Metodos

Metodos
de purificaci
de purificaci

n
n
Basado en las siguientes propiedades proteicas:
Basado en las siguientes propiedades proteicas:

Tama
Tama

o
o

Solubilidad
Solubilidad

Carga
Carga

Adsorci
Adsorci

n
n

Afinidad
Afinidad
CAROLINA VITA
Caracter Caracter stica stica
Procedimientos Procedimientos
Tamao
Dialisis ultrafiltracin
Electroforesis en gel
Cromatografia de exclusin molecular
Ultracentrifufacion
Solubidad
Precipitacin con Sales
Solventes organicos
por pH
Polaridad
Cromatografia de absorcin
C. En papel
C. En fase reversa
C. De interaccion hidrofbica
Carga
Cromatografia de intercambio inico
Electroforesis
Isoelectroenfoque
Selectividad Cromatografia de afinidad
Cromatografias
Cromatografias
de exclusi
de exclusi

n
n
molecular
molecular

Separan por tama

Separan por tama

o
o

Las columnas rellenas

Las columnas rellenas
polimeros
polimeros
inertes
inertes
Insolubles pero muy hidratados
Insolubles pero muy hidratados
Sephadex: polimeros de dextrano
Sepharose: agarosa
Superose: agarosa entrecruzada
Sephacryl: dextrano-bisacrilamida
Superdex: agarosa y dextrano
.
1.La columna se equilibra con el buffer de corrida
2. Aplicacin de la muestra (0.5 - 5% volumen de columna)
3. Elucin.
Exclusi
Exclusi

n
n
molecular
molecular
Exclusi
Exclusi

n
n
molecular
molecular
1.
1.
Separa mezclas de prote
Separa mezclas de prote

nas por tama

nas por tama

o
o
2.
2.
De macromol
De macromol

culas diferente
culas diferente
3.
3.
De grandes estructuras celulares como
De grandes estructuras celulares como
ribosomas
ribosomas
4.
4.
Determinaci
Determinaci

n de PM
n de PM
Volumen de exclusi
Volumen de exclusi

n
n
Prote
Prote

nas de gran tama

nas de gran tama

o no penetran
o no penetran
los poros permaneciendo en el
los poros permaneciendo en el
volumen de exclusi
volumen de exclusi

n de la columna
n de la columna
Vo
Vo
Se determina Vo con Blue Dextran
Ve se determina para cada protena
Vt se calcula de la frmula r 2 x h
Kav =Ve-Vo / Vt-Vo
Kav
Log Mw
Determinacion
Determinacion
de PM
de PM
CARGA
CARGA

Los grupos
Los grupos
R
R
en las prote
en las prote

nas globulares
nas globulares
se encuentran sobre la
se encuentran sobre la
superficie
superficie
exterior
exterior
de la mol
de la mol

cula, aunque tambi

cula, aunque tambi

n
n
pueden tener grupos ocultos o
pueden tener grupos ocultos o
participando de puentes de H
participando de puentes de H

Carga
Carga

depende de las propiedades

depende de las propiedades

cido
cido

base
base
de los grupos R
de los grupos R
Cromatograf
Cromatograf

a de intercambio i
a de intercambio i

nico
nico
Un intercambiador inico consiste en una matriz porosa
con grupos cargados unidos covalentemente.
Estos grupos se asocian con iones de la fase mvil
(contraiones), estos pueden intercambiarse por otros
iones de las misma carga sin alterar la matriz.
La matriz generalmente es un compuesto inorgnico,
resinas sintticas o polisacridos.
Matriz Nombre
Dextrano Sephadex
Agarosa Sepharose CL-6B
Celulosa Sephacel
Grupos cargados
Grupos cargados
Son una propiedad fundamental del intercambiador.
Determina el tipo y la fuerza del intercambiador
El nmero total y su disponibilidad determinan la
capacidad del intercambiador
Los de carga negativa adsorben cationes
mientras que los de carga positiva adsorben aniones.
As se llaman intercambiadores catinicos y
aninicos respectivamente.
Mecanismo de
separacin
Separa a molculas por
carga neta.
Grupos cargados unidos a
la matriz adsorben
muestras de carga
opuesta(reversible)
La desorcin se logra a
travs el cambio del pH o
aumentando la
concentracin de sal del
eluyente.
Fig 1.1. las molculas cargadas se
absorben en los en los
intercambiadores de carga opuesta.
La interaccin es un equilibrio
dinmico que puede estar
influenciado por pH como por la
concentracin de las sales.
Cromatografa de intercambio inico(IEX)
Adsorci
Adsorci

n
n
Fig 1.2. El tamao de la fecha
representa la fuerza de la adsorcin
Protenas poseen aa cargados
en su superficie, se adsorben
sobre el intercambiador
Protenas con carga neta
negativa se absorben a I.
catinicos,
La fuerza de adsorcin aumenta
con el aumento de carga neta.
La carga de los aa depende del
pH.
la carga neta depender del pH
de una manera que es bastante
especfica para cada protena
individual.
Desorci
Desorci

n
n
Existen 2 posibilidades
Reducir la carga neta
cambiando el pH.
Agregar un in que compita
por las cargas del
intercambiador
En IEX se utiliza una sal
monovalente como NaCl, ya
que tiene poco efecto sobre
el pH de la corrida
.
Fig 1.3. A mayor carga neta,
mayor es la adsorcion y
mayor la concentracion de
sales que se necesita para
desorber la muestra
1. El buffer se
bombea por la
columna
hasta que la
[salina] y el
pH lleguen a
un equilibrio
2
. La
muestra se
aplica , se
adsorbe y
se lava con
buffer
3. El gradiente comienza y los
componentes adsorbidos de la muestra
comienzan a eluir en funcin de su carga
neta.
Elution
order:
4.
Regeneracin de
los componentes
cargados hasta
remocin completa.
Separaci
Separaci

n
n
de
de
prote
prote

nas
nas
usando
usando
gradiente
gradiente
de
de
NaCl
NaCl
CARGA
CARGA

Los grupos
Los grupos
R
R
en las prote
en las prote

nas globulares
nas globulares
se encuentran sobre la
se encuentran sobre la
superficie
superficie
exterior
exterior
de la mol
de la mol

cula, aunque tambi

cula, aunque tambi

n
n
pueden tener grupos ocultos o
pueden tener grupos ocultos o
participando de puentes de H
participando de puentes de H

Carga
Carga

depende de las propiedades

depende de las propiedades

cido
cido

base
base
de los grupos R
de los grupos R
Electroforesis
Electroforesis
Transporte de part
Transporte de part

culas a trav
culas a trav

s de un
s de un
campo el
campo el

ctrico.
ctrico.
ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS
en
en
Papel de filtro o acetato de celulosa
Papel de filtro o acetato de celulosa

Revela
Revela
la presencia de prote
la presencia de prote

nas con colorantes

nas con colorantes
espec
espec

ficos
ficos

No
No
existe interacci
existe interacci

n con el soporte
n con el soporte

Resoluci
Resoluci

n
n
muy baja
muy baja

R
R

pido
pido
Separa por CARGA Y TAMA
Separa por CARGA Y TAMA

O
O
El material soporte interacciona con las
El material soporte interacciona con las
prote
prote

nas actuando como matriz retardando

nas actuando como matriz retardando
a las prote
a las prote

nas m
nas m

s grandes
s grandes

Geles
Geles
agarosa
agarosa

Geles
Geles
poliacrilamidas
poliacrilamidas
Condici
Condici

n
n
nativa(PAGE
nativa(PAGE
) o
) o
desnaturalizante(SDS
desnaturalizante(SDS
-
-
PAGE)
PAGE)
ELECTROFORESIS EN GELES
ELECTROFORESIS EN GELES
Geles
Geles
poliacrilamida
poliacrilamida
SDS
SDS
-
-
Page
Page
Condiciones
Condiciones
desnaturalizante
desnaturalizante
Utiliza en la corrida:
Utiliza en la corrida:

-
-
mercaptoetanol
mercaptoetanol

reducida
reducida
s
s

SDS
SDS

desnaturalizadas
desnaturalizadas
Las
Las
proteinas
proteinas
se separan
se separan
s
s

lo
lo
por su PM
por su PM
El SDS interacciona con las prote
El SDS interacciona con las prote

nas por
nas por
interacciones hidrof
interacciones hidrof

bicas
bicas
cumple 2 funciones cr
cumple 2 funciones cr

ticas:
ticas:

Recubre las
Recubre las
proteinas
proteinas
con carga negativa
con carga negativa
proporcional a su PM
proporcional a su PM

Desnaturaliza la estructura nativa de la prote
Desnaturaliza la estructura nativa de la prote

na
na

-
-
mercaptoetanol
mercaptoetanol
rompe los puentes
rompe los puentes
disulfuros
disulfuros
Se puede entonces Se puede entonces
determinar el peso determinar el peso
molecular aparente de molecular aparente de
cualquier prote cualquier prote na por na por
comparaci comparaci n con un patr n con un patr n n
de prote de prote nas de pesos nas de pesos
moleculares conocidos. Las moleculares conocidos. Las
movilidades de las movilidades de las
prote prote nas en los geles de nas en los geles de
SDS SDS- -PAGE son funciones PAGE son funciones
lineales del logaritmo de su lineales del logaritmo de su
peso molecular. peso molecular.
SDS PAGE of Purification
SDS PAGE of Purification
1. Complete mix of proteins
2. High Salt
3. Ion exchange
4. Gel-filtratio
5. Affinity
10micrograms loaded in each lane
USOS
USOS

DETERMINACI
DETERMINACI

N DE PI
N DE PI

DETERMINACI
DETERMINACI

N
N
DE PM
DE PM

#
#
DE PROTE
DE PROTE

NAS DE UNA MUESTRA

NAS DE UNA MUESTRA

#
#
DE SUBUNIDADES de PROTE
DE SUBUNIDADES de PROTE

NA
NA
Isoelectroenfoque
Isoelectroenfoque
Es un tipo de
Es un tipo de
electroforesis
electroforesis

Se basa en el desplazamiento de las mol
Se basa en el desplazamiento de las mol

culas
culas
en un gradiente de pH.
en un gradiente de pH.

Las mol
Las mol

culas
culas
anfot
anfot

ricas
ricas
(aa
(aa
) se separan en un
) se separan en un
medio en el que existe una
medio en el que existe una
diferencia de
diferencia de
potencial
potencial
y un gradiente de
y un gradiente de
pH
pH
.
.

La regi
La regi

n del
n del

no
no
do es
do es

cida
cida

La regi
La regi

n del c
n del c

todo es alcalina.
todo es alcalina.

Se establece un gradiente de pH tal que las
Se establece un gradiente de pH tal que las
mol
mol

culas que se han de separar tengan su

culas que se han de separar tengan su
pI
pI
dentro del rango.
dentro del rango.
Isoelectroenfoque
Isoelectroenfoque

Las sustancias que
Las sustancias que
estan
estan
en regiones de pH <
en regiones de pH <
pI
pI
tendran
tendran
carga
carga

y migraran hacia el c
y migraran hacia el c

todo
todo

Las que se encuentran en medios con pH >
Las que se encuentran en medios con pH >
pI
pI
tendr
tendr

n carga
n carga
-
-
y migrar
y migrar

n hacia el
n hacia el

nodo
nodo

La migraci
La migraci

n las conducir
n las conducir

a una regi
a una regi

n donde el pH
n donde el pH
coincidir
coincidir

con su
con su
pI
pI

neta nula y se detendr

neta nula y se detendr

n
n

De esta forma las mol
De esta forma las mol

culas
culas
anfot
anfot

ricas
ricas
se sit
se sit

an en
an en
estrechas bandas donde coincide su
estrechas bandas donde coincide su
pI
pI
con el pH
con el pH
IEF
IEF
IEF
IEF
Electroforesis bidimensional
Electroforesis bidimensional
La electroforesis bidimensional se basa en
La electroforesis bidimensional se basa en
separar las prote
separar las prote

nas en una mezcla seg

nas en una mezcla seg

n sus dos
n sus dos
propiedades moleculares, una en cada dimensi
propiedades moleculares, una en cada dimensi

n.
n.
El procedimiento m
El procedimiento m

s usado se basa en la
s usado se basa en la
separaci
separaci

n
n

Primera dimensi
Primera dimensi

n mediante
n mediante
ief
ief

Segunda dimensi
Segunda dimensi

n seg
n seg

n PM mediante
n PM mediante
electroforesis en
electroforesis en
poliacrilamida
poliacrilamida
SDS
SDS
-
-
Page
Page
Electroforesis bidimensional
Electroforesis bidimensional

Se ti
Se ti

en los geles
en los geles

se adquieren las im
se adquieren las im

genes de los geles con un

genes de los geles con un
esc
esc

ner de alta resoluci

ner de alta resoluci

n
n

se analizan con un software especializado.
se analizan con un software especializado.

As
As

se pueden comparar geles y observar

se pueden comparar geles y observar
cambios en el patr
cambios en el patr

n de manchas:
n de manchas:
1. 1.
variaci
variaci

n de intensidades,
n de intensidades,
2. 2.
aparici
aparici

n y/o desaparici
n y/o desaparici

n de manchas.
n de manchas.
La electroforesis 2D, englobada en un estudio de
La electroforesis 2D, englobada en un estudio de
prote
prote

mica
mica
, va seguida del an
, va seguida del an

lisis de
lisis de
manchas concretas hasta llegar a la
manchas concretas hasta llegar a la
identificaci
identificaci

n de les prote
n de les prote

nas
nas
correspondientes.
correspondientes.
Electroforesis 2D
Electroforesis 2D

Primera dimensi
Primera dimensi

n: IEF, rango de
n: IEF, rango de
pI
pI
3
3
-
-
10
10

Segunda dimensi
Segunda dimensi

n: SDS
n: SDS
-
-
PAGE 12%
PAGE 12%
Las aplicaciones de la
Las aplicaciones de la
prote
prote

mica
mica

Identificaci
Identificaci

n de nuevos marcadores para el

n de nuevos marcadores para el
diagn
diagn

stico de enfermedades
stico de enfermedades

Identificaci
Identificaci

n de nuevos f
n de nuevos f

rmacos
rmacos

Determinaci
Determinaci

n de mecanismos moleculares
n de mecanismos moleculares
involucrados en la patogenia de
involucrados en la patogenia de
enfermedades
enfermedades

An
An

lisis de rutas de transducci

lisis de rutas de transducci

n de se
n de se

ales
ales
Cromatografia
Cromatografia
hidrof
hidrof

bica
bica
Separacion
Separacion
de las prote
de las prote

nas por diferente

nas por diferente
hidrofobicidad
hidrofobicidad
Interacc
Interacc

on
on
reversible entre la prote
reversible entre la prote

na y la
na y la
superficie
superficie
hidrof
hidrof

bica
bica
del medio
del medio
cromatogr
cromatogr

fico
fico
La
La
interaccion
interaccion

con
con
alt
alt
fuerza i
fuerza i

nica
nica
Desorci
Desorci

n
n
:
:

decreciente de [salina]
decreciente de [salina]
Cromatografia
Cromatografia
hidrof
hidrof

bica
bica
Cromatografia
Cromatografia
hidrof
hidrof

bica
bica
Distintos
Distintos
ligandos
ligandos
:
:

fuerza:
fuerza:
Eter
Eter
<
<
isopropil<butil<octil<fenil
isopropil<butil<octil<fenil
No se puede predecir el comportamiento de
No se puede predecir el comportamiento de
la prote
la prote

na
na

Kit
Kit
test
test
HiTrapHIC Selection Kit
-Seleccionar el ligando apropiado y las condiciones
experimentales
5 medios con distintas caractersticas hidrofbicas
para screening y seleccin a pequea escala
Phenyl SepharoseHigh Performance
Phenyl Sepharose6 Fast Flow (low sub)
Phenyl Sepharose6 Fast Flow (high sub)
Butyl Sepharose4 Fast Flow
Octyl Sepharose4 Fast Flow
Cromatografia
Cromatografia
hidrof
hidrof

bica
bica
Cromatografia
Cromatografia
hidrof
hidrof

bica
bica
En agua pura los efectos hidrofbicos son muy dbiles para
causar la interaccin de la protena con el ligando.
Ciertas sales aumentan las interacciones hidrofbicasse
pegan al ligando
Fig 1.7. HIC deals with the relation between
water shells around hydrophobic surfaces,
bulk water clustersand salts enhancing
hydrophobic interaction.
Las siguientes sales aumentan la interaccin hidrofbica:
Na
2
SO
4
> K
2
SO
4
> (NH
4
)
2
SO
4
> NaCl > NH
4
Cl > NaBr >
NaSCN
Adsorci
Adsorci

n
n
Para lograr una desorcin selectiva la
concentracin de sal se disminuye de forma
gradual y los componentes eluyen en orden de
hidrofobicidad
Fig 1.8. The adsorption of hydrophobic molecules
is a reversible reaction whose equilibrium
is controlled by the salt concentration.
Cromatografia
Cromatografia
hidrof
hidrof

bica
bica
Cromatograf
Cromatograf

a de afinidad
a de afinidad
Cromatograf
Cromatograf

a de afinidad
a de afinidad