clasificacin de las transiciones electrnicas en trminos
de orbitales (enlazante#
*
(antienlazante, (enlazante# *(antienlazante $ par
solitario (no enlazante# designado por n. En la figura ># mostramos los ni'eles de
energia de los orbitales moleculares del formalde+doC$ algunas posibles transiciones
electrnicas !ue pueden ocurrir entre estos orbitales# tales como *, n *,
*, n *. %as energas de estas transiciones electrnicas sigue# generalmente# el
siguiente orden)
n *< *< n *< *< *
3tros dos importantes tipos de orbitales !ue se consideran en estas transiciones son el
orbital molecular ocupado de ma$or energa denominado 1303 ( 1ig+est 3ccupied
0olecular 3rbital $ el orbital molecular desocupado de menor energa denominado
%U03 (%oDest Unoccupied 0olecular 3rbital. (mbos orbitales se refieren al estado
fundamental de la molcula.
>

.ig.>.- 7iagrama de energa de los orbitales moleculares de l
.ormalde+do $ posibles transiciones electrnicas.
En las cuatro transiciones !ue se muestran en la figura ># el electrn !ue promociona no
'aria su spin $ por tanto el n-mero cu"ntico de spin total permanece igual a cero (59s
i
#
con s
i
9 :1C4 -1C4 . %a multiplicidad de spin (0945:1 en ambos estados# tanto
fundamental como e&citado# es igual a 1# por tanto todos estos estado son estados
singlete ( usualmente se denota como 5
2
el estado fundamental $ 5
1#
5
4#
5
>#
E para los
siguiente estados e&citados. Fodas las transiciones mostradas en la figura > son # por
tanto# transiciones singlete-singlete. 5i por lo contrario# el electrn promocionado
cambia su spin# el momento angular total de spin es 1 $ su multiplicidad >. El estado
e&citado !ue produce la transicin es un estado triplete. 7e acuerdo con la regla de
1und# para una misma configuracin electrnica# el estado triplete tiene menor energa
!ue el correspondiente singlete (figura <.
<
.ig.<.- 7istincin entre estados singletes $ tripletes.
Ejemplo del formalde+do.

Probabilidad de las transiciones. Ley de Lambert-Beer y Fuerza de Oscilador.
E&perimentalmente# la eficiencia de absorcin de luz a una determinada longitud de
onda# # por un medio absorbente se caracteriza por la absorbancia a esta , ((), o la
transmitancia F( !ue se definen como
((G9 log (I
G
2
CI
G
9 -log F(G
siendo F(G 9 I
G
CI
G
2
# donde I
G
2
$ I
G
son las intensidadesde la luz !ue entra $ sale del
medio absorbente# respecti'amente.
En muc+os casos# la absorbancia de una muestra sigue la le$ de %ambert-6eer
((G9 log (I
G
2
CI
G
9 () l c , donde () es el coeficiente de absorcin molar
(com-nmente e&presado en % mol
-1
cm
-1
# l es la longitud de paso de luz $ c es la
concentracin ( mol %
-1
. El coeficiente de absorcin molar e&presa la +abilidad de una
molcula para absorber la luz a una $ un determinado disol'ente. 5eg-n la teora
cl"sica# la absorcin molecular de luz puede ser descrita si consideramos a la molcula
como un dipolo oscilando# lo cual nos permite introducir la llamada fuerza de oscilador#
la cual est" directamente relacionada con la integral de la banda de absorcin mediante
la siguiente ecuacin)
f 9 4.>2> mc
2
4
C /
a
, e
4
n H I( d
donde m $ e son la masa $ carga del electrn# respecti'amente $ c
2
es la 'elocidad de la
luz# n es el ndice de refraccin. f es una cantidad adimensional $ sus 'alores est"n
=
normalizados# de tal manera !ue las transiciones m"s eficaces o probables tienen f
1 !ue se corresponde con unos 'alores de 12
<
-12
=
0
-1
cm
-1
.
%a 'entaja de introducir la fuerza de oscilador estriba en !ue tiene una cone&in directa
con las funciones de onda de los estados e&citados inicial (
i
) $ final (
f
) implicados en
la transicin. El tratamiento mecano-cu"ntico de la interaccin entre la radiacin $ la
materia demuestra !ue la probabilidad de absorcin o emisin entre dos estados
estacionarios es proporcional al cuadrado de la magnitud de la integral llamada
momento de transicin. Esta integral se define mediante la siguiente e&presin

fi
=
f
*
i
d, = -er
!ue es una medida del momento dipolar asociado con el desplazamiento de carga !ue se
produce cuando tiene lugar la redistribucin electrnica. %a fuerza de oscilador se
relaciona con este momento por
f 9 (;
4
C> (mAC+ e
4
J
fi
J
4
(s pues# se puede estimar lo probable !ue es una transicin si se conocen las funciones
de onda# lo !ue es una relacin importante entre la teora $ la e&perimentacin.
En las parejas de estados para los cuales esta integral es cero se dice !ue es una
transicin pro+ibida. @uando el 'alor de esta integral es distinto de cero se dice !ue la
transicin entre estos estados est" permitida.
4.1.4 Espectros de emisin
En la figura = se muestran todos los procesos !ue pueden ocurrir a una 'ez la molcula
interacciona con un fotn de una determinada longitud de onda en la regin UV-'isible
$ lo absorbe. ( estos procesos se denominan como fotofsicos $ pueden ser definidos
como transiciones !ue con'ierten un estado e&citado en otro estado e&citado o en el
fundamental.
Vamos a
empezar
.ig.=.- 8osibles 'as de dese&citacin de una molecula e&citada.
Empezaremos describiendo los procesos fotofsicos !ue son unimoleculares. Estos
procesos se clasifican en radiati'os $ no-radiati'os# $ para ilustrarlos# nada mejor !ue
utilizar el diagrama de 8errin-KablonsLi de la figura M. En esta representacin la
direccin 'ertical corresponde a un incremento de energa $ la direccin +orizontal no
M
tiene ning-n significado fsico. %os estados electrnicos son representados por los
smbolos 5
2
# 5
1
#

5
4
$ corresponden a los estados singlete fundamental# primero $
segundo e&citado# respecti'amente. F
1
$ F
4
representan los correspondientes estados
tripletes de 5
1
$ 5
4
# respecti'amente. %os procesos radiati'os est"n dibujados con lneas
rectas $ los no-radiati'os con lnea ondulada.
Vamos a describir bre'emente estos procesos)
Transiciones radiativas
(bsorcin 5-5 (5
2
: +A N 5
1
# caracterizada e&perimentalmente por el coeficiente de
absorcin molar I. Este proceso transcurre en un tiempo de apro&imadamente 12
-1=
s.
(bsorcin 5-F (5
2
: +A N F
1
# transicin pro+ibida $a !ue son estados de diferente
multiplicidad de spin $ por tanto la integral momento de transicin se anula. Esta
transicin est" caracterizada e&perimentalmente por el coeficiente de absorcin molar
I
(5-F
.
Emisin de fluorescencia (5
1
N 5
2
: +A # transicin permitida $ caracterizada por una
constante de 'elocidad k
f
con 'alores entre 12
12
-12
O
s
-1
.
Emisin de fosforescencia (F
1
N 5
2
: +A transicin pro+ibida $ caracterizada por una
constante de 'elocidad k
p
con 'alores entre 12
M
P 1 s
-1
.
Transiciones no-radiativas
@on'ersin interna (@I. Fransiciones entre estados e&citados de la misma multiplicidad
de spin (ej. 5
1
5
2
: Q caracterizadas por una constante k
ic
con 'alores entre 12
11
-12
R
s
-1
. @uanto menor sea la diferencia entre los estados e&citados# ma$or es la eficiencia de
@I.
@ruce entre sistemas (@I5. Fransiciones pro+ibidas entre dos ni'eles 'ibracionales
isoenergticos de estados electrnicos e&citados de diferente multiplicidad de spin (ej.
5
1
F
1
: Q o bien F
1
5
2
: Q caracterizadas por una constante k
cis
con 'alores
comprendidos entre 12
12
-12
;
s
-1
. %a presencia de "tomos pesados incrementa el
acoplamiento spin-rbita $ por tanto fa'orece !ue se produzca con m"s probabilidad
este tipo de transicin.
E&iste un tipo de transicin no-radiati'a !ue ocurre entre estados 'ibracionales de un
mismo estado electrnico. Este proceso se denomina relajacin 'ibracional $ a
temperatura ambiente# esta disipacin de energa# se produce en un tiempo de alrededor
12
-14
s. Este proceso es lento con respecto a la absorcin# sin embargo es mu$ r"pido con
respecto a la fluorescencia# @I $ @I5. Esto e&plica !ue las propiedades fluorescentes de
una molcula sean independientes del estado 'ibrnico# dentro de la banda de
absorcin
5
2
5
1#
al !ue la molcula es e&citada.
O

.ig.M.- 7iagrama de 8errin-KablonsLi. 8osicin relati'a de las bandas de
absorcin# fluorescencia $ fosforescencia.
Estos procesos no-radiati'os son los responsables de !ue no fluorezcan el 122S de las
molculas e&citadas# !ue la fluorescencia se origine siempre desde el estado 51# !ue su
perfil no 'are con la longitud de onda de e&citacin $ !ue el m"&imo de emisin
siempre se sit-e a ma$ores longitudes de onda (menor energa !ue el m"&imo de
absorcin. Este gap entre el m"&imo de la primera banda de absorcin $ el m"&imo de
fluorescencia se denomina desplazamiento de 5toLes. En general# las diferencias entre
los ni'eles 'ibracionales son similares en el primer estado e&citado $ en el fundamental
de a!u !ue los perfiles de la primera banda de absorcin $ la fluorescencia sean
im"genes especulares (figura O. %a transicin 2-2 es usualmente la misma en absorcin
$ fluorescencia# por tanto podemos obtener la longitud de onda de esta transicin del
punto de corte de ambos perfiles. (un!ue no entraremos en m"s detalles#
mencionaremos !ue todos los procesos anteriormente descritos son espont"neos.

;
.ig.O.-
6andas 'ibracionales en el espectro de absorcin $ fluorescencia
de un +idrocarburo arom"tico.
(dem"s de k
f
# +a$ otros par"metros !ue caracterizan la emisin fluorescente# uno de
stos es el rendimiento cu"ntico de fluorescencia (T
f
!ue se define como el cociente
entre el n-mero de fotones emitidos $ el n-mero de molculas e&citadas. 5i no
e&istieran canales de desacti'acin# el rendimiento cu"ntico de la molcula sera igual a
uno. 5i slo consideramos procesos de desacti'acin unimoleculares# T
f
'endr" dado
por )
U
f 9
k
f
C (k
f
: V k
i

5iendo k
i
la constante de desacti'acin de cada uno de los procesos no-radiati'os
unimoleculares.
Efecto de los procesos fotoinducidos intermoleculares sobre la emisin fluorescente.
Transferencia protnica fotoinducida.
%as propiedades "cidas $ b"sicas de una molcula pueden diferir significati'amente del
estado fundamental al e&citado. Una de las causas posibles de esta obser'acin es la
diferencia en la densidad de distribucin electrnica entre ambos estado $ la ocurrencia
de la transferencia protnica durante el tiempo de 'ida del estado e&citado depender" de
las 'elocidades relati'as entre los procesos de dese&citacin unimoleculares $ el
proceso de transferencia protnica.
7eterminacin del pWa en el estado e&citado mediante el ciclo de .Xster.
El pWa de un "cido dbil puede determinarse tericamente utilizando el ciclo de .oster
junto con medidas espectroscpicas.
7e acuerdo con este ciclo !ue mostramos en la figura ;
/
a
+A
(1
: Y1
2Z
9 /
a
+A
(
- : Y1
2
donde Y1
2
$ Y1
2Z
son las entalpias molar de ionizacin est"ndar# +A
(1
$ +A
(
- son las
diferencias de energa( correspondiente a la transicin 2-2 entre el estado e&citado $
R
fundamental de (1 $ (
-
# respecti'amente $ /
a
es el n-mero de ('ogrado. Esta
ecuacin puede ser escrita como
/
a
(+A
(
- - +A
(1
9 Y1
2Z
- Y1
2
.ig.;.- @iclo de .oster para la determinacin del pW del estado e&citado.
(sumiendo !ue las entropas de ionizacin Y5
2
$ Y5
2Z
son iguales# las diferencias de
entalpa puede ser reemplazada por la diferencia de energas libres Y[
2Z
- Y[
2
.
Y[
2
est" relacionada con la constante de e!uilibrio mediante
Y[
2
9 - *F ln W 9 4.> *F pW
de la misma forma# Y[
2Z
9 - *F ln WZ 9 4.> *F pWZ
donde * es la constante de los gases $ F la temperatura absoluta. Usando estas
ecuaciones $ con'irtiendo las frecuencias a n-meros de onda# la ecuacin puede
e&presarse como
pWZ-pW 9 4.1 12
->
(
(-
-
(1

Esta ecuacin muestra !ue si la banda de emisin de la forma b"sica est" localizada a
ma$or longitud de onda !ue la forma "cida# pWZ es menor !ue el pW del fundamental.
8or el contrario# si la emisin de la forma b"sica est" desplazada +acia el azul (menor
landa con respecto a la banda de emisin de la "cida# el "cido en el estado e&citado es
m"s dbil !ue en el fundamental.
En la pr"ctica# la diferencia entre
(-
$
(1
corresponde con la diferencia entre las
transiciones 2-2 de (
-
$ (1 # las cuales no son f"ciles de determinar . /ormalmente se
estiman promediando los n-meros de onda de los m"&imos de absorcin $ fluorescencia

22
9 (
abs
max
:
em
max

C4
5in embargo la mejor apro&imacin se encuentra utilizando el punto de interseccin de
los espectros normalizados de absorcin $ fluorescencia. En el caso !ue el
desplazamiento de 5toLes sea mu$ grande# ser" difcil encontrar este punto de
interseccin $ ser" preferible tomar
abs
max
como el promedio de los n-meros de onda
de la mitad superior de la banda de absorcin (5
2
N5
1
$ realizar la misma operacin
para obtener
em
max
pero# en este caso# con la banda de emisin fluorescente.
1
2
%a determinacin de la energa de esta transicin 2-2 es el ma$or factor de error en la
estimacin del pWZ. %a 'entaja de este mtodo es su sencillez $ !ue puede usarse
incluso cuando no se establece el e!uilibrio en el tiempo de 'ida del estado e&citado.
1
1
4. Espectroscopia de Vibracin. Espectros de absorcin I* .
%a espectroscopa de absorcin infrarroja (I* es una tcnica analtica de gran
importancia para los !umicos. Est" basada en las 'ibraciones de los "tomos de las
molculas. Un espectro de infrarrojo consiste en un espectro de absorcin !ue implica
transiciones entre ni'eles 'ibracionales diferentes dentro del mismo estado electrnico.
7ado !ue una molcula poliatmica tiene >/-M ( >/-= si es lineal grados de libertad
'ibracionales# su espectro de infrarrojo puede presentar dic+o n-mero de bandas de
absorcin# cu$as energas corresponder"n a la frecuencia de cada modo 'ibracional.
8ara !ue una 'ibracin d lugar a una absorcin de infrarrojo# debe causar un cambio en
el momento dipolar de la molcula. (s# la intensidad de una banda de infrarrojo ser"
ma$or cuanto ma$or sea el cambio en el momento dipolar con la 'ibracin.
%a principal utilidad de la espectroscopa de infrarrojo deri'a del +ec+o de !ue los
grupos funcionales mantienen cierta indi'idualidad dentro de las molculas# afectando
sus 'ibraciones fundamentalmente al enlace considerado. 5eg-n el modelo cl"sico del
oscilador armnico# la frecuencia 'ibracional de dos "tomos unidos por un enlace 'iene
dada por la e&presin

=
1
2 c
k

donde W es la constante de fuerza del enlace $ \ la masa reducida del sistema.

@omo resultado# se encuentra !ue los diferentes grupos funcionales se caracterizan por
diferentes frecuencias 'ibracionales# !ue naturalmente 'an asociadas a bandas distintas
en el espectro de infrarrojo.
5iempre !ue obtengamos un espectro I*# en condiciones !ue no sean de 'aco# la
radiacin infrarroja 'a atra'esar el aire $ ser" ine'itable !ue parte de esta radiacin sea
absorbida por algunas de las molculas !ue lo componen. Esta absorcin# junto con la
correspondiente a las 'entanas !ue utilicemos como soporte# constituir" el fondo del
espectro. (nalizaremos bre'emente la absorcin por parte del aire.
nterpretacin del espectro de infrarro!o del aire" entre los componentes ma$oritarios
de la atmsfera terrestre# los gases de /
4
$ 3
4
no producen absorcin de radiacin
infrarroja# $a !ue son molculas diatmicas apolares. En cambio# el 'apor de agua $ el
di&ido de carbono absorben radiacin infrarroja $ por tanto ser"n obser'ados siempre
!ue se realicen medidas de absorcin de infrarrojo en presencia de aire# $ deben
corregirse (espectro de referencia a la +ora de estudiar una muestra problema.
(tres ramas)

3
3
1 1
|| (dos ramas)

2
3
1 1
|| (dos ramas)

1
3
1 1
Degeneradas
(tres ramas)

3
3 @ 3
|| (dos ramas)

2
3 @ 3
No activa IR

1
3 @ 3
,
4
1
4
%a molcula de agua tiene una estructura no lineal $ por tanto presenta tres
modos 'ibracionales) una tensin simtrica ('
1
# una fle&in simtrica ('
4
$ una tensin
asimtrica ('
>
. [eneralmente se re!uiere menos energa para deformar un "ngulo entre
tres "tomos !ue para estirar un enlace# por lo !ue la banda '
4
debe aparecer a menores
frecuencias !ue '
1
$ '
>
. %as 'ibraciones '
1
$ '
>
cambian el mdulo del momento dipolar
('ibraciones paralelas mientras !ue la 'ibracin '
4
cambia la orientacin de dic+o
momento ('ibracin perpendicular. @omo consecuencia# estas tres 'ibraciones deben
dar lugar a bandas 'ibracionales acti'as en infrarrojo. %a molcula de @3
4
presenta una
estructura lineal $ por tanto sus grados de libertad 'ibracionales son cuatro. 7ado !ue el
momento dipolar permanente de la molcula es nulo# la 'ibracin de tensin simtrica
no ser" acti'a en el espectro de infrarrojo. En cambio la 'ibracin de tensin asimtrica
('ibracin paralela producir" una banda de absorcin# as como las dos 'ibraciones de
fle&in ('ibraciones perpendiculares# !ue son degeneradas en energa $ por tanto
aparecen como una sola se?al en el espectro. 8or otra parte# como las molculas de 1
4
3
$ @3
4
pueden girar libremente en su estado gaseoso# sus absorciones de infrarrojo
implican transiciones entre los distintos ni'eles rotacionales de los estados 'ibracionales
implicados. 7e a+ !ue las bandas de infrarrojo de estos compuestos sean bandas de
'ibracin-rotacin# es decir# !ue sus bandas de 'ibracin presentan estructura fina de
rotacin. (s una molcula poliatmica como 1
4
3 o @3
4
presenta bandas paralelas con
un contorno 8*# mientras !ue sus bandas perpendiculares tienen contornos 8Q*.
%os espectros de infrarrojo se pueden utilizar para identificar componentes de muestras
compar"ndolos con una coleccin de espectros de sustancias conocidas. (dem"s de la
identificacin $ comparacin de componentes se puede obtener informacin estructural.
%os grupos funcionales se pueden identificar debido a !ue sus bandas de absorcin se
encuentran en zonas relati'amente estrec+as. %os espectros de infrarrojo de los
compuestos org"nicos se pueden di'idir en las siguientes regiones generales)
%a regin de los grupos funcionales) <222-1>22 cm
-1
%a regin de la +uella dactilar) 1>22-R12 cm
-1
%a regin de los arom"ticos) R12-M=2 cm
-1
.
%as bandas en la regin de los grupos funcionales indican la presencia de grupos
org"nicos funcionales especficos. E&isten tablas donde se indican en !u inter'alo
absorben los diferentes grupos. Entre lo grupos funcionales f"cilmente identificables se
encuentran el grupo carbonilo# @93# $ el grupo +idro&ilo# -31.
%a regin de la +uella dactilar contiene picos !ue aparecen por modos normales
complicados !ue conlle'an mo'imientos de fle&in $ no son f"cilmente asignables. 5in
embargo# es la regin m"s sensible a la diferencia de estructura de los compuestos# es
decir# representa la +uella dactilar para un compuesto especfico.
%os picos en la regin de los arom"ticos no indican autom"ticamente la presencia de
anillos arom"ticos# debido a !ue aparecen tambin en esta regin las bandas
correspondientes a enlaces carbono-+algeno. %as bandas se originan por los
mo'imientos de fle&in de los enlaces @-1 fuera del plano del anillo arom"tico.
En la realidad# se re!uiere muc+a pr"ctica para interpretar los espectros I* $a !ue
aparecen numerosas des'iaciones a la apariencia esperada. En la actualidad los
instrumentos con transformadas de .ourier pueden obtener espectros en 'arios
segundos# para !ue# posteriormente# utilizando el softDare !ue desarrolle la
comparacin entre picos# se pueda identificar cada componente.


1
>
>. Medidas exerimenta!es de a"sorcin# emisin $ excitacin de f!uorescencia.
3.1 Espectros de absorcin
%as tcnicas e&perimentales para espectroscopia de absorcin en las regiones# UV#
'isible e I* son similares. En ellas se pasa un +az de luz# conteniendo un inter'alo
continuo de frecuencias# a tra's de la muestra# la luz !ue sale de sta (luz transmitida
se dispersa usando un prisma de difraccin reticulado $# en cada frecuencia# se compara
la intensidad de luz transmitida (I
t
con la intensidad del +az de referencia !ue no +a
pasado a tra's de la muestra (I
2
.
%a medida de un espectro de absorcin se basa en dos principios importantes) le$ de
%ambert $ la le$ de 6eer . %a le$ de %ambert establece !ue la proporcin de luz absorb
ida por un medio es independiente de la intensidad de luz incidente#

0
. %a le$ de 6eer
establece !ue la cantidad de luz absorbida es proporcional a la concentracin de
cromforo en la muestra. 7e la combinacin de estas dos le$es podemos e&presar)
(9bc
donde # se define como absorbancia $ 'iene dado por # 9 log (I
2
CI
t

#
es el coeficiente de
molar !ue es una constante de la molcula $ !ue depende de la longitud de onda de la luz
incidente. c es la concentracin molar $ b la longitud de paso de luz (anc+ura de la cubeta.
%a intensidad de la luz absorbida I
a
'iene dado por)
I
a
=I
0
- I
t
$ a partir de la le le$ de %ambert-6eer
I
a
$ I
0
(1-e
-2.3bc
)
@uando A>2, I
a
= I
0
es decir toda la luz incidente es absorbida.
Un espectro de absorcin 'iene descrito por una gr"fica donde se representa la intensidad de
absorbancia en la ordenada $ la longitud de onda de la luz absorbida en la abcisa. 5in
embargo# en espectroscopia I* es m"s +abitual presentar los espectros como un gr"fico
SFransmitancia frente al n-mero de onda (cm
-1

3.2 Espectros de fluorescencia

%a le$ de %ambert-6eer tambin puede ser e&presada como.
I
t
= I
0
10
-bc
(1
5i asumimos !ue la intensidad de la luz absorbida 'iene dada por I
0
- I
t
% tenemos)
I
a
= I
0
(1-10
-bc
)
%a intensidad de la fluorescencia I
f
'iene dada por I
a

f

1
<
I
f
=

I
0

f
(1-10
-bc
)
1aciendo un desarrollo en serie 10
-bc

I
f
=

I
0

f
{1-[1-2.303bc+(2.303bc)
2
/2!+.....]}
5i bc ] 0.05 todos los trminos del desarrollo despus de -2.303bc
pueden ignorarse# de manera !ue I
f
puede e&presarse como)
I
f
= 2.303 I
0

f
bc (4
5e +a determinado !ue para una absorbancia de 2.21 se producir" un error del 1S en la
intensidad de fluorescencia. 5in embargo# no solamente e&isten errores en la I
f
debido a la
rotura de la apro&imacin matem"tica# sino !ue estos errores tambin se debe al efecto de
filtro inerte de la disolucin. 6oDen $ ^oLes establecieron !ue para obtener una respuesta
lineal# la disolucin debe absorber menos !ue el =S de la luz de la fuente.
El 'erdadero espectro de fluorescencia es una representacin de la intensidad de
fluorescencia (a una intensidad $ longitud de onda de absorcin fija como una funcin de las
frecuencias o longitudes de onda de emisin.
%os espectros obtenidos en el fluormetro no son# generalmente# los 'erdaderos
espectros debido a la dependencia de la respuesta del sistema instrumental con la longitud de
onda.
%os par"metros !ue caracterizan la emisin de fluorescencia son) 8erfil ( I
f
frente a
# rendimiento cu"ntico (I
f
relati'a a I
a
$ tiempo de 'ida ( decaimiento de I
f
con el
tiempo de fluorescencia.
3.2.1 %sectro de excitacin
( la representacin de la intensidad de emisin (a una longitud de onda de emisin
fija en funcin de la longitud de onda de e&citacin ( I
0
constante se le llama espectro de
e&citacin.
5i la molcula cumple la regla de Was+a $ Va'ilo'#
f
es independiente de la de
e&citacin.
(s# si fijamos la concentracin de la especie !ue emite (fluorforo# I
I2
$ b_ I
f
` .
En otras palabras# el espectro de e&citacin obser'ado 'ariar" con . En estos casos# el
espectro de e&citacin tendr" el mismo perfil !ue el espectro de absorcin. Una 'entaja de la
espectroscopia de e&citacin sobre la absorcin es la ma$or sensibilidad de la tcnica de
fluorescencia !ue permite obser'ar el espectro de e&citacin a concentraciones m"s bajas !ue
en absorcin $ sobre todo# la gran utilidad de un espectro de e&citacin est" en !ue nos
informa de cual es la especie !ue est" produciendo esa emisin.
3.2.2 Determinacin de! rendimiento cu&ntico
1
=
Factores 'ue afectan a! rendimiento cu&ntico. %a medida del rendimiento cu"ntico de
fluorescencia de un compuesto en disolucin est" afectada por una serie de factores !ue +a$
!ue tener en cuenta a la +ora de obtener buenos 'alores de este par"metro.
Efectos de autoabsorcin y filtro inerte %a relacin lineal entre concentracin $
fluorescencia slo puede aplicarse a absorciones mu$ bajas. ( altas absorciones
los factores de correccin dependen de la geometra del instrumento. 8or otro
lado# si +a$ un fuerte solapamiento entre absorcin $ fluorescencia la
autoabsorcin es importante $ aumenta con la concentracin. 7e a!u# !ue los
'alores de
f
se obtengan de disoluciones mu$ diluidas.
Efecto de la longitud de onda de excitacin Es mu$ com-n asumir !ue el
f
es
independiente de la de e&citacin. 5in embargo# se +an obser'ado e&cepciones
a esta regla# de a!u !ue sea necesario 'erificar el cumplimiento de la le$ de
Va'ilo' en el deri'ado cu$o
f
!ueremos medir.
Una correccin del ndice de refraccin entre un est"ndar $ la muestra se
re!uiere de manera !ue se compensen las diferencias de la geometra ptica entre
la disolucin $ el est"ndar.
Efectos de la temperatura. %a fluorescencia es un par"metro !ue puede depender
fuertemente de la temperatura por lo !ue la medida del
f
+a$ !ue realizarlo a una
temperatura determinada $ si se realizan 'arias medidas +a$ !ue tener la
precaucin de mantener constante la temperatura.
Efectos de las impurezas. 8ara e'itar la presencia de posibles desacti'adores de la
fluorescencia# es necesario utilizar disol'entes grado u'asol
.Dispersin de la luz. Foda la luz incidente no es absorbida o trasmitida por la
muestra# sino !ue es tambin dispersada. Esta dispersin se origina por las
mismas molculas (dispersin *a$leig+ o por partculas en suspensin coloidal
(dispersin F$ndall. (mbos tipos de luz dispersa son recogidas junto con la
fluorescencia $ +a$ !ue tomar las debidas precauciones para separarlas.
3tro tipo de dispersin es la llamada dispersin *aman. %as bandas *aman
aparecen separadas de la radiacin incidente por la misma diferencia de
frecuencias !ue la de e&citacin. 7e esta manera# si la fluorescencia coincide
con la banda del disol'ente# la separacin puede efectuarse cambiando la de
e&citacin a 'alor m"s bajo. %a dispersin *aman es solamente importante si
recogemos la fluorescencia con alta sensibilidad# $a !ue este fenmeno es dbil#
no obstante +a$ !ue tenerla siempre en cuenta. 8or consiguiente# antes de medir la
fluorescencia# +a$ !ue realizar un ensa$o en blanco. Fodos los disol'entes
conteniendo "tomos de +idrgeno ligados a carbono u o&geno# muestran un
*aman desplazado >222 cm
-1
de la radiacin incidente.
M(todos uti!i)ados ara determinar e! rendimiento cu&ntico de f!uorescencia. 5i
analizamos la +istoria de las determinaciones de los rendimientos cu"nticos# obser'amos !ue
la ma$or parte de los autores sobreestiman su mtodo $ !ue es mu$ difcil determinar el

f
con un error menor del =S. El mtodo !ue utilizaremos en esta pr"ctica consistir" en
comparar la integral de fluorescencia de nuestro sistema con la integral de un patrn cu$o
'alor de
f
$a es conocido (est"ndar de fluorescencia. %a e&presin del rendimiento
cu"ntico de la muestra 'endr" dada por)
1
M

fs
=
fr

s


r

s

D
s
D
r
n
s
2
n
r
2
7onde los subndices s $ r se refieren a la sustancia problema $ de referencia
respecti'amente#
f
es el rendimiento cu"ntico_ A() es la absorcin de la disolucin a la
longitud de onda de e&citacin_ n# el ndice de refraccin_ I() es la intensidad de la l"mpara
a la longitud de onda de e&citacin $ D la integral de fluorescencia.
7e la e&presin anterior 'emos !ue el rendimiento cu"ntico relati'o puede ser determinado
midiendo el "rea de la banda de fluorescencia de la muestra $ del est"ndar. Fambin
comentar !ue para minimizar los errores en la obtencin del rendimiento cu"ntico# es
con'eniente e&citar la muestra $ el patrn de fluorescencia a la misma longitud de onda $ as
e'itaremos los errores de correccin del perfil de la l"mpara.
El principal error de este mtodo est" en la correccin de los espectros de fluorescencia. Este
error ser" tanto m"s pe!ue?o cuanto m"s solapen los perfiles de fluorescencia de la muestra $
del est"ndar.
1
O