UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENERIA

FACULTAD DE CIENCIAS


Mtodos de siembra, aislamiento y recuento de bacterias


CURSO: BIOLOGIA

PROFESORA: PILAR GARCIA A.


ALUMNOS: CORONEL SOLANO DAVID 20100450B
VILCHEZ YOVERA RICARDO ALONSO 20104088F


FECHA: 14/11/2012






















Objetivos:

Identificar mtodos eficaces para el aislamiento de microorganismos.

Manipular adecuadamente los cultivos puros.

Conocer algunos mtodos de siembra de colonias de bacterias.

Realizar una tcnica bsica de recuento de bacterias.











Mtodos de siembra, aislamiento y recuento de bacterias
Fundamento terico
Un medio de cultivo intenta el crecimiento y reproduccin in vitro de las bacterias, para
observar sus propiedades y conseguir un mejor estudio bioqumico e inmunolgico, al
contar con material en cantidad suficiente. Por ello constar de algunas propiedades (pH
adecuado, sales, nutrientes, condicione de aeroanaerobiosis, etc.), que sern las ms idneas
para la bacteria que deseamos estudiar y se citan en cada una de ellas en particular, en la
bacteriologa sistemtica.
Los medios de cultivo se dividen por su finalidad en: medios de enriquecimiento que tratan
de aumentar el nmero de bacteria existentes, si consideramos que se encuentran en
cantidad muy exigua, a la vez que inhiben la flora de asociacin acompaante y de
aislamiento (que tienen por fin conseguir una colonia o clon, es decir, grupo de bacterias
procedentes de una sola, con todas sus propiedades); los dos primeros son principalmente
lquidos y los segundos, slidos. Los medios selectivos son aquellos que poseen algn
componente que permite o no el crecimiento de una especie bacteriana, carcter de
importancia para su identificacin, y los diferenciales, aquellos en las que las diversas
especies que hay que testar alteran de forma distinta, por lo que suelen llevar indicadores
(sustancias que varan su coloracin segn el pH del medio) u otros ndices de reacciones
qumicas definidas.
Ambos medios selectivos o diferenciales pueden ser lquidos o slidos.
El objetivo clsico del aislamiento es la separacin de los microorganismos en grupos, que
puedan identificarse siguiendo los principios de la microbiologa.
METODOS DE CULTIVO
Cultivo placa agar
Se utilizan varios mtodos de siembra por estras en superficie entre las cuales tenemos el
mtodo francs y el clsico, la finalidad de estos, es obtener colonias separadas.
Mtodo francs (estra compuesta)
Se flamea el asa y se toma la muestra del material a estudiar.
Coloque el inoculo en uno de los extremos de la caja de Petri con el medio de cultivo
indicado. Extienda el cultivo haciendo 4 o 5 estras paralelas, sin romper el agar.
Flamee de nuevo el asa enfrela y sin tomar ms muestra, haga 4 o 5 estras paralelas
formando un ngulo recto con las anteriores. Este paso se repite hasta cubrir toda el rea de
la caja.
Mtodo clsico (estra simple)
Flamee el asa y se toma muestra del material a estudiar.
Extienda de un extremo a otro formando lneas en zigzag hasta cubrir toda el rea de la
caja.
CULTIVO EN AGAR INCLINADO
Rotule el tubo con su nombre, el nombre del germen que va inocular y la flecha en que se
hace el inoculo.
Con la mano derecha tome la aguja de inoculacin y flamela. Sin soltarla, djela enfriar.
Sostenga el tubo con el cultivo en la mano izquierda, remueva el tapn con el meique de la
otra mano y sostngalo de tal manera que no toque ninguna superficie.
Flamee la boca del tubo.
Retire con el agua de inoculacin una porcin de la colonia. Flamee nuevamente la boca del
tubo. Tpelo y descrtelo.
Toma el tubo a inocular, destpelo, flamelo e inoclelo, haciendo una estra en su
superficie en lnea recta.
Flamee de nuevo la boca del tubo, tpelo y colquelo en la gradilla. Antes de descartar la
guja de inoculacin, esterilcela.
Incube a 37 grados centgrados por 24 a 48 horas.
Describa las caractersticas del crecimiento bacteriano en agar inclinado.

CULTIVO EN AGAR NUTRITIVO
El crecimiento de las bacterias en medios lquidos se manifiesta por la aparicin de:
turbidez o sedimento, velo en la superficie del medio y olor caracterstico.
Para que la siembra proceda de igual manera que en el caso anterior pero utilizando el asa y
agitndola en un medio lquido. Incube a 37 grados por 24 o 48 horas, interprete los
resultados
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Aislamiento de bacterias en placas de agar. Extensin en superficie con asa de vidrio.
Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota o 0.1 ml de una
determinada dilucin del cultivo de bacterias y extenderlos con ayuda de una asa de vidrio,
previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que est completamente seco.
Incubar la placa en posicin invertida a la temperatura deseada (durante 24 o 48 horas)
segn el tipo de microorganismo.
Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permiten igualmente el recuento
de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra
sembrado.
2. Estra mltiple en superficie
Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una pequea muestra de cultivo
de bacterias y se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la placa con agar
nutritivo, en forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no daar el agar.
Se flamea el asa de kolle, se enfra despus de rozar la siembra realizada previamente, se
extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras. Este proceso se repite
sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en
estra. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada y en posicin invertida.
Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un
elevado nmero de bacterias.
3. Dilucin en masa o inmersin
En una placa Petri vaca, previamente estril, se deposita un volumen conocido de muestra
y luego se adiciona al medio de cultivo: agar nutritivo fundido, atemperado
aproximadamente 45C., se mezclan ambos por rotacin suave de la placa. De esta forma
los microorganismos se distribuirn de forma homognea en el medio de cultivo
permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.
La homogenizacin se deja enfriar en las placas hasta que solidifique el medio y
posteriormente incubarlo a la temperatura adecuada.
















Siembra por dilucin en masa







Aislamiento por estra en superficie Aislamiento por dilucin en masa







OBSERVACIONES:
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de los
casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento
explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a partir de una nica
clula inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las condiciones ambientales
adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos
iguales (un clon bacteriano).

El mtodo ms efectivo es el de dilucin en masa o inmersin pues es el ms exacto como
para el conteo de las bacterias

El nmero de bacterias contadas en la placa de agar nutritivo era de 48 bacterias a una
dilucin de 0.01 y el volumen analizado era de 0.5 mL. Por lo q en un tubo de cultivo puro
se encontraran aproximadamente 96000 UFC/mL.

DISCUSIONES:
De las tcnicas estudiadas se puede decir que el mtodo ms eficaz para poder aislar y
cultivar bacterias es el mtodo de inmersin o dilucin en masa.
Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos para predecir
cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a ir consumindose el substrato y cmo se van a
ir acumulando los productos del cultivo. Sin conocer estos factores es muy imprudente
iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el coste que ello
supone, puesto que no podemos predecir qu va a pasar, cundo va a completarse el
crecimiento, cmo se va a acumular el producto, etc.
Las clulas aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van
utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que
pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividindose en cuanto han
podido duplicar su masa y su material gentico. El tiempo que tarda una clula en hacer
todo lo anterior es lo que conocemos como tiempo de generacin (t) y puede variar desde
unos 20 minutos en condiciones ptimas hasta varios meses en condiciones del suelo. Cada
vez que transcurre un tiempo de generacin, el nmero de clulas se duplica, siguiendo, por
tanto, un incremento exponencial.

El recuento de bacterias es un mtodo muy utilizado cuando se necesita determinar el
tamao de la poblacin bacteriana de una muestra.
El recuento de microorganismos, en este caso, se basa en que cada uno desarrollar una
colonia visible. Pero debido a que una muestra no es totalmente homognea con respecto a
su composicin microbiolgica, es posible que una colonia se origine de un
microorganismo o de cientos de ellos, dando en este ltimo caso un recuento menor del
real. Tambin es posible que muchas de las bacterias presentes en la muestra no puedan
crecer en las condiciones elegidas (pH, temperatura, medio de cultivo, tiempo, etc.). En este
caso el recuento tambin ser inferior al real. Lo que si se sabe es que cada colonia
observada se form a partir de por lo menos un microorganismo. Esta es una condicin
necesaria y suficiente. Entonces la colonia es considera una unidad formadora de colonia
(ufc) a los efectos de los clculos.
Se admite, por lo tanto, que en los mtodos de recuento de microorganismos vivos, son
inevitables los errores. Especialmente cuando se examinan muestras pequeas, es posible
cometer grandes errores.

CONCLUSIONES:
Por medio de esta prctica se logr utilizar las tcnicas aprendidas durante el transcurso del
curso. Se logr aprender a realizar algunos de los mtodos que existen para cultivar
bacterias y de esta manera observar sus caractersticas macroscpicas e interpretacin de las
mismas, con lo que se observ que para cada bacteria existen caractersticas diferentes que
son las que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera se le
puede llegar a identificar con su correcta siembra y observacin para anlisis posteriores o
simplemente para la identificacin de una bacteria en algn medio u organismo.






















CUESTIONARIO

1.-DEFINICIONES:

Inocular: Introducir una sustancia en un organismo:

Incubar: Desarrollar el organismo una enfermedad
Cepa bacteriana: Colonia microbiana procedente de un solo germen obtenido de un
enfermo, y multiplicado por pases sucesivos en diferentes medios de cultivo.
Agar: Gelosa. Polisacrido polmero de la galactosa que se extrae de las Rodophyta, es
utilizado en bacteriologa para solidificar medios de cultivo y en la alimentacin por su
propiedad de gelificar.

Peptona: derivado proteico que se origina de la hidrolisis parcial de una protena debido a la
accin fermentativa de la pepsina.


2.- Qu es Unidad Formadoras de Colonias UFC?
Unidades Formadoras de Colonias es un valor que indica el grado de contaminacin
microbiolgica de un ambiente. Expresa el nmero relativo de microorganismos de un
taxn determinado en un volumen de un metro cbico de agua. UFC es el nmero mnimo
de clulas separables sobre la superficie, o dentro, de un medio de agar semi-slido que da
lugar al desarrollo de una colonia visible del orden de decenas de millones de clulas
descendientes. Las UFC pueden ser pares, cadena o racimos, as como clulas individuales
Unidad formadora de colonias. Una dilucin hecha con bacteria y agua peptonada se coloca
en el plato de agar (Cuenta de plato agar para muestras alimenticias o Agar trypticase de
soja para muestras clnicas) y expandida en el plato siguiendo este patrn. Las "Unidades
Formadoras de Colonias" (ufc) se miden en (UFC por mililitro).


3.- Emplear la tcnica de dilucin en masa, nos brinda el nmero
exacto de bacterias en un determinado volumen?

La tcnica de dilucin en masa no nos brinda un resultado adecuado para determinar el
nmero de bacterias en un volumen determinado, quien lo hace es la tcnica de extensin
por superficie Esta tcnica de siembra, adems de permitir que se distingan las colonias
por su morfologa, permite el recuento de microorganismos viables. La expresin de este
recuento se hace en "unidades formadoras de colonias" (UFC) ya que cada una procede de
un slo microorganismo (o de un grupo de microorganismos, pues en algunos casos stos
tienden a formar agregados).
4.- Cmo se obtiene un cultivo puro?

Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin microbiana mixta, se
utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo
XIX.

5.- Qu es la esterilizacin?
La esterilizacin es un mtodo de control del crecimiento microbiano que involucra la
eliminacin de todas las formas de vida microscpicas, incluidos virus y esporas, la
temperatura utilizada para la destruccin de los mismos, es de 100 C en adelante. Es un
trmino absoluto que implica la prdida de la viabilidad mediante la destruccin de todos
los microorganismos contenidos en un objeto, rea especfica o sustancia, acondicionando
de tal modo la posterior propagacin o contaminacin a otros objetos o al medio ambiente.



6.-Por qu es importante la esterilizacin?
La razn fundamental para efectuar la esterilizacin en Microbiologa Industrial es para
evitar la competicin por los nutrientes en medios de cultivo y permitir as que el cultivo de
microorganismos especficos que se utilizan en un proceso de fermentacin de los
rendimientos esperados en biomasa y/o metabolitos especficos






























Referencias bibliogrficas:

Prescott, L.M., J.P. Harley y D.A. Klein. MICROBIOLOGA (5 edicin).
McGraw-Hill Interamericana. Madrid. 2004. pp.: 105-112.
http://microrosa.wikispaces.com/file/view/Siembra+PRACT5.pdf
http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.%20Cultivo%20de%20
microoorganismos.pdf Fecha de consulta: 22-04-2010.
Romero Cabello, R. Microbiologa y Parasitologa Humana, Editorial
Panamericana, Mxico 2001. 2ed. Pgs. 257-429
Microbiologa General, Tema 2.- Cultivo de microorganismos.

http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jolope/GUIONPRACTICAS0506.doc
http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/GuiaMicro2.pdf