Prctica N 7

Bioqumica II

16/10/2013

UROGENESIS ACTIVIDAD DE LA ARGINASA

Obtencin de la enzima arginasa
Pesar 5g de hgado, enjuagar con KCl 0,15 M y secar con papel filtro. Aadir 10 mL de KCl 0,15 M MnCl2 5 mM. Homogenizar en fro y centrifugar a 3000 rpm por 10 min. Conservar el sobrenadante a baja temperatura.

Activacin de la enzima arginasa

Agregar 10 mL de buffer glicina 0,2 M pH 9 e incubar a 37C por 30 min

Estudio de la actividad enzimtica

Tubo 1: agregar 1 mL de arginina 0,1 M en buffer pH 9 + 0,5 mL de buffer glicina 0,2 M pH 9 + 0,5 mL de sol. arginasa + 0,2 mL de MnCl2 0,05 M. Tubo 2: agregar 1 mL de arginina 0,1 M en buffer pH 9 + 0,5 mL de buffer glicina 0,2 M pH 9 + 0,5 mL de sol. arginasa + 0,2 mL de agua. Tubo 3: agregar 1 mL de arginina 0,1 M en buffer pH 9 + 0,5 mL de buffer glicina 0,2 M pH 9 + 0,2 mL de MnCl2 0,05 M + 0,5 mL de agua.

Mezclar completamente y llevar a bao mara a 37C por 30 min, luego agrgar 1 gota de ureasa a cada tubo.

Aadir 1 mL de ATC 5% a cada uno, homogenizar y centrifugar a 3000 rpm por 10 min y separar el sobrenadante.

Determinacin de amoniaco
Tubo 1: agregar 0,5 mL de sobrenadante + 0,25 mL de reactivo de salicilato + 0,25 mL de reactivo de hipoclorito. Tubo 2: agregar 0,5 mL de sobrenadante + 0,25 mL de reactivo de salicilato + 0,25 mL de reactivo de hipoclorito. Tubo 3: agregar 0,5 mL de sobrenadante + 0,25 mL de reactivo de salicilato + 0,25 mL de reactivo de hipoclorito. St: agregar 0,5 mL de estndar de nitrgeno + 0,25 mL de reactivo de salicilato + 0,25 mL de reactivo de hipoclorito. B: agregar 0,5 mL de agua destilada + 0,25 mL de reactivo de salicilato + 0,25 mL de reactivo de hipoclorito.

Mezclar y llevar a bao mara por 30 min, leer al espectofotmetro a 600 nm y calcular la [NH 4]

Por: Flores Choque Pool Harol