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FACULTAD DE QUÍMICA-UNAN DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL 1515 GRUPO 10 SEMESTRE 2014/2 EQUIPO: Hernández Pichardo
FACULTAD DE QUÍMICA-UNAN DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL 1515 GRUPO 10 SEMESTRE 2014/2 EQUIPO: Hernández Pichardo
FACULTAD DE QUÍMICA-UNAN DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL 1515 GRUPO 10 SEMESTRE 2014/2 EQUIPO: Hernández Pichardo
FACULTAD DE QUÍMICA-UNAN DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL 1515 GRUPO 10 SEMESTRE 2014/2 EQUIPO: Hernández Pichardo
FACULTAD DE QUÍMICA-UNAN DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL 1515 GRUPO 10 SEMESTRE 2014/2 EQUIPO: Hernández Pichardo

FACULTAD DE QUÍMICA-UNAN DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

FACULTAD DE QUÍMICA-UNAN DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL 1515 GRUPO 10 SEMESTRE 2014/2 EQUIPO: Hernández Pichardo

MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL 1515 GRUPO 10

SEMESTRE 2014/2

EQUIPO:

NOMBRE:

2

Hernández Pichardo Alejandra

NOMBRE:

Gutiérrez Ponce Ma. Teresa

07

PRÁCTICA No. NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

“Técnicas de aislamiento de microorganismos”

FECHA(S) DE REALIZACIÓN:

FECHA DEL REPORTE:

18 y 25/03/14

27/02/14

CALIFICACIÓN DEL REPORTE: REVISADO POR: COMENTARIOS GENERALES:
CALIFICACIÓN DEL
REPORTE:
REVISADO POR:
COMENTARIOS GENERALES:

1

Diagrama Experimental

hasta que esté líquido (~45°C)

  • con BHI

Calentar

2 tubos

Gram a tubo con muestra en todos los medios Localizar inoculados colonias aisladas y puras comprobar
Gram a
tubo
con
muestra
en todos
los medios
Localizar
inoculados
colonias
aisladas y
puras
comprobar
pureza
Gram
colonia
pura en
Resiem-
BHI
bra
Diagrama Experimental hasta que esté líquido ( ~ 45°C) con BHI Calentar 2 tubos Gram a
dilución agotamiento vertir en cajas
dilución
agotamiento
vertir en
cajas
YPMD y Sabourab en gaveta Inocular en los Incubar diferentes 24h/37° medios C Por cuadrante radial
YPMD y Sabourab
en gaveta
Inocular
en los
Incubar
diferentes
24h/37°
medios
C
Por cuadrante
radial (7)
medios)
1 asada en tubo 2 (de tubo 1) asada en tubo 1 (de muestra) 1 Gram
1
asada
en tubo
2 (de
tubo 1)
asada
en tubo 1
(de
muestra)
1
Gram
CONSERVAR
Incubar 24h/37 °C
Incubar
24h/37
°C

Cuadrante radial

siembra en caja Incubar 24h/37° C
siembra
en caja
Incubar
24h/37°
C
Diagrama Experimental hasta que esté líquido ( ~ 45°C) con BHI Calentar 2 tubos Gram a
  • ver

desarrollo

(pura)

incubar 24/37°C Simbra en tubo Estría ondulada
incubar
24/37°C
Simbra
en tubo
Estría
ondulada
  • comprobar pureza

2

Objetivos:

Conocer el tipo y fundamento de los diferentes medios de cultivo empleados.

Aplicar las técnicas aprendidas hasta ahora para el aislamiento de microorganismos con

características específicas. Obtener cultivos puros y comprobar la pureza de estos.

Utilizar técnicas de conservación para los cultivos puros obtenidos.

Analizar los nutrimentos que aportan los medios y relacionarlos con el tipo de necesidades de cada microorganismo para hacer una suposición del cultivo puro.

Resultados:

Tabla 1.1. Clasificación y características de los diferentes tipos de medios empleados.

 

NOMBRE

 

COMPOSICIÓN (en

TIPO

CARACTERÍSTICAS

 

gramos por litro de agua).

ADICIONALES

Agar Infusión de Cerebro y

Infusión

de

cerebro

de

Si se añade antibiótico

el

Se emplea para el cultivo

Corazón:BHI

ternera

7.5,

infusión

de

medio

se

hace

selectivo

de bacterias exigentes

corazón

de

res

10.0,

para hongos.

como Estreptococos,

glucosa

2.0,

peptona

de

Neumococos,

gelatina

10.0,

cloruro

de

Meningococos y otros. Por

sodio 5.0, di-Sodio Hidrógeno Fosfato

la adición de estreptomicina,

2.5.

gentamicina o cloranfenicol resulta un medio selectivo para hongos.

YPMD

Agar

20.0,

extracto

de

Selectivo

para

cultivo

y

La dextrosa es la fuente de

malta

3.0,

dextrosa

10.0,

aislamiento

de

levaduras,

energía para el crecimiento

extracto

de

levadura

3.0,

mohos

y

otros

de microorganismos. La

peptona 5.0

 

microorganismos

peptona y el extracto de

 

acidúricos.

levadura proporcionan factores de crecimiento y la fuente de nitrógeno. El extracto de malta debido a su elevado contenido en diversos carbohidratos, sobre todo en maltosa y dextrosa son la base para el crecimiento de mohos y levaduras.

Agar

Eosina

Azul

de

Eosina amarillenta 0.4, azul

Medio diferencial para el

y

Por la combinación de

Metileno:EMB

 

de metileno 0.065, lactosa 5.0, peptona bacteriológica 10.0,

aislamiento

diferenciación de bacterias entéricas Gram-negativas.

estos dos colorantes y los dos hidratos de carbono se pueden distinguir algunos

 

di-potasio

hidrógeno

géneros. Las

fosfato 2.0, sacarosa 5.0,

bacterias lactosa-negativas

agar 13.5.

 

y sacarosa negativas (Salmonella y Shigella) dan colonias incoloras, mientras que las lactosa y/o sacarosa-positivas dan colonias púrpura-violeta negruzco con/sin un centro

3

     

oscuro y quedan rodeadas de una zona incolora. Por el efecto de estos mismos colorantes también queda inhibido el crecimiento de bacterias Gram-positivas. También es posible la identificación de Candida albicans.

Agar Sabouraud

Agar

15.0,

dextrosa

40.0,

Selectivo

Para cultivo y conservación

peptona 10.0

 

de hongos patógenos y no patógenos, particularmente dermatofitos, levaduras y microorganismos acidúricos. Cuando los materiales en estudio presentan abundantes

 

contaminantes, aislamiento mejora si se

el

adiciona al medio de

cultivo

sustancias

antimicrobianas selectivas, como cicloheximida, penicilina y estreptomicina

antes de usarlo, inhibiendo de esta forma la flora

contaminante

que interfiera en el cultivo de

hongos.

Rosa de bengala

Agar 15.5, peptona de soya

Selectivo

Para aislamiento

 

y

5.0,

recuento

de

levaduras

y

cloranfenicol 0.1, rosa de

mohos.

La dextrosa

es

la

bengala 0.05, dextrosa

fuente

de energía

para

el

10.0,

crecimiento

de

fosfato monopotásico, 1.0,

microorganismos.

La

sulfato de magnesio 0.5

peptona

proporciona

factores de crecimiento y la fuente de nitrógeno. La presencia de

rosa de bengala en la base, suprime el crecimiento de bacterias y

restringe

el

tamaño

y

la

altura

de

las

colonias

de

mohos

de

crecimiento

rápido.

Esta

restricción

ayuda en el aislamiento de

mohos

de

crecimiento

lento

y

pueden crecer las

levaduras.

Con

la

adición

del

rosa

de

bengala

se

facilita el recuento de

 

mohos y levaduras. El

cloranfenicol

inhibe

el

crecimiento

de

bacterias

4

     

presentes

en

el

medio

ambiente y alimentos.

Tripteína Soya Agar: TSA

Tripteína 15.0, peptona de soya 5.0,

 

Medio

utilizado para

cloruro de sodio 5.0, agar

propósitos

generales,

15.0.

favorece

el

desarrollo

y

aislamiento

de

una

gran

variedad

de

microorganismos aerobios, y anaerobios facultativos y estrictos.

El agregado

de

sangre,

permite

el

aislamiento

y

cultivo de microorganismos

aerobios

y

anaerobios

nutricionalmente exigentes y la observación de reacciones de hemólisis.

Manitol Sal Rojo de Fenol:

Extracto de carne 1.0,

Medio de cultivo selectivo

Se trata

de

un medio

MSA

pluripeptona 10.0,d-

y diferencial, utilizado para

altamente selectivo debido

manitol 10.0, cloruro de

el

aislamiento

y

a

su

alta

concentración

sodio 75.0, agar 15.0, rojo

diferenciación

de

salina. Los

estafilococos

de fenol 0.025.

estafilococos.

coagulasa

positiva

 

hidrolizan

el

manitol

acidificando el medio; las

colonias

aparecen

rodeadas

de

una

zona

amarilla

brillante.

Los

estafilococos

coagulasa

negativos,

presentan

colonias rodeadas de una

zona roja o púrpura.

En el

medio

de

cultivo,

el

extracto

de

carne

y

la

pluripeptona,

constituyen

la

fuente

de

carbono,

nitrógeno,

vitaminas

y

minerales, el manitol es el

hidrato

de

carbono

fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en

alta

concentración)

es

el

agente selectivo, y el rojo

fenol es el indicador de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta

concentración

de

sal

y

fermentan

el

manitol,

producen

ácidos,

con

lo

que se modifica

el

pH

del

medio y vira el indicador de

pH

del

color

rojo

al

amarillo.

Agar Cetrimide

Cetrimida

magnesio,

0.3, cloruro de

1.4,

digerido

Medio

selectivo

para

Pseudomonas aeruginosa

como elemento inhibidor de una

La

Cetrimida

actúa

pancreático

de

gelatina

amplia

variedad

de

20.0,

sulfato

de

potasio

microorganismos,

de

tal

5

 

10,0,

 

manera que no

 

agar 13.6.

inhibiendo

el

crecimiento

de

las

Pseudomonas

aeruginosa

lo

hace con

otras

especies

de

Pseudomonas.

 

Además su acción

tensioactiva

 

produce

la

liberación del fósforo y del

nitrógeno

 

a

las

células

bacterianas distintas de

 

Pseudomonas

aeruginosa.

Por la presencia de cloruro

de magnesio y sulfato

de

potasio

se

favorece

la

producción de piocianina que dará al medio

coloración azul verdoso o marrón.

Algunas

 

especies

de

Proteus,

Klebsiella

y

Providencia

 

pueden

contaminar el medio.

 

Resultados del Gram inicial (Gutiérrez Ponce Ma. Teresa).

Microscopio: Z-13 Fecha: 18/03/14 Muestra: dilución en SSI Aumento: 1000veces Tinción: Gram Descripción: célula alargada con formas opacas dentro de ella; cocobacilos en fila formando espirales y curvas

10,0, manera que no agar 13.6. inhibiendo el crecimiento de las Pseudomonas aeruginosa sí lo hace

Resultados del Gram inicial (Hdz Pichardo Alejandra).

Microscopio: Z-13 Fecha: 18/03/14 Muestra: dilución en SSI Aumento: 1000veces Tinción: Gram Descripción: Bacilos largos y delgados morados aislados, bacilos cortos morados aislados, cocobacilos grandes morados, cocos morados de tamaño mediano formando redes irregulares, cocos rojos medianos formando redes irregulares.

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10,0, manera que no agar 13.6. inhibiendo el crecimiento de las Pseudomonas aeruginosa sí lo hace

Resultados de las observaciones macroscópicas del desarrollo presentado en los diferentes medios de cultivo (Gutiérrez Ponce Ma. Teresa).

BHI (25): observé sólo 1 tipo de colonia

pequeña, blanca, redonda, brillosa, elevada

EMB (17): al menos 3 colonias distintas; aislada sólo 1 planas con morado en el centro, brillosas y aspecto verde metálico en el centro

convexas, moradas-rosáceas y grandes, brillosas (blanquizcas en el centro) blancas, brillantes y pequeñas TSA (60): al menos dos tipos de colonias

colonias rosas, brillosas y translúcidas

colonias blancas, brillosas y translúcidas MSA (31): no observé crecimiento Cetrimida (11): no observé crecimiento Dilución

colonias pequeñas, blancas, brillosas, poco elevadas

Sabourab (55)

colonias irregulares, grandes, blancas, translúcidas con rosa intenso en el centro y otras pequeñas color rosa intenso, brillantes, redondas

YPMD (73): crecimiento de distintas colonias, al menos 4 ó 5 colonia naranja-rojizo, convexas, brillosas, medianas, más concentradas en el centro, redondas. colonias blancas, pequeñas, altas, opacas, redondas

colonias blancas, translúcidas, planas, irregulares

colonias amarillas, convexas, opacas, pequeñas

Resultados de las observaciones macroscópicas del desarrollo presentado en los diferentes medios de cultivo (Hdz Pichardo Alejandra).

BHI (25): 2 tipos de colonia Colonias pequeñas, blancas brillosas y elevadas Colonias amarillas, brillosas, pequeñas y con elevación.

EMB (17): Sólo 1 colonia aislada Colonia grande con elevación de color morado brilloso.

Se observó un crecimiento irregular elevado de color morado brilloso y en algunas partes con coloración verde metálico. TSA (60): al menos tres tipos de colonias

colonias pequeñas amarillas, brillantes y con elevación. colonias grandes blancas, brillosas y con elevación.

colonias medianas de color rojo, opacas y con elevación. MSA (31): 1 colonia.

colonia blanca brillante con elevación de tamaño pequeño.

7

Cetrimida (11): no observé colonias aisladas

Crecimiento irregular blanco brilloso con elevación.

Dilución

colonias pequeñas, blancas, brillosas y elevadas

Sabourab (55)

colonias pequeñas rosadas, opacas y planas.

presencia de un crecimiento blanco translúcido brilloso convexo y en algunas partes el crecimiento presenta una coloración rosada.

YPMD (73): crecimiento de 5 colonias distintas colonias pequeñas blancas y brillantes con elevación .

colonias rojo brillante (intenso en el centro y disminuye hacia los bordes) convexas de varios tamaños.

colonias blancas opacas, translúcidas, planas e irregulares

colonias amarillas, opacas, planas y pequeñas

Colonias de tamaño grande planas de color amarillo intenso.

Después de seleccionar una colonia aislada los resultados del Gram para el cultivo puro seleccionado son:

Observación al microscopio del cultivo puro (Gutiérrez Ponce Ma. Teresa).

Microscopio: 17 Fecha: 20/03/14 Muestra: Colonia de EMB Aumento: 1000veces Tinción: Gram Descripción: bacilos gram negativos.

Cetrimida (11): no observé colonias aisladas  Crecimiento irregular blanco brilloso con elevación. Dilución  colonias

Observación al microscopio del cultivo puro (Alejandra Hdz Pichardo).

Microscopio: 17 Fecha: 20/03/14 Muestra: Colonia de MSA Aumento: 1000veces Tinción: Gram Descripción: cocobacilos gram positivos formando redes irregulares.

Cetrimida (11): no observé colonias aisladas  Crecimiento irregular blanco brilloso con elevación. Dilución  colonias

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Después de sembrar la colonia en el medio BHI los resultados fueron:

Resultados de la siembra del cultivo puro (Ma. Teresa Ponce).

Observé colonias blancas, pequeñas, brillantes.

Microscopio: Z-10 Fecha: 25/03/14 Muestra: Colonia de cultivo puro en BHI. Aumento: 1000 veces. Tinción: Gram Descripción: bacilos gram negativos (varios agrupamientos).

Después de sembrar la colonia en el medio BHI los resultados fueron: Resultados de la siembra

Resultados de la siembra del cultivo puro (Alejandra Hdz Pichardo).

Observé colonias pequeñas, blancas, brillantes y con elevación.

Microscopio Z-10:

Fecha: 25/03/14 Muestra: Colonia de cultivo puro en BHI. Aumento: 1000 veces. Tinción: Gram Descripción: cocobacilos Gram positivos formando redes Irregulares.

Análisis de resultados:

Después de sembrar la colonia en el medio BHI los resultados fueron: Resultados de la siembra

Tomamos muestra que contenía distintos tipos de microorganismos (columna), la cual se diluyo en SSI, se realizó Gram inicial para poder apreciar los microorganismos presentes y ésta se inoculó en distintos medios de cultivo (por agotamiento) para evaluar selectividad de medios y también para aislar sólo un tipo de microorganismo dependiendo de sus necesidades nutrimentales y metabólicas. Se realizó también dilución para disminuir la carga microbiana. De los medios inoculados se identificaron colonias aisladas y puras y se comprobó pureza con Gram. Se resembró la colonia que se encontraba pura en BHI; se volvió a verificar pureza y se sembró de nuevo para poder tener mayor crecimiento de colonias aisladas y así lograr conservarlo después en tubo.

Como se puede apreciar al hacer la prueba de Gram a la muestra que obtuvo de la columna había en esta una amplia variedad de microorganismos tanto (+) y (-). En el primer caso se tomó una colonia pequeña

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blanca y brillosa del medio EMB el cual según la literatura se emplea como medio diferencial para el aislamiento y diferenciación de bacterias entéricas Gram negativas, lo cual concuerda con lo observado en el microscopio después de realizar la tinción de Gram (bacilos Gram negativos) lo segundo que se reporta en la literatura sobre las características macroscópicas del crecimiento en los medios es por la combinación de los colorantes y los hidratos de carbono se pueden distinguir las bacterias lactosa- negativas y sacarosa negativas (Salmonella y Shigella) dan colonias incoloras, mientras que las lactosa y/o sacarosa-positivas dan colonias púrpura-violeta negruzco con/sin un centro oscuro rodeadas de una zona incolora. Se sabe que Salmonella y Shigella son bacilos según la literatura, pero las características macroscópicas de las colonias observadas no corresponden del todo así que no se puede asegurar que sean estos microorganismos y sólo se puede decir que se aisló un bacilo Gram negativo lo cual era lo esperado para este medio. En el segundo caso se tomó una colonia blanca, brillosa, pequeña y con elevación del medio MSA, es importante decir que era la única colonia presente en el medio y a primera vista se puede suponer que puede que este no sea el medio adecuado del microorganismo, pero que de cierta forma pudo encontrar la forma de sintetizar algunos componentes para poner vivir; al realizar Gram a esta colonia se observaron cocobacilos Gram positivos, la literatura reporta que es un medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos, al ser diferencial se pueden conocer las actividades metabólicas de los microorganismos mediante de los indicadores que tiene el medio se sabe según la literatura que los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color y los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura pero las características macroscópicas de la colonia no presentan ninguna de estas características y lo más importante la morfología del microorganismo no encaja con lo esperado pues es un medio para estafilococos (racimos de uvas). Después de resembrar al microorganismo en el medio BHI el cual se sabe que es para bacterias exigentes como Estreptococos, Neumococos, Meningococos, se ve que la morfología que se presenta ahora es que son cocos Gram positivos, así que se hace la suposición que la primera morfología presentada se debe a que el desarrollo de la bacteria no es óptimo debido a los nutrientes del medio y se cree que puede tratarse de Estreptococos, Neumococos o Meningococos.

Conclusiones:

Los microorganismos necesitan de distintos nutrimentos y condiciones, por lo cual no todos presentaron crecimiento en los distintos medios ya que algunos son selectivos lo cual nos indica que hay elementos

que inhiben el crecimiento de otros microorganismos y en el caso de los diferenciales nos permiten saber un poco del metabolismo del microorganismo, en este caso mediante indicadores en el medio. Así mismo los microorganismos que se seleccionaron para estudiar fueron bacterias por su rápido crecimiento (hongos y protozoarios necesitan periodos más largos de incubación).

El proceso de siembra y observación se realiza para obtener un cultivo puro sólo se puede asegurar (en el caso de bacterias) realizando una tinción de Gram y observando al microscopio pues se puede tener colonias que aparentemente estén puras pero que en la realidad están contaminadas. Como ya se observó todo este proceso de aislamiento se logra mediante las buenas técnicas para el manejo, sembrado y

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conservación de los microorganismos pues evitar la contaminación es un punto importante, para obtener

buenos resultados, la prueba de un buen trabajo es un cultivo sin contaminación cuando se observa al microscopio.

Bibliografía:

Disponible en: http://www.dibico.com/fichast/1110.pdf consultado por última vez: 27/03/14 a las 1:39 am Disponible en: http://www.dibico.com/fichast/1139.pdf consultado por última vez: 27/03/14 a las 1:41 am Disponible en: http://www.dibico.com/fichast/1017.pdf consultado por última vez: 27/03/14 a las 1:43 am Disponible en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/manitolsalagar.htm consultado por última vez: 27/03/14 a las 1:48 am Disponible en: http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8771 consultado por última vez: 27/03/14 a las 1:50 am Pedro García Martos, et al, “Microbiología Clínica Práctica”, servicio de publicaciones universidad de Cádiz, España 1994 Cultimed: Manual Básico de Microbiología, I.C.T S.L

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