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Anexo: Compendio de preguntas de parciales anteriores (cursos 2000-2009):


Nota: la inclusión de las siguientes preguntas y, particularmente, las respuestas esperadas que sirvieron de guía
para la corrección de los parciales por parte de los docentes, no tienen otro propósito didáctico que el de orientar
a los estudiantes acerca de cómo son los parciales de la materia y de cómo se corrigen. Aquellas preguntas de
parciales que los docentes consideramos que aportaban a la mejor comprensión de algún capítulo de la materia,
fueron incluidas en la guía de problemas y no se repiten aquí. Algunas de las preguntas de parciales integran
más de un capítulo de las clases de problemas. Las preguntas de los parciales de la presente cursada tendrán el
mismo espíritu pero serán diferentes en sus enunciados. El orden de los temas no es el mismo que en la guía.
Regulación e Ingeniería Genética pP3Rv (construcción con Rv) [barras negras]
1) Los operones mce de Mycobacterium tuberculosis a) ¿Qué tipo de efecto tiene la presencia del gen Rv
(bacteria que produce la tuberculo-
sis) codifica para proteínas poten-
cialmente involucradas en la viru-
β-gal
lencia de este patógeno. En el ge- 500 pP3Rv 200 100
noma de M. tuberculosis hay 4 ope- Rv
rones mce similares en secuencia y Promotor mce
organización, que codifican para
proteínas secretadas o de membrana
pP3 β-gal
y una proteína de tipo invasina. Es-
tos genes son exclusivos de las mi-
cobacterias y no se encuentran en
pJEM15 β-gal
otras bacterias mejor caracterizadas
como Escherichia coli. Santángelo
y col (del INTA Castelar) publica-
A
ron en Microbiology (2002,
148:2997–3006) un trabajo en el
que estudian la regulación de este B
operón en base a la información
genómica disponible. Por un lado
C
conocían las secuencias estructura- sobre la regulación del gen quimérico?
les de los genes mce pero no tenían bien caracterizado b) Si la construcción que interesa analizar es pP3Rv
su promotor. Por otro lado, les llamó la atención un ¿para qué se hicieron los experimentos con pP3 y con
gen (llamado Rv) ubicado hacia 5’ de uno de los ope- pJEM15?
rones dado que codificaba para una proteína cuya es- c) ¿Por qué se reemplazó la secuencia codificante de
tructura predicha por los modelos bioinformáticos era mce por la de la β-gal?
similar a la de algunos factores de transcripción. Para Para investigar la localización del sitio de unión de la
estudiar la función de este gen realizaron las siguien- proteína codificada por Rv hicieron gel-shifting en los
tes construcciones quiméricas: que se diferencian electroforéticamente los DNAs
pP3Rv contiene el gen Rv completo (incluyendo el “sueltos” de los que tienen “pegados” una proteína
promotor de Rv), la región intergénica completa hasta porque ésta les re-
el codón de iniciación del primer gen mce (es decir, A B C trasa su migración
donde debería ubicarse el promotor de mce). La se- 1 2 3 1 2 3 1 2 3 - en el gel. Los
cuencia codificante para mce fue reemplazada por el DNAs se detectan
gen lac por hibridación con
pP3 es igual, pero sin Rv una sonda del
pJEM15 es el vector vacío (salvo por el gen lac) segmento
A, B y C representan segmentos de la región inter- génico. Se
génica (1-100, 1-200 y 200-500 pb hacia 5’ del ATG, ron los siguientes
respectivamente) productos de PCR:
Lo primero que hicieron fue estudiar el efecto de in- A) nucleótidos 1-
troducir las construcciones quiméricas en E. coli obte- 100 B) 1-200,
niendo los siguientes resultados: + C) 200-500 con 1)
Efecto del gen Rv sobre el promotor mce: búfer 2) ex tractos de bacterias transformadas de
Micobacterias transformadas con E.coli conteniendo la construcción pP3Rv; 3) extrac-
pJEM15 (vector sin insertos) [barras blancas] tos de bacterias de E. coli conteniendo la construc-
pP3 (construcción sin Rv) [barras grises] ción pP3
d) ¿Dónde se localiza el sitio de unión de la proteína?
7 kb 3 kb 12 kb 2
e) ¿Por qué se utilizaron extractos de E. coli
(transformadas con las construcciones) y no de
micobacterias? E1 E2 E3 E4
promotor 21 pb 370 pb pb 130 pb
de actina 80
de tomate

vector
vera, c) tomate transgénico; hibridando con una sonda
de cDNA de longitud completa.
2) ¿Por qué habrá elegido tomate y no tabaco, por
ejemplo?
3) Analizando la expresión de los mRNAs de aloeve-
rina en distintos tejidos del tomate transgénico por la
técnica de Northern, usando como sonda al cDNA de
aloeverina de longitud completa, se observó lo si-
guiente:
Respuestas esperadas a) Activador a) ¿Cuáles son los tamaños del mRNA I y mRNA II?
b) La comparación entre la actividad de p3 y b) En el primer esquema ubique (con flechas) la pro-
p3Rv es lo que permite determinar que Rv es un bable ubicación del codón de iniciación y la del de
elemento activador (o represor si lo hubiese sido). terminación.
pJEM15 es un control negativo.
c) Porque es fácil de detectar enzimáticamente y los RNA de RNA de tomate transgénico
resultados no son afectados por la expresión de los Aloe vera: hoja raíz hoja raíz fruto flor
genes mce endógenos (cromosómicos) de las mico- _
bacterias tranformadas. mRNA I
d) 100-200
e) Porque necesito extraer de una célula que exprese
mRNA II
la proteína Rv, porque si no, nunca podría estudiar
su efecto.
2) El Dr. Cureta, en su eterna búsqueda de la pócima
de la juventud eterna, estudió la estructura y expre-
+
sión del gen de la aloeverina que produce una proteína c) ¿Por qué el Dr. Cureta reemplazó en su experimen-
de maravillosas propiedades curativas y rejuvenecedo- to el promotor de la aloeverina por el de la actina de
ras en Aloe vera (planta no comestible). Este gen da tomate? ¿Le parece que eligió el promotor más ade-
origen a dos proteínas diferentes en las hojas y las raí- cuado para sus propósitos? ¿Por qué?
ces de la planta por splicing alternativo. Sin embargo, d) ¿Qué conclusiones saca a partir de los resultados
la única que tiene propiedades especiales es la de la del Northern en cuanto a la especificidad tisular del
hoja que se produce en cantidades muy pequeñas. splicing del RNA del gen de la aloeverina?
Además, su purificación es ineficiente, con el agra- e) ¿Qué sugerencias experimentales le haría al Dr.
vante de que sus propiedades se ven afectadas por las Cureta para mejorar la performance de sus experimen-
fenoloxidasas que se liberan de los lisosomas cuando tos y así obtener los resultados deseados?
estas organelas se rompen en el proceso de homogeni- Respuestas 1) tomate, no da nada. Aloe vera: 3 ban-
zación. Esta es la estructura del gen de la aloeverina: das de 7, 3 y 12 kpb. Tomate transgénico: ídem. 2)
Porque el tabaco tampoco es comestible. El toma-
7 kb 3 kb 12 kb
te, sí. Respuesta alternativa: Si la idea es la de
mejorar la productividad, el tabaco (por su alta
E1 E2 E3 E4 producción de biomasa) podría haber sido una
promotor
210 pb 370 pb 8 0 pb 1 30 pb alternativa interesante. 3) a) 790 y 710, b) ATG:
Una flecha un poco a la derecha del extremo del
Las flechas indican sitios para la enzima HindIII. Los
exón 1 (no en el extremo porque siempre hay un ex-
dos mRNAs difieren porque en uno está presente y en
tremo 5´ de mRNA no codificante) o al principio del
el otro está ausente el exón E3 de 80 pb. El Dr. Cureta
exón 2. Stop: una flecha un poco a la izquierda del
decidió obtener tomates transgénicos transfectando
extremo derecho del exón 4 (siempre hay un segmento
con un plásmido recombinante con el gen clonado de
3´ no codificante a 3´ del codón de terminación), c) El
la aloeverina en el que había reemplazado al promotor
promotor nativo es poco eficiente y lo reemplaza por
nativo de la aloeverina por el de la actina de tomate,
uno constitutivo fuerte, pero podría haber elegido me-
con el fin de analizar la expresión de mRNAs de aloe-
jor el promotor: por ej. uno específico de fruto de to-
verina en los distintos tejidos:
mate, que es el tejido de interés para alimentación. d)
1) Sabiendo que los tomates no tienen ningún gen
Aparentemente, el sistema que permite reconocer al
endógeno homólogo al de la aloeverina, dibuje el
exón 3 como tal, es específico de hoja y de especie y,
patrón de bandas de hibridación que esperaría obtener
tal vez, de gen (pero eso no lo podemos determinar
en un Southern de DNAs genómicos digeridos con
con estos datos). e) Usar una construcción SIN intro-
HindIII provenientes de: a) tomate normal, b) Aloe
nes para evitar el procesamiento incorrecto.
3
3) Para el operón lactosa de Escherichia coli, indique vez identificado el clon se subclona y secuencia el
el genotipo de al menos uno de los diploides parciales inserto para ver si hay ORFs candidatos, los cuales
posibles capaces de producir beta-galactosidasa (codi- son testados funcionalmente de la misma manera.
ficada por el gen Z) constitutivamente y permeasa
4) La Dra. Romántica está intentando encontrar genes
(codificada por el gen Y) en forma normal (es decir
que aceleren la floración. Con este objetivo en mente
inducible con análogos de la lactosa) usando la no-
procede a transformar plantas de Arabidopsis thaliana
menclatura practicada en las clases de problemas.
mediante la utilización de Agrobacterium, con la si-
Respuesta: lacI+ lacOc lacZ+ lacY- / lacI+ lacO+
guiente construcción:
lacZ- lacY+ (en alguno de los 2 genotipos lacI puede
ser lacI-)
3) En la película Blade II, el héroe (Blade) es un “se-
mi”vampiro que lucha a favor de la humanidad con
los vampiros “malos” que quieren dominar el mundo. LB y RB: bordes izquierdo y derecho del T-DNA,
En una escena trascendental de la película, Blade es 35S: enhancer fuerte y constitutivo, nptII: gen de re-
capturado para poder extraer su sangre (y su ADN) sistencia a kanamicina Pnos: promotor constitutivo, t-
porque los vampiros estaban diseñando nuevas varian- nos: terminador
tes transgénicas clonadas con mejor adaptación. Si
Entre las miles de plantas generadas encuentra una
bien ya habían logrado obtener vampiros resistentes a
mutante
la plata modificando el gen de la metalotionina, quer-
ían extraer de Blade un gen de resistencia a la luz so- (M) que florece en la mitad de tiempo que las plantas
lar. Ud. ha sido contratado por los vampiros para salvajes (wild type = wt). A partir de una hoja de esta
hacer este trabajo (le han prometido vida eterna como planta extrae DNA, lo digiere con BamHI, lo corre en
forma de pago) y dispone de un laboratorio de inge- un gel de agarosa, transfiere a una membrana y lo re-
niería genética excelentemente equipado que le permi- vela con una sonda radiactiva correspondiente al T-
te, entre otras cosas, cultivar in vitro vampiroblastos DNA completo. Cuando cruzó esta planta con una
(células equivalentes a los fibroblastos humanos). Los planta salvaje, dentro de la descendencia, algunas
vampiroblastos extraídos de vampiros comunes se plantas presentaron floración temprana y otras no. Al
lisan en presencia de luz solar, mientras que las célu- repetir el Southern blot con 10 plantas de la F1 se ob-
las extraídas del cuerpo de Blade son luminoresisten- tuvieron los siguientes resultados:
tes. No se dispone de información alguna sobre la se-
cuencia del gen a clonar, ni anticuerpos, ni secuencias
parciales de aminoácidos de la proteína. Tampoco se
pueden planear cruzamientos genéticos de Blade con
vampiresas para estudiar su progenie porque llevaría
mucho tiempo. Inspirándose en el ejemplo histórico
del clonado molecular de los primeros oncogenes
¿qué estrategia de clonado y caracterización funcional
del gen de resistencia a luz solar propondría?
Respuesta: En caso de seguir los pasos históricos a) ¿Para qué se incluyó el gen quimérico npt II en la
descriptos en el Recombinant DNA de Watson y col.: construcción?
se extrae ADN total de Blade (sólo o con una “etique- b) ¿Cuál fue el objetivo de introducir un enhancer
ta” –tag- de secuencia nucleotídica conocida ligada) y “suelto” no acompañado de un promotor o de una se-
se lo usa para transfectar vampiroplastos por la técnica cuencia estructural?
de coprecipitación con fosfato de calcio. Después se c) ¿Cree que el hecho de que se observen dos bandas
exponen los vampiroblastos a la luz y se extrae ADN en el mutante parental se deba a que BamHI corte de-
total de las células transgénicas resistentes y se fabrica ntro del T-DNA o a qué se insertaron dos T-DNAs (en
una genoteca en fago lambda. Se releva (“screenea”) lugar de uno) en más de un lugar en el genoma? Ana-
la genoteca con ADN repetitivo de Blade (el equiva- lice teniendo en cuenta los resultados obtenidos con la
lente a secuencias Alu) o con la sonda para el tag para F1.
identificar el ADN procedente de Blade. Se confirma d) ¿Qué plantas de la F1 seguiría analizando? Justifi-
la identidad del clon de lambda por transfección de que. El hecho de conocer la secuencia de la construc-
vampiroblastos que se convierten en luminoresisten- ción utilizada le permitió a la Dra. Romántica median-
tes. te PCR, secuenciación y finalmente comparación con
Con técnicas más modernas se aislaría el ADN de la base de datos del genoma de Arabidopsis, identifi-
Blade y se lo clonaría en BACs (se puede aceptar que car el sitio exacto de inserción del T-DNA. Este sitio
sea en otros vectores como cósmidos o en fagos de inserción se encuentra 1 kpb río arriba (5’) de un
lambda). Con mezclas (“pooles”) de clones recombi- marco de lectura abierto aún no estudiado (ORF4329).
nantes se transfectan vampiroblastos para identificar e) ¿Qué efecto cree que tiene la inserción del T-DNA
células luminoresistentes (por electroporación o usan- sobre el ORF4329? ¿Qué experimento haría para
do liposomas). A las mezclas que producen clones comprobarlo? Muestre mediante un diagrama los re-
positivos se las separa en clones individuales hasta sultados esperados.
identificar el clon conteniendo el gen de interés. Una
4
f) ¿Cree que el ORF4329 es un gen inductor o repre- combinación homóloga y sí saben que para hacer un
sor de la floración? Diseñe un experimento comple- knock out dirigido se requiere recombinación homó-
mentario al realizado por la Dra. Romántica que, me- loga.
diante ingeniería genética, le permita comprobar su h) Haría un Southern usando como sonda al
hipótesis, indicando los resultados esperados. Recuer- ORF4329 y condiciones de baja rigurosidad en la
de que en la transformación mediante Agrobacterium hibridación. Para clonarlo haría una genoteca y locali-
el T-DNA no se integra mediante recombinación zaría el gen homólogo mediante hibridación con la
homóloga (en biobalística tampoco). sonda de Arabidopsis.
g) Como Arabidopsis es un yuyo y sus flores son bas- 5) Los ritmos circadianos que corresponden a ciclos
tante feas, un estudiante de doctorado de la Dra. de aproximadamente 24 horas permiten a los orga-
Romántica está interesado en ver si los rosales tam- nismos regular su actividad con la alternancia día-
bién tienen un gen homólogo al ORF4329. ¿Cómo lo noche. Aunque estos ritmos son autónomos, algunos
haría experimentalmente sabiendo que el genoma del estímulos externos, tales como la luz, pueden “poner
rosal no está secuenciado? En caso de que haya un en hora” este reloj interno. En mamíferos, existe un
gen homologo al ORF4329 presente, ¿cómo clonaría marcapasos central, ubicado en el núcleo supra-
el gen homólogo completo? quiasmático (NSQ) del hipotálamo anterior. Varios
Respuestas esperadas genes están involucrados en el mecanismo molecular
a) Como gen marcador selectivo que permite selec- del reloj interno, existiendo entre ellos lazos de retroa-
cionar las plantas transgénicas de las no transgénicas limentación positiva y negativa a nivel de la expresión
durante la regeneración de plantas en un medio conte- y de la actividad de las proteínas que codifican. Se
niendo el antibiótico kanamicina sabe que la fase de este marcapasos central se puede
b) Porque el objeto del experimento es que este en- adelantar con un estímulo lumínico durante la “noche”
hancer estimule constitutiva y fuertemente los promo- relativa que es captado en la retina y llevado al NSQ a
tores cercanos al sitio de inserción del segmento T con través del tracto retino-hipotalámico (que libera el
la esperanza de que alguno de ellos estimule la flora- neurotransmisor glutamato) y que este cambio de fase
ción temprana. está asociado a un aumento rápido de la expresión del
c) No puede haber ocurrido que haya sólo un sitio de gen Per1. Río arriba (hacia 5’) de este gen se encuen-
inserción y que BamHI corte dentro del DNA-T pues tra una secuencia cre (elemento de respuesta a
en la F1 las dos bandas segregan independientemente. cAMP), a la cual se puede unir en ciertas condiciones
Seguramente el DNA-T se insertó en dos sitios distin- el factor de transcripción CREB. Se realiza el siguien-
tos. te experimento: a un cultivo sincronizado de células
d) Seguiría analizando alguna de las siguientes plan- del NSQ de ratón se lo estimula durante la noche rela-
tas: 1, 6 o 9 ya que presentan floración temprana, pero tiva con concentraciones adecuadas de glutamato
no heredaron el inserto del T-DNA no relacionado con (provoca el mismo efecto que la luz provoca in vivo) o
la inducción temprana de la floración. El descartar las db-cAMP (dibutiril cAMP: análogo del cAMP que
plantas 4, 7 y 10 facilita los pasos siguientes de identi- puede atravesar la membrana celular) o con solución
ficación del sitio de inserción. salina (control). Después de 30 minutos se extraen
e) Dado que el T-DNA no interrumpe un gen ni el RNA y proteínas.
promotor mínimo, pero sí se ubica cercano al promo- Northern Blot con sonda para Per1:
tor, la inserción del DNA-T estaría aumentando la
Control Glut db-cAMP
transcripción del ORF4329 mediante los enhancers
35S. Para comprobar esta hipótesis habría que realizar
un Northern partiendo de mensajeros de plantas nor-
males y mutantes (sería interesante comparar también
tejidos florales y no florales ya que el enhancer 35S es Relación entre CREB fosforilado (P) y no fosforilado
constitutivo) utilizando una sonda complementaria al
ORF4329. Relación Control Glut. db-cAMP
f) Es un inductor de la floración pues al aumentar su CREB-P/CREB 0,3 4,2 2,2
expresión se adelanta la floración. Para comprobarlo
se podría hacer un antisense del ORF4329 y espero Esta relación se determinó realizando Western Blot
ver un retraso o ausencia de floración. Si repito el con anticuerpos anti-CREB y anti-CREB-P.
Northern vería menos mensajero que en el normal. Para poder confirmar el rol de CREB se construyó el
g) Otra respuesta alternativa que pueden pensar los siguiente sistema indicador (reportero) y se transfectó
alumnos sería realizar un knock out de ese ORF. En en células del NSQ en cultivo.
realidad teóricamente no sería correcto pues en plan- Prom: promotor del gen Per1.
tas no suelen realizarse knock outs, pero ellos proba-
blemente no lo sepan (conceptualmente no importa, Prom Sec estr.gen luc
cre
técnicamente, lo knock outs en la actualidad, salvo en
bacterias, se hacen por interferencia transformando
transitoriamente con RNAi o establemente con cons- La luciferasa (codificada por la secuencia estructural
trucciones que expresen iRNA). Además está la acla- del luc) es una enzima que reacciona con el agregado
ración de que la integración del T-DNA no es por re- de luciferina produciendo luminiscencia. Se ensaya la
5
actividad de estas células en las siguientes condicio-
nes:
+ inhibidor de AC - (baja expresión)
- glutamato - sin inhibidor - (baja expr.)
+ inhibidor de AC + (expr. media)
+ glutamato - sin inhibidor +++ (alta expr.)
AC (adenilato ciclasa): enzima que sintetiza cAMP a
partir de ATP, responsable del aumento de cAMP du- b. ¿Cómo se evaluó la relevancia relativa de cada una
rante la transducción de señales de diversos estímulos. de las regiones del promotor? (indique el gen reporte-
Interpretar estos resultados. ro y la obtención de los individuos utilizados para rea-
Se sospecha que el glutamato ejerce su acción vía lizar esta medición). ¿Qué cree usted que representa
cAMP pero que esta podría no ser la única vía en que en el esquema la región pintada de negro? ¿Qué in-
lo hace. ¿Qué opina acerca del rol de CREB en los dos formación brindan, con respecto a la estructura del
tipos de estímulo? Justificar. promotor, los resultados que se presentan en el es-
Respuestas a) Esta respuesta implica un mínimo de quema?
detalle de descripción de para qué se hicieron los 3 c. Finalmente, los investigadores se preguntaban cómo
experimentos y qué datos aporta cada uno. Conclusio- validar sus resultados, tanto con respecto a la función
nes: tanto glutamato como cAMP inducen la expre- del gen (efecto sobre el comportamiento) como a su
sión de Per1. La inducción por glutamato es más fuer- regulación. Elija una de estas dos opciones, y detalle
te que por cAMP. Además, el glutamato es capaz de al menos una metodología para poner a prueba su
activar el promotor de CREB aún en presencia de in- hipótesis.
hibidores de la AC. Rta a. Marcadores, genoteca dif, o arrays (por cual-
b) La contestación a esta pregunta puede tener algunas quiera que lo encaren esta bien, mientras que este bien
variantes de respuesta y se evaluará en función de la explicado)
coherencia del razonamiento que se emplee. La res- b. Deben mencionar un gen reportero (idealmente lu-
puesta esperada es que puede deberse a que el gluta- ciferasa, proque ese es el que vieron para insectos) y
mato activa la misma vía de señal del cAMP y además deben explicar brevemente como transfectar insec-
otra (u otras) o a que activan vías totalmente separa- tos con estas construcciones. luego los deben exponer
das que terminan en el mismo efecto (siendo la de glu- al olor para medir actividad. Parte pintada de negro:
tamato una vía más fuerte). En cuanto a CREB, se ve prom. minimo, siemrpe debe estar. regulacion: deben
que la fosforilación de CREB se corresponde con una decir qué regiones de importancia se detactan en cada
alta expresión, por lo que podría pensarse que CREB parte (2 reg positivas, 1a en la primera, 1a en la terce-
está implicado en la activación de Per1. El menor ra)
efecto de cAMP también se ve en este caso, lo que c. Función del gen: knockout, transposon-tagging,
lleva a pensar en principio que la menor expresión antisense. Funcion de las regiones regulatorias: apun-
vista con cAMP se debería a una menor activación de tamos a que se acuerden del ejemplo de footprinting
CREB y no a que falte activarse otro factor de trans- de la guia.
cripción además de CREB que sí se active con gluta- 7) Un grupo de criadores de caballos de Tennessee
mato. están interesados en el fenotipo champagne del pelaje
6) Ciertos individuos de la abeja Apis mellifera pre- de sus animales, que es controlado por un gen au-
sentan un comportamiento particular en cuanto a la tosómico dominante CH, pero resulta muy difícil dis-
limpieza de las celdas que contienen a las larvas para- tinguirlo del efecto producido por dilución de otros
sitadas por el ácaro Varroa destructor (llamado com- genes relacionados con la síntesis de melanina. Re-
portamiento higiénico). Este comportamiento se debe suelto a revelar las bases moleculares de este fenotipo
a la capacidad de las abejas de percibir un compuesto acude al Departamento de Genética de la Universidad
químico volátil producido por el ácaro. Con el fin de de Tennessee donde le proveen los siguientes datos de
establecer si dicho comportamiento tiene una base cruzamientos prueba en los cuales estaba involucrado
genética, se llevaron a cabo una serie de estudios y uno de los genes candidatos (llamado P de pigmento)
experimentos que permitieron identificar algunos ge- y obtiene la siguiente segregación genotípica:
nes candidatos (es decir, genes responsables del com- CHch Pp = 40 % CHch pp = 10 %
portamiento higiénico). chch pp = 40 % chch Pp = 10 %
a. ¿Qué metodología/s puede/n haber sido empleada/s a) ¿A qué distancia genética se encuentran CH y P?
para la detección de estos genes candidatos? b) Dada la implicancia del gen P en la pigmentación,
A continuación, los investigadores se interesaron por ¿qué técnica utilizaría Ud. para verificar la expresión
la regulación de uno de los genes de interés, y enten- de dicho gen si conociera al menos un par de primers
der así la relación entre la expresión de los mismos y que amplifiquen alguno de sus exones? Puntualice de
la presencia de los volátiles emitidos por el ácaro, se qué tejido partiría, qué aislaría y qué técnica emplear-
realizaron las siguientes construcciones: ía ¿Qué control positivo realizaría?
(en blanco se indica la región del promotor que ha Para dilucidar las bases moleculares implicadas en el
sido delecionada). mecanismo de pigmentación y dado que el gen P es un
miembro de la familia de proteínas transportadoras
6
que cumplen un rol importante en el desarrollo del le unen factores de transcripción y regulatorios y al
color del pelaje en mamíferos, Ud. decide investigar la correr los complejos en un gel nativo y revelar por
regulación de la expresión de esta proteína. Según la autoradiografía, la marca de 32P aparece retrasada en
bibliografía esta proteína había sido referida previa- la calle con extracto porque pesa más por tener los
mente como proton/amino acid transporter en huma- factores unidos. Estos resultados apoyan los obtenidos
nos y en ratón. Para comenzar sus estudios clona la en el punto anterior donde se verifica la actividad
región promotora (p) ubicada a 5´del gen YFP (Yellow transcripcional en el caso de existir factores específi-
Fluorescent Protein). Luego, realiza los siguientes cos para la región promotora de P.
experimentos de transfección: 8) En un laboratorio se obtuvieron protoplastos (célu-
Línea celular Plásmido Fluorescencia las vegetales sin pared) a partir de células de mesófilo
YFP de tabaco. Los mismos fueron electroporados (trans-
Melanocitos M3 p/YFP +++ formados en forma transitoria, es decir, sin buscar in-
tegración estable) con tres plásmidos recombinantes
Queratinocitos Q8 p/YFP ---- distintos (uno por vez y en distintas células). Los 3
c) ¿Cómo interpreta estos resultados en términos de plásmidos portan la secuencia codificante para la beta-
mecanismos de regulación de la expresión génica y glucouronidasa (GUS) proveniente de un gen bacte-
especificidad de tejidos? riano llamado uid A (cuya expresión transitoria puede
Para confirmar lo anterior, decide realizar un ensayo detectarse mediante una reacción que da color azul, en
de EMSA (electrophoretic mobility shift assay). Para una forma muy similar a la que se puede detectar al
ello, utiliza nuevamente la región promotora de este producto del gen lac Z) y un terminador adecuado pa-
gen y la marca en uno de sus extremos 5´ con 32P. In- ra plantas. Lo que varía en los distintos plásmidos es
cuba la preparación con y sin proteínas nucleares ex- el promotor (acompañado del respectivo enhancer en
traídas de tejido cutáneo de los animales y corre un los casos 1 y 2, en el caso 3 no lo hay) que controla la
gel nativo de agarosa. Luego revela por autoradiograf- expresión de las secuencias estructurales.
ía.
1 Promotor secuencia estructu- terminador
Calle 1: Región promotora del Rubisco ral para GUS rubisco
gen P marcada con 32P e incu-
bada sin extracto nuclear.
Calle 2: Región promotora del 2 Promotor 35S secuencia estructu- terminador
gen P marcada con 32P e incu- ral para GUS rubisco
bada con extracto nuclear.

3 Promotor lac secuencia estructu- terminador


ral para GUS rubisco

1 2 Aclaraciones: Rubisco = ribulosa bifosfato carboxila-


e) ¿Por qué observa diferencias en la corrida electro- sa (responsable de la fijación de C02 en la fotosíntesis)
forética? Explique si estos resultados se relacionan similar al de un problema de la guía; 35S = transcripto
con los resultados del ítem d) y por qué. del virus del mosaico del coliflor (CaMV) que se ex-
Rtas. presa en forma constitutiva; lac = operón lactosa de E.
a) 20 % de recombinantes, por lo tanto, se encuentran coli.
a 20 unidades de recombinación. 1) Los investigadores no agregaron controles negati-
b) Se parte de tejido cutáneo y se realiza una extrac- vos o positivos ¿Es porque alguna/s de las 3 construc-
ción de RNA. Posteriormente se realiza una retro- ciones podría/n ser, a su vez, control/es positivo y/o
transcripción a fin de obtener cDNA. Finalmente se negativo? Explique
hace una PCR usando el par de primers (en lo posible 2) ¿Con cuáles de las construcciones observará la apa-
cuantitativa qRT-PCR) que amplifiquen alguna región rición de color azul en las siguientes situaciones?
correspondiente a un exón determinado del gen P y así a) protoplastos expuestos a la luz
verificar la expresión del mismo, tejido-específica. b) protoplastos en oscuridad
Como control se podría realizar una PCR para algún c) protoplastos en oscuridad suplementados con lactosa
gen constitutivo o conocido de ese tejido, por ejemplo d) protoplastos en oscuridad suplementados con lac-
B-actina. tosa y glucosa
c) YFP se regula transcripcionalmente, se expresa 3) El laboratorio no probó variantes de terminadores
bien en melanocitos y no en queratinocitos. Por lo tan- ¿Se podría haber agregado el terminador de otro gen?
to, en este tipo celular se encuentran factores de trans- Explique si esto podría haber afectado los resultados.
cripción específicos necesarios que se unen a regiones RTA:1) Rubisco: promotor INDUCIBLE por luz, sólo
regulatorias que posibilitan la expresión del gen repor- inducirá expresión cuando hay luz (en (a)). El 35S por
tero y por lo tanto, regularían también la transcripción ser constitutivo, se expresará en todas las condiciones.
del gen P. El lac es un promotor procariótico, por lo que NO es
e) Las diferencias en la corrida electroforética se de- funcional en plantas. Nunca podrá inducir expresión.
ben a que al incubar la región promotora/reguladora Además, aunque funcionara, carece del gen codifican-
con un extracto nuclear propio del tejido específico, se
7
te para el represor y del gen para CAP (o CRP) como ii) la secuencia codificante de APP mutagenizada
para poder activarse o reprimirse. para contener un codón de terminación de lectura muy
La construcción 1 sirve como control positivo y la 3 cercano al codón de iniciación
de negativo, por todo lo anterior. iii) una secuencia antisentido o interferente?
2) a) 1 y 2 Los ratones transgénicos correspondientes: ¿desarro-
b) 2 llarían Alzheimer o qué? Estos experimentos ¿servir-
c) 2 ían para reforzar su conclusión en c)?
d) 2 Posteriormente, decidieron cruzar ratones transgéni-
3) Salvo excepción, el terminador no influye en la ex- cos y sanos, comprobando que el carácter fue domi-
presión de un gen. Podría hacerlo en la vida media del nante (como ocurre en humanos). Por otro lado, con-
mRNA (esto no se dio en teóricas) o en la unión (ad- siguieron una muy rara mutante que, sometida a de-
hesión) a algún componente subcelular (esto lo verán, terminadas condiciones de alimentación y estrés mos-
más adelante, en genética del desarrollo. traba la aparición de Alzheimer por problemas de
9) Las variantes heredables de la enfermedad de Alz- splicing del RNA de APP tal como ocurre en huma-
heimer, se dividen en varios tipos dependiendo de la nos.
causa genética que la produce. Una de ellas se cree Decidieron, entonces hacer un cruzamiento entre
que se debe una mutación en el promotor/enhancer del transgénicos (homocigotas para el transgén) y mutan-
gen codificante para la APP (precursor de la proteína tes (también homocigotas). Para determinar el fenoti-
beta A4 amiloide, que es la proteína que se acumula po, se los dejó llegar a edad adulta. En caso de no des-
excesiva y descontroladamente en esta enfermedad). arrollar Alzheimer, se los sometió a condiciones de
Otra se debe a una falla en el procesamiento (splicing) alimentación especial y estrés y, posteriormente, se
alternativo del exón 19. los volvió a evaluar.
En un estudio se produjeron ratones transgénicos que - Toda la F1desarrolló Alzheimer sin necesidad de
expresan APP murina bajo el control del promo- someterlos a alimentación especial y estrés.
tor/enhancer aislado de DNA de humanos enfermos. - En la F2 se obtuvieron 236 ratones Alzheimer sin
Los ratones transgénicos enfermaron de Alzheimer a necesidad de someterlos a alimentación especial y
edad adulta. estrés, 64 que desarrollaron Alzheimer únicamente
Al analizar por Southern blot a los ratones obtenidos, después de tratamiento especial y 23 que nunca desa-
mediante hibridación con cDNA de APP (primera co- rrollaron Alzheimer.
lumna) o con oligonucleótidos complementarios a las e) ¿Se ajusta este resultado a las proporciones espera-
secuencias del promotor diferenciales (2° y 3° colum- das a partir de las leyes de Mendel? En caso de no ser
nas), se observó el siguiente patrón: así, explicar estos resultados y comprobar la hipótesis.
Sonda: cDNA Sonda: promotor Sonda: promotor Rta a) Porque detecta las copias endógenas del gen
APP murino APP murino APP humana normal ya presentes en el ratón y, además, la copia
Ratón Ratón Ratón Ratón Ratón Ratón (adicional) del transgén APP.
normal transg. normal transg. normal transg. b) La sonda murina detecta el gen endógeno pero no
el transgén, la humana: viceversa
c) En ratones jóvenes, la expresión es similar. En los
adultos, disminuye notablemente en los normales y
a) ¿Por qué la banda del segundo carril electroforéti- aumenta en los transgénicos. Existiría asociación entre
co (columna 1) tiene un color más intenso? la expresión de APP y aparición de Alzheimer.
b) Explique las diferencias observadas al utilizar d) i) Fluorescencia leve en cortes de cerebro de ratón
sondas de promotores de origen humano y muri- joven y fluorescencia fuerte en adultos
no. ii) Ninguna diferencia
Posteriormente, realizaron Northern blots con RNA de iii) Ninguna diferencia o, dependiendo del grado de
cerebro de ratón, usando como sonda cDNA de APP interferencia, puede haber letalidad debida a la no
en ratones transgénicos jóvenes (sanos) y adultos (en- expresión de APP en ratones jóvenes (ambas respues-
fermos). tas se considerarán correctas)
Ratones jóvenes Ratones adultos En ninguno de los 3 casos se desarrollará Alzheimer.
Refuerzan la conclusión de c) porque sirven de con-
Normal Transg Nor- Transg
troles (testigos) negativos, indicando que no es la mu-
. mal .
tación en el promotor la causante directa de este
comportamiento, sino la resultante sobre-expresión
descontrolada del gen de APP.
c) ¿Qué conclusión extrae en cuanto al rol de la trans- e) Epístasis dominante 12:3:1
cripción? 10) Hace poco más de una década se desarrolló, me-
d) ¿Qué fenotipos se obtendrían si (utilizando el mis- diante ingeniería genética, una tecnología para estu-
mo promotor), en lugar de la secuencia codificante diar los genes expresados por un determinado patóge-
para APP se hubiera utilizado: no cuando éste infecta a un huésped. Esta tecnología
i) un gen indicador (reportero) como GFP, se denominó in vivo expression technology (IVET).
Esta estrategia se utilizó para hallar genes que se ex-
presan diferencialmente en Salmonella cuando ésta
8
infecta ratones. Para ello se generó una genoteca presión del inserto? ¿Por qué no fue necesario agre-
genómica empleando ADN genómico de Salmonella gar IPTG?
digerido con una enzima de restricción de corte fre- g) En dichas placas, ¿a qué tipo de insertos corres-
cuente, en cantidades limitantes, y luego clonado en el ponden las colonias blancas y a cuales las azules?
MCS del siguiente plásmido: ¿Esperaría que haya más colonias azules o más blan-
cas? (No pierda de vista el objetivo de esta estrategia
OriR6K generada).
AmpR mob h) A partir de la obtención de colonias de interés,
¿cómo haría para identificar los genes de Salmonella
que se expresan específicamente durante una infec-
LacZ
ción? Explique brevemente los pasos a seguir.
CAT
i) ¿Cómo evaluaría funcionalmente los genes identifi-
MCS cados?
AmpR: gen de resistencia a ampicilina Respuestas:
mob: origen de transferencia conjugativa dependiente a) Las E. coli deben ser :
de genes tra (no codificados en el plásmido) - pir+ : para que el plásmido pueda replicar y para po-
CAT: gen de resistencia a cloranfenicol sin su promo- der transferirlo completo a las salmonelas.
tor - tra+ : para tener los factores necesarios para poder
oriR6K: origen de replicación dependiente de la pro- transferir el plásmido por conjugación a las salmone-
teína pi (codificada por el gen pir+) las.
Lac Z -galactosidasa sin su promotor - recA- : para evitar que el plásmido se integre al ge-
MCS: sitio de clonado múltiple noma en caso de existir alguna zona homóloga.
Luego de ligar, se transformaron E. coli competentes Para seleccionar, luego de transformar, se crecen las
con el objetivo de transferir mediante conjugación el bacterias en medio con ampicilina (no se puede usar
plásmido a las salmonelas dado que estas últimas no cloranfenicol porque sino se estaría sesgando la selec-
eran susceptibles de ser transformadas. El propósito ción a aquellas construcciones que incorporaron un
de esta etapa del experimento es generar una genoteca promotor que pueda expresarse en E. coli).
de salmonelas donde el plásmido de la figura 1 se b) Las salmonelas deben ser:
haya integrado al genoma bacteriano por recombina- - pir- : para que el plásmido no pueda replicar y cuan-
ción homóloga (el segmento clonado presenta la se- do se realice la selección solo sobrevivan y repliquen
cuencia homóloga en el genoma). las bacterias que integraron el plásmido al genoma.
a) ¿Cómo debe ser el genotipo de las E. coli en cuanto - recA+: para que puedan integrar el plásmido por re-
a los genes pir, tra, y recA (participa en la recombina- combinación homóloga.
ción homóloga)? ¿Cómo se seleccionaron las E. coli - AmpR
transformadas? Justificar La selección de las bacterias debe realizarse creciendo
b) ¿Cómo debe ser el genotipo de las salmonelas en las bacterias en medio con ampicilina (no puede ser
cuanto a los genes pir y recA? ¿Cómo se seleccionan a cloranfenicol por motivos similares a los mencionados
las salmonelas que integraron el plásmido? Justificar. en la pregunta anterior).
c) Esquematice la región homóloga en el genoma de c)
Salmonella luego de ocurrir la recombinación homó-
ATG STOP ATG STOP
loga donde se integra el plásmido.
S-D S-D
Una de las particularidades de esta construcción es Terminador
que los genes CAT y LacZ están desprovistos de pro- X´ CAT LacZ
motor por lo que solo se podrán expresar (como men-
sajero policistrónico) si en el MCS se clonó un frag- X: inserto
mento de ADN que contiene un promotor en la orien- X´: región homóloga en el cromosoma
tación adecuada. d)
d) Esquematice el plásmido recombinante incluyendo: X´ CAT LacZ mob AmpR X
el inserto, secuencias de Shine-Dalgarno, ATG inicia- OriR6K
dores, codones STOP y terminadores de la transcrip- Cada gen tiene que tener su propia secuencia de Shi-
ción. ne-Dalgarno (río arriba del ATG) y su propio STOP.
e) ¿Por qué se realizó una biblioteca genómica y no Ambos genes tienen que tener la misma orientación
una de cDNA? para que puedan ser traducidos a partir del mismo
Con estas salmonelas recombinantes (que eran sensi- mensajero policistrónico. Por otra parte debe haber un
bles a cloranfenicol y LacZ-) se infectaron ratones a solo terminador de la transcripción rio abajo del lacZ
los cuales se les suministró cloranfenicol. Luego de 3 para que se genere el mensajero policistrónico.
días se sacrificaron los ratones y se recuperaron las e) Se realizó una biblioteca genómica porque el obje-
bacterias que sobrevivieron las cuales fueron plaquea- tivo es ver que promotores se encienden durante una
das en LB + X-gal (da colonias azu - infección in vivo utilizando los genes CAT y LacZ
galactosidasa). como reporteros. En una biblioteca de cDNA no se
f) ¿Qué característica tendrán las bacterias aisladas de encuentran los promotores y sí en una genómica.
los ratones (in vivo) en cuanto a la orientación y ex-
9
f) Porque la expresión de la -gal está regulada por el Posteriormente, transfectan este plásmido en células
inserto (en caso de que contenga un promotor) y no de ave previamente infectadas con FPV.
por el promotor y operador del operón Lac. a)¿Para qué hacen esta transfección en células infecta-
g) Las bacterias que sobrevivieron luego de la infec- das y no en células sin virus?
ción en ratón y selección con cloranfenicol son aque- Como resultado de lo anterior obtienen, sobre medio
llas que expresaron el gen de resistencia a este antibi- sólido conteniendo X-gal, una monocapa de células
ótico. Esto sólo sucede si el inserto contiene un pro- con muchas placas transparentes y otras pocas azules.
motor, en la orientación adecuada, que se expresa en b)¿Con cuáles se quedaron y por qué?
las bacterias durante la infección y por ende permite la De las placas seleccionadas aislaron inóculo con el
expresión del mensajero policistrónico que codifica cual infectaron nuevas células que fueron analizadas
para el gen CAT. por PCR, Western e inmunofluorescencia, como se
Cuando se plaquea en medio LB + X-gal las colonias muestra en la siguiente figura:
azules son las que expresan -gal. Dado que esto solo Fig: Células aviares
ocurre si el inserto tiene un promotor que es activo en infectadas con FPV
el medio LB, las colonias azules corresponden a bac- solamente (C) o se-
terias que poseen un inserto que tiene un promotor leccionadas en el paso
que se expresa tanto in vivo como in vitro, lo cual in- anterior (D) después
cluye genes de expresión constitutivas. de tratar con un anti-
En cambio, las colonias blancas corresponden a bacte- cuerpo marcado con
rias con insertos donde el promotor que fue activo in fluoresceína.
vivo (y por ende sobrevivieron a la selección con clo- c)¿Con qué anticuer-
ranfenicol) fue inactivo in vitro. Es decir corresponde pos habrán hecho este
a genes que solo fueron activos durante la infección. estudio y el de wes-
Por lo tanto esperaría que haya más colonias azules. tern? Es decir, ¿Qué
h) Partiendo de las colonias blancas se amplifica por antígenos reconocen
PCR el inserto, utilizando primers complementarios a estos reactivos?
las regiones del plásmido flanquantes al MCS y luego d)¿Cuál sería el si-
se puede secuenciar dicho inserto. Utilizando dicha guiente paso para
secuencia se puede realizar una búsqueda bioinformá- comprobar la efecti-
tica para ver a que gen corresponde, si el genoma está vidad de esta poten-
secuenciado. Si no está secuenciado se puede utilizar cial vacuna de nueva
el inserto como sonda para buscar el gen completo en generación?
una biblioteca genómica. e) Enumere 2 ventajas
i) Por ejemplo se puede knockear el gen/genes en que tendría usar esta vacuna respecto a las vacunas
cuestión y evaluar el proceso de infección en ratones, convencionales que se usan hoy en día.
comparando con la cepa salvaje. 3) a) Para que se produzca el reemplazo alélico (re-
11) El grupo de Ling y col. (2006) desarrolló una va- combinación homóloga entre plásmido y genoma de
cuna recombinante para el virus Newcasttle y el virus FPV) y se construya así el virus recombinante
de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV), que son en- b) Con las azules porque la expresión de beta gal es
fermedades cuarentenarias de los pollos, utilizando indicativa de la presencia de la inserción en los virus
para ello los genes de 2 antígenos de Newcasttle: el F recombinantes
y el HN y uno de ILTV: el gB. Para ello, subclonaron c) Anticuerpos que reconocen F, HN, gB y ¿por qué
estos genes primero en un plásmido de E. coli con el no? beta galactosidasa. De todos modos, sólo son im-
objetivo de incorporarlos (en un segundo paso) en el portantes lo 3 primeros porque el objetivo de todo esto
genoma del virus Fowlpox (FPV, viruela de ave de es inmunizar contra estos antígenos y la expresión de
corral, un pariente del virus vaccinia) bajo el control beta galactosidasa ya se evaluó enzimáticamente.
del promotor viral LP2EP2 (promotor temprano- d) Ensayos de protección vacunando y desafiando
tardío). Además, agregaron una construcción conte- posteriormente con los virus patogénicos.
niendo LacZ bajo el control de otro promotor viral e) Se puede hacer una única vacuna para 2 enferme-
tardío (el P11). Finalmente se colocaron secuencias dades distintas y no es necesario utilizar virus infec-
homólogas (llamadas “brazos”) de FPV (Am1 y Am2 ciosos para elaborar la vacuna.
significando “arm” –brazo- 1 y 2). Todo esto, en un Mendel y extensiones
vector de E. coli
como se muestra 1) En los cobayos, el color de pelo (negro vs blanco)
en la figura y es determinado por el gen B. Los símbolos negros re-
que es un presentan a los cobayos negros y los blancos a los co-
plásmido suicida bayos de fenotipo blanco. Se dispone del siguiente
(no tiene capaci- árbol genealógico, en el cual los individuos II1 y II4
dad de replica- pertenecen a líneas altamente endocriadas (asumir que
ción propia en pertenecen a líneas puras).
células de aves):
10
I 1 2 II) ¿Sobre qué fundamento(s) incluido(s) en la/s
ley(es) de Mendel) se apoyan sus predicciones en los
casos anteriores?
Nomenclatura: S alelo determinante de hemoglobina
II 1 2 3 4 falsiforme, N de Hb normal, _ puede ser cualquiera de
los 2 alelos (N o S)
Respuesta: a) ¼ b) 0
1 2
III ? I) a) abuelos SS (enfermo) x NN (sano)  padres SN
(sanos en ambos casos)  hijos posibles NN, SN o SS
a) Represente el genotipo probable de cada individuo b) abuelos en un caso: S_ x S_ (ambos sanos o en-
(en los casos de que pueda ser más de uno, represente fermos)  padre SS (enfermo), abuelos en otro caso
con un guión bajo, i.e. B_) NN x NN  padre NN (sanos todos)
b) Calcule la probabilidad de que un descendiente del II) En el concepto de segregación de los alelos al for-
cruzamiento entre III1 y III2 sea blanco. Para contes- mar las gametas que darán origen a la progenie expli-
tar es suficiente que escriba los genotipos al lado de citada en la primera ley de Mendel.
los símbolos en el esquema y las probabilidades (sólo 3) La corea de Huntington es una enfermedad rara,
de las que se usarán para hacer los cálculos) sobre el mortal, que aparece normalmente a mediana edad. Se
esquema (puede dibujarlo o escribir sobre este enun- debe a un alelo dominante. Un hombre fenotípicamen-
ciado). De lo contrario, explique su razonamiento te normal, de poco más de 20 años, advierte que su
Respuestas esperadas: padre ha desarrollado la corea de Huntington.
I Bb 1 Bb a) ¿Cuál es la probabilidad de que más tarde él mismo
2
desarrolle la enfermedad?
b) ¿Cuál es la probabilidad de que la desarrolle su hijo
BB 2/3 BB al cabo del tiempo? (Nota: Para sus cálculos asuma
II 1 2 bb ---Bb
3 4 que la frecuencia del alelo que produce la enfermedad
1/3 en la población humana es insignificante).
½b ½ bBB ½ BB Respuesta Suponiendo que el padre que desarrolla la
III Bb 1 ? 2 ½ Bb
enfermedad fuese heterozigota para el alelo mutante
(dado que la probabilidad de que también lo tenga la
En caso de respuesta con explicación: madre es insignificante): a) ½ b) ¼.
I1 y I2 tienen que ser heterocigotas (Bb) porque si no, Si suponen que el padre también podía ser homocigota
no podrían tener un hijo blanco (además de heterocigota) y se hacen los cálculos co-
II1 y II4 son BB por definición de líneas puras, II2 bb rrectos [a) 1 b) ½ ] para esta segunda posibilidad el
porque su fenotipo refleja su genotipo problema se considerará bien contestado. Si ponen
II3 es B_ porque no podemos saber qué segundo alelo homocigota como única posibilidad aún cuando se
recibió. Tiene 1/3 de posibilidades de ser BB y 2/3 de hagan los cálculos correctos, el problema está mal
ser Bb (son tercios y no cuartos porque se descarta contestado.
que pueda ser bb dado que su pelaje es negro). 4) Dos plantas enanas de maíz (E1 y E2) tenían origen
III1 es Bb porque deriva de un BB y un bb distinto, pero eran fenotípicamente idénticas. Se cru-
III2 es B_ dado que, como se explica arriba, existe zaron cada una de estas plantas enanas con una línea
una probabilidad de 2/3 que su padre II3 sea Bb altamente endocriada de plantas altas que, se sabía,
Si II3 era BB, III2 es BB. Si II3 era Bb, existe ½ de son homozigóticas para todos los genes que determi-
probabilidad de que III2 sea BB o Bb. nan el tamaño. Ambos cruces dieron lugar a una F1
Sólo si III2 resulta Bb, podrá tener ¼ de posibilidad constituida únicamente por plantas altas. Al autofe-
de tener un hijo blanco con III1 cundar cualquier planta de la F1, la proporción de la
Por lo tanto, la probabilidad de que se produzca un F2 fue de 3 altas: 1 enana. Los cruzamientos entre las
cobayo blanco es (2/3)(1/2)(1/4) = 2/24 = 1/12 dos líneas enanas paternas E1 x E2, solo dieron lugar
2) La anemia de células falciformes (ACF) es un pro- a plantas altas en la F1. A pesar de este resultado, en
ceso hereditario humano causado por un alelo au- la F2 reaparecieron las variantes enanas. La propor-
tosómico recesivo de muy baja incidencia en las po- ción de plantas enanas en la F2 fue de 7/16.
blaciones occidentales. Un matrimonio quiere conocer a) Explicar los resultados obtenidos, indicando todos
la probabilidad de tener un hijo afectado. Con sus co- los genotipos implicados.
nocimientos sobre herencia mendeliana ¿qué podría b) ¿Qué proporciones genotípicas y fenotípicas espe-
decirles si: raría si se realizase el cruzamiento prueba de la F1 del
a) ambos miembros de la pareja son normales, pero cruzamiento E1 x E2 con el progenitor E1?
cada uno de ellos tiene un padre afectado y el otro Respuesta a) Dos genes afectan al tamaño
progenitor no tiene historia familiar de ACF? A (normal)> a (enanismo 1)
b) el marido está afectado por la enfermedad pero la B (normal)> b (enanismo 2)
mujer no tiene antecedentes familiares de ACF? [Es un caso de epístasis complementaria]
I) Para cada caso construya las genealogías posibles P E1=AAbb x E2=aaBB
para esta familia indicando los genotipos y fenotipos F1 AaBb (altas)
de todos los individuos involucrados. F2 9 A_B_ (altas) vs 7 aa__ o __bb (enanas)
11
b) AaBb x AAbb  AABb ¼, AaBb ¼, AAbb ¼, A- 6) Se presentó ante los tribunales de justicia el si-
abb ¼. guiente caso: la familia Pérez reclama que cierto bebé
Proporciones fenotípicas: A- B- 1/2 altas; A- bb 1/2 (Juan), que les dieron en la maternidad, no les perte-
enanas nece y que, en cambio, el bebé Felipe, que tiene la
5) Un criador de canarios desea en generar aves de familia García, es el suyo y se lo cambiaron. La fami-
color naranja. Con este objetivo cruza animales de una lia García niega este hecho, y el tribunal ordena el
raza (es decir, altamente endocriada) amarilla con examen de los grupos sanguíneos de los bebes y de los
animales de una raza roja. A pesar de sus expectativas padres, con los siguientes resultados:
todos los animales de la descendencia resultaron de Ma- Pa- Bebé
color rojo. Sin darse por vencido, decidió cruzar esta dre dre
F1 con animales de la raza parental amarilla. Para su Familia Pérez AB O A (Juan)
sorpresa no solo los animales no resultaron naranjas, Flia. García A O O (Felipe)
sino que tuvieron variados colores: 25 rojos, 27 verdes ¿Qué familia tiene razón y por qué?
y 48 amarillos. Completamente desconcertado decide Respuesta: la García. Si escribimos los genotipos
llamarlo a usted como genetista para responder a los completos de los padres resulta claro que el primer
siguientes interrogantes: podría ser resultado de cualquiera de las 2 parejas,
a) ¿Es posible que el color de estas aves esté determi- pero el segundo bebé sólo de la segunda
nado por un solo locus? Ma- Pa- Bebé
b) ¿Y por dos loci? dre dre
Justifique por que sí o por qué no, indicando los alelos Familia Pérez AB OO AO
probables de los parentales y de la descendencia, y Flia García AO OO OO
alguna explicación bioquímica.
c) ¿Cómo haría para validar estadísticamente su hipó- Mapeo
tesis? Explique brevemente sin realizar los cálculos. 1) En una determinada especie animal los loci A,a; B,
Respuesta: b y C,c se localizan en el mismo autosoma. El locus
a) En primer lugar asumimos parentales homocigotas B,b es el central. La distancia entre A,a y B,b es de 20
porque se trata de razas en las cuales hay mucha en- unidades de mapa, la distancia entre B, b y C, c es de
docría. Si fuera determinado por un solo locus tene- 10 unidades de mapa y el coeficiente de coincidencia
mos es 0,6. Indicar la proporción esperada de individuos
AA (rojo) x aa (amarillo) obtenidos con el fenotipo Abc.
Respuesta: Cc = Frecuencia de dobles observadas
Aa (rojo) x aa (FO) / Frecuencia de dobles esperados (FE) = 0.6
½ Aa (rojo); ½ aa (amarillo)  FO= 0.6 x FE= 0.6 x 0.2 x 0.1=0.012
Deberíamos tener sólo fenotipos rojos y amarillos y en Nº de dobles observados = 0.012 x 100 = 1,2% indi-
igual cantidad viduos dobles recombinantes: AbC y aBc
b) Si son dos loci tenemos distancia. A-B = Nº de Individuos recombinantes en-
A1A1B1B1 (rojo) x A2A2B2B2 (amarillo) tre estos marcadores + Nº de dobles recombinates x
100 / nº total de individuos = 20 nº ind. rec. entre
A1A2B1B2 (rojos) x A2A2B2B2 estos marcadores + 1,2 = 18,8
Es decir, 18,8 % son recom. Abc y aBC por lo tanto
A1A2B1B2 (rojos); A1A2B2B2; A2A2B1B2; aproximadamente tendremos la mitad de individuos
A2A2B2B2 (amarillos) de cada tipo: 9,4 %
De lo genotipos restantes uno debería dar fenotipo 2) Se está estudiando una nueva especie de plantas
amarillo y el otro verde (no importa cual por simetría). descubierta recientemente. Se sabe que el alelo Q co-
Entonces supongamos que A1A2B2B2 es verde y difica para hojas verdes, y el q para hojas moteadas (Q
A2A2B1B2 es amarillo. domina sobre q); por su parte el alelo R codifica para
En este caso la relación rojo:verde:amarillo debería hojas redondas, y el r para puntiagudas (R domina
ser 1:1:2 que es lo que se observa. sobre r). Todavía no se sabe la función del gen E/e. A
Una posible explicación sería la siguiente vía de pro- estos investigadores les resultó raro que, a pesar de
ducción de pigmentos: haber muestreado una gran región en la que este tipo
de planta habita, no se encontró ninguna planta con
A1 B1 hojas verdes y puntiagudas simultáneamente. Para
dilucidar esta cuestión, se realizó un cruzamiento
prueba, y los resultados fueron los siguientes:
Amarillo verde rojo a) ¿Qué genes están ligados? clases Nro
b) ¿Hay interferencia? Contestar si o no,
EqR 280
Nota: A y B no están ligados porque si lo estuvieran no hace falta calcularla numéricamente
(lo mismo en a) eqr 203
en la F1 habría una frecuencia de gametas A1B1 ma-
c) ¿Por qué piensa que no se observan EQR 199
yor a ¼ con lo cual más de ¼ de la descendencia de-
bería ser roja. individuos de uno de los genotipos posi- eqR 7
c) Prueba de bondad de ajuste (chi-cuadrado) a una bles? Eqr 67
relación 1:1:2 d) Analizando los resultados, discuta qué eQr 279
eQR 73
12
supuestos de los que se utilizan para este tipo de entre dos líneas puras: una de plantas altas y vainas
dio para calcular las distancias génicas en base a las hinchadas y otra de plantas enanas y vainas arrugadas.
frecuencias observadas pueden no estar cumpliéndose. ¿Cuáles son las frecuencias que hubiera esperado
Rta: a) Q/q y E/e están ligados, E/e y R/r están liga- Mendel?
dos, q/Q y R/r no parecerían estar ligados porque el c) ¿Qué cantidad de individuos de cada fenotipo
porcentaje de recombinación es del 50%. Sin embar- esperaría encontrar, si la F2 estuviera compuesta por
go, se encuentran en el mismo cromosoma (están “li- 160 plantas? ¿Cuántos hubiera esperado Mendel (no
gados” a 50 um o más) es necesario realizar la verificación estadística)?
Para hacer los cálculos (no pedidos para responder la Solución
pregunta), primero tienen que sacar el locus central a) La distancia entre estos genes en unidades mapa
que es el E/e. Después: es de 199 - 78 = 121 (fa-le) y de 211 - 199 = 12 (le-
dist Q/q – E/e = 36,9 um v). Debido a la enorme distancia que separa al gen fa
dist E/e – R/r = 13,27 um de los otros dos, en un experimento de cruce se
dist q/q – R/r = 50,07 um (“no” están ligados) hubieran comportado como independientes. Sin em-
Lo correcto para calcular la distancia entre los genes bargo, el cruce le x v hubiera dado resultados muy
de los extremos es sumar las distancias internas (da alejados de la independencia. Por lo tanto, este par de
50,07 um), en vez de realizar una prueba de dos pun- caracteres no le hubiera permitido elaborar sus leyes.
tos (da 48,92 um), pues de lo contrario no se estarían Aclaración: en el enunciado dice “te”.
considerando los dobles recombinantes. b) Resultados que hubiera obtenido Mendel de haber
b) Si. Para hacer los cálculos (no pedidos para respon- cruzado le y v:
der la pregunta) Le V/Le V x le v/le v = Le V/ le v
Cc = 7 / 54,25 = 0,12 De acuerdo con la distancia a la que se encuentran
Por lo tanto I = 1- 0,12 = 0,88 estos dos genes y suponiendo igual frecuencia de re-
Siendo 7 el nro de dobles rec observados combinación en la formación de los gametos en los dos
Siendo 54,25 el nro de dobles rec esperados (0,369 * sexos, tendríamos: Acá deben saber en función de la
0,1327 * 1108) distancia, las frecuencias de los que son recombi-
Siendo 1108 el total de individuos nantes y de los que no lo son es un conepto teórico
c) Una posibilidad es que, como sugería el enunciado, importante.
la combinación de alelos Q/q r/r sea letal, siempre y 0,44 Le V 0,44 le v 0,06 Le v 0,06 le V
cuando a su vez el genotipo sea E/e. En el campo
abierto podría presentarse el mismo fenotipo genera- 0,44 Le V 0,1936 0,1936 0,0264 0,0264
do por el genotipo anterior por ejemplo por la combi-
nación de QQ Ee rr, Qq EE rr ò Qq eE rr (pues se 0,44 le v 0,1936 0,1936 0,0264 0,0264
pueden dar todas las combinaciones posibles, al no
0,06 Le 0,0264 0,0264 0,0036 0,0036
tratarse de cruzamientos prueba). Dado que en el
v
enunciado se menciona que a campo abierto no se ob- 0,06 le V 0,0264 0,0264 0,0036 0,0036
serva ese fenotipo (hojas verdes y puntiagudas) se
puede pensar que tanto Q/Q r/r como Q/q r/r son com- (En blanco, fenotipo LeV, en amarillo, lev. En rosa:
binaciones letales en presencia de por lo menos un Le v, en celeste, le V.
alelo E. (y no en presencia de ee, ya que se observan es decir, (Aca deben saber en forma teórica cuales
parentales del cruzamiento prueba que son Qq ee rr) serían las frecuencias esperadas de recombinantes
d) Hay que recordar que para calcular distancias en y no recombinantes)
base a frecuencias fenotípicas, se supone que todas las Le V le v Le v le V
gametas son igualmente viables. En este caso vemos
que no es así. Observado 0,6936 0,1936 0, 0564 0,0564
3) Los experimentos que realizó Mendel, con una se-
rie de marcadores genéticos de arveja, le permitieron Esperado 9/16= 1/16 3/16 3/16
llegar a la conclusión de que los caracteres se transmit- 0,5625 0,0625 0,1875 0,1875
ían independientemente unos de otros. Sin embargo, se c) Mendel, en su trabajo sobre hibridación en plantas,
sabe ahora que tres de ellos se encuentran en el cromo- indica que se hicieron varios experimentos uniendo
soma 4, en las posiciones (en unidades Morgan respec- caracteres de dos en dos o de tres en tres. Si hubiera
to del inicio del cromosoma), 78 (fa, vainas axia- realizado el cruce anterior unas 160 plantas (número
les/terminales), 199 (te, altura de planta alta/enana) y de plantas que contó en uno de sus experimentos de
211 (v, vainas hinchadas/arrugadas), siendo dominan- dihibridismo obtenido el siguiente resultado,
tes los alelos que se mencionan primero. Lo que Mendel Lo que Mendel
a) Dibuje un mapa genético de los marcadores indi- hubiera esperado hubiera encontrado
cando las distancias entre ellos. ¿Qué conclusiones Le V 90 111 (110,976)
puede deducir respecto a la utilidad que hubieran pre- Le v 30 9 (9,024)
sentado estos loci para los estudios de Mendel?
b) Según los datos aportados, indique las frecuencias le V 30 9 (9,024)
fenotípicas y genotípicas que esperaría en la F1 - y su
correspondiente F2- proveniente de un cruzamiento
13
le v 10 31 (30,976) 3) ¿A qué distancia del ori de transferencia mapea
el gen que codifica para trp? Y los que codifican
(Por supuesto, las diferencias son enormes) para leu y mal?
Otra forma de resolver el problema 4) ¿Qué experimento haría para determinar el orden
obs L l Total entre leu y mal?
V 111 9 120 5) Dibuje, indicando Origen de transferencia y termi-
v 9 31 40 nación, el modo en que el plásmido F se integró al
Total 120 40 160 cromosoma bacteriano y dio origen a esta HFR.
Sin suponer ligamiento 6) ¿Qué tipo de recombinación ocurre para que las
esperados L l Total bacterias leu- pasen a ser leu+? ¿Qué tipo de recom-
V 90 30 120 binación ocurre cuando el plásmido F se integra en el
v 30 10 40 cromosoma bacteriano?
Total 120 40 160 Rta: 1) Porque al estar más cerca del origen de trans-
ferencia pasan antes y le dan menos tiempo a las bac-
terias conjugantes a que se separen espontáneamente e
Genética Bacteriana interrumpan la transferencia.
1) ¿Cómo esperaría que fuera la transferencia hereda- 2) MM + ampicilina + los 2 aac que no se analizan en
ble del gen lac+ en cruzamientos entre cepas donoras cada caso F- AmpR aac+ donde aac+ es leu+, mal+ (que
de E. coli lac+ a) Hfr, b) F+ y c) F'lac con cepas re- en realidad no es un aminoácido) o trp+, respectiva-
ceptoras F- lac- incapaces de recombinar (rec-)? Justi- mente. Para los otros 2 genes cuyos aa están presentes
fique su respuesta en el medio, los genotipos pueden ser + o -. Por ej, en
Respuesta: El único cruzamiento capaz de transferir el primer caso el genotipo es F-AmpRleu+mal+/-trp+/-
el gen lac+ en forma heredable es aquel en el que in- 3) 10’, 5’
terviene la donora c) F'lac debido a que el gen lac+ 4) una prueba de recombinación equivalente a una
forma parte del plásmido transferido que no requiere prueba de 3 puntos con los 3 marcadores de este expe-
de recombinación (entrecruzamiento) para mantenerse rimento. 5) Dibujito
establemente en la célula receptora.. 3) Un tema de interés para la medicina humana y vete-
La cepa b) es capaz de transferir lac+ pero la cepa re- rinaria es el desarrollo de vacunas más confiables. En
ceptora requiere de las funciones de recombinación el caso de la brucelosis (que es una zoonosis, es decir,
homóloga para que se produzca el reemplazo alélico enferma a animales y a humanos) se desarrollaron va-
(entrecruzamiento) para integrar establemente el gen cunas para el ganado vacuno que consisten en bacte-
recibido. Como el segmento transferido es inestable rias vivas atenuadas por diferentes procedimientos de
(es lineal, no puede replicarse correctamente y es sus- cultivo. En este contexto, en la Argentina se utiliza la
ceptible a degradación por nucleasasas) termina per- cepa S19 que tiene algunos problemas porque no está
diéndose. suficientemente atenuada. Con el advenimiento de la
La cepa a) F+ sólo puede transferir lac+ con muy baja ingeniería genética se pudieron caracterizar genes co-
frecuencia si en alguna de sus células el factor F se mo el bp26 y el bmp18 que, al ser mutados, práctica-
integra previamente al cromosoma principal (esas po- mente eliminan la virulencia, tal como lo publican
cas células se convertirían en “Hfr”). Sin embargo, Campos y col (Veterinary Microbiology, 2002). En un
tendrá el mismo problema que la cepa b). trabajo previo, lo demostraron mediante el desarrollo
2) Se realizaron experimentos de conjugación inte- de mutantes knock-out para ambos genes.
rrumpida entre cepas Hfr AmpS leu+mal+trp+ y F- a) Indique una estrategia de cómo hubiese obtenido
AmpR leu-mal-trp-. Los resultados se exponen en la Ud. esta mutante knock-out. Utilice exclusivamente
siguiente figura: (mal: capacidad de metabolizar la esquemas para su respuesta
maltosa) Debido a que no resulta deseable la liberación de or-
ganismos modificados genéticamente conteniendo
genes de resistencia a antibióticos (y menos si éstos
son patogénicos), para la construcción de la cepa mu-
tante vacunal Δbp26::luc Δbmp18 (Δ simboliza dele-
ción y :: simboliza inserción y que bautizaron IN-
TA2) usaron una técnica de contraselección (ver Figu-
ra).
Aclaraciones: El gen sacB (de Bacillus subtilis) codi-
fica para una levansacarasa que metaboliza la sacarosa
en un levano que es tóxico para Brucella. Es decir que
las bacterias que contienen este gen se mueren cuando
se agrega sacarosa al medio de cultivo. a y b señalan
1) ¿Por qué los recombinantes para leu y mal aparecen secuencias homólogas (probables sitios de entrecru-
con mayor número de recombinantes? zamiento). El gen luc codifica para la luciferasa de
2) Explique en qué medios se hicieron crecer las luciérnaga, los genes ApR y KnR para resistencia a
bacterias para analizar su genotipo, y qué tipo de ampicilina y kanamicina, respectivamente. En varios
bacterias (qué genotipo) crece en cada uno. de los genes se especifican, con flechas, oligonucleó-
14
tidos diseñados para PCR y el tamaño del fragmento ausencia de sacarosa). En un segundo paso, se pa-
de amplificación esperado. sarían las bacterias a un medio conteniendo sacarosa,
B B B1 N
en ausencia de kanamicina. [De hecho, esto fue lo
que hicieron los autores del trabajo]. Lo mismo
S19 bp26 / bmp18 1 con ApR para el gen bmp18.
696 bp 990 bp
p26f p26r / p18f p18r Otra respuesta correcta: Suponiendo que se qui-
B + B siera seleccionar directamente la construcción 3,
luc sin pasar por la construcción 2 (doble recombinan-
Primer evento
pKS26L KnR te directo), KnR no tiene función alguna en el ex-
de entrecruza- perimento del problema. Al utilizarse el sistema de
sac
B
miento contraselección basado en SacB podría no estar
Integración del plásmido suicida
KnR
2 presente, sin afectar con su ausencia el resultado.
luc bp26
bp26 / bmp18 En este caso, su única función es ser un marcador
sacB
a selectivo en E. coli (otorga al plásmido una ventaja
b /
Segundo evento selectiva que ayuda a mantenerlo, evitando su
Selección con sacarosa de entrecruza- pérdida, durante su multiplicación en E. coli). En
B miento N el caso del segundo plásmido conteniendo ApR,
1 esta aproximación es mucho más difícil (aunque
luc / bmp18 3 no imposible) porque no tengo un gen indicador y
1837 bp 990 bp
p26f p26r / p18f p18r sólo puedo distinguir dobles recombinantes (cons-
+
bmp18 trucción 5) de salvajes (construcción 3) mediante
Primer evento pSD18 Ap R PCR de las colonias, por ej.
de entrecruza- ii) Este gen sirve para distinguir las mutantes
miento sacB “knock out” para el gen bp2 que quiero seleccio-
Integración del plásmido suicida nar (construcción 3) de las revertantes salvajes
(construcción 1), dado que ambas sobreviven en el
sacB ApR
4 medio conteniendo sacarosa.
 bmp18
luc / bmp18
iii) Como dice el enunciado, este gen sirve para
a
/ b contraseleccionar (seleccionar en forma negativa)
Segundo evento las construcciones 2 y 4 en presencia de sacarosa.
de entrecruza- Selección con sacarosa
c) Básicamente, el que el plásmido sea suicida me
miento permite seleccionar más eficientemente al recom-
INTA2 luc / bmp18 5 binante. Suponiendo que la selección de las cons-
1837 bp 694 bp trucciones se hizo paso a paso [como se explica en
p26f p26r / p18f p18r
“b) i)”], si el plásmido replicara en Brucella, la
b) ¿Qué función específica cumplen los siguientes selección en presencia de kanamicina solo me daría
genes marcadores en el esquema de obtención de la muchísimas bacterias con el plásmido sin integrar y
cepa vacunal? me sería extremadamente dificultoso aislar el recom-
i) ApR y KnR (2 ptos); ii) luc (2 ptos); iii) sacB binante (construc. 2) por su baja probabilidad de ocu-
c) ¿Porqué se usaron plásmidos suicidas? rrencia.
d) Diseñe un sistema molecular de detección para dis- Ahora, suponiendo la alternativa de selección directa
tinguir los 5 genotipos posibles entre sí. Explíquelo. del doble recombinante [como se explica en “otra res-
e) Un punto importante en cualquier campaña de erra- puesta correcta” en “b) i)”], el primer plásmido podría
dicación de enfermedades como la brucelosis es poder no ser suicida, porque sería seleccionado en forma
distinguir animales vacunados de infectados en forma negativa en presencia de sacarosa.
sencilla, barata y masiva. Tradicionalmente, el dia- d) Por PCR usando los primers flanqueantes de los
gnóstico se realiza mediante la detección de anticuer- genes. Las construcciones 1, 3 y 5 darían una sola
pos anti-Brucella en sangre porque la bacteria es muy banda por primer (total 2 bandas), a saber 696 + 990
difícil de detectar y no resulta sencillo diferenciar en- en 1, 1837 + 990 en 3 y 1837 + 694 en 5. Los cointe-
tre los animales que tienen estos anticuerpos debido a grados darían 2 bandas, para el par de primers p26 en
que estuvieron infectados o porque fueron vacunados. 2 o para el par de primers p18 en 4. En total 3 bandas.
¿Qué solución le parece que proponen los diseñadores También se considerarán correctas respuestas con
de esta vacuna? otras variantes (detección de fluorescencia en lugar de
Respuestas: a) Se podría usar el mismo esquema del la banda de 1837 combinada con PCR de los otros
enunciado (parte izquierda) reemplazando el gen luc genes; RFLPs usando bp26 y bmp18 como sondas,
por un gen de resistencia a antibiótico (por ej. a Tetra- detección de las proteínas codificadas mediante Wes-
ciclina) y manteniendo el gen de resistencia a kanami- tern, etc.), siempre y cuando la respuesta permita dife-
cina (o SacB) para seleccionar el doble recombinante. renciar claramente los 5 genotipos.
b) i) Suponiendo que se quiera ir paso a paso (como e) La presencia de anticuerpos anti-luciferasa diferen-
sugiere el flujo de esquemas) y seleccionar primero el cian animales vacunados con esta cepa respecto de los
cointegrado (construcción 2) y recién después el doble que se infectaron con una cepa salvaje no recombinan-
recombinante (construcción 3): KnR serviría para se-
leccionar en un medio conteniendo kanamicina (en
15
te. La ausencia (versus presencia) de anticuerpos con- (igual que en este experimento). c) No, están dema-
tra bp26 y bmp18, es otra variante de la respuesta. siado lejos para ser cotransducidos. d) No, porque es
También se considerará correcta (con la mitad de la una doble auxótrofa y por lo tanto requiero de la mu-
nota = 2,5 ptos) la respuesta que proponga el aisla- tación (reversión) simultánea de al menos 2 bases dis-
miento de bacterias del animal, las cuales deberían no tintas y cuya reversión no necesariamente requieren
ser fluorescentes en presencia de luciferina en el caso del mismo mecanismo de mutación Respuesta alter-
de la cepa de campo y ser fluorescentes en el caso de nativa que, en caso de aparecer, debe ser considerada
la cepa vacunal. Idem si la técnica seleccionada es una correcta: Sí, si utilizo MM+ bio (o MM+ arg).
PCR. En la realidad, esta última variante no es practi- 4) Un investigador está interesado en mapear y estu-
cable, porque la cepa vacunal sobrevive muy poco a diar 3 genes a, b y c involucrados en la biosíntesis de
las defensas del animal y resulta lento, peligroso y aminoácidos. Se sabe que los productos de los genes
poco práctico el aislamiento de bacterias patogénicas. a, b y c catalizan las siguientes reacciones:
4) Bacterias de una cepa de E. coli Hfr rec+ bio+ his+ Leu Ile
StrS son mezcladas junto a bacterias de otra cepa de E. A C
coli F- rec+ bio- his- StrR. A diferentes tiempos, se X
inter-rumpieron las conjugaciones, se plaqueó en los B
siguientes medios selectivos (todos conteniendo Str) Val
y al día siguiente se contó el N° de colonias. (MM = donde X es un compuesto que puede ser sintetizado
medio mínimo) por ambas cepas de bacteria creciendo en un medio
Tiempo Nº de colonias en mínimo (MM). Para realizar el estudio dispone de 2
(min) MM MM+bio MM+his MM+bio+his cepas de bacterias: Hfr a+b+c+ StrS y otra F- a- b- c- StrR
5 0 0 0 503 con las cuales realizó un experimento de conjugación
10 0 0 34 487 interrumpida obteniendo los siguientes resultados:
15 0 0 44 499
Nº recombinantes

20 0 0 50 503
25 0 0 59 498 c+ StrR
30 20 30 80 501
a) El experimento anterior se aprovechó para mapear
los genes involucrados en la síntesis de biotina.
Ubique en el mapa genético el gen bio. a+ StrR
Se aclara la posición donde está
integrada la secuencia del b+ StrR
plásmido F en esta cepa F
Hfr, y además la del gen
his, previamente mapeado. 4 8 12 16 20 24 t (min)
b) Un amigo suyo, his a) ¿En qué medios se seleccionaron cada uno de los
estudiante de Biología, le genotipos de bacterias del gráfico anterior?
cuenta que hizo un b) ¿A qué distancia del origen de transferencia de la
experimento de conjugación - cepa Hfr utilizada mapean los genes a, b y c?
mientras miraba videoclips de c) Grafique y explique los resultados que hubiera te-
Britney Spears- con una cepa Hfr diferente a la nido en el experimento de conjugación interrumpida si
anterior, la cual, al conjugar con la misma F- que en el el genotipo de la cepa dadora hubiese sido:
experimento anterior, le transfiere el gen his a los 20 i) Hfr a+b+c+ StrR
min y el gen bio a los 40 min. ¿Le creería a su amigo ii) F+ a+b+c+ StrS
o pensaría que se distrajo mientras hacía los iii) Si el origen de transferencia de la cepa Hfr
experimentos? se encontrara entre el gen b y el c.
c) Un fago que hace transducción generalizada puede El hecho de que a y b mapearan juntos y formaran
encapsidar fragmentos de DNA genómico de una parte de una misma vía metabólica le sugirieron al
cepa bacteriana infectada y lisada que tengan un investigador que a y b pertenecen a un mismo operón.
tamaño de hasta 30.000 pb. Si ese fago es usado para Con el objeto de estudiar esta posibilidad realizó el
infectar una cepa de E. coli salvaje, y el lisado siguiente experimento:
resultante es usado, a baja multiplicidad de infección, A) Se digirió ADN genómico de una cepa salvaje con
para infectar a la F- mencionada antes. ¿Esperaría la ER Alu I (de corte frecuente) en cantidades limitan-
observar colonias en MM? Justifique (1 min equivale tes. Luego los fragmentos se ligaron en uno de los
a 20 kpb aprox) vectores que se muestran.
e) ¿Usaría Ud. la cepa F- en MM para testear la muta- B) Luego se transformaron bacterias a- b- c+ AmpS con
genicidad de una sustancia en un test de Ames? uno de los vectores y se plaquearon las bacterias
R a) El gen bio entra a los 10’ y el his a los 30’, por lo transformantes en ágar + MM + ampicilina + un ami-
tanto el gen bio se encuentra a 1/3 de la distancia entre noácido. Cada una de las colonias que crecieron en
F e his. b) Le creo, seguramente tiene un Hfr distinto estas placas fueron luego cultivadas en ágar + MM +
con el F integrado apuntando al revés y en otra posi- ampicilina obteniéndose los siguientes resultados:
ción. Nótese que la distancia entre his y bio es de 20’
16
Vector 1: Todas las bacterias que crecieron en e) De las bacterias transformadas con el vector 1
MM+Amp+Leu crecieron también en MM+Amp. todas las bacterias b+ también eran a+, pero sólo el
-De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Val el 60% de las a+ eran b+.
60% crecieron en MM+Amp. En cuanto a las bacterias transformadas con el vector
Vector 2: De las bacterias que crecieron en 2 el 55% de las bacterias b+ también eran a+, y el
MM+Amp+Leu+Lac, el 55% crecieron en MM+Amp 50% de las a+ eran también b+.
+Lac. La diferencia en los resultados obtenidos con ambos
vectores radica en que el vector 1 no contiene un pro-
Alu I Alu I motor por lo que la expresión de los transgenes se
P dará solo si vienen acompañados de su promotor. El
hecho de que todas las bacterias b+ sean también a+
nos indica que b se transcribe utilizando el promotor
de a sugiriendo que a y b forman parte de un operón.
En el caso del vector 2 dado que aporta un promotor
(y éste está encendido debido a la lactosa) sí se obtie-
nen bacterias a-b+.
AmpR AmpR f) Dado que, cuando se transformó con el vector 1, no
se obtienen bacterias a-b+ pero sí a+b- esto nos sugie-
P = promotor del operón re que no se necesita que se transcriba b para que se
Vector 1 lac Vector 2 transcriba a (pero sí al revés). Esto indicaría que a se
-De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Val+ encuentra más próximo al promotor que b.
Lac, el 50% crecieron en MM+Amp+Lac. g) RT-PCR usando primers de la región 5´ del gen a y
d) ¿Cuáles son los genotipos de las bacterias que cre- de la región 3´ del gen b. Si amplifico es porque hay
cen en cada uno de los 3 medios? transcriptos que contienen al gen a y al b. Hay otras
e) ¿Cómo interpreta los resultados de este experimen- posibilidades que se evaluarán caso por caso…
to? Demuestre que estos resultados son compatibles 5) Se realiza un experimento
con la hipótesis de que a y b están en el mismo de transformación con una Antibióticos Nº colonias
operón. cepa bacteriana donante re- A 1.156
f) ¿Cuál de los genes está más cerca del promotor: a o sistente a cuatro antibióti- B 1.148
b? Justifique. cos: A, B, C y D. La cepa C 1.161
g) ¿Cómo haría, utilizando la técnica de PCR, para receptora es sensible a las D 1.139
demostrar que a y b pertenecen al mismo operón? In- cuatro drogas. La población AB 46
dique los resultados esperados tanto si a y b forman de células receptoras tratada AC 640
parte de un operón como si se transcriben indepen- se divide y se siembra en AD 942
dientemente. placas de medios suplemen- BC 51
Respuesta a) a+ StrR = MM + Str + Val + Ile tados con varias combina- BD 40
b+ StrR = MM + Str + Leu + Ile ciones de las drogas. Los CD 786
c+ StrR = MM + Str + Leu + Val resultados fueron: ABC 30
b) a y b mapean a 12 min del OriT y C mapea a 6 min. a) Uno de los genes está cla- ABD 42
c) i) Se hubieran seleccionado a las bacterias dadoras ramente alejado de los otros
ACD 630
por lo que no hubiera habido diferencias entre los dis- tres, los cuales parecen estar
BCD 36
tintos medios ni tampoco entre los distintos tiempos. estrechamente ligados.
ii) Se hubieran obtenido muy pocas recombinantes ABCD 30
¿Cuál es el gen distante?
(aquellas en las que el plásmido F+ se hubiera incor- b) ¿Cuál es el orden de los Total 7.877
porado en la cepa dadora y luego los marcadores a, b tres marcadores que están ligados?
o c se hubieran transferido a la cepa aceptora). Rta: a) B es el gen distante; b) A D C.
iii) Dependiendo de la orientación del OriT hay dos 1) El Dr. Watson está estudiando un fago temperado
posibilidades: -que a y b salgan primero y bastante descubierto en su laboratorio (P26) con el objeto de
tiempo después salga c -que c salga primero y bastan- determinar si durante el ciclo lisogénico éste se inserta
te tiempo después salgan a y b. en el cromosoma bacteriano, y si lo hace en qué sitio.
En el gráfico tienen que quedar claro esto, y además Para ello infecta una cepa Hfr salvaje AmpS StrS con
que la frecuencia de recombinantes para los genes que un fago deficiente en el cual se ha reemplazado al gen
salen primero debe ser bastante mayor que la de los X (esencial para que el fago entre en ciclo lítico, pero
genes que salen al final. no para que entre en ciclo lisogénico) por un gen de
d) MM+Amp+Leu = a- b+ AmpR y a+ b+ AmpR. Es resistencia a ampicilina bajo el control del promotor
decir, b+ AmpR Lac (con su región operadora).
MM+Amp+Val = a+ b- AmpR y a+ b+ AmpR. Es a) ¿En qué medio de cultivo selecciona a las bacte-
decir, a+ AmpR rias Hfr que presentan el fago?
MM+Amp = a+ b+ AmpR Luego de seleccionar en medio sólido 15 clones Hfr
La lactosa no importa, sólo se usa para inducir la ex- lisogénicos y con el objetivo de determinar si el fago
presión mediada por el promotor lac. defectivo está integrado en el cromosoma y en qué
sito lo hace, conjuga, por separado, a cada Hfr lisogé-
17
nica con una cepa F- gal- leu- arg- AmpS StrR obte- más cerca (o más lejos) del sitio de integración del
niendo, en todos los casos, el mismo resultado: fago. Lo que sí debería ocurrir, es que en todos los
clones el gen de resistencia a ampicilina mapee cerca
Gal+
del gen leu.
Nº de recomb

arg+ Mutagénesis y Transposición


1) En levaduras, el tratamiento con mutágenos permi-
AmpR tió seleccionar, en forma independiente, varios tipos
de mutantes auxótrofas incapaces de utilizar galactosa
Leu+ como nutriente. El mapeo de las mutaciones respon-
sables de esta característica permitió clasificarlas en 2
grupos de ligamiento distintos (mendelianamente in-
10 20 30 40 50 60 t(min) dependientes).
b) ¿En qué medios seleccionó a cada uno de los ge- a) ¿Significa este resultado que los genes involucrados
notipos? se encuentran en 2 cromosomas distintos? ¿Por qué?
c) En base a los resultados obtenidos, ¿cuál de las b) ¿Cuál será el fenotipo resultante del diploide resul-
siguientes opciones es la correcta? tado del cruzamiento entre mutantes (haploides) per-
- el fago no se integra en el cromosoma bacte- tenecientes a distintos grupos de ligamiento? ¿Por
riano (queda como episoma) qué?
- el fago se integra al cromosoma en un único c) ¿Cómo serán las proporciones fenotípicas de las
sitio levaduras (haploides) derivadas de las ascosporas una
- el fago puede integrarse en varios sitios del vez producida la meiosis?
cromosoma bacteriano d) ¿Qué clase de mutagénesis es la más apropiada pa-
Justifique su elección y por qué descarta las de- ra este tipo de experimentos? ¿la producida por radia-
más. ción  (gamma) o por algún compuesto químico como
Otro investigador, intentó reproducir estos experimen- el EMS o la nitrosoguanidina? Justifique muy breve-
tos con una cepa Hfr de su laboratorio y el mismo fa- mente.
go defectivo que solicitó al Dr. Watson. Sin embargo, Respuesta: a) En principio sí, los grupos de ligamien-
en este caso el marcador AmpR mapeó a 10 min del to pueden comprender y extenderse más allá de 50 u
origen de transferencia. de recombinación y pertenecer al mismo cromosoma
d) ¿Le parece que esto contradice necesariamente [es decir, si bien 2 genes o marcadores pueden com-
los resultados del Dr. Watson y su respuesta de la portarse mendelianamente como independientes por
pregunta c? estar a más de 50 unidades de mapa, a través de otros
Nota: Las bacterias gal- no pueden utilizar galactosa marcadores o genes intermedios puedo incluirlos a
como fuente de carbono y energía, las bacterias leu- y ambos en el mismo grupo de ligamiento = cromoso-
las arg- no pueden sintetizar los aminoácidos leucina y ma. Sin embargo pueden existir 2 grupos de ligamien-
arginina respectivamente. to pertenecientes al mismo cromosoma si no tengo la
R: a) Debe seleccionarlas en medio mínimo, sin glu- suerte de encontrar marcadores o genes intermedios].
cosa (para que no haya represión catabólica) y con b) Protótrofa. Por complementación. [Si a es el alelo
IPTG o lactosa para inducir al operón lac y que se ex- mutante de A y b de B: Ab x aB  AaBb fenotipo
prese el gen de resistencia a ampicilina. El medio debe salvaje]
tener además ampicilina para matar a todas las bacte- c) 3 a 1, auxótrofas a protótrofas [¼ ab, ¼ Ab, ¼ aB
rias que no posean el fago. vs ¼ AB]
b) Gal +: MM + gal + arg + leu + Streptomicina d) Usualmente se utiliza algún mutágeno químico
Leu +: MM + glu + arg + Streptomicina (como EMS o nitrosoguanidina) que producen muta-
Arg+: MM + glu + leu + Streptomicina ciones puntuales y se pueden dosificar más fácilmen-
AmpR: MM + lac + leu + arg + Ampicilina + Strep- te. La radiación  produce rupturas, deleciones y re-
tomicina (ojo que la fuente de carbono debe ser lacto- arreglos cromosómicos groseros, por lo que sería me-
sa y no glucosa, por un lado para inducir al operón y nos conveniente.
por el otro para que no haya represión catabólica) 2) Se estudia el efecto de 2 conocidos mutágenos en
c) Si el fago P26 no se integrara al cromosoma de la levaduras: el etil metanosulfonato (EMS) y el bromu-
Hfr y quedara como episoma no sería transferido a la ro de etidio (EtBr) observando la frecuencia de apari-
cepa F- en el experimento de conjugación interrupida ción de petites (levaduras que forman colonias de cre-
y por ende no se detectaría bacterias AmpR (recordar cimiento mucho más lento que las normales o gran-
que el gen de resistencia a ampicilina está dentro del des, debido a un malfuncionamiento del sistema de
genoma del fago). Además podemos decir que el fago fosforilación oxidativa). A primera vista, los resulta-
se integra en un único lugar del genoma porque en los dos parecen similares ya que ambos mutágenos indu-
15 clones de Hfr lisogénicas generadas el marcador cen una abundante aparición de mutantes. Sin embar-
AmpR entró en el mismo tiempo. go, más del 99% de las mutantes obtenidas con EMS,
d) No contradice los resultados del Dr. Watson ni las segregaban en una proporción mendeliana de 50%
conclusiones sacadas ya que, al ser una cepa Hfr dis- grandes a 50% petites, al ser cruzadas con levaduras
tinta el origen de transferencia puede estar ubicado salvajes (grandes). Nota: recordar que las levaduras
18
son usualmente haploides y que los fenotipos descrip- cepa
tos se refieren a lo observado con ese nivel de ploidía.
En cambio, más del 90% de las mutantes obtenidas
con EtBr “segregaban” 100% de petites o 100% de
grandes. Es decir, a pesar de tener un parental petite y
un parental grande, la progenie era toda petite o toda
grande. ¿Cómo se explican estos resultados?
Solución: el EMS afecta, fundamentalmente a genes
nucleares (que pueden afectar a las funciones mito-
condriales para resultar en un fenotipo petite -no reali-
zan fosforilación oxidativa- porque éstas importan
ciertas proteínas codificadas en el núcleo) y el EtBr
tiene mayor especificidad por los genes mitocondria-
les que se heredan uniparentalmente.
3) En un estudio sobre mutaciones inestables de maíz,
un investigador propuso los siguientes genotipos para
dos plantas distintas de esta especie: ¿Qué conclusiones puede sacar acerca de:
I) C/cd ; Ac+/Ac- a) la(s) region(es) requerida(s) para la transposición y
II) C/ca ; Ac- /Ac-
region(es) no requeridas?
C: alelo silvestre que permite la expresión del color
b) ¿Por qué estos resultados son inesperados y se con-
del grano; cd: es un alelo inestable producto de la in-
serción de un elemento móvil no autónomo Ds que tradicen con lo que Ud. aprendió en la materia?
inactiva la expresión del gen. ca: es un alelo inestable c) la(s) regio(es) requeridas para NeoR?
producto de la inserción de un elemento móvil Ac Solución: a) Para la transposición: completo,
autónomo que inactiva la expresión del gen. Ac+ pre-
sencia/ Ac- ausencia del elemento móvil (atención que sólo el extremo izquierdo (aquella parte
esta nomenclatura es distinta a la empleada en algunos afectada en la mutante 135). b) Porque hubiera espe-
libros de texto). rado que TODO el hubiera sido imprescindi-
Se realizaron los siguientes cruzamientos: ble para la transposición. c) El gen NeoR (completo o
a) plantas con genotipos I y II se cruzaron con plantas
su extremo 5’) está ubicado en algún lugar entre el
c/c; Ac- /Ac-, en donde el alelo c representa una forma
mutante incolora, producto de una sustitución de ba- extremo derecho de y su región derecha ad-
ses. yacente (es decir, parte o todo el fragmento afectado
b) planta con genotipo I) se cruzó con planta con ge- por la deleción en la mutante 138). [Con los datos su-
notipo II). ministrados no puedo afirmar que TODO el gen NeoR
¿Qué fenotipos y en qué proporciones aparecerán en esté en ese segmento. Tampoco puede concluirse, con
la descendencia de los cruzamientos a) y b)? NOTA: estos datos, que haya una superposición entre parte
Asumir que Ac y C no están ligados, y que la frecuen- del gen y el IR izquierdo, pero resulta altamente sos-
cia de rupturas cromosómicas es despreciable. pechoso. Para confirmarlo, deberían hacerse mutacio-
Respuesta: a) I) ½ púrpuras, ¼ blancas, ¼ mosaico
nes dirigidas usando deleciones más pequeñas o susti-
II) ½ púrpuras, ½ mosaico; b) ¾ púrpuras, ¼ mosai-
tuciones nucleotídicas puntuales].
cos [Todos los genotipos C_, homo- o heterocigotas,
son púrpuras; la probabilidad de que un transposón 5) En un trabajo reciente (Mol Gen Genomics, 2006,
(por ej. del locus Ac) justo vaya a insertarse en un lo- 275: 231-241) un grupo japonés estudia la coloración
cus específico del genoma es extremadamente baja. de las flores en Gentiana scabra, una planta ornamen-
Todos los genotipos “dobles” recesivos (conteniendo tal muy difundida en Japón. Para ello analizan tres
c, cd o ca) son mosaicos si está ca_ o cd_, Ac+_] cultivares de G. scabra: cv. Momokorin (flores rosa-
4) Se confeccionaron varios mutantes del Tn5 me- das), la línea mejorada 13-98 (flores rosadas) y el cv.
diante ingeniería genética. El mapa y el fenotipo se Alta (flores azules); y G. triflora cv. Macyri (flores
muestra más abajo: grafica una deleción del azules). Primero, miden la acumulación de antociani-
DNA entre los extremos de la llave. grafica nas mediante HPLC de extractos obtenidos de los
un fragmento de 800 pb de DNA foráneo que se in- pétalos de las flores. Los perfiles de HPLC obtenidos
fueron los siguientes:
sertó en la posición O. Las capacidades del mutante de
transponerse y de resistir a neomicina (NeoR) se indi- a y d) cv. Alta: dos picos, uno mayor correspondiente
can a la derecha de cada mutante. WT significa wild a delfinidina y otro menor a cianidina.
b,c y e,f) Línea 13-98 y cv. Momokorin: un único pico
type (normal o salvaje). y indican correspondiente a cianidina
las regiones repetidas invertidas (IR) del Tn5. NOTA:
Para su respuesta suponga que entre los valores de la
tabla 90 y 100 o entre 0 y 0,5 no existen diferencias
estadísticamente significativas.
19
i) ¿Qué le indican estos resultados en cuanto a la de- ii) ¿Cuál fue el objetivo de los experimentos mos-
terminación bioquímica del color de las flores? trados en a y b?
iii) ¿Para qué se realizó la hibridación con F3’H?
iv) ¿Qué explicación molecular podría dar a los cam-
bios en el perfil de los transcriptos?
A continuación, a partir de ADN genómico de las
plantas amplifican fragmentos conteniendo el ORF
F3’5’H (ver parte c de la figura anterior):
v) ¿Cuál fue el objetivo de este experimento?
vi) ¿Qué evidencian estos resultados?
Los fragmentos de 4 kb y 3,3 kb fueron clonados y
secuenciados.
El fragmento de 4 kb de la línea 13-98 presentaba en
el exón 1 una inserción (a la que llamaron dTgs1) cu-
ya secuencia contenía un sitio blanco de duplicación
(TSD) de 8 pb y repeticiones terminales invertidas
(TIR) de 14 pb. La secuencia TIR presentaba una re-
gión palíndromica imperfecta y exhibía similitud par-
cial con un elemento dTph de petunia (el cual se sabe
que es reconocido por la transposasa Ac).
El fragmento de 3,3 kb del cv. Momokorin contenía
una inserción en el exón 1, a la que denominaron
La enzima clave en la biosíntesis de delfinidina es la GsTRIM. Esta secuencia presentaba repeticiones di-
flavonoidil 3’5’- rectas terminales (TDR). Esta inserción no contenía
hidroxilasa secuencias que codificaran para alguna proteína. Asi-
(F3’5’H) que mismo, presentaba similitud con secuencias de Lotus
cataliza la japonicus, designadas LjTRIM.
hidroxilación en vii) ¿Qué le permiten confirmar estos datos de se-
5’ del anillo B cuencia? ¿Cuál es entonces la explicación para los
del esqueleto de diferentes fenotipos observados?
la antocianina. Como los elementos TRIM fueron identificados a par-
La expresión tir de análisis de bases de datos de secuencias nucle-
génica de esta otídicas y mostraron la peculiaridad de estar conser-
enzima se mues- vados en distintas especies de plantas, realizaron un
tra en la siguien- análisis filogenético empleando las secuencias TDR y
te figura: usando los programas CLUSTAL W y TREEVIEW.
a) Análisis de El árbol obtenido se muestra a continuación:
Northern blot
usando RNA
total de pétalos
de los tres culti-
vares de G. sca-
bra. La mem-
brana fue hibri-
dada con cada
una de las son-
das correspon-
dientes a los genes F3’5’H y F3’H (codifica para una
enzima que cataliza la hidroxilación en 3’ del anillo B
de flavonoides). rRNA: control de cantidad de RNA
ribosomal teñido con bromuro de etidio. vii) ¿Qué puede concluir del agrupamiento mostrado
b) Análisis de RT-PCR para amplificar el ORF de en el árbol?
F3’5’H usando RNA total extraído de pétalos. Los viii) Sugiera un experimento simple para analizar la
números a la derecha indican los tamaños de los existencia de los elementos dTgs1 y GsTRIM en el
fragmentos amplificados. genoma de otras especies de Gentiana.
Nota: por 3’RACE amplifican transcriptos menores a Rta: Aclaración: Las gentianas rosadas vienen siendo
1,4 kb en la línea 13-98 obtenidas por mejoramiento a partir de mutaciones
c) Análisis de PCR para amplificar la secuencia espontáneas a partir de gentianas azules, pero el/los
genómica de F3’5’H con los iniciadores empleados mecanismo/s involucrado/s eran desconocido/s hasta
para la RT-PCR. Los números a la derecha indican lo el momento.
mismo que en b. i) Estos resultados indican que hay diferencias en la
acumulación de las distintas antocianinas en ambas
20
plantas (azules y rosadas), en particular, las plantas vii) Al inicio del problema, en el enunciado, se in-
rosadas carecen de delfinidinas. Pero la acumulación dica que también disponen de G. triflora cv. Macyri.
de cianidinas es similar para ambas. Por lo tanto, el experimento sería hacer Southern blot
ii) Como los autores saben que la F3’5’H es la enzima de ésta conjuntamente con las 3 plantas analizadas de
clave en la síntesis de delfinidina y viendo los resulta- G. scabra e hibridar con dTgs1 y GsTRIM1 (Sout-
dos anteriores, analizan si hay diferencias en cuanto a herns separados, obviamente) y observar la aparición
la expresión del gen para esta enzima entre los dos de muchas bandas (esto mostraría que, como la ma-
tipos de plantas y analizan si esto podría explicar los yoría de este tipo de transposones, son miembros de
fenotipos observados. una familia de alto número de copias, y que están dis-
iii) La hibridación con F3’H es usada como control. tribuidos por todo el genoma de Gentiana).
Tanto en plantas azules como rosas se obtiene el mis- 6) Un investigador está estudiando el mecanismo de
mo patrón de expresión. Es otra enzima involucrada transposición del transposón X de ratón. Para ello,
en la síntesis de pigmentos pero que produce otro partiendo de la secuencia salvaje del transposón, in-
compuesto (que no tiene nada que ver con las delfini- serta una construcción entre el gen pol y el LTR de la
dinas, si bien pertenece a la misma ruta biosintética). derecha, que contiene:
También prueban con otros genes relacionados con la EcoRI EcoRI
síntesis de flavonoides y ven que exhiben los mismos
patrones que la F3’H pero esto tampoco lo muestran  
Intron
en el trabajo original. LTR pol gag C LTR
iv) Los resultados evidencian que:
No se observa transcripto de F3’5´H para la planta
Promotor
rosada, línea 13-98 tanto por Northern blot como por
RT-PCR (Aclaración: los primers para esta RT levan- - al gen C, cuya expresión le confiere color marrón a
tan el ORF por completo, full length). Además se los ratones.
aclara que por 3´RACE obtienen fragmentos menores - el promotor del gen C interrumpido por un intrón
a 1,4 kb. haciéndolo no funcional
Para la planta rosada cv. Momokorin, el transcripto de Partiendo de ratones albinos, genera ratones trans-
F3’5´H es de tamaño mayor que el observado para la génicos heterocigotas para dicha construcción (es de-
planta azul cv. Alta (Northern). Por RT-PCR este cul- cir, los ratones tienen una sola copia del transposón
tivar muestra dos fragmentos de 1,3 y 2,1kb que difie- recombinante).
ren del de 1,6kb observado para la planta azul. a) Detalle el fenotipo de dichos ratones en cuanto al
En conclusión: ninguna de las plantas rosadas acumu- color de piel y presencia o ausencia de manchas:
lan el transcripto de tamaño normal esperado (1,6kb) i) si se trata de un retrotransposón, ii) si se trata de un
v) El objetivo de este experimento fue examinar la transposón
estructura del gen para F3’5´H en estas plantas a partir Justifique su respuesta. A M
de amplificación sobre el ADN genómico de las mis- Los ratones resultaron albinos con algu-
mas, para ver si existen diferencias que puedan expli- nas manchas marrones. A partir de biop-
car los resultados a nivel de transcriptos. sias de piel, se extrajo ADN, se digirió
vi) Se obtienen fragmentos de amplificación de distin- con EcoRI y se realizó un Southern blot
to tamaño para las distintas plantas. Estos resultados utilizando como sonda el cDNA de
muestran que el cv. Alta (azul) muestra un fragmento “pol”.
de 2,8kb mientras que para la línea 13-98 y el cv. b) Esquematice los resultados esperados del Southern
Momokorin (rosadas) las bandas son 1,2 y 0,5kb mas si las biopsias se tomaron a partir de porciones albinas
grandes, respectivamente (sus tamaños eran 4 y 3,3 de la piel, y si se tomaron a partir de zonas marrones.
kb, respectivamente). Es probable que en el gen de las Justifique.
plantas rosadas haya alguna inserción. c) ¿Cómo explica el hecho de que algunas manchas
vii) Estos resultados, dadas las similitudes de las se- marrones resultaron grandes y otras pequeñas?
cuencias con elementos transponibles, evidencian que R) a) i) En aquellas células donde no ocurra transpo-
las inserciones observadas corresponderían a transpo- sición el color de la piel será albino ya que al estar
sones (dTgs1 y GsTRIM1). La explicación para los interrumpido el promotor de C y no ser funcional el
diferentes fenotipos observados es que estos transpo- gen C no se expresará.
sones interrumpen la secuencia del gen, resultando en En caso de que se trate de un retrotransposón, este
transcriptos anormales (o ausencia de transcripto) que transposón pasará por un intermediario de RNA. En
no permiten la síntesis de la enzima F3’5´H y por lo dicho intermediario podrá ocurrir el splicing del intrón
tanto no se sintetizan el pigmento que produce la colo- de la construcción y al retrotranscribirse a DNA e in-
ración azul (delfinidina). tegrarse en algún lugar del genoma del ratón se rege-
vii) Los resultados claramente muestran que GsTRIM1 nerará el promotor de C. En aquellas células de la piel,
y LjTRIM se agrupan juntos y apartados del resto de derivadas de aquellas donde ocurrió la retrotransposi-
los TRIMs reportados previamente, indicando que ción, se expresará el gen C dado parches de color
estos dos transposones son evolutivamente diferentes marrón.
de los otros elementos TRIM de plantas. ii) En este caso el intrón no se eliminará nunca (ya
que la maquinaria que elimina intrones los elimina del
21
RNA y no del DNA) por lo que el promotor nunca Fig 1: Promedio de unidades formadoras de placa
será funcional, aún cuando haya transposición. Por lo (pfu) para NNK, NNN y un control no tratado. Se gra-
tanto los ratones deberían ser íntegramente albinos. fican los desvíos estándar. Un asterisco simple impli-
b) En las zonas blancas de la piel no ocurrió transpo- ca P < 0.05 usando el Mann–Whitney U-test versus el
sición por lo que debería ver una sóla banda corres- control correspondiente. El doble asterisco (**) de-
pondiente al tamaño del fragmento incluyendo el nota P < 0.01. liver, hígado; lung, pulmón; O.T., te-
intrón. jido oral; esoph., esófago; tongue, lengua; kidney,
En las zonas marrones de la piel si ocurrió retrotrans- riñón; cont., control .
posición y se eliminó el intrón. Por este motivo deber- a) ¿Qué ventajas (en términos temporales) tiene este
ía ver dos bandas una incluyendo el intrón (el retro- método comparado, por ejemplo, con cuantificar el
transposón original no se elimina) y otra sin el intrón. desarrollo de tumores en los ratones, si es esto último
c) Las manchas grandes se deben a eventos de trans- es lo que interesa en última instancia?
posición que ocurrieron temprano en el desarrollo (y b) En base a los resultados ¿diría que las nitrosaminas
por ende dieron lugar a una porción grande de la piel) de tabaco son mutagénicas? ¿Por qué?
mientras que las manchas pequeñas se deben a even- c) Dado que la ingestión de agua sin nitrosaminas
tos de transposición que ocurrieron de forma más tard- (control) resulta en valores significativamente distin-
ía. tos de cero ¿sospecharía que en el experimento hay
7) NNK y NNN son nitrosaminas presentes en el ta- algún otro mutágeno que no se está controlando o que
baco y en el humo de cigarrillo, conjuntamente con es mutagénica el agua y que pueda afectar la validez
otros potentes carcinógenos y se sospecha que tienen del experimento?
un rol primario en el cáncer de pulmón, boca y otros d) A partir de los resultados ¿Considera que existe
sitios. Por otro lado, se cree que el té verde podría especificidad de tejido o no? ¿Se condicen estos resul-
funcionar como quimioprotector, debido a la presen- tados con las evidencias epidemiológicas previas que
cia de antioxidantes fenólicos que actuarían en los indican que pulmón, esófago y boca son los que mues-
pasos dependientes de replicación que ayudan a fijar tran mayor incidencia de carcinogénesis por efecto del
las mutaciones como parte del desarrollo oncogénico. cigarrillo?
Pressentin y col (2001) estudiaron genotoxicidad de e) Una de las ventajas de este sistema de detección es
NNK y NNN utilizando ratones transgénicos para que se puede aislar fácilmente DNA de las placas
lacZ (sistema Mutamouse) a los cuales suministraron transparentes y secuenciarlo. ¿Qué información apor-
NNN, NNK y/o té verde en el agua de bebida durante taría esto último?
tiempos y condiciones controladas. Después de los Posteriormente, se realizaron experimentos suminis-
tratamientos, extrajeron DNA de los órganos de in- trando una infusión de té verde, con los resultados que
terés, se lo empaquetó con un extracto con cápsides de se muestran en la Fig 2:
fago λ y se infectaron bacterias, las cuales se plaquea-
ron. Se investigaron, además de los órganos que des-
arrollan cáncer con mayor frecuencia en fumadores, al
hígado y al riñón porque se reportó que estos com-
puestos son metabolizados y excretados por vía urina-
ria en los fumadores (se sabe hace mucho que la orina
de fumadores es mutagénica). En la figura 1 se cuanti-
fican la cantidad de placas (playas de lisis) transparen-
tes sobre el total (azules + transparentes).

Fig. 2. Igual que en la Fig. 1. Las diferencias denota-


das por asteriscos son entre NNK y NNK+T. NNK+T:
NNK + té verde.
f) Indique y justifique si le recomendaría tomar té
verde a un fumador (aunque no le guste) en vez de
aconsejarle que deje de fumar.
Respuestas:
a) Porque esperar a que desarrollen tumores lleva, por
lo menos, varias semanas. Este método es más rápido.
22
b) Sí, en todos los casos, salvo la NNK en lengua, Preguntas :
porque los valores de PFU son significativamente di- a) Interprete los resultados numéricos
ferentes a los controles. b) ¿En qué etapa del desarrollo ocurren los eventos
c) No necesariamente, porque estos valores pueden que dan a origen a la progenie con ojos rojos ?
estar reflejando las frecuencias de mutación espontá- c) En este tipo de cruza también aparecen individuos
nea o basal. Aún en el caso de que hubiera otro mutá- con ojos blancos con manchas rojas (fenotipo
geno adventicio, las diferencias son estadísticamente mosaico). ¿Cómo justifica estos resultados? ¿En qué
significativas, validando así el experimento. etapa del desarrollo ocurrieron los procesos que
d) Sí, porque el órgano más afectado fue el hígado y originaron los ojos mosaico?
los demás lo hicieron en menor grado. No, por lo an- d)Las hembras mosaico presentan un mayor número
tedicho. Podría especularse que existe un efecto dife- de manchas rojas que los machos mosaico. ¿Cual es la
rencial por la vía de entrada. La vía de ingreso de las causa ?
nitrosaminas (oral en vez de pulmonar) podría ser un Solución:
causal de esta diferencia. Para demostrarlo, habría que Super familia mariner Tc1
suministrar las nitrosaminas por aspiración en una IR IR
atmósfera de humo y comparar los resultados.
e) Aportaría información sobre el mecanismo mole- 50-28 pb 1000 50-28 pb
cular de mutación (transiciones, transversiones, indels, trasposasa
etc) D. mauritiana: especie endémica hospedador de mari-
f) Las diferencias significativas indican que el té ver- ner: IR tr + IR
de sería un quimioprotector en todos los tejidos eva- mariner (wt)
luados salvo en esófago y lengua. Sin embargo, no
evita por completo la genotoxicidad en las condicio- IR tr - IR
nes ensayadas. Por lo tanto, no reemplaza el efecto peach
benéfico de dejar de fumar.
8) Recientemente, un grupo de investigadores
estudiaron los mecanismos de regulación del elemento IR tr + IR
transponible mariner, que está presente en genomas hsp
de invertebrados, hongos y humanos. Ellos obtuvieron a) hsp/+ ; +/+
un macho transgénico que tenía reemplazado un 25 ºC, 8%: actividad basal que induce la síntesis de tr,
fragmento del gen white, localizado en el cromosoma que actúa en trans sobre white interrumpido por pe-
X, por otro homólogo, pero interrumpido por un ach
mariner cuya transposasa no era funcional. Esta 37 ºC, 17%: idem, pero con promotor inducido
variante de transposón con transposasa no funcional 25 ºC: hsp/+; hsp/+
se denominó peach. El gen white codifica para un 37 ºC: 18% y 48%: análogo a la progenie de los otros
pigmento rojo del ojo y cuando está mutado por parentales pero con doble dosis de tr y trasposasa.
inserción, no se expresa y los ojos resultan blancos. +/+ ; +/+ : valores basales en ausencia de tr. 1% puede
Por sucesivas cruzas, se obtuvo una población de ser casual, retromutación debería ser 0%.
machos y hembras con todos sus cromosomas X b) Durante el desarrollo del embrión, etapas tempra-
conteniendo el gen white interrumpido por peach. nas
Por otro lado, se logró una construcción denominada c) Desarrollo embrionario, estado multicelular del de-
hsp, en la que el elemento mariner salvaje se puso sarrollo del ojo. La transposición que elimina a peach
bajo la regulación del promotor del gen de la proteína de white ocurrió varias veces.
hsp70 (heat shock protein), que es inducible por calor. a) La doble dosis del X en las hembras duplica la
Esta segunda construcción se introdujo en uno de los probabilidad de la transposición respecto a los ma-
cromosomas del par 2 de moscas transgénicas que ya chos, que tienen una sola dosis del X.
eran peach, obteniéndose moscas hsp/+.
Alteraciones cromosómicas y cromosomas
Se realizaron cruzas entre moscas transgénicas peach,
en las que uno de los parentales tenía 1 dosis de hsp 1) El caballo (Equus caballus) tiene un complemento
(hsp/+) y el otro parental, ninguna (+/+) . Se contó el diploide de 64 cromosomas, de los cuales 36 que son
porcentaje de la progenie, criada a 25ºC (actividad acrocéntricos. El burro o asno (Equus asinus) tiene 62,
basal de hsp) o a 37ºC (actividad inducida de hsp), de los cuales 22 son acrocéntricos.
que exhibía ojos rojos. a) Indique el número (diploide) de cromosomas que
tendrá el híbrido interespecífico (la mula)
Genotipo del Temp. % de progenie
b) ¿A qué atribuye la usual esterilidad (incapacidad
cromosoma 2 con ojos rojos
de producir gametas viables) de la mula?
de los padres
R: a) Las gametas de los caballos tendrán 32 cromo-
hsp/+ ; +/+ 25 8 somas (la mitad de 64) y las de los burros 31  32
37 17 +31 = 63 (¡el “2n” de la mula es impar!).
hsp/+ ; hsp/+ 25 18 b) A los problemas de apareamiento y segregación
37 48 meiótica derivados de cromosomas tan disímiles y de
+/+ ; +/+ 25 1 número impar
37 2
23
2) Describa un ejemplo de alteración cromosómica bandeo mostradas por las llaves).
estructural que afecte la fertilidad en individuos hete- a) ¿Cual fue el origen de esta anomalía y qué nombre
rocigotas para la alteración. Justifique brevemente su recibe?
respuesta. b) En caso de examinar la gametogénesis de este indi-
Respuesta: Cualquiera de los ejemplos de alteracio- viduo ¿esperaría observar alguna peculiaridad durante
nes estructurales que dio Liliana o figuran en los li- la meiosis? ¿Cuál?
bros (translocaciones recíprocas, por ejemplo) que c) ¿Podría implicar una reducción en la fertilidad de
impliquen la formación de configuraciones meióticas las gametas? ¿Por qué?
como trivalentes, tetravalentes, etc. y que afecten la Respuesta: a) Translocación no recíproca) 7:21
correcta migración de los cromosomas en la anafase b) Sí. Polivalentes formados entre el 7, el 21 y el 21
meiótica. La inclusión de algún esquema reemplaza translocado
buena parte de la explicación. c) Sí, como consecuencia de lo descripto en b) se
3) Se desea localizar en qué cromosoma se localiza el afectaría la migración a los polos provocando aneu-
locus para un marcador molecular de tipo codominan- ploidías capaces de inviabilizar las gametas
te (microsatélite) ligado a un carácter de interés 5) Un investigador trató con colchicina las famosas
agronómico (QTL). La especie vegetal tiene un núme- arvejas de Mendel y obtuvo los tetraploides corres-
ro diploide de 2n=10 cromosomas y se dispone de la pondientes. Por otro lado, también introdujo un
serie monosómica completa. Se cruza una planta transgén proveniente del trigo que estabiliza una for-
disómica homocigótica (muestra una banda de 200 ma de herencia diploide evitando la formación de po-
pb) por cada uno de los diferentes monosómicos todos livalentes (por ej. tetravalentes) que puedan distorsio-
los cuales muestran una banda de 180 pb. Algunos de nar la meiosis. Luego repitió los cruzamientos arvejas
los descendientes muestran ambas bandas (200/180 de flores blancas por arvejas de flores rojas. ¿Qué
pb) y otros sólo una (la de 200 pb). Las descendencias proporciones de plantas con flores blancas y rojas ob-
obtenidas se desglosan en la tabla clasificadas de tuvo en la F2? Describa los genotipos simplificados de
acuerdo a su constitución cromosómica, es decir si dicha F2, de la F1 que le dio origen y de los parentales
poseen 9 cromosomas (es decir, monosómicas) o 10 poliploides (usar guiones bajos para ejemplificar casos
cromosomas (disómicas, ver columna 1) y a su patrón en que ambas variantes genotípicas resultan en fenoti-
de bandas (columnas 2 a 5): pos equivalentes)
Descendencia de los 5 cru- Respuesta más correcta:
Cromosoma en zamientos analizados a) 15 a 1; P: AAAA x aaaa  F1: AaAa  F2. 15
condición mo- A___ 1 aaaa o
Disómicos Monosómicos
nosómica Respuesta menos correcta:
200/180 200 200/180 200
1 140 0 139 0 b) si se interpreta que todos los bivalentes posibles se
2 97 0 93 0 pueden formar (al azar) la frecuencia de individuos
3 193 0 0 196 aaaa en la F2 es 1/ 36 (1:35)
4 58 0 57 0 6) En un reciente trabajo de Learmonth y colaborado-
res se estudiaron los efectos a largo plazo de las artro-
5 158 0 145 0
plastías (injerto o reemplazo de partes óseas por próte-
Explique los resultados obtenidos e indique en qué sis metálicas) que generan debris (restos) en linfocitos
cromosoma se localiza el marcador molecular. de sangre periférica. Estos restos metálicos se suelen
Solución: Si el locus no está en un cromosoma cual- alojar en las adyacencias de la prótesis, ganglios linfá-
quiera de los que se encuentran en 2 copias (es decir ticos, hígado y páncreas. Para ello realizaron hibrida-
no está en el monosómico) tendrá una segregación 1:1 ción in situ (FISH: preparados cromosómicos a los
mendeliana normal y todos sus descendientes serán cuales hibridaron) con sondas específicas del cromo-
heterocigotas 200/180. Si el locus está en el cromo- soma 1 marcadas con un fluoróforo (rodamina) que lo
soma crítico lo que realmente estamos cruzando es tiñe específicamente de rojo, contrastando con el color
200/200 x 180, y de esta descendencia, los individuos azul del resto de los cromosomas (teñidos con DAPI).
con 9 cromosomas serán 200 y los de 10 cromosomas Observaron que cuando se utilizan prótesis con cro-
serán 200/180. Si observamos la tabla vemos que este mo-cobalto se observa un aumento de 3,5 veces de
razonamiento se compatibiliza con los resultados del conformaciones cromosómicas del tipo de la figura 1
cromosoma 3. y 2,5 veces de las de la fig. 2 respecto a la utilización
Por ej. para el cromosoma 1: 200/200 x 180/180  de prótesis de acero inoxidable.
todos 200/180 (sean mono- o disómicos) a) Defina el tipo de mutaciones cromosómicas estruc-
Para el cromosoma 3: 200/200 x ---/180  50% turales y numéricas detectadas en las figs. 1 y 2.
200/180 (disómicos) y 50% ---/200 (monosómicos) b) En el trabajo se hizo un especial esfuerzo para que
4) En una enferme- el muestreo realizado se independizara de factores
dad genética huma- como el hábito de fumar, el número de radiografías,
na se observa la si- etc. ¿Por qué?
guiente conforma-
ción cariotípica de
los pares de cromo-
somas 7 y 21 (notar
las similitudes de
24
a) Indique a qué conclusiones llegó el investigador.
Detalle los genotipos en los cruzamientos realizados,
Fig. 2 la dominancia de los alelos y los resultados del ma-
peo.
Por otro lado, al cruzar los helechos de la tribu 1 con
los de la tribu 3, suponiendo que iba a lograr los mis-
Fig. 1 mos resultados, se sorprendió al obtener otro resulta-
do. La F1, fenotípicamente igual al parental de la tribu
1, presentó 300 gametas de los siguientes tipos:
v1b1t1 141 v3b3t3 v1b3t3 v3b1t1 11
134 14
Al estudiar más detalladamente encontró que la F1 era
menos fértil que sus padres (los helechos nativos de
c) De acuerdo a lo que muestra este trabajo. En prin- cada tribu presentaban una fertilidad similar)
cipio, las prótesis de cromo-cobalto inducen mutacio- b) Explique todos los resultados obtenidos, realizando
nes ¿somáticas o germinales? Es decir, ¿podrían au- un esquema que muestre claramente qué se observaría
mentar la probabilidad de que se produzcan malfor- en paquitene de la F1 y la ubicación relativa de los
maciones genéticas en la descendencia de estos pa- loci, con sus distancias.
cientes? RESPUESTA
d) En este trabajo solo se examinaron mutaciones de a) Los helechos cultivados en tribus distintas son
tipo estructural y no aquellas de tipo puntual? ¿Se le homocigotas. Por lo tanto el cruzamiento es
ocurre algún modelo experimental (no humano) para V1b1t1/v1b1t1 (tribu1) X v2b2t2/v2b2t2 (tribu 2).
estudiar este aspecto. ¿Le serviría este modelo para La F1 es heterocigota y vemos que los rasgos de la
contestar con más certeza la pregunta c)? tribu 1 son todos dominantes. Al analizar las distan-
Rta a) traslocación y aneuploidía (triploidía) del cro- cias llegamos a
mosoma 1
b) Porque son otros factores mutagénicos comproba- VBT V-B V-T B-T CANTIDAD
dos que también aumentan la tasa de mutaciones y 111 P P P 87
podrían interactuar sinérgicamente (o no) con el factor 222 P P P 79
que estoy estudiando. 121 R P R 19
c) Somáticas. En principio, no. (los debris no se acu- 212 R P R 21
mulan en tejidos reproductivos) 112 P R R 77
d) Los sistemas basados en ratones transgénicos vistos 221 P R R 80
en clase de problemas injertados con prótesis o inyec- 122 R R P 15
tados con debris metálicos en sangre, analizando dis-
tintos tejidos incluyendo el reproductivo. Pueden con- 211 R R P 22
testar otros sistemas como pueden ser los de inter- VB: P= 323, R= 77 =>19,25 cM (20 es aceptable)
cambio de cromátides hermanas (por ej) pero este sis- VT: P=206, R= 194=> 48,5 No ligado
tema no detecta tan bien mutaciones puntuales sino las BT: P=203, R= 197 =>49,25 No ligado
cromosómicas o el test de Ames pero no podrían VB están a 20 u.m., T está en otro cromosoma o en el
examinar tejido reproductivo. mismo, pero muy alejado.
7) Un investigador está estudiando la genética de una b) Acá desaparecen fenotipos. Hay transtornos de fer-
especie de helecho denominado “Verdecitus bonitus, tilidad. Al analizar los resultados tenemos:
cultivada hace siglos por los indígenas del Amazonas. VBT V-B V-T B-T CANTIDAD
Le llama la atención que en una tribu (que llamaremos 111 P P P 141
1) todos los helechos son de hoja verde brillante (v1), 333 P P P 134
de borde liso (b1) y textura aterciopelada (t1), mien- 133 R R P 14
tras que en dos tribus del otro lado del río (que lla- 311 R R P 11
maremos 2 y 3) los helechos son opacos (v2), de bor-
VB= P= 275 R=25 => 25/300  0,0833 (aprox 8,3
de festoneado (b2) y textura ríspida (t2). Decide estu-
cM)
diar si los helechos de las distintas tribus pertenecen
VT todos parentales.
realmente a la misma especie y cuál es la dominancia
BT mismo resultado
entre los rasgos. Al cruzar los helechos de la tribu 1
Lo más probable es que haya ocurrido una transloca-
con los de las 2 obtiene una F1 integrada por helechos
ción. Entonces, lo que estamos midiendo (8,33cM) es
v1, b1 y t1 y sin problemas de fertilidad. Decide en-
la distancia entre V y el punto de la translocación. (F1
tonces que es válido considerarlas de la misma especie
es heterocigota estructural)
y decide mapear los loci estudiados. Analiza para ello
Es importante que expliquen que los trastornos de fer-
400 gametas producidas por la F1 y encuentra los si-
tilidad se deben a que las gametas cuya segregación
guientes resultados:
no es alterna no prosperan.
v1b1t1 87 v2b1t2 21 v1b2t2 15 Tienen que realizar el siguiente esquema y marcar que
v2b2t2 79 v1b1t2 77 v2b1t1 22 probablemente la distancia entre V y B siga siendo 20,
v1b2t1 19 v2b2t1 80
25
pero la distancia entre V y el punto de translocación es la distancia de T a los emás no modificaría la dis-
8,33 tancia entre V y B.
(V y B pueden ser intercambiables.) Por otro lado, tampoco es válida una deleción. Prime-
Si la translocación no ocurre “cortando” el espacio ro, porque si no es muy grande no debería ocasionar
entre V y B no cambian las distancias entre ellos, que transtornos en la fertilidad. Segundo porque aún si
es lo que pasa en el problema. Por lo tanto, esas op- cambia la frec de recombinantes ebtre V y B no cam-
ciones se descaetan- Igualmente, las gametas resul- biaría T, que seguiría estando no ligado.
tantes de quiasmas entre B y la translocación o entre t En el caso en que los tres loci estén en el mismo cro-
y la translocación son desbalanceadas. Sólo las re- mosoma (T bien lejano) sí es válido considerar que
combinantes entre V y la translocación son completas. una de las tribus tiene invertido V-B respecto a la otra.
En ese caso las gametas parentales y las recombinan-
tes entre V y el punto de inversión son las únicas via-
bles.
8) Usted trabaja en un hospital, en la división de Cito-
genética. Dos familias con padres de fenotipos com-
pletamente normales recurren a usted pues entre sus
descendientes tienen una hija que presenta Síndrome
de Down. Este síndrome se produce por tener 3 copias
del cromosoma 21.
Flia Madre Padre Hija enferma
1 46, XX 46, XY Down
2 45, XX, +T (14q. 21q) 46, XY Down
a) ¿Cuál es el cariotipo de las hijas de cada familia?
b) ¿Cómo es posible que la madre de la familia 2 ten-
ga fenotipo normal?
En la meiosis de la madre de la familia 2 se producen
trivalentes y en la posterior segregación dos cromo-
somas del trivalente, al azar, migran a un polo y el
Esas corresponden al 8,33- restante al otro.
Este esquema es uno de los posibles, ya que no hace c) Para cada uno de los 3 casos descriptos indique en
falta que los marcadores v y t estén en el mismo cro- la meiosis de qué parental se produjo la falla y en qué
mosoma, sólo es necesario que la translocación se dé fase de la misma. Mencione todas las posibilidades.
entre esos dos cromosomas. Esta es otra opción: d) Para cada familia indique si la probabilidad de te-
ner otro hijo con Down es alta o baja. Justifique.
Respuesta:
a) Hija 1: 47, XX, +21
Hija 2: 46, XX, -14, +T (14q . 21q)
b) El cromosoma 14 y el 21 son acrocéntricos por lo
que en la fusión, con pérdida de los brazos cortos, po-
siblemente se perdieron pocos genes. La madre de la
familia 2 tiene 45 cromosomas: dos de cada par, un
cromosoma 14, un cromosoma 21 y uno translocado.
Salvo para los genes de los brazos cortos del 14 y el
21 hay 2 copias de cada gen. Los genes de los brazos
cortos del 14 y 21 quedan en hemicigosis (están en las
copias normales) pero si son pocos puede que el feno-
tipo de la madre sea normal.
c) Familia 1: Los padres tienen genotipo normal por lo
que lo más probable es que no haya ocurrido disyun-
ción para el cromosoma 21 en la anafase I o la anafase
II durante la formación de gametas en el padre o en la
madre.
Familia 2: La madre presenta una fusión entre el cro-
mosoma 14 y el 21. Como resultado de esto en meta-
fase I se forma un trivalente por lo que en anafase I
puede haber una segregación desbalanceada de cro-
Si plantearon que T está en un cromosoma distinto, la mosomas.
única opción es la translocación. La inversión entre V d) Familia 1: La no disyunción es una falla que ocurre
y B no modificaría a T, por lo tanto VT y BT seguir- al azar por lo que, teniendo en cuenta factores de ries-
ían dando no ligados. go como edad de los padres, etc., la probabilidad de
La fusión (los 3 cromosomas en el mismo cromoso- que tengan más hijos con el Síndrome de Down son
ma) no es una opción porque, si bien podría modificar
26
bajas, o por lo menos similares a las de cualquier otra que se produzcan dos eventos de translocación recí-
pareja. proca.
Flia 2: 1/6 de las gametas darán lugar a descendientes c) Incorrecta. White sí está ligado al sexo pero la pro-
con Sín-drome de Down. Es decir tiene una alta pro- porción es de ½.
babilidad de tener otro descendiente Down (que en d) Incorrecta. La proporción esperada de machos con
realidad dentro de los hijos nacidos vivos es más de ojos wild type entre los machos de la descendencia es
1/6 ya que los casos resaltados en rojo no son viables, de ½. Ejemplifico el caso en que hubiese habido una
y el último caso generalmente tampoco). translocación recíproca entre w+ y e+.
10) Cuando se cruzaron dos plantas pertenecientes al Gametas que produce la hembra translocada:
mismo género, pero de diferentes especies, los híbri- Gametas
dos F1 presentaron mayor viabilidad y tuvieron más
flores. Desgraciadamente, estos híbridos fueron estéri-
les y sólo se pudieron propagar mediante injertos ve-
getativos. Explique la esterilidad de los híbridos.
Cómo podría el horticultor intentar anular la esterili-
dad. Explique los resultados que obtendría.
Rta.
La esterilidad se debe a que, como son especies dife-
rentes, los cromosomas no son homólogos, sino ½ Machos
homeólogos. Por lo tanto no se forman bivalentes, o w+ y hete-
sólo se forman pocos bivalentes y muchos univalen- rocigota
tes, la meiosis es irregular, y no se producen gametas
para e
viables (balanceadas).
Para anular la esterilidad se puede tratar con colchici- ½ Machos w
na, lo que produce una duplicación del número de y homocigo-
cromosomas. Esto da por resultado un alotetraploide
(o anfidiploide), en el cual se forman todos bivalentes, ta para e
la meiosis es regular y las gametas son balanceadas. Gametas que produ-
9) Se realiza el siguiente cruzamiento entre moscas ce el macho:
(Drosophila melanogaster). Una hembra heterocigota
para los siguientes caracteres: vestigial (vg) mutación
recesiva ubicada en el cromosoma II, white (w) muta-
ción recesiva ubicada en el cromosoma I (que es el X)
y ebony (e) mutación recesiva ubicada en el cromo-
soma III es cruzada con un macho recesivo para los
tres caracteres. Se obtuvieron los siguientes resulta- Genética cuantitativa
dos, siendo que toda la descendencia (sean machos o 1) La longitud media internodal en espigas de cebada
hembras) presentaron los siguientes fenotipos: de la variedad gran cervecera es de 4,24 mm (con
vg+ e+ w+ : vg e+ w : vg e w : vg+ e w+ baja variancia). En la variedad imperial la media in-
JUSTIFIQUE si las siguientes afirmaciones son co- ternodal es de 6,34 mm (con baja variancia). La media
rrectas (o no): de la F1 de un cruce entre las dos variedades tiene,
a) No se observan recombinantes entre vg y w, lo que aproximadamente, 5,4 mm (con baja variancia). La F2
puede deberse a la existencia de una inversión que da también 5,4 mm pero con un rango de variación
involucre a ambos genes. continuo desde un extremo parental al otro (alta va-
b) No se observan recombinantes entre vg y w lo que riancia). El análisis de la progenie de la autofecunda-
puede deberse a la existencia de una o más transloca- ción de cada uno de los individuos de la F2 mostró 3
ciones recíprocas. distribuciones entre sus descendientes: i) tipo gran
c) Entre los machos de la descendencia, la propor- cervecera con media de 4,24 mm y baja variancia, ii)
ción de machos con ojos blancos (white) es de 1/4 tipo imperial de 6,34 mm y baja variancia y iii) igual a
dado que este carácter está ligado al sexo. la F2. La longitud internodal en espigas de cebada, ¿es
d) Si hubiese habido una translocación recíproca entre un carácter discontinuo o cuantitativo?¿Cuántos loci
e+ y w+, la proporción de machos descendientes w+ están involucrados en la segregación del carácter?¿Por
hubiese sido distinta a la proporción esperada (pro- qué?
porción esperada es la que se obtendría si no hubiese Respuesta: La respuesta puede ser de distintas mane-
una alteración cromosómica). ras (ver más abajo) pero se debe concluir que la
R) a) Incorrecta. Sólo puede considerarse la transloca- herencia involucra un único locus y es típicamente
ción recíproca ya que los genes están en cromosomas mendeliana (en este caso semidominante ) y no de
independientes. Esta alteración permite explicar que tipo “cuantitativa”. Si gran cervecera es AA e impe-
los genes segreguen como si estuviesen ligados. rial aa, la F1 es Aa (semidominante) y los individuos
b) Correcta. Podría ser que vg+ haya translocado al de la F2 son AA, aa o Aa, como lo demuestra el com-
cromosoma donde está w+ o que vg haya translocado portamiento de las respectivas pruebas de progenie. Se
al cromosoma donde está w. Sería menos probable puede contestar que es un carácter discontinuo (medi-
27
do cuantitativamente) o que es cuantitativo (por su b) ¿Cómo serían las distribuciones en esta segunda
forma de medición) pero formado por un único locus generación?
(QTL). c) ¿Cuál fue su diagnóstico y qué plan de mejoramien-
2) Una población vegetal silvestre es sometida durante to presentó a la empresa?
muchas generaciones sucesivas a un proceso de selec- Aprovechando su estancia en el NOA decidió hacerse
ción artificial basado en sembrar cada año únicamente un viajecito a Bolivia y, en el lago Titicaca observó
las semillas procedentes de plantas incluidas en el unas llamas con una fibra de excepcional calidad
20% de mayor producción. Como consecuencia de la (muy superior a cualquiera de las del establecimiento
selección practicada, la producción media aumenta argentino) aunque de productividad de lana muy infe-
gradualmente. Los valores de heredabilidad del carác- rior. Indeciso, compra esas llamas y vuelve al estable-
ter producción en dicha población a lo largo del pro- cimiento a realizar nuevos cruzamientos entre ellas y
ceso selectivo serán a) creciente, b) decreciente, c) las argentinas. Para su sorpresa, entre los descendien-
primero creciente y luego decreciente d) constante. tes no sólo obtiene individuos con un aumento de la
Justifique su respuesta. calidad de la fibra, sino que algunos (muy pocos)
Respuesta: Decreciente. La heredabilidad está en animales tienen una productividad superior a la obser-
función directa con la variabilidad genética (varianza vada en la subpoblación seleccionada de “A”. Descon-
genotípica), la cual disminuye con el proceso de se- fiado, supone que los valores de estos pocos indivi-
lección.[Respuesta alternativa: debería ser decreciente duos podrían estar influidos por el ambiente, por lo
y después constante, una vez agotada la variabilidad que los pone aparte, deja que se crucen entre sí y ana-
genotípica]. liza sus hijos. Resultado: la alta productividad se man-
3) Dados los excepcionales conocimientos de Genéti- tiene y obtuvo las mejores llamas de la historia.
ca que adquirió en tiempo récord en este curso de ve- d) ¿Cómo explica su buena suerte? Es decir, ¿a qué
rano y gracias a la devaluación y sus bajas pretensio- fenómeno genético atribuye este resultado?
nes salariales, una exitosa empresa textil exportadora A todo esto, ya pasaron varios años y decide ir con sus
de productos regionales decide contratarlo para mejo- resultados a pedir un considerable aumento de sueldo.
rar la productividad y la calidad de la lana de sus re- Sin embargo, a esta altura del partido, vuelve Cavallo
baños de llamas. El establecimiento del NOA dispone al ministerio de Economía, reimplanta la convertibili-
de una población de animales cuya producción de lana dad y la empresa entra en crisis, entre otras cosas por-
y calidad de la fibra siguen una distribución de tipo que, durante los años en Ud. hacía estudios genéticos,
normal y que se muestran en A y B, respectivamente. la productividad no aumentó y decidieron prescindir
Tal como aprendió en Genética I, lo primero que hace de sus servicios por “ineficiente” (no vale la pena
es estudiar la heredabilidad del carácter y para ello hacer investigación y desarrollo en la Argentina, le
dividió la población en 3 subgrupos cada una (deno- argumentaron) y le vendieron las llamas a Telecom
minados 1, 2 y 3 en la figura) de acuerdo a los valores para su famosa propaganda (porque observaron que
promedio de producción o calidad X1, X2 y X3, res- llamaban por teléfono muy seguido a sus familiares
pectivamente). Seguidamente dejó que los individuos bolivianos).
de cada una de las subpoblaciones creadas se aparea- Mientras tanto, su hermanito más chico decide seguir
ran entre sí y analizó la distribución de valores de la sus pasos y en la facultad aprende que un grupo en
siguiente generación. Como se ve en la figura, los va- Australia, publicó un trabajo en el que encuentra una
lores promedio de la nueva generación coincidieron asociación entre un RFLP correspondiente a un gen
con los valores promedio de cada una de las subpo- que interviene en la síntesis de la queratina en la lana
blaciones paternas en A (productividad). En cambio en ovejas y que explica el 90% de la variabilidad (va-
en B (calidad) coincidieron con el promedio de la po- rianza genética) del carácter calidad de la fibra.
blación original sin seleccionar. e) En base a toda esta experiencia y en no más de 10
renglones ¿qué hubiera hecho distinto (además de vo-
tar con conciencia) para evitar este final? Nota: se cas-
tigará con -1 punto si la respuesta excede los 10 ren-
glones.
Respuesta: a) 1 (100%) y 0, respectivamente, b)
igual, c) Que, dada la alta heredabilidad de A, puedo
tratar de seguir seleccionando individuos en base a
producción y que, dada la nula heredabilidad de B, no
hay variabilidad genética y no tiene sentido seleccio-
nar para este carácter. Deberían buscarse otras fuentes
a) ¿Cómo fue la heredabilidad de los 2 caracteres?
de variabilidad. d) Segregación transgresiva. e) Hubie-
Debido a que es un profesional muy serio, antes de
ra tratado de hacer mis primeras evaluaciones utili-
hacer un diagnóstico prefirió esperar un par de años
zando la mayor diversidad genética disponible (y no
más y ver que ocurre en una segunda generación antes
limitarme a los animales del establecimiento) y, en
de emitir un diagnóstico y una estrategia de mejora-
paralelo, hubiera buscado la literatura científica rela-
miento. Para ello, sin aplicar nueva selección, dejó
cionada para evaluar la factibilidad de encontrar mar-
cruzar entre sí a los nuevos individuos pertenecientes
cadores moleculares para el carácter estudiado que me
a las subpoblaciones.
sirvan para seleccionar con más eficiencia. Por ejem-
28
plo, intentaría usar el gen de oveja como sonda que, si 1) a) Porque el tamaño observado es la combina-
hibrida con el gen homólogo de la llama, podría servir ción de una estructura genética poblacional particular
para observar si encuentro un polimorfismo útil en (variancia genética) que puede segregar y de la in-
llama para RFLP (u otra técnica como STS, SSCP, fluencia ambiental (no heredable) o variancia ambien-
etc.), es decir, ver si hay cosegregación de un marca- tal.
dor con mi característica de interés para así usarla en b) La selección diferencial fue de 8 – 5 = 3 mm y la
selección asistida por marcadores. Respuesta alterna- respuesta selectiva 6,5 – 5 = 1,5 mm. Por lo tanto, la
tiva: llamas transgénicas con el gen de la oveja. heredabilidad fue de h2 = 1,5/3 = 0,5 (50%)
4) En el mejoramiento bovino se busca un aumento c) Sí (o no, en el sentido de que se reduce a un míni-
más rápido del peso de los animales en determinados mo la variancia ambiental permitiendo expresar el
ecosistemas de pasturas semitropicales. Se trata de un máximo potencial genético; de todos modos sigue
carácter cuantitativo y aditivo. Para ello se cruzaron siendo casualidad que coincida una media general
vacas con cebúes (de aumento más rápido, pero cuya únicamente debida a factores genéticos de una pobla-
calidad de carne es menor) obteniéndose una F1 con ción sin seleccionar con los de una población selec-
valores intermedios (la media se ubicó equidistante cionada en la que no se afectó la influencia ambiental)
entre la media de las vacas y la media de los cebúes). d) Volver a seleccionar en la descendencia y en las
La varianza fue muy similar tanto a la de vacas como siguientes generaciones hasta que la heredabilidad se
de cebúes (que a su vez se parecían entre sí). Los inte- acerque a 0 (además de darles la dieta de Homero).
grantes de la F1 se cruzaron entre sí para obtener una 6) La resistencia al patógeno Sclerotinia sclerotiorum
población segregante. en girasol es un carácter complejo que involucra dis-
a) ¿Cómo supone que fue la media de esta población tintos loci y se evalúa cuantativamente mediante un
segregante? ¿mayor, menor o similar a la de la F1? índice de daño en el capítulo floral. Para evaluar la
b) La varianza fue ¿mayor, menor o igual a la de la heredabilidad del carácter se sembraron 100 plantas
F1? de una línea moderadamente resistente (no existen
Entre los individuos de esta población se encontraron variedades totalmente resistentes al patógeno) en Bal-
algunos que superaron en aumento de peso a los mejo- carce, obteniéndose una media de índice de daño de
res cebúes. 0,20. De esta población, se seleccionó un grupo de
c) ¿Conoce alguna explicación genética a este fenó- individuos de mayor resistencia, con una media para
meno? el índice de daño de 0,10, como padres para la si-
Respuestas esperadas: a) Similar, b) mayor, c) se- guiente generación, siendo la media de esta última
gregación transgresiva generación de 0,13 para la variable evaluada
5) Un conocido protagonista de Los Simpsons que a) ¿Cuál es la heredabilidad del carácter resistencia?
habitualmente se disfraza de Vaquita de San Antonio Cuando el mismo experimento, utilizando el mismo
se dedicó a la lucrativa venta de dichos coleópteros material y presión de selección se realiza en otra loca-
pero, para hacerlos más atractivos, necesitaba aumen- lidad, la heredabilidad obtenida fue de 0,50
tar su tamaño dado que naturalmente tienen una media b) ¿A qué se debe la diferencia en la heredabilidad
de tan solo 5 mm. Seleccionó los machos y hembras obtenida en ambos casos?
más grandes que encontró (promedio de 8 mm) pero Sobre una población segregante F2 proveniente del
como eran muy pocos decidió reproducirlos para así cruzamiento de la línea resistente estudiada arriba y
disponer de volumen para la venta. Para su sorpresa, una línea susceptible al patógeno, se realizó un es-
la descendencia no mantuvo la esperada longitud me- tudio con marcadores moleculares codominantes, de-
dia de 8 mm sino que bajó a 6,5 mm. Muy enojado tectándose 2 marcadores estrechamente ligados a 2
por la baja performance de los bichos, los tiró y se fue QTLs, uno en el grupo de ligamiento 8 (GL8) y el
a recoger coleópteros nuevos y repitió el procedimien- segundo en el grupo de ligamiento 6, que explican el
to de selección (con idénticos resultados). 50 y 35 % de la varianza genética del carácter resis-
a) ¿Por qué bajó la longitud promedio de la descen- tencia respectivamente. En base a estas conclusiones,
dencia? c) ¿Descartaría la presencia de otros QTLs para este
b) ¿Puede calcular la heredabilidad de este carácter? carácter en la población en estudio?
Después de admirar el tamaño de las cucarachas del El siguiente esquema representa el patrón para el mar-
bar de Moe, abandonó la idea de seleccionar y se le cador asociado al QTL del GL8 en el padre modera-
ocurrió criarlas con una dieta que le recomendó damente resistente (MR), en el sensible (S) y en 10
Homero. De esta manera logró aumentar el promedio individuos F2, evaluados como moderadamente resis-
de longitud de 5 a 6,5 mm (¡lo mismo que arriba!) tentes o sensibles (ver fila superior)
c) ¿Es casualidad que ambas medias hayan coincidi- Padres Resistentes Susceptibles
do? MR S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Finalmente decidió contratarlo como consultor ---- ---- ---- ----
d) ¿Qué hubiera hecho Ud en caso de querer conver- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ----
tirse en vendedor de vaquitas de San Antonio super ¿Cómo explica el patrón encontrado para el marcador
size, disponiendo únicamente de una regla milimetra- en estudio en los individuos 3 y 5 cuya evaluación
da y sabiendo que en Springfield NO existen laborato- fenotípica es moderadamente resistente?
rios de marcadores moleculares o ingeniería genética? Rta:
Respuestas esperadas a) h2 = Xf –Xo = 0,7
29
Xs - Xo ta en “a” en el siguiente gráfico, si aplicara un
b) a la varianza ambiental e interacción genotipo- método bioinformático tal como hicimos en el trabajo
ambiente (carácter cuantitativo, con alta componente práctico sobre QTL. Considere que la línea horizontal
ambiental). es el umbral de significación (LOD = 3).
c) Dado que entre los dos QTLs explican el 85 % de d) Se analizaron micromatrices mediante “chips” de
la varianza genética, es muy probable que haya otro/s genes que abarcan todo el cromosoma 3. Se identifica-
QTLs de efecto menor en otros grupos de ligamento ron 10 genes que aumentan significativamente sus
no detectados niveles de expresión en las moscas viejas (en edades
d) Se esta evaluando con un marcador ligado a un avanzadas se expresan al menos 4 veces más que en la
solo QTL y la resistencia moderada observada puede edad de control). Estos genes y su posición en el ma-
deberse a la presencia de otro/s QTL/s en esos indivi- pa (cM) fueron:
duos. También pueden decir que hubo recombinación Gen A B C D E F G H I J K
entre el marcador y el QTL, pero dado que se dijo que Posición 4 5 9 10 22 25 30 42 60 90 93
estaban estrechamente ligado se espera que deduzcan Sobre la base de su respuesta en “a”, ¿cuáles de estos
la primera respuesta genes NO estarían incluidos entre los responsables de
7) En Drosophila melanogaster se obtuvieron dos las diferencias en la longevidad entre las líneas C y L?
líneas homocigotas que difieren ampliamente en la Respuesta: a) el QTL esta entre aproximadamente 80
longevidad media a 25ºC. La línea L tiene una longe- y 100 cM – Es de esperar que existan mas QTL en
vidad media de 120 días mientras que la línea C tiene otros cromosomas porque el identificado en el cromo-
una longevidad media de solo 40 días (ver figura). A soma 3 explica menos (40 – 90 = 50 dias) que la dife-
partir de una retro-cruza entre las líneas C y L se rencia entre ambas lineas parentales (120 – 40 = 80
construyeron líneas RIL. A cada RIL se le midió la dias)
longevidad. El siguiente esquema muestra el cromo- b) las distancias genéticas no son proporcionales a las
soma 3 de las líneas C y L, y más abajo resume las físicas porque dependen de las frecuencias de recom-
RIL más informativas para localizar QTL de la longe- binación y las frecuencias de recombinación no son
vidad sobre este cromosoma, considerando que no ctes a los largo del cromosoma (son mayores en las
existe epistasis. regiones telomèricas y menores en las regiones cen-
a) ¿Indique dónde están el o los QTL a lo largo del tromericas)
cromosoma 3 (en cM) y justifique en menos de 5 ren- c) hacen una curva que supere el LOD de 3 solo entre
glones si es de esperar que existan más QTL en otros 80 y 100 cM
cromosomas? d) los genes que seguro NO serian responsables de
b) ¿Por qué las distancias genéticas no son proporcio- ninguna diferencia de longevidad entre las lineas pa-
nales a lo largo del mapa físico? (por ejemplo, la dis- rentales L y C son A, B, C, D, E, F, G, H e I, porque si
Cromosoma 3 Longevidad (días) bien cambian de niveles de expresión durante el enve-
Línea L 120 jecimiento NO están incluidos en el QTL (a diferencia
de los genes J y K).
Línea C 40
8) Un marcador molecular RFLP está ligado en Dro-
RIL1 40 sophila a un locus QTL está involucrado en la deter-
RIL2 90 minación del número de setas abdominales. Una son-
RIL3 da que cubre toda la región del polimorfismo, se
Líneas RIL 40
hibrida con un fragmento de restricción de 6,5 kpb,
con un fragmento de 4,0 kpb o con los dos (en los in-
dividuos heterocigotos). Los genotipos para el QTL
RIL70 40
son QQ, Qq y qq y los números de setas abdominales
0 20 40 60 80 100 medias que corresponde a cada genotipo son respecti-
Posición en cM
vamente 20, 18 y 16. Se efectúa el siguiente cruza-
tancia entre 0 y 20 cM es menor que la distancia entre miento:
40 y 60 cM en el mapa físico, ver figura)
Hembras 4 , 0 q  4 , 0 q machos
6 ,5Q 6 , 5Q
14
13
12 Se determinan, después, los fenotipos de cada descen-
11
10 diente y se les extrae el ADN que se somete a una co-
9
8
rrida electroforética e hibridación con la sonda de ma-
LOD
7 nera de determinar su perfil de RFLP. En los casille-
6
5 ros ubicados en las calles del gel dibujado más abajo,
4
3
escriba el número medio de las setas abdominales para
2 cada uno de los tres fenotipos RFLP, suponiendo que
1
0 la frecuencia de recombinación entre el QTL y el
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 marcador es del 10%. Recordar que no existe recom-
Posición en cM binación en los machos de Drosophila. Detalle el cru-
c) Esquematice una posible curva de LOD en función zamiento y todos los cálculos que realizó para obtener
de cM que esperaría obtener, de acuerdo a su respues- sus respuestas.
30
b) Mediante selección y posterior endocría logró
obtener dos líneas homocigotas para todo el genoma,
una de bajo peso (25 g) y la otra de alto peso corporal
(39 g). Si la varianza ambiental es de 3, ¿cuál es la
heredabilidad (h2) y la varianza fenotípica en cada una
de estas dos líneas homocigotas?

c) A partir de las dos líneas mencionadas en “b” se


construyeron 40 líneas RILs para el cromosoma 7,
pues era el único autosoma del que se disponía de
marcadores moleculares informativos. Teniendo en
cuenta el siguiente esquema que resume las líneas RIL
que resultaron informativas:
- indique si existe uno o más QTL sobre el cromoso-
ma 7, y la respectiva localización (segmento cro-
mosómico).
- ¿Cree Ud que pueden existir más QTLs para el mis-
mo carácter (peso) en el resto del genoma? Justifique
brevemente.
R) a) R = h2 S => h2 = R / S => h2 = (X1 – X0) / (Xs –
X0) = (32 – 30) / (35 – 30) = 0,4.
b) h2 = 0 en cada una de las líneas porque las líneas
son homocigotas para todo el genoma (incluyendo los
posibles genes que afectan al peso), es decir que la
varianza genética es nula. La VP será igual a VE por-
que toda la variación observada es ambiental, VP = 3.
c) El primer segmento negro del cromosoma 7 de la
RIL2 (contando de izq a derecha) es el único QTL
observado en este autosoma porque es el único que
diferencia a las RIL con respecto al peso corporal.
Seguramente existirán más QTLs en otros cromoso-
mas porque este cromosoma 7 no explica toda la dife-
9) El Dr. Kormy Yot (un importante nutricionista) se rencia entre las líneas de alto y bajo peso. La máxima
embarcó en un proyecto nutrigenómico (“una dieta diferencia entre las líneas “parentales” usadas para
para cada individuo, según su genotipo”) utilizando construir las RILs es de 39 gr – 25 gr = 14 g mientras
una población de ratones de laboratorio para determi- que la máxima diferencia entre las RILs explicada por
nar con precisión la influencia relativa de los compo- el cromosoma 7 es de 34 – 25 = 9 g.
nentes genéticos versus los componentes ambientales 10) Mediante un estudio de la capacidad musical en
(particularmente la dieta) en el peso corporal. Utilizó humanos se concluyó que ésta representa una función
una población genéticamente uniforme para la longi- compleja integrada por la apreciación del tono, memo-
tud del cuerpo (desde la cola a la nariz) cuyo peso ria tonal, sentido del ritmo, gusto melódico y conjunto
promedio es de 30 g. Para ver si la variación en el pe- armónico. En un estudio llevado cabo por Musi-Quita
so es heredable seleccionó a los ratones que pesaban se colectaron muestras de DNA humano de una po-
33 g o más (35 g en promedio) como progenitores de blación altamente endogámica (es decir, con carac-
la siguiente generación. En la siguiente generación el terísticas similares a las de un alto grado de endocría
peso promedio aumentó significativamente 2 g (el o autofecundación) con pedigrí cerrado (y conocido)
peso medio fue de 32 g). en Islandia, muy analizada por los laboratorios medi-
a) ¿Cuál es la heredabilidad (h2) del carácter en la po- cinales para realizar estudios de enfermedades heredi-
blación inicial de 30 g? tarias porque es lo más parecido (en humanos) a estu-
diar los recombinantes descendientes de un cruza-
31
miento controlado y se trató de mapear algún QTL ser una muestra que reúna en cada grupo diversidad
asociado a la capacidad musical. Para la realización de en cuanto a esos y otros factores para que la varianza
este estudio se muestrearon personas con buena afina- ambiental no sea la mayor contribuyente a la variación
ción (incluyendo a la famosa cantante Bjork) y perso- fenotípica observada.
nas que han demostrado ser “molestamente” desafina- c) Para los loci A y C ya que existe una correlación
das seleccionadas en “cantando por un sueño” en ver- entre la expresión del carácter cuantitativo Ia y la
sión vikinga. De esta manera, se establecieron 2 gru- condición 1, 2 o H de estos carácteres cualitativos.
pos, de acuerdo a un índice de afinación (Ia) que pue- d) Según los datos de la tabla al menos existe 1 QTL.
de cuantificarse (variando de 0 a 1): Afinados (A) cu- Si se observan los datos se ve que, con alta frecuencia,
yo Ia es mayor a 0.75 y Desafinados (D) cuyo Ia es A1 se hereda junto con C2, por lo tanto estos marca-
menor a 0.25. dores podrían estar ligados y mapear junto al mismo
a) ¿Cuál es la ventaja, para el análisis genético, de QTL. Sin embargo, dada la introducción del enuncia-
utilizar grandes poblaciones descendientes de muy do y teniendo en cuenta la complejidad del acto resul-
pocos individuos parentales? ta intuitivo adjudicar el fenotipo a más de 1 QTL. In-
b) ¿Qué piensa sobre cómo debió ser el muestreo de la cluso el hecho de obtener heterocigotas para A o C
población de individuos estudiada en cuanto a: su es- con valores tan altos y tan bajos de Ia hace pensar que
tatus social, país de origen, formación musical obteni- hay otros genes que colaboran en la expresión de este
da, etc.? ¿lo más homogéneo posible, tal como se carácter y también que el ambiente sería de gran in-
buscó en el caso de su origen genético o todo lo con- fluencia.
trario?¿Por qué? No necesariamente. Lo más probable es que NO, de-
Se estudió la distribución de los patrones de marcado- bido a que hay varios genes distintos involucrados
res moleculares (microsatélites). En la tabla sólo se (incluso distintos alelos de un mismo gen) que se fija-
muestran algunos de los loci analizados y el resultado ron en forma diferencial en las distintas poblaciones.
de sólo 10 individuos de cada grupo (considere que la 11) En una población experimental de Drosophila
muestra evaluada resulta representativa). melanogaster, el peso medio seco de las moscas es de
Grupo: Afinados 2000 ug. La varianza fenotípica es 40000 ug2 y
2
Ia 0.9 1 0.75 0.84 0.86 0.88 0.85 0.95 0.77 0.82 la varianza genética aditiva es de 10000 ug . Si
Locus A (A1A2) A1 A1 A2 H H H A1 A1 H H como progenitores de la siguiente generación
Locus B (B1B2) H H B1 B2 B2 H B1 B1 H B2 se seleccionan individuos grandes, que en
Locus C (C1C2) C2 C2 H H H H C2 C2 H H promedio pesan 2400 ug,
Desafinados a) ¿cuál es el peso corporal promedio espera-
Ia 0.02 0.23 0.05 0.2 0.15 0.04 0.07 0.08 0.1 0.25
do en la progenie?
b) ¿cuáles son la varianza ambiental y la here-
Locus A (A1A2) A2 H A2 H H A2 A2 A2 A2 A1
dabilidad en sentido amplio (H2) de este carác-
Locus B (B1B2) B2 B2 B1 H B1 H H B1 B2 B2
ter suponiendo que el único componente gené-
Locus C (C1C2) C1 C2 C1 H H C1 C1 C1 H C2
tico de la varianza fenotípica del carácter es el
TABLA: En cada caso se muestran los homocigotas para 1
aditivo?
ó 2 de cada locus y el heterocigota expresado como H.
Suponga ahora que para un estudio de QTL sobre el
c) ¿Cuáles de estos loci podrían servir para mapear peso seco de las moscas se ha seleccionado la pobla-
algún QTL asociado a la capacidad de afinación? Jus- ción indicada arriba durante muchas generaciones ob-
tifique su respuesta.
teniéndose dos líneas muy diferenciadas para este
d) ¿Qué podría decir acerca del número de QTLs aso-
carácter: la línea de alto peso (W) y la línea de bajo
ciados al carácter? Para responder básese en los datos
peso corporal (L). A partir de la F3 recombinante en-
de la tabla, en sus respuestas de los puntos anteriores
tre las dos líneas W y L se construyeron líneas RIL
y demás características sobre el carácter que se men-
para localizar los QTL.
cionan en el enunciado.
En el norte de nuestro país, se identificó una pobla- X
ción de origen indígena con características similares a Cromosoma 3
las de Islandia, lo mismo ocurrió con una tribu de
bosquimanos en África y con la población del pro- Línea de bajo
- peso 1000
blema 1.
Línea de alto peso 4000
e) Discuta la probabilidad de encontrar los mismos
QTLs en estas otras poblaciones.
Respuestas:
a) Como se dice en el enunciado, al tratarse de un RIL 1 1010
carácter complejo, es probable que haya muchos ge- RIL 2 2900
nes involucrados. Utilizar poblaciones endogámicas
RIL 3
de pedigrí cerrado permite reducir esta complejidad 40 RIL 1005
(el número de genes con variación, así como de sus
variantes alélicas), porque muchos de ellos deberían
estar en homocigosis y permanecer constantes.
b) Asumiendo que la varianza ambiental influye en el RIL 40 1020
fenotipo del carácter estudiado, se sugiere que debe 0 20 40 60 80 100

Posición genética en cM
32
c) A cada RIL se les midió el peso corporal, El si- distribución poblacional de los distintos genotipos:
guiente esquema muestra el cromosoma 3 de las líneas ¿Cuál es la frecuencia del alelo apoE2?
W y L) y más abajo resume las RIL más informativas Genotipo E2E2 E2E3 E2E4 E3E3 E3E4 E4E4 Total
para localizar QTL. ¿Dónde están los QTL a lo largo N° indiv 2 64 7 684 169 11 937
del cromosoma (en cM) y cuál es el número mínimo a) 0,002 b) 0,040 c) 0,076 d) 0,175
de genes del cromosoma 3 que afectan al peso corpo-
Respuesta:b) [f(E2)= (2x2)+(64)+(7)/(937x2)=0,040]
ral? Pueden haber más QTLs en otros cromosomas –
Justifique brevemente. 2) Hagamos un poco de ciencia-ficción. Supongamos
que la ciencia médica avanzase hasta el punto de que,
14 con un tratamiento aplicado a lo largo de toda la vida,
13
12 la especie humana dejase de sufrir nuevas mutaciones.
11
10
Admitamos también que tal tratamiento se aplica a
9 toda la humanidad en el intervalo de una sola genera-
LOD 8
7 ción, y se mantiene así en lo sucesivo. ¿Qué ocurriría
6
5
con la variabilidad genética en las sucesivas genera-
4 ciones? ¿Aumentaría? ¿Desaparecería? ¿Se mantendr-
3
2 ía? Explíquese tanto como pueda.
1
0
Respuesta: Suponiendo panmixia, ausencia de selec-
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
ción y el alto número poblacional de la especie, la va-
Posición en cM
riabilidad debería mantenerse constante (en equilibrio
de HW). Por lo tanto, se mantendría. Lo que se impe-
d) Dibuje una posible curva LOD en función de cM
que esperaría obtener, de acuerdo a su respuesta en diría es el surgimiento de potenciales nuevos alelos
“c”, en el siguiente gráfico si aplicara un método bio- inexistentes en la población actual.
informático tal como hicimos en el trabajo práctico 4) Según algunos las rubias (no teñidas) están conde-
sobre QTL. Considere que la línea horizontal es el nadas a la extinción cuando la población humana
umbral de significación (LOD = 3). mundial llegue a total panmixis. El alelo determinante
R) a) S = 2400 ug – 2000 ug = 400 ug del color rubio del principal gen involucrado en el
h2 = 10000 / 40000 = 25% color del cabello es de expresión recesiva.
R = h2 * S = 0.25 * 400 = 100 ug Si mediante un cálculo arbitrario estimamos que la
media esperada X1 = 2000 ug + 100 ug = 2100 ug cantidad de rubias/os es de 22 millones sobre una po-
b) VA = VP – VA = 40000 – 10000 = 30000 ug blación mundial de 6.600 millones y hay 50 millones
Como VG = VA, entonces H2 = h2 = 0.25 de heterocigotas.
c) Hay un solo QTL aproximadamente a 40 cM. Por a) ¿Cuál será la proporción de rubios cuando la pobla-
lo tanto el número mínimo de genes que afectan al ción llegue a equilibrio de Hardy-Weimberg?
carácter es 1. Deben haber más QTLs e otros cromo- b) ¿Qué proporción de rubios de la población tendrán
somas ya que este QTL no explica toda la diferencia los dos padres no rubios?
entre las líneas parentales W y L (4000 – 1000 ug). Rta: p=R+1/2H= 22/6600 +50/6600*1/2= 0,0071
d) Una posible curva esperada seria la siguiente. Lo q=1-p=0,9929
unico importante es que el LOD seria significativo En equilibrio H-W la población de rubios será
solo en el “intervalo” aproximado que consideraron p2=5*10-5
que era un QTL en la respuesta“c”. b) NO era necesario contestar. La respuesta era q2
14
2pq=0,014. La proporción de matrimonios (0,014)2=
13 2*10-4
12
11
Hijos ¼ * 2*10-4 = 5.10-5
10 1) Un investigador está estudiando una población de
9 peces que habita en una laguna ubicada en un oasis en
LOD 8
7 el desierto del Sahara. Se propone estudiar dos loci
6 correspondientes a dos enzimas en 1000 individuos:
5
4 Locus 1: A1A1: 640, A1A2: 320, A2A2: 40
3 Locus 2: B1B1: 400, B1B2: 580, B2B2: 20
2
1 a) Determine si los loci antes mencionados se encuen-
0 tran en equilibrio de Hardy-Weinberg. Evalúe estadís-
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ticamente su hipótesis.
Posición en cM b) En caso de que alguno/algunos de los loci no se
Genética de poblaciones encuentre en equilibrio, ¿cuál/cuáles pueden ser las
1) La apolipoproteína E (apoE) fue implicada como causas: falta de panmixia, selección o mutación? Justi-
un factor de riesgo en las enfermedades cardiovascu- fique tanto su elección como aquellas causas que des-
lares y en el Alzheimer. Se describieron 3 alelos co- carta.
munes: apoE2, apoE3 y apoE4. La tabla muestra la Respuesta:
a) Locus 1:
33
Frecuencias alélicas: A1=0,8, A2=0,2 razonable de por qué no existe el equilibrio en esta
Frecuencias genotípicas esperadas: población.
A1A1 = (0,8)2 x1000 = 640
A1A2 = 2x0,8x0,2 x 1000 = 320
A2A2 = (0,2)2 x 1000 = 40
X2 = 6402 / 640 + 3202 / 320 + 402 / 40 = 0  No re-
chazo Ho, por lo que este locus está en equilibrio de
H-W
Locus 2:
VC (valor crítico)=3,84 para 1 GL; VC=5,99 para 2
Frecuencias alélicas: B1=0,69 y B2=0,31
GL; VC=7,82 para 3 GL.
Frecuencias genotípicas esperadas:
b)¿Qué supuestos me permitirían a mí calcular, a par-
Frecuencias genotípicas esperadas:
tir de esta población, cuáles serían las frecuencias
B1B1 = (0,69)2 x1000 = 476
génicas dos generaciones después? ¿Y las genotípi-
B1B2 = 2x0,69x0,31 x 1000 = 428
cas? Explique su razonamiento. Aclaración: No se
B2B2 = (0,31)2 x 1000 = 96
pretende que esas sean realmente las frecuencias que
X2 = (476 - 400)2 / 476 + (428 – 580)2 / 428 + (96 –
va a tener la población en esa generación, sólo que
20)2 / 96 = 126,3
indique qué necesitaría un investigador para poder
Como este valor es mayor al valor crítico rechazo Ho
afirmar cuáles serían.
 este locus no se encuentra en equilibrio de H-W.
1) a) observado
b) Falta de panmixia: es poco probable que esta sea la
a1a1 a1a2 a2a2
causa ya que el locus 1 está en equilibrio y si no
100 120 80
hubiera panmixia también afectaría las frecuencias
p= 0,53333333
genotípicas de este locus.
q= 0,46666667
Selección: Es posible. Por ejemplo, el genotipo B2B2
Esperado bajo H-W
podría estar desfavorecido frente a los otros dos geno-
a1a1 a1a2 a2a2
tipos ya que su frecuencia es mucho menor de la espe-
85,33 149,33 65,33
rada. 2
X = 11,5752551
Migración: no puede ser ya que se trata de un oasis
No está en equilibrio (VC=3,84)
aislado en el desierto.
Posible explicación: lo más probable es que no exista
Mutación: Poco probable ya que para que las frecuen-
panmixia y que haya algo de endogamia (por ejemplo,
cias genotípicas observadas se deban a mutación
porque las plantas poseen algún grado de autofecun-
aproximadamente 80 de los 620 alelos B2 estudiados
dación facultativa, o porque sus semillas no se disper-
deberían haber mutado a B1, es decir que se requerir-
san tanto). Esto se justifica porque hay exceso de
ían tasas de mutación muy altas (más del 10%). Sin
homocigotas. Otras explicaciones menos probables:
embargo, no podemos descartar una mínima contribu-
diferencia entre sexos. (en este caso, si hubiera pan-
ción de las mutaciones a las frecuencias observadas.
mixia, sólo se tardaría dos generaciones en alcanzar el
5) Un estudioso de las plantas Florecitus lindus, des-
equilibrio, sería raro que el investigador justo hubiera
cubre una población silvestre en una apartada región y
encontrado la población en ese punto)
decide investigar sus características.
b) En ausencia de mutación, migración, selección y
Primero decide realizar un muestreo al azar de la po-
deriva, las frecuencias génicas serían las mismas que
blación, para lo que extrae ADN de 300 plantas. En-
ahora. Si además, hubiera panmixia, las frecuencias
tonces, entre otros estudios, analiza un carácter de im-
genotípicas serían las del equilibrio.
portancia ornamental, la presencia de un patrón de-
6) En 1960 el cacique de una tribu localizada en una
terminado de coloración en la flor. Por estudios pre- lejana isla del pacífico, preocupado por la gran canti-
vios en el género, sabe que ese carácter está determi- dad de enfermedades de origen genético presentes en
nado por un único gen autosómico y bialélico (siendo la población de la isla recurrió al Dr. Boyd. Éste estu-
la presencia del patrón de coloración dominante sobre dió la distribución de alelos de grupos sanguíneos MN
su ausencia). Como la planta florece cada tres años, y (los individuos son MM, MN o NN), obteniendo los
aún no está en floración, decide utilizar un marcador siguientes resultados: MM: 520, MN: 160, NN: 320
molecular RFLP localizado en el gen. Obtiene tres a) ¿Se encuentra la población en equilibrio de Hardy-
tipos de patrón de bandas. El primero, que por sus es- Weinberg con respecto a los grupos sanguíneos MN?
tudios está asociado con el patrón de color, aparece en Verifique estadísticamente.
100 individuos. El segundo patrón lo tienen 120 indi- b) ¿Hay mayor, menor o igual homocigosis que la es-
viduos y el tercero, sólo 80. perada por Hardy-Weinberg?
a) ¿Esta población se encuentra en equilibrio de Har- Sorprendido por estos resultados el Dr. Boyd decidió
dy-Weinberg para este carácter? Si la respuesta es averiguar un poco más sobre esta tribu, y encontró que
afirmativa, explique por qué cree usted que se mantie- la misma está dividida en 5 castas. Los matrimonios
ne en ese equilibrio. Si no lo es, dé una explicación entre personas de distinta casta estaban terminante-
mente prohibidos. Reanalizando sus datos, ahora te-
34
niendo en cuenta las castas a las que pertenecían las
personas, notó que dentro de cada casta se cumplían
las frecuencias de H-W.
c) ¿Cómo explica este último resultado en relación a
su respuesta de la pregunta “a”? ¿Qué supuestos no se
cumplen en la población total?
d) ¿Por qué le parece que hay tantas enfermedades
genéticas en la población?
Debido a estos hallazgos el Dr. Boyd recomendó al
cacique que quitara toda restricción en cuanto a los
matrimonios, lo cual el cacique acató inmediatamente. ¿Cuál es el tipo de herencia más probable para la
En 1980 el Dr. Boyd regresó a la tribu y notó que a
NOHL en la especie humana? Explique su razona-
pesar de que la población general no se encontraba en
equilibrio de Hardy-Weinberg, si sólo analizaba las miento.
muestras de sangre de los menores de 20 años ajusta- Según su hipótesis complete la 2° genealogía indican-
ban perfectamente a dicho equilibrio. do los individuos afectados.
e) ¿Cómo puede explicar este último resultado?
R) a) M = (520 + 160 /2) / 1000 = 0,6
N = (320 + 160/2) / 1000 = 0,4
Si la población se encontrara en equilibrio de H-W las
frecuencias genotípicas deberían ser:
MM = 0,62 * 1000 = 360
MN = 2 * 0,6 * 0,4 * 1000 = 480
NN = 0,42 * 1000 = 160
X2 = (520-360)2 /360 + (160-480)2 / 480 + (320-160)2
/ 160 = 444,4
Como es mayor que X21,0,05 entonces rechazamos la
hipótesis. Es decir la población no se encuentra en Respuesta: Observamos que todos los descendientes
equilibrio de H-W. independientemente de su sexo, muestran el fenotipo
b) Dado que los homocigotas esperados son 520 mien- de la madre. [Esto no podemos explicarlo si el carác-
tras que los observados son 840 podemos decir que ter estuviera en los cromosomas sexuales, ya que el
hay mayor homocigosis que la esperada por H-W. fenotipo de la descendencia no depende de si el carác-
c) Dado que están prohibidos los matrimonios entre ter es dominante o recesivo, o de la dirección del cru-
castas no hay panmixia. Por lo tanto aunque cada cas- zamiento, sino sólo del fenotipo de la madre]. Por lo
ta se encuentre en equilibrio de H-W la población to- tanto podríamos asegurar que este carácter es un caso
tal no lo está. Esto también explica la mayor homoci- de herencia materna.
gosidad respecto de lo esperado por H-W ya que están En B se sombrean: II 2, 3, 5; III 1, 3, 4, 8,10,11; IV
favorecidos los matrimonios co-sanguíneos. todos
d) La alta homocigosidad debida a la endogamia hace 2) El siguiente árbol muestra una familia que hereda
que sea más probable que una persona sea homocigota una forma severa de hidrocefalia causada por una mu-
para alelos recesivos responsables de una enfermedad tación en el gen L1CAM (localizado en el cromosoma
hereditaria. X) y que presenta una herencia recesiva. Utilizando
e) Al quitar la restricción en la elección de pareja, y un marcador intragénico que tiene tres alelos (12, 8 y
suponiendo que a partir de dicho momento hubo pan- 7) se hace el diagnóstico del propósito (nombre que
mixia, las frecuencias genotipicas de aquellos que na-
reciben los “pacientes” por parte de los genetistas
cieron bajo el nuevo régimen (los menores de 20
años) se ajustarán a H-W. Sin embargo, en la pobla- médicos y que se indica con una flecha).
ción general no sucede los mismo debido a que el
grupo de personas que nacieron antes (y que todavía
están vivos al realizar el análisis poblacional) presenta
las proporciones genotípicas que no ajustaban a H-W.
Genéticas no Mendelianas
1) La neuropatía óptica hereditaria de Leber (NOHL)
es una enfermedad rara en la especie humana que pro-
duce una rápida atrofia del nervio óptico y que genera
ceguera en adultos jóvenes. Esta enfermedad está ca-
racterizada por una pérdida bilateral de la visión cen-
tral mientras que se mantiene la visión periférica. La
1° genealogía muestra la herencia de esta enfermedad
en una familia bastante amplia: ¿Cuál fue el resultado del diagnóstico?
a) La propósito es portadora del alelo mutante
b) La propósito es heterocigota no portadora
35
c) La propósito es homocigota para el alelo normal monoploide)]. Por lo tanto, las frecuencias alélicas
d) El resultado no permite dar un diagnóstico preciso son iguales a las genotípicas f(LHON) = 0,3%
sobre el genotipo. F(normal) = 0,97%
Respuesta: b) b) A las mujeres (y no a los varones) porque se trata
3) En el antiguo testamento, Dios dispuso que los de una herencia materna, no hay necesidad de evitar la
hijos de Isaac y su mujer constituirían la nación judía. reproducción de los varones dado que no transmiten la
Sin embargo, la esposa de Isaac era bastante mayor y enfermedad
supuestamente infecunda. Según las costumbres loca- c) Después de la selección negativa la segregación
les de la época, ella eligió una mujer alternativa con la somática de los heteroplásticos y la aparición constan-
que Isaac tuvo un hijo: Esaú. Un día, la anciana mujer te de nuevas mutaciones similares llevarían la enfer-
le comentó a Isaac que estaba encinta y tuvo un hijo: medad genética a las mismas cifras actuales (después
Jacobo. Posteriormente, Jacobo se casó con 5 herma- de algunas pocas generaciones)
nas (de otra familia) y tuvo 13 hijos y varias hijas. 5) El señor señalado con un círculo rojo tiene una rara
Suponiendo que pudiera acceder a muestras de tejido enfermedad genética y le pregunta: -Vos que hiciste
de Isaac, Esaú, Jacobo y de los hijos de Jacobo y, un curso rápido de genética ¿me podrás averiguar qué
además, pudiese extraer DNA y analizarlo: probabilidad tengo de transmitirle esta enfermedad a
a) ¿Cuántos haplotipos o secuencias nucleotídicas di- mis futuros hijos?
ferentes en la región del cromosoma Y en la región
del gen Sry obtendría? Justifique.
b) ¿Cuántos tipos de secuencias nucleotídicas diferen-
tes del D-loop de DNA mitocondrial obtendría? Justi-
fique.
Solución: a) Uno sólo: el que proviene de Isaac
(herencia ligada al sexo, etc….)
b) 4: el de Isaac (donado por su madre), el que provie-
ne de la madre de Esaú, el que proviene de la madre
de Jacobo y el que proviene de la madre de las 5 her-
manas (herencia materna...)
4) Aproximadamente el 0,3% de la humanidad tiene
una enfermedad genética leve llamada LHON produ-
cida por una mutación que substituye una Asn por una Mi señora no posee esta enfermedad pero ¡con la
Asp en el complejo NADH mitocondrial. genética nunca se sabe!. ¿Me tendré que hacer un aná-
a) ¿Cuáles son las frecuencias genotípicas para este lisis yo o mi señora?
carácter? ¿Serían distintas a las frecuencias alélicas? ¿Le podrá contestar sin necesidad de pedirle un análi-
¿por qué? sis genético detallado (pedigrí) a la señora? Justifique
b) Si apareciese una corriente eugenésica que preconi- brevemente.
ce “mejorar” la raza humana que proponga eliminar Rta: La probabilidad es nula porque se trata de un
las enfermedades genéticas por métodos drásticos claro ejemplo de herencia materna. No requiere de
¿deberían prohibir tener hijos a todos los individuos más análisis.
con síntomas de LHON?¿por qué? Atención: ignore Respuestas alternativas válidas a esta pregunta (no
los datos que se enumeran a continuación para contes- pedidas):
tar esta pregunta. a) Imprinting materno
Gracias a los conocimientos adquiridos en genética I y b) podría ser un gen autonómico recesivo
para buscar argumentos científicos para enfrentar al En el caso b), SÍ debería hacer análisis genéticos.
movimiento eugenésico a Ud se le ocurre hacer 2 6) En la siguiente genealogía los símbolos en negro
estudios: i) diagnóstico molecular confirmatorio y ii) denotan la condición patológica de una enfermedad
cuantificación de la frecuencia de aparición espontá- con baja incidencia en la población, que afecta ma-
nea de esta mutación. En el primer caso encontró que, yormente a hombres. Justifique todas sus respuestas.
además de los enfermos, existen individuos con la a) ¿Cuáles de los siguientes tipos de herencia puede
mutación pero asintomáticos (debidos a heteroplas- descartar: herencia mendeliana, ligada al sexo, li-
mia: presencia de mitocondrias con genotipo normal y gada al cromosoma Y, limitada por el sexo, in-
mutante en una única célula) y en el segundo que la fluenciada por el sexo, herencia materna, influen-
misma es significativa. cia materna?
c) Argumente por qué estos estudios demostrarían la b) De las posibilidades que no descartó, ¿cuál le pare-
inutilidad práctica de encarar la selección negativa ce más probable?
propuesta por los eugenésicos. c) asumiendo como cierta la hipótesis que esco-
Respuestas: a) Este es un carácter mitocondrial por lo gió en el punto b), ¿cuál sería el genotipo de los
que, salvo algún caso raro de heteroplasmia, el alelo distintos individuos de la genealogía? Tenga en
está presente o ausente (como si fuera una especie
36
cuenta que en algunos casos puede haber más de dos diferentes, apareciendo animales con un fenoti-
una opción posible. po en mosaico llamado “carey”, formado por pelos
d) Si los individuos que poseen el asterisco se negros y naranjas distribuidos en forma aleatoria en
casan, cuál es la probabilidad que tengan un todo el cuerpo
hijo que porte el alelo enfermo? Hembras F1 Machos F1
I Cruza- Hem- Ma- negro naranja carey negro naranja
miento bras chos
II 1 negro negro 48 46
2 naranja negro 16 20
III 3 carey naranja 47 43 38 54
4 carey negro 12 21 29 35
IV * a) ¿De qué tipo de herencia se trata?
b) ¿Por qué sólo aparecen hembras carey y no así ma-
V * chos?
Respuesta: c) ¿Cuál es la relación de dominancia entre los genes
a) Herencia mendeliana: no la puedo descartar, podría que condicionan estos colores?
tratarse de una enfermedad recesiva. 2) a) Que los dos cruces recíprocos den resultados
Ligada al sexo: puede ser diferentes indica, en principio, herencia en relación
Ligada al Y: No puede ser porque sino el hijo varon II con el sexo. Fijándonos en los machos de la F1; su
debería ser enfermo y el V no debería serlo. fenotipo es igual al de su madre, típico deherencia
Limitada por el sexo: no puede ser porque según el cruzada. Los hijos reciben el cromosoma X de la
enunciado en la población también hay mujeres en- madre con el alelo para negro o para
fermas. naranja, sin embargo, las hijas presentan el mismo
Influenciado por el sexo: puede ser fenotipo «carey» en ambos cruces. De acuerdo con la
Herencia e influencia materna: no porque las madres hipótesis de herencia ligada al sexo, las hijas del pri-
de los enfermos no están enfermas y el que introdujo mer cruce tienen que ser heterozigotas, con un cro-
el alelo que da la enfermedad fue el padre de las gene- mosoma X materno portador del alelo para negro y
ración I un cromosoma X paterno con un
b) Es un gen ligado al cromosoma X. Podría ser un alelo para naranja. En las hembras heterozigotas se
gen autonómico recesivo, pero eso sería posible si expresarían los dos alelos, produciendo dicho fenoti-
todos los matrimonios se dieron con personas hetero- po en mosaico. Esto se debe al fenómeno de inactiva-
cigotos para la enfermedad y si ésta es rara como dice ción aleatoria de uno de los dos cromosomas X de la
el enunciado esta alternativa es muy poco probable. hembra, que se produce en fases tempranas del desa-
También podría ser influenciado por el sexo. rrollo (Lionización).
c) b) El resultado de los cruces 3 y 4 nos ayudará a con-
firmar la hipótesis. Una hembra «carey», será hetero-
I A a a zigota para negro y naranja (X neXna), y tendrá hijos
X X XY
tanto negros (XneY) como naranjas (XnaY), que es lo
que ocurre en los dos cruces. Una hembra «carey» cru-
II
XAXa XAY XAXa XAY XAXa zada con un macho naranja tendrá hijas tanto «carey»
como naranja:
ne na
III a a aX X x XnaY = XneXna + XnaXna + XnaY + XneY
X Y XAXa XAY XAX-- A X Y
XAY X Y X X
A a
XAXa X Y carey naranja = carey + naranja+ naranja
IV +negro
XAY XAXa XAXa XAYXAX-- XAY XaY XAXX *
-- A XaY
Y Xa
Y En el cruce hembra «carey» con macho negro la dife-
? rencia es que en lugar de hijas naranjas aparecen, lógi-
V * camente, hijas negras, siendo todo lo demás igual.
XaY XAX-- XAX-- Los machos, al ser hemizigotos, serán siempre X naY
?
ne
d)La probabilidad de que la mujer sea heterocigota es (naranjas) o X Y (negros), pero nunca podrán ser
½ (dado que recibió XA del padre y existe ½ de proba- «carey».
bilidad que haya recibido Xª de la madre) y la proba- c) Aunque negro y naranja son alelos del mismo gen,
bilidad de que siendo heterocigota transmita el alelo no se puede hablar estrictamente o deducir relaciones
enfermo es ½. Por lo tanto la probabilidad de que un de dominancia/recesividad, de herencia intermedia o
hijo varón porte un alelo enfermo es ¼. de codominancia, ya que en cada célula que produce
9) El Dr. Visen publicó hace años los resultados de la pelo se manifiesta uno u otro alelo, en los machos de-
herencia del color del pelaje de los gatos. Su primera bido a la hemizigosis y en las hembras heterozigotas
observación fue que el pelaje puede ser de color negro debido a la inactivación de uno de ellos.
o naranja, entre otros. Posteriormente al cruzar gatos 10) En plantas de maíz con citoplasma de tipo T se ha
con estos colores los cruces recíprocos dieron resulta- identificado un gen (urf13) cuya expresión induce la
37
androesterilidad. Asímismo para este tipo de plantas nominó alz) mapea en el cromosoma 3, flanqueado
se han identificado dos genes restauradores nucleares a 10 cM y 13 cM por dos marcadores RFLP humanos
dominantes (Rf1 y Rf2) cuya expresión concertada denominados hs3 y hs1, respectivamente (Fig. 1) (No-
restaura la fertilidad, no habiendo restauración si sólo ta: fue posible usar sondas humanas ya que muchas
se expresa uno de estos genes. El gen Rf1 fue el pri- sondas de esta especie hibridan con DNA de ratón
mer gen restaurador aislado y caracterizado molecu- debido a su alto grado de parentesco). Recientemente,
larmente. Si se dispone de una planta con citoplasma un grupo de investigación, clonó molecularmente en
T, homocigota para el gen Rf1 dominante, descono- humanos, un gen (gdm) involucrado en la regulación
ciéndose su constitución genética para el locus Rf2,
de la producción de mielina a nivel cerebral y lo ma-
a) Indique cual/es de las siguientes líneas de maíz
peó en el cromosoma 8, flanqueado a 12cM y 15cM,
utilizaría en sus experimentos para determinar la
composición alélica del locus Rf2 en la planta incóg- por los mismos marcadores hs3 y hs1. En la publica-
nita. Justifique su respuesta, indicando qué planta ción de dicho trabajo, los autores reportaron la locali-
usaría como padre y como madre en sus experimentos zación cromosómica del gen y su secuencia completa.
de cruzamiento, cómo espera que sea la descendencia Al leer este trabajo, se sospechó (y con fundamento)
en caso de que la planta a la que se le quiere determi- que el gen de ratón podría ser un homólogo del gen
nar el genotipo sea rf2rf2, Rf2rf2 o Rf2Rf2 y por qué humano. Lamentablemente ambos grupos nunca cola-
descarta las plantasno elegidas. boraron para que esto se pudiera demostrar.
i. T rf1 rf1 Rf2 Rf2 iv. N Rf1 Rf1 rf2 rf2 a) ¿Cuáles fueron los fundamentos de la sospecha?
ii. N rf1 rf1 Rf2 Rf2 v. T Rf1 Rf1 b) ¿Qué estrategia utilizaría usted para clonar, al me-
Rf2Rf2 nos parcialmente, al gen supuestamente homólogo de
iii. T Rf1 Rf1 rf2 rf2 vi. N Rf1 Rf1 Rf2 ratón (recuerde que el gen de ratón está mapeado pero
Rf2 no está secuenciado y no se sabe si la similitud de se-
Nota: N corresponde a citoplasma normal, T corres- cuencia es alta, ni tampoco si hibridan entre sí)?
ponde a citoplasma androestéril. c) ¿Cómo verificaría, funcionalmente, si el gen de
b) Un mejorador recibe una planta con una nueva humanos cumple la misma función que su homólogo
fuente de androesterilidad citoplasmática y al cruzarla en ratones? Diseñe un experimento recordando que
con una línea restauradora para los genes Rf1 Rf2 ob- los genes y las proteínas humanas son funcionales en
tiene toda la descendencia estéril ¿Cómo explica este
ratones y viceversa.
resultado?
R) a) Utilizaría la planta iv como padre que es fértil Fig. 1
cM
(citoplasma normal) y aparte es homocigota dominan- cM
te para RF1 (este locus no está en estudio pero es ne-
cesario para restaurar fertilidad) y rf2 doble recesivo
para evaluar la composición de la descendencia al
cruzarlo por la planta incógnita (T Rf1Rf1 -- --) hs3
Si la descendencia es 100% estéril, la planta era T hs3 12
10
Rf1 Rf1 rf2 rf2 (Rf1 solo no restaura la fertilidad) gdm alz
13 15
Si la descendencia es 100% fértil la planta era T
Rf1Rf1 Rf2Rf2 hs1 hs1
Si la descendencia es 50% esteril, 50% fértil, la planta
era T Rf1Rf1 Rf2rf2
Las otras líneas no darían resultados conclusivos
i), iii): no dan polen viable
ii) , v), vi): toda la descendencia es fértil pero no se
puede establecer que alelos Rf2/rf2 componen el lo- Humano Ratón
cus incógnita Respuesta: a) La sintenia evolutiva (conservación
b) Es portadora de un gen de androesterilidad distinto filogenética de mapas genéticos entre especies empa-
al urf13 para el cual la línea retauradora no posee el
rentadas) y, tal vez, las características de los genes en
gen restaurador necesario
cuanto a su rol fisiológico.
Genómica b) Clonado posicional (cualquiera de sus variantes es
1) Mediante el uso de marcadores moleculares se correcta). Otras alternativas de clonado ingeniosas
construyó un mapa de ligamiento del ratón, usando pueden llegar a aceptarse.
como genotipos parentales de la población de mapeo a c) Hacer estudios de complementación en ratones
dos líneas endocriadas que presentan una marcada transgénicos (alz/alz, es decir homocigotas recesivos)
diferencia respecto a su predisposición a contraer usando el gen humano como transgén. Espero que a
Alzheimer experimental (enfermedad caracterizada ninguno se le ocurra hacer humanos transgénicos para
por una acelerada desmielinización a nivel cerebral). Alzheimer…..
Se localizó en dicho mapa de ligamiento, además, un 2) El clonado molecular de genes de resistencia (R) a
locus (gen de expresión recesiva) involucrado en di- enfermedades en plantas es un viejo objetivo de los
cha predisposición. El mencionado gen (al que se de- fitopatólogos que trabajan en interacción huésped-
38
patógeno. A fines de los ’90 se clonaron los primeros especiales? ¿Se requiere, dentro de lo anterior, mo-
genes R por estrategias de clonado posicional (ver dificar el promotor y el terminador? ¿Por qué? ¿Se
figura) y en la actualidad ya hay decenas de estos ge- debe tener alguna consideración acerca del genotipo
nes en el GeneBank y otras bases de datos. Ud se in- que se va a transformar? Es decir ¿se puede usar un
volucra en un proyecto de este tipo para su tesis y tie- clon de la misma planta que se usó para clonar el gen
ne que resolver un número de cuestiones: de resistencia?
En el último paso (el ) se secuencian los insertos, se
identifican las ORF (secuencias abiertas de lectura)
presentes, las que se constituyen en candidatos a ge-
nes R.
f) ¿Cómo se identifica una secuencia ORF en un in-
serto?
g) ¿y si hay más de una, cómo me doy cuenta de la
correcta?
h) Bioinformáticamente ¿de qué manera puedo asig-
narle una posible función al gen?
Rta: a) Genómicos porque tengo representada una
copia exacta del segmento cromosómico que estoy
identificando, incluyendo regiones no codificantes
que me van a servir para empalmar (identificar sola-
pamientos entre clones) las secuencias con las que se
arma el mapa físico de la región. Si usara clones de
cDNA, no podría empalmar un clon con otro porque
no habría secuencias comunes entre ellos.
b) BACs o YACs porque son los que me permiten
contener insertos más grandes y así poder tener re-
prensada la región cromosómica en el menor número
de clones posible.
c) Las sondas utilizadas para RFLP pueden utilizarse
En el paso  se identificaron marcadores moleculares
como sondas para inspeccionar (“screenear”) la geno-
ligados al locus a distancias genéticas del orden de los
teca y así identificar los clones que se corresponden al
10 cM. En el paso  se obtuvieron marcadores más
segmento cromosómico en estudio. El ordenamiento
cercanos de forma tal de disminuir las distancias físi-
de los insertos lo puedo deducir de estas hibridacio-
cas para que en el paso  poder trabajar con un
nes. Sé que el orden deducido del mapa genético es
número no muy grande de clones.
M1-M3-M4-M2. El mapa físico, en cambio, sólo me
a) ¿Con qué tipo de colecciones (libraries) de clones
permite ubicar M3 y M4 porque no tengo clones que
se trabaja para hacer esto?
abarquen a M1 y M2 (+ el gen que quiero clonar) y
i) genómicos
sean contiguos a M3 y M4. Por lo tanto, el inserto del
ii) o de cDNA
clon 1 (que sólo hibrida con M3) tiene que estar ubi-
y ¿por qué?
cado en un extremo y así sucesivamente. La ocurren-
b) ¿Qué tipo de vectores se utilizan (plásmidos, fagos,
cia de insertos que hibridan un marcador y al gen
cósmidos, BAC o YAC) y porqué?
(clones 3 y 4) facilitan este ordenamiento.
c) Suponiendo que los marcadores moleculares em-
d) 600-700 kpb / 0,2 cM = 2000 – 3500 kpb
pleados (M1, M2, M3 y M4) son RFLPs ¿Cómo se
Porque uma proviene del mapeo genético que se reali-
hace (metodológicamente) para identificar los clones
za mediante cruzamiento y recuento de recombinantes
1, 2, 3 y 4 de la figura y su ordenamiento posicional
(unidades de recombinación o cM) y la otra por ma-
(mapa fisico)?
peo de restricción donde se comparan los tamaños de
d) ¿Cuál es el tamaño físico aproximado (en kilo-
los insertos com estándares de tamaño molecular en
pares de bases) de 1 unidad de mapa genético (1 cM)
kilo pare de bases.
en el ejemplo de la figura?
e) Si se decide utilizar transformación mediada por
¿Por qué esta diferencia de unidades? ¿Cómo se mide
Agrobacterium tumefaciens, se requiere subclonarlo
cada una de ellas?
en un vector Ti. En el caso de usar biolística (cañón
Una vez identificados los clones correspondientes a
génico), no haría falta subclonar en ningún vector es-
esta región cromosómica, sus insertos se subdividen
pecial. No se requiere cambiar secuencias regulatorias
en tamaños más chicos (paso ) para su subclonado y
porque estamos trabajando con genes y secuencias
transferencia a plantas (paso ) para evaluar a estas
nativas y el experimento no requiere cambiar la regu-
últimas fenotípicamente como R (resistentes) o S
lación de su expresión. No se puede elegir un clon de
(sensibles) a la enfermedad.
la planta de la cual se clonó el gen porque sería resis-
e) Para introducir los segmentos de ADN en plantas
tente independientemente del inserto que se le intro-
¿se requiere de algún paso de subclonado en vectores
39
duzca. Debería elegirse un genotipo susceptible a la M2 separados entre sí por 0,3 cM (aproximada-
enfermedad. mente 600.000 pb). Después, el Dr. Lirón construyó
f, g y h) Identificando codones de iniciación (ATG) y una genoteca de BAC y encontró 4 BACs solapantes
terminación (alguno de los 3 codones STOP) con pro- (A-D) que abarcaban toda la región entre los marcado-
gramas informáticos. Esto se podría complementar res M1 y M2:
mediante la identificación de secuencias consenso de 100 kpb
promotores, terminadores, splicing, etc.Mediante el
uso de BLAST y comparación con otras secuencias ya
publicadas. M1 M2
3) Dos variedades puras de maíz (A y B) pueden ser
distinguidas por una serie de RFLPs, los cuales dan
los siguientes patrones:
A
B
C
D
Con estos BACs (que habían sido obtenidos utilizando
DNA genómico de un ratón sleepy homocigota) el Dr.
Lirón generó 4 líneas transgénicas (una para cada
BAC: LA, LB, LC y LD respectivamente) transfec-
Un consorcio internacional de secuenciación del ge-
tando células de un ratón salvaje. Los ratones de las
noma del maíz de otra variedad, le pide que usted le líneas LB y LC tuvieron un sueño reducido de 2
envíe sondas para poder “anclar” una colección de horas, igual a la de sleepy mientras que los ratones de
BACs al mapa genético. Usted conoce la localización las líneas LA y LD presentaban duraciones de sueño
en el mapa genético de los 7 RFLPs de la figura y sa- similares a los normales.
be, además, que las enzimas utilizadas no cortan de- c) ¿Qué características deberían tener los marcadores
ntro de los fragmentos utilizados como sonda. ¿Cuáles moleculares utilizados por el Dr Lirón para realizar
sondas enviaría y por qué? este mapeo? ¿De qué tipo de marcadores se trataría,
Rta: Enviaría las sondas correspondientes a los probablemente? ¿Cómo explica los resultados obteni-
RFLPs 213, 48 y la 1112 dado que parecen ser de co- dos? ¿En qué región del mapa que se presenta se en-
pia única. Evitaría las demás porque parecen hibridi- cuentra el gen mutado?
zar con más de una región del genoma y por lo tanto d) ¿Hubiera obtenido los mismos resultados transfec-
podrían inducir al error al hibridizar con BACs que tando ratones sleepy con BACs procedentes de ratones
no son contiguos. salvajes? ¿Por qué?
4) El Dr. Lirón estudió la duración de la fase alfa en el Durante el tiempo que le tomó realizar todos estos
sueño de ratones y encontró un mutante, al que llamó experimentos, salió publicado el borrador del genoma
sleepy, cuya fase alfa duraba 2 horas, mientras que en de ratón (salvaje) por lo que, basado en la secuencia
los ratones salvajes la misma es de 4 horas. Al cruzar de la región en la que determinó que estaba su gen
un sleepy con otro ratón salvaje, la mitad de los des- mutante, encontró 3 posibles genes.
cendientes resultó mutante y la mitad salvaje. MM_213: secuencia homóloga a un gen de Danio re-
a) El ratón analizado ¿era homocigota o heterocigota rio (pez cebra) pero careciendo promotor.
para el gen sleepy? ¿Se trata de un alelo dominante, MM_437: gen constitutivo involucrado en la glucóli-
recesivo, codominante o semidominante? Justifique su sis.
respuesta. MM_854: gen de función desconocida que presenta
Al concurrir a un congreso internacional de sonambu- enhancers propios de genes que se expresan en el sis-
lismo, Lirón se encuentra con un colega que encontró tema nervioso central.
otro mutante similar. El investigador decide verificar e) ¿Cómo se hizo, bioinformáticamente hablando, pa-
si el gen involucrado es el mismo que él encontró. ra adjudicar estas funciones hipotéticas a estos 3 ge-
Para ello, utiliza una línea homocigota para el gen nes? Explique, si resulta pertinente, si debe emplear
sleepy y la cruza con los ratones, también homocigota técnicas moleculares adicionales y programas in-
para el gen en cuestión, del colega. Todos los ratones formáticos.
de la F1 tuvieron sueño alfa reducido. Luego cruzó la f) ¿Cuál o cuáles elegiría como genes candidatos a
F1 con ratones salvajes. De los 200 descendientes que estar relacionados con el sueño?
obtuvo, 180 presentaron sueño alfa reducido mientras Respuestas esperadas:
que 20 presentaban sueño normal. a) Heterocigota. Si estas mutaciones se pueden detec-
b) Los alelos mutantes encontrados ¿pertenecían am- tar fenotípicamente es porque son dominantes.
bos al mismo gen? Justifique su respuesta. En caso b) Si se tratara del mismo gen la F1 tendría ambos
que los genes fueran distintos ¿estarían ligados? ¿a alelos del mismo gen mutantes (homocigota). Al rea-
qué distancia? lizar la cruza de la F1 con una cepa salvaje, todos los
El siguiente objetivo del Dr. Lirón decidió mapear el ratones (salvo que haya recombinación intragénica
gen mutado. Para ello, utilizando 200 marcadores mo- que es muy poco probable) resultarán heterocigotos:
leculares, logró ubicarla entre dos marcadores M1 y -la mitad para la mutación de la línea sleepy
40
-la otra mitad para la mutación de la línea del colega de hecho posiblemente dicha mutación sea letal en
Dado que ambas mutaciones son dominantes, todos homocigosis.
los ratones de la descendencia deberían tener sueño El MM_854 es un buen candidato porque es un gen
reducido. Dado que éste no es el caso (hay un 10% de que posiblemente se exprese diferencialmente en sis-
ratones salvajes) podemos descartar que se trate del tema nervioso central.
mismo gen. 5) Carol Martinson recibió unas muestras de aránda-
Si el gen mutado es el C/c y el mutado en la otra línea nos de un productor que aducía que las plantas que
es el R/r entonces la F1 de la cruza será CcRr. Al cru- había comprado en la empresa Truchex (SRL, Socie-
zar con ratones salvajes (ccrr), si los genes no están dad de responsabilidad MUY limitada) no rendían ni
ligados tendremos ¼ CcRr, ¼ Ccrr, ¼ ccRr y ¼ ccrr tenían la calidad prometida. Para genotipificar, Carol
donde todos los genotipos salvo el ccrr (que tiene comparó los patrones de marcadores moleculares con
memoria normal) tienen memoria reducida (algunos la muestra problema (número 2, supuestamente perte-
genotipos más que otros). Es decir que si los genes no neciente a la variedad O’Neil) con muestras de mate-
están ligados esperaríamos tener ¼ de ratones con rial de multiplicación del INTA Concordia de O´Neal
memoria normal, lo cual no es el caso. Por lo tanto, y de otra variedad muy usada (Misty), tanto de mate-
los genes están ligados. rial in vitro como de las plantas derivadas de micro-
CCrr x ccRR propagación puestas a campo, obteniendo el siguiente
C r x c r electroforetograma:
c R c r
Las gametas parentales del cruzamiento prueba son Cr
y cR mientras que las recombinantes son CR y cr. Da-
do que en la descendencia del cruzamiento prueba 20
individuos son ccrr, entonces un 10% de las gametas
producidas por la F1 son cr. Un porcentaje equivalen-
te debe ser CR que es el producto complementario de
recombinación. Es decir que el 20% de las gametas
son recombinantes con lo que la distancia entre los
genes es de 20 u.m.
c) Debió utilizar marcadores STS, es decir marcadores
de localización única.
Si un BAC porta el alelo mutante al generar la línea
transgénica, ésta tendrá insertado en algún lugar del
genoma. Como el alelo mutante es dominante se va a
poder expresar aún en presencia de uno (suponiendo
reemplazo alélico) o dos (suponiendo integración
ectópica) copias del alelo salvaje.
Dado que los BACs B y C presentan el fenotipo mu-
tante ambos BACs contienen al gen completo. Por
este motivo podemos localizar al gen en la zona de
solapamiento de los BACs B y C (de aproximadamen- Fig Patrones de amplificación de RAPDs. Las diferen-
te 100 kpb). tes calles representan los productos de amplificación
d) No, si hubiese usado BACs procedentes de ratones obtenidos para las distintas muestras: 1 (O’Neal, certi-
salvajes para transfectar ratones sleepy, los ratones ficado, in vitro), 2 (supuesto O’Neal), 3 (O’Neal de
transfectados hubiesen sido todos con fenotipo sleepy campo), 4 (Misty de campo) y 5 (Misty, certificado, in
ya que este alelo es dominante sobre el alelo normal. vitro).
e) Se secuenció la región de solapamiento de los clo- a) ¿Qué significan las bandas marcadas con flechas
nes BAC B y C, subclonados en vectores plasmídico, negras que Carol dibujó sobre la foto? ¿En qué se di-
se realizó un ensamblado de los mismos y los contigs ferencian de las bandas marcadas con flechas blancas?
obtenidos fueron analizados para la detección de mar- ¿Cuáles de los 2 tipos de bandas fueron útiles para
cos de lectura abiertos y se compararon los mismos este análisis?
con secuencias en bases de datos, utilizando progra- b) ¿Pertenecía la muestra 2 a la variedad O´Neal o no?
mas de comparación local como BLASTX y Computando las bandas y armando una base de datos,
BLASTN pudiendo predecir en base a la similitud de Carol calculó la similitud entre las muestras y obtuvo
las secuencias contenidas en esa región con secuen- el siguiente dendrograma:
cias de función conocida disponibles en bases de datos c) Ubique las muestras 2, 3 y 4 en los casilleros en
f) El MM_213 no es un buen candidato porque como blanco del dendrograma.
le faltan secuencias presentes en los promotores, posi- d) En las comparaciones, Carol incluyó material mi-
blemente no se transcriba (y sea un pseudogen). cropropagado in vitro y de campo ¿Existe alguna
El MM_437 tampoco es un buen candidato porque es razón por la cual podrían ser diferentes y explicar lo
un gen constitutivo y fundamental para la glucólisis. que pasó?
Su mutación debería afectar más cosas que el sueño y
41
a) Describa brevemente las diferencias observadas
entre transgénicas y normales.
b) ¿Cómo interpreta que, en la transgénica, la sonda
detecta mRNA de nos en la parte anterior (izquierda)
del embrión (además de en la parte posterior)?
c)¿Por qué el transgénico con la construcción 1 pre-
senta el fenotipo mutante bicoid?
d) Brevemente ¿qué resultados esperaría con la cons-
trucción 3?
e) ¿Eesperaría resultados diferentes si, en la construc-
ción 1, se reemplaza el promotor nos por el promotor
bcd? ¿Por qué?
Rta: a) Las flechas negras indican las bandas polimór- 3) a) fenotipos: normal y bicoid. Hibridación in situ
ficas (variables) y las blancas indican bandas mono- con sonda nos: hibrida en la parte posterior en el nor-
mórficas. Las negras fueron las útiles porque permiten mal, anterior y posterior en el transgénico. Con la
establecer DIFERENCIAS además de similitudes. sonda bcd, no se detectan diferencias.
b) No c) 3, 4 y 2 b) Porque la secuencia 3’UTR es la responsable de la
d) Para los brillantes: podría haber variación somaclo- unión a proteínas del citoesqueleto. La secuencia
nal (mutación causada por el hecho de cultivar in vi- 3’UTR bcd es diferente a la nos y “pega” el mRNA
tro) del transgén nos a la parte anterior. Debe recordarse
Desarrollo, epigenética, etc. que el transgén se adiciona y no reemplaza a los genes
1) Las etapas más tempranas del desarrollo en moscas normales presentes en la mosca. Por eso se detecta,
se explican, en parte, por la distribución subcelular de como era de esperar, mRNA de nos en la parte poste-
los transcriptos de genes maternos como el bicoid rior igual que en el normal.
(bcd) y el nanos (nos), dado que los mismos están ad- c) Es consecuencia de la expresión, en la parte ante-
heridos al citoesqueleto. Con el objeto de estudiar por rior, del relocalizado producto del transgén nos, que
donde se une un ARN mensajero al citoesqueleto, se interfiere con la del bcd y el resultado es un embrión
realizaron una serie de construcciones quiméricas: con 2 colas (bicoid)
1 Promotor 5’UTR nos Codif. 3’UTR d) Todo daría igual que en el normal porque la región
nos nos bcd 5´ no codificante, no tiene función en la localización
2 Promotor 5’UTR nos Codif. 3’UTR subcelular.
nos bcd nos e) No, porque ambos genes son del mismo tipo (ma-
3 Promotor 5’UTR bcd Codif. 3’UTR terno) y se expresan en forma relativamente sincroni-
nos nos nos zada y similar.
UTR (untranslated región) simboliza el DNA que es- 2) Muchos tipos de cáncer humano tienen su causa en
pecifica los extremos 5’ y 3’ no codificantes del la hipometilación del ADN. Para estudiar este fenó-
mRNA. meno se generaron ratones transgénicos conteniendo
Como puede observarse, se reemplazaron 3 segmentos alguna de estas construcciones:
de nos (de a uno por vez) por los respectivos segmen- i) Vector conteniendo un promotor de SV40 (constitu-
tos de bcd. tivo, proveniente de un adenovirus) controlando la
Con los mismos, se transformaron genéticamente expresión de la secuencia estructural de la metiltrans-
moscas silvestres y se analizaron los embriones tem- ferasa 1 (Dnmt1) en orientación antisentido
pranos por hibridación in situ de mRNAs en el em- ii) Vector conteniendo un promotor de SV40 (consti-
brión utilizando como sonda un cDNA de nos (segun- tutivo, proveniente e un adenovirus) controlando la
da fila) o bcd (tercera fila). En la primera fila, se ob- expresión de la secuencia de la metiltransferasa 1
serva el aspecto del embrión en una etapa más avan- (Dnmt1) en orientación sentido
zada. La figura siguiente muestra el resultado que se iii) Vector conteniendo el promotor constitutivo pro-
obtuvo con la construcción 1 en moscas silvestres veniente del fago  controlando la expresión de la se-
(primera columna) y moscas transgénicas (segunda cuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en
columna). orientación sentido.
iv) Vector conteniendo el promotor constitutivo pro-
veniente del fago  controlando la expresión de la se-
cuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en
orientación antisentido
Se sabe que la enzima Dnmt1 controla la metilación
del ADN en ratones y que su sobre-expresión permite
metilar exhaustivamente todo potencial ADN metila-
ble y que su disminución causa una sustancial hipo-
metilación del ADN en todos los tejidos.
a) ¿Cuál de los 4 vectores usaría? ¿Por qué?
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b) En base al vector elegido, ¿cómo espera que sea el metilados para así comparar ambos patrones, dado
grado de metilación general del ratón transgénico? que usar sólo una enzima que sí reconoce sitios meti-
Explique el mecanismo lados, no es capaz de diferenciarlos de los no metila-
c) ¿Con cuál de las siguientes técnicas corroboraría dos. Una complicación (que no es necesario explicitar
que el ADN está hipometilado? Justifique: en la respuesta correcta) es que los genes metilados
i) digestión con sendas ER que reconocen sitios meti- por imprinting tienen una copia (epialelo) metilado y
lados y no metilados, respectivamente, seguido de otro no metilado.
Southern Blot con la sonda Dnmt1 d) Cruzaría 2 homocigotas: por ej. ♂ homocigotas
ii) ensayo de protección a la digestión por ADNasaI para Tm1 y ♀ Tm2. Después, analizaría en la F1 la
iii) preparación de ARN de ratón salvaje y ratón correspondencia entre metilación (por ej. por secuen-
transgénico, seguida de Northern Blot con la sonda ciación bisulfítica que, además, me revelará la presen-
Dnmt1 cia/ausencia del sitio EcoRI en el epialelo metilado).
iv) digestión con ER que reconocen sitios metilados, (La otra alternativa es una doble digestión con ER
seguido de Southern Blot con la sonda de igf2 (insu- sensible/insensibles a metilación + EcoRI seguido de
lin-like growth factor-2, conocido gen que sufre im- Southern). En base a cual alelo aparezca metilado de-
pronta génica) terminaré si el imprinting es paterno o materno. La
v) secuenciación bisulfítica genómica directa de confirmación del imprinting se puede hacer realizando
Dnmt1y/o igf2 un cruzamiento “prueba” con el parental que no metila
vi) secuenciación bisulfítica del cDNA de Dnmt1y/o sus gametas. Debería ver un 50% de la progenie con
igf2 metilación para cada alelo.
Para la/s técnica/s elegida/s indique los controles que e) 25% de individuos Tm1 homocigotas con una copia
haría. de las 2 metiladas (Tm1m/Tm1), 25% Tm2 homocigo-
El ratón transgénico desarrolló tumores en varios teji- tas ídem (Tm2m/Tm2), 25% de heterocigotas con meti-
dos. Se determinó que el gen Tm, candidato a causar lación en Tm1 (Tm1m/Tm2) y 25% de heterocigotas
tumores en hígado, se encontraba hipometilado en con metilación en Tm2 (Tm2m/Tm1).
estos ratones. Ud. sabe que Tm presenta dos alelos, 3) Los genes fushi-tarazu (ftz) y engrailed (en) codifi-
Tm1: sin sitio para EcoRI y Tm2 con sitio para EcoRI. can factores de transcripción con homeodominio y
d) ¿Cómo haría para probar que Tm sufre impronta pueden producir la expresión de otros genes. Ambos
(imprinting) en ratones salvajes? Ud cuenta tanto con genes actúan aproximadamente en el mismo momento
ratones homocigotas como con heterocigotas. durante el desarrollo y en la misma región para espe-
e) Suponiendo que realmente existe impronta de Tm cificar destinos celulares en los segmentos corporales.
en el macho ¿cómo sería la proporción de Tm1 y Tm2 Estudios experimentales de mutantes evidenciaron
metilados y no metilados en la F2, es decir los nietos que en embriones ftz (-), no hay proteína engrailed
de un cruzamiento entre ratones ♂ homocigotas para mientras que en embriones en (-) la expresión de ftz es
Tm1 y ♀ Tm2? normal.
Respuesta a) El i) porque es el único que tiene un i) ¿Regula engrailed la expresión de fushi-tarazu o
promotor que se expresa en células eucarióticas y tie- sucede lo contrario?
ne potencialidad de reducir la actividad de mutilación ii) Indique cuando se expresan estos genes y cual es la
bloqueando la traducción del gen que codifica la en- función principal de cada uno de ellos.
zima Dmnt 1. Contestación no necesaria: Podría venir iii) ¿Se expresan estos genes durante toda la vida del
bien usar al vector ii) pero sólo como CONTROL organismo? En caso afirmativo justifique.
contrastante del experimento. Las construcciones de Rta:
los vectores iii) y iv) no se expresarían en células eu- 4) Durante el desarrollo de la mosca Drosophila me-
carióticas porque  sólo funciona en bacterias. lanogaster participan varias moléculas conocidas co-
b) Altamente reducida. El RNA antisentido (comple- mo morfógenos, siendo en las primeras etapas, de
mentario) de Dmnt 1 formará una doble cadena de origen materno (los mRNAs que codifican para dichos
RNA con el mensajero nativo dificultando su traduci- morfógenos se traducen en el huevo, pero provienen
bilidad. Al reducirse la cantidad de enzima, se reduce de las células nutricias maternas). Ejemplo de esto y
también el efecto de la misma. responsables del establecimiento del eje antero-
c) La v) dado que este tipo de secuenciación permite posterior son:
detectar nucleótidos metilados. Se debe secuenciar un -en la parte anterior del embrión, BICOID (bcd) y
gen ya caracterizado como metilado. No sabemos si más tardíamente HUNCHBACK (hb), productos de
éste es el caso del gen Dmnt1 y lo más probable es los respectivos mRNA maternos.
que no lo sea. En todo caso, Dmnt1 puede servir como -en la parte posterior del embrión, NANOS (nos) y
control (no metilado). En realidad, el control más im- más tardíamente CAUDAL (cd), productos de los res-
portante es comparar con la secuenciación común pectivosmRNA maternos. Se demostró también que:
(que es insensible a la metilación) y (como se indica -la proteína bcd reconoce el 3’UTR del mRNA de
después) ratones transgénicos vs no transgénicos. La cd y enla región promotora del gen hb
iv) sirve si se compara el patrón de restricción de -la proteína nos reconoce el 3’UTR del mRNA de
ratón transgénico vs no transgénico. También podría hb. I) ¿Qué tipo de acción presentan bcd y nos según
ser aceptada como válida si se explica que se usa ER lo comentado anteriormente? Para contestar complete
que NO reconocen sitios metilados, además de los el siguiente esquema con flechas de unión: (conven-
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ciones:  activación, ---| inhibición). perimentos de la Fig asignando en cada caso, alguna
de las 4 opciones que se muestran debajo de la figura,
en donde se ha ensayado el agregado de mRNA bcd
en embriones con diferentes fondos genéticos En la
Figura siguiente, complete (con flechas) el esquema
de los resultados de inyección de mRNA de bcd.
II) Con toda la información que tiene acerca de bcd,
complete los fenotipos que espera observar en los ex-

Rta I)
bcd nos

gen mRNA hb cd mRNA cd


HB hb
Explicación: bcd y nos son los morfógenos de la parte anterior y posterior: bcd actua como factor de trans-
cripción para hb regulando positivamente su transcripción, pero también es un inhibidor de la traducción del
morfógeno cd, que es más tardío. Análogamente, nos es un inhibidor del morfógeno más tardio de la parte ante-
rior, hb.
II) Explicación: bcd es el morfógeno principal anterior, ya que donde se coloca, se generan zonas que darán
lugar a estructuras anteriores (cabeza y torax). El esquema del primer experimento sería análogo a una comple-
mentación (mutante bcd-, con fenotipo WT por el agregado del morfógeno anterior en la zona correspondien-
te).
Desarrollo normal Desarrollo en mutante bcd- inyectado adelante inyectado al medio iny. atrás en salvaje

? ? ?

Las 4 opciones para los 3


casos incógnita 