1.

INTRODUCCIN

Hoy en da son varios los ecosistemas en nuestro pas que se encuentran afectados, en mayor o menor grado, por la desertificacin. Es as como el Archipilago de Juan Fernndez, ubicado en el Ocano Pacfico al oeste de la costa de Chile continental, no escapa a este efecto, a pesar de estar protegido como Parque Nacional, desde 1935 y como Reserva de la Biosfera, desde 1977, ya que desde su descubrimiento por el navegante espaol Juan Fernndez, en el ao 1574, comenz la explotacin de los recursos y se dio pie al deterioro de sus riquezas naturales con la introduccin de las primeras cabras, conejos, vegetales exticos, pestes de plantas, incendios y la sobre utilizacin por animales domsticos (bovinos, caballares), dejndose una enorme huella en las comunidades de plantas nativas y endmicas.

Debido a su accidentada geomorfologa, un clima semi riguroso y, en especial, por su flora y fauna, nica en el mundo (endmica), constituye uno de los ecosistemas ms particulares, sorprendentes y de mayor inters botnico del mundo, lo que ha estimulado una basta actividad de investigacin y estudio de sus recursos, existiendo actualmente ms de 60 obras cientficas sobre aspectos generales de la vegetacin del archipilago y ms de 80 trabajos botnicos especficos (CONAF, 1992).

La flora del archipilago est compuesta por 131 especies endmicas (62% de la flora nativa vascular), 12 gneros endmicos, y 1 familia endmica (MARTICORENA, STUESSY y BAEZA, 1998). Sin embargo, a pesar de su importancia botnica (un alto endemismo de gneros, especies y variedades), cerca del 70% de las angiospermas endmicas se encuentran amenazadas de extincin. Por esta razn, se tomaron medidas de conservacin y recuperacin de la

fitocenosis del Parque Nacional, donde, a partir del ao 1985, se iniciaron los primeros ensayos de propagacin de algunas especies vegetales endmicas en las instalaciones del Parque, llegando a tener sobre el 50% de ellas con tcnicas conocidas de propagacin (RICCI y LEIVA, 2000; RICCI, 1998). Es as como, en conjunto con la Corporacin Nacional Forestal, en diversos viajes de colecta a las islas se han llevado al vivero del Jardn Botnico Nacional, ubicado en Via del Mar, semillas de las especies endmicas, ensayndose diversas tcnicas de propagacin. Adems, el Gobierno de Chile, junto con el de Holanda, financiaron e iniciaron, en el ao 1997, un proyecto llamado Conservation, Restoration and Development of the Juan Fernndez islands, cuyo objetivo es la mantencin y reforestacin de la flora nativa, y, a la vez, contribuir al desarrollo socioeconmico de la poblacin local, la cual est muy ntimamente ligada a los recursos naturales de la isla (CONAF, 2001).

La idea es lograr afinar un protocolo que permita la propagacin in vitro de 6 especies endmicas del Archipilago de Juan Fernndez, Isla Rbinson Crusoe, con problemas de conservacin, para la reforestacin de su ecosistema y la posible comercializacin como plantas ornamentales y/o medicinales, evitando su extincin.

Para la presente investigacin los objetivos son los siguientes:

Objetivos generales

Preservar la flora nativa de nuestro pas y endmica del Parque Nacional Archipilago de Juan Fernndez, que se encuentra en estado de conservacin vulnerable y en peligro de extincin.

Aplicar mtodos de propagacin in vitro a plantas del Archipilago de Juan Fernndez, Isla Robinson Crusoe, que se encuentran en estado de conservacin a punto de extincin, en peligro de extincin, vulnerable y rara, para la creacin de bancos de germoplasma.

Propagar una cantidad de plantas que permitan concretar las etapas posteriores de enraizamiento y aclimatacin.

Objetivos especficos

Seleccionar plantas de los gneros Dendroseris, Robinsonia, junto con las especies Ochagavia elegans, Plantago fernandezia, disponibles en el vivero del Jardn Botnico Nacional.

Desarrollar un protocolo para propagar in vitro estas plantas, manteniendo las caractersticas de la planta madre.

Describir

la

capacidad

germinativa

de

Plantago

fernandezia,

bajo

determinadas condiciones.

2. REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1. Descripcin general del Archipilago de Juan Fernndez:

2.1.1. Ubicacin.

CONAF (2001) seala que este grupo de tres islas, situado en el Ocano Pacfico a 667 km de la costa de Chile continental (frente al puerto de San Antonio), est compuesto por las islas Robinson Crusoe (Masatierra), con una superficie de 4.794 ha. (78 51 O, 33 37 S), Marinero Alejandro Selkirk (Masafuera), con una superficie de 4.952 ha. y a 187 km al oeste de la primera (80 45 O, 33 45 S), y Santa Clara, una pequea isla de 221 ha. y a una distancia de 1,2 km al suroeste de Robinson Crusoe, abarcando el archipilago una superficie total de 9.967 hectreas.

2.1.2. Clima.

Debido a la ubicacin del Archipilago de Juan Fernndez, al oeste de la Corriente marina de Humboldt, dispone de un clima ocenico, agradable, libre de heladas (a nivel del mar), y con lluvias mucho ms abundantes y mejor distribuidas que en las tierras continentales de Chile a la misma latitud (MUOZ, 1969).

Segn la CONAF (2003), presenta un clima mediterrneo continental con una fuerte influencia ocenica, con una humedad ambiental elevada (76,5% de humedad relativa), un promedio anual de temperatura de 15,2C con una amplitud trmica de 6,3C entre los meses ms fros y ms clidos. Las precipitaciones son abundantes

en los meses de otoo-invierno (BARRERA, 1997), las que decrecen entre los meses de octubre y febrero, teniendo una media anual de 1041,5 mm. (CONAF, 2003), producindose un dficit hdrico en los meses de verano, sin embargo sobre los 300 m.s.n.m. existe durante todo el ao abundante neblina y humedad (BARRERA, 1997).

COSIO y GLVEZ (2003), describen un Clima Templado Seco Estival, Provincia Seco Estival Breve, desde la cota 0 a 400 m.s.n.m., y un Clima Templado Hmedo, Provincia Hmedo de Verano Fresco, desde la cota 400 m.s.n.m. a las altas cumbres (900-1000 m.s.n.m.).

2.1.3. Geologa y Geomorfologa.

stas son islas jvenes de origen volcnico (MUOZ, 1969; STUESSY, SANDERS y SILVA, 1984), con edades que varan entre 3.79 0.20 y 4.23 0.16 millones para Robinson Crusoe (MARTICORENA, 1995; STUESSY et al., 1984); 1.01 0.12 y 2.44 0.14 millones de aos para Alejandro Selkirk, y 5.80 2.10 millones para Santa Clara, las que tienen relacin con su geomorfologa, origen y evolucin de la flora nativa. Con respecto a la geomorfologa, la Isla Robinson Crusoe presenta amplios valles y un alto grado de erosin; en cambio, la Isla Alejandro Selkirk presenta profundas quebradas y una erosin ms suave (STUESSY et al., 1984). Por otro lado, COSIO y GALVEZ (2003) describen la Isla Robinson Crusoe con una predominancia del Distrito Cerrano y Montano, de altas pendientes, con algunos sectores ondulados y una baja proporcin de valles o sectores planos.

2.1.4. Ubicacin Administrativa.

Corresponde a la Comuna de Juan Fernndez y es administrada por la Provincia de Valparaso, Quinta Regin de Valparaso, Chile (CONAF, 2003).

Se ubica Geogrficamente a una altitud entre 0 - 915 m.s.n.m., y Ecolgicamente dentro del Reino Templado, Dominio Seco Estival, Provincia Seco Estival Breve y dentro del Reino Templado, Dominio Hmedo, Provincia Hmeda de Verano Fresco (COSIO y GLVEZ, 2003).

2.1.5. Poblacin.

Su poblacin total es de 509 habitantes, lo que representa un 0.037% de la poblacin regional y un 0.062 % del nivel provincial (INE, 1992). Datos del Censo Poblacional del ao 2002, muestran un total de 633 personas, con una variacin intercensal del 29,7% (INE, 2003).

2.1.6. Grado de Proteccin.

En el ao 1935 fue declarado Parque Nacional Archipilago de Juan Fernndez, mediante el Decreto Supremo N 103 del Ministerio de Tierras y Colonizacin, para la proteccin del patrimonio ecolgico nacional. Posteriormente, en el ao 1977 fue declarado Reserva de la Biosfera por la UNESCO, integrando la Red Mundial de Reservas de la Biosfera (CONAF, 2003).

2.2. Descripcin Botnica del Archipilago de Juan Fernndez:

2.2.1. Caractersticas Generales de la Flora Vascular.

El mdico y botnico alemn JOHOW (1896), en su anlisis evolutivo de la Flora de Juan Fernndez seala un total de 236 especies, de las cuales existen 74 especies nativas, 69 endmicas y 93 introducidas.

El botnico sueco SKOTTSBERG (1921) considera en su lista un total de 142 especies nativas, representadas en 40 familias y 80 gneros, de las cuales no menos del 69% es endmica. Posteriormente, analiza en su conjunto la flora del Archipilago de Juan Fernndez, conformando un total de 146 especies nativas y 137 especies adventicias, 16 de los 87 gneros son de naturaleza endmica (18,4% correspondiente a 101 especies), es decir, el 70% del total de las especies (SKOTTSBERG, 1953).

Contiene, segn STUESSY et al. (1992), 361 especies de plantas vasculares, entre las que se incluyen 53 helechos, 65 monocotiledneas y 243 dicotiledneas, representadas en 75 familias y 213 gneros. En relacin con el endemismo presenta 1 familia, 12 gneros y 126 especies (23 helechos, 15 monocotiledneas y 88 dicotiledneas), 29 de ellas (dicotiledneas) son Asterceas, es decir, un 33% de la flora dicotilednea endmica. De las angiospermas endmicas, el 97% son perennes y 64% son leosas (arbustos, rboles arrosetados y rboles), las cuales se encuentran en una frgil condicin, y un 75% de ellas estn consideradas como extintas, amenazadas, raras u ocasionales.

El inventario de todas las angiospermas introducidas en la flora del Archipilago de Juan Fernndez contabiliza un total de 195 especies, sealando que 175 especies estn presentes en la isla Robinson Crusoe, 106 en la isla Alejandro Selkirk y 25 en Santa Clara, encontrndose varias de ellas en ms de una isla (MATTHEI, MARTICORENA y STUESSY, 1993).

MARTICORENA, STUESSY y BAEZA (1998) sealan, en el ltimo catlogo de la flora vascular del Archipilago de Juan Fernndez, un total de 423 especies (55 Pteridofitas, 289 Dicotiledneas y 79 Monocotiledneas), de las cuales el 31,2% son endmicas, 18,7% nativas y 50,1% adventicias.

Es importante resaltar la relacin fitogeogrfica que tiene la flora del archipilago con otras regiones del mundo, ubicadas a grandes distancias. Tal es el caso de las islas Hawai (5500 millas), Nueva Zelandia (4700 millas), Magallanes y la Antrtida (2.300 millas), la regin andina (400 millas) y an Mxico (MUOZ, 1969; CONAF, 2003).

La flora del archipilago se caracteriza tambin por la forma que adoptan los rboles, es decir, sus hojas agrupadas en el extremo superior del tallo a causa del acortamiento de los entrenudos (en roseta), representada por unas 25 especies de las familias Asteraceae, Apiaceae (Ex Umbeliferae), Plantaginaceae y Bromeliaceae. Estos representantes se subdividen, a la vez, en plantas con forma de candelabro (especies de Compuestas arborescentes) y palmiforme, siendo en este ltimo tipo Plantago fernandezia Bert. y las especies del gnero Phoenicoseris las ms importantes (MUOZ, 1969).

2.2.2. Caractersticas de la Isla Robinson Crusoe.

En la isla Robinson Crusoe (ex Ms a Tierra), su parte oeste es una rea seca, formada por campos de gramneas y sin rboles, lo que contrasta con su parte central, la Baha de Cumberland y el cerro Yunque (915 m. de altura), los que estn formados por un bosque siempre verde y donde abundan la mayora de las plantas endmicas de la isla (MUOZ, 1969). Actualmente, predominan las Geraniceas, Juncceas y Ciperceas, existiendo un suelo desnudo (COSIO y GLVEZ, 2003).

Las asociaciones vegetales de esta isla son: a) El bosque de montaa baja; b) El bosque de montaa alta; c) Matorral; d) Grupos aislados de Nothomyrcia fernandeziana; e) Formaciones de gramneas Stipa fernendeziana; f) Asociaciones de Compuestas arborescentes, donde se encuentran especies del gnero Robinsonia; y g) Asociacin del matorral de maqui, Aristotelia chilensis (Mol.) Stuntz. (SKOTTSBERG, 1921).

MATTHEI, MARTICORENA y STUESSY (1993) sealan una alta proporcin de especies adventicias, especialmente en esta isla, donde la flora extica (61,4%) supera a la suma de la flora nativa, junto con la endmica (38,6%).

2.2.3. Caractersticas de la Isla Alejandro Selkirk.

La vegetacin se divide en dos categoras principales, siendo una de ellas la flora de las quebradas, la que se desarrolla desde el nivel del mar hasta los 1000 m. de altitud. La flora que est a nivel del mar, es escasa, debido a las transformaciones que ha sufrido por la presencia de numerosas malezas, entre las cuales se

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encuentra el palqui (Cestrum parqui L Her.), cardilla (Carthamus lanatus L.), cardo penquero (Cynara cardunculus L.), etc; la otra categora es la flora magallnica, la que se encuentra a mayores alturas hasta alcanzar los 1350 m. Las principales comunidades de plantas son el bosque de la montaa baja y el bosque de montaa alta (MUOZ, 1969).

MATTHEI, MARTICORENA y STUESSY (1993) sealan tambin en esta isla una alta proporcin de especies adventicias, pero de menor relevancia que en las otras dos islas, superando la flora extica (58,6%) a la suma de la flora nativa, junto con la endmica (41,4%).

2.2.4. Caractersticas de la Isla Santa Clara.

Esta isla no presenta cursos de agua, y se desarrolla una flora que coincide con la parte seca de la isla Robinson Crusoe. Entre las especies endmicas, se encuentran Dendroseris litoralis Skottsb. y Dendroseris pruinata (Joh.) Skottb., Compuestas arborescentes (MUOZ, 1969). Adems, presenta una muy alta proporcin de especies adventicias, superando la flora extica (25 especies u 83.3%) a la suma de la flora nativa junto con la endmica (6 especies o 16.7%) (MATTHEI, MARTICORENA y STUESSY, 1993). CONAF (2003) seala que hoy existen solamente una estepa graminosa y algunas compuestas arborescentes, formando manchas aisladas en la franja costera.

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2.3. Cambio y causas del cambio de la Flora del Archipilago de Juan Fernndez:

SANDERS et al. (1987) indican que la flora ha ido cambiando rpidamente desde el tiempo de los primeros colonizadores, con la introduccin de plantas adventicias, las que removieron plantas nativas al competir con stas, generando la extincin de algunas especies que se explotaban con importancia econmica. En los ltimos veintisiete aos, este deterioro continu por un sobrepastoreo, debido a la introduccin de animales y por una extrema competencia de especies leosas agresivas, amenazando con la extincin de muchas especies endmicas de valor cientfico.

Entre los dos cambios ms importantes, se encuentran aquellas plantas que eran vistas ocasionalmente en los primeros dos mil aos, han llegado a ser mucho ms raras, no encontrndose en varias localidades. La abundante reduccin de estas especies se ve reflejado por la disminucin, entre un 9 y 67% de las especies, en siete localidades. Las localidades sobre Alejandro Selkirk han sufrido la mayor prdida, con un 50% de promedio, en comparacin con el 20% de disminucin en Santa Clara y un 17% de promedio de prdida en Robinson Crusoe. El segundo mayor cambio es la invasin de especies agresivas en el hbitat de las especies endmicas, habiendo un incremento de un 250% de promedio de especies introducidas en la isla Robinson Crusoe (SANDERS et al., 1987)

Otro cambio que sealan SANDERS et al. (1987) es la desecacin del hbitat de las tres islas y el incremento del suelo rido y del hbitat xerfito en comparacin con el mesfito, al parecer causado por el sobrepastoreo y pisoteo, resultando, en la cubierta de plantas y el suelo, menor capacidad de retener el agua de lluvia. Estos autores sugieren que el sobrepastoreo y el pisoteo por la introduccin de mamferos son la gran amenaza para la flora nica de Juan Fernndez, sealando la presencia

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de cabras (Capra hircus L.)en gran nmero (3.000 a 5.000) y fuerza destructiva, entre otros como vacunos (Bos taurus L.), ovejas (Ovies aries L.), caballares (Equus caballus L.), coatis (Nasua nasua L.), conejos (Oryctolagus cuniculus L.). Los factores sealados anteriormente son favorecidos en mayor medida por la erosin, que afecta en un 40% de forma severa a extremadamente severa en la isla Robinson Crusoe, causada por la actividad humana (corte y quema de la vegetacin), junto con los factores naturales de erosin como precipitaciones abundantes, vientos fuertes, laderas abruptas y suelos con baja capacidad de retencin de agua (IREN-CORFO, 1982).

2.4. Descripcin del gnero y especies de la Familia Asteraceae:

Antes de la descripcin de los gneros y especies, es necesario especificar que BENOIT (1989), describe de la siguiente forma las categoras de Estado de Conservacin de Especies.

Las especies en peligro son aquellas de las que existe un escaso nmero de ejemplares en la naturaleza y cuya existencia est seriamente amenazada si los factores causales siguen funcionando. Se incluyen especies cuyas poblaciones se han reducido tan drsticamente que se hallan en riesgo inminente de extincin (BENOIT, 1989).

Las especies vulnerables son aquellas que podran pasar a la categora de en peligro en el futuro prximo, si las causales de su disminucin continan funcionando (BENOIT, 1989).

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Tambin es importante describir las especies en la forma en que las plantas, especficamente sus yemas de conservacin o renuevo, son capaces de pasar el invierno, denominada formas biolgicas de las plantas y, conforman las categoras Fanerfitas, Camfitas, Hemicriptfitas, Criptfitas, Terfitas, Hidrfitas, Epfitas y Parsitas (RAUNKIAER, 1934).

RAUNKIAER (1934) describe las Fanerfitas (del griego phaneros = visible y, pitn = vegetal) como rboles y arbustos, plantas cuyas formas de renuevo estn alejadas del suelo y, por los tanto, en climas donde hay nevadas invernales no son cubiertas por la nieve; a las Camfitas (del griego chamae = a tierra) como plantas cuyas yemas de renuevo se encuentran sobre el nivel del suelo, pero a menos de 25 cm. de altura.

Los gneros Dendroseris y Robinsonia, pertenecientes a la familia Asteraceae son monotpicos del Archipilago de Juan Fernndez. Por su parte, esta familia es la ms representada en este grupo de islas, ya que forma el 20% de su flora (SKOTTSBERG, 1956).

Estos dos gneros destacan tambin por una alta especiacin, la que es favorecida por la presencia en estas islas de una enorme diversidad de hbitat, y la que origina una gran diversidad morfolgica, expresndose sta en el gnero Dendroseris a travs de la forma de rboles y arbustos en roseta (SANDERS et al., 1987), pertenecientes a las Fanerfitas (RAUNKIAER, 1934).

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2.4.1. Gnero Dendroseris D.Don (Lactuceae).

El gnero Dendroseris corresponde a rboles o arbustos lactferos, de ramas bifurcadas marcadas por las cicatrices de las hojas cadas. Las hojas se ubican agrupadas hacia el extremo apical de las ramas. Sus flores estn ubicadas en cabezuelas paniculadas, con todas las flores liguladas, de corolas blancas o amarillas; involucro constituido de varias filas de hojuelas unidas en la base, siendo las exteriores ms cortas; receptculo sin brcteas; anteras aladas, con la base aflechada; ramitas del estilo largas, delgadas, troncadas. Sus frutos son aquenios glabros, trasaovado-oblongos, escotados en ambos extremos; pelos del vilano numerosos, delgados, sencillos. Incluye un total de 5 especies endmicas del Archipilago de Juan Fernndez (REICHE, 1910), siendo actualmente 11 las especies determinadas, de las cuales ocho han evolucionado en la isla Robinson Crusoe y tres en Alejandro Selkirk (STUESSY et al., 1984). La gran diversidad morfolgica de estas especies permite distinguir los subgneros Rea, Dendroseris y Phoenicoseris, encontrndose Dendroseris neriifolia en el primero y Dendroseris litoralis en el segundo (SANDERS et al., 1987). Las especies del subgnero Dendroseris habitan tanto en zonas costeras como bosques hmedos, especialmente a orillas del mar y en altos arrecifes, mientras que las del subgnero Rea se desarrollan mayormente en bosques de mediana altura.

JOHOW (1896) indica que las especies de este gnero destilan una gran cantidad de un jugo lechoso, de gran viscosidad y espesor. Sus troncos y ramas son ahuecados.

La especie Dendroseris litoralis Skottsb., llamada comnmente Col de Juan Fernndez, es descrita por RODRGUEZ, MATTHEI y QUEZADA (1983) como un rbol de 2 a 5 m. de altura, copa redondeada, tronco tortuoso, de 10-30 cm. de

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dimetro, blando con ltex, ramificado desde cerca de la base; una corteza de color gris, con estras transversales ms oscuras. Ramas tortuosas, cubiertas de hojas rosuladas en su parte apical. Hojas perennes, simples y pecioladas; lmina de 25-45 cm. de largo y 18-30 cm. de ancho, aovada u oblonga, coriceo-carnosa, acorazonada en la base, de color verde glauco en la cara superior, ms claro en la inferior, margen ondulado; pecolo de 12-20 cm. de largo, de seccin triangular y caniculado en la base. Captulos dispuestos en inflorescencias paniculadas, pndulas de 40-60 cm. de largo, con hojas ssiles, redondas o lanceoladas, abrazadora en la base, de 2-12 cm. de largo y 2-10 cm. de ancho. Captulos amarillos o de color rojo anaranjado (MUOZ, 1969), numerosos, de 2-5 cm. de dimetro con pednculos de 1-5 cm. de largo. Cinco estambres insertos en el tubo de la corola, con anteras de 7-9 mm. de largo, caudadas en la base, unidas para formar un tubo. Ovario lenticular, con los mrgenes dilatados, de 1 mm. de largo y 1,5 mm. de ancho; estilo filiforme, dividido en dos ramas de 2,5-3 mm. de largo y en cuyo interior van las pailas estigmticas. El fruto es un aquenio, aplanado, de 2-5 mm. de largo y 2-3 mm. de ancho, ligeramente alado; papus formado por 1-2 grupos de cerdas que estn cubiertas por finos apndices antrosos.

MUOZ (1969) hace mencin de un grupo particular de especies que ofrece el Archipilago de Juan Fernndez, desde un punto de vista agronmico para la horticultura. Entre estas especies est la col de Juan Fernndez, Dendroseris litoralis Skottsb., de hojas grandes y flores muy vistosas de color rojo anaranjado, la que se cultivaba en muchos jardines y plazas de Via del Mar. Adems, BENOIT (1999) seala que sus cabezuelas aportan nctar para la supervivencia del picaflor de Juan Fernndez (Sephanoides fernandensis), entre diciembre y febrero (RODRGUEZ, MATTHEI y QUEZADA, 1983).

BENOIT (1999) seala que todas las coles estn en peligro de extincin y, actualmente la especie Dendroseris litoralis Skottsb., slo existe en jardines y no se

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encuentra en estado silvestre. Sin embargo, RODRIGUEZ, MATTHEI y QUEZADA (1983) indican que en estado natural se encuentra en lugares muy restringidos, slo sobre rocas en las cercanas del mar. Adems, es cultivada en la isla Robinson Crusoe y en el continente, siendo frecuente encontrarla en Valparaso, Via del Mar y Reaca y, aisladamente, en La Serena y Concepcin.

CONAF (2001) citan a la especie Dendroseris litoralis Skottsb., como una de entre varias especies endmicas afectadas por el pastoreo de cabras (Capra hircus), debido a que crecen en lugares solo accesibles para stas. Adems, sealan que de esta especie junto a Dendroseris neriifolia, entre otras, permanecen solo unos pocos individuos en su ambiente natural, se extrajeron semillas y se cultivaron almcigos, como una de las tareas del proyecto Conservacin, mantencin y desarrollo del Archipilago de Juan Fernndez.

La especie Dendroseris neriifolia (Dcne.) Hook. et Arn, es un rbol muy ramificado, de copa extendida. Sus hojas se distribuyen sobre la mitad superior de las ramas, son angostas y lanceoladas, obtusas, coriceas, glabras, enteras, atenuadas en el pecolo, de aproximadamente 15 cm. de largo y de 1,5-2 cm. de ancho. Sus inflorescencias son compuestas (en cabezuelas pequeas), corolas blancas, de pednculos cortos provistos de agudas brcteas; involucro cilndrico de 3 filas de hojuelas donde las exteriores son aovadas, las interiores linear oblongas, obtusas, con tricomas y mrgenes pestaosos. Sus frutos son aquenios comprimidos, de forma oblongo-trasovoides (JOHOW, 1896 y REICHE, 1910). Por su parte, JOHOW (1896) la describe como un rbol de 2-4 m. de alto y de 0,1-0,3 m. de dimetro.

Segn REICHE (1910), esta especie es una planta endmica en la isla Robinson Crusoe que se encuentra escasa.

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Segn CONAF (2003), las especies Dendroseris litoralis Skottsb. y Dendroseris neriifolia (Dcne.) Hook. et Arn, se encuentran dentro de la Categora Estado de Conservacin en peligro, aunque tambin son catalogadas por DANTON et al. (1998) en un grado de amenaza a punto de extincin.

2.4.2. Gnero Robinsonia D.C (Senecionae).

El gnero Robinsonia, el segundo ms numeroso de la familia Asteraceae (SILVA, BITTNER y PACHECO, 1992) y caracterstico de la isla Robinson Crusoe, se distingue principalmente por poseer las flores en un involucro compuesto de una o dos filas de escamas. Sus cabezuelas son dioicas, debido al abortamiento de uno de los 2 sexos de sus cabezuelas. Las flores femeninas presentan 5 estambres rudimentarios, un estilo con 2 brazos extendidos, y anteras libres. Se caracteriza tambin por tener un vilano de pelos uniseriados, blancos, ms o menos unidos en la base, que se desprende del aquenio antes de la madurez, lo que impide que los aquenios de estas plantas residentes en una pequea isla ocenica, sean arrastrados por el viento al mar (JOHOW, 1896).

Por su parte, REICHE (1910) describe al gnero Robinsonia como arbolitos o arbustos glabros, resinosos, con las ramas marcadas por las cicatrices semicirculares de las hojas cadas. Sus hojas enteras y alternas, se ubican hacia el extremo de las ramas. Sus flores, son cabezuelas pequeas, corimbosas, radiadas y dioicas; de involucro acampanado, de hojuelas uniseriadas, libres o ms o menos unidas, un receptculo desnudo y plano. Las flores masculinas tienen las anteras soldadas entre s, el ovario rudimentario, un estilo sencillo y provisto de largos pelos. La corola de las flores femenina presenta una lgula tridentada; en cambio, en las flores hermafroditas, la corola es tubulosa y las masculinas angostamente acampanadas con pice con 5 dientes. Las anteras de las cabezuelas masculinas

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son aladas, sin colas; en las flores femeninas las anteras son pequeas, reducidas y libres. El estilo de las flores hermafroditas sobresale de las cabezuelas. Sus frutos son aquenios glabros, marcados de costillas prominentes. Los cotiledones enroscados o planos. Las 5 especies conocidas son endmicas en la Isla Robinson Crusoe (REICHE, 1910).

La especie Robinsonia thurifera Dcne. se caracteriza por ser un arbusto con ramas bifurcadas, renuevos delgados y con muchas hojas hasta la base. Sus hojas son ssiles, semi-abrasadoras, entre 15-23 cm. de largo, de forma linear-lanceoladas, enteras, acuminadas, atravesadas por un nervio central muy grueso que se encuentra surcado en la base, y muy poco reticuladas por los nervios secundarios. Pancula hojosa de centenares de cabezuelas aglomeradas en los extremos de los pednculos principales. con pedicelos ms o menos del largo de las cabezuelas (3 mm). Las hojuelas del involucro estn soldadas hasta la mitad, con lgulas trilobuladas. Vilano frgil, de 5 pelos libres y distantes. Aquenios pelados, con 5 costillas elevadas. Cabezuelas masculinas desconocidas (JOHOW, 1896 y REICHE, 1910).

JOHOW (1896) y REICHE (1910) sealan que esta especie es endmica de la Isla Robinson Crusoe. Actualmente es poco abundante, debido a que en el pasado se le extraa una resina medicinal (REICHE, 1910).

Es descrita por JOHOW (1896) como una especie muy rara (debido a lo difcil que fue encontrar un individuo para su clasificacin), la que secreta una muy olorosa y abundante resina, de renuevos de 1,5 cm de dimetro, marcados por cicatrices. Vulgarmente era llamado por los isleos como Resino macho y al parecer, en tiempos pasados, esta especie era la que entregaba la resina tan estimada por sus

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virtudes medicinales, para el dolor de cabeza, explicando el porqu de su casi exterminio.

Segn CONAF (2003), la especie Robinsonia thurifera Dcne, se encuentra dentro de la Categora Estado de Conservacin en peligro, siendo tambin catalogada por DANTON et al. (1998) en un grado de amenaza a punto de extincin.

La especie Robinsonia gayana Dcne. es un arbusto con ramas igualmente bifurcadas, renuevos delgados y con muchas hojas hasta la base. Sus hojas son ssiles, semi abrasadoras, linear-lanceoladas, enteras, acuminadas, atravesadas por un nervio central que se engruesa en la base y que se adelgaza hacia el pice con numerosos nervios laterales que se distribuyen en forma casi paralela (JOHOW, 1896 y REICHE, 1910). Sus flores son corimbos terminales, compuestos, de entre 30-40 cabezuelas, provistos de brcteas alesnadas, cabezuelas de 5 mm de ancho, hojuelas del involucro soldadas hasta la mitad, lgulas con el pice 3 dentado. Sus frutos son aquenios, marcados de 5 costillas gruesas. El vilano est formado por entre 13-15 pelos ligeramente unidos en la base. Cotiledones planos. Sus troncos pueden tener una altura entre 2-4 m. (REICHE, 1910).

Segn JOHOW (1896), esta especie habita en la zona boscosa de la isla, desde baja altitud sobre el mar, hasta la cima de los cerros, creciendo entre arbustos. La describe como un arbusto de entre 2 y 4 m de estatura, con hojas de entre 9 y 15 cm de largo y 1,5 cm de ancho, enteras, acuminadas, agrupadas en las puntas de renuevos, las que ms adelante, al caer, dejan una gran cantidad de cicatrices sobre la corteza de las ramas, sobre la que ms tarde destilar una resina olorosa; como frutos, aquenios desnudos. Es nombrado vulgarmente tambin como Resino.

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JOHOW (1896) y REICHE (1910) sealan que Robinsonia gayana Dcne. es endmica de la isla Robinson Crusoe, siendo en la actualidad considerada por la CONAF (2003) y DANTON et al. (1998), dentro de la Categora Estado de Conservacin vulnerable.

2.4.3. Caractersticas qumicas de la Familia Asteraceae.

Es decrita por HEYWOOD, HARBORNE y TURNER (1977) como una familia muy rica en metabolitos secundarios, sustancias muchas de ellas txicas para el hombre y/o animales, caracterizados por sesquiterpenolactonas, compuestos acetilnicos y flavonoides, stos ltimos de gran importancia, porque permiten determinar relaciones sistemticas y de evolucin en las plantas durante la floracin.

SILVA, BITTNER Y PACHECO (1992) se aislaron e identificaron 16 flavonoides, algunos esteroides, dos sesquiterpenos y tres compuestos fenlicos, adems de los caractersticos triterpenos pentacclicos, dentro de las 11 especies del gnero Dendroseris. Dentro de la especie Dendroseris litoralis, se aislaron los compuestos: Escualeno, cido morlico, Lupeol acetato, Lupeol, Taraxteril acetato, cido urslico, -sistosterol, daucosterina, estigmasterol glicsido, octadecano, cido graso triglicrico y alcohol de cadena larga insturada, en tanto que en la especie Dendroseris neriifolia se aislaron los compuestos Lupeol, cido betulinico, taraxasterol, -sistosterol, estigmasterol, vainilina, cido urslico, 8-(x-Hidroxi achillin, Dendroserin, Hidrocarburo y grasas, siendo el subgnero Rea caracterstico en tener flavonoles y flavonas mono y diglucsidos.

Estos mismos autores aislaron y encontraron en el gnero Robinsonia, cuatro tipos de flavonoides, con un total de 14 compuestos, 8 flavonoles (5 Quercetin, 1

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Kaempferol, 2 Isorhamnetin), 3 flavonas (2 Luteolin y 1 Apigenin), 2 flavanonas (Eriodictyol y Naringenin) y 1 dihidriflavonol (Taxifolin). Tambin se aislaron 5 diterpenos conocidos y uno nuevo (thuriferin), -sistosterol, stigmast-4 en 3- ona y vainilina, en Robinsonia thurifera; 3 diterpenos (kauranol, thuriferin y ent-kaur-8-16 dien, 17,19 cido dioico) en Robinsonia gayana.

2.5. Descripcin del gnero y especie de la Familia Bromeliaceae.

El gnero Ochagavia, no monotpico del archipilago, pertenece a la familia Bromeliaceae, suculenta, de forma vital Camfita (RAUNKIAER, 1934), es endmico de Chile e incluye a 3 especies: Ochagavia carnea, Ochagavia chamissonis y Ochagavia elegans. Es relativamente abundante en la isla Robinson Crusoe, por lo que se encuentra en estado de conservacin vulnerable.

El gnero Ochagavia se caracteriza por tener flores con 3 spalos linear-oblongos, no mucronados, libres hasta el pice del ovario ciatiforme, cubiertos imbricadamente en la base, erectos, aquillado-triangulares, simtricos, glabros, un poco encorvados en el pice. Adems, poseen 3 ptalos libres, erectos, oblongo-unguiculados, algo ms grandes que el cliz, angostos y elpticos, apenas mucronados, a veces finamente escamosos en la base, doblados hacia atrs en el pice; uuela corta y ancha. Sus estambres son un poco o mucho ms largos que los ptalos, epginos; filamentos libres, glabros, filiformes; anteras dorsifijas, elpticas o linear-oblongas, verstiles, dehiscentes longitudinalmente. Tiene un ovario nfero, anguloso o comprimido, glabro, oblongo, con tres lculos, tubo epgino visible, pero corto, con muchos vulos en cada lculo; estilo largo, filiforme, sobrepasando los ptalos; estigmas cortos, algo retorcidos. El fruto es ovodeo, triangular abayado, con semillas pequeas, irregulares en forma, esfricas o elpticas, base aguda, pice obtuso, testa delgada, oscura (a causa de la endopleura), rugoso-estriada,

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tuberculada; endosperma harinoso, abundante; embrin muy pequeo. Sus hojas se distribuyen en una roseta densa, ensiformes, textura firme, con mrgenes provistos de espinas pungentes; tomento visible; el pice terminado en un acumen tieso y muy punzante; espinas dirigidas hacia arriba. Como inflorescencia tiene un capitulo multifloro, central, pednculo corto o ssil; cuando es pedunculado las hojas estn distanciadas; la flor est rodeada parcialmente por una brctea ancha, ms larga que el ovario, bordes serrados, pice acuminado-dentado. Flores de color rojo, violeta o amarillas (MUOZ, 1969). Este mismo autor indica que es endmico de Chile y est conformado por 5 representantes especficos (MUOZ, 1966).

La especie Ochagavia elegans R. A. Phill., endmica de la isla Robinson Crusoe, habita en rocas de acceso casi imposible, ubicadas en la costa occidental; en Puerto Francs y Puerto Ingls, entre peas muy altas y perpendiculares; en el Morro de Juanango, que est cerca de la parte norte de la isla, se desarrolla casi a nivel del mar hasta varios metros sobre l (JOHOW, 1896).

JOHOW (1896) entre sus observaciones, seala que esta especie al igual que aquellas del gnero Puya, crece nicamente en el suelo. Adems la describe como una planta que tiene un tallo que se extiende horizontalmente, con muchas ramas, las que permiten en ciertas ocasiones formar con algunos pocos individuos, manchones entre las rocas. En la parte apical de estas ramas, se ubica una roseta de hojas rodeadas de dientes con forma de espina, y cubiertas de escamas plateadas.

MUOZ (1969) menciona a un grupo particular de especies que ofrece el Archipilago de Juan Fernndez, desde un punto de vista agronmico para la horticultura, sealando entre estas especies el ajo dulce o ajo verde, Ochagavia

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elegans Phil., una Bromelicea de muy atractiva belleza durante su floracin, que es, sin duda, la planta ms hermosa del archipilago.

CONAF (2003) declara a la especie Ochagavia elegans R.A. Phill. dentro de la Categora Estado de Conservacin vulnerable, mientras que DANTON et al. (1998) la consideran poco amenazada, pero rara.

2.6. Descripcin del gnero y especie de la Familia Plantaginaceae.

El gnero Plantago, perteneciente a la familia Plantaginaceae, se caracteriza por poseer plantas normalmente herbceas y excepcionalmente leosas, anuales o perennes. Sus hojas son alternas, generalmente arrosetadas y con pednculos acanalados. Sus flores son hermafroditas, actinomorfas; con 4 estambres, ovario normalmente bilocular (excepcionalmente 3-4 lculos), estilo pubescente. El fruto es una cpsula dehiscente (pixidio) (NAVAS, 1979).

La especie Plantago fernandezia (Dcne.) Bert., es una planta leosa, de forma vital Camfita (RAUNKIAER, 1934), de 1-2 m. de altura (JOHOW, 1896), de tallos poco ramificados en la base, delgados, frgiles, marcados por las cicatrices de las hojas cadas. Sus hojas, que miden aproximadamente 20 cm. de largo y 2-3 cm de ancho, se ubican agrupadas en el pice del tallo, de forma linear u oblongo lanceoladas, ssiles, semi-abrasadoras (JOHOW, 1896 y REICHE, 1911), adelgazadas y algo pubescentes hacia la base, por lo dems, glabro (REICHE, 1911), segn JOHOW (1896) glabras; enteras o ligeramente denticuladas hacia el pice, recorridas por 7 o 9 nervios gruesos y paralelos. Sus inflorescencias delgadas y de 20-30 cm. de largo, nacen en las axilas de las hojas sobre largos pednculos, de estambre inclusos. Su fruto es una cpsula bilocular de 2 semillas.

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Es una especie endmica de la isla Robinson Crusoe (JOHOW, 1896 y REICHE, 1911). Segn JOHOW (1896), habita en la zona del bosque claro, en el sector de Portezuelo de Villagra, desde los 300 m.s.n.m., sealando que es muy escasa, debido a que no fue posible encontrarla en otro lugar de la isla.

Segn CONAF (2003), la especie Plantago fernandezia (Dcne.) Bert., se encuentra dentro de la Categora Estado de Conservacin en peligro, en cambio DANTON et al. (1998) la catalogan en un grado de amenaza a punto de extincin.

2.7. Propagacin y cultivo de Gneros y sus especies:

CONAF (2001) ha cultivado, en vivero, 16 especies endmicas del Archipilago de Juan Fernndez, de las cuales, 13 se encuentran en estado crtico de conservacin, sealando que las especies han sido reintroducidas en su ambiente natural gracias al Proyecto Conservacin, restauracin y desarrollo de las islas Juan Fernndez.

2.7.1. Propagacin por semillas y cultivo del Gnero Dendroseris.

STUESSY et al. (1983) sealan el xito que ha tenido CONAF en el cultivo de plantas provenientes de semillas de Dendroseris litoralis como resultado de un plan en terreno, indicando que un total de 100 plantas germinadas en la oficina central de San Juan Bautista presentan un buen crecimiento, las que son establecidas sin problemas dentro de su propiedad y en sectores del poblado. Dentro del proyecto y enfocado en la conservacin in situ, se han colectado semillas y cultivado almcigos de especies de las cuales solo existen unos pocos individuos en su

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ambiente natural, entre estos Dendroseris litoralis y Dendroseris neriifolia (CONAF, 2001).

Es sealado por RODRIGUEZ, MATTHEI y QUEZADA (1983) el cultivo de la especie Dendroseris litoralis Skottsb en la isla Robinson Crusoe y en el continente, siendo frecuente encontrarla en Valparaso, Via del Mar (STUESSY et al, 1984), Reaca y aisladamente en La Serena y Concepcin. Tambin corroborado por BENOIT (1999), indicando que las coles estn presentes slo en jardines.

2.7.2. Propagacin por semillas y cultivo del Gnero Robinsonia.

Normalmente se ha estado cultivando la especie Robinsonia berteroi Bert., tambin endmica del archipilago de Juan Fernndez a travs de semillas, pero este mtodo es muy lento y de alta incidencia en enfermedades, lo que no permite obtener una propagacin masiva de la especie con el objetivo de evitar su extincin y reforestacin en su hbitat natural (VELOZO, CAMUS y ROJAS, 2001).

2.7.3. Propagacin por semillas y cultivo de Gnero Ochagavia.

RICCI (1998) describe la propagacin de la especie Ochagavia elegans R.A. Phill. a travs de la siembra de semillas en un sustrato mullido, arenoso y con buen drenaje, desinfectado con Basamid granulado (BASF), suministrando un riego permanente por nebulizacin, en platabandas bajo un invernadero, para obtener un 21% de germinacin de las semillas a los 103 das de siembra. El repique se realiza a travs de hijuelos, los que se enraizan en un sustrato arenoso limoso.

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2.7.4. Propagacin y cultivo del Gnero Plantago.

Dentro del arboretrum de la Administracin del Parque Nacional Archipilago de Juan Fernndez, unos pocos individuos de especies muy raras, provenientes de semillas, son conservados, entre estos Plantago fernandezia (CONAF, 2001).

2.8. Cultivo in vitro:

Aunque el mtodo de propagacin in vitro ha sido tradicionalmente usado para el cultivo de especies comerciales, ha aumentado el conocimiento de su aplicacin en especies raras o en peligro de extincin (ARRABAL et al., 2002).

2.8.1. Tipos y tamaos de explante.

MERINO (1987) menciona que a pesar de que todos los cultivos de tejidos provienen de rganos o de sus secciones, la organizacin del progenitor no siempre se mantiene durante el desarrollo in vitro. Sin embargo, un cultivo de rganos tiene el objetivo de alcanzar, a partir de una estructura organizada, la morfologa y la fisiologa que lo identifican con los rganos de su especie. Adems, seala que se ha ensayado con secciones de hojas como explantes (rganos muy inmaduros), logrando pocos resultados exitosos.

Los primordios de hoja requieren un medio nutritivo simple para completar su desarrollo, con agar para primordios grandes y, lquido para primordios muy pequeos, para favorecer el crecimiento y supervivencia (MERINO, 1987).

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El material de inicio utilizado en micropropagacin de plantas arbreas est constituido por porciones apicales de brotes en crecimiento activo (BALDINI, 1992), debiendo considerar que el riesgo de aparicin de patgenos en los tejidos vegetales aumenta con el incremento del tamao de los explantes iniciales (GARCIA y NOA, 1998).

YEOMAN y MACLEOD (1977) recomiendan utilizar fragmentos de tejidos que contengan un gran nmero de clulas ( 5 a 10 mm. por lado), para incrementar la posibilidad de xito en el cultivo.

GARCIA y NOA (1998) consideran el proceso de formacin de callos como una de las tcnicas de cultivo de tejidos para la obtencin de plantas libres de virus, debido a que el crecimiento celular es ms veloz que la replicacin viral, sin embargo, segn BARBA (1987) existen varias anormalidades en estos tejidos, provocadas por una modificacin en la citologa nuclear de las clulas, durante el cultivo (aberraciones cromosmicas, mutaciones, etc.), cuya frecuencia aumenta con la edad de cultivo, y la proporcin de aparicin, dependiendo de la composicin del medio y la especie.

Segn YU y MEDERITH (1986), en Vitis vinifera L., el estado de desarrollo de las yemas y la posicin de los explantes en la planta madre, son factores importantes en la respuesta de ste a la brotacin. Tambin, afirman que el tamao del explante y su edad fisiolgica son factores que influyen en la sobrevivencia del explante, siendo menor en yemas ubicadas en los pices de las ramillas. Este efecto de la posicin est relacionado con el contenido de fenoles presentes en el tejido. Los fenoles son ms abundantes en las yemas apicales y con mayor exposicin al sol.

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2.8.2. Cultivo in vitro en la Familia Asteraceae.

El cultivo de rganos y tejidos de plantas como una tcnica para la propagacin masiva de plantas seleccionadas est ahora establecido para muchas especies de plantas, pero slo unas pocas especies en la familia Asteraceae han sido propagadas usando el cultivo de tejidos (KOTHARI y CHANDRA, 1984).

MURASHIGE, SERPA y JONES (1974) describen la multiplicacin clonal de Gerbera a travs del cultivo de tejidos, utilizando como explantes iniciales puntas de brotes de 0,5 a 1 cm de alto, compuestos de una yema terminal, siendo poco comn, debido a la alta frecuencia de contaminacin por microorganismos, y porque las puntas de brotes son extremadamente pubescentes, siendo poco efectivo el uso de desinfectantes convencionales. La multiplicacin la realizan separando repetidamente y recultivando secciones muy pequeas que se originan de las puntas de brotes, utilizando el medio Murashige y Skoog (MS), gelificado en agar, suplementado con bajos niveles de AIA (0,5 mg/l) y una alta concentracin de Kinetina (10 mg/l), para la rpida multiplicacin de secciones pequeas. Para el enraizamiento de las pequeas secciones, las cultivan en el medio MS con una concentracin de cido -Indol Actico (AIA) mucho ms alta (10 mg/l) y una alta intensidad de luz (10000 lux), ya que se logra el mximo incremento en las secciones y mejora el vigor de los cultivos.

Variaciones genticas han sido observadas en algunas plantas propagadas a travs del cultivo de tejidos, siendo la ms comn el incremento en el nmero de los cromosomas y colores mutantes entre otras (MURASHIGE, SERPA y JONES, 1974).

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El cultivo de puntas de brotes como explante en Gerbera es un sistema ms rpido que el uso de captulos florales, pero el nmero de inicio requerido es mucho ms alto, debido a la alta tasa de infeccin (80%). Para objetivos prcticos, ambos mtodos pueden ser usados, el sistema de captulo en la fase inicial y el sistema punta de brote en la fase de propagacin masiva (PIERIK et al., 1975).

HILL (1968) describe en Chysanthemum la formacin de brotes sobre cultivo de callos, derivados de explantes de tallo, de receptculo y hoja.

KOTHARI y CHANDRA (1986) describen la regeneracin de plantas de Tagetes erecta L., una importante planta ornamental, a travs del cultivo de segmentos de hojas (1,5 *0,6 cm.) sobre el medio base Murashige y Skoog (MS), suplementado con Bencil Adenina (BA) (3 a 5 mg/l), ms AIA (1 a 5 mg/l), observando la regeneracin de un gran nmero de yemas brotadas adventiciamente, las que se multiplicaron sobre el mismo medio, pero con 3 mg/l de BA ms 1 mg/l de AIA. Estos autores aseguran la elongacin de las yemas cuando son repicadas sobre un medio con 2 mg/l de BA ms 0,5 mg/l de cido Giberlico (GA3); y la formacin de races en la base de los brotes cultivados sobre papel filtro, sin callos, en tubos sobre un medio MS lquido con 0,5 mg/l de cido -Indol Butrico (IBA) ms 0,5 mg/l de GA3.

La propagacin de cultivos de tejidos de Senecio cruentus D.C., se realiz, utilizando puntas de brotes provenientes de plantas seleccionadas a partir de semillas germinadas in vitro. La multiplicacin de brotes result mejor sobre medio de Gerbera Murashige y Skoog (MS), suplementado con 2,8 uM de AIA. Por otra parte, la mxima formacin de races ocurri con un medio MS modificado con reducidos niveles de sales inorgnicas y 1,3 uM de ANA (COCKREL, MC DANIEL y GRAHAM, 1986). Tambin, observaron que la germinacin de la semilla y el

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desarrollo de la planta fue mejor inducido sobre medio MS de Gerbera, con el desarrollo de brotes mltiples, luego de 6 semanas de iniciado el cultivo.

La obtencin del mximo nmero de brotes vegetativos en el cultivo de Centaurea paui Loscos ex Willk. a partir de yemas axilares, es logrado en el medio MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), con 2% de sucrosa, 100 mg/l de myo-inositol, 10 mg/l de tiamina, 1 mg/l de cido nicotnico, 1,0 mg/l de piridoxina, suplementado con 0,5 mg/l de BA o 2 mg/l de kinetina (CUENCA, AMO-MARCO y PARRA, 1999).

LEE et al (1994), describen la regeneracin de plantas de Coreopsis lanceolata L. mediante el cultivo de secciones de hojas en un medio MS, vitaminas de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962) suplementado con 1uM de ANA ms 10uM de BA, favoreciendo la formacin de brotes adventicios sobre los explantes.

2.8.2.1. Cultivo in vitro del Gnero Robinsonia.

VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000) describen el cultivo de tejidos de Robinsonia berteroi Bert., utilizando como explantes secciones de hojas (1cm2), secciones nodales, partes de inflorescencias y raquis, sobre un medio de cultivo WPM (Woody Plant Medium), con micronutrientes y vitaminas de MS, 40000 mg/l de sacarosa, 100 mg/l de inositol, 0,8 % de agar, con antioxidante (100mg/l de cido ctrico).

La inclusin del cido ctrico logra retardar significativamente el proceso oxidativo durante 2 a 3 semanas; sin embargo, despus de un mes de cultivo no observan respuestas de crecimiento en hojas y nudos, pero s en raquis y flores. En estas ltimas, ven hiperplasia (abultamiento) de los tejidos de la zona media, con indicios

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de desarrollo de callo en un 80% de los explantes; mostrando una mejor respuesta al sistema de cultivo, con una menor oxidacin y logrando el desarrollo de alguna forma de crecimiento. En raquis detectan el desarrollo de callo en una muestra, la que despus de 2 meses de cultivo se oxid (VELOZO, CAMUS y ROJAS, 2000).

VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000) aclaran que esta especie es recalcitrante y desarrolla una respuesta oxidativa muy acelerada causada por el dao mecnico propio del cultivo, sin poder anular este fenmeno ni con previos lavados como inclusin en el medio de soluciones antioxidantes.

2.8.3. Cultivo in vitro en la Familia Bromeliaceae.

La micropropagacin, a travs de yemas laterales, constituye un mtodo ms rpido para obtener una gran cantidad de plantas uniformes en esta familia (HOSOKI y ASAHIRA, 1980).

HOSOKI y ASAHIRA (1980) describen la propagacin clonal de 4 especies (Quesnelia quesneliana, Vriesea poelmannii, Aechmea fasciata y Guzmania spp.), mediante el cultivo in vitro de hojas y yemas laterales, sobre un medio base MS lquido con macroelementos, RINGE y NITSCH (1968) con microelementos y suplemento orgnico, 2% de sucrosa y 0,7% de agar. La formacin de yemas adventicias, a partir de yemas laterales, se obtienen sobre un medio lquido con 1 mg/l de ANA, ms 1 mg/l de BA; a partir de hojas al ser repicadas sobre un medio lquido con 1 mg/l de ANA ms 1 mg/l de BA. El enraizamiento se logra cultivando los brotes obtenidos, en un medio slido con 0,1 mg/l de ANA.

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La propagacin in vitro de la especie Puya chilensis, puede realizarse a travs del cultivo de yemas axilares de tejido foliar nuevo, sobre un medio Reinert y Mohr (1967) con 6 g/l de agar y 30 g/l de azcar. La formacin de vstagos laterales (multiplicacin) se logr con la adicin al medio de 1 mg/l de ANA y 2 mg/l de kinetina. La formacin de races es favorecida por la inclusin de carbn activado en el medio nutritivo (600 mg/l) (CAMPOS, 1995).

ARRABAL et al. (2002) describen la propagacin de Crypthanthus sinuosus (L.B. Smith), planta endmica en peligro de extincin, mediante el cultivo de pices de tallo y raz, sobre un medio MS lquido sin reguladores de crecimiento (MS0), logrando una frecuencia de regeneracin del 93%o suplementado con 2,2 uM BAP y 0,05 uM ANA

2.8.4. Cultivo in vitro en la Familia Plantaginaceae.

2.8.4.1. Gnero Plantago.

PARAMANIK, CHAKRABORTY y RAYCHAUDHURI (1995) describen el cultivo de Plantago ovata Forssk. utilizando como material vegetal plantas de semillas germinadas in vitro y a partir de stas, puntas de brotes como explantes (6-8 mm de largo), sobre un medio de cultivo MS, con 0,8% de agar y suplementado con 0,2 mg/l de AIA y 5 mg/l de BAP, en el cual forman brotes mltiples.

En esta misma especie, CHAWDHURY, KUNDU y RAYCHAUDHURI (1995) utilizan como explante yemas brotadas y segmentos de hipocotilo (entre 4-6 mm de largo), colocados en un medio base MS, formando callos al suplementarlo con 1 mg de 2,4-

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D y 0,5 mg/l de kinetina. Este callo indujo embriones al ser cambiado a medio MS suplementado con 0,5 mg/l de ANA y 1 mg/l de BAP. El mejor resultado lo obtuvieron con las yemas brotadas como explantes.

Puntas de brotes (10 mm de largo) de Plantago major L. son cultivadas en un medio MS modificado: reduciendo el contenido de NH4NO3 a 412,5 mg/l y KH2PO4 a 340 mg/l, conteniendo 100 mg/l de myo-inositol, 0,4 mg/l de pyridoxina-HCl, 30 g/l de sacarosa, 8g/l de agar, 0,01 uM de GA3 y 0,01 uM de BAP. Esto indujo entre un 57% y 100% los brotes y se mejor la elongacin y vigor de los mismos. Sin embargo, la mejor concentracin en el medio fue 0,5 uM de BAP, junto con un incremento de glucosa, estimulando la formacin de casi 7 brotes su elongacin (50 mm cada uno). Se obtiene un mejor enraizamiento de los brotes elongados, en un medio MS a la mitad suplementado con 5g/l de agar y 1 uM de ANA (MEDEROS et al., 1997).

2.9. Propagacin por semillas:

La utilizacin de una semilla sana constituye un mtodo de control importante para muchas enfermedades sistmicas en varias especies, en que la va de transmisin del patgeno, se produce a travs de los rganos vegetativos empleados en la propagacin (GARCIA y NOA, 1998), por lo tanto, virus y micoplasmas que pueden estar presentes en las plantas madres, se transmiten limitadamente a sus descendientes (BALDINI, 1992).

Sin embargo, BALDINI (1992) seala que las semillas sufren cambios bioqumicos durante su formacin que inducen una condicin de latencia fisiolgica transitoria de

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los embriones, permaneciendo quiescentes (dormicin embrional), aunque las condiciones sean favorables para el inicio del proceso germinativo.

2.9.1. Germinacin de la semilla.

Es definida por TISCORNIA (1984) como el paso de una semilla del estado de reposo al vegetativo, y descrito por BALDINI (1992) como un proceso compuesto de cuatro fases: a) Preparacin: durante la cual el cuadro hormonal se modifica, con una disminucin de los inhibidores y aumento de los promotores. b) Activacin de los procesos metablicos, la cual se caracteriza por un aumento de la actividad enzimtica, sobre todo de las alfa amilasas, por un aumento de la respiracin celular e hidrlisis de las sustancias de reserva. c) Mittica: durante la cual los meristemos embrionales crecen por divisin celular. d) Fase de desarrollo, durante la cual el epicotilo y radcula salen originando la plntula.

La semilla germinada es aquella semilla en que la radcula ha emergido tras romper las cubiertas, debido al brusco cambio que sufre el metabolismo interno de la semilla en ese momento (BESNIER, 1989). Segn AZCON - BIETO y TALN (2000), con la emergencia radicular finaliza la germinacin y se inicia el crecimiento de la plntula.

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BALDINI (1992) seala que las plntulas se pueden desarrollar segn dos modelos distintos: germinacin epgea, en la cual el hipoctilo se alarga llevando a los cotiledones fuera del sustrato o germinacin hipgea en la que los cotiledones permanecen en el sustrato.

HARTMANN y KESTER (1987) definen viabilidad de las semillas como el porcentaje de germinacin, el cual indica el nmero de plantas producidas por un nmero dado de semillas, considerando como caractersticas adicionales, la germinacin rpida, el crecimiento vigoroso de las plntulas y el aspecto normal de ellas. Estos mismos autores sealan que deben ocurrir dos procesos para que una semilla sea viable: polinizacin y fecundacin. La viabilidad se puede determinar por varias pruebas, pero las ms utilizadas son la germinacin directa, de embrin separado y la de tetrazolio. En la prueba de germinacin directa, el porcentaje de germinacin se determina por la cantidad de plntulas normales producidas por las semillas.

Una vez que el embrin ha alcanzado su capacidad para germinar, es esencial para la supervivencia de la especie que la germinacin de la semilla se efecte en un tiempo y lugar favorables para el crecimiento y la supervivencia de la especie (HARTMANN y KESTER, 1987).

CUENCA, AMO-MARCO y PARRA (1999) indican que el uso de semillas es una alternativa para el establecimiento de abundantes brotes libres de patgenos, sin daar la planta silvestre, sin embargo pueden darse mecanismos de hibridacin, imposibilitando el material para las programas de conservacin.

HARTMANN y KESTER (1998) sealan que las semillas de Bromeliceas se han cultivado en la forma descrita para orqudeas, pero en un medio de cultivo lquido en

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agitacin constante, siendo cambiados cada siete das hasta la germinacin. Adems, considera importante en rganos de almacenamiento, los patrones de letargo estacional.

2.10. Desinfeccin del material para la propagacin in vitro:

2.10.1. Antecedentes generales.

El inicio del cultivo in vitro es la primera etapa crtica en el xito de la propagacin de varias plantas (MARKS y SIMPSOM, 1989), siendo importante el tipo de explante y el lugar de colecta (HARTMANN, KESTER y DAVIES, 1990), para contar con un material libre de microorganismos como hongos, bacterias y levaduras (HARTMANN y KESTER, 1998), a partir de plntulas cultivadas en condiciones semiestriles despus de la desinfeccin de las semillas o plantas cultivadas en invernadero sobre sustratos inertes (PIERIK, 1987; MARGARA, 1988). Para esto, es necesario realizar una exhaustiva desinfeccin del explante, sobre todo de aquel que proviene de terrenos en donde no se hacen desinfecciones, como tambin de las mesas de trabajo utilizados (HARTMANN y KESTER, 1998).

La concentracin de la solucin desinfectante y el tiempo de desinfeccin depende de la especie con que se trabaje (PIERIK, 1987; HARTMANN y KESTER, 1998).

Para las desinfecciones, se utilizan compuestos qumicos, como algunos alcoholes (etlico, metlico o isoproplico), en concentraciones del 70 al 75%, los cuales son muy txicos para el material vegetal, por ello su empleo es recomendado slo para enjuagues de corta duracin y para la esterilizacin de superficies externas (HARTMANN y KESTER, 1998).

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BIANCANI (1996), en la desinfeccin de explantes de chirimoyo (Annona cherimola Mill.), afirma que no hay diferencias al utilizar hipoclorito de sodio al 3% ms Tween 20 por 15 min., etanol 95% por 5 seg ms hipoclorito de sodio 0,25% ms Twenn 20 por 10 min. y perxido de hidrgeno 35% ms Tween 20 por 10 min. En cambio, si hay diferencias en la poca en que se toman los explantes, presentando los menores niveles de contaminacin en el mes de enero con brotes nuevos y herbceos.

2.10.2. Desinfeccin de explantes en la Familia Asteraceae.

CUENCA, AMO-MARCO y PARRA (1999) recomiendan como procedimiento prctico de micropropagacin para conservar especies endmicas en peligro de extincin (Centaurea paui Loscos ex Willk., Asteraceae) y evitar la hibridacin, el uso de yemas axilares en la base de la roseta y en la poca de floracin en el tallo de la inflorescencia. Sin embargo, sealan que la micropropagacin de plantas que crecen en terreno en forma de roseta es a menudo difcil, debido a la contaminacin por hongos y bacterias en las yemas de la base de la roseta rodeadas por un grupo de hojas y localizadas a nivel del suelo, siendo muy difcil su esterilizacin. Adems, consideran que el uso de explantes de la roseta implica la destruccin de la planta madre, siendo una desventaja para la conservacin de especies en peligro. Descartando stos, utilizan segmentos de tallos de inflorescencias los que son desinfectados en etanol por 1 minuto ms Tween 80, seguido por 20 minutos en hipoclorito de calcio al 7%.

Los explantes, puntas de brotes de Gerbera, son desinfectados por 10 minutos con hipoclorito de sodio al 5,25% diluido con agua y conteniendo 0,1% de Tween 20. Luego son enjuagados 3 veces con agua estril (MURASHIGE, SERPA y JONES, 1974).

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La esterilizacin de las hojas de Tagetes erecta L., es realizada en una solucin de Hg Cl2 al 0,1% por 5 minutos y luego enjuagadas 3 veces en agua destilada estril (KOTHARI y CHANDRA, 1986).

Los explantes puntas de brotes de Senecio cruentus D.C., son desinfectados en hipoclorito de sodio al 5,25% por 3 minutos, seguido de 3 enjuagues en agua destilada estril (COCKREL, MC DANIEL y GRAHAM, 1986).

2.10.2.1. Gnero Robinsonia.

La desinfeccin de secciones de hojas, secciones nodales y secciones de flores sin raquis de la especie Robinsonia berteroi Bert., pueden ser esterilizadas con hipoclorito de sodio, al 10%, durante 10 minutos, luego enjuagadas cuatro veces con agua estril y dejadas en una solucin antioxidante (100 mg/l de cido ctrico) durante 5 minutos (VELOZO, CAMUS y ROJAS, 2000).

2.10.3. Desinfeccin de explantes en la Familia Bromeliceae.

Los explantes de las 4 especies de Bromeliceas se logran desinfectar en una solucin de hipoclorito de sodio, conteniendo 1% de cloro activo, por 10 minutos, y luego enjuagadas 2 veces en agua estril (HOSOKI y ASAHIRA, 1980).

Las yemas axilares de Puya chilensis, se desinfectan con una solucin de hipoclorito de sodio al 1% durante 3 minutos, y luego se enjuagan con agua

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destilada estril durante 5 minutos. Sin embargo, el porcentaje de sobrevivencia de los explantes por tratamiento es bajo (33%) (CAMPOS, 1995).

2.10.4. Desinfeccin de explantes en la Familia Plantaginaceae.

Para la desinfeccin de las semillas de Plantago ovata Forssk. se sumergen en HgCl2 al 0,05% por 10 minutos, las que luego se enjuagan tres veces con agua destilada estril (PARAMANIK, CHAKRABORTY y RAYCHAUDHURI, 1995; CHAWDHURY, KUNDU y RAYCHAUDHURI, 1996).

Las puntas de brotes de la especie Plantago major L. se desinfectan primero con etanol, al 40%, durante dos minutos y, luego, en HgCl2, por 10 minutos, siendo posteriormente enjuagadas tres veces con agua destilada estril (MEDEROS et al., 1997).

2.11. Pardeamiento y antioxidantes:

2.11.1. Pardeamiento.

El pardeamiento enzimtico es definido como la transformacin de enzimas en las primeras etapas, de compuestos fenlicos en polmeros coloreados, normalmente pardos o negros. Este proceso es observado en los vegetales ricos en compuestos fenlicos (CHEFTEL y CHEFTEL, 1992).

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CHEFTEL y CHEFTEL (1992) sealan entre los sustratos naturales de pardeamiento enzimtico los mono, di o polifenoles, cuya reactividad vara segn su estructura y el origen de las enzimas que catalizan su oxidacin. Tambin, clasifican algunos sustratos como los principales constituyentes fenlicos de los vegetales, entre stos se encuentran el pirocatecol, la 3,4-dihidroxifenilalanina o dopamina (DOPA), los cidos de anillo aromtico como el cido clorognico, y los flavonoides como los antocianidoles, leucoantocianidoles, flavonoles y flavonas, entre otros.

El mecanismo de reaccin de las enzimas participantes consiste en una hidroxilacin de monofenoles y la oxidacin de difenoles. Las enzimas responsables de la oxidacin son nombradas individualmente como monofenolasa y polifenol oxidasa y, sistemticamente, como o-difenol oxgeno oxidoreductasa (CHEFTEL y CHEFTEL, 1992).

La enzima polifenol oxidasa (PPO), considerada una metaloenzima por contener un 0,2% de cobre, se activa generalmente en el mismo rango de pH ptimo para el pardeamiento enzimtico; es decir, entre 5 y 7 o especficamente entre 6 y 6,5. Este proceso es sealado por DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI (1991), quienes confirman que los compuestos fenlicos son oxidados por las polifenoloxidasas y los productos de la oxidacin inhiben la actividad de las enzimas, causando la muerte del explante y el bronceado del medio de cultivo.

2.11.2. Tcnicas para reducir y controlar el pardeamiento enzimtico.

Para el control del pardeamiento enzimtico, se necesita reducir la cantidad de componentes fenlicos y sus productos oxidativos, inhibir la accin de las

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polifenoloxidasas (PPO), y disminuir el suministro de oxgeno (DIRR y HEUSER, 1987).

Para lograr lo anterior, existen varios mtodos, que han sido utilizados principalmente en el cultivo de especies leosas con exitosos resultados, entre los que se encuentran, la exposicin de la planta madre a oscuridad o bajos niveles de irradiacin (MARKS y SIMPSON, 1989; CASSELLS y MINAS, 1983; PIEPER y ZIMMER, 1976), uso reducido de la luz o completa oscuridad durante el establecimiento de los explantes (DIRR y HEUSER, 1987), adicin de PVP (CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975), PVPP (OYANEDEL, 1995) y/o carbn activado y/o antioxidantes como cido ctrico o ascrbico al medio (ZIV y HALEVY, 1983), mantencin de los explantes por varias horas previo al cultivo en antioxidantes (ZIV y HALEVY, 1983), utilizacin de medios lquidos al inicio del cultivo para facilitar y diluir ms rpido los productos txicos (REINERT y MOHR, 1967; DIRR y HEUSER, 1987; AMIN, SHARMA y SRINIVASA, 1992), disminuir los tejidos daados por cortes para reducir la exudacin (DIRR y HEUSER, 1987), traspaso de los explantes a un medio renovado (BROOME y ZIMMERMAN, 1978) para evitar la formacin de pigmentos (PIERIK, 1990).

MACAS, RODRIGUEZ y CANALS (1998), definen el PVPP como un clarificante sinttico formado a partir de la polimerizacin en medio alcalino de la vinilpirrolidona, que presenta gran afinidad por los polifenoles, de forma que, debido a su particular insolubilidad en medio hidroalcohlico, est especialmente adaptado para eliminar los compuestos fenlicos del medio. Su mecanismo de adsorcin de los polifenoles se basa en la formacin de puentes de hidrgeno entre los grupos fenlicos y el oxgeno del grupo amida del anillo pirrolidona del PVPP. De esta forma, arrastra consigo los compuestos fenlicos que a l se enlacen, eliminndolos del medio. Dentro del grupo de polifenoles, el PVPP adsorbe preferentemente aquellos que poseen un mayor grado de hidroxilacin (taninos fundamentalmente).

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AMIN, SHARMA y SRINIVASA (1992) obtuvieron una disminucin del porcentaje de explantes pardeados y de la cantidad de pardeamiento por explante, junto con un incremento de la sobrevivencia in vitro, al tratar las yemas dormantes de uva vinfera con captan (0,2%) y luego almacenadas en bolsas de polietileno a 4 3C previo a ser usadas.

2.12. Reaccin, temperatura y fotoperiodo:

2.12.1. Reaccin.

Es un factor muy importante en la elaboracin de un medio de cultivo, debido a que la mayora de las clulas animales y vegetales tienen un pH que vara entre 5.0 y 8.0; muchos elementos no estn disponibles para las plantas en determinados pH o se hacen poco aprovechables (CORFO, 1990).

HARTMANN y KESTER (1998) recomiendan utilizar pH en el rango de 5 a 6 para lograr un crecimiento adecuado de las plantas cultivadas in vitro.

2.12.1.1. Reaccin Familia Asteraceae.

El pH utilizado para el cultivo in vitro de Gerbera es 5,7 (MURASHIGE, SERPA y JONES, 1974), pH 5,6 para Gerbera jamesonii (PIERIK et al., 1975), pH 5,8 para el cultivo de Tagetes erecta L. (KOTHARI y CHANDRA, 1986) y Senecio cruentus D.C. (COCKREL, MC DANIEL y GRAHAM, 1986), mientras que en Robinsonia berteroi Bert., VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000) ensayaron con pH 5,5.

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2.12.1.2. Reaccin Familia Bromeliaceae.

El pH utilizado por HOSOKI y ASAHIRA (1980), para el cultivo in vitro de las 4 especies de Bromeliceas y al igual que Puya chilensis es de 5,6 (CAMPOS, 1995).

2.12.1.3. Reaccin Familia Plantaginaceae.

El pH utilizado para el cultivo in vitro de Plantago ovata Forssk. es 5,7 (PARAMANIK, CHAKRABORTY y RAYCHAUDHURI, 1995; CHAWDHURY, KUNDU y RAYCHAUDHURI, 1996) y pH 5,8 para Plantago major L. (MEDEROS et al., 1997).

2.12.2. Temperatura y fotoperiodo.

Se obtiene un desarrollo satisfactorio de las plantas cultivadas in vitro al utilizar temperaturas entre 20C y 28C (HARTMANN y KESTER, 1998), en cambio MARGARA (1988) seala que temperaturas adecuadas para este tipo de cultivos van entre 22 y 25C.

HARTMANN y KESTER (1998) sealan que la luz proporcionada a los cultivos in vitro debe ser considerada, en trminos de intensidad, largo del da y calidad, siendo necesaria para la regulacin de procesos como formacin de tallo, induccin radicular y embriognesis asexual. Adems, consideran al igual que MARGARA (1988) que la intensidad de la luz de 1.000 lux es ptima, para muchos cultivos de tejidos.

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2.12.2.1. Temperatura y fotoperiodo Familia Asteraceae.

La incubacin de Gerbera es descrita con un fotoperiodo de 16 horas, una intensidad de luz de 1000 lux y una temperatura de 27C, para estimular el desarrollo de brotes, y de 10000 lux, para iniciar el enraizamiento (MURASHIGE, SERPA y JONES, 1974). Para Gerbera jamesonii se incuba primero en oscuridad a una temperatura de 25C por 4 semanas, y luego con un fotoperiodo de 16 horas, una intensidad de luz de 2100 lux, y una temperatura de 23C por otras 4 semanas (PIERIK et al., 1975). Estos mismos autores obtuvieron un buen enraizamiento y desarrollo de brotes a una baja intensidad de luz (800 lux), en comparacin con una alta intensidad de luz (2100 lux).

Las condiciones de incubacin utilizadas para el cultivo de Tagetes erecta L. son un 24 horas de iluminacin (1000 lux), con una temperatura de 28C (KOTHARI y CHANDRA, 1986).

COCKREL, MC DANIEL y GRAHAM (1986) incuban el cultivo de Senecio cruentus D.C., a 23 1C de temperatura y un fotoperiodo de 16 horas (1000 lux).

La temperatura de incubacin de Robinsonia berteroi Bert. es de 25C, junto con un fotoperiodo de 16 horas y una intensidad lumnica de 33 umoles m2 s-1 (VELOZO, CAMUS y ROJAS, 2000).

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2.12.2.2. Temperatura y fotoperiodo Familia Bromeliaceae.

HOSOKI y ASAHIRA (1980), utilizan para la incubacin in vitro de las 4 especies de Bromeliceas una temperatura de 27 2C, un fotoperiodo de 16 horas y una agitacin constante a 20 rpm.

Puya chilensis se incuba con un fotoperiodo de 16 horas de luz y una temperatura de 24C (CAMPOS, 1995).

2.12.2.3. Temperatura y fotoperiodo Familia Plantaginaceae.

Las condiciones de incubacin utilizadas para el cultivo de Plantago ovata Forssk. son un fotoperiodo de 16 horas de luz con una intensidad de luz de 1500 lux, 55 5% de humedad relativa y 25 1C de temperatura (PARAMANIK, CHAKRABORTY y RAYCHAUDHURI, 1995). En cambio, CHAWDHURY, KUNDU y RAYCHAUDHURI (1996), la incuban con un fotoperiodo de 16 horas luz, 55-60% de humedad relativa y 22-25C de temperatura.

MEDEROS et al. (1997) incuban Plantago major L. con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 24C de temperatura.

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3. MATERIALES Y MTODOS

El presente trabajo de investigacin se realiz en el Laboratorio de Propagacin Profesor Gregorio Rosenberg, de la Facultad de Agronoma de la Pontificia Universidad Catlica de Valparaso, en el perodo comprendido entre agosto 2002 y agosto 2003.

El material vegetal necesario para el cultivo y desarrollo de estas especies en estudio, fue extrado desde el vivero del Jardn Botnico Nacional, ubicado en Camino el Olivar s/n, Via del Mar, Quinta Regin.

Se seleccionaron plantas de las especies Dendroseris litoralis, Dendroseris neriifolia, Robinsonia gayana, Robinsonia thurifera, Ochagavia elegans y Plantago fernandezia. De todas estas plantas, a excepcin de Dendroseris litoralis, solo una de cada especie fueron trasladadas al sombreadero perteneciente al Laboratorio de Propagacin, ubicado a un costado del mismo. En este lugar, las plantas fueron desinfectadas con una solucin fungicida de Captan ms Benlate al 1.5%, media hora antes de la extraccin del material para su uso en el laboratorio.

De estas plantas, aquellas pertenecientes a la familia Asteraceae (Dendroseris litoralis, Dendroseris neriifolia, Robinsonia gayana, Robinsonia thurifera), se tomaron y seleccionaron hojas con y sin pecolo (Robinsonia gayana y Robinsonia thurifera), del sector superior, medio e inferior del follaje, del cual se obtuvieron, como explantes, secciones de hoja de, aproximadamente 1cm2, para el cultivo in vitro.

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De la planta perteneciente a la familia Bromeliaceae (Ochagavia elegans), se tomaron hojas basales y apicales, de las cuales se obtuvieron como explantes, secciones de hojas de aproximadamente 1cm2, y del tallo, secciones del mismo con y sin yemas apicales y basales.

De la planta perteneciente a la familia Plantaginaceae, se tomaron frutos (simples) con dos estados distintos de madurez, de los cuales se extrajeron semillas para realizar ensayos de germinacin.

Basndose en la tcnica descrita por PIERIK (1987), se prepararon los medios de cultivo mediante soluciones madres. Para stas y para las diluciones de los medios de cultivo, se utiliz agua bidestilada.

Los compuestos orgnicos y las sales minerales fueron pesados en una balanza analtica, y para la medicin de los lquidos, se utilizaron matraces Erlenmeyer, pipetas graduadas, probetas y matraces de aforo.

Se homogeneiz la solucin con un agitador magntico, y con un pH-metro se ajust el pH. Posteriormente se calent la solucin en un anafe elctrico y a los 60C se aplic el agar, se agit y mantuvo hasta alcanzar los 98C.

Se utiliz para los ensayos tubos de vidrio de 37 ml, vertiendo aproximadamente 10 ml de medio por tubo, y luego cubrindolos con cuadrados de papel de aluminio de 25 cm2. La esterilizacin de los medios se realiz en un autoclave controlado manualmente a 121C y 1,1 bar de presin durante 15 minutos.

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El aislamiento e inoculacin del material vegetal se realiz en condiciones de asepsia dentro de una cmara de flujo laminar, con aire filtrado de 0,2 micras, la que previamente se desinfect con etanol al 96% y se aplic luz UV por media hora. El material quirrgico como pinzas, porta bistures, bistures y Placas de Petri, algodn y papel gofrado, se esterilizaron en una estufa de calor seco (105C). La manipulacin de los explantes se realiz cerca de un mechero (metanol), el material quirrgico se flame constantemente, la boca de los tubos se orient hacia la corriente de aire filtrado y se utiliz mascarilla para reducir la contaminacin.

Para el desarrollo de los explantes de hojas, yemas y tallos, se utiliz una cmara de crecimiento con temperatura controlada (232C) y un fotoperiodo de 16 horas de luz; en cambio, para semillas, se utiliz una cmara de crecimiento con temperatura controlada (272C) y un fotoperiodo de 16 horas de luz.

Ensayo 1. Efecto de cuatro protocolos de desinfeccin sobre los explantes de hojas de las especies Dendroseris litoralis, Dendroseris neriifolia, Robinsonia gayana y Robinsonia thurifera, familia Asteraceae.

El medio nutritivo que se utiliz en este ensayo, consisti en una solucin con macro y micro nutrientes de WPM (Woody Plant Medium) (LLOYD y McCOWN, 1981), cido ascrbico (100 mg/l), 7g/l de agar, ajustada a pH 5,5.

La desinfeccin se realiz, basndose en el protocolo de desinfeccin para plantas leosas, del Laboratorio de Propagacin de la Facultad de Agronoma, Pontificia Universidad Catlica de Valparaso.

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De este modo, las hojas de estas especies fueron lavadas superficialmente con abundante agua corriente, para quitar esporas de hongos y restos de tierra.

A continuacin, las hojas se sometieron a los siguientes tratamientos: Tratamiento 1: Desinfeccin con hipoclorito de sodio al 1%, ms cido ctrico (500 ppm) y cido ascrbico (500 ppm). Tratamiento 2: Desinfeccin con etanol al 70%, ms hipoclorito de sodio al 1%, cido ctrico (500 ppm) y cido ascrbico (500 ppm). Tratamiento 3: Desinfeccin con hipoclorito de sodio al 1,5%, ms cido ctrico (500 ppm) y cido ascrbico (500 ppm). Tratamiento 4: Desinfeccin con etanol al 70%, ms hipoclorito de sodio al 1,5%, cido ctrico (500 ppm) y cido ascrbico (500 ppm).

La preparacin de las soluciones desinfectantes para cada tratamiento se realiz utilizando matraces de 1000 ml. y fueron guardadas en botellas plsticas de 1000 ml. hasta el momento de su uso.

Las desinfecciones se realizaron en vasos precipitados de 500 y 1000 ml. Para aquellas en las que se us alcohol al 70%, las hojas se sumergieron en ste durante 10 segundos y se enjuagaron inmediatamente con una solucin de agua destilada estril ms cido ctrico y cido ascrbico (500 ppm cada uno), sobre un colador para eliminar restos del alcohol.

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Este experimento fue conducido como Diseo Completamente al Azar (DCA), con el siguiente Modelo matemtico: Yij = uij + + Donde: Yij : Valor observado en cada unidad experimental. uij : Efecto de la Media General sobre cada observacin. : Efecto del Tratamiento sobre cada observacin. : Efecto del error experimental Aleatorio sobre cada observacin.

Se realizaron 25 repeticiones por tratamiento, considerando a cada explante como una repeticin. Se evaluaron en cada caso las variables sobrevivencia y grado de oxidacin de los explantes. Las mediciones se realizaron cada 15 das, a partir de la segunda semana de cultivo.

La sobrevivencia fue evaluada en porcentaje de explantes sobrevivientes, segn la presencia o ausencia de sta, as como tambin la incidencia o causa de sta (hongo y/o bacteria). Las mediciones se efectuaron hasta el da 80, asumiendo que despus del da 80 no existi contaminacin posterior.

Para la evaluacin del grado de oxidacin se utiliz la Escala Relativa de Pardeamiento (ERP) descrita por ZIV y HALEVY (1983), asignando una calificacin a cada estado del explante para cada especie, especificada en el ensayo 2. Los resultados de sobrevivencia y grado de oxidacin de los explantes, se registraron de forma similar al Cuadro 1.

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CUADRO 1. Efecto de cuatro protocolos de desinfeccin y un origen de explante sobre el porcentaje de sobrevivencia y oxidacin de los explantes in vitro. Tratamiento T1: Desinfeccin 1 T2: Desinfeccin 2 T3: Desinfeccin 3 T4: Desinfeccin 4 Sobrevivencia de explantes (%) Da 20** Da 40 Da 80 Oxidacin por explante Da 75

Ensayo 2: Efecto de dos medios de cultivo slidos sobre la oxidacin promedio, callosidad y color de explantes de hojas, de cuatro Asterceas y, explantes de yemas de Robinsonia thurifera, en la etapa de establecimiento in vitro.

El material vegetal que se utiliz para ser establecido in vitro, fueron hojas y yemas (tercio medio y superior), provenientes de la respectiva planta madre para cada especie, obtenidas durante los primeros 15 das de febrero. La desinfeccin usada fue aquella en la que se obtuvo el mejor resultado en cuanto a menor contaminacin y el mejor resultado en cuanto a menor oxidacin.

Su establecimiento se realiz utilizando 2 tratamientos, cada uno de ellos con el medio nutritivo base macro y micro nutrientes de WPM (LLOYD y McCOWN, 1981), vitaminas de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), que contenan dos reguladores de crecimiento (auxinas y citoquininas) en distintas concentraciones, 30 g/l de sacarosa, 1g/l de PVPP, 7 g/l de agar, ajustado a pH 5,5. Los tratamientos que se evaluaron fueron los siguientes: Tratamiento 1: 1 mg/l de ANA ms 2 mg/l de BAP. Tratamiento 2: 1 mg/l de ANA ms 3,5 mg/l de BAP.

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Luego los explantes se mantuvieron en la cmara de crecimiento (23 2C) por una semana en completa oscuridad, y, con el tiempo, fueron expuestos gradualmente a la luz directa.

En este ensayo, se evaluaron las variables contaminacin, grado de oxidacin y color, para explantes de hojas, incluyendo las variables longitud del brote y nmero de hojas para explantes de yemas. Las mediciones se realizaron cada 15 das, a partir de la segunda semana posterior al cultivo.

La contaminacin fue evaluada en porcentaje de explantes sobrevivientes, segn la presencia o ausencia de sta, as como tambin la incidencia o causa de sta (hongo y/o bacteria). Las mediciones se realizaron cada quince das. Las anotaciones de las observaciones se registraron de forma similar al Cuadro 2.

CUADRO 2. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie, segn el medio de cultivo. Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Da 20 Da 40 Da 60

Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2

Para la evaluacin del grado de oxidacin, se utiliz una Escala Relativa de Pardeamiento (ERP) similar a la descrita por ZIV y HALEVY (1983), asignando una calificacin a cada estado del explante, segn la especie.

Para las especies del gnero Robinsonia y la especie Dendroseris litoralis, la escala utilizada es la siguiente:

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1 : Tejido sin pardeamiento. 2 : Tejido con pardeamiento en cortes. 3 : Tejido con pardeamiento heterogneo leve 4 : Tejido con pardeamiento homogneo leve. 5 : Tejido con pardeamiento heterogneo fuerte 6 : Tejido con pardeamiento homogneo fuerte 7 : Necrosis total del explante.

Para la especie Dendroseris neriifolia, las calificaciones para formar la ERP son las siguientes: 1 : Tejido sin pardeamiento. 2 : Tejido con pardeamiento heterogneo 3 : Tejido con pardeamiento homogneo leve. 4 : Tejido con pardeamiento homogneo leve y fuerte en la nervadura. 5 : Tejido con pardeamiento homogneo fuerte 6 : Necrosis total del explante.

Para evaluar el grado de tejido de callo, se utiliz tambin una escala similar, asignando una calificacin a cada estado del explante, la que vari segn la especie. Para las especies del gnero Robinsonia, la calificacin utilizada se seala a continuacin: 1 : Explante sin presencia de tejido de callo. 2 : Explante con tejido de callo en dos cortes. 3 : Explante con tejido de callo en dos cortes y nervadura. 4 : Explante con tejido de callo en ms de dos cortes. 5 : Explante con tejido de callo en ms de dos cortes y nervadura.

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Para la especie Dendroseris litoralis, las calificaciones asignadas para cada estado del explante son las siguientes: 1 : Explante sin presencia de tejido de callo. 2 : Explante con tejido de callo en dos cortes. 3 : Explante con tejido de callo en ms de dos cortes 4 : Explante con tejido de callo en ms de dos cortes y nervadura. 5 : Explante con tejido de callo en todo el explante.

Para la especie Dendroseris neriifolia, se midi esta variable con la siguiente calificacin: 1 : Explante sin presencia de tejido de callo. 2 : Explante con tejido de callo en un corte. 3 : Explante con tejido de callo en ms de un corte.

El color fue medido de acuerdo a una tabla Munsell (MUNSELL, 1998), asignando un nmero a cada color del explante y asocindolo a un valor de la tabla especfico para cada especie. En la especie Dendroseris litoralis, se ocup la siguiente escala de color: 1: verde oscuro 3: verde oscuro pardeado 4: verde amarillo 5: amarillo 6: naranjo caf 7: caf claro 8: caf oscuro 3/4 5 GY 3/2 7.5 GY 8/6 2.5 GY 8/10 5Y 7/8 2.5 Y 5/4 2.5 Y 3/2 5YR

2: verde propio de la especie 5/8 7.5 GY

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En la especie Dendroseris neriifolia, se ocup la siguiente escala de color: 1: verde oscuro 2: verde propio de la especie 3: verde amarillo 4: verde caf 5: caf anaranjado 6: caf plomizo 3/4 5 GY 5/10 5GY 3/2 7.5 GY 8/6 2.5 GY 8/10 5Y 7/8 2.5 Y

En Robinsonia gayana, se utiliz la siguiente escala de color: 1: verde oscuro 2: verde propio de la especie 3: verde claro 4: verde amarillo 5: verde oscuro opaco 6: caf oscuro 7: caf muy oscuro 3/4 5 GY 5/6 7.5 GY 5/8 5 GY 8/10 2.5 GY 4/4 7.5 YR 4/2 7.5 YR 3/2 5 YR

En Robinsonia thurifera, se ocup la siguiente escala de color: 1: verde oscuro 2: verde propio de la especie 3: verde claro 4: verde oscuro opaco 5: caf claro 6: caf muy oscuro 3/4 5 GY 4/6 5 GY 5/10 5 GY 4/4 7.5 YR 5/6 2.5 Y 3/2 5 YR

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Las variables longitud del explante, nmero de brotes y nmero de hojas se analizaron descriptivamente para las yemas, debido a que el nmero de repeticiones no era representativo para comparar tratamientos y evaluarlos estadsticamente.

Las mediciones de longitud se realizaron con un pie de metro de marca Mitutoyo por fuera del tubo o frasco de vidrio, donde los explantes fueron medidos desde la superficie del medio de cultivo hasta el pice del explante. En las mediciones de nmero de hoja, se consider hoja a aquella totalmente expandida.

El experimento fue conducido como Diseo Completamente al Azar (DCA), con el mismo Modelo matemtico descrito en el ensayo 1.

La variable cuantitativa sobrevivencia fue contrastada con el Test de Tukey. Las variables oxidacin y tejido de callo, tambin fueron contrastadas con el Test de Tukey, debido a que la escala numrica asignada a cada estado del explante corresponde a una graduacin, donde un estado es mejor que el siguiente. Lo anterior no se cumple para la variable respuesta color, porque fue medida a travs de rangos, por lo que no cumple con el supuesto de normalidad de los datos, siendo necesario el uso del Test U de Mann-Whitney, el cual es equivalente al Test no paramtrico T-Student (CANAVOS, 1988; SPIEGEL, 1991), cuyo estadstico de prueba, U de Mann-Whitney est dado por:

U = n1 * n2 +

n1 (n1 +1) R1 2

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Donde, U es una funcin de la variable aleatoria R1 y de los tamaos de las muestras n1 y n2. Si H0 es cierta, la ocurrencia de cualquier orden particular para las observaciones en el conjunto combinado es equiprobable. Por lo tanto, bajo H0, R1 es la suma de n1 enteros positivos seleccionados en forma aleatoria de entre los primeros n1 + n2. De acuerdo a lo anterior, puede determinarse que: E(R1) = n1 (n1 + n2 + 1) / 2 Var(R1) = n1 * n2 (n1 + n2 + 1) / 12. Por lo tanto, se tiene que:

E (U ) = n1 * n2 + y

n1 (n1 +1) n *n E ( R1 ) = 1 2 2 2

Var (U ) = Var ( R1 ) = (n1 * n2 ) *

n1 + n2 +1 . 12

Para una hiptesis alternativa bilateral, es probable que se rechace H0 si se obtiene un valor muy grande o muy pequeo de U. Lo anterior ocurrir cuando el valor de R1 es muy grande o muy pequeo, respectivamente. Sin embargo, cuando n1 y n2 son mayores de 10, la distribucin de U se encuentra, en forma adecuada, aproximada por una distribucin normal con media y varianza dadas anteriormente. Por lo tanto, bajo H0 la variable aleatoria

Z =

U E (U ) Var (U )

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es aproximadamente N(0,1) para valores grandes de n1 y n2. La hiptesis de nulidad puede establecerse como sigue: H0 = No existe efecto de los tratamientos sobre el color.

La decisin de rechazar o no rechazar H0 est basada en el valor-p, que corresponde al nivel de significacin ms bajo con el cual el valor del estadstico de prueba observado es significativamente distinto a lo propuesto en H0. Luego, si se trabaja con un nivel de significacin =0,05 la regla de decisin es: Se Rechaza H0 si: Valor-p < =0,05.

Cuando se rechaza la hiptesis nula, existe efecto de tratamiento, lo que implica que al menos un par de medias son distintas, en este caso se debe utilizar un test para comparar todos los pares de medias.

Ensayo 3: Efecto de dos medios de cultivo lquidos sobre la oxidacin promedio, callosidad y color de explantes de hojas en la etapa de establecimiento in vitro, de cuatro especies de la familia Asteraceae.

Se utiliz como material vegetal para ser establecido in vitro, hojas provenientes de la respectiva planta madre para cada especie, obtenidas a fines de abril para Dendroseris neriifolia, a mediados de mayo para Dendroseris litoralis, Robinsonia gayana y Robinsonia thurifera.

La desinfeccin usada fue aquella en la que se obtuvo el mejor resultado en cuanto a mayor sobrevivencia y el mejor resultado en cuanto a menor oxidacin.

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Su establecimiento se realiz utilizando 2 tratamientos, cada uno de ellos con el mismo medio nutritivo utilizado en el ensayo anterior, macro y micro nutrientes de WPM (LLOYD y McCOWN, 1981), vitaminas de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), conteniendo las mismas concentraciones de auxinas y citoquininas, 30 g/l de sacarosa, 1g/l de PVPP, pero lquido, ajustado a pH 5,5; en tubos de ensayo sobre un soporte metlico en agitacin constante, bajo las mismas condiciones ambientales del ensayo anterior, para su desarrollo.

En este ensayo, se evaluaron las variables sobrevivencia, grado de oxidacin, callosidad y color. Las mediciones se realizaron cada 15 das, a partir de la segunda semana de cultivo. Para la evaluacin del grado de oxidacin de cada especie, se utiliz la ERP, descrita en el segundo ensayo.

Debido a la escasa cantidad de explantes disponibles por planta, se usaron pocos, seis para las especies Dendroseris litoralis, Robinsonia thurifera, y diez para Dendroseris neriifolia y Robinsonia gayana, por lo tanto, los resultados fueron analizados descriptivamente.

Ensayo 4: Efecto de dos medios de cultivo slidos sobre la oxidacin, callosidad y color de explantes de hoja en la etapa de establecimiento in vitro para cuatro especies de la familia Asteraceae.

El material vegetal que se utiliz para ser establecido in vitro, fueron hojas provenientes de la respectiva planta madre para cada especie, obtenidas a fines de abril para Dendroseris neriifolia y Robinsonia gayana y, a mediados de mayo para Dendroseris litoralis y Robinsonia thurifera.

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Al igual que el ensayo anterior, se utiliz la desinfeccin en la que se obtuvo el mejor resultado en cuanto a menor contaminacin y menor oxidacin. Su establecimiento se realiz utilizando 2 tratamientos, cada uno de ellos con el mismo medio nutritivo base utilizado en el ensayo anterior, macro y micro nutrientes de WPM (LLOYD y MCCOWN, 1981), vitaminas de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), 30 g/l de sacarosa, 1g/l de PVPP, 0,3 g/l de carbn activado, 7 g/l de agar, ajustado a pH 5,5.

Los tratamientos que se evaluaron fueron los siguientes: Tratamiento 1: 1 mg/l de ANA ms 2 mg/l de BAP. Tratamiento 2: 1 mg/l de ANA ms 4,5 mg/l de BAP.

Se realizaron 25 repeticiones por tratamiento para explantes de hojas, considerando a cada explante como una repeticin. Tambin, se evaluaron las variables contaminacin, grado de oxidacin y color, cuyas mediciones se realizaron cada 15 das, a partir de la segunda semana posterior al cultivo.

La contaminacin fue evaluada en porcentaje de explantes sobrevivientes, segn la presencia o ausencia de sta, as como tambin la incidencia o causa de sta (hongo y/o bacteria). Las observaciones se registraron de forma similar al cuadro 2, en el ensayo 2.

Para la evaluacin del grado de oxidacin, se utiliz la Escala Relativa de Pardeamiento (EPR) descrita por ZIV y HALEVY (1983), asignando una calificacin a cada estado del explante, especificada en el ensayo 2 para cada especie.

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El experimento fue conducido como Diseo completamente al azar (DCA), usando el mismo Modelo matemtico descrito en el ensayo uno.

La variable cuantitativa sobrevivencia fue contrastada con el Test de Tukey. Las variables cualitativas oxidacin y tejido de callo, tambin fueron contrastadas con el Test de Tukey, debido a que la escala numrica asignada a cada estado del explante corresponde a una graduacin, donde un estado es mejor que el siguiente. Lo anterior no se cumple para el color, por lo que ste fue contrastado con el Test no paramtrico de Mann-Whitney, descrito en el ensayo dos.

Ensayo 5: Efecto de dos medios de cultivo slidos sobre la oxidacin y color de explantes de hoja en la etapa de establecimiento in vitro para Robinsonia thurifera, familia Asteraceae.

El material vegetal que se utiliz para ser establecido in vitro, fueron hojas (tercio superior) de un brote lateral, de 15 cm de longitud, provenientes de la respectiva planta madre, obtenidas a mediados de mayo.

La desinfeccin se realiz basndose en el protocolo de desinfeccin para plantas leosas, del Laboratorio de Propagacin de la Facultad de Agronoma, Pontificia Universidad Catlica de Valparaso. Al igual que el ensayo 2, 3 y 4, se utiliz la desinfeccin que obtuvo el mejor resultado en cuanto a mayor sobrevivencia y una baja oxidacin.

El medio nutritivo base que se utiliz en este ensayo, consisti en una solucin con macro y micro nutrientes de WPM (LLOYD y McCOWN, 1981), vitaminas de MS

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(MURASHIGE y SKOOG, 1962), cido ascrbico (100 mg/l), 30 g/l de sacarosa, 3 g/l de carbn activado, 6 g/l de agar, ajustado a pH 5,5.

Su establecimiento se realiz utilizando los siguientes tratamientos: Tratamiento 1: 1 mg/l de ANA ms 2 mg/l de BAP. Tratamiento 2: 1 mg/l de ANA ms 4,5 mg/l de BAP.

Se realizaron 20 repeticiones por tratamiento, considerando a cada explante como una repeticin y, se evaluaron las variables sobrevivencia, grado de oxidacin y color. Las mediciones se realizaron 30 das posterior al cultivo.

La contaminacin fue evaluada en porcentaje de explantes sobrevivientes, segn la presencia o ausencia de sta, as como tambin la incidencia o causa de sta (hongo y/o bacteria). Las anotaciones de las observaciones se registraron de forma similar al cuadro 2.

Para la evaluacin del grado de oxidacin se utiliz la Escala Relativa de Pardeamiento (EPR) descrita por ZIV y HALEVY (1983), asignando una calificacin a cada estado del explante, especificada en el ensayo 2.

El experimento fue conducido como Diseo Completamente al Azar (DCA), usando el mismo Modelo matemtico descrito en el ensayo 1.

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La variable cuantitativa sobrevivencia fue contrastada con el Test de Tukey. Las variables cualitativas oxidacin y tejido de callo, tambin fueron contrastadas con el Test de Tukey, debido a que la escala numrica asignada a cada estado del explante corresponde a una graduacin, donde un estado es mejor que el siguiente. Lo anterior no se cumple para el color, por lo que ste fue contrastado con el Test no paramtrico de Mann-Whitney, descrito en el segundo ensayo.

Ensayo 6: Efecto de cuatro protocolos de desinfeccin sobre los explantes de hojas en la especie Ochagavia elegans, familia Bromeliaceae.

El material vegetal usado fueron hojas basales, obteniendo como explantes secciones de hojas de aproximadamente 1cm2.

El medio nutritivo que se utiliz en este ensayo, consisti en una solucin con macro y micro nutrientes de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), cido ascrbico (100 mg/l), 7% de agar, ajustado a pH 5,5.

La desinfeccin se realiz basndose en el protocolo de desinfeccin para plantas leosas, del Laboratorio de Propagacin de la Facultad de Agronoma, Pontificia Universidad Catlica de Valparaso. De este modo, las hojas de estas especies fueron lavadas y escobilladas superficialmente con abundante agua corriente, para quitar restos de tierra y esporas. Luego, las hojas fueron sometidas a los siguientes tratamientos:

Tratamiento 1: Desinfeccin con hipoclorito de sodio al 1%, ms cido ctrico (500 ppm) y cido ascrbico (500 ppm).

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Tratamiento 2: Desinfeccin con etanol al 70%, ms hipoclorito de sodio al 1%, cido ctrico (500 ppm) y cido ascrbico (500 ppm). Tratamiento 3: Desinfeccin con hipoclorito de sodio al 1,5%, ms cido ctrico (500 ppm) y cido ascrbico (500 ppm). Tratamiento 4: Desinfeccin con etanol al 70%, ms hipoclorito de sodio al 1,5%, cido ctrico (500 ppm) y cido ascrbico (500 ppm).

El experimento fue conducido como Diseo Completamente al Azar (DCA), cuyo Modelo matemtico fue descrito en el primer ensayo.

Se realizaron 25 repeticiones por tratamiento, considerando a cada explante como una repeticin. Se evaluaron en cada caso las variables sobrevivencia y oxidacin de los explantes, cuyas mediciones se efectuaron cada 15 das, hasta el da 75.

La sobrevivencia fue evaluada en porcentaje de explantes sobrevivientes, segn la presencia o ausencia de sta, as como tambin la incidencia o causa de sta (hongo y/o bacteria). Las anotaciones de las observaciones se registraron de forma similar al Cuadro 1.

Para la evaluacin del grado de oxidacin se utiliz la Escala Relativa de Pardeamiento (ERP) descrita por ZIV y HALEVY (1983), asignando una calificacin a cada estado del explante para cada especie, descrita en el siguiente ensayo. Los resultados fueron expresados de forma similar al cuadro 2.

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Ensayo 7: Efecto de dos medios de cultivo sobre la oxidacin promedio y color de tres tipos de explantes en la etapa de establecimiento in vitro, en Ochagavia elegans.

El material vegetal que se utiliz para ser establecido in vitro fueron hojas y tallos, obtenidos a mediados de febrero. Del tallo se obtuvieron secciones de tallo con y sin yemas apicales y basales provenientes de plantas madre de semilla, sembradas el ao 2000. La planta madre se traslad desde el vivero del Jardn Botnico de Via del Mar hasta el sombreadero perteneciente al Laboratorio de Propagacin.

Su establecimiento se realiz utilizando 2 tratamientos, cada uno de ellos con el mismo medio nutritivo, conteniendo diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento. El medio nutritivo base usado es macro y micro nutrientes de RM (REINERT y MOHR, 1967) con 30 g/l de azcar, vitaminas de RM, 6 g/l de agar, ajustado a pH 5,6. Los tratamientos que se evaluaron fueron los siguientes:

Tratamiento 1: 1 mg/l de ANA ms 2 mg/l de Kinetina. Tratamiento 2: 1 mg/l de ANA ms 3 mg/l de Kinetina.

En este ensayo, se evaluaron las variables contaminacin, grado de oxidacin, callosidad y color, cuyas mediciones se realizaron cada 15 das a partir de la segunda semana posterior al cultivo.

Para la evaluacin del grado de oxidacin se utiliz la Escala Relativa de Pardeamiento (EPR) descrita por ZIV y HALEVY (1983), pero la calificacin asignada a cada estado del explante vari, segn el tipo de explante probado. En el caso de secciones de hoja estas se describen a continuacin:

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1 : Tejido sin pardeamiento. 2 : Tejido con pardeamiento en uno de los cortes. 3 : Tejido con pardeamiento en ms de un corte. 4 : Tejido con pardeamiento en todos los cortes. 5 : Tejido con pardeamiento total del explante.

En el caso de yemas, tanto apicales como basales, la calificacin fue la siguiente: 1 : Tejido sin pardeamiento. 2 : Tejido con pardeamiento leve en el trozo de tallo 3 : Tejido con pardeamiento homogneo leve. 4 : Tejido con pardeamiento fuerte en el trozo de tallo. 5 : Tejido con pardeamiento homogneo fuerte. 6 : Necrosis total del explante.

El experimento fue conducido como Diseo Completamente al Azar (DCA), con el Modelo matemtico detallado en el primer ensayo.

Las variables cuantitativas longitud del explante (crecimiento), nmero de brotes, nmero de hojas y sobrevivencia fueron contrastadas con el Test de Tukey. Las variables oxidacin y tejido de callo, tambin fueron contrastadas con el Test de Tukey, debido a que la escala numrica asignada a cada estado del explante corresponde a una graduacin, donde un estado es mejor que el siguiente. Lo anterior no se cumple para el color, siendo contrastado con el Test no paramtrico de Mann-Whitney, especificado en el segundo ensayo.

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La medicin del color se realiz de igual forma que los ensayos anteriores, de acuerdo a una tabla Munsell (MUNSELL, 1998), asignando un nmero a cada color del explante y asocindolo a un valor de la tabla especfico para cada especie.

En este caso se ocup la siguiente escala de color para explantes de hoja: 1: blanco propio de la especie 3: verde claro propio de la especie 4: verde amarillo 5: verde pardeado 6: caf claro 8/4 5Y 7/10 5GY 7/8 2.5 GY 5/4 2.5 GY 6/6 2.5 Y

2: verde oscuro propio de la especie 4/4 7.5 GY

Para explantes de yemas y tallos, se utiliz la escala de color siguiente: 1: blanco propio de la especie 2: caf claro 3: caf oscuro 8/4 5Y 6/6 2.5 Y 4/2 7.5 YR

Ensayo 8: Efecto de dos medios de cultivo con carbn activo sobre la oxidacin promedio y el color de tres tipos de explantes en la etapa de establecimiento in vitro, para Ochagavia elegans.

El material vegetal que se utiliz para ser establecido in vitro fue similar al ensayo anterior, hojas y tallos, obtenidos a principios de mayo, pero de otra planta obtenida de semilla del mismo ao. Al igual que en el ensayo anterior los explantes correspondieron a secciones de tallo, pero solamente con yemas. En este caso

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tambin la planta madre se traslad desde el vivero del Jardn Botnico de Via del Mar hasta el sombreadero perteneciente al Laboratorio de Propagacin.

Para su establecimiento, se realizaron 2 tratamientos, cada uno de ellos con el mismo medio nutritivo, conteniendo diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento que el ensayo anterior. El medio nutritivo base usado, macro y micro nutrientes de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), vitaminas de MS, con 25 g/l de azcar, 0,3 g/l carbn activo, 7,5 g/l de agar, ajustado a pH 5,7. Los tratamientos que se evaluaron fueron los siguientes: Tratamiento 1: 0,2 mg/l de AIB ms 0,4 mg/l de BAP. Tratamiento 2: 0,2 mg/l de AIB ms 0,7 mg/l de BAP.

El experimento fue conducido como Diseo Completamente al Azar (DCA). Se utilizaron 20 repeticiones por tratamiento, considerando a cada explante como una repeticin. El Modelo matemtico usado fue descrito en el ensayo 1.

Se evaluaron en este ensayo las variables contaminacin, grado de oxidacin y color, para explantes de hojas, agregando la variable largo del explante, para explantes de yemas, cuyas mediciones se realizaron cada 15 das a partir de la segunda semana posterior al cultivo.

La sobrevivencia fue evaluada en porcentaje de explantes sobrevivientes. Las mediciones se efectuaron cada 15 das, hasta el da 90, asumiendo que despus del da 90 no existi contaminacin posterior. Las anotaciones de las observaciones se registraron de forma similar al cuadro 2, para explantes de hojas.

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El grado de oxidacin se evalu al igual que el ensayo anterior, utilizando la Escala Relativa de Pardeamiento (ERP) descrita por ZIV y HALEVY (1983), con las mismas calificaciones detalladas. En el caso de secciones de hoja estas calificaciones se describen a continuacin: 1 : Tejido sin pardeamiento. 2 : Tejido con pardeamiento en uno de los cortes. 3 : Tejido con pardeamiento en ms de un corte. 4 : Tejido con pardeamiento en todos los cortes. 5 : Tejido con pardeamiento total del explante.

En el caso de yemas, la calificacin fue la siguiente: 1 : Tejido sin pardeamiento. 2 : Tejido con pardeamiento leve en el trozo de tallo 3 : Tejido con pardeamiento homogneo leve. 4 : Tejido con pardeamiento fuerte en el trozo tallo. 5 : Tejido con pardeamiento homogneo fuerte. 6 : Necrosis total del explante.

La variable cuantitativa sobrevivencia y las variables cualitativas oxidacin y tejido de callo fueron contrastadas con el Test de Tukey. En cambio para el color lo anterior no se cumple, siendo contrastado con el Test no paramtrico de MannWhitney, descrito en el ensayo dos.

La medicin del color tambin se realiz de igual forma que los ensayos anteriores, de acuerdo a una tabla Munsell (MUNSELL, 1998) asignando un nmero a cada

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color del explante y asocindolo a un valor de la tabla especfico para cada especie, pero con una calificacin distinta al ensayo anterior.

En este caso se ocup la siguiente escala de color para explantes de hoja: 1: blanco propio de la especie 2: verde oscuro propio de la especie 3: verde oscuro pardeado 4: verde claro propio de la especie 5: caf claro 8/4 5Y 4/4 7.5 GY 5/8 5GY 7/10 5GY 6/6 2.5 Y

Para explantes de yemas y tallos, se utiliz la escala de color siguiente: 1: blanco propio de la especie 2: verde claro propio de la especie 3: caf claro 4: caf rojizo 5: caf oscuro 8/4 5Y 8/6 2.5 GY 6/6 2.5 Y 4/4 7.5 YR 4/2 7.5 YR

Ensayo 9: Germinacin de semillas de Ochagavia elegans R. A. Phill.

El objetivo de este ensayo fue probar otra alternativa de explantes, disponible en abundancia para esta especie recalcitrante, sin tener que destruir algunas plantas.

Se utiliz como material vegetal flores maduras de Ochagavia elegans, colectadas a fines de octubre del ao 2002 a partir de algunas plantas establecidas en terreno

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bajo malla semisombra, en sector Islas Ocenicas del Jardn Botnico de Via del Mar, siendo facilitadas por el colector Oscar Fernndez, a inicios de febrero del ao 2003. Posteriormente, en el mes de abril, se extrajeron las semillas desde la base de una flor (ovario) para ser sembradas in vitro.

La desinfeccin de las semillas se realiz sumergiendo stas en una solucin de hipoclorito de sodio al 1% ms tween 20, dentro de una jeringa (40 ml) durante 10 minutos. Luego, fueron enjuagadas 3 veces con agua destilada estril, expulsando los restos de detergente mediante una aguja hipodrmica unida a la punta de la jeringa.

La siembra de las semillas se realiz en tubos de vidrio de 37 ml, sobre un medio de germinacin de ctricos utilizado en el Laboratorio de Propagacin de la Facultad de Agronoma, Pontificia Universidad Catlica de Valparaso, conteniendo una semilla por tubo. El medio nutritivo base utilizado es macro nutrientes y micro nutrientes de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), sin vitaminas, 8 g/l de agar, ajustado a pH 5,5.

Las semillas se mantuvieron en una cmara de crecimiento con una temperatura controlada (27 2C) y ciclos alternantes de luz y oscuridad, siendo 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad.

Ensayo 10: Germinacin de semillas de la especie Plantago fernandezia (Dcne) Bert.

El objetivo de este ensayo era construir curvas de germinacin, las cuales se obtienen al representar grficamente el tanto por ciento de semillas germinadas, con relacin al tiempo transcurrido desde la siembra (PREZ, PITA y GOMEZ, 1994).

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Para esto, se recolectaron frutos nuevos y maduros de Plantago fernandezia (Dcne) Bert. en el vivero del Jardn Botnico de Via del Mar, de la nica planta madre existente con la capacidad de dar frutos, establecida en un macetero plstico de 20 m3. Los frutos nuevos y maduros fueron colectados en invierno (julio, 2002) y primavera (fines de octubre, 2002), respectivamente.

Luego de colectados los frutos, se les extrajo las semillas. Estas ltimas fueron sumergidas y agitadas en una solucin fungicida de Captan ms Benlate al 1.5%, y posteriormente enjuagadas con agua destilada estril. La desinfeccin de las semillas, se realiz utilizando hipoclorito de sodio al 1% por 10 minutos, ms tween 20. Luego, fueron enjuagadas con agua destilada estril, hasta eliminar los restos del detergente.

La siembra de las semillas se realiz en tubos de vidrio de 37 ml sobre un medio de germinacin, conteniendo una semilla por tubo. El medio nutritivo base utilizado es macro y micronutrientes de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), 8 g/l de agar, pH 5,5, el mismo medio utilizado para ctricos.

La germinacin de las semillas se llev a cabo en cmaras de crecimiento con una temperatura controlada (27 2C) y ciclos alternantes de luz y oscuridad, siendo 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad.

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4. PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS

Ensayo 1: Efecto de cuatro protocolos de desinfeccin sobre los explantes de hojas para cuatro especies de la familia Asteraceae.

Los explantes de hojas de las especies Dendroseris litoralis, Dendroseris neriifolia, Robinsonia gayana y Robinsonia thurifera, colocados sobre un medio WPM cero (sin reguladores de crecimiento), sobrevivieron sin generar algn tipo de crecimiento, hasta que la fuerte oxidacin sobre stos produjo una completa necrosis y muerte de ellos.

4.1.1. Gnero Dendroseris

Se analizan, a continuacin, los resultados obtenidos de los registros de sobrevivencia y oxidacin al cabo de dos meses y medio para explantes de la especie Dendroseris litoralis (Cuadro 1).

CUADRO 1. Efecto de cuatro protocolos de desinfeccin y un origen de explante sobre el porcentaje de sobrevivencia y oxidacin de los explantes in vitro en Dendroseris litoralis. Tratamiento T1: Desinfeccin 1 T2: Desinfeccin 2 T3: Desinfeccin 3 T4: Desinfeccin 4 Sobrevivencia de explantes (%) Da 20** 100 a* 96 b 88 c 100 a Da 40 96 a* 96 a 88 b 96 a Da 80 72 d 88 b 84 c 96 a Oxidacin por explante Da 75 4.0 b* 3.6 a* b 3.32 a 3.48 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

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El porcentaje de explantes sobrevivientes a los 40 das, es alto para todos los tratamientos, presentando una similitud entre los tratamientos uno (T1), dos (T2) y cuatro (T4), siendo la desinfeccin numero tres (T3) la peor, en tanto que, a los 20 das slo los T1 y T4 son superiores al resto. Sin embargo, a los 80 das, todos los tratamientos presentan diferencias (P0.05) entre ellos, siendo T4 la mejor con la menor contaminacin por hongos y bacterias. Esto podra ser debido a que contiene la mayor concentracin de hipoclorito de sodio (1.5%) y la aplicacin previa de etanol (70%).

Aunque la desinfeccin nmero cuatro presenta poca mortalidad hasta el da 80, presenta una alta oxidacin de los explantes, confirmando lo expuesto por McCLELLAND y SMITH (1993) con respecto a la desventaja que posee el hipoclorito de sodio, de producir oxidaciones en los tejidos vivos.

La variable oxidacin, a los dos meses y medio de realizado el cultivo de los explantes, presenta diferencias (P0.05) (Cuadro 1), siendo las desinfecciones nmero tres y cuatro las mejores, ya que muestran la menor oxidacin promedio y, porque T2 al no diferir del resto, es considerada una desinfeccin intermedia. Esto puede deberse a una desinfeccin sin alcohol y a la posicin del explante utilizado en la planta, como es sealado por YU y MEREDITH (1986) en cultivos de vid (Vitis vinfera L.), donde encontraron que la posicin de los explantes y los efectos de la luz, son factores muy significantes para el control del pardeamiento de los tejidos, por efecto de los contenidos fenlicos preexistentes y la posterior sobrevivencia.

En ninguno de los tratamientos hubo formacin de callo u rgano, lo que puede deberse a la falta de compuestos orgnicos en el medio de cultivo como vitaminas y reguladores del crecimiento, acelerndose la mortalidad de los mismos por efecto del pardeamiento. Esto es confirmado por MURASHIGE (1977) para la mayora de

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las plantas propagadas in vitro, donde el xito depende tanto de la seleccin del explante adecuado como la composicin del medio, siendo importante tambin la edad, el estatus de agua y nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE GROOT, 1985).

Es importante indicar que, se usa el medio WPM cero, porque se quiere lograr la obtencin de explantes sanos o libres de patgenos y, porque existen especies que generan crecimiento en respuesta a un medio simple (solo sales inorgnicas), sin la necesidad de agregar compuestos orgnicos. El medio WPM fue desarrollado por LLOYD y McCOWN (1981), para algunas especies leosas sensibles a la salinidad in vitro, como Rhododendron spp. y Kalmia spp.

A esto hay que agregar que los explantes fueron cambiados a un medio renovado a los 98 das de cultivo, con el fin de obtener alguna reaccin positiva, al reducir el efecto del pardeamiento de los compuestos fenlicos liberados al medio, sobre los tejidos del explante, siendo que BROOME y ZIMMERMAN (1978) recomiendan en Rubus ursinus Cham y Schlecht., hacerlo despus de dos das, sin embargo, este es un perodo de tiempo extremo, siendo lo normal para otras especies leosas, traspasarlos al cabo de 30 das de cultivo. A pesar de ser transferidos, los explantes sufrieron una completa necrosis.

La oxidacin de compuestos fenlicos liberados por un rompimiento celular debido a lesiones, es una de las serias causas de prdida al inicio del cultivo (MARKS y SIMPSON, 1989), por inhibicin y muerte de los explantes en un amplio rango de especies (CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975).

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Por lo anterior, se desprende que en el tratamiento nmero cuatro los explantes presentan la menor contaminacin junto con la menor oxidacin, ya que no difiere (P0.05) del tercer tratamiento.

A continuacin, se analizan los resultados obtenidos de los registros de explantes sobrevivientes, durante tres perodos de cultivo y los registros de oxidacin a los dos meses y medio de cultivo, para la especie Dendroseris neriifolia (Cuadro 2).

CUADRO 2. Efecto de cuatro protocolos de desinfeccin y un origen de explante sobre el porcentaje de sobrevivencia y oxidacin de los explantes in vitro de Dendroseris neriifolia. Tratamiento T1: Desinfeccin 1 T2: Desinfeccin 2 T3: Desinfeccin 3 T4: Desinfeccin 4 Sobrevivencia de explantes (%) Da 20** 100 a 96 b 96 b 92 c Da 40 92 b 96 a 96 a 88 c Da 80 88 c 92 b 96 a 84 d Oxidacin por explante Da 75 3.12 a* 3.0 a 3.0 a 3.12 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Se presentan diferencias (P0.05) en el alto porcentaje de explantes sobrevivientes durante los das 20, 40 y 80 de cultivo. A los 20 das, T2 y T3 presentan porcentajes similares de explantes sobrevivientes, siendo superadas solo por T1, en tanto que, a los 40 das, T2 y T3 superan a los restantes. Sin embargo, a los 80 das, la desinfeccin nmero tres es la mejor, con la menor tasa de contaminacin por hongos y bacterias, donde los primeros fueron la principal fuente de contaminacin.

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La baja mortalidad de explantes en T3 hasta el da 80, puede ser debido al igual que en Dendroseris litoralis porque contiene la mayor concentracin de hipoclorito de sodio (1.5%), sin la aplicacin previa de etanol (70%). Sin embargo, presenta tambin oxidacin al igual que los dems tratamientos, de los cuales no difiere, por lo tanto, se desprende que es el mejor.

Esto puede ser al igual que para Dendroseris litoralis favorecido por una desinfeccin con hipoclorito de sodio (McCLELLAND y SMITH, 1993) y, a la posicin del explante utilizado en la planta, como lo sealan YU y MEREDITH (1986), quienes detectaron que existe una fuerte relacin entre el fenmeno de pardeamiento de puntas de brotes de Vitis vinfera L.. como explantes y el origen del explante, por efecto de los contenidos fenlicos preexistentes y la posterior sobrevivencia.

Los explantes fueron cambiados a un medio renovado a los 80 das de cultivo, para intentar reducir la fuerte oxidacin que provocan los compuestos fenlicos liberados al medio de cultivo sobre los tejidos, prolongar el perodo de vida del explante y, obtener alguna respuesta de crecimiento. Con respecto a lo sealado, de forma poco comn para otras especies leosas, recomiendan BROOME y ZIMMERMAN (1978), cambiar los explantes a los dos das de cultivo, en Rubus ursinus Cham y Schlecht., siendo normalmente despus de 30 das, como sucede en Rhododendron spp., cuyos primeros subcultivos se realizan cada dos semanas, pero posteriormente se realizan cada 6 a 8 semanas (HARTMANN y KESTER, 1998). Sin embargo, a pesar del subcultivo en el medio nuevo, los explantes se necrosaron completamente luego de 10 das.

Al igual que en Dendroseris litoralis, los explantes no formaron callos ni rganos en ninguno de los tratamientos, lo que tambin puede deberse a la falta de compuestos

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orgnicos en el medio de cultivo como vitaminas y reguladores del crecimiento, acelerndose la mortalidad de los mismos por efecto del pardeamiento. Esto es sealado por MURASHIGE (1977) para la mayora de las plantas propagadas in vitro, donde el xito depende tanto de la seleccin del explante adecuado como la composicin del medio, siendo importante tambin la edad, el estatus de agua y nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE GROOT, 1985).

4.1.2. Gnero Robinsonia.

Al observar los resultados obtenidos de los registros de explantes sobrevivientes para la especie Robinsonia gayana en el Cuadro 3, se presentan diferencias (P0.05) entre todos los tratamientos, a los 20, 40 y 80 das de cultivo.

CUADRO 3. Efecto de cuatro protocolos de desinfeccin y un origen de explante sobre el porcentaje de sobrevivencia y oxidacin de los explantes in vitro de Robinsonia gayana. Tratamiento T1: Desinfeccin 1 T2: Desinfeccin 2 T3: Desinfeccin 3 T4: Desinfeccin 4 Sobrevivencia de explantes (%) Da 20** 92 b 96 a 72 c 92 b Da 40 72 b 80 a 40 d 64 c Da 80 16 a 4 c 0 d 8 b Oxidacin por explante Da 75 2.76 a* 3.6 a 36 a 3.8 b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

A diferencia de las especies del gnero Dendroseris, los porcentajes de explantes sobrevivientes, son mucho ms bajos, a los 80 das de cultivo. En este caso, la desinfeccin dos, presenta el mayor porcentaje de explantes sobrevivientes hasta

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los 40 das de cultivo, pero a los 80 das, la desinfeccin nmero uno es la mejor, al presentar el mayor porcentaje de explantes sobrevivientes con una menor contaminacin por hongos y bacterias, siendo estas ltimas la principal causa de la alta mortalidad de los explantes en todos los tratamientos, al final del cultivo. El uso de antibiticos en el medio de cultivo, tales como amoxicilina, agramicina (OYANEDEL, 1995) o penicilina, terramicina, estreptomicina, ha sido til para el control del desarrollo de bacterias, incluso, con efectos estimuladores sobre el crecimiento (HARTMANN y KESTER, 1998). Estos antibticos podran ser una buena alternativa para mejorar la sobrevivencia de los explantes en esta especie, evitando la aparicin bacterias, posterior al cultivo o tardamente en l.

La desinfeccin nmero tres (T3) puede haber tenido un insuficiente efecto de la aplicacin de la solucin fungicida (Captan y Benlate) sobre estos explantes, previo a la desinfeccin. Debe mencionarse que en algunos tubos se encontraron tanto hongos como bacterias.

HARTMANN y KESTER (1998) consideran que la desinfeccin es uno de los puntos ms importantes para el xito del cultivo in vitro, sobre todo si se trabaja con material proveniente de sitios en donde no se hacen desinfecciones y no se utilizan como explante tejidos bien protegidos (meristemas) o pices de tallo cubiertos por las escamas foliares (MARGARA, 1988), como es en este caso, en que el material provena del Jardn Botnico de Via del Mar, siendo ms propenso a la penetracin de patgenos.

Los resultados de la variable oxidacin, por explante, para la especie Robinsonia gayana, presentados en el cuadro 3, se describen y analizan a continuacin, luego de 75 das de cultivo.

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Los tratamientos nmero uno, dos y tres (T1, T2 y T3) presentan el menor pardeamiento promedio, al no existir diferencias (P0.05) entre ellos, siendo mejores con respecto al tratamiento nmero cuatro (T4). Sin embargo, se debe considerar que la variable oxidacin es la ms importante que se debe controlar en estas especies, tal como lo confirman MARKS y SIMPSON (1989) para poder alcanzar el xito y un eficiente establecimiento y cultivo de muchas especies in vitro.

El efecto de la oxidacin sobre los explantes puede haber sido causado por el uso de hipoclorito de sodio (1% y 1,5%), que es confirmado por McCLELLAND y SMITH (1993), al sealar la desventaja que posee el hipoclorito de sodio, es decir, producir oxidaciones en los tejidos vivos. Tambin es posible que exista alguna relacin entre el fenmeno de pardeamiento del explante y el origen del explante, tal como sucede entre puntas de brotes de Vitis vinfera L. como explantes y el origen del explante, existiendo una fuerte relacin entre ellos, por efecto de los contenidos fenlicos preexistentes y la posterior sobrevivencia, detectado por YU y MEREDITH (1986).

Al igual que en las otras especies, los explantes no presentan organognesis en ningn tratamiento, quizs tambin debido la falta de compuestos orgnicos en el medio de cultivo (vitaminas, reguladores del crecimiento, etc.), acelerando as la mortalidad de los mismos por efecto del pardeamiento, despus de dos meses y medio. MURASHIGE (1977) confirma que el xito de la mayora de las plantas propagadas in vitro, depende tanto de la seleccin del explante adecuado como de la composicin del medio, siendo importante tambin la edad, el estatus de agua y nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE GROOT, 1985).

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Se analizan a continuacin los resultados de registros de sobrevivencia para los explantes de la especie Robinsonia thurifera (Cuadro 4), durante tres perodos de cultivo.

CUADRO 4. Efecto de cuatro protocolos de desinfeccin y un origen de explante sobre el porcentaje de sobrevivencia y oxidacin de los explantes in vitro de Robinsonia thurifera. Tratamiento T1: Desinfeccin 1 T2: Desinfeccin 2 T3: Desinfeccin 3 T4: Desinfeccin 4 Sobrevivencia de explantes (%) Da 20** 88 b* 76 c 92 a 88 b Da 40 60 a 44 c 52 b 40 d Da 80 8 a* 0 b 8 a 0 b Oxidacin por explante Da 75 2.8 a* 3.2 a 3.36 a 3.0 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Los tratamientos nmero uno y tres son los mejores por presentar la mayor tasa de sobrevivientes de explantes a los 80 das de cultivo, existiendo diferencias (P0.05) con respecto a los dems tratamientos. Tanto hongos como bacterias en igual proporcin son causantes de la alta mortalidad de los explantes.

Aunque los tratamientos nmero uno y tres presentan una menor mortalidad de explantes hasta el da 80, existe una alta oxidacin de los explantes al igual que los restantes tratamientos, tambin debido al efecto oxidativo del hipoclorito de sodio, expuesto por McCLELLAND y SMITH (1993) sobre los tejidos vivos al entrar en contacto durante los enjuagues.

En cuanto a los resultados de pardeamiento promedio de los explantes, no muestran diferencias (P0.05) entre los tratamientos de desinfeccin a que fueron

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sometidos. Al igual que las restantes especies del gnero, se produce oxidacin sobre los tejidos, debido quizs al efecto negativo de oxidacin del hipoclorito de sodio y el alcohol, sealado por McCLELLAND y SMITH (1993) y, posiblemente debido una fuerte relacin entre el fenmeno de pardeamiento de puntas de brotes de Vitis vinfera L. como explantes y el origen del explante, por efecto de los contenidos fenlicos preexistentes y la posterior sobrevivencia, detectada por YU y MEREDITH (1986).

Es importante sealar que, los explantes de hoja, presentan muy bajos porcentajes de sobrevivencia, a diferencia de las especies del gnero Dendroseris.

Se desprende de los resultados de ambas variables, que los tratamientos nmero uno y tres son los mejores al presentar una similar oxidacin promedio por explante y la mayor tasa de explantes sobrevivientes.

En ninguno de los tratamientos, los explantes mostraron organognesis, lo que al igual que en las otras tres especies de la familia, puede ser por la falta de compuestos orgnicos en el medio de cultivo (vitaminas y reguladores del crecimiento), acelerando as la mortalidad de los mismos por efecto del pardeamiento, despus de dos meses y medio, siendo factores importantes para el xito de la mayora de las plantas propagadas in vitro, segn MURASHIGE (1977), la seleccin del explante adecuado y la composicin del medio, al igual que la edad, el estatus de agua y nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE GROOT, 1985).

Finalmente, la inclusin del cido ascrbico (100 mg/l), en las cuatro Asterceas, logra retardar el proceso oxidativo durante 2 semanas, de forma similar a lo que

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obtuvieron VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000), en cultivo de secciones de hojas en Robinsonia berteroi. Sin embargo, ellos utilizan una desinfeccin ms fuerte (hipoclorito de sodio al 10%), pero por menos tiempo (10 minutos) y, luego del lavado posterior en agua destilada estril, dejan los explantes en una solucin antioxidante de cido ctrico (100 mg/l) durante 5 minutos, repitiendo cuatro veces esta operacin. Adems, se confirma lo que sealan VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000), con respecto a que se desarrolla una respuesta oxidativa muy acelerada causada por el dao mecnico propio del cultivo, sin poder anular este fenmeno ni con previos lavados como inclusin en el medio de soluciones antioxidantes.

Ensayo 2: Efecto de dos medios de cultivo slidos con PVPP sobre la oxidacin promedio, callosidad y color de explantes de hojas, de cuatro Asterceas y, explantes de yemas de Robinsonia thurifera, en la etapa de establecimiento in vitro.

4.2.1. Explantes de hojas en gnero Dendroseris.

Del ensayo anterior, se utiliz la desinfeccin del tratamiento nmero tres (hipoclorito de sodio al 1,5%) (Cuadro 1), por presentar la menor contaminacin de los explantes, sin la necesidad de gastar etanol, como sucede en los T2 y T4. Los explantes de hojas fueron establecidos sobre el medio nutritivo base WPM (LLOYD y Mc COWN, 1981), conteniendo ANA y BAP en distintas concentraciones y, 1 g/l de PVPP, entre otros.

En el cuadro 5, se presentan los resultados de sobrevivencia para los explantes de la especie Dendroseris litoralis en ambos medios de cultivo, los que no presentan diferencias (P0.05) entre ellos, a los 20 y 80 das de cultivo, pero s a los 40 das de cultivo.

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CUADRO 5. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Dendroseris litoralis, segn el medio de cultivo. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Da 20** 68 a* 68 a Da 40 56 b 60 a Da 80 0 a* 0 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Esta alta mortalidad por contaminacin se debe a la deteccin en el medio de cultivo mediante previo anlisis fitopatolgico (Anexo 1), de algunas colonias bacterianas del gnero Erwinia y Xanthomonas, previsto por un cambio de coloracin en el medio (color amarillo leve a intenso), generado por la liberacin de exudados de polifenoles por los explantes (MARGARA, 1988).

Se presentan a continuacin (Cuadro 6) las variables oxidacin y formacin de callo promedio por explante, en la etapa de establecimiento in vitro, donde la variable oxidacin evidencia diferencias (P0.05) entre los tratamientos, contrario a lo que sucede en la variable callosidad.

CUADRO 6. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidacin y formacin de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Dendroseris litoralis. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Oxidacin por explante Da 30** Da 60 3.36 a* 3.72 b 3.24 a 3.28 a Formacin de callo por explante Da 30 Da 60 2.44 a* 2.92 a* 2.16 a 2.92 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

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En el medio uno los explantes presentan mayor oxidacin promedio solo a los 60 das despus de realizado el cultivo, en tanto que, la formacin de tejido de callo es similar en los explantes de ambos medios. Esta diferencia en el grado de oxidacin, puede deberse a lo que seala YU y MEREDITH (1986) en cultivos de Vitis vinfera L., donde encontraron que la posicin de los explantes y los efectos de la luz, son factores muy significativos para el control del pardeamiento de los tejidos, por efecto de los contenidos fenlicos preexistentes y la posterior sobrevivencia.

VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000) obtuvieron en Robinsonia berteroi, con explantes de hojas, una completa oxidacin a los 15 das de cultivo, mientras que en este ensayo todava hay explantes que no se oxidan completamente a los 30 das de cultivo, comprobando que el uso de PVPP, favorece la absorcin de sustancias fenlicas (PIERIK, 1990), mediante la formacin de puentes de hidrgeno entre los grupos fenlicos y el oxgeno del grupo amida del anillo pirrolidona del PVPP, arrastrando consigo los compuestos fenlicos que a l se enlacen, eliminndolos del medio (MACAS, RODRIGUEZ y CANALS, 1998).

Tambin, fue importante para CHRISTIANSEN y FONNESBECH (1975) la poca del ao en que los explantes de Hamamelis (Familia Hamamelidaceae) fueron tomados, siendo mejor en el mes de julio (Hemisferio Norte) en comparacin a aquellos tomados en agosto. Estos autores obtuvieron un mejor desarrollo y la menor intensidad de pardeamiento en los explantes de estas especies leosas arbreas, al usar en el medio de cultivo 1% de PVP (Polivinilpilorridona). Slo es posible sealar que el contenido de PVPP, en el medio de cultivo, junto con otras condiciones (oscuridad al inicio del cultivo, cmara de crecimiento con menores temperaturas) redujo el efecto de pardeamiento sobre los tejidos.

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Ambos medios producen formacin de callos en los sectores de corte del explante, principalmente en aquellos perpendiculares a la nervadura, acompaado de oxidacin del medio (exudaciones de color rojizo alrededor del callo) y del explante, lo que lleva a una mortalidad total ms rpida si no se cambian los explantes a un medio renovado. Esto corrobora lo expuesto por MARGARA (1988) con respecto a que las sustancias excretadas por el explante (compuestos fenlicos, taninos, etc.) producen oscurecimiento del medio e inhibicin del crecimiento acompaado, a veces, por necrosis del explante, y por YEOMAN y MACLEOD (1977), quienes sealan la importancia de transferir el tejido de callo a un medio renovado, con una frecuencia de dos a seis semanas para evitar un irremediable debilitamiento, intoxicacin y muerte. Los explantes no son transferidos a un medio nuevo porque se perdi la totalidad de los explantes por una alta contaminacin de bacterias endgenas.

Tambin, con respecto a lo anterior, ZIV y HALEVY (1983) detectaron, en Strelitzia reginae (Familia Strelitziaceae), que los exudados de color caf que difunden en el medio son detrimentales para favorecer el desarrollo de los explantes, los cuales eventualmente llegan a ser necrticos y mueren, tal como sucedi en esta especie. Adems, la oxidacin de compuestos fenlicos liberados por un rompimiento celular, debido a lesiones, es una de las serias causas de prdida al inicio de establecimiento del cultivo (MARKS y SIMPSON, 1989). DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI (1991) afirman, tambin, que los productos de la oxidacin inhiben la actividad enzimtica, causando la muerte del explante y el bronceado del medio de cultivo.

HARTMANN y KESTER (1998) afirman que la formacin de callo se debe a la alta concentracin de auxinas y baja dosis de citoquininas en el medio de cultivo, en tanto que CHISTIANSON y WARNICK (1983) consideran que el tejido de callo aparece cuando estos dos grupos de hormonas se encuentran en proporciones

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similares, aunque no siempre se cumple para todas las especies. Sin embargo, en este ensayo la proporcin de citoquininas es mayor que la de auxinas en ambos tratamientos, e igualmente se observ formacin de callos. Adems, con respecto al tejido de callo, debe mencionarse que es positiva su formacin en trminos de respuesta al medio de cultivo, pero es negativa en relacin a la formacin de rganos, siendo considerada una etapa intermedia a la organognesis.

No se observa formacin de rganos, a excepcin de seis explantes (4 explantes del medio uno y 2 explantes del medio dos), que forman races areas (presentes en 5 explantes de hojas y 1 explante de pecolo) y cuatro explantes de hoja que forman races en el medio (Figura 1).

Con respecto a las races adventicias, segn BARBA (1987), existe un problema complejo con el tejido de callo, que es la alteracin y dao de la citologa nuclear de las clulas durante el cultivo, pudiendo aparecer mutaciones puntuales producto de la formacin de brotes adventicios (PIERIK, 1990), como en este caso, o distintos tipos de ploidas (NOVAK, 1980), es decir, se asocia a una potencial variabilidad gentica (HARTMANN y KESTER, 1998). Tambin con respecto a esto, MERINO (1987) considera que las hojas se cultivan normalmente bajo luz, con ciclos de oscuridad, porque aparecen anormalidades morfogenticas durante el cultivo en oscuridad, como el caso de los explantes que formaron races areas.

Tambin, PIERIK (1990) seala que en Gerbera, una alta concentracin de citoquininas causa no solo fragosidad, sino tambin la aparicin de diferentes formas de hojas, formacin de callos y brotes adventicios. Estos brotes adventicios pueden aumentar las tasas de produccin de plantas aberrantes (HARTMANN y KESTER, 1998).

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1A PECOLO

1A HOJA

1B 2 EX.HOJAS

1B 3 EX. HOJAS (T1)

FIGURA 1. Explantes de pecolo y hoja en Dendroseris litoralis Skottsb., que formaron races adventicias (1A), del medio uno; explantes (EX.) de hojas (1cm2), que presentan races normales (1B).

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Es posible que esta especie requiera una proporcin de citoquininas mucho mayor que el de auxinas, como sucede con el cultivo de Gerbera, en el que MURASHIGE, SERPA y JONES (1974) utilizan bajos niveles de AIA (0,5 mg/l) y una alta concentracin de Kinetina (10 mg/l), tanto para la induccin de brotes como la rpida multiplicacin de secciones pequeas; al igual que en Coreopsis lanceolata L., pero en un medio MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962) suplementado con 1uM de ANA ms 10uM de BA, favoreciendo la formacin de brotes adventicios sobre los explantes (LEE et al, 1994).

Las auxinas y citoquininas son, posiblemente, los componentes ms importantes del medio, regulando el desempeo del explante, en gran medida (DIRR y HEUSER, 1987)

La medicin de las variables (Cuadro 6) a los 90 das de cultivo no fue evaluada debido a la deteccin en el medio, mediante un previo anlisis fitopatolgico, de algunas colonias bacterianas del gnero Erwinia y Xanthomonas (Anexo 1). En tanto, la variable respuesta color, es expresada a continuacin, en valores promedio muestrales (Cuadro 7), registrados a los 30 y 60 das de cultivo.

CUADRO 7. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Dendroseris litoralis, a los 30 y 60 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 4 a* 4 a 6 5 a b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

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Se detectaron diferencias (P0.05), entre los dos tratamientos, solo a los 60 das de cultivo, observndose principalmente en el medio uno, el color naranjo caf, correspondiente en la tabla Munsell (MUNSELL, 1998) para tejidos a 7/8 2.5 Y y, en el medio dos, el color amarillo (8/10 5 Y). Esta diferencia es confirmada con los resultados de oxidacin (Cuadro 6). En tanto que, a los 30 das de cultivo, se observ mayormente el color verde amarillo (8/6 2.5 GY).

Se presentan, en el Cuadro 8, los resultados del porcentaje de explantes sobrevivientes para la especie Dendroseris neriifolia, en donde no hay diferencias (P0.05) entre ambos medios de cultivo, solo a los 80 das de cultivo.

CUADRO 8. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Dendroseris neriifolia, segn el medio de cultivo. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Da 20** 96 b 100 a Da 40 28 a 16 b Da 80 0 a* 0 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P= 0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

La coloracin amarilla detectada en el medio de cultivo en todas las repeticiones, aunque ms leve que en Dedroseris litoralis, puede ser debida tambin a la presencia de bacterias endgenas, aunque no fue comprobado por anlisis fitopatolgico. Sin embargo, este material vegetal se descart para las siguientes mediciones.

Al igual como sucedi con Dendroseris litoralis, HARTMANN y KESTER (1998) sealan que estos patgenos bacterianos internos, como Erwinia, estn presentes, pero no crecen con facilidad en el medio de cultivo, debido a la acidez de ste o

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porque la citoquinina presente en el medio reduce su crecimiento, pudiendo llegar a inhibir el potencial de crecimiento y el enraizamiento.

Es importante destacar lo sealado por MARGARA (1988), quien recomienda el uso de tejidos bien protegidos (meristemas) o pices de tallo cubiertos por las escamas foliares como explantes, para lograr con xito la propagacin in vitro, sobre todo considerando que el material se encuentra muy expuesto al medioambiente. Sin embargo, dada la escasez de material disponible (plantas madres) y nula formacin de yemas axilares en estas dos especies, es un proceso ms complejo de realizar.

Las variables oxidacin y formacin de callo (Cuadro 9) en la etapa de establecimiento in vitro, no evidenciaron diferencias (P0.05) entre los dos tratamientos, a los 30 y 60 das de cultivo.

CUADRO 9. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidacin y formacin de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Dendroseris neriifolia. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Oxidacin por explante Da 30** Da 60 3.24 a* 3.88 a* 3.36 a 3.96 a Formacin de callo por explante Da 30 Da 60 1.64 a* 1.8 a* 1.28 a 1.56 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

En ambos medios de cultivo, los explantes presentan una similar oxidacin y callosidad promedio al cabo de dos meses de cultivo. Esta nula diferencia significativa en el grado de oxidacin, contrario a lo que sucedi en Dendroseris litoralis, tambin puede deberse a los factores, posicin de los explantes y los

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efectos de la luz, detectados por YU y MEREDITH (1986), para el control del pardeamiento de los tejidos.

Tambin, al igual que en Dendroseris litoralis, ambos medios producen formacin de pequeos callos (2 a 3 mm) en los sectores de corte del explante, pero solamente en la zona de contacto de la nervadura central con el medio, y, por lo tanto, menor, siendo tambin positivo como respuesta al medio de cultivo, pero detrimental para la organognesis en los explantes. Adems, se observ una leve coloracin amarilla del medio y una fuerte oxidacin del explante en la zona que rodea la nervadura central. En relacin a esta fuerte oxidacin, recomiendan YEOMAN y MACLEOD (1977) transferir el tejido de callo a un medio renovado, con una frecuencia de dos a seis semanas para evitar el debilitamiento, intoxicacin y muerte. Sin embargo, al igual que en Dendroseris litoralis, no se tranfirieron los explantes a medio renovado por la posible presencia de bacterias en el medio. Adems, corrobora lo que MARGARA (1988) indica con respecto a que las sustancias excretadas por el explante (compuestos fenlicos, taninos, etc.) producen oscurecimiento del medio e inhibicin del crecimiento acompaado, a veces, por necrosis del explante.

La similitud en formacin de callo entre los tratamientos es debida, segn CHISTIANSON y WARNICK (1983), a que los dos grupos de hormonas se encuentran en proporciones similares, siendo posible que esta especie tambin requiera una proporcin de citoquininas mucho mayor que el de auxinas, como es descrito en el cultivo de Gerbera (MURASHIGE, SERPA y JONES, 1974) y Coreopsis lanceolata L. (LEE et al, 1994), para la formacin de brotes u organognesis.

Tampoco se observa formacin de rganos en los explantes, al igual como sucedi en Dendroseris litoralis, tambin debido quizs al pardeamiento de los tejidos,

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provocado por la oxidacin de compuestos fenlicos liberados en un rompimiento celular, causado por lesiones (MARKS y SIMPSON, 1989), ya que las especies de ste gnero poseen segn SILVA, BITTNER y PACHECO (1992), una alta cantidad de flavonoides, y algunos flavonoles y flavonas, considerados por CHEFTEL y CHEFTEL (1992) como sustratos naturales de pardeamiento enzimtico y principales constituyentes fenlicos de los vegetales.

Tambin se debe considerar con respecto al pardeamiento, las diferencias morfolgicas de las hojas entre las especies Dendroseris litoralis y Dendroseris neriifolia, descritas por JOHOW (1896), REICHE (1910), RODRIGUEZ, MATTHEI y QUEZADA (1983), siendo las hojas de Dendroseris neriifolia, ms pequeas, angostas (15 cm de largo y entre 1,5-2 cm. de ancho), coriceas y con una delgada nervadura central (tejido meristemtico); en cambio, en Dendroseris litoralis, son grandes (lmina entre 25-45 cm. de largo y 18-30 cm. de ancho), aovada u oblonga, coriceo-carnosa, y una nervadura central con ramificaciones laterales.

Los resultados de la variable respuesta color en los explantes, se presentan a continuacin (Cuadro 10), en dos periodos de cultivo.

CUADRO 10. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Dendroseris neriifolia los 30 y 60 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 3 a* 3 a 4 a 4 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

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No se evidencian diferencias (P0.05) entre los dos medios de establecimiento a los 30 y 60 das de cultivo, observndose a los 30 das principalmente el color verde amarillo, equivalente en la tabla Munsell (MUNSELL, 1998) a 3/2 7.5 GY y, a los 60 das mayormente el color caf plomizo (7/8 2.5 Y).

4.2.2. Explantes de hojas en gnero Robinsonia.

En este gnero se utiliz la desinfeccin nmero uno (T1), que result ser mejor en el ensayo uno, para ambas especies, por presentar la menor contaminacin de los explantes junto a un menor efecto sobre la oxidacin de los explantes.

El Cuadro 11 presenta los resultados de sobrevivencia para explantes de la especie Robinsonia gayana en ambos medios de cultivo.

CUADRO 11. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Robinsonia gayana, segn el medio de cultivo. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Da 20** 72 b 92 a Da 40 68 b 92 a Da 60 68 b 92 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

A diferencia de las dos especies del gnero Dendroseris, ambos medios de cultivo presentan diferencias (P0.05) en los tres perodos de cultivo, siendo el medio nmero dos el mejor, porque muestra una mayor sobrevivencia de los explantes por una menor contaminacin provocada por hongos, la principal causa de mortalidad,

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posiblemente debido a una mayor eficiencia de la solucin fungicida aplicada al material vegetal del cual provienen esos explantes. La sobrevivencia de los explantes en ambos medios es alta, en comparacin a aquella obtenida en el ensayo del protocolo de desinfeccin, debido a la ausencia de bacterias.

Se evidenciaron diferencias significativas (P0.05) entre los dos medios de cultivo segn el Test de Tukey en la variable formacin de callo, no as en la variable oxidacin, en la etapa de establecimiento in vitro. Estos resultados se expresan a continuacin (Cuadro 12):

CUADRO 12. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidacin y formacin de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Robinsonia gayana. Tratamiento T1: Medio 1 T2: Medio 2 Oxidacin por explante Da 30** 2.72 a* 2.68 a Da 60 3.2 a* 3.12 a Da 90 4.88 a* 4.46 a Formacin de callo por explante Da 30 1.72 a* 1.96 a Da 60 2.12 a 2.56 b Da 90 2.36 a 3.24 b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

La oxidacin promedio por explante es similar en ambos medios de cultivo, durante los tres perodos de evaluacin, sin embargo, la formacin de callo por explante es similar solo a los 30 das, siendo mayor en el medio dos a los 60 y 90 das de cultivo. Esta similitud en el grado de oxidacin, al igual que en Dendroseris neriifolia, puede ser debido a una posicin y recepcin de luz similares al material que aporta explantes, factores detectados por YU y MEREDITH (1986), en Vitis vinfera, necesarios para el control del pardeamiento de los tejidos, asegurando tambin que existe una relacin inversa entre la existencia de compuestos fenlicos y la sobrevivencia in vitro de los explantes.

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VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000) lograron, en la especie Robinsonia berteroi, retardar dos o tres semanas el proceso oxidativo, al incluir en el medio de cultivo, cido ctrico (100 mg/l), siendo similar al efecto del PVPP en el medio de cultivo. Sin embargo, estos autores tambin obtienen, en explantes de hoja, el mayor grado de oxidacin, a diferencia de secciones nodales, inflorescencias y raquis.

La menor oxidacin sobre los explantes permite la formacin de una mayor callosidad, pero esta relacin no siempre es inversa, tal como sucede en Dendroseris litoralis (Cuadro 6), por lo que depende principalmente de las caractersticas qumicas y morfolgicas de la especie. Al contrario, VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000) no observaron respuestas de crecimiento en secciones de hojas de Robinsonia berteroi, solamente en secciones de raquis y flores, los que formaron tejido de callo, pero tambin se oxidaron luego de dos meses, sin presentar un crecimiento significativo.

Ambos medios producen formacin de callos en los sectores de corte del explante, y algunos explantes tambin en la nervadura central, acompaados de exudacin en el medio (con una coloracin rojiza alrededor del callo) y oxidacin del explante. Es por esta razn que YEOMAN y MACLEOD (1977) dan mucha importancia a transferir el tejido de callo a un medio renovado con una frecuencia de dos a seis semanas para evitar un irremediable debilitamiento, intoxicacin y muerte. Esto ltimo se favorece con el cambio de los explantes a un medio renovado a los 40 das de cultivo. Sin embargo, al igual que en las especies del gnero Dendroseris, en ambos medios, no se observa la formacin de rganos sobre los explantes, confirmando lo expuesto por MARGARA (1988), con respecto a que las sustancias excretadas por el explante (compuestos fenlicos, taninos, etc.) producen oscurecimiento del medio, inhibicin de la actividad enzimtica (DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI, 1991) y del crecimiento, acompaado de bronceado del medio de cultivo y, a veces, por necrosis del explante.

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Tambin, se debe considerar la alta cantidad de flavonoides encontrados por SILVA, BITTNER y PACHECO (1992), tales como flavonoles, flavonas, flavanonas y dihidriflavonol, en la composicin qumica de esta especie y las dems de la familia Asteraceae, considerados por CHEFTEL y CHEFTEL (1992) como sustratos naturales de pardeamiento enzimtico y principales constituyentes fenlicos de los vegetales.

Al igual que en las otras especies, esta nula formacin de rganos en los explantes, tambin se puede explicar al usar concentraciones hormonales similares entre las auxinas y citoquininas, lo que permite la formacin de tejido callo segn CHISTIANSON y WARNICK (1983), siendo posible que esta especie tambin requiera una proporcin de citoquininas mucho mayor que el de auxinas, como es descrito en el cultivo de Gerbera (MURASHIGE, SERPA y JONES, 1974) y Coreopsis lanceolata L. (LEE et al, 1994), para la formacin de brotes u organognesis.

Sin embargo, KOTHARI y CHANDRA (1984) obtienen en Tagetes erecta L., con una combinacin de 1mg/l de AIA y 3mg/l de BA, una buena respuesta morfogentica, con un excelente desarrollo de brotes. Es importante enfatizar que las especies Gerbera, Chrysanthemum, Tagetes, etc., son todas herbceas, mientras que los gneros Robinsonia y Dendroseris conforman especies que son Fanerfitas semileosas.

Finalmente, la oxidacin sobre los explantes no pudo ser controlada, provocando una necrosis total y homognea sobre stos despus de tres meses de cultivo. Sin embargo, se logra alargar el perodo de cultivo en comparacin al ensayo nmero uno.

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Se presentan a continuacin (Cuadro 13) los resultados de los registros de la variable color, en valores promedio muestrales, durante tres meses de cultivo.

CUADRO 13. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Robinsonia gayana los 30, 60 y 90 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 Da 90 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 4 a* 4 a 5 a 5 a 6 a 6 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Durante los tres perodos de registro de las observaciones de color, 30, 60 y 90 das de cultivo, no se detectaron diferencias (P0.05) entre los dos tratamientos, presentando principalmente el color verde amarillo (8/10 2.5 GY) a los 30 das; el color verde oscuro opaco (4/4 7.5 YR), a 60 das; y, el color caf oscuro (4/2 7.5 YR), a los 90 das desde su cultivo.

El cuadro siguiente (Cuadro 14) presenta los resultados de sobrevivencia, en porcentaje de explantes sobrevivientes, para la especie Robinsonia thurifera en ambos medios de cultivo.

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CUADRO 14. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Robinsonia thurifera, segn el medio de cultivo. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Da 30** 100 a* 100 a Da 60 92 a* 92 a Da 90 92 a* 92 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Los resultados no evidencian diferencias (P0.05) entre los dos medios de cultivo, durante los tres meses de cultivo. Al igual que la especie Robinsonia gayana, los explantes presentan una alta sobrevivencia en comparacin al ensayo nmero uno del protocolo de desinfeccin, causada por la baja incidencia de bacterias, siendo totalmente opuesto a los resultados en el gnero Dendroseris, quizs ms susceptible a stas (Cuadros 5 y 8).

Es importante tener presente las recomendaciones de MARGARA (1988), en el uso de tejidos bien protegidos (meristemas) o pices de tallo cubiertos por las escamas foliares, como explantes, para lograr con xito la propagacin in vitro, porque pueden manifestarse en cualquier momento bacterias y virus, como sucedi en el gnero Dendroseris. Por este motivo, se intenta ms adelante probar como explantes, yemas axilares en esta especie.

Aunque ambos tratamientos presentan una baja mortalidad de explantes hasta el da 90, existe una alta oxidacin de ellos, incluso mayor que en las especies anteriormente analizadas. Se presentan a continuacin (Cuadro 15) los resultados de las variables oxidacin y callosidad promedio por explante para la especie Robinsonia thurifera a los 30, 60 y 90 das de cultivo.

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CUADRO 15. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidacin y formacin de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Robinsonia thurifera. Oxidacin por explante Tratamiento T1: Medio 1 T2: Medio 2 Da 30** 2.64 a* 2.32 a Da 60 4.24 a* 4.08 a Da 90 5.84 a* 5.76 a Da 30 2.24 a 2.60 b Da 60 2.44 a 3.16 b Da 90 2.92 a 3.72 b Formacin de callo por explante

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

No se evidenciaron diferencias (P0.05) entre los explantes de ambos medios, en la variable oxidacin, desde el inicio hasta los 90 das de cultivo, pero s en la variable callosidad, donde el medio nmero dos, forma una mayor cantidad promedio de tejido de callo por explante, semejante a lo sucedido en Robinsonia gayana, aunque ligeramente mayor, a pesar de existir una ms alta oxidacin promedio en los dos ltimos meses. Esta similitud en el grado de oxidacin, al igual como sucedi en Robinsonia gayana, tambin puede deberse a los factores posicin de los explantes y los efectos de la luz, detectados por YU y MEREDITH (1986), para el control del pardeamiento de los tejidos.

Al igual que en Robinsonia gayana y en las especies del gnero Dendroseris, ambos medios producen formacin de callos en los sectores de corte del explante y nervadura, acompaados de una leve exudacin en el medio (con una coloracin rojiza alrededor del callo), y una fuerte oxidacin homognea de los explantes despus de tres meses de cultivo. A pesar de que los explantes fueron transferidos a un medio renovado a los 38 das de cultivo, se produjo una completa necrosis de ellos. Con respecto esto, YEOMAN y MACLEOD (1977) recomiendan transferir el tejido de callo sano (sin contaminacin y sin necrosis) a un medio renovado, con una frecuencia de dos a seis semanas, para evitar un irremediable debilitamiento, intoxicacin y muerte. Sin embargo, en sta y al igual que en las otras especies es

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imposible transferir un tejido sin necrosis, considerando que la eliminacin del sector necrosado, significa la liberacin de ms polifenoles o exudados de color caf (ZIV y HALEVY, 1983) y la inhibicin de la actividad enzimtica, causando la muerte del explante y el bronceado del medio de cultivo (DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI, 1991).

Es importante destacar la alta cantidad de flavonoides (flavonoles, flavonas, flavanonas y dihidriflavonol), encontrados y descritos por SILVA, BITTNER y PACHECO (1992), en la composicin qumica de las especies del gnero y de la familia Asteracea, siendo considerados por CHEFTEL y CHEFTEL (1992) como sustratos naturales de pardeamiento enzimtico y principales constituyentes fenlicos de los vegetales.

PIERIK (1990) considera importante el estado fisiolgico y la edad de la planta donadora de callo. Es recomendable utilizar plantas jvenes y con crecimiento activo.

Al igual que en Robinsonia gayana y las otras especies, esta nula formacin de rganos en los explantes tambin se puede explicar debido al uso de concentraciones hormonales similares entre las auxinas y citoquininas, estimulando la formacin de tejido callo, segn CHISTIANSON y WARNICK (1983), no cumplindose siempre esta relacin en todas las especies, ya que, con diferencias de concentraciones entre estas hormonas muy similares a las que utilizan KOTHARI y CHANDRA (1984) en Tagetes erecta L., obtienen una buena respuesta morfogentica, con un excelente desarrollo de brotes.

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Es posible que esta especie tambin requiera una proporcin de citoquininas mucho mayor que el de auxinas para estimular la formacin de brotes, como es descrito en el cultivo de Gerbera (MURASHIGE, SERPA y JONES, 1974) y Coreopsis lanceolata L. (LEE et al, 1994), o solo la presencia de citoquininas, descrito en el cultivo de Centaurea paui Loscos ex Willk.,a partir de yemas axilares en un medio MS (MURASHIGE and SKOOG, 1962), suplementado con 0,5 mg/l de BA o 2 mg/l de kinetina (CUENCA, AMO-MARCO y PARRA, 1999).

Por lo sealado en el prrafo anterior y, al igual que en la otras especies, es muy importante aclarar las diferencias morfolgicas entre las especies de los gneros Gerbera, Chrysanthemum, Tagetes, Centaurea, etc. (todas herbceas) y las especies de los gneros Robinsonia y Dendroseris (semileosas).

Los resultados de la variable color de los explantes de Robinsonia thurifera, luego de 90 das de cultivo, se presentan a continuacin (Cuadro 16).

CUADRO 16. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Robinsonia thurifera a los 30, 60 y 90 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 Da 90 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 3 a* 3 a 5 a 5 a 6 a 6 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

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No se evidenciaron diferencias (P0.05) entre los medios de establecimiento, a los 30, 60 y 90 das de cultivo de los explantes, encontrndose en mayor cantidad el color verde claro (5/10 5 GY) a los 30 das; el color caf claro (5/6 2.5 Y), a los 60 das; y el color caf muy oscuro (3/2 5 YR), a los 90 das.

Estos cambios, en las condiciones medioambientales in vitro, han limitado, efectivamente, el pardeamiento del medio en explantes de la orqudea Phalaenopsis al iniciar el cultivo en oscuridad (PIEPER y ZIMMER, 1976, GEORGE y SHERRINGTON, 1984). An as, no se logr eliminar completamente el efecto de pardeamiento y necrosis total de los explantes.

Se desprende de los resultados de este ensayo, que los explantes de hojas de las cuatro especies, colocados sobre un medio nutritivo base macro y micro nutrientes de WPM (LLOYD y MCCOWN, 1981), vitaminas de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), PVPP y 7 g/l de agar, entre otros, reaccionaron a los dos medios, generando una mejor respuesta que en el ensayo anterior, algunos formando callos en la zona de corte y otros, sobre la nervadura, lo que les permiti permanecer con vida por ms tiempo (ms de tres meses) a causa de un menor efecto de oxidacin, debido al uso de PVPP en el medio, las menores temperaturas de la cmara de crecimiento y una baja exposicin a la luz durante el inicio del cultivo.

4.2.3. Explantes de yemas en Robinsonia thurifera.

Otra alternativa al uso de secciones de hoja como explante es, probar secciones de tallo con yemas axilares del sector medio y apical de la planta, obtenidas a fines de marzo, y que se presentan visualmente solo en esta especie.

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Los resultados de las variables sobrevivencia, oxidacin y color se analizan descriptivamente, debido al bajo nmero de explantes disponibles por planta (16), que representan el nmero de repeticiones (8) por tratamiento.

El porcentaje de explantes sobrevivientes a los 90 das de cultivo es bajo (12,5%) en comparacin con los explantes de hojas, debido al uso de una desinfeccin ms leve (hipoclorito de sodio al 0,5% por 10 minutos), siendo los hongos la principal causa de muerte al inicio del cultivo y las bacterias, al final del mismo (90 das). Se encontraron diferencias principalmente en la posicin o lugar de origen del explante, donde el 100% de las yemas del sector medio de la planta muere al inicio del cultivo en ambos medios, porque creci sin la proteccin de las hojas, las que anteriormente fueron removidas para llevar a cabo otros ensayos.

En yemas apicales, tambin hay diferencias de sobrevivencia entre los medios, siendo los hongos la principal causa de mortalidad, debido posiblemente a la baja eficiencia de la solucin fungicida aplicada antes de la desinfeccin o a la desinfeccin misma en cuanto al tiempo o cantidad de hipoclorito utilizada o al lugar de procedencia de las yemas axilares (3-5 mm. de largo), el sombreadero del Laboratorio de Propagacin, encontrndose al igual que en el Jardn Botnico, muy expuestas al medioambiente y susceptibles a la penetracin de patgenos. La seleccin del explante (MARGARA, 1988) y el lugar de origen (HARTMANN y KESTER, 1998), son factores muy importantes para lograr el xito del cultivo in vitro.

A pesar de la alta oxidacin y la mediana contaminacin de los explantes, dos yemas del medio 2 logran sobrevivir y crecer durante ms de dos meses y una por ms de tres meses, donde lamentablemente las primeras se contaminaron con bacterias y la ltima se oxid al ser transferida a los tres meses de cultivo al medio renovado nmero dos del ensayo cuatro (con carbn activo), quizs debido a un

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efecto negativo del carbn activo sobre estas especies o por deshidratacin del explante durante el subcultivo. La yema lleg a medir 8.12 mm. de largo y a expandir 3 hojas. GARCIA y NOA (1998) sealan que, a pesar de usar pices meristemticos en el cultivo de caa de azcar, pltano y banano, el principal factor que influye en los bajos ndices de establecimiento se debe a la necrosis de los tejidos, consecuencia de la oxidacin de los fenoles.

Los explantes en la zona de la seccin del tallo presentan una oxidacin promedio menor (valor de 3.3) que en explantes de hojas a los 90 das de cultivo para ambos medios (Figura 2). Sin embargo, es posible pensar que es una buena alternativa como explante sobre todo si se logra controlar eficientemente la oxidacin del tejido que es cortado (la seccin de tallo), confirmndose que la oxidacin de compuestos fenlicos liberados por un rompimiento celular debido a lesiones, es una de las serias causas de prdida al inicio de establecimiento del cultivo (MARKS y SIMPSON, 1989), por inhibicin y muerte de los explantes, en un amplio rango de especies (CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975).

Los resultados descriptivos confirman la efectividad del medio de cultivo en cuanto al balance de los grupos de hormonas, para el desarrollo de las yemas durante al menos tres meses. Esto confirma lo sealado por MURASHIGE (1977) con respecto a que el xito de la propagacin in vitro depende tanto de la seleccin del explante adecuado como la composicin del medio, as como tambin la edad, el estatus hdrico y nutritivo de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE GROOT, 1985).

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FIGURA 2. Explantes de yemas axilares de Robinsonia thurifera Dcne., en el medio nmero dos, a los 20 das de cultivo.

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A lo largo del cultivo, las yemas presentaron una menor heterogeneidad de colores que los explantes de hojas, predominando el color verde claro, que en la tabla Munsell (MUNSELL, 1998) para tejidos, equivale a 8/4 2.5 GY, mientras que la seccin del tallo presenta colores entre caf claro y caf oscuro, correspondientes a 6/4 2.5 Y y 3/2 5 YR en la tabla Munsell, respectivamente.

Es importante destacar que VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000), durante los ensayos de cultivo in vitro de Robinsonia berteroi, no reportan el uso de yemas con secciones de tallo como explantes, ni la presencia de agentes patgenos, como bacterias, las que s tienen una alta incidencia en la sobrevivencia de todas las Asterceas, sobre todo, en las especies del gnero Dendroseris.

Ensayo 3: Efecto de dos medios de cultivo lquidos sobre la oxidacin promedio, callosidad y color de explantes de hojas en la etapa de establecimiento in vitro, de cuatro especies de la familia Asteraceae.

Otra alternativa al uso de medio slido para el favorable desarrollo de los explantes es probar inicialmente con medio lquido, para controlar el pardeamiento de tejidos como en el cultivo de especies de Cattleya (ISHII, UEMOTO y FUJIEDA, 1979) y de Pelargonium x hortorum (HILDEBRANDT y HARNEY, 1988), debido a las ventajas de absorber nutrientes y evitar las impurezas del agar, siendo preferible en explantes de ciertas especies de plantas que exudan sustancias txicas desde la superficie cortada (HARTMANN y KESTER 1998).

Los explantes de hojas son cultivados sobre el mismo medio nutritivo base del ensayo anterior, macro y micro nutrientes de WPM (LLOYD y MCCOWN, 1981), vitaminas de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), PVPP, pero lquido (sin agar), probando los medios uno y dos del tercer ensayo, en tubos de ensayo sobre un

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soporte metlico en agitacin constante, bajo las mismas condiciones ambientales del ensayo anterior.

Este medio demostr tener un efecto distinto al medio slido en todas las especies sobre los pocos explantes usados, seis para las especies Dendroseris litoralis, Robinsonia thurifera, y diez para Dendroseris neriifolia y Robinsonia gayana, por lo tanto, los resultados sern analizados descriptivamente.

Los explantes de la especie Dendroseris litoralis, al igual que en medio slido, muestran formacin de callos en ambos medios en la zona de corte del explante, pero con la diferencia que lo hacen 15 das ms tarde, en todos los cortes y en un alto nmero por corte. Los valores de oxidacin promedio de los explantes a los 30 y 60 das son similares al ensayo con medio slido, al igual que la variacin del color, sin embargo, se prolong por ms tiempo el color cercano a la especie. Se debe mencionar la similitud de la coloracin amarilla leve a fuerte del medio lquido, respecto al medio slido, lo que puede indicar tanto la liberacin de polifenoles por los explantes como la presencia de bacterias.

Lo anterior es confirmado por la alta cantidad de sustratos naturales de pardeamiento enzimtico CHEFTEL y CHEFTEL (1992) que posee sta y las dems especies (SILVA, BITTNER y PACHECO, 1992), y que las sustancias excretadas por el explante (compuestos fenlicos, taninos, etc.) producen oscurecimiento del medio (MARGARA, 1988), inhibicin de la actividad enzimtica (DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI, 1991) y del crecimiento, acompaado de bronceado del medio de cultivo y a veces por necrosis del explante.

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Los explantes de la especie Dendroseris neriifolia, a diferencia del medio slido, no forman callos en la zona de corte y de unin de la nervadura con el medio, sino que presentan un arrugamiento u ondulamiento homogneo como reaccin al medio, y una oxidacin promedio por explante mayor en ambos tratamientos, a los 60 das de cultivo, sin la formacin de callos. De igual forma, los explantes muestran mayormente los colores caf anaranjado (8/10 5 Y) y caf plomizo (7/8 2.5 Y), que representan tejidos muy oxidados, tempranamente a los 30 das de cultivo.

En Robinsonia gayana, al igual que en medio slido, algunos explantes formaron callos en la zona de corte perpendicular a la nervadura, con la diferencia de que el medio lquido estimul la elongacin de algunos explantes y prolong el color de la especie en algunos explantes de forma heterognea por ms de un mes y medio. Sin embargo, los explantes presentan una oxidacin promedio mucho mayor que en el medio slido a los 30 das de cultivo. En un par de tubos, el medio lquido, a diferencia del medio slido, presenta una coloracin anaranjada leve, lo que puede indicar la liberacin de polifenoles desde los explantes y la absorcin de stos por el contenido de PVPP (polyvinylpolypyrrolidona), siendo descrito por PIERIK (1990) como un polmero que adsorbe las sustancias de tipo fenlico. Tambin, MACAS, RODRGUEZ y CANALS (1998) describen su accin en base a la gran afinidad que posee con los poilifenoles, gracias a su insolubilidad en el medio hidroalcohlico. Adems, su mecanismo de adsorcin de los polifenoles se basa en la formacin de puentes de hidrgeno entre los grupos fenlicos y el oxgeno del grupo amida del anillo pirrolidona del PVPP, arrastrando consigo los compuestos fenlicos que a l se enlacen y, eliminndolos del medio.

El medio lquido a diferencia del medio slido, en Robinsonia thurifera, retard la formacin de tejido de callo, manifestando a los 60 das de cultivo un pequeo engrosamiento, en los extremos de la nervadura, en algunos explantes. Al igual que la especie anterior y a diferencia del medio slido, tambin se present esta

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coloracin en un tubo, lo que puede indicar la liberacin de polifenoles o de bacterias endgenas al explante.

Ensayo 4: Efecto de dos medios de cultivo slidos con carbn activo y PVPP sobre la oxidacin, callosidad y color de explantes de hoja en la etapa de establecimiento in vitro para cuatro especies de la familia Asteraceae.

Los explantes de hojas fueron colocados sobre un medio nutritivo base macro y micro nutrientes de WPM (LLOYD y McCOWN, 1981), vitaminas de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), PVPP, carbn activado y agar.

Los explantes se desarrollaron bajo las mismas condiciones del ensayo dos, menores temperaturas de la cmara de crecimiento y una baja exposicin a la luz durante el inicio del cultivo. PIEPER y ZIMMER (1976) afirman que estas condiciones medioambientales in vitro han limitado efectivamente el pardeamiento del medio en explantes de la orqudea Phalaenopsis al iniciar el cultivo en oscuridad. Sin embargo, no se logr eliminar completamente, ni reducir, ni detener por un largo perodo el efecto de pardeamiento, hacindose presente tempranamente la necrosis total de los explantes.

4.4.1. Gnero Dendroseris.

De igual modo que el ensayo dos, se utiliza la desinfeccin nmero tres (hipoclorito de sodio al 1,5%), por tener un menor efecto sobre la oxidacin de los explantes y una baja contaminacin de los mismos, en el ensayo del protocolo de desinfeccin. Sin embargo, se debe tener presente que, a pesar de usar esta desinfeccin, est la posibilidad de que surjan bacterias endgenas, como sucedi en el ensayo dos, lo que es, en esta especie, otro gran problema durante su cultivo.

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Se presentan a continuacin (Cuadro 17) los resultados de sobrevivencia de los explantes, para la especie Dendroseris litoralis, en tres perodos de cultivo.

CUADRO 17. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Dendroseris litoralis, segn el medio de cultivo. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Da 20** 76 b 80 a Da 40 68 a* 68 a Da 60 68 a 60 b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Ambos medios de cultivo presentan diferencias (P0.05) entre ellos, a los 20 y 60 das de cultivo, siendo el medio nmero uno el mejor, a los 60 das, porque muestra una mayor sobrevivencia de los explantes, debido a una menor contaminacin por bacterias, la principal causa de mortalidad, posiblemente se deba a un menor contenido endgeno de stas en esos explantes. Estas bacterias internas estn a menudo presentes en los cultivos, pero la infeccin puede no ser aparente hasta despus de varios subcultivos (DIRR y HEUSER, 1987) o ms adelante del cultivo, hasta que las condiciones de acidez y citoquininas en el medio se reduzcan (HARTMANN y KESTER, 1998).

Aunque ambos tratamientos presentan una baja mortalidad de explantes hasta el da 90, ya existe una muy alta oxidacin de los explantes a los 30 das de cultivo, la que incluso es mayor a la oxidacin promedio en los explantes del ensayo dos, a los 60 das de cultivo (Cuadro 18). En el mismo cuadro, se presenta la variable oxidacin en la etapa de establecimiento in vitro.

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CUADRO 18. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidacin en la etapa de establecimiento in vitro de Dendroseris litoralis. Tratamiento T1: Medio 1 T2: Medio 2 Oxidacin promedio por explante Da 30** Da 60 Da 90 3.96 a 4.68 a* 4.92 a* 4.52 b 4.92 a 5.08 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

En los medios nmero uno y dos los explantes presentan una similar oxidacin promedio, a los 60 y 90 das de cultivo, sin embargo no se observ formacin de tejido de callo, durante los tres periodos de evaluacin, y, por lo tanto, no hubo diferencias significativas (P0.05). Al igual que en otros ensayos, esto puede deberse a la relacin que existe entre la posicin de los explantes y la luz que reciben, con el pardeamiento de los tejidos (YU y MEREDITH, 1986; CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975), por efecto de los contenidos fenlicos preexistentes y la posterior sobrevivencia.

Al igual que el ensayo dos, el medio de cultivo presenta una tenue coloracin amarilla, debido al color negruzco del carbn activado, indicando posiblemente la presencia de alguna contaminacin por bacterias o generada por la liberacin de exudados de polifenoles por los explantes. Sin embargo, los efectos positivos y negativos del carbn activo varan, dependiendo de la especie y de la edad del material colectado. Un efecto favorable se tuvo en Sequoiadendron giganteum, con la adicin de 20 g/l al medio de cultivo y usando microestacas de clones juveniles en crecimiento activo, las que presentaron un menor contenido de polifenoles en la parte alta del explante durante la fase de elongacin, cuya diferencia no fue observada en clones maduros (BON, GENDRAUD y FRANCLET, 1988).

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MARGARA (1988), en tanto, seala que el carbn activado favorece el crecimiento de los tejidos, especialmente en el cultivo de pices, sin embargo tambin existen efectos negativos sobre algunos frutales, inhibiendo la formacin de races o el crecimiento, debido a la absorcin de reguladores de crecimiento (auxinas, citoquininas) contenidas en el medio, lo que es posiblemente la causa de la leve reaccin al medio, a diferencia del ensayo anterior.

Los resultados de la variable respuesta color, expresados en valores promedio muestrales, durante tres perodos de cultivo en la etapa de establecimiento, se observan en el Cuadro 19.

CUADRO 19. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Dendroseris litoralis a los 30, 60 y 90 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 Da 90 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 5 7 a* 7 a 7 a 7 a 7 a b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Se detectaron diferencias (P0.05) entre los medios de establecimiento, solo a los 30 das de cultivo de los explantes, observndose principalmente en el medio uno, el color amarillo (8/10 5GY) y, en el medio dos, el color caf claro (5/4 2.5 Y). Por lo tanto, es posible inferir que el medio uno es mejor al representar un color promedio ms cercano al color verde propio de la especie (5/8 7.5 GY), que implicara un

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menor pardeamiento sobre los explantes, tal como se observa en el Cuadro 18. En tanto que, a los 60 y 90 das de cultivo, se observ mayormente el color caf claro (5/4 2.5 Y), indicando la exudacin de compuestos fenlicos.

Se presentan en el Cuadro 20 los resultados del porcentaje de explantes sobrevivientes para la especie Dendroseris neriifolia, los que presentan diferencias (P0.05) entre ambos medios de cultivo, solo despus de 40 das, y que se prolonga hasta los 60 das.

CUADRO 20. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Dendroseris neriifolia, segn el medio de cultivo. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Da 20** 88 a* 88 a Da 40 84 b 88 a Da 60 84 a 80 b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

De igual modo que en Dendroseris litoralis, los explantes en el medio nmero dos muestran una mayor Tasa de sobrevivencia a los 40 das de cultivo, debido, principalmente, a una menor incidencia de hongos, gracias a una mayor eficiencia de la solucin fungicida aplicada antes de la desinfeccin y, a la misma desinfeccin, en relacin a cantidad de surfactante y la adherencia o cubrimiento superficial del mismo sobre los explantes, cuya efectividad vara en respuesta al tiempo y dosis (HARTMANN y KESTER, 1998). Sin embargo, a los 80 das de cultivo, el medio uno, presenta una mayor tasa de explantes sobrevivientes, debido a la ausencia de bacterias endgenas.

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HARTMANN y KESTER (1998) dan mucha importancia al lugar de recoleccin del material como al tipo de explante con que se trabaja para tener xito en la desinfeccin y cultivo in vitro. A pesar de esto y considerando que el lugar de procedencia del material vegetal es el sombreadero del Laboratorio de Propagacin, la mortalidad de los explantes es baja y la aparicin de bacterias es nula.

En la etapa de establecimiento in vitro se evidenciaron diferencias (P0.05) entre los dos tratamientos, solamente en la variable oxidacin. Los resultados de las variables oxidacin y callosidad promedio se presentan a continuacin (Cuadro 21):

CUADRO 21. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidacin y formacin de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Dendroseris neriifolia. Tratamiento T1: Medio 1 T2: Medio 2 Oxidacin por explante Da 30** 4.84 a* 4.36 a Da 60 5.52 b 5.12 a Da 90 5.68 b 5.4 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P 0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

En el medio de cultivo nmero uno, los explantes presentan una mayor oxidacin promedio que el medio nmero dos, luego de dos y tres meses de cultivo; en tanto que no se observa formacin de tejido de callo, en ambos medios, durante los tres meses de cultivo. Sin embargo y, al igual que en Dendroseris litoralis, los altos valores promedios de oxidacin en los explantes a los 60 das de cultivo superan en casi un punto a aquellos para la misma especie en el ensayo anterior, a los 30 das de cultivo. Es posible que el carbn activo sea la causa de esta alta oxidacin, lo que podra confirmar lo expuesto por PIERIK (1990), quien seala que el carbn activo puede estabilizar el pH, pero tambin en algunos casos adsorber compuestos

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orgnicos como auxinas, citoquininas, vitaminas, etc. (HARTMANN y KESTER, 1998), provocando un efecto inhibitorio como en este caso.

Lo anterior tambin puede haber sido favorecido con las sustancias excretadas por el explante (compuestos fenlicos, taninos, etc.) como lo expone MARGARA (1988) y DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI (1991) las que producen oscurecimiento del medio e inhibicin del crecimiento, acompaado a veces por necrosis del explante, al igual que en las especies anteriormente sealadas. Incluso, se realiz el cambio a un medio renovado de aquellos explantes que no presentaban una oxidacin fuerte y homognea a los 34 das de cultivo. Sin embargo, a los 10 das de llevado a cabo el traspaso, los explantes se oxidaron completamente, sin llegar a formar tejido de callo ni presentar organognesis (Cuadro 21).

En el Cuadro 22, se presentan los resultados de coloracin en los explantes durante tres perodos de cultivo.

CUADRO 22. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Dendroseris neriifolia a los 30, 60 y 90 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 Da 90 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 5 a* 5 a 6 a 6 a 6 a 6 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

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La variable respuesta color no evidenci diferencias (P0.05) entre los medios de establecimiento, durante los tres perodos de cultivo, observndose preferentemente el color caf anaranjado (8/10 5Y) a los 30 das de cultivo y, el color caf plomizo, a los 60 y 90 das.

4.4.2. Gnero Robinsonia.

Los resultados de sobrevivencia para explantes de la especie Robinsonia gayana en ambos medios de cultivo, se presentan a continuacin (Cuadro 23), a los 20, 40 y 60 das de realizado el cultivo.

CUADRO 23. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Robinsonia gayana, segn el medio de cultivo. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Da 20** 36 a 16 b Da 40 28 a 16 b Da 60 28 a 16 b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P 0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Ambos medios de cultivo presentan diferencias (P0.05), a los 20, 40 y 60 das de cultivo, siendo el medio uno el mejor, porque obtiene una mayor sobrevivencia de explantes por una menor contaminacin por bacterias al inicio del cultivo, la principal causa de mortalidad, posiblemente debido a un menor contenido exgeno y endgeno de stas en esos explantes, las que incluso pueden aparecer ms adelante (DIRR y HEUSER, 1987; HARTMANN y KESTER,1998). Sin embargo, en esta especie no era evidente la aparicin de stas al inicio del cultivo, en los ensayos anteriores.

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En la variable oxidacin, se evidencian diferencias (P0.05) entre los dos medios de cultivo, solo a los 30 das de cultivo; en cambio, hay diferencias en la formacin de callo, a los 60 y 90 das, en la etapa de establecimiento in vitro (Cuadro 24), siendo mayor la callosidad en el medio dos, y, por ende, en contra de la organognesis en los explantes.

CUADRO 24. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidacin y formacin de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Robinsonia gayana. Tratamiento T1: Medio 1 T2: Medio 2 Oxidacin por explante Da 30** 4.64 b 3.84 a Da 60 5.56 a* 5.44 a Da 90 5.72 a* 5.52 a Formacin de callo por explante Da 30 1.0 a* 1.0 a Da 60 1.24 a 1.76 b Da 90 1.56 a 2.0 b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P 0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

En ambos medios, los explantes presentan una alta oxidacin promedio, debido a las sustancias excretadas por el explante (compuestos fenlicos, taninos, etc.) como lo expone MARGARA (1988) y DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI (1991), las que producen oscurecimiento del medio e inhibicin del crecimiento, acompaado a veces por necrosis del explante, al igual que en las especies anteriormente sealadas.

La oxidacin se vio favorecida al no trapasar los explantes a un medio nuevo, como lo recomienda BROOME y ZIMMERMAN (1978), hacerlo a los dos das de cultivo, en Rubus ursinus Cham y Schlecht. Sin embargo, este periodo de tiempo no es lo caracterstico para las especies leosas, siendo subcultivado Rhododendron spp. al inicio cada 2 semanas, y, posteriormente, cada 6 u 8 semanas. A pesar de cambiar a un medio renovado un explante, debido a que los dems presentaban una

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oxidacin fuerte y homognea, a los 54 das de cultivo, se oxid completamente a los pocos das.

A diferencia del segundo ensayo, la oxidacin promedio de los explantes es muy alta al inicio del cultivo (30 das), y supera, en poco ms de un punto, al promedio obtenido a los 60 das. Esto sugiere que los factores nombrados quizs no son la nica causa de aquello, pudiendo ser tambin la poca de cultivo, siendo mejor para CHRISTIANSEN y FONNESBECH (1975), en Hamamelis, en el mes de julio (Hemisferio Norte); o un efecto negativo del carbn activo al provocar un efecto inhibitorio con la adsorcin de auxinas, citoquininas y vitaminas (HARTMANN y KESTER, 1998).

La accin individual o conjunta de estos factores en ambos medios, inhibe la reaccin del explante al medio de cultivo, vindose reflejado en la formacin de callos pequeos en el sector de corte del explante, perpendicular a la nervadura del mismo, que es mayor en el medio dos a los 60 y 90 das de cultivo. La oxidacin sobre los explantes no pudo ser controlada, lo que provoc una necrosis total y homognea de forma muy acelerada, en 60 das de cultivo.

Se presentan, a continuacin (Cuadro 25), los resultados de los registros de color en los explantes, expresados en valores promedio muestrales, de tres perodos de cultivo.

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CUADRO 25. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Robinsonia gayana a los 30, 60 y 90 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 Da 90 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 5 3 a* 6 a 6 a 7 a 7 a b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

De igual modo que en Dendroseris litoralis, solo se encontr diferencias (P0.05) a los 30 das de cultivo, presentndose en el medio uno, en mayor cantidad, el color verde oscuro opaco (4/4 7.5 YR) y, en el medio dos, mayormente el color verde claro (5/8 5GY), demostrando ser mejor al representar un color de explante ms cercano al color verde propio de la especie (5/6 7.5 GY), lo que podra indicar un menor grado de oxidacin. Esto queda demostrado en los resultados de la variable oxidacin (Cuadro 24). En tanto, a los 60 y 90 das de cultivo, se observaron los colores caf oscuro (4/2 7.5 YR) y caf muy oscuro (3/2 YR), respectivamente.

El Cuadro 26 presenta los resultados de sobrevivencia en explantes de Robinsonia thurifera, en ambos medios de establecimiento, de tres perodos de cultivo.

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CUADRO 26. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Robinsonia thurifera, segn el medio de cultivo. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Da 30** 44 b 48 a Da 60 40 a 28 b Da 90 40 a 24 b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P 0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Los resultados evidencian diferencias (P0.05) entre los dos medios, a los 30, 60 y 90 das de cultivo, siendo mejor el medio nmero uno, desde los 60 hasta los 90 das, por obtener un mayor porcentaje de explantes sobrevivientes, gracias a una menor contaminacin de bacterias al inicio del cultivo, durante los primeros 15 das, de igual forma que en Robinsonia gayana, las que se encontraban en menor cantidad endgena en esos explantes.

Por esto es importante partir con un material ptimo, libre de enfermedades sistmicas producidas por bacterias, virus, micoplasmas y rickettsias, comenzando con una seleccin adecuada, en terreno, del explante (HARTMANN y KESTER, 1998; GARCIA y NOA, 1998).

Se presentan los resultados de las variables oxidacin y callosidad promedio por explante para la especie Robinsonia thurifera a los 30, 60 y 90 das de cultivo (Cuadro 27).

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CUADRO 27. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidacin y formacin de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Robinsonia thurifera. Tratamiento T1: Medio 1 T2: Medio 2 Oxidacin por explante Da 30** 4.40 a* 5.08 a Da 60 5.8 a* 5.88 a Da 90 5.92 a* 6.0 a Formacin de callo por explante Da 30 1.44 b 1.12 a Da 60 Da 90 2.0 b 2.0 b 1.24 a 1.76 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

No se evidenciaron diferencias (P0.05) entre los explantes de ambos medios, en la variable oxidacin, desde el inicio hasta los 90 das de cultivo, pero s en la variable callosidad, donde el medio nmero uno fue mejor, pues form una mayor cantidad promedio de tejido de callo por explante.

Al igual que en Robinsonia gayana, en ambos medios de establecimiento los explantes presentan una extremadamente alta oxidacin promedio a 30 das de cultivo, incluso mayor, superando en casi un punto al promedio obtenido a los 60 das. Esto es en parte debido a que las sustancias excretadas por el explante (compuestos fenlicos, taninos, etc.) producen oscurecimiento del medio e inhibicin del crecimiento e incluso necrosis del explante (MARGARA, 1988; DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI, 1991).

La oxidacin en esta especie tambin se vio favorecida al no traspasar los explantes a un medio renovado hasta los 34 das de cultivo, siendo muy tarde para lo que recomienda BROOME y ZIMMERMAN (1978) en Rubus ursinus Cham y Schlecht., a los dos das de cultivo. Sin embargo, normalmente en otras especies leosas los explantes son cambiados a un medio renovado al cabo de 30 das de cultivo, como sucede en Rhododendron spp., donde los primeros subcultivos se realizan cada dos

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semanas, pero posteriormente se hacen cada 6 u 8 semanas (ANDERSON, 1975; KYTE y BRIGGS, 1979). Estas transferencias se realizan para contrarrestar el efecto y evitar, segn YEOMAN y MACLEOD (1977), un irremediable debilitamiento, intoxicacin y muerte. Esto tambin puede ser confirmado con lo expuesto por McCLELLAND y SMITH (1993) con respecto a la desventaja que posee el hipoclorito de sodio, de producir oxidaciones en los tejidos vivos al entrar en contacto durante los enjuagues. A pesar de la transferencia a un medio nuevo, a los pocos das de realizar el cambio, los explantes se oxidaron fuerte y homogneamente, lo que indica que alguno de los constituyentes del medio de cultivo, posiblemente el carbn activado, afect fuertemente la sobrevivencia de los explantes.

Esto tambin sugiere que los factores nombrados no son los nicos causantes de los altos valores de oxidacin a los 30 das de cultivo, pudiendo ser en este caso tambin la poca de cultivo, siendo mejor para CHRISTIANSEN y FONNESBECH (1975) en Hamamelis el mes de julio (Hemisferio Norte); o un efecto negativo del carbn activo, al provocar un efecto inhibitorio con la adsorcin de auxinas, citoquininas y vitaminas (HARTMANN y KESTER, 1998).

Al igual que en la otra especie del gnero, se inhibe la reaccin del explante al medio de cultivo, con la escasa cantidad y pequea formacin de callos en el sector de corte del explante, perpendicular a la nervadura del mismo y nula organognesis. Sin embargo, existe una mayor formacin de callos en el medio uno, debido a la estrecha relacin de las concentraciones entre ambas hormonas, lo que es corroborado por CHISTIANSON y WARNICK (1983), HARTMANN y KESTER (1998), quienes afirman que la formacin de callo se debe a la alta concentracin de auxinas y baja dosis de citoquininas en el medio de cultivo. Se debe considerar que mejor es que no haya formacin de callo, en el sentido de favorecer la organognesis, pero, en cuanto a respuesta, podra considerarse algo negativo.

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Producto de una oxidacin homognea fuerte, los explantes se necrosaron y murieron rpidamente, luego de 60 das de cultivo.

Los resultados del color de los explantes de Robinsonia thurifera, luego de 90 das de cultivo se presentan a continuacin (Cuadro 28).

CUADRO 28. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Robinsonia thurifera a los 30, 60 y 90 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 Da 90 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 3 a* 4 5 a 6 a 6 a 6 a b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Se obtienen diferencias (P0.05) a los 30 y 60 das de cultivo, entre los dos medios de establecimiento. A los 30 das, el color verde claro (5/10 5GY) fue el ms representativo en el medio uno; y en el medio dos, el color verde oscuro opaco (4/4 7.5 YR). A los 60 das, en el medio uno, el color ms sobresaliente fue el caf claro (5/6 2.5 Y), en tanto que en el medio dos, es el color caf muy oscuro (3/2 5YR). De esto, se desprende que el medio uno es mejor hasta los 60 das de cultivo, al representar colores equivalentes a un menor distanciamiento del color propio de la especie (4/6 5GY), que representa un menor pardeamiento sobre los explantes. Sin embargo, a los 90 das de cultivo, en ambos tratamientos se observa mayormente el color caf muy oscuro (3/2 5 YR).

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Se desprende de los resultados que los explantes de las cuatro Asterceas reaccionaron de forma tarda a los medios, generando una menor y peor respuesta que en el ensayo dos, casi todos ellos evidenciando un rpido pardeamiento al inicio del cultivo y, por consiguiente, una muerte ms acelerada, y donde solo algunos explantes formaron callos muy pequeos, principalmente, en la zona de corte. Adems, se pudo constatar de una alta incidencia de bacterias, no solo como sucedi en el gnero Dendroseris, del segundo ensayo, sino que tambin el gnero Robinsonia es susceptible a ellas.

La razn de la diferencia en los resultados existentes entre este ensayo y el ensayo dos, que deberan haber sido positivos y mejores en cuanto a contrarrestar los efectos de pardeamiento por ms tiempo, no lo fueron, porque quizs la inclusin de carbn activado tuvo un efecto negativo para estas especies.

Ensayo 5: Efecto de dos medios de cultivo slidos sobre la oxidacin y color de explantes de hoja en la etapa de establecimiento in vitro para Robinsonia thurifera, familia Asteraceae.

Los explantes de hojas fueron colocados sobre un medio nutritivo base macro y micro nutrientes de WPM (LLOYD y McCOWN, 1981), vitaminas de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), cido ascrbico, carbn activado, ANA y BAP como reguladores de crecimiento y agar.

Los explantes se desarrollaron en una cmara de crecimiento con temperaturas de 232C y en oscuridad durante una semana, exponindolos gradualmente a la luz, en los das siguientes de cultivo. PIEPER y ZIMMER (1976), afirman que estas condiciones medioambientales in vitro han limitado efectivamente el pardeamiento del medio en explantes de la orqudea Phalaenopsis al iniciar el cultivo en

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oscuridad. Sin embargo, no se logr eliminar completamente, ni reducir, ni detener por un largo perodo el efecto de pardeamiento, hacindose presente tempranamente la necrosis total de los explantes.

El Cuadro 29 presenta los resultados de sobrevivencia, en porcentaje de explantes sobrevivientes para la especie Robinsonia thurifera, en ambos tratamientos, a los 30 das de cultivo.

CUADRO 29. Efecto de dos medios de cultivo y un origen de explante sobre el porcentaje de explantes sobrevivientes y la oxidacin promedio por explante, en la etapa de establecimiento in vitro de Robinsonia thurifera, a los 30 das de cultivo. Tratamiento T1: Medio 1 T2: Medio 2 Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) 65 a 60 b Oxidacin por explante 4.9 4.65 a* a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05).

Los resultados evidencian diferencias (P0.05) entre los dos medios, a los 30 das de cultivo, en el porcentaje de explantes sobrevivientes, no siendo as en la variable oxidacin. El medio uno resulta ser mejor, al presentar la mayor tasa de explantes sobrevivientes, siendo las bacterias la causa principal de la mortalidad. Sin embargo, la sobreviviencia es mayor que el ensayo 4, para la misma especie, posiblemente debido a que contiene exgena y endgenamente una menor presencia de stas en esos explantes, las que incluso pueden aparecer en un perodo ms avanzado del cultivo (DIRR y HEUSER, 1987; HARTMANN y KESTER, 1998).

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Es por esto que, es importante partir con un material ptimo, libre de enfermedades sistmicas producidas por bacterias, virus, micoplasmas y rickettsias, comenzando con una seleccin adecuada en terreno del explante (HARTMANN y KESTER, 1998; GARCIA y NOA, 1998). Sin embargo, lo anterior no fue posible de realizar y, sera factible incluir antibiticos en el medio de cultivo, tales como amoxicilina, agramicina (OYANEDEL, 1995) o penicilina, terramicina, estreptomicina, de gran utilidad para el control del desarrollo de bacterias, incluso, con efectos estimuladores sobre el crecimiento (HARTMANN y KESTER, 1998).

Es importante destacar la similitud de los valores de oxidacin, con respecto al ensayo 4, para la misma especie, pero al mismo periodo (30 das) no hay formacin de tejido de callo. Sin embargo, la oxidacin fue menor durante los primeros 7 das de cultivo, en que estaban en oscuridad, por lo tanto, sera una buena alternativa, prolongar el nmero de das bajo esta condicin o quizs traspasarlos a ese tiempo a un medio renovado, pero sin carbn activo. Se presentan a continuacin (Cuadro 30) los resultados de la variable respuesta color, a los 30 das de cultivo.

CUADRO 30. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Robinsonia thurifera a los 30 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 5 4 a b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

A los 30 das de cultivo, se evidencian diferencias (P0.05) entre los explantes de los dos tratamientos, observndose principalmente el color caf claro (5/6 2.5 Y) en el medio uno y, el color verde oscuro opaco (4/4 7.5 YR) en el medio dos, a diferencia del ensayo 4, es mejor el medio dos, al presentar un color promedio

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equivalente a una mayor cercana del color propio de la especie (4/6 5GY), el cual debera representar una menor oxidacin de los explantes. No obstante, esto no se cumple en los resultados de la variable oxidacin (Cuadro 29).

Se desprende de los resultados que, los explantes reaccionaron levemente al medio de cultivo, solo durante los primeros 15 das, con una muy leve oxidacin en la zona del corte y doblando los bordes paralelos a la nervadura hacia el agar, pero, despus de este perodo, los explantes comenzaron a oxidarse rpida y homogneamente, sin llegar a formar algn tejido u rgano.

Ensayo 6: Efecto de cuatro protocolos de desinfeccin sobre los explantes de hojas en la especie Ochagavia elegans, familia Bromeliaceae.

Los explantes de hojas fueron colocados sobre un medio nutritivo base MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962) cero, en el que sobrevivieron durante dos meses y medio sin generar respuesta alguna a ste, hasta que la oxidacin produjo una completa necrosis de ellos.

Se presentan, en el Cuadro 31, los resultados de los registros de sobrevivencia de los explantes, a los 30, 60 y 90 das de cultivo para la especie Ochagavia elegans.

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CUADRO 31. Efecto de cuatro protocolos de desinfeccin sobre la tasa de sobrevivencia y la oxidacin de explantes de hoja en Ochagavia elegans R. A. Phill. Tratamiento T1: Desinfeccin 1 T2: Desinfeccin 2 T3: Desinfeccin 3 T4: Desinfeccin 4 Sobrevivencia de explantes (%) Da 30** 52 c 60 b 80 a 36 d Da 60 52 c 56 b 64 a 24 d Da 90 44 c 56 b 64 a 20 d Oxidacin por explante Da 75 2 a* 2.2 a 2.48 b 3 c

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

El porcentaje de explantes sobrevivientes presenta a los 30, 60 y 90 das de cultivo, diferencias (P0.05) entre las desinfecciones, siendo la nmero tres la mejor, porque presenta la menor contaminacin por hongos y bacterias, y, en la cual, los hongos fueron la principal causa de mortalidad. Estas diferencias, pueden ser debido al mayor efecto de la dosis de desinfectante utilizada, al contener la mayor concentracin de hipoclorito de sodio (1.5%) sin la aplicacin previa de etanol.

Aunque la desinfeccin nmero tres presenta una baja mortalidad hasta el da 90, presenta una alta oxidacin de los explantes, confirmando tambin al igual que en las otras especies descritas, lo expuesto por McCLELLAND y SMITH (1993) con respecto a la desventaja que posee el hipoclorito de sodio, de producir oxidaciones en los tejidos vivos al entrar en contacto durante los enjuagues.

Cabe sealar que, a pesar de que estos explantes (hojas), se encuentran ms expuestos a los patgenos, presentan una mayor tasa de sobrevivencia que en el cultivo de trozos de hojas (provistos de yemas en la base) en Puya chilensis (12,5%), donde CAMPOS (1995) utiliza una desinfeccin ms leve (hipoclorito de

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sodio al 1% durante tres minutos), debido a que es un explante ms protegido del ambiente al estar cubierto por las escamas foliares (MARGARA, 1988).

La variable oxidacin (Cuadro 31) evidencia diferencias (P0.05), a los 75 das de cultivo. En la desinfeccin nmero uno, los explantes presentan a los 75 das de cultivo una menor oxidacin promedio, que no es diferente, estadsticamente, de la desinfeccin nmero dos, pero s de la nmero tres y cuatro. Esta diferencia puede ser debida al menor porcentaje de hipoclorito de sodio (1%), lo que provoca una reduccin del efecto negativo (oxidacin) de esta solucin sobre los tejidos (McCLELLAND y SMITH, 1993), y/o a la fuerte relacin entre el fenmeno de pardeamiento de puntas de brotes como explantes y el origen del explante, por efecto de los contenidos fenlicos preexistentes y la posterior sobrevivencia, detectada por YU y MEREDITH (1986), tambin sealado en la familia Asteraceae.

CAMPOS (1995) en Puya chilensis no seala la presencia de pardeamiento en los explantes, a pesar del uso de cido ctrico en el medio de cultivo. En tanto que Ochagavia elegans presenta una oxidacin leve de los explantes en la zona de corte, a los dos das de cultivo.

Los explantes no formaron tejido de callo ni rgano alguno en el medio utilizado para las desinfecciones, lo que puede deberse, al igual que en las especies de la familia Asteraceae, a la falta de compuestos orgnicos en el medio de cultivo, como vitaminas y reguladores del crecimiento. MURASHIGE (1977) afirma que en la mayora de las plantas propagadas in vitro, el xito depende tanto de la seleccin del explante adecuado como la composicin del medio.

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Como consecuencia de lo anterior, los explantes presentaron necrosis a los 75 das de cultivo, al no ser cambiados a un medio renovado. Esto corrobora la importancia que YEOMAN y MACLEOD (1977) dan a tener que transferir el tejido callo a un medio renovado con una frecuencia de dos a seis semanas para evitar un irremediable debilitamiento, intoxicacin y muerte.

Adems, la oxidacin de compuestos fenlicos liberados por un rompimiento celular debido a lesiones, es una de las serias causas de prdida al inicio de establecimiento del cultivo (MARKS y SIMPSON, 1989).

Ensayo 7: Efecto de dos medios de cultivo sobre la oxidacin promedio y color de tres tipos de explantes en la etapa de establecimiento in vitro, en Ochagavia elegans.

Los explantes de hojas, yemas y tallos fueron colocados sobre un medio nutritivo base macro y micro nutrientes de RM (REINERT y MOHR, 1967), vitaminas de RM, suplementado con ANA y Kinetina como reguladores del crecimiento, probando dos proporciones distintas de estos grupos de hormonas.

Se utilizan como explantes secciones de hojas del sector basal (maduras) y de mayor tamao para el cultivo, yemas apicales y basales con secciones de tallo y trozos de tallo sin yemas. Debido a la escasez de explantes disponibles por planta, se usan 9 explantes de yemas y 8 explantes de tallo.

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4.7.1. Explantes de hojas

Se utilizan principalmente secciones de hojas externas (mayor edad) o de mayor tamao para el cultivo y 10 explantes por tratamiento, cuyos resultados de los registros de sobrevivencia de tres perodos de cultivo se presentan a continuacin (Cuadro 32).

CUADRO 32. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Ochagavia elegans, segn el medio de cultivo. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Da 30** 90 b 100 a Da 60 90 b 100 a Da 90 90 b 100 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

El alto porcentaje de explantes sobrevivientes a los 90 das de cultivo, presenta diferencias (P0.05) entre los medios, siendo mejor el medio nmero dos por no evidenciar contaminacin por hongos, la principal causa de mortalidad. Esto puede ser debido a una mayor eficiencia de la solucin fungicida aplicada antes de la desinfeccin en cuanto a homogeneidad y, a la misma desinfeccin, en relacin a cantidad de surfactante y la adherencia o cubrimiento superficial del mismo, sobre los explantes, cuya efectividad vara en respuesta al tiempo y dosis (HARTMANN y KESTER, 1998).

Por otra parte, la variable oxidacin no evidenci diferencias (P0.05), luego de tres meses de cultivo, entre los dos medios (Cuadro 33).

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CUADRO 33. Efecto de dos medios de cultivo y un origen de explante sobre la oxidacin, en la etapa de establecimiento in vitro de Ochagavia elegans. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Oxidacin promedio por explante Da 60 2.8 a* 3.5 a

Da 30** 2.8 a* 3.5 a

Da 90 3.1 a* 3.7 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

A pesar de no existir diferencias significativas (P0.05) entre los medios en esta variable, sigue siendo la ms importante, sealndose que la oxidacin de compuestos fenlicos liberados por un rompimiento celular debido a lesiones, es una de las serias causas de prdida al inicio de establecimiento del cultivo (MARKS y SIMPSON, 1989), por inhibicin y muerte de los explantes en un amplio rango de especies (CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975).

Durante el perodo de cultivo, no hubo organognesis ni formacin de algn tejido, lo que puede ser porque el medio no era el adecuado, provocando la muerte de los explantes por efecto del pardeamiento y agotamiento del medio, al no ser transferidos a un medio renovado, como sealan YEOMAN y MACLEOD (1977), la importancia de transferir el tejido de callo a un medio renovado con una frecuencia de dos a seis semanas para evitar un irremediable debilitamiento, intoxicacin y muerte. Esto tambin es confirmado por MURASHIGE (1977) para la mayora de las plantas propagadas in vitro, donde el xito depende tanto de la seleccin del explante adecuado como la composicin del medio, siendo importantes tambin la edad, el estatus de agua y nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE GROOT, 1985).

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Se analizan a continuacin los resultados obtenidos de los registros de la variable color, durante tres momentos de cultivo (Cuadro 34).

CUADRO 34. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de hojas en Ochagavia elegans a los 30, 60 y 90 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 Da 90 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 3 a* 2 a 3 a 3 a 4 a 5 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

No se detectaron diferencias (P0.05) entre los distintos medios de establecimiento, durante tres perodos de cultivo, 30, 60 y 90 das. Se observ a los 30 das, principalmente en el medio uno, el color verde claro (7/10 5 GY) y, el color verde oscuro propio de la especie (4/4 7.5 GY) en el medio dos. A los 60 das, ambos medios presentaron mayormente el color verde claro (7/10 5 GY). Sin embargo, a los 90 das, el color verde amarillo (7/8 2.5 GY) en el medio uno y, el color verde pardeado (5/4 2.5 GY) en el medio dos, son los ms representativos.

4.7.2. Explantes de yemas

Las yemas apicales se desinfectan con hipoclorito de sodio al 0,5%, durante 10 minutos y, las basales, con hipoclorito de sodio al 1,5%, durante 10 minutos.

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Los resultados del porcentaje de sobrevivencia de dos orgenes de explantes durante tres perodos de cultivo, se presentan en el Cuadro 35.

CUADRO 35. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Ochagavia elegans, segn el origen del explante y el medio de cultivo. Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 YEMAS APICALES Da 30** Da 60 Da 90 50 b 40 b 40 b 80 a 70 a 60 a YEMAS BASALES Da 30 Da 60 Da 90 20 b 10 b 0 a* 10 a 0 a 0 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

No se evidenciaron diferencias estadsticas significativas, segn el Test de Tukey (P0,05), a los 90 das de cultivo, entre ambos medios de establecimiento, en yemas de la base de la planta, al contrario de lo que sucedi en yemas apicales, donde s se encontraron diferencias significativas, siendo mejor el medio nmero dos por presentar una menor contaminacin por hongos y bacterias, los primeros son la principal causa de mortalidad de los explantes. Esta diferencia puede ser porque las yemas de la base son de mayor tamao que las del pice de la planta y se encuentran ms expuestas al ambiente; a pesar de las diferentes dosis empleadas en la desinfeccin.

La desinfeccin es uno de los puntos ms importantes para el xito del cultivo in vitro, sobre todo si se trabaja con material proveniente de sitios en donde no se hacen desinfecciones (HARTMANN y KESTER, 1998), y no se utilizan como explante tejidos bien protegidos (meristemas) o pices de tallo cubiertos por las escamas foliares (MARGARA, 1988), como es en este caso, en que el material se

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encontraba en el sombreadero del Laboratorio de Propagacin, y, por sto, ms susceptible a la penetracin de patgenos en tejidos meristemticos.

Se presentan en el siguiente cuadro (Cuadro 36) los resultados de oxidacin de dos orgenes de explante a los 30, 60 y 90 das de cultivo.

CUADRO 36. Efecto de dos medios de establecimiento y dos orgenes de explante sobre la oxidacin en la etapa de establecimiento in vitro de Ochagavia elegans. Oxidacin promedio por explante Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 YEMAS APICALES Da 30** Da 60 Da 90 4.7 a 4.8 a* 5 a* 4.8 b 4.8 a 5 a YEMAS BASALES Da 30 Da 60 Da 90 4.5 a* 4.7 a* 5 a* 4.5 a 4.7 a 5 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

En la variable oxidacin, los explantes de ambos medios de cultivo no evidenciaron diferencias (P0.05), a los dos y tres meses de cultivo, para los dos orgenes de explantes. Este factor es tambin uno de los ms importantes para el desarrollo de esta especie, ya que no pudo ser controlado, observndose altos valores de oxidacin promedio, alcanzados en todos los explantes, incluso mayores que en explantes de hojas, sealndose que la oxidacin de compuestos fenlicos liberados por un rompimiento celular debido a lesiones, es una de las serias causas de prdida al inicio de establecimiento del cultivo (MARKS y SIMPSON, 1989), por inhibicin y muerte de los explantes en un amplio rango de especies (CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975). Los explantes estn completamente oxidados a los 90 das de cultivo.

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No se observ desarrollo de las yemas ni formacin de algn tejido, lo que puede ser a causa de la alta oxidacin de los explantes o quizs porque el medio no era el adecuado, provocando la muerte de los explantes por efecto del pardeamiento y agotamiento del medio, al no ser transferidos a un medio renovado. Esto lo confirma MURASHIGE (1977) al sealar que el xito del cultivo in vitro depende tanto de la seleccin del explante adecuado como de la composicin del medio.

CAMPOS (1995), durante la desinfeccin y etapa de establecimiento, reporta que no hay pardeamiento sobre los explantes de Puya chilensis, sin embargo, utiliza una desinfeccin ms leve (hipoclorito de sodio al 1% por 3 minutos, pero obteniendo una bajo porcentaje de sobrevivencia de stos (33%), sin hacer distincin en la posicin de los explantes.

Se presentan, en los Cuadros 37 y 38, los resultados de la variable color, registrados en tres perodos de cultivo, para yemas apicales y yemas basales, respectivamente.

CUADRO 37. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de yemas apicales en Ochagavia elegans a los 30, 60 y 90 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 Da 90 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 3 a* 3 a 3 a 3 a 3 a 3 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

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No se evidenciaron diferencias (P0.05), entre los dos medios de establecimiento, durante los tres periodos de cultivo, 30, 60 y 90 das, observando en todos ellos, mayormente el color caf oscuro (4/2 7.5 YR), el cual representa una alta oxidacin sobre los explantes, quedando demostrado en los resultados de oxidacin (Cuadro 36).

CUADRO 38. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de yemas basales en Ochagavia elegans a los 30, 60 y 90 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 Da 90 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 2 a* 2 a 2 a 2 a 3 a 3 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Al igual que en yemas apicales, durante los tres periodos de cultivo, 30, 60 y 90 das, no se encontraron diferencias (P0.05), entre los dos medios de establecimiento, observando a los 30 y 60 das, mayormente el color caf claro (6/6 2.5 Y), mientras que a los 90 das, el color ms representativo es el caf oscuro (4/2 7.5 YR). Estos colores implican una oxidacin de las yemas basales, ms leve que en yemas apicales, sin embargo, la prdida total del color propio de la especie sucede tempranamente, a los 30 das de cultivo.

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4.7.3. Explantes de tallo

Se utilizaron como explantes trozos de tallo con secciones de races y sin yemas laterales. El cuadro siguiente (Cuadro 39) presenta los resultados de explantes sobrevivientes, en ambos medios de cultivo, durante tres perodos de cultivo.

CUADRO 39. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Ochagavia elegans, segn el medio de cultivo. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Da 30** 50 b 60 a Da 60 50 a* 50 a Da 90 50 a* 50 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

El porcentaje de explantes sobrevivientes a los 60 y 90 das de cultivo no presenta diferencias (P0.05), entre los medios de establecimiento. En comparacin con los otros dos tipos de explantes, la sobrevivencia es mucho menor que en explantes de hojas, y similar a explantes de yemas.

La variable oxidacin tampoco evidencia diferencias (P0.05), durante tres meses de cultivo, entre los dos medios de establecimiento (Cuadro 40).

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CUADRO 40. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidacin en la etapa de establecimiento in vitro de Ochagavia elegans. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Oxidacin promedio por explante Da 60 1.8 a* 2.8 a

Da 30** 1.8 a* 2.8 a

Da 90 1.8 a* 2.8 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Se presentan bajos niveles de oxidacin, a diferencia de los restantes tipos de explantes (hojas y yemas). Sin embargo, durante el perodo de cultivo no hay organognesis, ni tampoco formacin de algn tejido, lo que puede ser porque la concentracin de los grupos hormonales auxinas-citoquininas o la eleccin del tipo de medio (lquido o slido), no provoque la reaccin de los explantes; es decir, no son adecuados. Es el caso del cultivo de Cattleya por REINERT y MOHR (1967) en medio slido, en donde las secciones de tejido meristemtico provenientes de yemas laterales como explantes, se tornan de color caf negruzco durante las primeras tres semanas de desarrollo y posteriormente mueren. Sin embargo, en un medio lquido el crecimiento y desarrollo de los explantes es satisfactorio. Tambin en Cryptanthus sinuosus L.B. Smith, una Bromelicea de Brasil, en peligro de extincin, resulta ser eficiente su propagacin en un medio liquido MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), sin reguladores de crecimiento, usando como explantes secciones de tallo-raz.

Los resultados del color de los explantes de tallo en Ochagavia elegans, luego de 90 das de cultivo, se presentan a continuacin (Cuadro 41).

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CUADRO 41. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de tallo en Ochagavia elegans a los 30, 60 y 90 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 Da 90 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 2 a* 2 a 2 a 2 a 2 a 2 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Al igual que en los explantes de hojas y yemas, durante los tres periodos de cultivo, 30, 60 y 90 das, no se encontraron diferencias (P0.05), entre los dos medios de establecimiento, observndose mayormente el color caf claro (6/6 2.5 Y).

Ensayo 8: Efecto de dos medios de cultivo con carbn activo sobre la oxidacin promedio y el color de tres tipos de explantes en la etapa de establecimiento in vitro, para Ochagavia elegans.

Los explantes de hojas, yemas y tallos fueron colocados sobre un medio nutritivo base macro y micro nutrientes de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), vitaminas de MS, ANA y Kinetina como reguladores del crecimiento en dos distintas proporciones y carbn activo.

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4.8.1. Explantes de hojas

Se utilizaron como explantes secciones de hojas del sector medio y apical para el cultivo. Los resultados de los registros de sobrevivencia de explantes, de tres perodos de cultivo se presentan a continuacin (Cuadro 42).

CUADRO 42. Porcentaje de explantes de hojas sobrevivientes en la especie Ochagavia elegans, segn el medio de cultivo. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Da 30** 90 b 100 a Da 60 90 b 100 a Da 90 90 b 100 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

El alto porcentaje de explantes sobrevivientes a los 30, 60 y 90 das de cultivo presenta diferencias (P0.05) entre los medios, siendo mejor el medio nmero dos, al presentar una sobrevivencia total y mayor, debido posiblemente a una nula incidencia de bacterias, la nica causa de mortalidad en el medio nmero uno y tambin quizs a la alta eficiencia de la desinfeccin en tiempo y dosis, factores que HARTMANN y KESTER (1998) consideran importantes para la efectividad del surfactante en la desinfeccin del explante, debiendo considerar tambin que la capacidad para daar tejidos tambin crece.

Los resultados de la variable oxidacin durante tres perodos de cultivo para los explantes en dos medios de establecimiento, se expresan en el Cuadro 43, donde no se evidencian diferencias (P0.05), luego de tres meses de cultivo, para ambos medios.

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CUADRO 43. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidacin en la etapa de establecimiento in vitro de Ochagavia elegans. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Oxidacin promedio por explante Da 60 2.9 a* 2.75 a

Da 30** 2.7 a* 2.65 a

Da 90 3.1 a* 3.05 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Sin embargo, existe una alta oxidacin de los explantes en la zona del corte (transversal a la direccin de la hoja) aunque menor que en el ensayo anterior, pero que va en aumento con el tiempo de cultivo. Este efecto oxidativo se favorece con la permanencia del explante en el mismo medio, ya que normalmente en otras especies leosas los explantes son cambiados a un medio renovado al cabo de 30 das de cultivo, como sucede en Rhododendron spp., donde los primeros subcultivos se realizan cada dos semanas, pero posteriormente se hacen cada 6 a 8 semanas (ANDERSON, 1975; KYTE y BRIGGS, 1979). Estas transferencias se realizan para contrarrestar el efecto y evitar, segn YEOMAN y MACLEOD (1977), un irremediable debilitamiento, intoxicacin y muerte. Esto tambin puede ser confirmando con lo expuesto por McCLELLAND y SMITH (1993) con respecto a la desventaja que posee el hipoclorito de sodio, de producir oxidaciones en los tejidos vivos al entrar en contacto.

Esta oxidacin en la zona del corte del explante es producida segn MARKS y SIMPSON (1989) por una oxidacin de compuestos fenlicos liberados (MARGARA, 1988; DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI; 1991) por un rompimiento celular debido a lesiones, siendo una de las serias causas de prdida al inicio de establecimiento del cultivo, por inhibicin y muerte de los explantes (CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975). No se han realizado estudios anteriormente con respecto a la composicin qumica de la especie, pero es posible

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que esta especie suculenta, contenga qumicamente una cierta cantidad de sustratos fenlicos similares a los detectados en las Asterceas.

Los menores valores de oxidacin promedio con respecto al ensayo anterior pueden estar relacionados con la inclusin de carbn activo en el medio de cultivo, siendo corroborado por HARTMANN y KESTER (1998) quienes sealan que este reactivo contrarresta el efecto de ciertas sustancias inhibitorias liberadas por algunos tejidos (en este caso de los compuestos fenlicos) o la adsorcin de pigmentos txicos, marrones y negros (compuestos de tipo fenlico y melanina), y de otros compuestos txicos incoloros (PIERIK, 1990). Al igual que para las especies de la familia Asteraceae, es la variable ms importante para el xito de la propagacin in vitro de esta especie.

En los explantes de ambos medios no se observa organognesis ni formacin de tejido de callo, lo que puede deberse, al igual que en las restantes Asterceas, a la seleccin inadecuada del medio de cultivo, considerado junto con la seleccin del explante adecuado, los factores ms importantes en xito de la propagacin in vitro (MURASHIGE, 1977), pero, sin dejar de considerar tambin, la edad, el estatus de agua y nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE GROOT, 1985).

Se analizan a continuacin los resultados obtenidos de los registros de la variable color, en tres perodos de cultivo (Cuadro 44).

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CUADRO 44. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de hojas en Ochagavia elegans a los 30, 60 y 90 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 Da 90 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 3 a* 3 a 3 a 3 a 3 a 3 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Los resultados no demuestran diferencias (P0.05) entre ambos medios de establecimiento, a los 30, 60 y 90 das de cultivo, observndose con mayor predominancia el color verde oscuro pardeado (5/8 5 GY).

4.8.2. Explantes de yemas

Debido a la baja cantidad de este tipo de explantes disponibles por planta, solo fue posible disponer de un bajo nmero de explantes (6) o repeticiones para ser analizados estadsticamente por cada tratamiento. En este caso, se trabaja con todas las yemas posibles del tallo, sin hacer distincin en la ubicacin de ellas.

Los resultados de los registros de sobrevivencia, expresados en porcentaje de explantes sobrevivientes, durante tres periodos de cultivo, 30, 60 y 90 das, se presentan a continuacin (Cuadro 45).

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CUADRO 45. Porcentaje de explantes de yemas sobrevivientes en la especie Ochagavia elegans, segn el medio de cultivo. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Da 30** 83.3 a 66.6 b Da 60 83.3 a 66.6 b Da 90 66.6 a* 66.6 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

El alto porcentaje de explantes sobrevivientes a los 30 y 60 das de cultivo, presenta diferencias (P0.05) entre los medios, siendo mejor el medio nmero uno, al presentar una sobrevivencia mayor, gracias a una menor incidencia de hongos, debido a una mayor eficiencia de la solucin fungicida aplicada antes de la desinfeccin. Sin embargo, esta diferencia desaparece a los 90 das de cultivo. Lo anterior, puede ser debido tambin a lo que sealan (HARTMANN y KESTER (1998), quienes indican que la efectividad del surfactante en la desinfeccin del explante depende de la relacin tiempo-dosis, aumentando sta cuando se aumentan ambos, pero la capacidad para daar tejidos tambin crece.

Los resultados de la variable oxidacin durante tres perodos de cultivo para los explantes en dos medios de establecimiento, se expresan en el Cuadro 46, en donde no se evidencian diferencias (P0.05), luego de tres meses de cultivo, entre los dos medios.

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CUADRO 46. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidacin en la etapa de establecimiento in vitro de Ochagavia elegans. Tratamientos T1: Medio 1 T2: Medio 2 Oxidacin promedio por explante Da 60 4.80 a* 4.5 a

Da 30** 4.4 a* 4.5 a

Da 90 4.83 a* 4.75 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Tukey (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

Sin embargo, existe una alta oxidacin de los explantes, aunque algo menor que en el ensayo siete, sin carbn activo, el cual puede haber favorecido la absorcin de compuestos fenlicos liberados al medio de cultivo durante los primeros 30 das, porque despus los valores se asemejan a los obtenidos en el ensayo sin carbn activo. Esto es confirmado por HARTMANN y KESTER (1998), quienes sealan que contrarresta el efecto de ciertas sustancias inhibitorias liberadas por algunos tejidos (en este caso de los compuestos fenlicos) o la adsorcin de pigmentos txicos, marrones y negros (compuestos de tipo fenlico y melanina), y de otros compuestos txicos incoloros (PIERIK, 1990). Al igual que para las especies de la familia Asteraceae, es la variable ms importante para el xito de la propagacin in vitro de esta especie.

Este efecto oxidativo se favorece con la permanencia de los explantes en el mismo medio hasta los 30 das, luego del cual son traspasados a un medio renovado. Este es un perodo de tiempo normal para las transferencias de los explantes a un medio nuevo, como sucede en Rhododendron spp., cuyos explantes (brotes con yemas) son subcultivados al principio cada dos semanas, pero posteriormente se hacen cada 6 a 8 semanas (ANDERSON, 1975; KYTE y BRIGGS, 1979). Sin embargo, no hubo cambios favorables para los explantes en esta variable.

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Esta oxidacin en casi todo el explante, es producida segn MARKS y SIMPSON (1989) por una oxidacin de compuestos fenlicos liberados (MARGARA, 1988; DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI; 1991), por un rompimiento celular debido a lesiones, inhibicin y muerte de los explantes (CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975). Es posible que esta especie suculenta, contenga qumicamente sustratos fenlicos similares a los detectados en las Asterceas, sin embargo, no se han hecho estudios al respecto.

Los menores valores de oxidacin promedio con respecto al ensayo anterior pueden estar relacionados con la inclusin de carbn activo en el medio de cultivo, lo que est corroborado por HARTMANN y KESTER (1998), quienes sealan que contrarresta el efecto de ciertas sustancias inhibitorias liberadas por algunos tejidos (en este caso de los compuestos fenlicos) o la adsorcin de pigmentos txicos, marrones y negros (compuestos de tipo fenlico y melanina), y de otros compuestos txicos incoloros (PIERIK,1990). Al igual que para las especies de la familia Astercea es la variable ms importante para el xito de la propagacin in vitro de esta especie, ya que se puede controlar solamente con la inclusin de carbn activo al medio de cultivo

CHISTIANSON y WARNICK (1983) sealan que cuando la proporcin de citoquininas es mayor que la de auxinas, se induce el inicio de yemas de brote. Si se considera que esta relacin existe en los tratamientos, entonces es posible inferir que el problema sea la eleccin del tipo de medio, slido o lquido. Tal es el caso del cultivo de Cattleya por REINERT y MOHR (1967) en medio slido RM (REINERT y MOHR, 1967), en donde las secciones de tejido meristemtico, provenientes de yemas laterales como explantes, se tornan de color caf negruzco durante las primeras tres semanas de desarrollo y posteriormente mueren. Sin embargo, en un medio RM lquido, el crecimiento y desarrollo de los explantes es satisfactorio,

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debido a que en un medio lquido los fenoles se encuentran diluidos, en cambio, en un medio slido los fenoles siempre estn en contacto con los explantes.

Tambin es importante mencionar que la concentracin de agar en el medio de cultivo MS (7,5 g/l) es mucho ms alto que aquel usado en el ensayo 7(6 g/l), lo que puede influir en la retencin de los nutrientes en el medio, reduciendo su absorcin. Esto lo confirman HARTMANN y KESTER (1998) al considerar que concentraciones de agar superiores en 1,0 a 1,2 g/l a la adecuada, tienden a reducir el crecimiento. Adems, cuanto mayor es la concentracin de agar, la fuerza con que el agua es retenida tambin es mayor, lo que reduce el potencial osmtico (PIERIK, 1990).

En los explantes de ambos medios, no hay organognesis ni formacin de tejido de callo, lo que puede deberse al igual que en las Asterceas, a la seleccin inadecuada del medio de cultivo, considerado junto con la seleccin del explante adecuado, dos de los factores ms importantes en el xito de la propagacin in vitro (MURASHIGE, 1977), pero sin dejar de considerar tambin la edad, el estatus de agua y nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE GROOT, 1985). El carbn activo puede haber provocado un efecto inhibidor sobre el crecimiento, al adsorber reguladores de crecimiento (auxinas y citoquininas) del medio (MARGARA, 1988; PIERIK, 1990).

Se analizan a continuacin los resultados obtenidos de los registros de la variable color, expresados en valores promedio mustrales, en tres perodos de cultivo (Cuadro 47).

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CUADRO 47. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de yemas en Ochagavia elegans a los 30, 60 y 90 das de cultivo in vitro, segn el medio de cultivo. MEDICIN Da 30** Da 60 Da 90 TRATAMIENTO T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 T1: Medio 1 T2: Medio 2 MEDIA MUESTRAL 3 a* 3 a 3 a 3 a 4 3 a b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, segn Test de Mann-Whitney (P0.05). **: Das contados desde que se realiz el cultivo.

A diferencia del ensayo 7, existen diferencias (P0.05) entre los medios de establecimiento con yemas como explantes, solo a los 90 das de cultivo, presentado el medio uno mayormente el color caf rojizo (4/4 7.5 YR) y, el medio dos el color caf claro (6/6 2.5 Y). De esto se desprende que el medio dos podra ser mejor al presentar un color ms cercano al color propio de la especie (8/4 5 Y), al representar un menor pardeamiento de los explantes, sin embargo, los resultados de oxidacin (Cuadro 46) no lo confirman.

4.8.3. Explantes de tallo

A partir del trozo apical del tallo, se obtienen dos explantes, para probar uno en cada medio de establecimiento. La sobrevivencia de estos explantes es del 100%, luego de 60 das de cultivo, sin embargo presentan una alta oxidacin producto de la desinfeccin con hipoclorito de sodio (0,5% por 10 minutos), sealado anteriormente como oxidante de los tejidos. De esto, se desprende que a pesar de utilizar para la desinfeccin una baja concentracin de hipoclorito de sodio, un corto

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perodo de tiempo de desinfeccin, enjuagues con agua destilada ms antioxidantes (cido ctrico y ascrbico), condiciones de desarrollo en oscuridad durante la primera semana y temperaturas de la cmara de crecimiento de 232C, es alta la sensibilidad del tejido a la oxidacin. Sin embargo, fue efectiva, favoreciendo en ambos medios el desarrollo de las yemas. Uno de los explantes (T1) presenta dos yemas, una de casi 2 mm. y otra de casi 3 mm.de largo; en tanto, el otro explante (T2) presenta una yema de casi 3 mm de largo, despus de 60 das de cultivo (Figura 3).

El color de la especie en los explantes (equivalente en la tabla Munsell a 8/6 2.5 GY), en ambos medios, se pierde a los 60 das de cultivo, tornndose de color caf rojizo (equivalente a 4/4 7.5 YR), lo que demuestra tambin que hay efecto de pardeamiento de compuestos fenlicos presentes en el explante y que son liberados al realizar el corte. Esto confirma lo expuesto por MARKS y SIMPSON (1989), quienes describen la oxidacin de compuestos fenlicos liberados por un rompimiento celular debido a lesiones, como una de las principales causas de prdida al inicio de establecimiento del cultivo, por inhibicin y muerte de los explantes (CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975).

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T1

T2

FIGURA 3. Explantes de tallo Ochagavia elegans R. A. Phill., con yemas axilares en crecimiento. T1: medio uno, con 1 yema; T2: medio dos, con 2 yemas.

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Ensayo 9: Germinacin de semillas de Ochagavia elegans R. A. Phill.

Otra alternativa al uso de secciones de hojas, yemas laterales con trozos de tallo y secciones de tallo como explante, son las semillas.

Las semillas fueron recolectadas en primavera (fines de octubre del ao 2002) dentro de los restos florales (en el ovario) por Oscar Fernndez, encargado del vivero del Jardn Botnico, en el sector Islas Ocenicas, del Jardn Botnico de Via del Mar.

De una flor se extrajeron ms de 100 semillas, de las cuales fueron sembradas en abril del 2003 aproximadamente el 50%, en un medio de germinacin MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962) utilizado para ctricos. Debido a que las semillas se encontraban protegidas y encerradas dentro del ovario de la flor (que forma como fruto una baya indehiscente), no fue necesario desinfectar con una solucin fungicida, pero s con hipoclorito de sodio al 1% durante 10 minutos. Como se esperaba, no se presentaron agentes de contaminacin sobre las semillas sembradas. Sin embargo, no se ha observado la germinacin de ellas desde que se realiz la siembra al cabo de tres meses.

BALDINI (1992) describe varios tratamientos para favorecer la germinacin de las semillas, indicando entre estos la aplicacin de giberelinas a las semillas quiescentes para modificar su estatus hormonal y permitir su pronta germinacin; la inmersin en agua caliente por 12 horas, para el ablandamiento de las cubiertas y eliminar los inhibidores y, la escarificacin mecnica o qumica.

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Se decide escarificar mecnicamente (pelado manual) 10 semillas in vitro en la cmara de flujo, mediante una lupa electrnica. En este proceso y en la mayora de las semillas, se encuentra el endosperma envolviendo a un pequeo tejido que parece ser el embrin y que se prolonga en uno de los extremos, Sin embargo, tambin se detectan algunas semillas vanas o atrofiadas, causado por un aborto seminal, considerado por BALDINI (1992) como la formacin de semillas sin embrin y formadas solamente por el involucro. Este fenmeno puede ser causado por dos razones, esterilidad gentica o una insuficiente llegada de matabolitos a la semilla. La razn ms probable sera la segunda, debido a la distinta condicin del clima existente en Via del Mar (Jardn Botnico), donde no existe una fuerte influencia marina, la condicin de humedad y precipitacin necesaria para su desarrollo con respecto al de su hbitat de crecimiento en el archipilago (CONAF, 2002; BARRERA, 1997), descrito anteriormente por JOHOW (1896).

Luego de 20 das de cultivo, en una de las semillas se detecta una reaccin del embrin sobre el medio de cultivo, formando en el extremo del tejido, pequeas prolongaciones laterales.

Posiblemente el medio slido no es el ms adecuado para el cultivo de estas semillas, por lo sealado por HARTMANN y KESTER (1998) al indicar que las semillas de Bromeliceas se han cultivado en la forma descrita para orqudeas, pero siendo cambiados cada siete das hasta la germinacin.

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Ensayo 10: Germinacin de semillas de Plantago fernandezia (Dcne) Bert.

La fecha de recoleccin de frutos se realiz en pleno invierno (principios de Agosto del ao 2002). De un fruto se extrajeron un total de 115 semillas, las cuales fueron sembradas en un medio de germinacin MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962) utilizado para ctricos.

Del total de semillas sembradas, germinaron slo 22 de ellas, al cabo de 15 das de realizada la siembra. Sin embargo, no se pudo continuar con el ensayo por presentar una alta tasa de contaminacin por hongos (100%), lo que pudo deberse a una ineficiente desinfeccin en tiempo (10 minutos) o dosis de hipoclorito de sodio (1%). Podra haberse usado previo a la desinfeccin, una solucin fungicida, por tratarse de un material proveniente de un sitio con alta probabilidad de infestacin por inculos, y porque las semillas se encuentran adheridas peltadamente al fruto, una cpsula circuncisa y dehiscente (pixidio) (NAVAS, 1979)., mucho ms expuestas que las semillas de Ochagavia elegans, del ensayo anterior. Sin embargo, fue posible desinfectar algunas plntulas de las semillas germinadas in vitro, con una solucin de Captan ms Benlate (1,25%) y plantarlas ex vitro (bajo invernadero del Laboratorio de Propagacin) en vasos contenedores plsticos, con una mezcla de sustrato de arena, perlita y tierra de hoja (1:1:1), desinfectado con la misma solucin fungicida (Figura 4).

Es importante sealar que la desinfeccin fue realizada en base a los buenos resultados obtenidos sobre semillas de ctricos y de Passiflora pinnatistipula Cav, logrando ESTAY (2002), 100% de germinacin y sin contaminacin.

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FIGURA 4. Planta de Plantago fernandezia (Dcne) Bert., de un ao de edad, obtenido de semillas recolectadas del vivero del Jardn Botnico de Via del Mar, Agosto de 2002.

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Se hizo el intento de probar con semillas recolectadas tardamente (septiembre del ao 2002), pero realizando la siembra de 51 semillas en marzo del ao 2003. Sin embargo y a pesar de la contaminacin del 80% de ellas, las que sobrevivieron no estaban viables, aparentemente, por el tiempo transcurrido desde la recoleccin y porque no hubo germinacin alguna. Esto es corroborado por HARTMANN y KESTER (1987), quienes definen viabilidad de las semillas como el porcentaje de germinacin, el cual indica el nmero de plantas producidas por un nmero dado de semillas.

Lo anterior demuestra lo importante que es la etapa de desinfeccin del explante para lograr propagarlo libre de patgenos, la que enfatizan y previenen HARTMANN y KESTER (1998), sobre todo si se trabaja con material proveniente de lugares donde no se hacen desinfecciones continuas, y no se utilizan como explantes tejidos bien protegidos (meristemas) o pices de tallo cubiertos por las escamas foliares (MARGARA, 1988), como es en este caso, en que el material (fruto) provena del Jardn Botnico de Via del Mar, por ende ms susceptible a la penetracin de patgenos en tejidos. A diferencia del ensayo con semillas de Ochagavia elegans, las semillas de Plantago se encontraban en los frutos abiertos expuestas al ambiente, siendo necesaria la aplicacin de un fungicida.

Posteriormente, se intenta recolectar semillas en una fecha ms temprana (junio 2003), pero lamentablemente las semillas no se formaron, quizs debido a que la condicin climtica que hubo en el perodo de la polinizacin no fue el adecuado o quizs hubo polinizacin, pero no fecundacin. HARTMANN y KESTER (1987) sealan que deben ocurrir dos procesos para que una semilla sea viable: polinizacin y fecundacin.

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La viabilidad se puede determinar por varias pruebas, pero las ms utilizadas son la germinacin directa, de embrin separado y la de tetrazolio. En la prueba de germinacin directa, el porcentaje de germinacin se determina por la cantidad de plntulas normales producidas por las semillas.

No fue posible cumplir con la construccin de la curva de germinacin de las semillas, ni poder obtener una planta libre de hongos o virus. Sin embargo, este medio de cultivo es factible para lograr la germinacin de algunas semillas (19%) y pasar a la etapa siguiente de establecimiento in vitro.

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5. CONCLUSIONES

No fue factible implementar una metodologa de propagacin in vitro para la fase de establecimiento de las especies Dendroseris litoralis Skottsb., Dendroseris neriifolia (Dcne.) Hook et Arn., Robinsonia gayana Dcne. y Robinsonia thurifera Dcne., endmicas de la Isla Robinson Crusoe, para propagar una cantidad de plantas que permitan concretar las etapas de proliferacin, enraizamiento y aclimatacin.

La fase de establecimiento de Dendroseris litoralis Skottsb., Dendroseris neriifolia (Dcne.) Hook et Arn., Robinsonia gayana Dcne. y Robinsonia thurifera Dcne., no puede lograrse a travs de secciones de hojas, sin embargo, las yemas apicales de posicin axilar, como explantes, pueden ser una buena alternativa a desarrollar en Robinsonia thurifera.

Las especies Dendroseris litoralis Skottsb., Dendroseris neriifolia (Dcne.) Hook et Arn., Robinsonia gayana Dcne. y Robinsonia thurifera Dcne., sufren una alta oxidacin de los tejidos desde su obtencin como explante y durante el cultivo in vitro, que causa una inevitable necrosis.

Las desinfecciones de las especies del gnero Dendroseris y Robinsonia, no reducen ni eliminan la alta incidencia de bacterias endgenas, durante la etapa de establecimiento in vitro.

Es factible implementar una metodologa de propagacin in vitro para la fase de establecimiento en la especie Ochagavia elegans R.A. Phill., familia Bromeliaceae.

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No fue posible describir la capacidad germinativa de Plantago fernandezia (Dcne.) Bert., familia Plantaginaceae, bajo condiciones controladas de crecimiento, pero s es factible lograr la germinacin de las semillas de Plantago fernandezia (Dcne.) Bert. en el medio de germinacin MS cero, sin vitaminas y sin azcar.

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6. RESUMEN

En el Laboratorio de Propagacin Profesor Gregorio Rosenberg de la Facultad de Agronoma, Pontificia Universidad Catlica de Valparaso, se realizaron ensayos con el objetivo de desarrollar una metodologa de propagacin in vitro para las especies Dendroseris litoralis Skottsb., Dendroseris neriifolia (Dcne.) Hook et Arn., Robinsonia gayana Dcne., Robinsonia thurifera Dcne. y Ochagavia elegans R.A. Phill. y, un anlisis de germinacin de semillas de Plantago fernandezia (Dcne.) Bert., endmicas de la Isla Robinson Crusoe, Archipilago de Juan Fernndez, con problemas de conservacin. Primero se evaluaron cuatro protocolos de desinfeccin para Asterceas, dando mejores resultados la desinfeccin que utilizaba hipoclorito de sodio al 1,5% ms cido ctrico y cido ascrbico (500 ppm cada uno), para Dendroseris litoralis Skottsb. y Dendroseris neriifolia (Dcne.) Hook et Arn. y, la desinfeccin que utilizaba hipoclorito de sodio al 1,0% ms cido ctrico y cido ascrbico (500 ppm cada uno), para Robinsonia gayana y Robinsonia thurifera, ms Tween 20 durante 20 minutos. Para las etapas de establecimiento, se probaron tres medios de cultivo distintos, dando mejores resultados, en cuanto a menor oxidacin y mayor prolongacin de vida de los explantes, un WPM ms vitaminas de MS, 1 mg/l de ANA ms 3,5 mg/l de BAP, 30 g/l de sacarosa, 1g/l de PVPP, 7 g/l de agar, con pH 5,5. Luego, se evaluaron cuatro protocolos de desinfeccin para Ochagavia elegans R.A. Phill., obteniendo mejores resultados de sobrevivencia y oxidacin, la desinfeccin que contena hipoclorito de sodio (1,5%) ms cido ctrico y cido ascrbico (500 ppm cada uno), ms Tween 20 por 20 minutos. Se probaron dos medios de cultivo distintos para la etapa de establecimiento, con mejores resultados en cuanto a menor oxidacin y mayor desarrollo de los explantes, en yemas de secciones de tallos, sobre un MS ms vitaminas de MS, 0,2 mg/l de IBA ms 0,4 o 0.7 mg/l de BAP, 25 g/l de azcar, 0,3 g/l carbn activo, 7,5 g/l de agar, ajustado a pH 5,7. En la especie Plantago fernandezia (Dcne.) Bert., se probaron dos fechas de recoleccin de semillas, siendo mejor en el mes de Agosto, por encontrarse viables las semillas y lograr germinar el 19% de un total de 115 semillas, sobre un medio de germinacin para ctricos (MS cero). Sin embargo no es factible describir la capacidad germinativa de sus semillas. A pesar de todos los ensayos, no es factible implementar una metodologa de propagacin in vitro para todas las especies, conservando las caractersticas de la planta madre, y, por lo tanto, no es posible preservar la flora nativa y endmica de nuestro pas.

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