La replicacin del DNA es el proceso por el cual la informacin contenida en el DNA es perpetuada.

La replicacin del DNA es semiconservadora. Cada Cadena de DNA acta como molde para la sntesis de una nueva cadena. El resultado son dos molculas de DNA nuevas, cada una con una cadena nueva y otra vieja. Este proceso se denomina replicacin semiconservadora. La sntesis del DNA progresa invariablemente en direccin 5' 3 y por lo tanto es semidiscontinua. La replicacin empieza en un punto de origen y normalmente avanza de forma bidireccional formando una doble horquilla La replicacin es muy precisa. La replicacin tiene lugar con un grado extraordinario de fidelidad. En E. coli se comete un error cada 1010 nucletidos incorporados. El DNA es sintetizado por DNA polimerasas. Se conocen numerosos tipos de Polimerasas tanto en procariotes como en eucariotes, pero su mecanismo de accin es similar en todos los casos: todas ellas actan sintetizando una doble cadena complementaria a la doble cadena de DNA preexistente y todas ellas requieren un cebador inicial, cadena corta de RNA, para poder proceder a la sntesis de DNA.

En E. coli, se requieren ~42 minutos para replicar en su totalidad su nico cromosoma circular. Se ha calculado, tomando en cuenta la longitud del cromosoma de E. coli (4,639,221 pares de bases exactamente) que la velocidad de incorporacin de nucletidos a la cadena creciente del DNA es de ~1000 pares de bases por segundo y por horquilla. En clulas humanas se ha calculado que esta velocidad de incorporacin es solamente de ~100 pares de bases por segundo y por horquilla. El genoma humano contiene 3 109 pares de bases y debe replicarse en 8 horas, tiempo en el cual podran replicarse apenas 3 106 pares de bases. Este clculo sugiere que el genoma humano debe tener un mnimo de 1000 horquillas de crecimiento durante la replicacin. Sin embargo, clculos ms precisos, usando mtodos autoradiogrficos, han indicado que el genoma humano contiene entre 10,000 y 100,000 replicones, cada uno de los cuales se replica independientemente durante una parte de las 8 horas requeridas para la replicacin del genoma en su totalidad.

El Origen de la Replicacin
Los orgenes de replicacin son los puntos fijos, situados en la doble hlice de DNA, a partir de los cuales se lleva cabo la replicacin, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla. La cantidad de DNA que se puede sintetizar a partir de un nico origen de replicacin se denomina replicn o unidad funcional de replicacin. El genoma bacteriano es un replicn nico circular. En organismos eucariotas, la replicacin del ADN se inicia en mltiples orgenes a la vez (hay uno cada 20 kb aproximadamente), es decir, hay multitud de replicones.

Semiconservativa y bidireccional en E. coli Mltiples orgenes de replicacin en los cromosomas eucariotes

Un punto de origen (Ori C) y dos puntos de crecimiento (PC).

El cromosoma de E. coli es un Replicn (unidad de replicacin)

DNA Polimerasas
La replicacin del DNA se lleva a cabo mediante enzimas conocidas con el nombre de DNA polimerasas dirigidas por DNA o simplemente como DNA polimerasas. Estas enzimas utilizan el DNA de hebra sencilla como molde sobre el que catalizan la sntesis de la hebra complementaria, a partir de los desoxinuclesidos trifosfato adecuados. Los nuevos nucletidos se seleccionan por su capacidad para aparearse, segn la complementariedad demostrada por Watson y Crick, con las bases de la molcula molde, de modo que la hebra recin sintetizada forma una doble hlice con la hebra molde. Todas las DNA polimerasas pueden aadir el nucletido aportado por un desoxinuclesido trifosfato nicamente al grupo 3'-OH libre de un polinucletido preexistente, que tiene sus bases apareadas, de forma que la hebra de DNA se extienda slo en la direccin 5 3'

DNA Polimerasas
La polimerasa cataliza el ataque nucleoflico del 3-OH

terminal de la cadena nucleotdica sobre el -fosfato del desoxinucletido trifosfato que debe agregarse, liberando pirofosfato inrganico. Sin embargo, las DNA polimerasas slo pueden agregar nucletidos al extremo 3 de una cadena polinucleotdica pre-existente, no pueden iniciar por s mismas la agregacin de bases complementarias a una hebra de DNA molde. Para iniciar esta reaccin, las DNA polimerasas requieren un cebador (primer), pequea cadena de RNA, que tenga un grupo 3-OH libre y que haya sido previamente sintetizado por una enzima diferente, utilizando el principio de complementariedad de bases, sobre el molde de DNA de una sola hebra.

dedos

Estructura de la DNA Polimerasa. La estructura inicial conocida de la DNA polimerasa fue la de un fragmento de la DNA polimerasa I de E. coli llamado fragmento de Klenow. Como otras DNA polimerasas, la unidad de polimerasa semeja una mano derecha con dedos (naranja), palma (azul), y pulgar (verde). El fragmento de Klenow incluye tambin un dominio de exonucleasa.

Mecanismo de la DNA Polimerasa. Dos iones metlicos (Mg2+) participan en la reaccin de la DNA polimerasa. Uno de ellos coordina el grupo 3-OH del cebador, mientras los grupos fosfatos del nuclesido trifosfato forman un puente entre los dos iones metlicos. El grupo 3-OH del cebador ataca el grupo -fosfato del dNTP para formar un nuevo enlace fosfodister.

Todas las DNA Polimerasas tienen estructuras semejantes. Su estructura se ha dividido en varios dominios independientes que son descritos por analoga con la mano derecha humana. El DNA se fija en un hondo surco compuesto de tres dominios. El dominio palma contiene varios motivos, cuyas secuencias han sido estrictamente conservadas, donde radica el sitio activo cataltico. Los dedos participan en la colocacin del DNA molde de manera correcta en el sitio activo. El pulgar fija el DNA a su salida de la enzima y es importante en la determinacin de la procesividad de la enzima. Las DNA polimerasas caen dentro de cinco familias basadas en homologas de secuencia; la palma es el dominio mejor conservado entre todas ellas, pero el pulgar y los dedos contienen diferencias secuenciales que permiten esta clasificacin. Las regiones ms importantes de estos tres dominios convergen para formar una superficie continua donde reside el sitio cataltico. La actividad de exonucleasa reside en un dominio independiente con su propio sitio cataltico. El dominio amino-terminal de la Polimerasa se extiende dentro del dominio de exonucleasa.

El hecho esencial de la sntesis de DNA es la formacin de un nuevo enlace fosfodister entre la hebra en crecimiento 5 3 del DNA y un entrante dNTP (desoxiribonuclesido trifosfato) que ser utilizado como sustrato. El enlace es creado por el ataque nucleoflico del hidroxilo 3 terminal de la hebra en crecimiento sobre el -fosfato del dNTP que funge como sustrato. Cada dNTP entrante forma primero una interaccin apropiada con la base en el molde. Solo despes de este reconocimiento acta la polimerasa para formar el enlace fosfodister con la ltima base aadida. As, las DNA polimerasas son enzimas dirigidas por el molde.

REACCIN DE LA DNA POLIMERASA

Procesividad
Despus de aadir un nucletido a la cadena de DNA en crecimiento, la DNA polimerasa se disocia o bien se traslada a lo largo del molde y despus debe reasociarse nuevamente para aadir otro nucletido. El proceso es notablemente ms rpido si la polimerasa aade nucletidos sin disociarse del molde. El nmero medio de nucletidos aadidos antes de que la poIimerasa se disocie, define su procesividad. Las DNA polimerasas muestran una gran variacin en esta propiedad; algunas solo aaden unos pocos nucletidos antes de disociarse, mientras que otras aaden muchos millares. La necesidad de que la Polimerasa se disocie y luego deba reasociarse nuevamente al molde de DNA, limita la velocidad global de polimerizacin, lo cual no es compatible con los tiempos dedicados a la sntesis de DNA, tanto en procariotes como, sobre todo, en eucariotes, por lo cual se sabe que existen cofactores cuya labor es aumentar la procesividad de la enzima.

DNA Polimerasas Procesividad

La procesividad de las DNA polimerasas es muy baja. Esto significa que solo unos pocos nucletidos sern incorporados en la cadena creciente del DNA antes de que la Polimerasa se disocie de su sustrato. Una procesividad adecuada es conferida mediante la asociacin de una protena de forma anular, llamada abrazadera deslizante de la DNA Polimerasa (tambin llamada factor de procesividad), que rodea al DNA y acta como un factor de movimiento sobre la unidad cataltica de la DNA activando notablemente su procesividad. Esta abrazadera deslizante en eucariotes se conoce como Antgeno Nuclear de Proliferacin Celular (PCNA). La abrazadera deslizante no puede auto-ensamblarse alrededor del DNA y requiere para ello la ayuda de un complejo proteico, conocido como cargador (o ensamblador) de la abrazadera (llamado tambin Complejo Accesorio de la Polimerasa) que en los eucariotes se conoce como RFC.

Abrazadera del DNA

La abrazadera del DNA (DNA clamp), tambien llamada abrazadera deslizante, es una estructura proteica que funciona como un factor promotor de la procesividad de la DNA Polimerasa. La abrazadera se fija a la DNA polimerasa y evita que la enzima se disocie de la hebra molde de DNA que se replica, es decir aumenta su procesividad. Se encuentra tanto en procariotes, como en eucariotes. Como la procesividad es el paso limitante en la velocidad de replicacin del DNA, la abrazadera deslizante, aumentando el nmero de nucletidos que la enzima puede agregar por cada asociacin, incrementa la velocidad de sntesis del DNA hasta 1000 veces, cuando se compara con la enzima sin abrazadera. Las abrazaderas son colocadas sobre el DNA molde por protenas especializadas, dependientes de ATP, llamadas cargadoras de la abrazadera, estas mismas protenas disocian la abrazadera cuando la replicacin se completa. Los sitios de fijacin para las proteinas fijadoras se sobreponen con los sitios de fijacin para la DNA polimerasa, de esta manera la abrazadera no ser disociada mientras la Polimerasa permanezca unida.

Las dos subunidades de la polimerasa III de E. coli forman una abrazadera circular que rodea el DNA. La abrazadera se desliza a lo largo del DNA, aumentando la procesividad de la holoenzima de la polimerasa III mas de 1 000 veces al impedir su disociacin del DNA. La vista longitudinal muestra las dos subunidades rodeando un modelo espacial del DNA. En la vista lateral, modelos del perfil de superficie toroidal de las subunidades rodean un modelo de la molcula de DNA.

Clamp en procariotes, PCNA en eucariotes: Protena accesoria que acta como una abrazadera regulada. Mantiene la DNA Pol firmemente unida al DNA cuando se desplaza, pero la libera cuando la Pol se detiene, o retarda, ante una regin de DNA de doble cadena

Abrazadera fija al DNA

El ensamble de la abrazadera requiere hidrlisis de ATP

Estructura simtrica, subunidades, de la abrazadera

REPLICACIN DISCONTINUA

En el momento de la replicacin de DNA, la doble hlice debe abrirse, actividad que es realizada por la enzima Helicasa, que rompe los puentes de hidrgeno que unen las hebras de DNA formndose as la horquilla de replicacin, A medida que la helicasa va separando la doble cadena, se deben ir replicando las nuevas cadenas, para esto se debe empezar con un fragmento de RNA, llamado RNA cebador. Para iniciar la nueva cadena de DNA, en la direccin continua, los nuevos desoxirribonucletidos se aaden en direccin 5' 3 sin ningn problema, pero la otra cadena, cadena discontinua o retrasada, se encuentra en sentido contrario, por la condicin de antiparalelismo que el DNA posee, por lo que el mecanismo debe ser diferente.

Hebra continua (Conductora) y discontinua (Retrasada)

Continua: Sintetizada sin

interrupciones por la DNA Polimerasa en la direccin de la horquilla de replicacin. Requiere un solo cebador. forma discontinua en direccin opuesta a la horquilla de replicacin. Requiere un cebador para cada fragmento Al abrirse la burbuja de replicacin se sintetizan, en la hebra retrasada, fragmentos cortos de DNA (1000-2000 nucletidos en procariotes, 100 a 200 en eucariotes) llamados Fragmentos de Okazaki

Discontinua: Sintetizada en

La Replicacin es bidireccional

Okazaki descubri que una de las cadenas nuevas de DNA se sintetiza en forma de trozos cortos, denominados fragmentos de Okazaki. De modo que una de las cadenas es sintetizada de modo continuo y la otra de modo discontinuo. La cadena continua o cadena conductora, es aquella cuya sntesis en direccin 5 3' transcurre en la misma direccin que el movimiento de la horquilla de replicacin. La cadena discontinua, o cadena rezagada, es aquella cuya sntesis en direccin 5' 3' transcurre en direccin contraria a la direccin del movimiento de la horquilla. Los fragmentos de Okazaki tienen una longitud desde algunos pocos centenares hasta unos pocos millares de nucletidos, segn el tipo celular. Sin embargo, debe tomarse en cuenta que la sntesis de la hebra conductora y de la hebra rezagada estn estrechamente coordinadas.

Fragmentos de Okazaki

Okazaki descubri que una de las cadenas nuevas de DNA se sintetiza en forma de trozos cortos, denominados fragmentos de Okazaki. De modo que una de las cadenas es sintetizada de modo continuo y la otra de modo discontinuo. La cadena continua o cadena conductora, es aquella cuya sntesis en direccin 5 3' transcurre en la misma direccin que el movimiento de la horquilla de replicacin. La cadena discontinua, o cadena rezagada, es aquella cuya sntesis en direccin 5' 3' transcurre en direccin contraria a la direccin del movimiento de la horquilla. Los fragmentos de Okazaki tienen una longitud desde algunos pocos centenares hasta unos pocos millares de nucletidos, segn el tipo celular. Sin embargo, la sntesis de la hebra conductora y de la hebra rezagada estn estrechamente coordinadas.

Primasa Sintetiza el RNA-cebador que es necesario para iniciar la polimerizacin Helicasa Desenrrolla el DNA y lo funde Ligasa Une dos cadenas de DNA adyacentes Protenas de unin a hebras sencillas (SSBP) mantienen abierto el DNA despus de la actividad de la Helicasa, y lo protegen Girasa Es una Topoisomerasa que alivia el estrs torcional creado por la actividad de la helicasa sobre la molcula de DNA Telomerasa Termina los extremos de la hebra de DNA

La Helicasa es una enzima vital en los seres vivos ya que participa en los procesos de replicacin, transcripcin, recombinacin y reparacin del DNA, y de biognesis de ribosomas. Su misin es romper los puentes de hidrgeno que unen las bases nitrogenadas, haciendo as posible que otras enzimas puedan copiar la secuencia de la hebra molde.

Son protenas que se van desplazando longitudinalmente a lo largo de los enlaces fosfodister del cido nucleico, separando las dos cadenas antiparalelas del cido nucleico (ya sea ADN bicatenario, ARN bicatenario o un hbrido ADN-ARN) usando para ello la energa que se desprende en la hidrlisis de ATP o GTP. Se mueven a lo largo de la doble cadena con una direccionabilidad y una procesividad especficas de cada enzima particular. Hay muchas helicasas (14 confirmadas en E. coli y 24 en clulas humanas) como consecuencia de la gran variedad de procesos en los que debe ser catalizada la separacin de cadenas de cido nucleico.

Helicasa

Helicasa RuvA de Escherichia coli

Las helicasas adoptan diferentes estructuras y estados de oligomerizacin. Mientras que la helicasa tipo ADN-B acta sobre el DNA como hexmeros en forma de rosca, otras enzimas han demostrado ser activas como monmeros o como dmeros. Estudios recientes han demostrado que las helicasas no slo esperan de forma pasiva a la horquilla para abrirla, sino que desempean un papel activo obligando a la horquilla a abrirse, por lo que es un motor activo en el desenrollamiento del DNA. Las helicasas pueden actuar de una forma mucho ms rpida in vivo que in vitro debido a la presencia de una serie de protenas accesorias que ayudan en la desestabilizacin de la unin en la horquilla

Para que se pueda iniciar la sntesis de DNA se necesita un extremo 3-OH libre al que la DNA Polimerasa pueda ir aadiendo nucletidos. Ese extremo 3-OH lo suministra un RNA de pequeo tamao, alrededor de 10 a 20 ribonucletidos, que se denomina RNA cebador o Primer". Dicho cebador lo sintetiza un enzima denominado Primasa. La Primasa es una RNA polimerasa que utiliza como molde DNA. En procariotas, esta enzima se une directamente a la DNA Helicasa, formando un complejo llamada Primosoma, que se va desplazando con la cadena en formacin. En Procariotas, la misma Holoenzima de DNA polimerasa III lleva a cabo la sntesis del fragmento correspondiente de DNA en la cadena retrasada hasta llegar al siguiente cebador.

DNA Sntesis. Hebra Retardada

Todos los fragmentos de Okazaki comienzan por un RNA Cebador. A partir de este cebador, la Holoenzima de DNA polimerasa III lleva a cabo la sntesis del fragmento de DNA correspondiente hasta llegar al siguiente cebador. En ese momento, la DNA polimerasa I sustituye a la Holoenzima de DNA polimerasa III. La DNA polimerasa I se encarga de retirar el RNA cebador mediante su actividad de exonucleasa 5-P 3-OH y al mismo tiempo rellena el hueco sintetizando DNA. La ruptura en los enlaces fosfodister entre los dRNP de la cadena retrasada del nuevo DNA es reparada por la DNA Ligasa

Para este proceso intervienen una serie de enzimas:

La RNasa H ("H" de hbrido RNA-DNA) elimina la cadena de RNA que

La eliminacin de cebadores se da en la hebra conductora, de sntesis continua, pero debido a que en sta hay un solo cebador es un proceso que slo tiene lugar una vez. Por el contrario, en la hebra rezagada se dar tantas veces como fragmentos de Okazaki haya.

forma el cebador, a excepcin del ribonucletido directamente unido a la cadena de DNA La DNA Pol I elimina este ribonucletido gracias a su actividad de exonucleasa 5' 3' y rellena el hueco con DNA quedando una molcula completa a excepcin de una rotura o "mella (nick) entre el extremo 3'OH libre y el fosfato 5' de la cadena reparada Por ltimo, la DNA Ligasa sella esa rotura catalizando la reaccin de condensacin entre el grupo fosfato y el OH de la desoxirribosa del nucletido contiguo, completando el enlace fosfodister; para ello, es preciso utilizar la energa de una molcula de ATP

La sorprendente complejidad de la replicacin del DNA proviene de la necesidad de una fidelidad extrema en los mecanismos involucrados, que es indispensable con el fin de mantener la integridad del genoma generacin tras generacin.

El nivel de fidelidad de las copias de DNA es muy alto, debido a:

1. La especificidad enzimtica de la maquinaria replicativa 2. La correccin de errores de las DNA polimerasas mediante prueba de lectura
Detectan nucletidos incorrectos y los eliminan hacia atrs (actividad exonucleasa 3 - 5) a) Reparacin directa. La regin daada se corrige in situ b) Reparacin por escisin de bases
La DNA fotoliasa utiliza energa de la luz para eliminar los dmeros de pirimidina formados por radiacin UV Las bases daadas se retiran y se reemplazan

3. Los mecanismos de reparacin post-replicativos

c) Reparacin por escisin de nucletidos

Se elimina y se reemplaza un fragmento en torno a la zona daada

La escinucleasa urvABC escinde 12 nucletidos en la zona daada Regeneracin a cargo de la DNA Pol I y la DNA ligasa

Correccin de Pruebas 1

La sorprendente complejidad de la replicacin del DNA proviene de la necesidad de una fidelidad extrema en los mecanismos involucrados, que es indispensable con el fin de mantener la integridad del genoma generacin tras generacin. La fidelidad con que se copia el DNA durante la replicacin es tan grande que solo se comete un error por cada 109 a 1010 nucletidos copiados. La alta fidelidad de replicacim del DNA no depende slamente de la coplementariedad de las bases sino que existen varios mecanismos que, actuando secuencialmente, pueden corregir cualquier error de apareamiento que haya ocurrido (prueba de lectura o proofreading).

Correccin de Pruebas 2

La primera prueba de lectura es realizada por la misma Polimerasa y ocurre justamente antes de que se agregue un nuevo nucletido a la cadena en crecimiento. Selectividad de estructura. El nuevo desoxinucletido trifosfato (dNTP) debe primero aparearse con el nucletido molde, lo cual induce un cambio conformacional de la enzima que genera una estrecha bolsa donde cabr estrechamente el nuevo par de bases constitudo por la nueva base y su base correspondiente en el molde de DNA. Tal modificacin conformacional slo es posible cuando el dNTP entrante puede formar un par de bases tipo Watson-Crick con su correspondiente base en el molde de DNA. Un nucletido incorrectamente apareado es rechazado antes de ser covalentemente unido. Solo despus que ha ocurrido este proceso la actividad de la polimerasa cataliza la formacin del nuevo enlace fosfodister. Este mecanismo asegura la exactitud de la replicacin.

Correccin de Pruebas 3

Las molculas de DNA con un par de bases equivocado en el extremo 3 de la cadena en crecimiento no funcionan efectivamente como sustratos porque la Polimerasa no puede acomodarlos debidamente en su sitio activo. En estos casos, la cadena creciente de polinucletidos abandona el sitio activo de Polimerasa y migra al sitio con actividad de Exonucleasa (en algunos casos se utilizar una enzima distinta). En dicho sitio, el ltimo nuletido agregado es suprimido por la actividad hidroltica de la 3-5 Exonucleasa. Debido a que las bases mal apareadas inducen este translado del sitio de polimerasa al sitio de exonucleasa, este proceso funciona como una manera, muy adecuada, de proveer una prueba de la exactitud de la secuencia de bases del DNA que esta siendo sintetizado.