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LABORATORIO DE ANALISIS DE ALIMENTOS SEPARACIN DE PROTENAS

INTRODUCCIN Las protenas son sustancias orgnicas muy complejas presentes en toda la materia viva. Todas las protenas contienen adems de carbono, hidrgeno, tambin nitrgeno y a menudo azufre y fsforo. Todas las protenas se componen bsicamente de estructurales denominadas aminocidos unidos por enlaces provocando caractersticas especficas en cada una. Las propiedades de las protenas se ven afectadas por modificaciones en el p", la absorcin de protenas mediante intercambio inico depende del p", es decir de valores de p" por abajo del punto isoelctrico la carga neta de la protena es positiva y la molcula se ve absorbida con mayor fuerza en intercambiadores catinicos como la carbo#imetil celulosa sdica. $sta propiedad permite la separacin y la purificacin de protenas mediante cromatografa de intercambio inico. La movilidad de las molculas de protenas en un campo electrosttico tambin depende del valor de p". investigacin de protenas. OBJETIVOS $l estudiante identificar el p" isoelctrico de la casena. $l estudiante aprender a separar la clara del huevo en sus fracciones de globulina y alb&mina por el mtodo de precipitacin salina o salado. $l estudiante aprender a realizar una dilisis. $l estudiante conocer la prueba de 'uiret para la identificacin de protenas. $sta propiedad permiti desarrollar la tcnica de la electroforsis %ue es una de las ms utilizadas en la ! unidades peptdicos

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MATERIALES 9 tubos de ensayo. tubos de centrfuga de (!! ml. agitadores de vidrio. 'olsas para dilisis. Tela de manta de cielo o gasa )proporcionada por el alumno*. ( +atrz volumtrico de ,!! ml. ( -radilla ( .ollo de "ilaza )proporcionado por el alumno* Tijeras )proporcionadas por el alumno* ( molde para elaborar el %ueso )proporcionado por el alumno* +anta de cielo )proporcionada por el alumno* ( termmetro con escala de hasta !!/0 EQUIPO 1otencimetro. 0entrfuga. REACTIVOS 2oluciones de cido actico !.!(, !.( y (+. 0asena. 2ulfato de amonio. 2olucin de 3a4" (+. 2olucin saturada de sulfato de amonio. 2olucin de 3a0l !.(,+. 2olucin de 3a4" al !5. 2olucin de sulfato c&prico al !.,5. 6lcohol amlico. 7 8 huevos )proporcionados por el alumno*. 6gua destilada. Leche entera de vaca, cabra u oveja )proporcionada por el alumno* Tabletas de renina o cuajo 2al yodatada )de mesa, proporcionada por el alumno* 1.$16.609:3 ;$ L6 24L<09:3 ;$ 062$=36 1) $n un matraz volumtrico de ,!! ml. colo%ue ., g de casena. 2) 6dicione !! ml de agua destilada y un volumen de solucin de 3a4" )(+* %ue proporcione e#actamente !.!, moles de 3a4". 3) 6gregue unas gotas de alcohol amlico para disminuir la formacin de espuma.

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4) 6gite, disuelva y adicione una solucin de cido actico (+ %ue proporcione e#actamente !.!, moles de cido actico 5) 6fore a ,!! ml. con agua destilada. ;$T$.+93609:3 ;$L p" 924$L>0T.904 ;$ L6 062$=36 $l p" isoelctrico )baja solubilidad, carga neta igual a !* debe recordarse cuando se investiga sobre la separacin y purificacin de fracciones proticas. $#isten varios mtodos para la determinacin e#perimental del p" $n esta determinacin el p" donde se isoelctrico )p"9* de una protena. la casena. La casena est presente en la leche en forma de partculas coloidales o micelas y son fcilmente separadas por precipitacin isoelctrica. $l cuajado y la acidificacin son una prctica de la tecnologa de lcteos para la preparacin de productos de leche agria y algunos %uesos suaves. La acidificacin natural se lleva a cabo por inoculacin de la leche con iniciadores por ejemplo, cultivos de bacterias cido lcticas.

presenta la mnima solubilidad puede ser usado para estimar el p" isoelctrico de

1.40$;9+9$3T4 1) 1repare una serie de tubos como se indica? REACTIVO (volume e ml!" "4 "460 !.!(+ "460 !.( + "460 (.! + TUBO 8 B., D !., D NMERO , @ B.! A.! D D (.! .! D D

( B.8 !.@ D D

A.B (. D D

7 B.B D !. D

A ,.! D 8.! D

B (.! D B.! D

C A.8 D D (.@

2) 6gregue ( ml. de solucin de casena a cada muestra y mezcle inmediatamente cada ,! minutos. 4) Tabule los resultados e indi%ue el grado de precipitacin? minutos. 3) 4bserve la presencia o ausencia de turbidez en la mezcla a los (!, 7! y

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! E ning&n cambio. (F E opalecencia.

F

E notable opalecencia.

7F E precipitacin. 8F E marcada precipitacin. ,F E abundante precipitacin. 5) ;etermine el p" de cada tubo en el medidor de p". II. 1.$0919T609:3 26L936 4 26L6;4* La precipitacin salina o salado es uno de los mtodos de separacin de protenas de su estado natural )actividad biolgica*. $l sulfato de amonio es una de las sales ms utilizadas para la precipitacin salina de protenas. $s muy soluble )A@! g de sulfato de amonioH(!!! ml. de agua a una temperatura de !I0, temperatura promedio del laboratorio* y el in sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas inicas. $n esta determinacin la protena blanca del huevo )clara* ser separada en fracciones de globulina y alb&mina. 1.40$;9+9$3T4 $s recomendable trabajar en e%uipos de trabajo de 1) 2epare las claras y las yemas de 7 8 huevos. 2) 0ombine las claras y filtre a travs de una manta de cielo o gasa. 3) 0olo%ue , ml. de clara de huevo en un tubo de centrfuga y adicione , ml. de solucin saturada de sulfato de amonio, mezcle suavemente. 4) ;eje en reposo durante 7! minutos moviendo ocasionalmente. 5) 1ermita %ue sedimente y decante el l%uido sobrenadante. -uarde el precipitado y la fraccin sobrenadante. 6) .ealice una prueba de confirmacin de la presencia de protena en la muestra como se describe a continuacin? .$6009:3 ;$ '<9.$T a 7 personas. ;9G$.$3096L ;$ 1.4T$=362 )1.$0919T609:3

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0uando una solucin de protena fuertemente alcalina es adicionada a una solucin de sulfato de cobre se obtiene un color p&rpura. La reaccin es caracterstica de las sustancias %ue poseen dos grupos D3"D04D unidos directamente o separados por un tomo de carbono o de nitrgeno. 2e trata de una reaccin inducida por la unin peptdica pero tambin puede ocurrir en sustancias no proticas %ue posean tal estructura )ejemplo, la biurea o buiret*. 1.40$;9+9$3T42 1) 6dicione ml de solucin de 3a4" al !5 a ml. de la solucin de

prueba )la del paso , antes mencionada )fraccin sobrenadante*. 2) +ezcle y aJada gota a gota solucin de sulfato c&prico al !.,5. 3) 6gite constantemente hasta la formacin del color p&rpura. <n e#ceso de sulfato c&prico provocar la formacin de un precipitado de hidr#ido de sodio. 7) ;emuestre %ue el slido es globulina? a* 1ruebe la solubilidad en solucin de 3a0l !.(,+ b) Transfiera la solucin de 3a0l conteniendo la protena disuelta a una bolsa de dilisis y permita la dializacin durante la noche frente a ,!! ml de agua destilada. 4bserve y e#pli%ue TODOS los resultados.

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G4.+609:3 ;$ <3 -$L ;os de los geles proticos ms conocidos y presentes en alimentos son? gelatina casena coagulada )%ueso* $sta determinacin estudiar los principios de la fabricacin de %uesos en semejanza con la formacin de geles. 1.40$;9+9$3T4 (* 1ulverizar K tableta de renina y adicionarla a (!! mL de leche * 0alentar C!! mL de leche en un precipitador )u olla proporcionada por el alumno* de (!!! mL hasta alcanzar A,/0 )utilizar parrilla de calentamiento o, puede ser mechero pero se debe tener mucho cuidado al utilizarlo para %ue la leche no se derrame al hervir* 7* 6dicionar los (!!mL de leche %ue contienen la renina o cuajo a la porcin caliente. 8* +over algunas veces ,* ;ejar en reposo durante (, minutos para formar la cuajada @* 1resionar la cuajada sobre manta de cielo para separarla del suero. 6dicionar sal al gusto A* ;ejar en reposo la cuajada en su molde durante (, minutos para formar el %ueso $#plicar %u sucede durante el proceso de elaboracin del %ueso.

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