06/12/2011

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Anlisis microbiolgico de alimentos
Microorganismos marcadores
Mara Marcela Martnez Miranda
Magister en Microbiologa
Departamento de Ingeniera
Universidad de Caldas
En realidad
La mayora de los
alimentos
contienen
microorganismos.
No es posible el
anlisis de todos
los patgenos y de
todos los
alterantes.
Marcela Martnez M.Sc.
Porqu buscar
microorganismos marcadores?
1. La deteccin de
patgenos puede ser muy
complicada, muy lenta y/o
muy costosa.
2. La investigacin de
patgenos en alimentos
no facilita un enfoque
preventivo.
3. Calidad microbiolgica en
trminos de
microorganismos
marcadores.
Marcela Martnez M.Sc.
Microorganismos marcadores
Son organismos (o
grupos) que advierten:
manejo inadecuado
presencia de
microorganismos
patgenos
Su deteccin en el
laboratorio es ms
sencilla, rpida y/o
econmica.
Marcela Martnez M.Sc.
Microorganismos marcadores
Microorganismos cuya presencia
en cantidades o niveles por
encima de ciertos lmites
numricos indica la posible
presencia de patgenos
ecolgicamente relacionados.
ndices
Microorganismos cuya presencia
en cantidades determinadas
indica un tratamiento o
procesado de inocuidad
inadecuado.
Indicadores
Marcela Martnez M.Sc.
Caractersticas de un buen ndice de
contaminacin en alimentos
1. Origen especfico
2. Tcnicas de laboratorio
fiables y rpidas
3. Resistencia a
condiciones ambientales
y al procesado tanto o
ms que los patgenos a
los cuales representa.
Marcela Martnez M.Sc.
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Un microorganismo marcador dado
puede funcionar a la vez como ndice y
como indicador.
Por ejemplo, la presencia de cantidades
importantes de E. coli en los camarones
precocinados congelados indica:
Un tratamiento de
inocuidad
insuficiente
cumpliendo de ese
modo una funcin
de indicador
La presencia posible de
patgenos entricos, es decir,
una funcin de ndice para
microorganismos de
importancia para la salud
pblica, como por ejemplo las
shigelas, que se pudieran
haber originado en la zona
donde fueron tratados los
camarones.
Marcela Martnez M.Sc.
Los principales microorganismos
indicadores en alimentos son:
Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de
proceso:
Aerobios Mesfilos
Psicrfilos y psicrotrficos
Termfilos o termodricos
Mohos y levaduras
Coliformes totales
Indicadores de contaminacin fecal:
Coliformes fecales
E. coli
Enterococos
Anaerobios sulfito-reductores
Marcela Martnez M.Sc.
Otros microorganismos
indicadores
Estafilococos coagulasa positiva
(Staphylococcus aureus)
Recuento de Anaerobios Mesfilos
Recuento de Anaerobios Esporulados
Recuento de Virus entricos
Marcela Martnez M.Sc.
Mtodos de anlisis microbiolgico
Mtodo: cualitativo
PRESENCIA / AUSENCIA en
25 g o mL de muestra.
Salmonella sp.
Vibrio cholerae
Listeria monocytogenes
Mtodo: cuantitativo
Tubos mltiples: NMP/g o mL
de muestra
Recuento en placa: ufc/g o mL
a. Por incorporacin
b. Por superficie
Marcela Martnez M.Sc.
Indicadores de condiciones de
manejo o de eficiencia de proceso
Aerobios
mesfilos
Psicrfilos y
termfilos
Mohos y
levaduras
Coliformes
totales
Marcela Martnez M.Sc.
Recuento de aerobios mesfilos
(RAM)
Se desarrollan en presencia de aire
a temperaturas medias (25-40C).
Dan lugar a la formacin de colonias
visibles despus de 72 horas a 3O
C ( 48 horas a 37C) sobre un agar
de recuento, incubado en
condiciones de aerobiosis.
Indican:
la calidad sanitaria de un
alimento.
las condiciones de manipulacin.
las condiciones higinicas de la
materia prima.
Marcela Martnez M.Sc.
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Aplicacin del RAM
Alimentos
frescos,
refrigerados y
congelados.
Materias primas e
insumos.
Alimentos listos
para consumir.
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El RAM NO es til para:
Alimentos fermentados.
Col acida, queso y otros
derivados lcteos.
Alimentos esterilizados
(Recuento Microscpico
Directo).
Alimentos deshidratados y
congelados (Recuento
Microscpico Directo).
Alimentos refrigerados
(Recuento de
psicrotrficas).
Marcela Martnez M.Sc.
Existen dos mtodos clsicos para
el recuento de aerobios mesfilos
Marcela Martnez M.Sc.
RAM por el mtodo de siembra a
profundidad
Profundidad 10 -1 (48 h) 10 -2 A (48 h) 10 -2 B (48 h) 10 -3 A (48 h) 10 -3 B (48 h)
Marcela Martnez M.Sc.
Un RAM elevado indica:
En alimentos estables
Materias primas muy contaminadas.
Tratamiento no satisfactorio.
En alimentos perecederos
Materias primas muy contaminadas.
Tratamiento no satisfactorio.
Almacenamiento en condiciones de
temperatura inadecuadas.
Marcela Martnez M.Sc.
Un RAM elevado puede significar:
1. Excesiva contaminacin
de la materia prima.
2. Deficiente manipulacin
durante el proceso de
elaboracin.
3. La posibilidad de que
existan patgenos, pues
stos son mesfilos.
4. La inmediata alteracin
del producto.
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Psicrotrficos
Por definicin son
organismos que producen
crecimiento visible a 7
o
C
1
o
C dentro de 7 a 10
das, independiente de su
temperatura de crecimiento
ptima.
Los organismos
mayormente asociados con
alimentos refrigerados y
que causan dao son
psicrotrficos y no
psicroflicos
Marcela Martnez M.Sc.
Psicrotrficos
Incluye bacilos y cocos; formadores de esporas; gram
positivos y gram negativos; aerbos; anaerobios y
anaerobios facultativos.
Aeromonas
Bacillus
Clostridium
Lactobacillus
Escherichia
Listeria
Serratia, ect.
Hongos y levaduras
Marcela Martnez M.Sc.
Psicotrficos patgenos
Patgenos
Aeromonas hydrophila
Bacillus cereus (algunas
cepas)
Clostridium botulinum type E,
B y F
Listeria monocytogenes
Vibrio cholerae
Yersinia enterocoltica
Escherichia coli (algunas
cepas)
Marcela Martnez M.Sc.
Psicrotrficos
Mtodos de deteccin
Cultivo durante 10 das
a 7
o
C para siembra en
profundidad.
Cultivo durante 7-8
das a 7
o
C para
siembra en superficie
Cultivo durante16 hr a
17
O
C seguido de 3
das a 7
o
C
Marcela Martnez M.Sc.
Termodricos
Organismos que
pueden tolerar calor y
por consiguiente
tienen la capacidad
de sobrevivir
pausterizacin. Son
capaces de sobrevivir
el calentamiento de
un alimento a
temperaturas de 60 a
80
O
C.
Marcela Martnez M.Sc.
Termodricos
Gnero Alimento asociado
Actinomycetes Leche
Alcaligenes Leche
Arthrobacter Leche
Bacillus Leche/huevos
Clostridium Leche
Coryneform Huevos
Lactobacillus Leche/carne/jugos
Microbacterium Leche
Micrococcus Leche/huevos
Pseudomonas Huevos
Streptococcus/
Enterococcus
Leche/carne/huevo
Marcela Martnez M.Sc.
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Coliformes
Bacilos Gram negativos
No esporulados
Aerobios o anaerobios
facultativos
Fermentan la lactosa a 35C
con produccin de cido y
gas
Viven en el ambiente y en
animales de sangra caliente
Los coliformes totales
incluyen los fecales
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.
Son algunas especies que
pertenecen a los gneros:
Gnero Fuente
Escherichia
Heces (humanas y
animales)
Klebsiella Heces, ambiente
Enterobacter Heces, ambiente
Citrobacter Ambiente
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.
Coliformes como indicadores de
contaminacin fecal
Se encuentran en el intestino del hombre y de
animales, pero tambin en otros ambientes
como: suelo, plantas, cscara de huevo, etc.
Son tiles como indicadores de contaminacin
fecal por:
Su frecuencia en heces
Su fcil deteccin en el laboratorio
Sus caractersticas semejantes a algunos miembros
patgenos de la familia Enterobacteriaceae
Marcela Martnez M.Sc.
Aplicacin del uso de Coliformes
como indicadores
1. Deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el
manejo y en la fabricacin de los alimentos.
2. Evaluacin de la calidad microbiolgica de un
producto.
3. Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias
e higinicas en el equipo.
4. Calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de
agua utilizados en las diferentes reas del
procesamiento de alimentos.
Marcela Martnez M.Sc.
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Pruebas de determinacin de
Coliformes
1. Investigacin y recuento en
medio lquido
Se usa el Caldo
lactosado biliado verde
brillante (Brilliant Green
Bile Lactose: BGBL)
2. Investigacin y recuento en
medio slido
Se utiliza el medio
selectivo agar biliado
rojo-violeta (Violet Red
Bile Agar: VRBA)
Marcela Martnez M.Sc.
Pruebas para deteccin y
recuento de Coliformes
1. Prueba presuntiva
Caldo Lauril Triptosa (CLT).
Caldo Mc. Conkey.
Caldo lactosado bilis verde brillante.
2. Prueba confirmativa:
Medio EC.
Medio bilis lactosa (BLVB)
Marcela Martnez M.Sc.
Investigacin y recuento en
medio slido
Coliformes totales
en placas de agar
bilis rojo violeta,
incubadas por 24 h
a 35 C
UFC/g (o/mL) de
muestra.
Marcela Martnez M.Sc.
Coliformes fecales (CF)
Origen intestinal
Pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae
Bacilos Gram negativos,
anaerobios facultativos, no
esporulados.
Fermentadores de lactosa a
44.5 C con produccin de gas.
Principalmente Escherichia coli
(90%)
Marcela Martnez M.Sc.
Determinacin de CF
Su determinacin se hace a partir de la segunda etapa
(confirmativa) del mtodo de NMP, cultivando en caldo
lactosado con incubacin a 44.5 C. Marcela Martnez M.Sc.
Escherichia coli (coliformes
termotolerantes)
Capacidad para producir
indol a partir de triptfano
Produccin de la enzima -
glucuronidasa.
Es el ndice de
contaminacin fecal ms
adecuado.
Hay grandes cantidades de
Escherichia coli en las
heces humanas y
animales.
Marcela Martnez M.Sc.
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Determinacin de E. coli
Mtodos basados en:
Produccin de cido y gas a partir
de la lactosa.
Produccin de la enzima -
glucuronidasa.
Los procedimientos incluyen:
Filtracin con una membrana que
despus se incuba en medios
selectivos a 4445 C.
nmero ms probable
Marcela Martnez M.Sc.
Recuento de Enterobacterias
Familia
Enterobacteriaceae
Lactosa + y lactosa -
Se usan como grupo
indicador en lugar del
grupo de coliformes
totales.
Son de origen fecal y
no fecal.
Marcela Martnez M.Sc.
Razones por las cuales se utilizan las enterobacterias
como indicadoras en lugar de los coliformes
1. Los coliformes son un
grupo mal definido
taxonmicamente.
2. Los coliformes solo
tienen en cuenta las
enterobacterias
lactosa positiva.
3. Las Enterobacterias
son mas resistentes
que los coliformes.
Marcela Martnez M.Sc.
Qu indica niveles altos de Enterobacteiras en
alimentos procesados?
Tratamiento inadecuado y/o
contaminacin posterior al
tratamiento; ms
frecuentemente a partir de
materias primas, equipos
sucios o manejo no
higinico
Multiplicacin microbiana
que pudiera haber permitido
el crecimiento de toda la
serie de microorganismos
patgenos y toxignicos.
Marcela Martnez M.Sc.
Mtodos para el recuento de
Enterobacterias
Mtodo de
recuento
Recuento en
placa
Recuento en
medio lquido
Mtodo de
ausencia
presencia
VRBG Agar
Confirmacin con
prueba de oxidasa
Marcela Martnez M.Sc.
Estreptococos fecales
Enterococcus
Se encuentran en las heces
de los humanos y animales
de sangre caliente.
Animales de produccin:
vaca, cerdo, oveja, caballo,
gallina y pato.
Son importantes en
situaciones donde se sabe
que hay contaminacin
fecal y no se detectan
coliformes.
Marcela Martnez M.Sc.
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Uso de Enterococcus como
indicadores en alimentos
Aunque se encuentran
en cantidades menores
que E. coli, son mas
resistentes.
Se consideran
indicadores en alimentos
procesados, como
lcteos y crnicos, en
los cuales E. coli no
puede sobrevivir.
Marcela Martnez M.Sc.
Especies de Enterococcus
Grupo Especies Hbitat
Grupo 1
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Enterococcus durans
estn normalmente
presentes en las heces de
humanos y animales
Grupo 2
Streptococcus bovis
Streptococcus equinus
Enterococcus avium
no se encuentran
comnmente en las heces
humanas
Marcela Martnez M.Sc.
Clostridiumsulfito reductores
Bacterias Grampositivas,
esporuladas, anerobias,
reductoras de sulfitos.
Se utilizan como
indicadores de
contaminacin fecal
antigua.
Clostridium perfringens es
de origen fecal y tambin se
encuentra ampliamente
distribuida en la naturaleza.
Marcela Martnez M.Sc.
Recuento de esporas de Clostridium
sulfito reductores
Se pesan 10g o ml y se homogenizan
con 90ml de peptona 0.1%
Se realizan diluciones seriadas en
9ml peptona 0.1%
Marcela Martnez M.Sc.
Choque trmico para formacin de
esporas
Se ponen los tubos con las diluciones a sembrar en agua hirviendo por 10
minutos para hacer luego el choque trmico y activar las esporas.
Para finalizar el choque trmico, se ponen los tubos de diluciones en hielo.
Marcela Martnez M.Sc.
Siembra en fondo en agar SPS
Se siembra 1ml en fondo de la dilucin
que ha sido sometida a choque trmico
y se agrega el medio SPS caliente.
Marcela Martnez M.Sc.
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Incubacin en anaerobiosis
Se llevan a incubar las cajas en cmara
de anaerobiosis por 72 horas a 37 C,
con sobre generador de anaerobiosis e
indicador atmosfrico.
Marcela Martnez M.Sc.
Mohos y levaduras
Crecen ms lentamente que las bacterias en los alimentos no cidos que
conservan humedad.
Las levaduras crecen mas rpidamente que los mohos, pero con frecuencia
junto a ellos.
Mohos son aerobios estrictos.
Levaduras crecen en aerobiosis o en anaerobiosis (fermentacin).
hongos filamentosos
Unicelulares
Marcela Martnez M.Sc.
Mohos y levaduras en alimentos
Importantes en alimentos
cidos y en los de baja
actividad de agua:
Frutas frescas
Jugos
Vegetales
Quesos
Cereales
Alimentos salazonados
Encurtidos
Alimentos congelados y
deshidratados
Marcela Martnez M.Sc.
Recuento de mohos y levaduras
Se desarrollan en
condiciones de aerobiosis.
A temperaturas que varan
entre 20 y 30C.
Crecen ms lentamente
que las bacterias.
Los medios de cultivo
deben favorecer su
desarrollo pero no el de las
bacterias.
Marcela Martnez M.Sc.
Medios de cultivo para mohos
Agar de Sabouraud
Agar papa dextrosa
Agar extracto de malta
Agar Czapek-Dox
Agar Micosel o micobitico
BHI + antibiticos
BHI
Marcela Martnez M.Sc.
Recuento de mohos y levaduras
Se tiene en cuenta el rango de 10 UFC 100 UFC
Se reportan indistintamente mohos y levaduras
Marcela Martnez M.Sc.
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La misin de la vida es descubrir la vocacin y luego
entregarse a ella con todo el corazn
Buda
Marcela Martnez M.Sc.