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Caracterización FisicoQuímica de los Extractos de la Semilla del Arbol del Neem

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CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE LOS EXTRACTOS DE LA SEMILLA DEL ÁRBOL DE NEEM (Azadirachta Indica) EN EL DEPARTAMENTO DEL CESAR

RHONAL JOSÉ OÑATE LÓPEZ LUIS ALBERTO QUINTERO LÓPEZ

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR FACULTAD DE INGENIERÍAS Y TECNOLÓGICAS PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL VALLEDUPAR / CESAR 2008

1

CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE LOS EXTRACTOS DE LA SEMILLA DEL ÁRBOL DE NEEM (Azadirachta Indica) EN EL DEPARTAMENTO DEL CESAR

RHONAL JOSÉ OÑATE LÓPEZ LUIS ALBERTO QUINTERO LÓPEZ

Trabajo de grado presentado como requisito para optar el titulo de Ingeniero Agroindustrial

TILCIA STELLA DURAN IBARRA Directora

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR FACULTAD DE INGENIERÍAS Y TECNOLÓGICAS PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL VALLEDUPAR / CESAR 2008

2

A Dios por su inmensa misericordia y amor, A mi Papá y Mamá por su paciencia y por haberme brindarme su apoyo incondicional, A mis hermanos por su ayuda y fortaleza, A todos mis Familiares, Amigos y demás personas que siempre estuvieron dispuestas a colaborarme en esta labor y en especial a la directora del proyecto.

RHONAL JOSÉ OÑATE LÓPEZ

A Dios por su eterno amor, compañía y ayuda. A mi Padre y Madre por brindarme todo su amor e inmensa dedicación contribuyendo día a día, sin egoísmo a que mis sueños se transformen en logros. A mis hermanos Omar Enrique y Omar Alberto por su compañía y apoyo incondicional. A mis Familiares, Amigos y demás personas que desinteresadamente han contribuido en mi formación personal y profesional. LUIS ALBERTO QUINTERO LÓPEZ

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TABLA DE CONTENIDO

Pág.

LISTA DE CUADROS LISTA DE FIGURAS LISTA DE ANEXOS RESUMEN ABSTRACT INTRODUCCIÓN 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 1.1. Descripción Del Problema 1.2. Formulación Del Problema 2. JUSTIFICACIÓN 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo General 4.2. Objetivos Específicos 4. MARCO TEÓRICO 4.1. Antecedentes Históricos 4.2. Marco Legal 4.3. Marco Conceptual 4.3.1. Árbol Del Neem 4.3.1.1. Principales Características Del Árbol Del Neem 4.3.1.1.1. Descripción Botánica 4.3.1.1.2. Descripción Taxonómica 4.3.1.1.3. Organografía 4.3.1.1.4. Ecología 4.3.1.1.5. Condiciones Para La Propagación Y Desarrollo 4.3.1.2. Componentes Químicos 4.3.1.2.1. Terpenoides

7 9 10 11 12 13 15 15 16 17 19 19 19 20 20 23 25 25 26 26 26 27 27 28 29 31

4

4.3.1.2.1.1. Clasificación 4.3.1.2.1.2. Terpenoides Con Poder Biocida Presentes En El Árbol Del Neem 4.3.1.2.1.2.1. Azadiractina 4.3.1.2.1.2.2. Meliantrol 4.3.1.2.1.2.3. Salannina 4.3.1.2.1.2.4. Nimbina Y Nimbidina 4.3.1.3. Procedimientos Para La Elaboración Del Insecticida Natural 4.3.1.3.1. Tecnología De Producción Artesanal 4.3.1.3.1.1. Empleo De La Semilla Entera 4.3.1.3.1.2. Empleo De La Hoja 4.3.1.3.2. Tecnología De Producción Industrial 4.3.1.3.2.1. Empleo Del Aceite 4.3.1.3.2.1.1. Métodos De Extracción Del Aceite 4.3.1.3.2.1.1.1. Extracción Mecánica 4.3.1.3.2.1.1.2. Extracción Con Solvente 4.3.1.3.2.2. Empleo De La Torta 4.3.1.4. Mecanismo De Acción Del Insecticida 4.3.1.5. Insectos Que Controla 5. METODOLOGÍA 5.1. Introducción Metodología 5.1.1. Enfoque De Investigación 5.1.2. Población 5.1.3. Selección De Variables 5.1.4. Diseño Experimental 5.1.5. Técnicas Utilizadas 5.2. Procedimiento Experimental 5.2.1. Selección De La Muestra 5.2.2. Acondicionamiento Del Fruto 5.2.3. Determinación de Características Fisicoquímicas de la Semilla Molida 5.2.4. Extracción De Aceite

32 35 36 39 40 41 41 41 42 43 43 44 44 44 46 48 49 51 53 53 53 53 53 56 58 60 60 61 61 62

5

5.2.5. Determinación de Características Fisicoquímicas del Aceite 5.2.6. Determinación de Características Fisicoquímicas de la Torta 5.2.7. Extracción del Extracto Presente en la Torta 5.2.8. Análisis Fisicoquímico de El Extracto de la Torta 6. Resultados Y Análisis 6.1. Caracterización Proximal De La Semilla Molida Del Árbol Del Neem 6.2. Extracción Y Características Fisicoquímicas Del Aceite de la Semilla Molida Del Árbol Del Neem 6.3. Características Fisicoquímicas De La Semilla Desengrasada O Torta Del Árbol Del Neem 6.4. Extracción Del Extracto Presente En La Torta 6.4.1. Análisis De Varianza Para El Diseño Unifactorial 6.4.2. Método De Análisis De Media 6.5. Análisis Fisicoquímico Del Extracto Presente En La Torta 6.6. Características Fisicoquímicas Del Sólido Agotado 7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS

64 64 65 66 67 67

69

71 72 74 78 81 84 86 90 94

6

LISTA DE CUADROS

Pág.

Cuadro Nº 1. Tolerancia Del Neem A Factores Climáticos Y Suelo Cuadro Nº 2. Cantidad De Azadiractina Obtenido Usando Distintos Solventes Cuadro Nº 3. Factores Que Se Mantienen Constantes Durante El Proceso Cuadro Nº 4. Factores Y Niveles Definitivos Utilizados En El Diseño Cuadro Nº 5. Técnicas Utilizadas Cuadro Nº 6. Características Dimensionales De La Semilla De Neem Cuadro Nº 7. Caracterización Fisicoquímica De La Semilla Molida Del Árbol Del Neem Cuadro Nº 8. Características Fisicoquímicas Del Aceite De La Semilla Del Árbol Del Neem Cuadro Nº 9. Características Fisicoquímicas De La Semilla

29

49

56 57 58 67

68

70

Desengrasada O Torta Del Árbol El Neem Cuadro Nº 10. Tratamientos A La Semilla Molida Desengrasada Del Árbol Del Neem Cuadro Nº 11. Datos Finales Del Experimento Del Porcentaje De Extracto Presente En La Semilla Desengrasada Del Árbol Del Neem Cuadro Nº 12. Análisis De Varianza Para El Porcentaje De Extracto Presente En La Torta Cuadro Nº 13. Método De La Mínima Diferencia Significativa (LSD) Cuadro Nº 14. Medias Con El 95% De Confianza Entre Intervalos LSD Cuadro Nº 15. Cantidad Relativa (%) De Los Componentes Presentes En El Extracto Etanólico De La Semilla Del Árbol Del Neem

71

72

74

75 76

79

81

7

Cuadro Nº 16. Análisis Fisicoquímicas Del Extracto Presente En La Torta Cuadro Nº 17. Características Fisicoquímicas Del Sólido Agotado 84 85

8

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura Nº 1. Árbol Del Neem (Azadirachta Indica) Figura Nº 2. Estructura Molecular Del Isopreno, La Unidad Química De Los Terpenoides Figura Nº 3. Estructura Molecular De La Azadiractina Figura Nº 4. Estructura Molecular Del Meliantrol Figura Nº 5. Estructura Molecular De La Salannina Figura Nº 6. Estructura Molecular De Nimbina (A) Y Nimbidina (B) Figura Nº 7. Elaboración Artesanal De Insecticida Natural Neem

25

31 36 39 40 41 42

Figura Nº 8. Modelo General Del Proceso De Extracción Del Extracto 54 Figura Nº 9. Mapa Del Departamento Del Cesar Con Los Sitios De Recolección De La Muestra Figura Nº 10. Montaje De Extracción De Grasa En Equipo Soxhlet Figura Nº 11. Aceite Extraído De La Semilla Molida Del Árbol Del Neem Figura Nº 12. Extracción De Los Compuestos Presentes En La Torta Figura Nº 13. Graficas De Las Medias Al 95% Con LDS Figura Nº 14. Análisis de las medias. Figura Nº 15. Cromatograma Para Extracto De Semilla Del Árbol Del Neem Empleando El Método 2. 83 64 65 78 80 60 63

9

LISTA DE ANEXOS

Pág.

ANEXO A. Fotografías De Todo El Proceso De Caracterización De Los Extractos De La Semilla Del Árbol Del Neem En El Departamento Del Cesar ANEXO B. Determinación De La Composición Química De Un Extracto Etanólico, Por Cromatografía De Gases Con Detector Selectivo De Masas (GC-MC) ANEXO C. Determinación Azadiractina Del Extracto Etanólico, Por Cromatografía Líquida De Alta Resolución HPCL ANEXO D. Nombre Químico (IUPAC), Estructura, Uso Y Toxicidad Para El Organismo Y El Medio Ambiente 110 106 100 95

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RESUMEN

El árbol del Neem es conocido con el nombre botánico de Azadirachta Indica, es un árbol nativo de la india y se encuentra diseminado en varios municipios del departamento del Cesar. Dada la necesidad que existe de utilizar la naturaleza como un equilibrador de la contaminación ambiental y además disminuir la utilización de insecticidas químicos, se hace imperativo, a través de la investigación generar bioinsecticidas que ayuden al sector agrícola en el manejo integrado de plagas, como una opción sana. El objetivo de este trabajo fue caracterizar fisicoquímicamente los extractos presentes en la semilla del árbol del Neem; los cuales contienen una serie de componentes bases de insecticidas biodegradables. Se determinaron varios parámetros fisicoquímicos de cada uno de los extractos obtenidos en esta semilla. Se tomo como base de análisis la semilla molida sin tratar, el aceite obtenido por solvente y la torta desengrasada para obtener un extracto de base etanólica que presenta condiciones aptas como insecticida natural. Tanto al aceite como al extracto etanólico, se le realizaron pruebas fisicoquímicas volumétricas, gravimétricas y cromatrográficas, donde se comprobó que tienen los mismos componentes activos de otras partes del mundo. Los componentes activos (terpenoides) que contiene esta semilla son la base de producción de insecticidas naturales utilizados por diferentes partes de Latinoamérica. Estos análisis fisicoquímicos fueron comparados con análisis de otros países para mirar la relación que tiene el usar estos extractos de modo que se puedan realizar insecticidas que no afecten el medio ambiente y sean muy eficaces para combatir insectos.

Palabras

claves:

Azadirachta

Indica,

extracción

química,

terpenoides,

bioinsecticidas, Neem.

11

ABSTRACT

The tree of the Neem is known by Azadirachta Indica's botanical name, is a native tree of the indies and is spread in several municipalities of the department of the Cesar. Given the need that exists to use the nature as an equilibrador of the environmental pollution and in addition chemists diminish the utilization of insecticides, becomes imperative, across the investigation (research) to generate bioinsecticidas that help to the agricultural sector in the integrated managing of plagues, as a healthy option. The aim of this work was to characterize PhysicistChemically the present extracts in the seed of the tree of the Neem; which contain a series of components bases of biodegradable insecticides. Several

physicochemical parameters decided of each one of the extracts obtained in this seed. I take the seed as a base of analysis ground without treating, the oil obtained by solvent and the cake desengrasada to obtain a base extract ethanol that presents suitable conditions as natural insecticide. Both to the oil and to the extract ethanol, him(her) there were realized physicochemical volumetric tests(proofs), gravimétricas and cromatrográficas, where there was verified that they have the same active components of other parts of the world. The active components (terpenoides) that this seed contains are the base of production of natural insecticides used on different parts (reports) of Latin America. These

physicochemical analyses were compared with analysis of other countries to look at the relation that has use these extracts so that there could be realized insecticides that do not affect the environment and are very effective to attack insects.

Key words: Azadirachta Indica, chemical extraction, terpenoides, bioinsecticidas. Neem.

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INTRODUCCIÓN

El árbol del Neem es conocido con el nombre botánico de Azadirachta Indica, es un árbol nativo de la India. Entre los muchos usos y beneficios que se pueden obtener del árbol del Neem, uno de los más importantes es su utilización en el control de plagas de los cultivos. Las propiedades insecticidas del árbol del Neem se han estudiado desde los años 20, pero estos trabajos fueron poco apreciados en su momento. Aunque son muchas las plantas que pueden ser usadas para el control de insectos, las investigaciones impulsadas por el departamento de agricultura de Estados Unidos mostraron que el Neem es el que posee mayor potencialidad como insecticida1.

Durante años el control de insectos se ha basado en el uso de productos químicos de acción sistémica. Pero el uso de plaguicidas químicos sintéticos está produciendo efectos adversos sobre los organismos benéficos y el desarrollo de resistencias, por lo que es usual incrementar las dosis de aplicación, con riesgo para la salud pública y al ambiente (Cisneros et al. 1995; Pascual 1996; Picanço et al, 1999).

Además, la seguridad alimentaría y los daños ambientales causados por estos insecticidas sintéticos, son preocupaciones que los países tienen y que por ello se han planteado una serie de exigencias que se han protocolizado como Buenas Prácticas Agrícolas. Estas exigencias han potenciado el desarrollo de nuevos métodos de control que favorezcan la reducción de residuos que puedan provocar trastornos en el hombre y el medio ambiente2.

1

NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Neem: A Tree For Solving Global Problems. National Academy Press. Washington DC. USA. 1992. 2 BRIMNER, T. AND G. BOLAND. A review of the non-target effects of fungi used to biologically control plant diseases. Agriculture, ecosystems and Environment. 2003.

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Gran parte de la literatura relacionada con la extracción de los extractos de Neem consiste de patentes que se enfocan mayormente en la descripción de diversos procedimientos de extracción y en la comparación de la efectividad de diferentes solventes3. Sin embargo, en el departamento del Cesar no hay una información concreta de las semillas del árbol Neem ni de los extractos que estas contenían. Ante estas circunstancias se ha respondido con procesos de investigación orientados a la búsqueda de nuevas fuentes potenciales de desarrollo para la producción de nuevos métodos con el fin de obtener y producir insecticidas naturales más competitivos.

Por estas razones, se buscaron alternativas viables y seguras con respecto a los insecticidas convencionales, para así contribuir a aumentar el interés por la producción y empleo de extractos naturales, en especial los obtenidos del árbol del Neem.

Como aporte a estas alternativas limpias de producción, esta investigación pretende contribuir a esclarecer las propiedades y características fisicoquímicas de los extractos que se extraen de la semilla del árbol del Neem en el departamento del Cesar.

3

NAGASAMPAGI et al., 1999; LARSON, 1985; SANKARAM et al., 1999; MOORTY y KUMAR, 1998; ROLAND y BLOUIN, 1996.

14

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.1. Descripción Del Problema

La azadirachtina es un tetraterpenoide característico de la familia Meliaceae pero especialmente del árbol del Neem (Azadirachta índica), originario de la india. Este compuesto se encuentra en la corteza, hojas y frutos de este árbol pero la mayor concentración se ubica en la semilla4. Este compuesto y otros más (salannina, meliantriol, etc.) presentes en el árbol del Neem, muestran una acción insecticidaimpiden el crecimiento de los insectos-, afectando a un número de especies que incluyen algunas de las plagas más mortíferas para la agricultura y la salud humana, y además tienen un efecto fertilizante foliar.

Este árbol se usa desde tiempos prehistóricos y era utilizado sobre todo en la parte medicinal. Se dice que es un “árbol noble” porque puede servir de: abono, medicina, insecticida, crece con facilidad, necesita poca atención, purifica el aire, proporciona madera y también da sombra, una de las características notables es, que está virtualmente libre de insectos y nematodos5.

En el departamento del Cesar el árbol del Neem ha sido introducido por medio de personas particulares que lo han sembrado de forma ornamental sin saber la cantidad de propiedades que éste posee y los grandes usos que se le pueden dar potencialmente en la industrialización de productos.

En este sentido, es importante explotar la oportunidad que se tiene de aprovechar el árbol del Neem, en especial su semilla, para generar nuevos productos de uso agrícola, pecuario y humano, lo cual aporta al mejoramiento de la calidad de vida,
4

SILVA, G., A. LAGUNES, J. C. RODRÍGUEZ Y D. RODRÍGUEZ. Insecticidas vegetales; Una vieja-nueva alternativa en el control de plagas. Revista Manejo Integrado de Plagas (CATIE). 2002. 5 FITZPATRICK, T. The Giving Tree. Washington University. 1992.

15

al incremento del empleo, al retorno al campo y al desarrollo en general de la región.

Estas razones son mas que suficientes para especular sobre la importancia del tema, especialmente la posibilidad de contar con el árbol del Neem en el departamento el Cesar y mirando que las características ambientales y de suelos son parecidas a las de otros países, se toma la decisión de analizar si los extractos de la semilla del árbol del Neem sembrado en el departamento del Cesar contienen los compuestos de acción insecticida.

1.2. Formulación Del Problema

Tendido en cuenta lo anterior, este proyecto plantea la siguiente pregunta de investigación:

¿Tienen los extractos de la semilla del árbol del Neem sembradas en el Departamento del Cesar la composición fisicoquímica necesaria para el desarrollo de potenciales productos agroindustriales?

16

1. JUSTIFICACIÓN

Una tercera parte de la producción de alimentos a nivel mundial se ve destruida por pestes de los cultivos y de los productos almacenados, lo cual ha hecho imprescindible el uso de nuevas vías para el control de plagas 6. Los productos más usados son pesticidas de origen sintético que tienen un gran impacto en el medio ambiente y que pueden causar trastornos en el hombre, ya que sus diferentes compuestos tóxicos quedan impregnados en las plantas, el suelo y son difíciles de degradar.

La industria, buscando satisfacer estas nuevas necesidades ha cambiado su enfoque de producción, intensificando la investigación y desarrollo de nuevas formulaciones y la reinvención de las existentes, cuyo común denominador esta íntimamente asociada con la sustitución de ingredientes, buscando con ello entregarle al consumidor un producto más natural, libre de posibles efectos adversos. En el caso de los insecticidas estas circunstancias les ha devuelto un mercado potencial a los de origen natural, convirtiéndose estos en una alternativa a los insecticidas sintéticos, ya que además de combatir las plagas indeseables, reducen el riesgo de la resistencia en los insectos, tiene menos consecuencias letales para los enemigos naturales, reducen la aparición de plagas secundarias, no ocasionan daños en el medio ambiente y no son nocivos para el hombre.

Una planta que se presenta como promisoria para la producción del insecticidas es el árbol del Neem (Azadirachta indica), el cual según el Consejo de Investigación Nacional de los Estados Unidos (NRC) en un informe titulado “El Neem aporta soluciones a problemas globales”, considera este árbol como “la más

6

AHMED, S., C. MITCHELL, AND R. SAXENA. Renewable resource utilization for agriculture and rural development and environmental protection: Use of indigenous plant material for pest control by limited resource farmers. Planning Wkshp, Botanical pest control proyect. Int. Rice Res. Inst. Los Baños, Philippines. 1984.

17

prometedora de todas las especies vegetales por el hecho de que puede beneficiar eventualmente a todos los habitantes de éste planeta”7.

Trabajos relacionados con el árbol del Neem son conocidos en todo el mundo. Luego de ciertas observaciones en África en 1959 sobre el Neem, y de otras investigaciones publicadas en la India, a partir de la década de los 90´s, varios cientos de investigadores comenzaron a estudiar este árbol8.

En Colombia, los estudios realizados con el árbol de Neem son muy recientes; En el departamento del Cesar la siembra del árbol de Neem se ha venido adelantando por su uso ornamental en perímetros urbanos, y como control biológico de moscas y garrapatas en las zonas rurales.

En este estudio se efectuó la caracterización de los extractos presentes en las semillas del árbol del Neem apuntando esta investigación al desarrollo de nuevos campos de acción productiva, a través de la generación de valor agregado y el aprovechamiento de un recurso que hasta ahora ha sido subutilizado y que podría ser un producto primario en una industrial aun incipiente pero prometedora, lo que en últimas es el énfasis primordial de la agroindustria.

7 8

CABAL, Esteban. Revista Natural: Neem, el árbol del siglo XXI. Madrid - España 2000. PEREZ, R. Asesora grupo estatal alimentos, MINAZ, 01/2002. Carta agropecuaria azucarera. Tema: El árbol del Neem. http: //www.virtualcentre.org/es/enl/keynote5/htm, en GRUPO DE INVESTIGACIÓN YAGUA. Validación Integral del Sistema Agroforestal con árbol del Neem en la Vereda Guabinal Cerro, Girardot- Cundinamarca. Universidad Piloto de Colombia y Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá, D. C., 2005.

18

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo General

Caracterizar fisicoquímicamente los extractos de la semilla del árbol de Neem en el departamento del Cesar.

3.2. Objetivos Específicos  Determinar las características fisicoquímicas de la semilla molida del árbol del Neem.  Establecer las propiedades fisicoquímicas presentes en el aceite y la torta o semilla desengrasada del árbol del Neem.  Extraer los compuestos presentes en la torta de la semilla del árbol del Neem.  Estudiar los potenciales usos que puedan tener los extractos de la semilla del árbol del Neem.

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4. MARCO TEÓRICO

4.1. Antecedentes Históricos

Las plantas han evolucionado por más de 400 millones de años y para contrarrestar el ataque de los insectos han desarrollado mecanismos de protección, como la repelencia y la acción insecticida. El método de control de plagas más antiguo fueron los sacrificios humanos, pero dada su baja efectividad, o tal vez la falta de voluntarios, se comenzaron a utilizar polvos y extractos vegetales, de lo cual hay antecedentes incluso en la Biblia9. El uso de extractos y plantas pulverizadas como insecticida datan de la época del imperio romano. Existen antecedentes de que en el año 400 a.c., en tiempos del rey Jerjes de Persia (hoy Irán), para el control de piojos se espolvoreaba la cabeza de los niños con un polvo obtenido de flores secas de una planta conocida como piretro (Tanacetum cinerariaefolium; Compositae). El primer insecticida natural, propiamente como tal, apareció aproximadamente en el sigo XVII cuando se demostró que la nicotina, obtenida de hojas de tabaco, mataba a unos escarabajos que atacaban al ciruelo. Hacia 1850 se introdujo un nuevo insecticida vegetal conocido como rotenona que se obtuvo de las raíces de una planta llamada vulgarmente timbó. Hasta ese momento esta planta sólo se utilizaba para pescar, pues los indígenas se habían dado cuenta que si lanzaban trozos de esta raíz al agua a los pocos minutos comenzaban a flotar peces que eran muy fáciles de atrapar. Con posterioridad se usaron plantas con propiedades irritantes como la sabadilla, que se utilizaba para descongestionar las fosas nasales, y el incienzo que no mataban directamente a los insectos sino que se decía que los “espantaban”. Otras plantas, pero en la actualidad, son quasia (Quaisa amara; Simaroubaceae) y el Neem o Margosa (A. indica) las cuales aparte de mostrar

9

ADDOR, R.W. Insecticides. In: Godfrey C.R.A. (Ed) Agrochemicals from natural products. Marcel Dekker. 1995.

20

excelentes resultados como controladoras de insectos también han resultado ser fuente de compuestos para combatir enfermedades como el cáncer10. El uso masivo de estos insecticidas ha tenido un camino muy difícil pues en una primera época las recopilaciones que hacían los investigadores, entre los agricultores e indígenas, tenían mucho de superstición y cuando se les sometió a pruebas con rigor científico no mostraron efecto alguno. Después de la segunda guerra mundial las pocas plantas que mostraron resultados auspiciosos, y alcanzaron a usarse masivamente, fueron reemplazadas por los insecticidas sintéticos. Con la aparición en la década de los cuarenta de estos insecticidas sintéticos se pensó que los insecticidas vegetales desaparecerían para siempre pero problemas como la contaminación del ambiente, los residuos en los alimentos y la resistencia por parte de los insectos han hecho que hoy en día vuelvan a ser tomados en cuenta11. El Neem, margoza o cinamomo, ha demostrado tener propiedades insecticidas y farmacológicas, y ser de beneficio para la agricultura y el desarrollo rural12. Por otra parte, puede ser utilizado de manera efectiva, en comunidades de bajo nivel tecnológico, para reducir la dependencia de los plaguicidas sintéticos y para generar ingresos. Este árbol, es de fácil propagación, es perenne, ocupa poco espacio, y requiere de poco trabajo, agua, y fertilizantes; no se destruye al utilizar material diverso de su planta; no es maleza ni hospedero de plagas, en cambio, es ornamental y maderable; el material insecticida se extrae con relativa facilidad; los

10

ARNASON, J.T., B.J. PHILOGENE AND P. MORAND (EDS). Insecticides of plant origin. American Chemical Society, Washington, DC. USA. 1989. 11 HEAL, R., E. ROGERS., R.T. Wallace AND O. Starnes. A survey of plants for insecticidal activity. Lloydia. 1950. 12 SAXENA, R.C., Z.R. KHAN, Y N.B. BAJET. Reduction of tungro virus transmission by Nephotettix virescens (homóptera: Cicadellidae) in Neem cake-treated rice seedlings. J. Econ. Entomol. 1987.

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extractos son fáciles de procesar y formular; y proporciona seguridad a los humanos y animales al usarlo y consumirlo en las diferentes formas y propósitos13. Durante siglos, el mundo occidental ignoró el árbol de Neem y sus propiedades: las prácticas de los campesinos y médicos indios no eran consideradas dignas de atención por la mayoría de colonialistas británicos, franceses y portugueses. Pese a ello, durante los últimos años, la creciente oposición a los productos químicos en Occidente y, en particular, a los plaguicidas, ha hecho crecer un gran entusiasmo por las propiedades farmacéuticas del Neem. En el nuevo mundo fue introducido recientemente en Estados Unidos de Norteamérica, y en varios países sudamericanos como Argentina, Brasil, y Chile; en países centroamericanos como Nicaragua, México y Honduras; en países del Caribe como Haití, antigua Surinam, Islas Vírgenes, Cuba y Puerto Rico, y recientemente en Colombia14. En Colombia, donde la palabra insecticida es sinónimo de toxicidad y contaminación, causa mucha curiosidad el Neem, que se presenta como productor de un insecticida vegetal que controla insectos, nemátodos, babosas, virus y hongos en plantas y además se utiliza para alimentar el ganado, como medicamento para combatir las lombrices intestinales en humanos y aun para preparación de licores15. Datos empíricos señalan que el árbol de Neem ingreso al país hace más de 30 años, con la siembra de cultivos ilícitos en los departamentos de Santander y Antioquia: en la Zona del Magdalena Medio, Puerto Triunfo y

13

AHMED, S., C. MITCHELL, AND R. SAXENA. Renewable resource utilization for agriculture and rural development and environmental protection: Use of indigenous plant material for pest control by limited resource farmers. Planning Wkshp, Botanical pest control proyect. Int. Rice Res. Inst. Los Baños, Philippines. 1984. 14 LEOS, M.J. Y R.P. SALAZAR S. El árbol insecticida neem (Azadirachta indica A. Juss) en México. Universidad Autónoma de Nuevo León. Facultad de Agronomía. Folleto Técnico No. 3. Marín, Nuevo León, México. 1992. 15 FIGUEROA, P. Adalberto. Ciencia al día: Universidad Nacional de Colombia. El Árbol Milagroso, Sirve Para Todo. Palmira, Colombia. 2007.

22

Doradal específicamente y algunos otros cultivos aislados en la zona norte del departamento del Valle del Cauca16. En Colombia no se han desarrollado muchos trabajos con el árbol del Neem, pero podemos nombrar cuatro en especial: el primero por parte de estudiantes de Zootecnia de la universidad de Fusagasuga (2004), en el manejo de Neem para el control de garrapata Labophilus sp., en el ganado de la zona; el segundo realizado por estudiantes de Ingeniería Química de la Universidad Nacional de Colombia (2004), para la determinación y aislamiento de más de 20 moléculas efectivas en el control de insectos; el tercero por estudiantes de administración y gestión ambiental de la Universidad Piloto de Colombia (2007), modelo empresarial ecoeficiente para la transformación y comercialización de los productos derivados del sistema agroforestal con árbol del Neem, en la vereda guabinal-cerro, GirardotCundinamarca y un cuarto por el Grupo de Entomología Médica de la Universidad de Antioquia (2002), en la evaluación de la actividad insecticida del Neem sobre la cucaracha Periplaneta Americana.

4.2. Marco Legal El artículo 8° de la Constitución Nacional consagra: “Es obligación del Estado y de las personas, proteger las riquezas culturales y naturales de la Nación”. El artículo 79 de la Constitución Nacional, establece el derecho de todas las personas a gozar de un ambiente sano, y a la participación de la comunidad en las decisiones que puedan afectarla. Igualmente establece para el Estado entre otros deberes, el de proteger la diversidad e integridad del ambiente.

16

GRUPO DE INVESTIGACIÓN YAGUA. Validación Integral del Sistema Agroforestal con árbol del Neem en la Vereda Guabinal Cerro, Girardot- Cundinamarca. Yagua. Universidad Piloto de Colombia y Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá, D. C., 2005.

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El artículo 80 de la Carta Política, preceptúa que le corresponde al Estado planificar el manejo y aprovechamiento de los recursos naturales, para garantizar su desarrollo sostenible, su conservación, restauración o sustitución, y además, debe prevenir y controlar los factores de deterioro ambiental, imponer las sanciones legales, y exigir la reparación de los daños causados.

El Ordenamiento Constitucional señala en su artículo 95, que toda persona está obligada a cumplir con la Constitución y las leyes y dentro de los deberes de la persona y el ciudadano, establece en su numeral 8º el de: “Proteger los recursos culturales y naturales del país y velar por la conservación de un ambiente sano”. La parte IV del Decreto – Ley 2811 de 1974 se refiere a: “De las normas de preservación ambiental relativas a elementos ajenos a los recursos naturales” y en el Título I: “Productos Químicos, Sustancias Tóxicas y Radioactivas”, establece: “Artículo 32”. Para prevenir deterioro ambiental o daño en la salud del hombre y de los demás seres vivientes se establecerán los requisitos y condiciones para la importación, la fabricación, el transporte, el almacenamiento, la comercialización, el manejo, el empleo o la disposición de sustancias y productos tóxicos o peligrosos. “En particular, en la ejecución de cualquier actividad en que se utilicen agentes físicos tales como sustancias radioactivas o cuando se opere con equipos productores de radiaciones, se deberán cumplir los requisitos y condiciones establecidos para garantizar la adecuada protección del ambiente, de la salud del hombre y demás seres vivos”.

24

4.3. Marco Conceptual 4.3.1. Árbol Del Neem

Figura Nº 1. Árbol Del Neem (Azadirachta Indica)

El árbol del Neem (Azadirachta indica), es una especie vegetal de una importancia potencial relevante, en virtud de sus características muy distintas, las cuales se reconocen en el mundo científico de occidente, y reconocido su uso milenario en las culturas del viejo mundo. Esta especie arbórea, ha despertado la atención del mundo científico biológico, por sus múltiples propiedades y usos; también se le conoce con los nombres comunes de “cinamomo”, “acederaque”, y “margoza”, o “la planta milagrosa”, o “la botica del pueblo” como lo llaman en la India, donde desde hace siglos los indios recurren a este árbol para aliviar el dolor, la fiebre y las infecciones. Por ese motivo, en los últimos años ha ido en aumento el interés de la ciencia por esta especie, ya que dos decenios de investigación revelan resultados prometedores en tantos campos, que esta especie pudiera aportar enormes beneficios a la humanidad17.

17

OSUNA, L.E. Producción de plantas y establecimiento y manejo de plantaciones de neem (Azadirachta indica A. Juss). Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias-INIFAP. Centro de Investigación Regional del Noroeste-CIRNO. Campo Experimental Todos Santos-CETS. Folleto Técnico Núm. 5. México. 2000.

25

4.3.1.1. Principales Características Del Árbol Del Neem 4.3.1.1.1. Descripción Botánica El Neem es un árbol de tamaño pequeño a mediano, con un tronco recto. Los tallos de las ramas de 2 a 5 metros forman una corona unida, densa, redonda y en forma ovalada. La altura total es de 15 a 25 metros, alcanzando ocasionalmente hasta 30 m, con un diámetro de tronco que alcanza de 30 a 90 cm. El Neem está caracterizado por un sistema de raíces laterales penetrantes, que pueden extenderse hasta 15 m, con una cofia relativamente corta. Tiene corteza moderadamente gruesa, con fisuras de color rojizo-castaño. Siempre está verde o muda, dependiendo del clima, los períodos de deshoje son normalmente breves, y ocurren durante las sequías prolongadas. Los frutos son drupáceos, ovaloblongos, amarillos purpúreos, de 1cm de diámetro y normalmente contienen una sola semilla. El fruto tiene una longitud de 2 cm y, cuando madura, el pericarpio aparece amarillo y de textura rugosa. Estos empiezan a aparecer cuando el árbol alcanza una edad de 3 a 5 años. Las hojas son alternas, imparipinnadas y compuestas, de 10 a 38 cm. Y agrupadas al extremo de las ramas18.

4.3.1.1.2. Descripción Taxonómica

Reino: Plantae Filo: MAGNOLIOPHYTA Clase: Magnoliopsida Orden: Melia Familia: Meliaceae

18

STONEY, C. 1998. Una guía útil para los árboles de uso múltiple. Uso del Neem como agente de Control Biológico de Plagas. Program Officer y Erin Hughes, Program Associate Winrock International. Hoja informativa, FACT 98–04S, Junio 1998. http://www.winrock.org/forestry/factpub/spusonim.htm. En GRUPO DE INVESTIGACIÓN YAGUA. Validación Integral del Sistema Agroforestal con Árbol del Neem. Bogotá, D.C. 2005.

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Género: Azadirachta Nombre científico: Azadirachta indica A. Juss. Sinónimos: Melia indica, Melia azadirachta Nombres comunes: Árbol del Neem, margosa, limba, cinamomo, mimba, nimba, kohomba y lila india.

4.3.1.1.3. Organografía

Produce flores blancas o crema, hermafroditas dispuestas en racimos de hasta 22 cm de largo. Su fecundidad depende de la cantidad de iluminación recibida, así como de la humedad. Las hojas con foliolos son de color verde claro e intenso en dependencia de las condiciones agroclimáticas. El fruto es una drupa suave y carnosa en forma elipsoidal, de 1.2 a 2 cm de largo, conteniendo usualmente una semilla; es de color verde claro durante su desarrollo, tornándose progresivamente hasta amarillo en la madurez. La fruta madura es pulposa y posee una cutícula fina que se desprende fácilmente19.

4.3.1.1.4. Ecología

El Neem se adapta a un extenso rango de climas y condiciones de suelos, en elevaciones entre el nivel del mar y los 700m, sin embargo puede crecer en altitudes de hasta 1500m, en tanto las temperaturas permanezcan moderadas, ya que no soporta el frío o la congelación; tolera temperaturas extremadamente altas, pero su rango normal está cerca de los 9.5ºC a 37ºC. También es altamente tolerante de la sequía y una vez establecido, puede sobrevivir a estaciones secas de 7 a 8 meses. Requiere tan poco como 150 mm de lluvia por año en áreas en donde el sistema de raíz pueda acceder al agua subterránea dentro de los 9 a 12

19

Ibid. p. 94.

27

metros de la superficie; sin embargo, se desarrolla mejor en zonas que reciben de 450 a 1200 mm al año20. Prefiere los suelos profundos, permeables y arenosos, pero puede plantarse en una amplia variedad de tipos de suelo, incluyendo sitios difíciles donde la mayoría de otras especies no se desarrollan bien. Puede prosperar en suelos rocosos, secos, poco profundos e infértiles, pero no se recomienda para ciénagas barrosas o fangosas, suelos barrosos, salinos, o donde la subsuperficie sea dura o se hallen capas de laterita. Tampoco debe sembrarse donde los suelos se vuelvan empapados o temporalmente inundados. Prefiere un pH de suelo en el rango de 5.2 a 7.0, pero puede crecer dentro de un rango de pH de 5.0 a 8.0. Los árboles maduros demandan mucha luz, pero las plántulas toleran la sombra moderada durante su primera temporada de crecimiento en sitios secos21.

4.3.1.1.5. Condiciones Para La Propagación Y Desarrollo22 El árbol Neem se propaga naturalmente por semillas; los frutos cuando están maduros caen al suelo pudiendo germinar si las condiciones son adecuadas, siendo su capacidad de germinación muy alta durante las primeras 4 semanas, descendiendo luego rápidamente. Los frutos empiezan a aparecer cuando el árbol alcanza una edad de 3 a 5 años, hasta los 10 años la producción de frutos no es rentable.

20

STONEY, C. 1998. Una guía útil para los árboles de uso múltiple. Uso del Neem como agente de Control Biológico de Plagas. Program Officer y Erin Hughes, Program Associate Winrock International. Hoja informativa, FACT 98–04S, Junio 1998. http://www.winrock.org/forestry/factpub/spusonim.htm. En GRUPO DE INVESTIGACIÓN YAGUA. Validación Integral del Sistema Agroforestal con Árbol del Neem. Bogotá, D.C. 2005. 21 Ibid. p. 95. 22 SÁNCHEZ, R. Raúl. Zoe tecno-campo: Aceite de Neem un insecticida ecológico para la agricultura. http://www.zoetecnocampo.com/Documentos/Neem/neem01.htm. 2007.

28

El desarrollo más o menos óptimo de este árbol se ve condicionado por los siguientes factores:

-

Humedad relativa. Tipo de suelo (acidez o basicidad). Edad del árbol (para descubrir a que edad el contenido de azadiractina es mayor). Cuadro Nº 1. Tolerancia Del Neem A Factores Climáticos Y De Suelo

Límites Lluvia (mm) Temp. (ºC) Arcilla (%) Arena (%) Marco (m)

Intervalo <300 4 <25 <50 <1,8 x 1,8

Límites inferiores 500-800 10-20 25-45 50-75 3 x 3-4 x 5

Óptimo 1800 27 >45 >75 >7 x 7

Superiores 2000-2500 40-49 >70 >85

Fuente: El insecticida botánico Neem, un control natural y eficaz de plagas. 1993

4.3.1.2. Componentes Químicos

El Neem contienen varios miles de componentes químicos, de especial interés son los terpenoides, compuestos por C, H y O; la presencia del oxígeno hace esos compuestos más solubles en agua, metanol o etanol que en hexano, gasolina u otros solventes similares. Actualmente se conoce de la existencia de unos 100

29

terpenoides. El más activo es la azadiractina, de la que existen varios tipos que varían desde la azadiractina A a la azadiractina K23. Realmente, los primeros trabajos sobre la química del Neem se hicieron en la India en los años 20, con el aislamiento de un ácido en el aceite de Neem al que se llamó ácido margósico. Desde los primeros estudios del Dr. Siddiqui en 1942, más de 100 componentes terpenoides, la mayoría de los tetranotriterpenoides, diterpenoides, triterpenoides, pentanotriterpenoides, hexanotriterpenoides y algunos compuestos no terpenoides han sido aislados de varias partes del árbol24. Existen muchos más compuestos activos en el árbol del Neem. De las hojas se pueden aislar varias moléculas como un flavonoide polifenólico llamado quercetina, un β-sitosterol, el nimbosterol, nimbina y otros liminoides, como la nimocinolida e isonimocinolida. También se han aislado un grupo de alcanos de entre 14 y 31 carbonos, aminoácidos y ácidos grasos. De las flores se extrae un aceite que contiene sesquiterpenos, nimbosterol y numerosos flavonoides entre los que destacan la melicitrina y el kaempferol. Las flores producen una cera compuesta por una mezcla compleja de ácidos grasos (araquídico, esteárico, palmítico, oleico y linoléico). La corteza y madera del árbol del Neem son también fuente de numerosos principios activos: nimbina, nimbidina, nimbinina,

nimbosterol, margosina, nimbineno y algunos diterpenos como la nimbinona, nimbocilina, nimbidiol y nimbiona25. Pero sin duda el elemento más interesante en la bioquímica del Neem son las semillas, por su riqueza en lípidos y la presencia de moléculas con una intensa actividad biológica. El hueso de la drupa contiene una o dos semillas y de ellas se obtiene un aceite compuesto de ácido oleico (50-60%), palmítico (13-15%),

23

SAXENA, S.K. Y SAXENA, PURNIMA: El Neem en el control de nematodos: Estudio en el que se demuestra la eficacia del aceite de Neem en el control de nemátodos.1995. 24 Ibid. p. 85. 25 El portal de los productos del árbol del Neem en España. http://www.neem.es/bioq.html. 2008.

30

esteárico (14-19%), linoleico (8-16%) y araquídico (1-3%), composiciones que varían según el método de extracción.

4.3.1.2.1. Terpenoides26

Figura Nº 2. Estructura Molecular Del Isopreno, La Unidad Química De Los Terpenoides Los terpenoides, algunas veces referidos como isoprenoides, son una vasta y diversa clase de compuestos orgánicos similares a los terpenos. El nombre proviene que los primeros miembros de esta clase fueron derivados del aguarrás “turpentine” en inglés, “terpentin” en alemán. Los terpenoides pueden verse como formados por unidades de 5-carbono isopreno (pero el precursor es el isopentenil difosfato), ensambladas y modificadas de muchas maneras diferentes, siempre basadas en el esqueleto del isopentano. La mayoría de los terpenoides tiene estructuras multicíclicas, las cuales difieren entre sí no sólo en grupo funcional sino también en su esqueleto básico de carbono. Los monómeros generalmente son referidos como “unidades de isopreno” porque la descomposición por calor de muchos terpenoides da por resultado ese producto; y porque en condiciones químicas adecuadas, se puede inducir al isopreno a polimerizarse en múltiplos de
26

R. CROTEAU, T. M. KUTCHAN, N. G. LEWIS. "Natural Products (Secondary Metabolites)". En: Buchanan, Gruissem, Jones (editores). Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists. Rockville, Maryland, Estados Unidos. 2000. Capítulo 24.

31

5 carbonos, generando numerosos esqueletos de terpenoides. Por eso se relaciona a los terpenoides con el isopreno, si bien se sabe ya desde hace más de 100 años que el isopreno no es el precursor biológico de esta familia de metabolitos. Estos lípidos se encuentran en toda clase de seres vivos, y son biosintetizados en las plantas, donde son importantes en numerosas interacciones bióticas (Goodwin 1971). En las plantas los terpenoides cumplen muchas funciones primarias: algunos pigmentos carotenoides son formados por terpenoides, también forman parte de la clorofila y las hormonas giberelina y ácido abscícico. Los terpenoides también cumplen una función de aumentar la fijación de algunas proteínas a las membranas celulares, lo que es conocido como isoprenilación. Los esteroides y esteroles son producidos a partir de terpenoides precursores27. Los terpenoides de las plantas son extensamente usados por sus cualidades aromáticas. Juegan un rol importante en la medicina tradicional y en los remedios herbolarios, y se están investigando sus posibles efectos antibacterianos y otros usos farmacéuticos. Están presentes, por ejemplo, en las esencias del eucalipto, los sabores del clavo y el jengibre. También en el citral, mentol, alcanfor, y los cannabinoides. La biosíntesis de los terpenoides en las plantas es a través de la vía del ácido mevalónico.

4.3.1.2.1.1. Clasificación28 Los terpenos son hidrocarburos que pueden verse como una combinación de numerosas unidades isopreno, por lo general unidas de forma cabeza-cola, pero también pueden darse combinaciones cabeza-cabeza y algunos compuestos
27

GOODWIN TW. Aspects of terpenoid chemistry and biochemistry. Academic Press, Londres. 1971. 28 JUDD, W. S. CAMPBELL, C. S. KELLOGG, E. A. STEVENS, P.F. DONOGHUE, M. J. Plant systematics: a phylogenetic approach, Second Edition.Sinauer Axxoc, USA. Capítulo 4. 2002.

32

están formados por uniones cabeza-medio. Los terpenoides pueden ser considerados como terpenos modificados donde grupos metilo han sido reacomodados o removidos, o a los que se les han añadido átomos de oxígeno. Algunos autores usan el término terpeno para referirse a los terpenoides. La clasificación de los terpenoides según su estructura química, es similar a la de los terpenos, los cuales son clasificados en base al número de unidades isopreno presentes y en el caso de los triterpenoides, si están ciclados. Se los clasifica en: Hemiterpenoides. Los terpenoides más pequeños, con una sola unidad de isopreno. Poseen 5 carbonos. El hemiterpenoide más conocido es el isopreno mismo, un producto volátil que se desprende de los tejidos fotosintéticamente activos.

Monoterpenoides. Terpenoides de 10 carbonos. Llamados así porque los primeros terpenoides aislados del aguarrás en los 1850s, fueron considerados la unidad base, a partir de la cual se hizo el resto de la nomenclatura. Los monoterpenos son mejor conocidos como componentes de las esencias volátiles de las flores y como parte de los aceites esenciales de hierbas y especias, en los que ellos forman parte de hasta el 5 % en peso de la planta seca.

Sesquiterpenoides. Terpenoides de 15 carbonos (es decir, terpenoides de un monoterpenoide y medio). Como los monoterpenoides, muchos sesquiterpenoides están presentes en los aceites esenciales. Además muchos sesquiterpenoides actúan como fitoalexinas, compuestos

antibióticos producidos por las plantas en respuesta a la aparición de microbios, y como inhibidores de la alimentación (“antifeedant”) de los herbívoros oportunistas. La hormona de las plantas llamada ácido abscísico es estructuralmente un sesquiterpeno, su precursor de 15 carbonos, la

33

xantosina, no es sintetizada directamente de 3 unidades isopreno sino producida por un “cleavage” asimétrico de un carotenoide de 40 unidades.

Diterpenoides. Terpenoides de 20 carbonos. Entre ellos se incluye el fitol, que es el lado hidrofóbico de la clorofila, las hormonas giberelinas, los ácidos de las resinas de las coníferas y las especies de legumbres, las fitoalexinas, y una serie de metabolitos farmacológicamente importantes, incluyendo el taxol, un agente anticáncer encontrado en muy bajas concentraciones (0,01% de peso seco) en la madera del tejo (“yew”), y forskolina, un compuesto usado para tratar el glaucoma. Algunas giberelinas tienen 19 átomos de carbono por lo que no son consideradas diterpenoides porque perdieron un átomo de carbono durante una reacción de “cleavage”.

Triterpenoides. Terpenoides de 30 carbonos. Son por lo general generados por la unión cabeza-cabeza de dos cadenas de 15 carbonos, cada una de ellas formada por unidades de isopreno unidas cabeza-cola. Esta gran clase de moléculas incluye a los brassinoesteroides, componentes de la membrana que son fitoesteroles, algunas fitoalexinas, varias toxinas y “feeding deterrents”, y componentes de las ceras de la superficie de las plantas, como el ácido oleanólico de las uvas.

Tetraterpenoides. Terpenoides de 40 carbonos (8 unidades de isopreno). Los tetraterpenos más prevalentes son los pigmentos carotenoides accesorios que cumplen funciones esenciales en la fotosíntesis.

Politerpenoides. Los politerpenoides, que contienen más de 8 unidades de isopreno, incluyen a los “prenylated quinone electrón carriers” como la plastoquinona y la ubiquinona, también poliprenoles de cadena larga relacionados con las reacciones de transferencia de azúcares (por ejemplo

34

el dolicol), y también a enormemente largos polímeros como el “rubber”, usualmente encontrado en el látex.

Meroterpenoides. Así se llama a los metabolitos secundarios de las plantas que tienen orígenes sólo parcialmente derivados de terpenoides. Por ejemplo, tanto las citokininas como numerosos fenilpropanoides contienen cadenas laterales de un isoprenoide de 5 carbonos. Algunos alcaloides, como las drogas anticáncer vincristina y vinblastina, contienen fragmentos terpenoides en sus estructuras. Además algunas proteínas modificadas incluyen una cadena lateral de 15 o 20 carbonos que es un terpenoide, que es el que ancla la proteína a la membrana.

Esteroides.

Triterpenos

basados

en

el

sistema

de

anillos

ciclopentanoperhidrofenantreno (“cyclopentane perhydro-phenanthrene ring system”). Buchanan et al. No los consideran terpenoides.

4.3.1.2.1.2. Terpenoides Con Poder Biocida Presentes En El Árbol Del Neem Hasta ahora, al menos nueve triterpenos del neem han demostrado una habilidad para impedir el crecimiento en los insectos, afectando a un número de especies que incluyen algunas de las plagas más mortíferas para la agricultura y la salud humana. Son los componentes azadiractina, salannina, melantriol, nimbina y nimbidina los más conocidos y por ahora al menos, parecen ser los más significativos.

35

4.3.1.2.1.2.1. Azadiractina29

Figura Nº 3. Estructura Molecular De La Azadiractina

Es el principal agente de la planta a la hora de combatir los insectos. Normalmente se encuentra en la semilla en proporciones del 0,1 al 0,9 %. Dosis de 30-60 g/ha de este componente son suficientes para controlar diversos tipos de plagas chupadoras y masticadoras. La azadiractina está constituida por al menos nueve isómeros estrechamente relacionados, nombrados de la A a la K. Los tipos A y B de azadiractina son los que se presentan en mayor cuantía. Se piensa que el 83 % de la azadiractina natural es de tipo A y el 16 % es de tipo B. El resto lo constituyen las variaciones de C a K, por lo que al aislar la azadiractina se detectaban 4 isómeros amorfos con actividad biológica similar. Para muchos autores la mayoría de los efectos antihormonales y antialimentarios del Neem son debido a la azadiractina. De hecho se considera que del 72 al 90 % de la actividad biológica del Neem es debida al contenido en azadiractina, (William Quarters, 1994). Es estructuralmente parecido a las ecdisonas (hormonas que se encuentran en los insectos y que controlan el proceso de metamorfosis del insecto desde el estado de larva hasta que llega a ser adulto).

29

SÁNCHEZ, R. Raúl. Zoe tecno-campo: Aceite de Neem un insecticida ecológico para la agricultura. http://www.zoetecnocampo.com/Documentos/Neem/neem01.htm. 2007.

36

Esta materia activa no mata insectos, al menos no inmediatamente, sino que en lugar de ello, repele y destruye su crecimiento y reproducción. Los últimos 20 años de investigación han mostrado que es uno de los más poderosos reguladores de crecimiento y frenador de la alimentación que se ha probado. Repele y reduce la alimentación de muchas especies de plagas de insectos así como de algunos nemátodos. Algunos autores demostraron una reducción en la síntesis de ecdisona al aplicar el principio activo. Otros autores (Rembold et al., 1984), sugieren que la azadiractina interviene en el sistema neuroendocrino para controlar la síntesis de la hormona ecdisona y juvenil. La azadiractina aparece por tanto como una materia activa de origen natural que resulta bastante eficaz; de hecho, es tan potente que una simple señal de su presencia previene a algunos insectos de incluso tocar las plantas. No obstante se han mostrado algunas limitaciones sobre todo debido al efecto de los rayos ultravioletas sobre esta sustancia que aceleran su degradación. El efecto residual dura unos cinco días, aunque los efectos juvenoides, es decir sobre el crecimiento, pierden su actividad normalmente después de uno o dos días bajo condiciones de campo30. Las temperaturas parecen jugar un papel de forma indirecta: temperaturas más altas incrementan el efecto porque los insectos son más activos bajo estas condiciones, y el efecto anticomida es conseguido más rápidamente que a bajas temperaturas. Se ha probado efectividad contra más de 175 especies evaluadas, a dosis de tan solo 10 ppm. La azadiractina fue probada por primera vez en la Universidad de Keele, por Morgan, el descubridor de tal sustancia. En Kenia, ese mismo año K. Leuschner, trabajando en el Centro de Investigación de café en Upper Kiambu, observó que un trozo de Neem metanólico, controló la chinche del café (Antestiopsis orbitalis bechuana) en cuanto a su crecimiento. La mayoría de las
30

WARTHEN, J.D. Neem (Azadirachta indica A. Juss): Organisms affected. 1989.

37

ninfas tratadas con el extracto, murieron durante sucesivos estados de crecimiento y las pocas que sobrevivieron hasta forma adulta, tenían alas y tórax malformados. Se demostró que la azadiractina era eficaz contra el escarabajo de judía mejicano (Epilachna viriavestis) y contra el escarabajo de la patata (Leptinotarsa decemlineata). Se observó que casi todas las hembras pararon de poner huevos. Algunas hembras habían sido completamente esterilizadas y el efecto era irreversible.

La azadiractina parece que actúa bloqueando la producción de ecdisona, de esta forma altera el delicado equilibrio hormonal de los insectos, afectando a su metamorfosis. Las malformaciones producidas en cualquiera de los estadíos o los daños morfogenéticos en adultos, como alas, aparato bucal mal desarrollado entre otros, provoca que los daños que puedan producir estos insectos se reduzcan ya que su actividad alimenticia se ve afectada, no pueden volar, son estériles, muriendo rápidamente. Estos efectos se producen de forma combinada y con diferente grado de acción, dependiendo de la especie de insecto, de su estado de desarrollo, del proceso de extracción y de la concentración del preparado31. Hay que tener en cuenta el efecto que la radiación solar produce sobre su eficacia, ya que causa una disminución sobre su efecto anticomida, no obstante se puede evitar si se mezcla el aceite de Neem, con aceite de angélica, ricino y cáñamo. Por otra parte el efecto secundario anticomida también ha sido explicado como un posible efecto de la azadiractina sobre los ecdiesteroides. No obstante también ha quedado probado que algunos efectos reguladores del crecimiento del azadiractina se entienden por la acción directa de esta sobre la movilidad intestinal

31

STEETS, R. AND H. SCHMUTTERER. The effect of azadirachtin on the longevity and reproduction of Epilachna varivestis Muls. (Coleoptera: Cocinellidae). 1975. p.176.

38

en el caso de Locustidae migratoria. Esto quizás lleva a interferir en el proceso de la metamorfosis influyendo en las diferentes etapas de esta. La azadiractina es la materia más eficaz de las contenidas en el Neem, capaz de garantizar el control de las plagas y de ser la alternativa a productos sintéticos, ya que el control añadido de los insectos útiles, que no son afectados, posibilita el reducir el número de aplicaciones tal como se ha comprobado en ensayos de diversos cultivos en diferentes países.

4.3.1.2.1.2.2. Meliantriol32

Figura Nº 4. Estructura Molecular Del Meliantrol

Fue aislado por primera vez por Lavie en 1967. Su estructura es también muy complicada al igual que la de la azadiractina. Este compuesto actúa también como inhibidor de la alimentación. Hace posible que en concentrados extremadamente bajos, los insectos cesen de comer. Además también actúa sobre el crecimiento de los insectos y afecta también a nemátodos.

32

TOVAR, H.H. El neem. Insecticida Botánico. Los insecticidas naturales inician un cambio radical en el control de plagas. Tecnoagro. Año 1. Núm. 2. Naucalpan, Estado de México. México. 2000.

39

La demostración de su habilidad para prevenir el mascado de las langostas en los cultivos, fue la primera prueba científica del uso tradicional del Neem para el control de insectos en los cultivos de La India.

4.3.1.2.1.2.3. Salannina33

Figura Nº 5. Estructura Molecular De La Salannina

Fue la tercera materia activa aislada del Neem. Estudios indican que este compuesto inhibe también, poderosamente la alimentación, pero no influye en los distintos cambios hasta que los insectos no llegan a ser adultos34.

Se probó su poder en laboratorio contra varios tipos de plagas, (langosta migratoria, trepadora roja de California, el escarabajo rayado del pepino, el escarabajo japonés y la mosca doméstica), en todos los casos se demostró su alto poder inhibidor de la alimentación.

33

SÁNCHEZ, R. Raúl. Zoe tecno-campo: Aceite de Neem un insecticida ecológico para la agricultura. http://www.zoetecnocampo.com/Documentos/Neem/neem01.htm. 2007. 34 COHEN, E., QUISTAD, G.B. Y CASIDA, J.H. 1996. Cytotoxicity of nimbolide, epoxyazadiradione and other liminoids from neem insecticide. Life Sciences. 1996. p.1075.

40

4.3.1.2.1.2.4. Nimbina y Nimbidina

Figura Nº 6. Estructura Molecular De Nimbina (a) Y Nimbidina (b) Estos compuestos han demostrado su actividad sobre el Virus X de la Patata, Vaccinia virus, y sobre el virus de las enfermedades venéreas de las aves.

La Nimbidina es el componente primario de principios amargos, que se produce cuando las semillas de Neem son sometidas a un proceso de extracción con alcohol. Esto ocurre en cantidades bastante grandes; sobre el 2 % del núcleo.

4.3.1.3. Procedimientos Para La Elaboración Del Insecticida Natural 35

4.3.1.3.1. Tecnología De Producción Artesanal Este sistema para la elaboración de bioinsecticidas es muy simple, pues la materia prima (semilla y hojas) después de secadas pueden utilizarse, siendo procesadas mediante aparatos y equipos de poca complejidad.

35

SODEPAZ, 2002. Proyecto introducción del árbol del Neem en Cuba.http://www.sodepaz.org/nim/ en GRUPO DE INVESTIGACIÓN YAGUA. Validación Integral del Sistema Agroforestal con árbol del Neem en la Vereda Guabinal Cerro, GirardotCundinamarca. Universidad Piloto de Colombia y Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá, D. C., 2005.

41

Figura Nº 7. Elaboración Artesanal De Insecticida Natural Neem

4.3.1.3.1.1. Empleo De La Semilla Entera Inicialmente se realiza la recolección de la materia prima (frutos), esta se coloca en lechos de lavado durante un periodo de 24 horas para facilitar el desprendimiento de la cascarilla. Luego del remojo el fruto es despulpado, este puede ser manual o mecánico. Esta semilla obtenida se lava y luego se somete a un proceso de secado durante una semana expuesta al sol.

42

Las semillas después de secadas hasta alcanzar entre 8 y un 10 % de humedad, son sometidas a un proceso de molido, utilizando molinos manuales o eléctricos en dependencia de la disponibilidad local; esta operación se regulará para lograr un tamaño de la partícula entre 1 y 2 mm a fin de obtener un buen proceso de extracción del principio activo cuando se elabore el extracto acuoso, que se empleará en el control de plagas de insectos y ácaros, y en forma de polvo para el control de los nemátodos e insectos que atacan el cogollo del maíz y el sorgo. El producto obtenido se envasa en bolsas plásticas con capacidades de 1 y 5 Kg; posteriormente se almacenan durante un mes o más en condiciones de ambiente fresco.

4.3.1.3.1.2. Empleo De La Hoja La hoja para ser utilizada como insecticida o antiparasitario durante algún tiempo, se debe deshidratar manteniendo su color verde claro, luego se procede al molido, envase y conservación igual que la semilla. La hoja verde para uso emergente y limitado, puede ser aplicada en forma de extracto acuoso en el control de plagas agrícolas y de ectoparásitos.

4.3.1.3.2. Tecnología De Producción Industrial En este sistema de producción la materia prima se procesa a partir de métodos de elaboración de un grado de complejidad más elevado, si se compara con los métodos artesanales. Aquí se emplea una infraestructura compuesta por equipos, aparatos, máquinas enmarcados dentro de un flujo tecnológico con parámetros y sustancias aditivas especiales.

43

4.3.1.3.2.1. Empleo Del Aceite Por esta vía, la producción de los insecticidas utiliza como materia prima la almendra de la semilla descascarillada, la cual se somete a un proceso de prensado donde se extrae el aceite que se filtra y luego se formula empleando diferentes sustancias orgánicas y emulsificantes, así como otros coadyuvantes. También con el aceite y el residuo, se puede elaborar ungüento, pasta y pomada para emplear en el control de ectoparásitos en animales.

4.3.1.3.2.1.1. Métodos De Extracción Del Aceite

4.3.1.3.2.1.1.1. Extracción Mecánica El uso de la extracción de aceites por medios mecánicos, presenta bajos

rendimientos en comparación con la extracción con solvente. Los procesos mecánicos de extracción pueden reducir el aceite en el grano molido en 5% a 10% de peso, mientras que los procesos de extracción por solventes reducen el aceite en el grano molido a menos del 1% de peso. Como el valor de la fracción de aceite es típicamente dos o tres veces el valor de fracción del grano molido por peso, la pérdida de rendimiento es muy costosa. El proceso de extracción mecánica también tiene comparativamente un altísimo consumo de energía y costos de mantenimiento por toneladas de materiales de oleaginosas procesadas.

Existen cuatro razones por las cuales el proceso mecánico de extracción es todavía utilizado selectivamente. En primer lugar, este proceso, puede ser proporcionado en muy pequeña escala, tan bajas como 10 toneladas por día. El costo de capital para las pequeñas instalaciones de extracción mecánica es considerablemente inferior a las pequeñas instalaciones de extracción por solvente. En segundo lugar, hay un gran mercado de alto valor para los aceites

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naturales que no hayan estado en contacto con disolventes o productos químicos, requiriendo el uso de la extracción mecánica. En tercer lugar, la extracción mecánica puede crear una torta de alto contenido proteico como alimento para animales rumiantes, que se vende a un precio más alto que la torta proveniente de la extracción con solventes. Por último, la extracción mecánica es considerada a menudo más confiable que el disolvente en el tratamiento de la extracción de materiales difíciles (Copra y Palm Kernel), en caliente y climas tropicales.

El equipo usado para la extracción mecánica de fracciones de aceites de las fracciones del grano molido es la prensa de alta presión o Expeler Press (Anderson Internacional trademark). Una expeler es un dispositivo mecánico que utiliza un tornillo sin fin horizontal, con el aumento del diámetro de cuerpo para impartir presión sobre los materiales oleaginosos a medida que avanza a lo largo de la longitud del tornillo. La prensa tiene una función, para los materiales oleaginosos de menor aceite posible. La clave de la ejecución de la prensa consiste en aplicar la máxima presión a una fina sección transversal del material oleaginoso para exprimir la mayor cantidad de aceite posible. Es común para la utilización de prensas de agua fría y el agua de enfriado o refrigerado de barriles de aceite para disipar el calor suficiente para mantener la presión y fricción interna.

Las prensas más completas son capaces de procesar de 10 a 100 toneladas de material oleaginoso por día. A menor capacidad de llenado, las prensas pueden obtener típicamente aceite residual inferior en la harina, a costa de consumir más energía y costo de mantenimiento por tonelada de semilla procesada.

La fracción de aceite retirado en la prensa está cargada con finas partículas de grano molido, normalmente en el rango de 0.5-15% en peso. Estas partículas suelen ser removidas del aceite utilizando el método tradicional de bombeo de aceite en un tanque de 30 a 60 minutos de tiempo de residencia para permitir que estas, las más pesadas establecerlas y continuar dragando de la base del tanque.

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Después de la separación gravimetríca, el aceite es entonces bombeado a través de un screener vibrador o mediante una hoja de filtro a presión para la separación final de partículas del grano molido. Partículas de grano molido separadas de las del flujo de aceite limpio están saturadas con el aceite y el reciclado en el proceso por delante de la amplia difusión por la prensa.

4.3.1.3.2.1.1.2. Extracción con solventes El proceso de extracción por solvente tiene beneficios en los rendimientos significativamente más alta producción de aceite que por extracción mecánica, junto con una menor dependencia de los gastos de funcionamiento. El principal inconveniente de la extracción por solvente es el elevado costo de capital inicial para la construcción de una instalación. Extracción por solvente, sus instalaciones construidas hoy son comúnmente en el rango de tamaños de 1000 a 5000 toneladas por día, con un costo de $ 15 millones a 75 millones de dólares para la construcción.

El disolvente utilizado en la mayoría de las plantas extractoras de aceites de semillas alrededor del mundo es el hexano comercial, que es una mezcla generalmente de hidrocarburos, cuyo rango de ebullición de temperatura es de 65-69 ° C. La mayoría del hexano comercial disponible contiene aproximadamente el 65% de hexano normal, con el 35% restante de la composición que consta de ciclopentano e isómeros de hexano. Como el vapor de hexano es tres veces más pesado que el aire y cantidades ligeras de hexano mixtos en el aire puede crear una mezcla explosiva, debe tenerse especial cuidado en la construcción y funcionamiento de plantas de extracción por solvente. La National Fire Protection Agency boletín NFPA - 36 plantas de extracción con solventes es la reconocida guía para la seguridad en la construcción y el funcionamiento de esas instalaciones.

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A causa de las consideraciones de seguridad, el proceso de extracción por solvente se construye en una instalación de proceso de preparación de la semilla. El proceso de extracción por solvente consta de cinco unidades de procesos estrechamente relacionados entre sí: extracción por solvente, desolventización de grano molido, secado del grano molido y la refrigeración, destilación de miscelas y recuperación de solventes.

El extractor hace parte del equipo en los procesos de extracción por solventes, donde la fracción del aceite vegetal del material oleaginoso es separada de la fracción del grano molido por la disolución de la fracción de aceite en el disolvente. Separado el material de la oleaginosa se transporta desde el proceso de preparación de las semillas a la extracción por solvente y entra en el proceso de extracción por solventes. El solvente de extracción transmite el material preparado de su entrada a su salida, con tal que el material preparado resida aproximadamente 30 a 120 minutos de tiempo. Mientras que el material está siendo transmitido adelante, la miscela (disolvente y solución de aceite) es lavada a través del lecho para extraer el aceite vegetal del material.

Cada lavado de la miscela disminuye la concentración de aceite vegetal. Después de cuatro a ocho lavados de la miscela, el material se lava una vez más con un nuevo disolvente, terminando el proceso de extracción. Antes de las salidas de los materiales del extractor, se permite el drenaje por gravedad para reducir su retención de disolvente. El extracto del material gastado cae en la descarga y sale del equipo. La miscela con la mayor concentración de aceite vegetal también sale del equipo a un tanque de depósito de miscela.

En el proceso de extracción por solvente, la miscela se difunde en la superficie del material oleaginoso a través de las paredes de las células del cuerpo del aceite situados dentro de las células. La miscela rápidamente entra en solución con el cuerpo del aceite. Como la miscela continúa entrando y va en la solución, la

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presión interna se establece dentro de la célula y concentrada la miscela, se difunde hacia fuera de la célula. Esta miscela concentrada se difunde a través de las paredes de las células adyacentes y, finalmente, llega a la superficie de la partícula.

Una vez la miscela más concentrada llega y bañan al material oleaginoso de miscela fuera del material oleaginoso, que va rápidamente en la solución con miscela, aumentando gradualmente su concentración. Este proceso continúa hasta que la concentración de la miscela dentro de las células del material oleaginoso en el entra en equilibrio con la concentración de miscela fuera de materiales oleaginosos.

Todos los materiales oleaginosos tienen poca diferencia en la estructura celular y, por consiguiente, un tiempo de requerimiento necesario diferente para la miscela dentro de las células del material oleaginoso para llegar en equilibrio con la miscela a fuera del material oleaginoso.

4.3.1.3.2.2. Empleo de la torta La torta resultante del proceso de prensado, se molina destinándose igualmente para la elaboración de insecticida a usar como extracto acuoso para el control de plagas de insectos y ácaros, en forma de polvo para el control de nemátodos y, por último, como materia prima para la elaboración de insecticida industrial a base de extracto etanólico con un contenido aproximado de 3000 a 4000 ppm (3 a 4 g/l) de Azadiracbtina ó concentrados con contenidos superiores de ese agente activo.

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Cuadro Nº 2. Cantidad De Azadiractina Obtenido Usando Distintos Solventes SOLVENTE USADO Etanol (95%) Metanol / agua (85:15) Metanol Acetona Etil-éter AZADIRACTIN ENCONTRADO (µg/10µl) 2,80 2,60 2,19 0,74 1,28

Fuente: El Insecticida Botánico Neem, Un Control Natural Y Eficaz De Plagas: 1993

4.3.1.4.

Mecanismo De Acción Del Insecticida

Las propiedades del Neem vienen basadas en el parecido que presentan sus componentes con las hormonas reales, de tal forma que los cuerpos de los insectos absorben los componentes del Neem como si fueran hormonas reales y estas bloquean su sistema endocrino. El comportamiento profundamente arraigado resultante y las aberraciones psicológicas, dejan a los insectos tan confundidos en su cuerpo y cerebro, que no pueden reproducirse y sus poblaciones se reducen mucho36.

Los efectos precisos de varios extractos del Neem son a veces difíciles de concretar. La complejidad de ingredientes del Neem y sus formas de mezclarlos y de acción tan variadas, complican en gran medida su aclaración. Pero, a pesar de las dudas en varios detalles, se sabe bastante bien y es de sobra conocido que varios extractos del Neem actúan en diversos insectos de diferentes maneras:
36

SAXENA, S.K. Y SAXENA, PURNIMA: El Neem en el control de nematodos: Estudio en el que se demuestra la eficacia del aceite de Neem en el control de nemátodos.1995.

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Destruyendo e inhibiendo el desarrollo de huevos, larvas o crisálidas. Bloqueando la metamorfosis de las larvas o ninfas. Destruyendo su apareamiento y comunicación sexual. Repeliendo a las larvas y adultos. Impidiendo a larvas poner huevos. Esterilizando adultos. Envenenando a larvas y adultos. Impidiendo su alimentación. Bloqueando la habilidad para tragar (reduciendo la movilidad intestinal). Enviando mayores errores a su metamorfosis en varios periodos de desarrollo del insecto. Inhibiendo la formación de quitina (material del que se compone el esqueleto del insecto). Impide que se realicen las mudas, necesarias para entrar en la siguiente etapa del desarrollo, de tal forma que actúa como regulador de crecimiento del insecto.

De todos estos efectos, se puede decir que actualmente el poder repelente es probablemente el efecto más débil. La actividad anticomida (aunque interesante y valiosa en gran extremo) presenta corta vida y es variable. La más importante cualidad del Neem, es el bloqueo en el proceso de metamorfosis de la larva 37.

Otras características destacables del Neem son: difícil desarrollo de resistencia por tratarse de una mezcla de componentes bioactivos, sistémico através de las raíces cuando se aplican al suelo, elevada biodegradabilidad, sobre todo por la acción de la radiación U.V., con una persistencia en campo de 4-8 días y posibilidad de sinergismo con otros productos naturales como Bacillus thurigiensis.

37

SÁNCHEZ, R. Raúl. Zoe tecno-campo: Aceite de Neem un insecticida ecológico para la agricultura. http://www.zoetecnocampo.com/Documentos/Neem/neem01.htm. 2007.

50

4.3.1.5. Insectos Que Controla Se reportan más de 200 insectos que son afectados o muestran susceptibilidad al Neem (warthem, 1989). A continuación se mencionan algunos órdenes y plagas agrícolas que son afectadas por los productos de Neem, así como sus efectos. Coleóptera. Las larvas de los escarabajos, especialmente fitofagos, coccinélidos (escarabajo mexicano del haba y escarabajo del pepino); crisomélidos (escarabajo colorado de la papa entre otros); quienes rehúsan a comer plantas tratadas con Neem, crecen pocos y algunos mueren por contacto. Díptera. Muchas especies de insecto díptero, como moscas de la fruta, mosco del cuerno y mosca doméstica, mosca del melón, zancudos, por ejemplo; son susceptibles a los productos del Neem. Homóptera. Afidos (de los cítricos, del algodón, caña de azúcar), psilidos, mosquita blanca y otros homópteros son sensibles a los productos de Neem. La ninfa de defoliadores presenta considerable efecto antialimentario y efectos reguladores del desarrollo. Himenóptera. En este grupo (como minador de la hoja del abedul, hormiga de la madera, abeja mielera), el Neem provoca efectos antialimentarios y tiene efectos reguladores del crecimiento en los estados inmaduros. Lepidóptero. Las larvas de lepidóptero como gusano soldado, barrenador del fruto, gusano cogollero del maíz, gusano del tabaco, presentan una alta sensibilidad al Neem, el cual bloquea la alimentación aunque el efecto más importante es la interrupción del crecimiento. Orthóptera. En defoliadores como grillos y langostas, el efecto

antialimentario es el más importante, estas especies rehúsan a comer las

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plantas tratadas con Neem. Recientemente un nuevo efecto descubierto es el que modifica su comportamiento gregario a formas solitarias. Thysanoptera. El Neem es muy efectivo en ninfas de trips (trips de arroz), que están presentes en el suelo; a los adultos los obliga a salir de sus refugios en las plantas al provocar repelencia. Además de las arriba mencionadas, se ha probado que el Neem también es efectivo sobre blattodea, phasmida, phtniraptera, siphonoptera y ostracodos, arañas y nematodos, especies nocivas de lombrices y hongos, incluyendo el productor de aflatoxina, asperguillus flavus. Resultados obtenidos en pruebas de campo, en plantaciones de cultivos alimentarios en países tropicales, han demostrado los beneficios del control de plagas a base de los derivados del Neem, han aumentado así la productividad. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha llevado a cabo con éxito ensayos con Neem en aguas para combatir los mosquitos de la malaria.

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5. METODOLOGÍA

5.1. Introducción Metodológica

5.1.1. Enfoque De Investigación Según la naturaleza de los objetivos en cuanto al nivel de conocimiento que se desea alcanzar, este proyecto tuvo un enfoque de investigación experimental descriptiva, con resultados que se dirigen a resolver un problema concreto, en circunstancias y características puntuales. Los ensayos y comprobaciones se realizaron de forma práctica, con ayuda de instrumentos claves, estudio bibliográfico y el apoyo técnico necesario en estos casos.

5.1.2. Población Se seleccionaron los árboles sembrados de modo ornamental situados en la zona urbana de la ciudad de Valledupar y las zonas rurales de los municipios de La Paz y Agustín Codazzi ubicados en el Departamento del Cesar.

5.1.3. Selección de Variables El trabajo desarrollado se dividió en tres etapas importantes: La primera fue la caracterización fisicoquímica de la semilla molida del árbol del Neem; La segunda la extracción del aceite de la semilla molida caracterizada; y La tercera, la extracción del extracto de la torta o semilla desengrasada resultante de la extracción del aceite de la semilla molida caracterizada.

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Fue en esta última etapa donde se centró la investigación, puesto que era en este punto donde se mediría la cantidad de extracto obtenido por medio de un solvente etanolico. Como resultado de la revisión bibliográfica sobre los factores que influyen en esta etapa se determinaron las variables de entrada a modificar para medir el efecto sobre las variables de salida; además se determinó cuáles de las variables de entrada se mantendrían constantes y cuáles no se medirían.

Como variables de entrada para el proceso de extracción del extracto con el solvente etanolico en el equipo soxhlet, se eligió la cantidad de ml del solvente etanolico; y como variables de salida se determinó el porcentaje de extracto etanólico contenido en la semilla desengrasada (torta).

% Extracto Insecticida = (PI - Po) × 100 M Po = Peso del Balón Vació PI = Peso del Balón + Extracto Insecticida M = Peso de la Muestra NR T

CE SMD

Extracción Del Extracto Insecticida

%E

PA Figura Nº 8. Modelo General Del Proceso de Extracción Del Extracto
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Variables de Entrada: CE = Cantidad de Etanol.

Variables de Salida: %E = Porcentaje de Extracto.

Factores Controlables: T = Temperatura. NR = Número de Reflujos. SMD = Cantidad de Semilla Desengrasada (torta).

Factores Incontrolables: PA = Presión Atmosférica (esta es la presión del medio ambiente).

De igual manera se fijaron unos factores que no se modificaron y que permanecen constantes dentro del proceso, estos fueron: temperatura que se mantuvo entre 78-79 ºC (temperatura de ebullición del etanol), presión (atmosférica de la ciudad de Valledupar), número de reflujos de 5 y la cantidad de muestra que fue de 10 g. Todo esto se fijo teniendo en cuenta la bibliografía consultada y pre-ensayos realizados antes del proceso final.

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Cuadro Nº 3. Factores Que Se Mantienen Constantes Durante El Proceso FACTOR Temperatura (ºC) Número De Reflujos Cantidad De Muestra (g) Presión atmosférica (atm) NIVELES 78-79º 5 10 1

5.1.4. Diseño Experimental

Para llevar a cabo la estimación del porcentaje de extracto contenido en la semilla desengrasada del árbol del Neem, se realizaron inicialmente pre-ensayos variando el número de reflujos y la cantidad de muestra tratada. De estos pre-ensayos se determinó que el número de reflujos adecuados para el proceso era de 5 y la cantidad de muestra indicada era de 10 g; esto debido al comportamiento presentado durante los tratamientos, puesto que fue en ese número de reflujos donde se obtuvo la mayor extracción en la muestra con menor consumo del solvente etanol.

Teniendo en cuenta lo anterior, para el desarrollo de la investigación se planteo un diseño experimental unifactorial o experimento con un solo factor, con 7 niveles del factor y tres repeticiones.

Cada uno de los tratamientos se realizó por triplicado para un total de 21 tratamientos. A cada tratamiento se le determinó el porcentaje de extracto contenido en la semilla desengrasada del árbol del Neem, valores que fueron registrados para realizar el diseño estadístico planteado.

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Es claro también que las variables de interferencia como cantidad de solvente, cantidad de muestra, etc., fueron controladas, manteniendo un procedimiento estándar previamente determinado y cuidando que se cumplieran con las mínimas variaciones posibles. Las muestras fueron tomadas con un muestreo estadístico adecuado, como lo es el muestreo aleatorio el cual es una técnica utilizada comúnmente en donde las muestras son seleccionadas de tal manera que todas las combinaciones de unidades tienen la misma probabilidad de ser elegidas como muestra, y mantenidas en iguales condiciones, para evitar posibles efectos negativos en los resultados de la investigación.

Cuadro Nº 4. Factores Y Niveles Definitivos Utilizados En El Diseño Cantidad De Etanol (ml) Número De Corrida Experimental

330 320 310 300 290 280 270

1 4 7 10 13 16 19

2 5 8 11 14 17 20

3 6 9 12 15 18 21

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5.1.5. Técnicas Utilizadas

Para el cumplimiento de los objetivos propuestos en este proyecto se midieron los siguientes parámetros, empleando y aplicando equipos y técnicas descritas a continuación en el cuadro Nº 5.

Cuadro Nº 5. Técnicas Utilizadas

PARÁMETRO

MEDICIÓN DESCRIPCIÓN

MATERIALES Y EQUIPO (S)

MÉTODO

Estufa, Contenido de agua
Humedad

desecador, balanza analítica.

Evaporación a peso constante

%

en la muestra.

Contenido de proteína bruta
Proteína

Unidad de digestión Kjeldahl, titulador automático Metrohm. Aparato de extracción Soxhlet, Kjeldahl

%

presente en la muestra.

%
Extracto etéreo

Contenido de grasa presente en la muestra.

balones, estufa, hexano, desecador, balanza analítica.

Soxhlet

58

Matraz de fondo plano de
Fibra cruda

%

Contenido total de fibra en la muestra.

500 ml, embudo, estufa, horno, desecador, balanza analítica.

Digestión acida y básica

Contenido de minerales totales o
Céniza

Crisoles de porcelana, mufla, desecador, balanza analítica. Calcinación

%

material inorgánico presente en la muestra.

Grado de acidez o
pH

pH Meter.

Potenciometría

-

basicidad de la muestra

Acidez

%

Cantidad de acido presente en la muestra

Titulador automático.

Titulación

Relación entre
Densidad

Picnómetro, balanza analítica. Picnometria

g/ml

Masa de un cuerpo y el volumen que ocupa

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5.2. Procedimiento Experimental 5.2.1. Selección De La Muestra Las muestras se tomaron de forma manual y de modo aleatorio del fruto del árbol del Neem de tres zonas diferentes del departamento el Cesar: Zona urbana de la ciudad de Valledupar. Zona rural del municipio Agustín Codazzi. Zona rural del municipio La Paz.

Figura Nº 9. Mapa Del Departamento Del Cesar Con Los Sitios De Recolección De La Muestra

60

Estas muestras se tomaron de forma aleatoria, recogiendo los racimos enteros y cortándolos desde la parte de conexión con la planta. La recolección dependió mucho de las condiciones en las cuáles se encontraba el fruto. Se seleccionaron aquellos frutos que no tenían daños físicos, ni signos de enfermedades, ni golpes, ni magulladuras, con coloración externa homogénea y que se encontraran listos para ser cosechados (los frutos que estuvieran maduros).

5.2.2. Acondicionamiento Del Fruto En esta etapa se realizó un lavado de los frutos con agua potable para liberarlos de residuos que afectaran o dañaran su estado físico y además se humedeció el cuerpo carnoso o pulpa del fruto para facilitar el proceso de despulpado que se realizó de forma manual.

Posteriormente la semilla se sometió a un proceso de secado a una temperatura de 70ºC durante un tiempo de 6 horas, para una mejor conservación durante el almacenamiento, así como eliminar la humedad presente y seguir con el desarrollo de las próximas etapas. En este proceso de secado se obtuvieron porcentajes de humedad (8 – 12%).

Esta semilla secada se sometió a molienda en un molino eléctrico y luego se tamizo, obteniendo partículas homogéneas de un diámetro de 1 a 2 mm (Martínez C. – Pavón).

5.2.3. Determinación De Características Fisicoquímicas De La Semilla Molida En esta etapa, a la semilla molida, se le realizó un análisis proximal en el cual se determinaron parámetros como: proteína, grasa, humedad, ceniza y calcio, utilizando el método de análisis proximal de Weende; que consiste en el conjunto
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de determinaciones que se realizan para describir la composición nutritiva de una sustancia alimenticia que pueda reducirse al estado de harina 38. Además se determino el pH, acidez, y la conductividad. Teniendo en cuenta las recomendaciones reportadas por la A.O.A.C. (Association of Official Analytical Chemists).

5.2.4. Extracción De Aceite Una vez se determinaron las características de la semilla molida del árbol de Neem se realizó la extracción del aceite tomando una cantidad de semilla molida secada.

El método de extracción utilizado fue por solvente (hexano), a través de un extractor soxhlet, esto basándonos en la teoría antes revisada (Espinosa R. y Martínez J.).

En cuanto al montaje en el equipo soxhlet, este se fundamento en el principio de transferencia de masa, debido a las propiedades del solvente y la muestra en estudio, en el cuál el material oleaginoso entra en contacto con el disolvente a través de un medio filtrante y ambas fases sólido – solvente, entran en contacto intimo y el soluto o los solutos se difunden desde el sólido a la fase líquida, lo que permite una separación de los componentes originales del sólido en este caso el aceite, esto es lo que se conoce comúnmente con el nombre de lixiviación liquidosólido39.

Este proceso se manejo por medio de la Norma Técnica Colombia (NTC) 235 de 1998. El hexano es un reactivo de grado analítico y fue adquirido de Distrumedica
38 39

BERNAL, I. Análisis de alimentos. Bogotá: Guadalupe Ltda., 1994. GEANKOPLIS, C. J. Procesos de Transporte y Operaciones Unitarias. 3ª Edición Compañía Editorial Continental, S.A. de C.V. México, D.F. 1998. p. 461.

62

S.A. de marca MERCK. Este aceite fue extraído solo con fines de determinar las características fisicoquímicas que presenta.

Para la determinación de los tiempos, la temperatura y la cantidad de reflujos se siguió la recomendación expuesta en la tesis extracción y caracterización del aceite crudo de higuerilla (ricino communis) hibrido variedad mamona brasilera,

cultivado en el copey - cesar, y a pre-ensayos realizados por los investigadores en las instalaciones del Centro de Investigación para el Desarrollo de la Ingeniería (C.I.D.I) de la Universidad Popular del Cesar.

La Figura Nº10, permite observar el montaje de extracción de grasa en el equipo soxhlet que se empleó en el proceso.

Figura Nº 10. Montaje De Extracción De Grasa En Equipo Soxhlet

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5.2.5. Determinación De Características Fisicoquímicas Del Aceite Para esta fase del proyecto se determinaron las características fisicoquímicas del aceite extraído anteriormente, realizándole análisis de densidad, color, acidez, pH y punto de saponificación; Para estos análisis se tuvieron en cuenta las normas NTC.336 de 1999, NTC.335 de 1998 y NTC.218 de 1999, y además las técnicas recomendadas por la AOAC (Association of Official Analytical Chemists).

Figura Nº 11. Aceite Extraído De La Semilla Molida Del Árbol Del Neem

5.2.6. Determinación De Características Fisicoquímicas De La Torta La semilla desengrasada o torta es el sólido restante de la extracción del aceite, también fue analizada y los parámetros determinados fueron: pH, color, acidez, alcalinidad, % de proteína, fibra y ceniza. El análisis de estos parámetros se realizó como indicador de los cambios de la semilla durante todo el proceso de extracción del extracto presente en la torta o semilla desengrasada y que tiene propiedades como insecticida. La normalización de los parámetros fisicoquímicos más importantes se llevo a cabo de acuerdo a las determinaciones según el método determinado por la AOAC 981.12/90 y adaptado por Bernal 199340.

40

Ibid. p. 104-107.

64

5.2.7. Extracción Del Extracto Presente En La Torta Después de haber extraído el aceite, de determinar sus características y las de la torta, se procedió a extraer el extracto presente en la torta. Este procedimiento se llevo a cabo utilizando el método propuesto por Larson (1985). Este método plantea la utilización de un solvente (etanol) para arrastrar el extracto en el extractor soxhlet. El montaje que se ejecuto en el equipo soxhlet es un principio de transferencia de masa llamado lixiviación líquido-sólido. El etanol utilizado es de grado comercial, con un porcentaje del 96% de pureza.

Se realizaron ensayos preliminares para determinar: la cantidad de muestra, la cantidad de reflujos y la cantidad de solvente a utilizar. Buscando con esto la optimización del proceso en cuanto a máxima extracción y bajo volumen de solvente empleado. Estos porcentajes se determinaron llevando hasta

evaporación a Peso Constante. La Figura N° 12 permite visualizar el montaje empleado en el proceso de Extracción Del Extracto Presente En La Torta. Además se determinó por medio de un diseño experimental el efecto de las variables consideradas durante el proceso de extracción.

Figura Nº 12. Extracción Del Extracto Presente En La Torta

65

Una vez se obtiene el extracto de la torta, esta queda convertida en un sólido o bagazo al cual se llamó Sólido Agotado. A este sólido agotado, se le midieron pH, porcentaje de fibra y de proteína.

5.2.8. Análisis Fisicoquímico Del Extracto De La Torta Para la caracterización fisicoquímica del extracto de la torta o de la semilla desengrasada, se empleó cromatografía de gases acoplada a masas. Este análisis se realizó en el Laboratorio de Cromatografía de la Universidad Industrial de Santander (UIS), utilizando la técnica de cromatografía de gases con detector selectivo de masas (GC-MS), operando en el modo de barrido completo de radio frecuencia (full scan).

Como complemento en la caracterización fisicoquímica, también se realizó un análisis para determinar la cantidad de Azadiractina presente en el extracto obtenido de la semilla desengrasada del árbol del Neem. Este análisis fue realizado con la técnica de Cromatografía Líquida de alta resolución HPCL en la Universidad Nacional De Colombia Sede Medellín.

Además se le realizó al extracto análisis de densidad, acidez, pH, color, alcalinidad, teniendo en cuenta las normas técnicas recomendadas por la AOAC (Association of Official Analytical Chemists).

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6. RESULTADOS Y ANÁLISIS

En esta sección se presentan los resultados de la metodología llevada a cabo en la ejecución del proyecto, y se hace un análisis de estos.

6.1. Caracterización Proximal De La Semilla Molida Del Árbol Del Neem

En el Cuadro Nº 6, se muestran los resultados de las características dimensionales realizadas a la semilla. Cada una de las pruebas se realizó teniendo en cuenta las respectivas técnicas.

Cuadro Nº 6. Características Dimensionales De La Semilla Del Neem Semillas Masa (g) Largo (cm) Promedio 0.85 1.5 Ancho (cm) 0.65

Fuente: Investigadores, 2008.

Para la caracterización de la semilla fue necesario un pretratamiento del fruto, despulpado, secado y una posterior molienda y tamizado, para poder tener partículas homogéneas (1 – 2 mm), lo cual permite que el contacto con el solvente optimice la extracción.

En el Cuadro Nº 7, se muestran los resultados de la caracterización fisicoquímica que se le realizo a la semilla Molida del árbol el Neem. Todos los análisis se realizaron por triplicado, en el Centro de Investigación para el Desarrollo de la Ingeniería (C.I.D.I) de la Universidad Popular del Cesar. Los análisis realizados

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fueron: humedad, ceniza, proteína bruta, extracto etéreo, fibra cruda y calcio. Además de esto se le realizaron otros análisis de pH, acidez y conductividad.

Cuadro Nº 7. Características Fisicoquímicas De La Semilla Molida Del Árbol Del Neem PARÁMETRO % Humedad % Proteína % Extracto Etéreo % Ceniza % Fibra Bruta % Acidez (Acido Oleico) pH Conductividad (µs/cm) Calcio (ppm) PROMEDIO 8.50 19.95 18.02 3.03 24.81

0.20

5.66 1730 1.914

Fuente: Investigadores

Los datos obtenidos en la caracterización fisicoquímica de la semilla molida del árbol del Neem, presentaron un alto contenido de proteína y fibra bruta, resultado que al ser comparado con otros trabajos realizados, en Venezuela por Carlos Romero y Maritza Vargas en la Universidad de Carabobo-Venezuela, mantienen una concordancia en las concentraciones obtenidas. De igual forma, en los demás
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parámetros evaluados se encontraron diferencias y similitudes con los rangos reportados en la literatura. Es así como, los porcentajes de ceniza y de extracto etéreo, fueron más bajos, respecto a los reportados por Romero C. y Vargas M. en 2005, lo que se atribuye a las condiciones de trópico-seco que presenta nuestra región y a la textura del suelo. En cuanto al porcentaje de humedad, este se disminuyo para tener mejores condiciones de trabajo durante el proceso y en el almacenamiento.

6.2. Extracción Y Características Fisicoquímicas Del Aceite De La Semilla Molida Del Árbol Del Neem

Para la extracción y caracterización fisicoquímica del aceite de la semilla molida del árbol del Neem se describieron los resultados obtenidos a partir del desarrollo experimental de este trabajo y que permitieron establecer una optimización del proceso de extracción de aceite de la semilla molida del árbol del Neem.

Con esta extracción se pudo observar y determinar por medio de pre-ensayos y otros trabajos realizados de extracción de aceite de semillas oleaginosas que el número indicado de reflujos para el experimento de extracción en el equipo soxhlet era cuatro, teniendo constante la cantidad de muestra (40 g) y la temperatura (60 63ºC). Para cada reflujo el tiempo de extracción fue de aproximadamente de 90 minutos; esto nos muestra la influencia en el número de reflujos en el porcentaje de grasa extraído.

Se extrajo la cantidad necesaria de aceite para determinar cada una de las características fisicoquímicas.

En el Cuadro Nº 8, se presenta un paralelo de comparación en el cual aparecen registrados los análisis fisicoquímicos que se le realizaron al aceite en este estudio

69

comparándolos con los obtenidos por Romero C. y Vargas M. en la Universidad de Carabobo-Venezuela en 2005.

Cuadro Nº 8. Características Fisicoquímicas Del Aceite De La Semilla Del Árbol Del Neem

PROMEDIO PARÁMETRO (Investigadores, 2008)

PROMEDIO (Romero C. y Vargas M. en 2005)

Densidad (g/cm3) % Acidez (Ácido Oleico) Punto De Saponificación Color pH

0.86 0.44

0.94 0.22

191.18

195

Amarillo 5.14

Amarillo -

Se puede analizar que los resultados obtenidos tienen muchas similitudes con los obtenidos en Venezuela por Romero C. y Vargas M. en 2005. El valor de acidez establece la cantidad de ácidos grasos originados por la lipólisis de los triglicéridos que forman al aceite; en este sentido, se afirma que el aceite de Neem evaluado no ha experimentado hidrólisis acentuada, por lo que la presencia de ácidos grasos libres es alta, lo cual está relacionado con el bajo contenido de humedad de la semilla y del buen proceso realizado. El valor de acidez libre (0,44 g de ácido

70

oleico/100 g de aceite) estuvo dentro de los límites establecidos por la Normativa Técnica Colombiana (NTC) para aceites vegetales. En cuanto a los valores de punto de saponificación, densidad y color son bastante parecidos a los reportados por la literatura sobre todo por Romero C. y Vargas M. en 2005.

6.3. Características Fisicoquímicas De La Semilla Desengrasada O Torta Del Árbol Del Neem

Para la determinación de las características fisicoquímicas de la Torta de la semilla del árbol del Neem se tuvieron en cuenta los parámetros más importantes, arrojándonos que la Torta de semillas del Neem, tienen un alto porcentaje de proteína y fibra Bruta, lo que es muy interesante ya que podría ser utilizada como un subproducto nutritivo. Los otros parámetros analizados, observados en el Cuadro Nº 9, nos arrojaron condiciones aceptables de la Torta o semilla desengrasada, observando que la acidez disminuyo con relación a la semilla sin desengrasar, esto por el hecho que ya el aceite no se encuentra presente y este contiene altos índices de acidez. El porcentaje de ceniza aumento un poco con relación a la semilla sin desengrasar, lo que nos indica que hay mas concentración de minerales; por otro lado el pH disminuyo porque ya no hay aceite en la semilla molida.

Cuadro Nº 9. Características Fisicoquímicas De La Semilla Desengrasada o Torta Del Árbol Del Neem

PARÁMETRO % Proteína % Fibra Bruta

PROMEDIO 21.70 32.07

71

Alcalinidad (ppm Ca) % Cenizas % Acidez (Ácido Oleico) pH Color Calcio (ppm)

11.71 3.28 0.10

5.23 Marrón 1.886

Fuente: Investigadores, 2008.

6.4. Extracción Del Extracto Presente En La Torta A continuación se detallan los tratamientos ejecutados a la semilla molida desengrasada del árbol del Neem. Se mantuvieron constantes la temperatura, la cantidad de muestra y el número de reflujos.

Cuadro Nº 10. Tratamientos A La Semilla Molida Desengrasada Del Árbol Del Neem Cantidad De Etanol (ml) 300 310 320

Secuencia

Número De Corrida

1 2 3

4 17 9

72

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

13 1 18 7 5 10 20 19 15 2 11 21 3 16 12 6 8 14

280 330 300 270 290 310 280 290 330 320 300 270 310 320 290 280 330 270

73

En el siguiente cuadro se observa cada uno de los resultados de los tratamientos que se realizaron para la obtención del extracto presente en la semilla desengrasada del árbol del Neem. También se observa que el mayor porcentaje de extracto se obtiene con 300 ml de etanol.

Cuadro Nº 11. Datos Finales Del Experimento Del Porcentaje De Extracto Presente En La Semilla Desengrasada Del Árbol Del Neem Cantidad De Etanol (ml) 330 320 310 300 290 280 270 Observaciones 1 23.97 25,03 26.56 28.89 25.68 23.77 22.46 2 23.92 25.10 26.80 28.85 25.78 23.80 22.39 3 23.91 24.98 26.67 28.83 25.70 23.76 22.42 Total 71,80 75,11 80,03 86,57 76,16 71,33 67,26 528,26 Promedio 23,9333 25,0367 26,6767 28,8567 25,72 23,7767 22,4233 25.2033

6.4.1. Análisis De Varianza Para El Diseño Unifactorial Con la ayuda del software estadístico Statgraphics 5.1, se realizó el análisis de varianza ANOVA para el diseño unifactorial con tres repeticiones planteado.

74

Cuadro Nº 12. Análisis De Varianza Del Porcentaje De Extracto Presente En La Torta

Fuente De Variación CE Error Total

Suma De Cuadrados

Grados Libertad

Media De Cuadrados

Fo

F Tabla

81,5669 0,049 81,6159

6 14 20

13,5945 0,0035

3884,14

0,0000

Del análisis de varianza se puede observar claramente que la media de los cuadrados entre tratamientos (13,5945) es mucho mayor que la media de

cuadrados dentro de los tratamientos (0,0035), lo que indica que es improbable que las medias de tratamientos sean iguales, por tal razón al calcular Fo y compararla con las F de tabla, esto es 3884,14 > 0,0000 al 5%, lo que hace concluir que existen diferencias significativas entre las medias de las seis variables al 95% de confiabilidad.

Para determinar exactamente cuál de ellas es diferente, se realizó una comparación entre las medias de los tratamientos por el método de mínima diferencia significativa, ya que es una prueba muy eficiente para detectar diferencias verdaderas en las medias.

75

Cuadro Nº 13. Método De La Mínima Diferencia Significativa (LSD)
Método: 95,0 % LSD % Extracto 270 280 330 320 290 310 300 Contrastes 330 – 320 330 – 310 330 – 300 330 – 290 330 – 280 330 – 270 320 – 310 320 – 300 320 – 290 320 – 280 Datos 3 3 3 3 3 3 3 Media 22,4233 23,7767 23,9333 25,0367 25,72 26,6767 28.8567 Diferencia *-1,10333 *-2,74333 *-4,92333 *-1,78667 *0,156667 *1,51 *-1,64 *-3,82 *-0,683333 *1,26 Limites +/0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 Grupos Homogéneos X X X X X X X

76

320 – 270 310 – 300 310 – 290 310 – 280 310 – 270 300 – 290 300 – 280 300 – 270 290 – 280 290 – 270 280 – 270

*2,61333 *-2,18 *0,956667 *2,9 *4,25333 *3,13667 *5,08 *6,43333 *1,94333 *3,29667 *1,35333

0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 0,103603 0,103603

* Denota Una Diferencia Significativa.

En el cuadro Nº 13 se muestra un procedimiento de comparación múltiple para determinar las medias que son significativamente diferentes unas de otras. La mitad inferior de la salida muestra la diferencia estimada entre cada par de medias. El asterisco (*) que se encuentra al lado de los 21 pares, indica que éstos muestran diferencias estadísticamente significativas a un nivel de confianza 95,0%. En la parte superior del cuadro, se identifican 7 grupos no homogéneos según la alineación del signo X en la columna. El método actualmente utilizado para discernir entre las medias es el procedimiento de las menores diferencias significativas de Fisher (LSD). Con este método, hay un 5,0% de riesgo de

considerar cada par de medias como significativamente diferentes cuando la diferencia real es igual a 0.

77

Figura Nº 13. Graficas De Las Medias Al 95% Con LDS

En la Anterior Figura se puede observar de una manera ilustrada que evidentemente los porcentajes de Extracto etanólico de la semilla desengrasada del árbol del Neem varían uno con respecto del otro. Cuando la cantidad de etanol llega a un punto de 300ml (punto óptimo), es en donde la cantidad de extracto soluble en etanol se satura o el solvente llega hasta la máxima capacidad de adsorber el extracto y por ello cuando se le adiciona más cantidad de etanol este comienza a disminuir ya que no tiene más extracto que solubilizar.

6.4.2. Método De Análisis De Media Utilizando la tabla de medias se determino el error estándar entre estas para conocer los límites más bajos y más altos alrededor de la media de cada tratamiento. En el siguiente cuadro se muestra estos datos:

78

Cuadro Nº 14. Medias Con El 95% De Confianza Entre Intervalos LSD Método: 95,0 % LSD Error Estándar Datos 330 320 310 300 290 280 270 Frecuencia 3 3 3 3 3 3 3 Media 23,9333 25,0367 26,6767 28,8567 25,72 23,7767 22,5367 (s Agrupada) 0,054292 0,054292 0,054292 0,054292 0,054292 0,054292 0,054292 Limite Inf. 23,851 24,9543 26,5943 28,7743 25,6377 23,6943 22,4543 Limite Sup. 24,0157 25,119 26,759 28,939 25,8023 23,859 22,619

Total

21

25,2195

En este cuadro se muestra la media para cada columna de datos. También muestra el error estándar de cada media, que es la medida de su variabilidad en la muestra. El error estándar (s) es el resultado de dividir la desviación típica agrupada por la raíz cuadrada del número de observaciones en cada nivel. De esta tabla se puede observar los límites inferiores y superiores que presentan los tratamientos de acuerdo al valor calculado alrededor de su media. Los intervalos mostrados actualmente se basan en el procedimiento de las menores diferencias significativas de Fisher (LSD). Se construyen de tal manera que si dos medias son iguales, sus intervalos tendrá un intervalo de confianza del 95,0%.

79

Figura Nº 14. Análisis De Las Medias En la Figura Nº 14 se puede observar como las medias de los tratamientos con 330ml, 320ml, 280ml y 270ml de cantidad de etanol se encuentran por debajo de la media de las medias de los tratamientos, dejando ver de una manera mas detallada que el tratamiento con 310ml, 300ml y 290ml de cantidad de Etanol son los que producen un mejor resultado, estando estos distante de los otros resultados en especial con el tratamiento de 300ml, además en las rayas rojas se ven representados los limites máximos y mínimos de la media de las medias y aun la media del tratamiento con 300ml es superior al limite máximo calculado (28.85 > 25.37).

Por lo tanto, teniendo en cuenta los resultados arrojados por el diseño y ensayos realizados, se escogió trabajar con 300ml de etanol en la cámara de reflujo, manteniendo constante la cantidad de muestra y temperatura. Al extracto obtenido se le realizaron diferentes determinaciones fisicoquímicas y un perfil de componentes. También se le realizo una determinación de la cantidad de Azadiractina (Compuesto activo del Neem) por medio de cromatografía liquida de alta resolución (HPLC).

80

6.5. Características Fisicoquímicas Del Extracto Presente En La Torta

En el análisis realizado por Cromatografía de Gases (GC) se identificaron los compuestos presentes con base en sus espectros de masas, usando la base de datos de NIST, Wiley y Adams. En el Cuadro Nº 10 se reportan la identificación y la cantidad relativa (%) de los componentes presentes en el extracto etanólico de la semilla desengrasada del árbol del Neem. Este extracto también fue analizado en modo de barrido completo de radiofrecuencia (full scan).

Cuadro Nº 15. Cantidad Relativa (%) De Los Componentes Presentes En El Extracto Etanólico De La Semilla Del Árbol Del Neem Nº Pico tR, min Cantidad Relativa %

Identificación

1 2 3 4 5

11,27 12,99 26,29 29,50 50,73

2,3 - Butanodiol Furfural 3-Hidroxi-2,3-dihidromaltol 5-Hidroximetil-2-furancarboxaldehído Ácido hexadecanoico Ácido octadecanoico + hexadecanoato de etilo Ácido octadecenoico

2,60 2,72 9,09 77,10 1,26

6

51,46

4,26

7

54,29

2,96

81

El análisis realizado por Cromatografía Líquida de alta resolución HPCL identificó el contenido de azadiractina expresado en porcentaje. Para esta identificación el Laboratorio de Análisis Instrumental de la Universidad Nacional De Colombia Sede Medellín utilizó dos metodologías. El método 1 fue tomado de la tesis de maestría “Efecto antialimentario de los extractos de suspensiones celulares de Azadirachta indica sobre Spodoptera frugiperda J.E. Smith en condiciones de laboratorio” Jacqueline Capataz Tafur et al y el método 2 fue tomado del artículo “Determinación de azadirachtina por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) en semillas del árbol del Neem (A. indica) cultivadas en Colombia”. Vitae. Revista de la Facultad de Química Farmacéutica. Universidad de Antioquia. Vol 9 Número 1. Año 2002. Págs. 59-63.

De acuerdo al método 1, la Azadirachtina presente debía aparecer a los 4.8 minutos y según el método 2 ésta debía salir a los 9.14 minutos. El cromatograma 1 presento que al inicio del informe no registra un pico característico en el tiempo estipulado. Esto debido a que no se había completado la extracción total de Azadiractina del extracto enviado. Por consiguiente fue necesario que el laboratorio completara la extracción utilizando como base el artículo “Determinación de azadirachtina por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) en semillas del árbol del Neem (A. indica) cultivadas en Colombia”. Vitae. Revista de la Facultad de Química Farmacéutica. Universidad de Antioquia. Vol 9 Número 1. Año 2002. Págs. 59-63. Lo anterior permitió que el cromatograma 2 mostrara un pico característico de la Azadirachtina proporcionando un porcentaje de área de 20.1620% y un contenido de Azadirachtina expresada en un porcentaje del metabolito activo del 0.25% (± 0.01%).

82

Figura Nº 15. Cromatograma Para Extracto De Semilla Del Árbol Del Neem Empleando El Método 2. El intervalo de concentración de Azadiractina en las muestras analizadas de semilla de Neem en el departamento del Cesar es inferior si se compara con datos reportados41 de la localidad de Girardot (0.29%), Indonesia (0.47%), Nicaragua (0.47%), Togo (0.40%) e India (0.35%) y es superior a regiones como Nigeria (0.15%) y Sudan (0.19%).

También se realizaron pruebas fisicoquímicas al extracto obtenido de la Torta o semilla desengrasada de Neem. Estos resultados se muestran el siguiente cuadro:

41

Schmutterer H. Natural Pesticidas From The Neem Tree (Azadirachta Indica A. Juss) and Other Tropical Plants. Third International Neem Conference. Nairobi, Kenya. 1986, Pag. 157 – 160.

83

Cuadro Nº 16. Características Fisicoquímicas Del Extracto Presente En La Torta

PARÁMETRO Densidad (g/cm3) % Acidez (Ácido Oleico) Alcalinidad (ppm Ca) pH Color

PROMEDIO 1.135 3.843

20.94 4.51 Vinotinto

Fuente: Investigadores

6.6. Características Fisicoquímicas Del Sólido Agotado

El sólido agotado es aquel bagazo que queda después de haber extraído el aceite y el extracto de las semillas molidas del árbol del Neem. A este bagazo se le realizaron una serie de análisis para determinar que se podría hacer agroindustrialmente con él; arrojándonos que este contiene altos porcentajes de fibra y proteína lo que nos indica que podría ser utilizado para realizar un subproducto nutricional para la industria animal.

En cuanto al análisis de pH este se presento más alto que el de la semilla molida y Torta, lo que es bueno ya que se puede trabajar con concentraciones de hidrógenos que tienden más a la neutralidad. En el cuadro No. 15 se presentan algunas características analizadas en el sólido agotado.

84

Cuadro Nº 17. Características Fisicoquímicas Del Sólido Agotado

PARÁMETRO % Fibra Bruta % Proteína pH

PROMEDIO 42.69 20.3 5.90

Fuente: Investigadores

85

7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

En este trabajo se obtuvieron datos experimentales de las semillas del árbol del Neem sembrados en los municipios de Valledupar, La Paz y Agustín Codazzi del departamento del Cesar, como parte del deseo de estimular el aprovechamiento de la naturaleza como equilibrador de ella misma, estableciendo información previa que permita mirar la viabilidad de la utilización de este árbol como fuente natural para el desarrollo como biocida.

El fruto del árbol de Neem presento características dimensionales similares a las encontradas en otras partes del mundo. El estudio realizado se presento con el fin de conocer con claridad las diferencias que pudieran tener estos frutos con relación a los de otras partes.

El buen tratamiento en el almacenaje de la semilla molida contribuye a optimizar el desarrollo de la investigación, pues da una mejor confiabilidad y exactitud en las mediciones del proceso, cuyos resultados así reflejan con claridad la calidad de estos estudios.

Por medio de la determinación de las características fisicoquímicas de la semilla del árbol del Neem se pudo establecer que los resultados obtenidos se encuentran dentro de los datos reportados de C. Romero y M. Vargas en 2005, es decir, no presentaron diferencias significativas, con la excepción de los porcentajes de extracto etéreo y cenizas. No obstante es primordial observar que estas características fisicoquímicas dependen mucho del tipo de suelo, medio ambiente y climatología que presente la zona de estudio.

86

Por otro lado la extracción del aceite por medio de solvente (hexano) se realizó a través de un sistema que presenta un montaje en el equipo soxhlet en el que se pueden controlar sin ningún problema algunas variables que afectan este tipo de extracción (Cantidad de Muestra, Número de reflujos y Temperatura); sin embargo, se recomienda otros sistemas en los que la cantidad de muestra no este en contacto con el solvente (Anhídrido Carbónico (C02) con presión) para no obtener en el aceite y la semilla desengrasada o torta residuos de solvente.

El aceite presento características similares a los de otros trabajos de investigación realizados, pero en cuanto a su rendimiento este disminuyo, presentando un porcentaje de aceite del 18.02%. En comparación a extracciones realizadas a otras semillas oleaginosas este porcentaje es alto, lo que hace viable la utilización del aceite para el aprovechamiento agroindustrial. El bajo rendimiento de esta semilla en la zona de estudio puede deberse a causas climatológicas y al tipo de suelo que presenta esta zona de nuestro país.

Se presenta el aceite del árbol del Neem, a través de las pruebas fisicoquímicas realizadas, como una alternativa para un potencial uso en la industria de los jabones, por el alto punto de saponificación que este aceite presenta.

La semilla desengrasada o torta presenta altos porcentajes de proteína (21.7%) y fibra cruda (42.69%). Se puede evaluar el incluirla en las dietas para animales, aves y medir sus efectos en el desarrollo de estos. Es fácil almacenarla y su calidad no se pierde en la misma, tampoco es susceptible de ser atacado por hongos.

87

Para la extracción del extracto presente en la semilla desengrasada o torta del árbol del Neem por medio de solvente etanólico, se presenta un sistema sencillo en el que se pueden controlar sin ningún problema la mayoría de variables que afectan este tipo de extracción (Cantidad de muestra, cantidad de solvente, numero de reflujos y temperatura); sin embargo, se recomienda otros sistemas en los que se puedan controlar de igual manera otras variables (agitación, presión) que puedan aumentar la velocidad de extracción y el rendimiento del extracto etanólico.

En cuanto al rendimiento del extracto etanólico obtenido de la torta por medio del montaje en el equipo soxhlet, se pudo observar que trabajar con cantidades de etanol al 96% de 310ml y 290ml pueden ser rentable dado las grandes cantidades de extracto que se pueden obtener, sin embargo se puede concluir que lo ideal para trabajar con el montaje en el equipo soxhlet es con una cantidad de etanol al 96% de 300ml con 10g de muestra. Se recomienda trabajar con temperaturas que no sean superiores al punto de ebullición del etanol, ya que esto puede incurrir en daños en las sustancias activas que el extracto presenta.

La concentración de la cantidad de Azadiractina en el departamento del Cesar fue de 0.25%, intervalo de concentración mayor si se compara con datos reportados en regiones como Nigeria (0.15%), y Sudan (0.19%), y es inferior a Indonesia (0.47%), Nicaragua (0.47%), Togo (0.40%) e India (0.35%). En Colombia – Girardot, se obtuvo una concentración del 0.29%. Esto se debe a las condiciones climáticas y propiedades del suelo de un nuestra región, por otro lado se recomienda que se estudie la cantidad de Azadiractina que presentan estas semillas de otras partes del país y que se apliquen a nivel de campo observar su efecto antialimentario sobre diferentes insectos y plagas de cultivos.

88

Por otra parte el estado de madurez en que se recolecte el fruto es ideal para una buena producción de Azadiractina, por eso se deben recolectar los frutos más o menos a los 120 a 130 días después de la floración cuando estos completen su estado de madurez fisiológica, ya que es aquí donde se produce mayor cantidad de este compuesto activo.

En futuras investigaciones se recomienda hacer pruebas de campo, para ver el efecto de los extractos etanolicos en condiciones reales de aplicación. También se sugiere continuar con la búsqueda de los compuestos químicos en extractos de las semillas de árbol del Neem (Azadirachta indica), a fin de incluirlos en control integrado de plagas.

89

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93

ANEXOS

94

ANEXO A. Fotografías De Todo El Proceso De Caracterización De Los Extractos De La Semilla Del Árbol Del Neem En El Departamento Del Cesar

95

96

97

98

99

Anexo B. Determinación De La Composición Química De Un Extracto Etanólico, Por Cromatografía De Gases Con Detector Selectivo De Masas (GC-MC)

100

101

102

103

104

105

ANEXO

C.

Determinación

Azadiractina

Del

Extracto

Etanólico,

Por

Cromatografía Líquida De Alta Resolución HPCL

106

107

108

109

Anexo D. Nombre Químico (IUPAC), Estructura, Uso Y Toxicidad Para El Organismo Y El Medio Ambiente

110

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