Bearing---- soporte

Adventitious---- accidental
Solely---- únicamente
Accuracy--- exactitud

Moreover—además
Background--- ambiente
Encourage—fomentar
Strain-----cepa
Tissue--- tejido
Roots---raíces

Mediated--- mediado

El uso de un marcador selectivo fluorescente, en Agrobacterium Rhizogenes

para detectar la transformación de la zanahoria
Resumen:

• Se usó una proteína verde fluorescente (GFP) como marcador selectivo

• Su uso fue muy efectivo en la zanahoria (Daucus carota L.)
• Las raíces de la zanahoria fueron inoculadas con varias cepas (A4, A4T,
LBA1334 y LBA9402 y todos los genes fueron soportados por el plásmido
Pbin-m-gfp5-ER.
• Este método no requiere ningún agente de selección como herbicidas o
antibióticos
• Además al usar este procedimiento se reduce tiempo y trabajo
• Los genes transformados se pueden extirpar fácilmente del tejido huésped
para luego cultivarlos por separado

Introducción:

• La proteína verde fluorescente (GTP) se extrajo de la medusa Aequorea

victoria
• El GTP no es tóxico para las células y para que se dé la fluorescencia no se
necesitan ni sustratos ni co- factores
• El GTP se puede monitorear directamente en células vivas, y esto permite
que las células transformadas se puedan identificar visualmente

Materiales y Métodos:

• De las raíces de la zanahoria se utilizaron 11 genotipos, los cuales se

almacenaron en turbas a 4°C y después se utilizaron para experimentos
sucesivos

• Las raíces se compraron en un supermercado

• Antes de inocularse, las raíces se lavaron, se pelaron y se esterilizó la
superficie por 20 minutos al 15% en hipoclorito de sodio, después se lavó
tres veces en agua estéril
• De las 12 a 36 cajas se tomó de cada raíz y se hicieron cortes transversales
de 3mm de delgadez, usando un cuchillo estéril
 + Proceso de transformación y las condiciones del tejido

• Se usaron 4 cepas de Agrobacterium:

A4, A4T, LBA1334 y LBA9402, albergadas por el plásmido Pbin-m-gfp5-ER,

soportados por el gen de la neomicin fosfotransferasa (nptII), impulsado por
el promotor nos y por el gen (gfp), impulsado por el gen promotor 35S en la
región T-DNA.

La bacteria creció en un medio semisólido YMB, con un suplemento de 50 mg l-1

de kanamicina para seleccionar el plásmido binario

El inoculo fue preparado en base a un cultivo líquido bacteriano, que creció en la

noche a 25°C en un medio MGL y 50 mg l-1 de kanamicina.

Un medio MGL contiene lo siguiente:

2.5g l-1 de extracto de levadura

5g l-1 triptona
5g l-1 manitol
5g l-1 NaCI
1.16 g l-1 glutamato de sodio
0.25g l-1 KH2PO4
0.1g l-1 MgSO4
1mg l-1 biotina, pH= 7

La suspensión se centrifugó por 5 minutos, a 15000 rpm y las células recogidas se

suspendieron nuevamente en el medio MS con 30g l-1 sacarosa, a un pH de 5.8,
suplementado 0.2mg l-1 ácido nafatalenoacetico (NAA) y acetosiringona (AS) a
varias concentraciones (0, 25, 50 , 75 y 100μM) y se diluyeron hasta tener una
densidad óptica de 600nm.

Los discos con las raíces de la zanahoria se pusieron boca arriba en cajas de Petri
con 6% de agar en agua y con 200mg l-1 de cefotaxima.

El inoculo con concentración de 100μl se extendió en la superficie de cada disco

de zanahoria.
Los discos de control se cubrieron con el mismo inoculo pero este sin células
bacterianas. Todos los discos se guardaron por cuatro semanas en la oscuridad y
a 22°C.

Para la selección, los discos se iluminaron con una lámpara para luz UV.

Las raíces fueron de al menos 2cm de longitud y mostraron un color verde

fluorescente, se transformaron putativamente; se extirparon y se pusieron con 1
mg l-1 2,4-D de medio B5 y 400 mg l-1 de cefotaxima para la producción de callos.
La regeneración se realizó en un medio MS con sacarosa al 20g l-1, suplementado
con 0.2mg l-1 de kinetina, también a los brotes se les puso en ese medio pero
carentes de reguladores de crecimiento.

Las transferencias de todos los tejidos se hicieron cada cuatro semanas por cada
cultivo.

Las plántulas se aclimataron en ollas con turbas, en un cuarto aclimatado (22/19°C

día y noche, en un fotoperiodo de 16 horas) y después se transfirieron a un
invernadero.

+ Análisis de PCR y Southern

El ADN de la planta se extrajo de muestras de plantas por el método de CTAB,

con algunas modificaciones, como agregar 0.1% de β-mercaheptanol al buffer y la
precipitación del ADN se hiso en presencia del isopropanol.

Para la prueba de PCR se agregaron mezclas de 12.5 μl conteniendo 100 ng de

DNA, 0.1 mM por cada dNTP, 0.2μM por cada primer y 0.25 de la Tac polimerasa.

Se usaron tres genes pares específicos como primers

Para el gen nptII (F 5’-3’ y en reversa R 5’-3’)

Para el gen gfp5-er (F 5’-3’ y en reversa R 5’-3’)
Para el gen virD2 (F 5’-3’ y en reversa R 5’-3’)

Se esperaron fragmentos: de 804, 727 y 338 bp respectivamente.

La amplificación se hiso en un termociclador usando las siguientes condiciones

para cada uno:

Para los fragmentos obtenidos con nptII y gfp:

94°C por 4 minutos, 45 ciclos de 94°C por un minuto

56 °C por un minuto
72°C por 2 minutos
Seguidos por 72°C por 10 minutos
Para el virD2 se aplicaron las mismas condiciones, excepto que la temperatura fue
de 65°C.
Los fragmentos se separaron con gel de agarosa al 1.5% y después se colorearon
con bromuro de etidio.

Para el análisis de southern blot:

Se hiso la digestión de 30μg de DNA con la enzima HindIII.

Los fragmentos se separaron en un gel de agarosa al 1.2% y en 0.5 del buffer TBE
y se transfirieron en una membrana de nylon, se transfirieron en la noche por
capilaridad.
Los genes obtenidos de los fragmentos de nptII y gfp fueron etiquetados por un
método alemán, y por el protocolo de la PCR y los que resultaron rápidamente de
la prueba se utilizaron como pruebas.

Después de la reticulación ultravioleta, las membranas se prehibridizaron a la

membrana. La detección de los fragmentos de DNA se realizó de acuerdo a las
instrucciones que contiene el filtro de hibridización.

+ Diseño del experimento y análisis de los datos

Se reunieron los discos de diversas partes de las raíces al azar y se separaron

en grupos, a los cuales se les asignaron tratamientos diferentes.

Los discos con cada raíz diferente se inocularon con las cepas, para detectar las
diferencias en virulencia de las cepas bacterianas. Se compararon varios
genotipos de las zanahorias, después de que se inocularon con LBA1334 en
presencia de 50μM AS.
Después de la inoculación se contaron los explantes que tuvieron respuesta, se
contaron las raíces expresadas por GFP y se calcularon sus proporciones.

Las proporciones se compararon por el método de chi cuadrada y se analizó la

varianza por el método de Tukey-Kramer.

Resultados.-

El primer desarrollo de un tejido de zanahoria se observó después de 7-10 días de

la inoculación. En casi todos los discos se observó el desarrollo de tejidos
neoplásticos. Las raíces se iniciaron una semana después. Las raíces se
elongaron en las semanas siguientes y llegaron a medir hasta 6cm de longitud
pero cada una difirió en cuanto a longitud y delgadez.

Después de 4 semanas de cultivo, se contaron las raíces desarrolladas en cada

disco.

Para calcular la eficiencia de transformación sólo las raíces más largas de 2cm se
tomaron en cuenta.
En general se puede decir que sólo entre el 25-98% de los discos inoculados
produjeron raíces, pero fue dependiendo también del tratamiento que se les dio.

Las raíces putativas transformadas se identificaron si mostraban una fluorescencia

verde clara cuando se expusieron los discos a la detección por GFP.
Los discos que fueron de control, no produjeron ni raíces ni exhibieron
fluorescencia.

Se escogieron 152 raíces fluorescentes de todos los tratamientos que se hicieron,

se extirparon de los discos. De esos sólo 127 (84%) produjeron tejidos callosos.
Esos callos continuaron creciendo mientras se cultivaron en kanamicina, pero sólo
8 clones (6%) se tornaron cafesosos y finalmente se deterioraron. La exposición
repetitiva de esos tejidos callosos a la luz ultravioleta reveló que esos 8 clones
susceptibles perdieron su fluorescencia verde durante el cultivo.

Las plantas obtenidas de los tejidos fluorescentes se checaron para ver si había
transgenes en el DNA genómico.

No se detectó el gen virD2 en ninguna planta, esto indicó que estaban libres de
Agrobacterium.
Los análisis Southern indicaron que una o varias copias de transgenes se
incorporaron al DNA de la planta dependiendo del clon.

Efecto de la cepa bacteriana

Cada cepa tuvo un impacto significativo en la eficiencia de la transformación.

En total 506 de 745 discos (68%) produjeron 3878 raíces de al menos 2 cm de

longitud.
Las cepas A4T y LBA1334 fueron las más efectivas, después siguió 69% de de la
LBA9402 y con 54% la A4.

Efecto de la acetosiringona

Para el caso de la cepa LBA9402 la adición de acetosiringona en concentraciones

de 50-100μM se elevó al doble en el número de discos con raíces.

Efecto de la inoculación retardada.-

Los discos de zanahoria fueron tratados con un inoculo que contenía 50μM de
acetosiringona, dentro de las siguientes 4 horas después de la preparación o la
inoculación retardada hasta el día siguiente (18h). Por ese tiempo los discos se
guardaron en un medio de agar con cefotaxima, en cajas de petri, en un cuarto
con temperatura.

Para todas las cepas, el número de respuesta de los discos disminuyó, después
de la inoculación retardada de 197 a 181 (8%).

Las cepas A4T y LBA1334, fueron las que mantuvieron las mejor respuesta de
inducción entre 82-97% de los discos.

Efecto del genotipo de la zanahoria.-

Se usaron 12 genotipos, los cuales difirieron significativamente la proporción de

respuesta de los discos. Iban de 25 a 93%.

Dolanka, Danvers y Karotan produjeron más de 10 raíces de 2cm de longitud por

disco.
La eficiencia de transformación calculada como porcentaje de los discos
inoculados que producen raíces que expresan el GFP varió de 13 a 85%.

Algunas de las raíces utilizadas fueron altamente susceptibles a Agrobacterium,

mientras que se caracterizaron por una baja respuesta, independientemente en la
cepa utilizada.

Discusión.-

Los discos de zanahoria se inocularon con A. rhizogenes y produjeron raíces y

una fracción de esas exhibieron fluorescencia visible en luz ultravioleta.

10% de las raíces exhibieron una fluorescencia verde intenso que permitieron una
fácil identificación. Esta baja proporción se debe a que no se tomaron en cuenta
las que presentaron baja fluorescencia.

La producción de una raíz en un cultivo in vitro seguida de la inoculación se lleva a

cabo en 5 meses.

Las modificaciones inducidas por A. rizhogenes se ha observado en algunas

plantas transformadas.

Se utilizaron dos cepas A4T y LBA1334, soportadas por el plásmido pRiA4 y

pRi1855, respectivamente, pero ambas se derivaron de la A. tumefaciens C58,
otras cepas fueron A4 y LBA9402, con los mismos plásmidos tmb
respectivamente.

En este trabajo las cepas A4T y LBA1334 tuvo una mayor producción de raíces
que las otras.

Que por las diferencias entre los plásmidos Ti y Ri no son los responsables de una
mayor eficiencia en la transformación, sino más bien se debe a los antecedentes
cromosómicos.

Conclusión.-

El A. rizhogenes es un buen mediador en la transformación de raíces de

zanahoria, y puede ser una herramienta muy importante en la producción de
plantas transgénicas.

El uso de un vector construido por un gen gfp, ayuda a identificar fácilmente raíces
transformadas, usando una lámpara de luz ultravioleta.