ASPECTOS PRTICOS NA REALIZAO DO HEMOGRAMA

ANTICOAGULANTES
EDTA (TAMPA ROXA) Atua em nvel do on clcio (seqestrador). Principal uso em hematologia. O sangue colhido com anticoagulante deve ser cuidadosamente homogeneizado por inverso de no mnimo 8 vezes para evitar hemlise e a coagulao do sangue. Verificar sempre o volume correto de material para cada tubo. O anticoagulante preferido para hemograma um dos sais do EDTA. Tm sido usados o K2EDTA, o K3EDTA e o Na2EDTA. O recomendado pelo International Committee (ICSH) o K2EDTA, tanto em forma seca como em soluo, em concentrao nal entre 1,5 e 2,2 mg/mL. A soluo tem a vantagem de permitir uma mistura mais rpida e uma menor freqncia de coagulao indesejada; em tubos a vcuo, a parede coberta pelo EDTA, e a mistura lenta no problema. Ao usar-se o EDTA em soluo, algumas determinaes so afetadas pela diluio, principalmente se for coletado um volume escasso de sangue. O excesso de EDTA tem efeito prejudicial na morfologia dos eritrcitos em distenses coradas. O Na2EDTA menos solvel do que os sais potssicos; o K 3EDTA causa desidratao dos eritrcitos e baixa o micro-hematcrito. Eritrcitos, leuccitos e plaquetas so estveis em sangue total com EDTA por at 24 horas. O esfregao sangneo deve ser feito dentro de 3 horas aps a coleta do sangue. Os tubos EDTA so utilizados para anlise de sangue total em laboratrios clnicos. Muitos laboratrios usam instrumentos de contagem de glbulos com um dispositivo aspirador das amostras, que perfura as tampas de borracha e reduz a indesejvel manipulao do sangue. Para us-los, h necessidade de escolha de tubos com rolha de borracha apropriada, que no vaze pelo orifcio. CITRATO DE SDIO (TAMPA AZUL) Captao dos ons clcio. Principal uso: estudos da coagulao Os tubos para coagulao contm em seu interior, soluo tamponada de citrato trissdico a 0,129 mol/l (3,8%). A hemodiluio consiste em 1 parte de citrato para 9 partes de sangue. TUBO SECO (TAMPA VERMELHA) Principal uso: bioqumica e sorologia e demais exames que necessitam de soro Os tubos para bioqumica e sorologia so revestidos internamente com partculas de slica micronizada, as quais ativam a coagulao quando os tubos so gentilmente invertidos.Os tubos para sorologia com gel contm uma barreira de gel presente no fundo do tubo. Este material possui densidade intermediria entre o sangue coagulado e o soro. Durante a centrifugao, a barreira de gel move-se para cima posicionando-se entre o soro e o cogulo, onde forma uma barreira estvel, separando o soro dos outros componentes celulares. O soro pode ser utilizado diretamente do tubo de coleta, eliminado a necessidade de

transferncia para outro recipiente. Esta barreira permite a estabilizao da maioria dos parmetros no tubo primrio, sob as condies de armazenamento recomendadas, por at 48 horas.

INTERFERENTES (ERROS) NA COLETA

HEMOCONCENTRAO

Demora no garroteamento aumento dos analitos no permeveis parede do vaso

HEMLISE

Liberao de constituintes intracelulares que provocam interferncias nas anlises Causas:

Venopuno traumtica/demorada Forte presso de aspirao do sangue Forte presso no esvaziamento da seringa Formao de bolhas/espuma Ressecamento do sangue na parede do tubo

MACRO E MICROCOGULOS

Incio de coagulao indesejada Causas:

Venopuno traumtica/mltipla Demora no preenchimento da seringa Demora no esvaziamento da seringa Relao sangue/anticoagulante inadequada muito sangue para pouco anticoagulante

PUNO MLTIPLA
Sobreposio do material Liberao de interferentes teciduais Hemlise

FALTA DE HOMOGENEIZAO DO SANGUE NO TUBO

Ao inadequada do anticoagulante no tubo de coleta

PREPARO DE DISTENSO DE SANGUE

A distenso de sangue para exame microscpico pode ser feita de sangue sem anticoagulante (sangue nativo) venoso ou capilar ou de sangue anticoagulado com 2

EDTA. A quelao do clcio pelo EDTA impede a agregao plaquetria, fazendo com que as plaquetas se distribuam de modo homogneo na distenso e seu nmero possa ser estimado microscopia (Figura 1). Distenses de sangue capilar mostram agregao plaquetria proeminente (Figura 2) e de sangue venoso nativo mostram pequenos agregados (Figura 3). Distenses de sangue nativo venoso ou de sangue capilar so isentas de artefatos provocados pela conservao e pelo anticoagulante. Alguns laboratrios ainda usam essas distenses como rotina; entretanto, o uso obrigatrio para investigar alteraes como a crenao dos eritrcitos ou a agregao de leuccitos ou plaquetas, que pode ser induzida pela conservao ou pelo EDTA. Por outro lado, distenses feitas quando o sangue anticoagulado chega ao laboratrio tm a vantagem de mostrar artefatos que inuenciaro a validade dos resultados dos contadores eletrnicos, como a presena de lamentos de brina, agregados plaquetrios ou crioaglutinao dos eritrcitos. A boa prtica laboratorial inclui a anotao da data e da hora da chegada da amostra e a distenso de lmina imediatamente aps o recebimento. Desse modo, ca registrado o tempo decorrido em trnsito e pode ser conrmada a atribuio de alteraes morfolgicas ao armazenamento prolongado de sangue anticoagulado com EDTA.

Figura 1 - Distenso feita com sangue anticoagulado pelo EDTA, mostrando a distribuio uniforme das plaquetas

Figura 2 - Distenso feita com sangue capilar no-anticoagulado, mostrando a agregao plaquetria que habitualmente ocorre

Figura 3 - Distenso feita com sangue no-anticoagulado, mostrando pequeno grau de agregao plaquetria

DISTENSO MANUAL EM LMINA

As lminas de vidro devem estar limpas e desengorduradas; no podem ser porosas, pois isso aumenta a colorao de fundo. necessria uma lmina distensora com quinas cortadas para que a distenso seja mais estreita do que a lmina. Se for prevista uma cobertura com lamnula, a lmina distensora tambm deve ser mais estreita do que a 4

lamnula, para que esta cubra os bordos da distenso e seja facilmente examinada ao microscpio. Uma distensora com bordas lisas bem mais fcil de manipular preparada lapidadando-as. Distensoras de acrlico so disponveis comercialmente e apresentam tima manuseabilidade. O laboratorista que distende as lminas deve usar luvas. Uma gota de sangue (nativo ou anticoagulado) colocada prximo extremidade da lmina. Sangue anticoagulado, de frascos com rolha, pode ser retirado com um tubo capilar descartvel. A lmina distensora aplicada a um ngulo de 25 a 30 na frente da gota de sangue e recuada at toc-la. Uma vez espalhado o sangue ao longo da borda posterior da distensora, esta impelida para a frente com um movimento suave e uniforme, de modo a distender uma na pelcula de sangue sobre a lmina. Se o ngulo da distensora for muito obtuso, ou o movimento muito rpido, a distenso ser muito curta. O operador experiente aprende a diferenciar o sangue com hematcrito (Hct) acima do normal, que viscoso e exige um ngulo mais agudo para distenses satisfatrias, do sangue com baixo Hct, que requer um ngulo mais obtuso. A tcnica de distenso deve produzir uma pelcula de sangue com uma cauda reta; uma distenso em forma da impresso de um polegar far o observador moverse de uma rea tima para identicao das clulas para outras reas demasiadamente espessas. importante limpar a distensora com um pano seco ou com gaze aps cada utilizao, caso contrrio podero ser transferidas clulas de uma distenso para outra (Figura 4).

Figura 4 - Clulas blsticas de um paciente com leucemia aguda inadvertidamente transferidas para a lmina de outro paciente pelo uso de um distensor limpo de modo inadequado.

 medida que as distenses so feitas, devem ser rotuladas com o nome do paciente e a data, ou com um nmero de identicao. Quando em pequeno nmero, as lminas podem ser rotuladas com pela escrita a lpis na parte espessa da distenso. Lminas opacicadas nas duas faces de uma extremidade so prticas, pois evitam a perda de tempo na escolha da face que deve ser voltada para cima. A secagem das lminas deve ser rpida; um ventilador, comum ou com ar aquecido, til para esse m. Se as distenses secarem lentamente, haver contrao das clulas, com apario de bolhas e vilosidades citoplasmticas, linfcitos bipolares, ncleos hipercromticos e desapario dos nuclolos. Essas alteraes podem ocorrer tanto em clulas normais como em clulas neoplsicas, de modo a torn-las inaparentes.

FIXAO, COLORAO E MONTAGEM

Fixao em metanol, podendo ficar at 20 minutos. Atraso na fixao provoca alteraes na cor, tendendo para o azul turqueza. Presena de gua provoca alteraes (artefatos) que simula hipocromia (Figura 5).

Figura 5 - Alteraes artefatuais produzidas pela pesena de 5% de gua no metanol usado para xao.

COLORAO
No h consenso entre os laboratrios quanto escolha do melhor corante, mas todos os corantes em uso baseiam-se no de Romanowsky, protozoologista russo do nal do sculo XIX. Trata-se de uma mistura do antigo azul-de-metileno e de eosina para corar o ncleo e o citoplasma do parasito da malria em prpura e azul, respectivamente.

Subseqentemente, Giemsa modicou o mtodo, combinando azur e eosina. O corante mais usado no Reino Unido uma combinao de corantes conhecida como May-GrnwaldGiemsa (MGG), enquanto na Amrica do Norte o de Wright, que contm azul-de-metileno policromado isto , aquecido de modo a produzir anlogos e eosina. No Brasil h um predomnio de corantes panticos ditos rpidos de onde o nmero de etapas varivel, podendo chegar apenas uma. s vezes, usada uma combinao Wright-Giemsa, que d melhores resultados. Demonstrou-se por cromatograa que os corantes preparados pelos mtodos qumicos tradicionais no so puros; eles so vendidos com a mesma denominao, mas contm mistura varivel de 5 a 10 corantes. H signicativa variao, inclusive entre lotes de um mesmo fabricante. Os componentes essenciais dos corantes de Romanowsky so um componente bsico (catinico), como o azur-B, que confere cor azul ou azul-violeta aos cidos nuclicos (xa-se aos grupos fosfato do DNA e do RNA), s nucleoprotenas, aos grnulos dos baslos e, fracamente, aos grnulos dos eosinlos, alm de um corante cido (aninico), como a eosina, que confere cor laranja hemoglobina e aos grnulos dos eosinlos e, combinando-se com protenas nucleares, contribui para a cor do ncleo. A combinao azur-B e eosina um corante de Romanowsky satisfatrio, da mesma forma que a mistura de azur-B, azul-de-metileno e eosina. Obtm-se uma colorao satisfatria e reprodutvel com corantes comerciais de boa qualidade e uma mquina automatizada de colorao. Tradicionalmente, o citoplasma que se cora em azul e os grnulos que se coram em prpura ditos baslos, enquanto os grnulos que se coram de violeta ou prpurarosado, azurlos. Na verdade, tais tonalidades so obtidas pela tomada de um nico corante bsico, como o azur-B ou o azur-A. Os termos acidlo e eosinlo referem-se captao do corante cido, eosina, embora acidlo seja costumeiramente usado para os componentes celulares que se coram de rosa, e eosinlo, para os que se coram de la ranja. A Tabela 1 mostra a variedade de cores que um corante de Romanowsky deve produzir. A colorao deve ser feita no pH correto. Quando o pH muito baixo, os componentes baslos no se coram de maneira adequada; os leuccitos ca m plidos, com grnulos eosinlos de um vermelho brilhante. Quando o pH muito alto, h captao excessiva do corante bsico, com uma colorao excessiva generalizada; torna-se difcil distinguir a policromatolia dos eritrcitos, os grnulos dos eosinlos coram-se em azul-escuro ou cinza e os grnulos dos neutrlos coram-se demais, simulando granulaes txicas. Solues de corantes podem necessitar de ltrao logo antes do uso para evitar depsito de corante na s distenses, o qual pode ser confundido com incluses nos eritrcitos. As mquinas automticas de colorao com tcnica de imerso, em que as lminas so integralmente mergulhadas no corante, fornecem melhores resultados do que as so mquinas que cobrem as lminas com uma na camada de corante, em posio horizontal; nestas h precipitao de grnulos de corante que dificultam a visualizao.

COLORAO CARACTERSTICA DE DIFERENTES COMPONENTES CELULARES COM CORANTE DE ROMANOWSKY Colorao dos componentes celulares Cromatina (incluindo os corpos de Howell-Jolly) Grnulos promielocticos e bastes de Auer Citoplasma dos linfcitos Citoplasma dos moncitos Citoplasma rico em RNA (isto , citoplasma baslo) Corpos de Dhle Grnulos especcos dos neutrlos, grnulos dos linfcitos, granulmero das plaquetas Grnulos especcos dos baslos Grnulos especcos dos eosinlos Eritrcitos Fonte: BAIN, Barbara J. B Cor

Prpura

Vermelho-purpreo

Azul Azul-acinzentado Azul-escuro

Azul-acinzentado Prpura-claro ou rosa

Prpura-escuro Laranja Rosa

BIBLIOGRAFIA
LIMA, A. O. et al. Mtodos de Laboratrio Aplicados Clnica. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1992. BAIN, Brbara. Clulas Sangneas. Artmed. Porto Alegre, 2001.