PRCTICA 5 PURIFICACIN ADN Y ELECTROFORESIS Etapa 2. SEPARACIN Y VISUALIZACIN DE CIDOS NUCLEICOS POR ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA.

INTRODUCCIN Se pueden detectar fcilmente pequeas diferencias entre molculas similares de ADN y ARN separndolas mediante electroforesis en gel. En muchos tipos de geles, la movilidad electrofortica de un fragmento de ADN es inversamente proporcional al logaritmo del nmero de pares de bases, dentro de un cierto lmite. Se utilizan geles de poliacrilamida para separar fragmentos de hasta unos mil pares de bases, y geles ms porosos, de agarosa, para resolver mezclas de fragmentos mayores. La agarosa es un polmero lineal, procedente de las algas rojas, en el que se alternan D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa. Una caracterstica importante de estos geles es su alto poder de resolucin. Adems es posible visualizar los cidos nucleicos separados en el gel si a ste se le aade bromuro de etidio durante su preparacin. El bromuro de etidio es un compuesto fluorescente con capacidad de intercalarse entre los pares de bases de los cidos nucleicos, haciendo posible su visualizacin cuando el gel es iluminado con luz ultravioleta. Como del bromuro de etidio es un compuesto altamente cancergeno, en esta prctica se utilizar un reactivo alternativo denominado Texas RedTM, con el que se visualizarn las bandas de ADN. MATERIALES Y REACTIVOS Agarosa Texas RedTM 5000X Buffer de electroforesis 50X TAE Buffer de carga: PROTOCOLO Preparacin del gel. Se utilizar un gel de agarosa al 1 %. Para prepararlo: 1) Se aaden 0.4 g de agarosa a 40 ml de agua destilada conteniendo 500 l de buffer TAE, se mezcla bien y se calienta en una parrilla hasta que la agarosa se disuelva sin que llegue a hervir. 2) Cuando no est tan caliente se aaden 0.2 l de Texas Red y se remueve para que se mezcle. 3) Mientras tanto se prepara la placa donde se va a polimerizar el gel, sellando sus extremos con cinta adhesiva e introduciendo el peine para formar los pocillos.

4) Una vez que la agarosa no est tan caliente se vierte sobre la placa y se deja polimerizar. 5) A continuacin se saca el peine con cuidado y se retira la cinta adhesiva. Electroforesis. 1) Se aaden 2 l de buffer de carga a 4 l de ADN aislado previamente. 2) Se introduce la muestra en el pocillo con ayuda de una punta y una micropipeta. 3) Se separan las muestras en buffer 1X TAE a 90 voltios durante 45-60 min. 4) Una vez terminada la electroforesis, el gel se visualiza en un transiluminador con luz ultravioleta. Las bandas de ADN se vern de color verde.