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Universidad de Talca Facultad de Cs. de la salud Dpto.

Bioqumica Clnica e Inmunohematologa

Espectrofotometra y Control Instrumental

Prof. TM. Mg Cs. Roxana Orrego C.

Marzo- 2014

Espectrofotometra Trmino que se refiere al uso de la radiacin electromagntica (REM) para medir las concentraciones una sustancia.
Historia Antes de 1940 la mayora de las determinaciones en qumica clnica era de tipo volumtricas, gravimtricas y por comparacin de colores. resultados semicuantitativos.

1940

En la dcada del 50 se comienza a utilizar el espectrofotmetro en USA, Resultados: cuantitativos, confiables, reproducibles. Mejora la precisin y la exactitud.

El espectrofotmetro es un instrumento muy til, por su sencillez, rapidez, especificidad * y sensibilidad*. * Dado en su mayor parte por la metodologa estandarizada

ANTECEDENTES Todo tomo y molcula es capaz de absorber energa (bajo ciertas limitaciones).
La energa puede proporcionarse en forma de REM luz

El tipo y la cantidad de REM absorbida por una molcula esta relacionada con su estructura.
As mismo la cantidad de REM absorbida est relacionada con el nmero de molculas que interaccionan con ella.

Antecedentes tericos
La REM se desplaza describiendo una onda, mientras ms pequea es la longitud de onda () mayor energa que posee y viceversa. La longitud de onda ( ) es la distancia lineal desde cualquier punto de una onda hasta el punto correspondiente de la onda adyacente y se mide comnmente en nm.(nanmetros) La frecuencia ( ) es el nmero de ondas que pasan por un punto en una unidad de tiempo s-1= Hertz (Hz).

Antecedentes tericos
La espectrofotometra en qumica clnica slo trabaja con la REM ultravioleta cercana y la visible.

Long de onda (nm) Color de la luz absorbida 380-420 Violeta

Color complementario trasmitido Amarillo verdoso

420-440
440-470 470-500 500-520 520-550

Azul-violeta
Azul Verde azulado Verde Amarillo verdoso

Amarillo
Anaranjado Rojo Prpura Violeta

550-580
580-620 680-780

Amarillo
Anaranjado Prpura

Azul-violeta
Azul Verde

Instrumentacin
1. 2. 3. 4. 5.

Espectrofotmetro de haz simple


Fuente estable de E radiante (Lmpara) Hendidura de entrada para enfoque de la luz Selector de longitud de onda (sistema monocromador o filtros ) Hendidura de salida para enfoque de la luz Dispositivo para mantener el recipiente que contendr la solucin (porta cubeta) 6. Detector de energa radiante (fototubos) 7. Dispositivo para leer seal elctrica

1 + 2 1

0.05

Lmparas:
Tungsteno fuente de radiacin de los 380 - 780 nm. Las ms empleadas en qumica clnica son las de yoduro de tungsteno que tiene una vida til aprox. 3000 h. Deuterio e hidrgeno en el intervalo de 220 - 360 nm. (UV)

Mercurio proporcionan slo espectros discontinuos de 313, 365, 405, 436 y 546 nm (slo tiles para calibracin)

Distribucin espectral de lmparas

Absorcin Filtro Selector de longitud de onda Monocromador Redes


Interferencia

De corte
De banda

Prismas De transmisin

De reflexin

Selectores de longitud de onda


Filtros : Dispositivos sencillos, formados por un solo material y trasmite energa en la deseada , absorbiendo el resto de las . Filtros con absorcin-transmisin selectiva (filtros de vidrio y Wratten) Filtros de interferencia
Filtro de interferencia

Monocromadores: producen un haz de radiacin de gran pureza espectral y permiten variar de forma continua y en un gran intervalo la . La E radiante es dispersada por un prisma o una red de difraccin, estos dan rangos ms estrechos de .

Prismas: generan dispersin de la REM basado en el fenmeno de refraccin de la luz. El grado de desviacin depende de la .
Para la regin visible se usa prisma de vidrio Para la regin UV se usa prisma de cuarzo

* Dispersin Luz es no lineal

Rejillas o redes de difraccin o reflexin: Superficie lisa, en la cual se graban gran n de surcos. Regiones UV-visible poseen (300-2000 surcos x mm). Los surcos estn muy prximos entre s, cuando la luz es reflejada por la rejilla, cada estra se comporta como una fuente de radiacin. *Dispersin de la luz en es lineal.

Ancho de banda espectral (ABE)

La luz que sale del sistema monocromador no es una sola , sino que comprende un intervalo de .
Ancho de Banda: intervalo de que pasan a travs de hendidura de salida del sistema monocromador, medida en la del flujo saliente detectado.

Celdas o porta muestras

Existen de todos tamaos y formas. Tienen un espesor (o trayectoria ptica) de 1,00 cm.

* Normalizacin de Abs= Abs leda x 1/camino ptico en cm.

Detectores : convierten energa radiante en seal elctrica (clulas fotovoltaicas, fototubos, fotodiodo, tubo fotomultiplicadores, termopares y bolometros) El detector ideal debe:

Poseer elevada sensibilidad en la regin espectral


de estudio Dar respuesta lineal para la energa radiante

Tener un tiempo de respuesta pequeo Ser utilizable en amplio intervalo de


Dar una mnima seal de salida ante ausencia de radiacin.

Fotomultiplicador: seal ms intensa Los electrones emitidos por una superficie fotosensible inciden en una segunda superficie, llamada dnodo, la cual se mantiene (+) respecto al emisor fotosensible

Fundamento de mediciones espectrofotomtricas.


Cuando una muestra absorbe fotones, la potencia del haz disminuye (P P 0) donde P0 es la energa que sale del monocromador. La ley que explica la relacin entre la absorcin y la concentracin de una sustancia es conocida comnmente como ley de Beer o Lambert-Beer. Si T es la transmitancia, es decir la radiacin que pasa al travs del cuerpo entonces T=P/P0 , por lo que T solo puede tener valores que van desde 0 a 1.
P0 T= P ; P0 %T = P x 100 P0 P

C b

T= 10

k*C

T= 10 k*b

Cuando no se absorbe luz

P= P0

A = 0.

Si se absorbe el 90% de la luz, 10% es lo que se transmite, es decir, P=1/P0 A = 1.

Al absorberse el 99% de la luz, se transite el 1% A = 2.

A= bc

Ley de Lambert-Beer

Clasificacin de las desviaciones de la ley de Lambert-Beer


Reales = verdadero
n (n2 +2)2

Instrumentales

Radiacin no monocromtica Radiacin errtica o parsita Errores de lectura

Qumicas

Dimerizaciones Influencia del equilibrio Rxs. AcidoBase Complejos


Influencia del disolvente Influencia de la temperatura Impurezas de los reactivos Interaccin entre especies absorbentes (Interferencias espectrales)

Personales

Variabilidad Metrolgica
La variabilidad metrolgica debida a variaciones sistemticas del procedimiento de medida se cuantifica mediante el error sistemtico Error sistemtico: Se estima calculando la diferencia entre la medida de un gran n de mediciones repetidas y el valor verdadero. En todo sistema de medidas se producen alteraciones que llevan a errores sistemticos que pueden ser de tipo constante, proporcional o mixto.

1. Error constante: ser aquel valor que se mantiene en la misma magnitud numrica en todas las mediciones.

2. Error proporcional: es aquel valor que har cambiar el valor verdadero incrementando o disminuyendo la magnitud de la medida.
3. Error mixto: afectan al valor verdadero tanto en forma constante como proporcional simultneamente.

1,6 1,4 R = 1

1,2 1 0,8
0,6 0,4 0,2 0 0 50 100 150 200 R = 1 absorbancia ideal

absorbancia medida

1,6 1,4 1,2 1 absorbancia ideal absorbancia medida R = 1

0,8
0,6

1,6

0,4 R = 1 R = 0,9996 absorbancia ideal absorbancia medida 0,2

1,4
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2

0
0 50 100 150 200

0
0 100 200

La calibracin de los espectrofotmetros comprende:

1. Calibracin de la escala fotomtrica 2. Calibracin de la escala de la longitud de onda


Calibracin de escala fotomtrica: se certifica la transmitancia y absorbancia entregadas por el equipo Se usan filtros con diferentes niveles de transmitancia (alcance de : 340 -900 nm)

Calibracin de longitud de onda


Mtodos para la calibracin de la longitud de onda en el visible y UV:
Mtodo n1 (ms adecuado) Uso de lmparas de con fuertes lneas de emisin de bien definidas. Las lmparas de mercurio producen fuertes lneas de emisin a 313, 365, 405, 436 y 546 nm. Lmpara de hidrgeno (o deuterio) con lneas de emisin entre 486 y 656 nm.

Mtodo n 2 Uso de filtros de compuestos de tierras raras (xido de holmio y didimio)

El espectro de absorcin del xido de holmio posee fuertes lneas de absorcin a 241, 279, 287, 333, 361, 418, 453, 536 y 636 nm. (rango 240-650)
El didimio tiene bandas de absorcin mucho ms anchas 573, 586, 685, 741 y 803. (rango 380-900nm)

Control de calidad de los espectrofotmetros


Es necesario realizar peridicamente pruebas para verificar el instrumento. Estas pruebas implicar evaluar : 1. Exactitud de longitud de onda 2. Linealidad de la respuesta del detector 3. Radiacin errtica(luz errtica o luz parsita) 4. Exactitud y precisin fotomtrica. 5. Estabilidad fotomtrica

Mtodo para evaluar y controlar la calibracin


Se debe evaluar la concordancia entre la longitud de onda que indica el seleccionador y la longitud de onda de referencia y sta se expresa en nm.

Mtodo del Punto Isosbstico.**

Cuando una sustancia presenta diferentes espectros en forma cida y bsica, stas pueden presentar un mismo punto donde se cruzan, este punto grfico es conocido como PI. Estos son fijos por lo que permiten verificar la exactitud de la longitud de onda.

**La limitacin de este procedimiento es que se debe hacer el barrido espectrofotomtrico para cada una de las formas de dicha sustancia.

Soluciones ms usadas

Solucin cida-alcalina de cromato de potasio.(405-500 nm) Solucin cida- alcalina de rojo congo (520-570 nm)

Grfico punto isosbstico Rojo Congo

Desventajas del uso de soluciones reactivas como estndar secundario: picks de absorcin generalmente anchos cambios espectrales por contaminacin y/o envejecimiento errores en la preparacin del reactivos

El mtodo consta de 3 pasos: 1. Preparacin de formas alcalinas y cidas del colorante 2. Realizacin del barrido espectrofotomtrico 3. Interpretacin de resultados: grfico del espectro para encontrar el PI. Si el punto isosbstico experimental difiere del terico , estamos frente a un corrimiento de la longitud de onda.
Clculo de corrimiento(nm): PI experimental PI terico

Limites de aceptabilidad: Intervalo ptimo : 2 nm Intervalo aceptable: 3 nm

Linealidad fotomtrica

Un espectrofotmetro que trabaje adecuadamente debe mostrar una relacin lineal entre la cantidad de energa radiante absorbida y la lectura del indicador. Soluciones ms usadas: La oxihemoglobina a 415 nm. p-nitrofenol a 405 nm. Sulfato de amonio y cobalto a 512 nm. Sulfato de cobre 650 nm Colorante verde vegetal a 257, 410 y 630 nm

Evaluacin Coeficiente de correlacin(r) y pendiente


Lmites de aceptabilidad: r Ideal: 1 r ptimo: 0,9995-1 r Aceptable: 0,995-0,9994 Pendiente ideal: 1 Pendiente ptima: 0.98 - 1,02 Pendiente aceptable: 0.97 1.03

*Grficas no lineales pueden indicar: Error en diluciones Error instrumental

Luz errtica: Luz que llega al detector sin pasar por la muestra

Se genera en los extremos de los intervalos espectrales. Produce desviacin negativa de la ley de L-B. Mtodos para evaluarla: Uso de filtros o soluciones que posean alta transmisin sobre una porcin del espectro, pero opacos por debajo de la lmite. Soluciones ms usadas: Li2CO3 < 250 nm NaBr 0,1 M < 240 nm Acetona < 320 nm

Limites de aceptabilidad L.E ptima: <0,5% L.E. aceptable: 0,5-1%


Acciones correctivas: Sellar rendijas que filtren luz Cambio fuente de luz Realinear componentes del sistema Verificar calibracin de las (s) de onda Limpiar superficies pticas

Exactitud fotomtrica

Definicin: Grado de concordancia entre el valor de absorbancia real y el obtenido.

As el error al leer una absorbancia respecto a una referencia se denomina inexactitud fotomtrica.
Mtodo: medicin de absorbancia de soluciones, las que se comparan con los valores de referencia. Soluciones ms usadas: 340 nm: dicromato de potasio en cido perclrico 0,001 N H2SO4 0,01 N. 405 nm: p-nitrofenol en NaOH 0,1 N; soluciones de sales de nquel Ni(H2O) 6+2 con Abs certificada 505 nm: soluciones de sales de cobalto Co(H2O)6+2 en H2SO4 0,47 N. con Abs certificada. 540 nm: solucin de cianmetahemoglobina con Abs certificada

Evaluacin de la exactitud fotomtrica


Se debe calcular la inexactitud fotomtrica del instrumento como la diferencia entre la absorbancia promedio encontrada y el valor de referencia.
% Inexactitud fotomtrica: (Abs encontrada-Abs referencia) Abs referencia

Limites de aceptabilidad: Exactitud fotomtrica ptima : Inexactitud 2% Exactitud fotomtrica aceptable: Inexactitud 3%

Ejemplo: 505 nm Temperatura: 30oC Medida 1= 0.315 Abs Medida 2= 0,313 Abs Abs referencia 505 nm, 30oC = 0,323

Precisin fotomtrica
Def: grado de repetibilidad de medidas, siendo una medida de dispersin de una serie de mediciones de %T o A alrededor del valor medio y se expresa como coeficiente de variacin porcentual.
Se puede usar cualquier solucin, lo importante es que esta permanezca estable el tiempo que duren las mediciones. Mnimo 10 mediciones

Impresin fotomtrica=CV % = DE x 100 X


Lmites de aceptabilidad Precisin ptima: CV%< 0,5% Precisin aceptable: CV% 0,5-1%

Estabilidad fotomtrica
Capacidad del instrumento de mantener constante la Abs en funcin del tiempo.
Si observamos variaciones constantes y continuas a valores altos o bajos de Abs tendremos deriva fotomtrica. Si observamos variaciones al azar de la Abs, tendremos ruido fotomtrico

Calculo de la deriva: este parmetro es la pendiente de la curva de


Abs v/s tiempo y se expresa como porcentaje. Deriva: (Abs final- Abs inicial) x 100 Abs inicial

Calculo de Ruido: refleja la dispersin de los valores de los valores

alrededor del valor medio de Abs multiplicado por 100 para expresarlo en %. Ruido: DE x 100 Abs promedio

Lmites de aceptabilidad: Estabilidad ptima: Ruido + deriva < 0,5 % Estabilidad aceptable: Ruido + deriva 0,5-1 %

Cuadro resumen de control fotomtrico


Tipo de control Espectrofotmetros . Control de exactitud Fotmetros autoanalizadores

si

si

si

Control de precisin
Control de linealidad Control de estabilidad

si
si si

si
si si
no

si
si si
no

Control de exactitud de longitud de onda


Control de luz errtica o parsita

si

si

si

si

Cronograma recomendado para control fotomtrico


Parmetro/ Frecuencia mensual trimestral semestral

Exactitud de
Precisin Exactitud X X

Luz parsita
Estabilidad fotomtrica

X
X

Referencias
1. Frings CS. & Broussard LA. (1979). Calibration and Monitoring of Spectrometers and Spectrophotometers. Clin Chem 25/6, 1013-1017 2. Korzun WJ. & Miller G. (1986). Monitoring the Stability of Wavelength Calibration of Spectrophotometers. Clin Chem. 32/1, 162-165. 3. Kaplan LA and Pesce AJ. (1996). Clinical Chemistry: theory, analyses and correlation. 3rd Edition 4. Duymovich C. Acheme R, Sesini S & Maziotta D. (2005) Espectrofotmetros y fotocolormetros. Gua prctica de actualizacin. Acta Bioquim Clin Latinoam; 39(4):529-39.

ANEXO Controles de equipos de un laboratorio clnico


Instrumental Espectrofotmetros Fotocolormetros Balanzas Centrfugas Lectores de placas Termmetros Baos termorregulados Cubetas termostatizadas Estufas Refrigeradores Congeladores

Termomtrico

Volumtrico

Material de vidrio Pipetas y micropipetas Dispensadores