NACIONES UNIDAS OFICINA CONTRA LA DROGA Y EL DELITO

MTODOS RECOMENDADOS PARA LA IDENTIFICACIN Y EL ANLISIS DE

ANFETAMINA, METANFETAMINA Y SUS ANLOGOS CON ANILLO SUSTITUIDO

EN MATERIALES DECOMISADOS
(Revisados y actualizados)

MANUAL PARA USO DE LABORATORIOS NACIONALES DE ENSAYO DE ESTUPEFACIENTES

V.05-86469

Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos OFICINA DE LAS NACIONES UNIDAS CONTRA LA DROGA Y EL DELITO Viena

MTODOS RECOMENDADOS PARA LA IDENTIFICACIN Y EL ANLISIS DE

ANFETAMINA, METANFETAMINA Y SUS ANLOGOS CON ANILLO SUSTITUIDO

EN MATERIALES DECOMISADOS
(Revisados y actualizados)

MANUAL PARA USO DE LABORATORIOS NACIONALES DE ENSAYO DE ESTUPEFACIENTES

NACIONES UNIDAS Nueva York, 2005

La mencin de nombres de empresas y productos comerciales no implica opinin alguna de parte de las Naciones Unidas. La presente publicacin no ha pasado por los servicios de edicin.

ST/NAR/34

AGRADECIMIENTOS
La Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la ONUDD desea expresar su agradecimiento a los expertos que participaron en la Reunin de Consulta sobre El examen de los mtodos para la identificacin y el anlisis de estimulantes de tipo anfetamnico y sus anlogos con anillo sustituido en material decomisado por su contribucin al contenido del presente manual. Sra. Rosa Alis Rodrguez, Laboratorio de Drogas y Sanidad de Baleares, Palma de Mallorca (Espaa) Dr. Hans Bergkvist, SKL Laboratorio Nacional de Ciencias Forenses, Linkping (Suecia) Sra. Warank Boonchuay, Divisin de Anlisis de Estupefacientes, Departamento de Ciencias Mdicas, Ministerio de Salud Pblica, Nonthaburi (Tailandia) Dr. Rainer Dahlenburg, Bundeskriminalamt / KT34, Wiesbaden (Alemania) Sr. Adrian V. Kemmenoe, The Forensic Science Service, Birmingham Laboratory, Birmingham (Reino Unido) Dr. Tohru Kishi, Instituto Nacional de Investigacin de Ciencia Policial, Chiba, Japn Dr. Waldemar Krawczyk, Laboratorio Forense Central de Polica, Ministerio del Interior y Administracin, Varsovia, Polonia Sr. Ira Lurie, Special Testing and Research Laboratory, Drug Enforcement Administration, McLean, Virginia (Estados Unidos de Amrica) Dr. Yukiko Makino, Departamento de Fiscalizacin de Estupefacientes, Kanto-Shinetsu Oficina de Salud y Bienestar, Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Tokio (Japn) Sr. Tim McKibben, Special Testing and Research Laboratory, Drug Enforcement Administration, McLean, Virginia (USA) Sra. Anneke Poortman, Laboratorio de Ciencias Forenses, Ministerio de Justicia, Rijswijk (Pases Bajos) Sra. Jana Skopec, Australian Government Analytical Laboratories, Pymble, NSW (Australia) Sr. Takahiro Terasaki, Kanto-Shinetsu Oficina Regional de Fiscalizacin de Estupefacientes, Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Tokio (Japn) La Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la ONUDD desea tambin expresar su agradecimiento a la Sra. Jana Skopec por la revisin, actualizacin y finalizacin del manuscrito, tambin con contribuciones adicionales de los participantes en la reunin1.

Tambin se agradece mucho la revisin del proyecto del manual que hizo el Dr. Ken Tanaka, de la Agencia Nacional de Polica del Japn.

iii

ndice
I. II. III. IV. INTRODUCCIN .......................................................................................................... EMPLEO DEL MANUAL ............................................................................................... CLASIFICACIN / DEFINICIONES.............................................................................. DESCRIPCIN DE LOS COMPUESTOS PUROS ...................................................... A. B. V. A. B. C. VI. A. Estereoqumica .................................................................................................... Caractersticas fsicas .......................................................................................... Sntesis de la anfetamina..................................................................................... Sntesis de la metanfetamina............................................................................... Sntesis de ETA con anillo sustituido ................................................................... Ensayos presuntivos ............................................................................................ 1. 2. 3. B. C. Ensayos cromticos..................................................................................... Ensayo de aniones ...................................................................................... Ensayos de microcristales ........................................................................... 1 2 3 4 4 5 6 7 8 10 13 13 13 17 19 19 25 26 27 27 29 31 31 33 35 37 38 38 40 40 42 42 43 45 45 46 46

FABRICACIN ILCITA DE ETA ..................................................................................

ANLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE ETA ................................................

Cromatografa de capa delgada (CCD) .............................................................. Cromatografa en fase gaseosa (CG) detector de ionizacin por llama (FID) 1. 2. Anlisis cualitativo ....................................................................................... Anlisis cuantitativo ..................................................................................... i. ii. Mtodo A: mtodo estndar nico ........................................................ Mtodo B: mtodo estndar mltiple sin derivatizacin ......................

iii. Mtodo B: mtodo estndar mltiple con derivatizacin ..................... D. E. F. G. Cromatografa en fase gaseosa espectrometra de masas (CG-EM) ............ Cromatografa lquida de gran rendimiento (CLGR) ........................................... Espectrometra infrarroja transformada de Fourier (FTIR) ................................. Anlisis de ismeros pticos................................................................................ 1. 2. 3. Punto de fusin ............................................................................................ Ensayos de microcristales ........................................................................... Tcnicas instrumentales .............................................................................. i. ii. Tcnicas de CG .................................................................................... Tcnicas de CLGR................................................................................

iii. Tcnicas de EC..................................................................................... iv. Tcnicas IR ........................................................................................... VII. OTRAS TCNICAS ANALTICAS PARA EL ANLISIS DE ETA................................. A. B. C. Tcnicas de resonancia magntica nuclear H (RMN) ....................................... Electroforesis capilar (EC) .................................................................................. Cromatografa en fase slida microextraccin en fase slida (CG-SPME)
1

1. 2. D.

Mtodo de anlisis de cabeza .................................................................... Anlisis (de trazas) de muestras acuosas..................................................

47 47 47 49

Cromatografa en fase gaseosa espectroscopa infrarroja transformada de Fourier (CG-FTIR) ...............................................................................................

ANEXOS................................................................................................................................

vi

I.

INTRODUCCIN

En el plano internacional la atencin se centra cada vez ms en una cuestin de importancia creciente: los estimulantes de tipo anfetamnico (ETA). En particular durante los ltimos 10 a 15 aos, el uso indebido de ETA relacionado con las anfetaminas (anfetamina y metanfetamina) y sustancias del grupo xtasis (MDMA, MDA, MDEA, etc.), ha pasado a ser un problema mundial. Aunque hay diferencias regionales, en la actualidad ningn pas est a salvo de una de las mltiples facetas de la fabricacin, el trfico o el uso indebido de ETA. Esta nueva situacin, que con frecuencia abarca ETA nuevos y desconocidos, o combinaciones, y las tendencias del trfico plantean un desafo tanto a las autoridades nacionales encargadas de hacer cumplir la ley como al personal cientfico de los laboratorios forenses. Hoy en da, los analistas deben estar en condiciones de analizar una amplia gama de sustancias y preparados, y deben utilizar mtodos ms precisos y cientficos de identificacin y anlisis a fin de hacer frente al mayor nmero de anlisis necesarios y a los requerimientos de las leyes nacionales ms estrictas contra las drogas. Adems, el carcter internacional del trfico de drogas requiere el intercambio oportuno de datos analticos entre laboratorios y los servicios de represin en los planos nacional, regional e internacional. Por estas razones, la Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la ONUDD comenz a principios de los aos 80 a ejecutar un programa de armonizacin y establecimiento de mtodos de ensayo recomendados para laboratorios nacionales de ensayo de drogas. En septiembre de 1998, la Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la ONUDD, en cooperacin con el Servicio de Ciencias Forenses del Reino Unido, organiz una reunin consultiva con la participacin de 13 expertos para examinar mtodos para la identificacin y el anlisis de estimulantes de tipo anfetamnico (ETA) y sus anlogos con anillo sustituido en material decomisado. El presente manual refleja las conclusiones de esa reunin, que fueron revisadas y actualizadas nuevamente en 2004/2005. Ofrece asistencia prctica a las autoridades nacionales describiendo mtodos recomendados para su empleo en laboratorios de ensayo de drogas con miras a identificar y analizar estimulantes de tipo anfetamnico (ETA) y sus anlogos con anillo sustituido. El presente manual forma parte de una serie de publicaciones similares que tratan de la identificacin y el anlisis de diversos grupos de drogas sometidas a fiscalizacin internacional. Combina y reemplaza manuales publicados anteriormente sobre Mtodos recomendados para el ensayo de anfetamina y metanfetamina (ST/NAR/9, 1987) y Mtodos recomendados para el ensayo de los derivados anfetamnicos ilcitos con anillo sustituido (ST/NAR/12, 1988). El presente manual y los anteriores proponen enfoques que pueden ayudar a los analistas de drogas a seleccionar mtodos apropiados a la muestra que se examina, con la posibilidad tambin de adaptarlos al nivel de adelanto de los diferentes laboratorios. Por primera vez en esta serie de publicaciones, el presente manual tiene tambin anexos con mtodos validados seleccionados. La mayora de los mtodos que se describen han sido publicados en la bibliografa cientfica, y han sido utilizados durante un cierto nmero de aos por laboratorios de reputacin conocida. Al identificar esos mtodos, la Reunin Consultiva tuvo presente que haba varios otros mtodos publicados en la literatura de las ciencias forenses que tambin producan resultados aceptables. El presente manual se limita a los mtodos analticos para los ETA. Un manual separado sobre tcnicas analticas ms generales, y sus caractersticas y empleos prcticos para el anlisis de drogas, complementa esta serie de manuales sobre mtodos recomendados.

II.

EMPLEO DEL MANUAL

No todos los mtodos descritos en el presente manual deben aplicarse a todas las muestras sospechosas de ser o contener anfetamina, metanfetamina u otros ETA. La eleccin del mtodo y el enfoque de su anlisis quedan a la discrecin de los analistas y dependen del tipo de droga de que se trate, la disponibilidad de los instrumentos y los materiales de referencia apropiados, as como del nivel de prueba jurdicamente aceptable en la jurisdiccin en que trabajan los analistas. Por consiguiente, si bien se reconoce que los requisitos exclusivos de diferentes jurisdicciones pueden determinar las prcticas que aplican los diferentes laboratorios, las Buenas Prcticas de Laboratorio exigen que un enfoque analtico para determinar la identidad de una sustancia sometida a fiscalizacin en material sospechoso comprenda, como mnimo, la determinacin de por lo menos dos parmetros no relacionados entre s. La seleccin de esos parmetros en cualquier caso particular deber tener en cuenta la droga de que se trate y los recursos de laboratorio de que dispone el analista. Cuando sea posible, se deben utilizar tres tcnicas analticas totalmente diferentes: ensayos cromticos, cromatografa (por ejemplo, CCD, CG o CLGR) y espectroscopa (por ejemplo, IR o UV). Las tcnicas compuestas, como CG-EM, cuentan como dos parmetros, siempre que se utilice la informacin de ambas tcnicas (por ejemplo, el tiempo de retencin y las caractersticas del espectro de masa). Se hace hincapi tambin en la importancia fundamental de que los analistas de drogas dispongan de libros de referencia sobre drogas de uso indebido y tcnicas analticas. Adems, el analista debe necesariamente estar al corriente de las tendencias del momento en el anlisis de drogas, ajustndose coherentemente a la literatura sobre ciencias forenses y anlisis de actualidad. La ONUDD ayuda a los laboratorios a este respecto proporcionando, previa solicitud, artculos seleccionados de la literatura cientfica. La Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la ONUDD agradecer todas las observaciones que se le hagan llegar sobre el contenido y la utilidad del presente manual. Los comentarios y las sugerencias se pueden dirigir a: Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos Oficina de las Naciones Unidas Contra la Droga y el Delito Centro Internacional de Viena P. O. Box 500 A-1400 Viena (Austria) Fax: +43-1-26060-5967 Correo-e: lab@unodc.org Todos los manuales, as como las directrices y otras publicaciones cientficas y tcnicas se pueden solicitar a la direccin mencionada ms arriba.

III.

CLASIFICACIN / DEFINICIONES

Los estimulantes de tipo anfetamnico (ETA) son un grupo de sustancias, en su mayora de origen sinttico, estructuralmente derivadas de la -fenetilamina (-PEA, grfico 1). Los ETA por lo general estimulan el sistema nervioso central. Por lo tanto son considerados, en diverso grado, como prototipos de estimulantes del sistema nervioso central con un potencial de toxicidad sictica cuando se usan en dosis excesivas o por largos perodos. Los NH2 ETA pueden producir uno o ms sntomas relacionados con la dosis, incluido un estado de mayor alerta y euforia, pulsaciones aceleradas, mayor presin arterial, respiracin y temperatura corporal. El uso indebido crnico puede producir agitacin, temblores, hipertensin, prdida de memoria, alucinaciones, episodios sicticos, ilusiones Grfico 1 paranoicas y comportamientos violentos. La abstinencia despus de haber tomado dosis altas de ETA puede provocar depresin grave. Los ETA se producen ilcitamente en una variedad de preparados (polvo, tabletas o cpsulas), y se pueden inyectar, ingerir oralmente, esnifar o fumar. La modificacin qumica en los puntos R1 a R9 (grfico 2)2 produce un nmero prcticamente ilimitado de compuestos farmacolgicamente activos, algunos de los cuales son estimulantes ms potentes que otros. Aunque hay varias posibilidades para la modificacin de la cadena lateral, la sustitucin en el anillo aromtico aporta la mayor contribucin a diferencias cualitativas sustanciales en los efectos farmacolgicos.
R9 R8 R3 R4 R1 N R2

R7 R6

R5

Grfico 2

En cuanto a las caractersticas estructurales, los ETA se pueden dividir en tres grandes subgrupos, que corresponden en gran parte a las siguientes pautas de sustitucin en el anillo aromtico: i. ii. iii. Ninguna sustitucin en el anillo aromtico (por ejemplo, anfetamina, metanfetamina, fenetilina); Grupo metilendioxi: sustitucin en el anillo aromtico (por ejemplo, MDA, MDMA, MBDB); Otras pautas de sustitucin, por lo general incluyendo uno o ms de los grupos alkiloxi (por ejemplo, 2C-B, STP/DOM).

Por razones de orden prctico, el presente manual contiene datos especficos slo para una seleccin de los ETA ms comunes. En particular, incluye ETA sometidos a fiscalizacin internacional y ETA seleccionados sometidos a fiscalizacin nacional. Los analistas deben tener presente que se pueden encontrar otros anlogos estrechamente relacionados. En la mayora de los casos, la metodologa presentada se podr aplicar tambin a esos anlogos. Las estructuras qumicas de los ETA seleccionados, junto con los nombres comunes y de la nomenclatura de la Unin Internacional de Qumica Pura y Aplicada (Nomenclatura IUPAC) figuran en el anexo I.

No se muestran todos los otros sustituyentes para saturar las valencias, ya que por lo general se utiliza hidrgeno (H).

IV.

DESCRIPCIN DE LOS COMPUESTOS PUROS

Los ETA se decomisan normalmente en forma de sales, en particular como clorhidratos, sulfatos, fosfatos o sales de bromuro. No obstante, no es difcil que en las investigaciones de laboratorios clandestinos se encuentren esos compuestos tambin en forma de bases (por lo general, un lquido aceitoso de color pardo). Las sales son sustancias cristalinas o en polvo, que varan en coloracin desde el blanco (similar a los productos de calidad farmacutica) hasta el rosado, el amarillo o el pardo. Con frecuencia se encuentran hmedos y despiden un olor desagradable caracterstico, debido a la presencia de residuos de disolventes y/o precursores. Los ETA tambin se pueden encontrar en forma de tabletas. Adems de los ETA activos, las tabletas suelen contener diferentes adulterantes, agentes reductores, colores de alimentos comunes y/o diferentes excipientes y agentes aglutinantes. Anfetamina La anfetamina ilcita se suele encontrar en forma de polvo como sal sulfatada, y rara vez como tableta. En los laboratorios clandestinos se suele decomisar anfetamina base, normalmente como lquido aceitoso pardo con un olor desagradable caracterstico de 1-fenil-2-propanona (P-2P) y/o residuos de disolvente. Metanfetamina La metanfetamina fabricada en forma ilcita est disponible en diferentes formas, segn la regin geogrfica. Estas formas incluyen el polvo, los cristales (comnmente conocidos como Cristal, Ice o Shabu) y las tabletas (comnmente conocidas como Yaba). La forma de sal ms comn es el clorhidrato. ETA con anillo sustituido con un grupo metilendioxi MDMA, MDA y MDEA se encuentran comnmente como tabletas que pueden estar marcadas con un emblema. Rara vez se encuentran en forma de polvos, pero stos contienen concentraciones elevadas de sustancias activas. Las tabletas suelen tener colores brillantes y con frecuencia varan en tamao. El contenido de droga suele oscilar entre 40 y 140 mg. Se sabe de diferencias regionales en el contenido de droga y cambios que se producen con el tiempo. En Europa, por ejemplo, el contenido medio de MDMA en las tabletas de xtasis ha bajado a unos 60-70 mg (en comparacin con unos 100 mg a mediados de los aos 90). La forma de sal de ETA de tipo metilendioxi que se encuentra con ms frecuencia es el clorhidrato, pero tambin se han visto sales de bromuro y fosfatos.

A.

ESTEREOQUMICA

La mayora de los ETA tienen por lo menos un centro quiral y, por lo tanto, pueden encontrarse como mezcla racmica o como enantimeros individuales3. En los mercados ilcitos, la mayora de los ETA se encuentran en un compuesto estereoqumico tpico. La anfetamina, por ejemplo, y la mayora de los ETA con anillo sustituido, se encuentran normalmente como racematos, mientras que la metanfetamina se suele encontrar como enantimero S- o dextro (tambin
3

Los trminos (d) o (+), (l) o () y (d, l) o () se utilizan normalmente para designar la rotacin ptica de sustancias quirales. (R) y (S) describen la configuracin estrica absoluta de sustituyentes en centros quirales individuales, y se prefieren sobre todo en el caso de los diasteremeros.

conocido como Ice o Shabu), adems del racemato. En el captulo VI.G., infra, se describe el anlisis de ismeros pticos.

B.

CARACTERSTICAS FSICAS

Puntos de fusin y de ebullicin Se conocen los puntos de fusin y/o ebullicin de los ETA que se encuentran con ms frecuencia. Los analistas deben tener presente, sin embargo, que esos datos se refieren a sustancias puras4. Con excepcin de los ETA de alta pureza, como la metanfetamina cristalina (Ice), los puntos de fusin se deben utilizar, por lo tanto, slo como ensayo presuntivo (respecto del uso de los puntos de fusin para la diferenciacin de ismeros, vase el captulo VI.G.1, infra). Solubilidades Las solubilidades de ETA seleccionados y sus sales se proporcionan en la seccin sobre ensayo de aniones (pgina 17, infra). La recristalizacin selectiva basada en las diferencias de solubilidad se puede utilizar para la separacin de algunas sales de ETA (vase el captulo VI.F. sobre FTIR). Datos espectroscpicos Los datos del anlisis de espectro de masa (EM), infrarrojo (IR) y de resonancia magntica nuclear (RMN) de los ETA ms comunes aparecen en ediciones anteriores de los dos manuales de las Naciones Unidas relacionados con el anlisis de ETA, es decir, Mtodos recomendados para el ensayo de anfetamina y metanfetamina (ST/NAR/9) y Mtodos recomendados para el ensayo de los derivados anfetamnicos ilcitos con anillo sustituido (ST/NAR/12). Los datos tambin se pueden encontrar en la pgina web de la Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos.

Los analistas tambin deben tener presente que los puntos de fusin de algunos ETA pueden variar en funcin del disolvente que se utilice para la cristalizacin.

V.

FABRICACIN ILCITA DE ETA

El conocimiento del mtodo utilizado en la fabricacin ilcita de drogas de uso indebido puede cumplir una funcin importante en la interpretacin de los resultados de anlisis, especialmente en casos en que se han realizado anlisis ms a fondo de impurezas y subproductos de la fabricacin, denominados estudios de perfil de impurezas. El uso de mtodos de sntesis obtenidos o publicados ilcitamente (literatura subterrnea o Internet), los qumicos clandestinos sin experiencia, el equipo de laboratorio inapropiado y la falta de control de calidad en los laboratorios suelen dar por resultado productos impuros y de calidad inferior, y variaciones en la calidad y la potencia. En consecuencia, las drogas fabricadas ilcitamente suelen contener subproductos e intermedios derivados de materias primas con impurezas, reacciones incompletas y purificacin inadecuada de los intermedios y el producto sinttico final. Los tipos y las cantidades de impurezas que se encuentran en muestras de ETA ilcitos (el perfil de impurezas) dependen en gran parte de los mtodos de sntesis, las proporciones, la fuente y la pureza de las materias primas, las condiciones de la reaccin y los procesos de purificacin, si los hubiere. La presencia o ausencia de impurezas especficas (marcadores) puede ser til para determinar el mtodo de sntesis empleado y las materias primas (precursores) utilizadas. El anlisis de disolventes puede aumentar el cuerpo de informacin y, de esa forma, puede constituir un instrumento til para la comparacin y caracterizacin de muestras de ETA. Si bien los estudios de perfil de impurezas no son el tema del presente manual, algunos de los mtodos descritos se pueden adaptar para ese propsito5. En la literatura se encuentran descripciones de varios mtodos de sntesis de ETA que utilizan los fabricantes ilcitos o clandestinos. Los mtodos de sntesis de uso ms comn para la fabricacin ilcita de anfetamina se pueden modificar tambin para producir metanfetamina o anfetaminas con anillo sustituido. Esto se logra frecuentemente sustituyendo la fuente amina o la fuente del anillo aromtico, respectivamente, durante el proceso de reaccin. En general, la disponibilidad de precursores determina en gran medida la eleccin del mtodo de sntesis utilizado en las operaciones ilcitas. A continuacin se presentan descripciones breves de los mtodos de sntesis ms comnmente utilizados para la anfetamina, la metanfetamina y la MDMA6. Los mtodos de sntesis se clasifican sobre la base de los tipos de reduccin utilizados en la reaccin y del mecanismo de reduccin. En la prctica, muchas de esas reacciones se conocen por nombres populares como mtodo Leuckart, o mtodos del cido hidridico/fsforo rojo, oxima, nitrostireno, Birch o Emde. Esos nombres populares se basan en el qumico que descubri el mtodo, o en los reactivos caractersticos o los intermedios importantes. Siempre que es posible se incluyen los nombres populares.

Para una introduccin general a este tema, se remite al lector al manual de las Naciones Unidas Caracterizacin de drogas y elaboracin de perfiles de impurezas (ST/NAR/32/Rev.1, 2001); para mtodos y enfoques ms especficos para la elaboracin de perfiles de impurezas de la metanfetamina, vase tambin ONUDD, publicacin cientfica y tcnica No. 17 (SCITEC/17), 2000. 6 Para ms detalles, se remite al lector al manual de las Naciones Unidas Clandestine manufacture of substances under internacional control (ST/NAR/10/Rev. 2, 1998).

A.

SNTESIS DE LA ANFETAMINA

La reaccin central de todos los mtodos utilizados para la sntesis de la anfetamina se basa en la reduccin cataltica del 1-fenil-2-propanona (P-2-P, bencil metil ketona, BMK, fenilacetona), en presencia de amonaco o metilamina. Los mtodos de reduccin ms populares de la actualidad son el mtodo Leuckart (reduccin no metlica) y el mtodo de reduccin metlica cataltica (aminacin reductiva, hidrogenacin cataltica o hidrogenlisis). Reaccin Leuckart (reduccin no metlica) En razn de su sencillez, la reaccin Leuckart sigue siendo uno de los mtodos de sntesis ms populares para la fabricacin ilcita de anfetaminas. La sntesis Leuckart es una reduccin no metlica que normalmente se realiza en tres etapas. Para la sntesis de la anfetamina, se calienta una mezcla de P-2-P y formamida (algunas veces en presencia de cido frmico), o formiato de amonio hasta que se obtiene una reaccin de condensacin en el producto intermedio N-formilanfetamina. En la segunda etapa, la Nformilanfetamina se hidroliza, normalmente utilizando cido clorhdrico (vase el grfico 3). La mezcla de la reaccin se hace bsica, se asla y se destila (vapor). En la etapa final, el producto se precipita de la solucin, normalmente como sal sulfatada. La anfetamina base es un lquido aceitoso con un olor a pescado y amina caracterstico.

Grfico 3. Reaccin Leuckart utilizada en la fabricacin ilcita de anfetamina El mtodo Leuckart es uno de los ms estudiados. En la literatura se identifican y describen varias impurezas especficas del mtodo. Las impurezas ms prominentes son el intermedio Nformilanfetamina (por lo general, arrastrado al producto final) y 4-metil-5-fenil pirimidina. Otros mtodos sintticos no dan tantas impurezas especficas como el mtodo Leuckart. Aminacin reductiva (reduccin metlica cataltica) La aminacin reductiva es un proceso de reduccin qumica o cataltica de aldehdos y cetonas en presencia de amonaco, o una amina primaria o secundaria, que resulta en la amina relacionada de orden superior. El mecanismo de reaccin pasa por la formacin de una imina o producto intermedio de iminio por la reaccin de un compuesto de carbonilo con un compuesto amino apropiado, seguida de la reduccin. En la sntesis de la anfetamina que utiliza mtodos de aminacin reductiva se emplea P-2-P y un catalizador preferido. Los mtodos utilizados con

ms frecuencia se pueden dividir en tres tipos diferentes basados en las especies de reduccin: a) b) c) Reduccin cataltica heterognea utilizando xido de platino, paladio o nquel Raney; Reduccin metlica por disolucin utilizando aluminio, zinc o amalgamas de magnesio; Reduccin metlica utilizando hidruro de aluminio-litio (LiAlH4), borohidruro de sodio (NaBH4) o, con menos frecuencia, cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3).

La reduccin cataltica heterognea se logra normalmente utilizando una mezcla de P-2-P y gas de amonaco cargado con hidrgeno en presencia de un catalizador seleccionado. El paladio en carbn (Pd/C) o el xido de platino son los catalizadores de uso ms comn, seguidos por el nquel Raney. Las reducciones se logran normalmente a baja presin y baja temperatura. En raras ocasiones, tambin se han encontrado aminaciones a alta presin en un reactor a presin Parr (presin o bomba de tubo). La reduccin metlica por disolucin utilizando aluminio, zinc o amalgamas de magnesio es uno de los mtodos de aminacin reductiva de uso ms comn. El procedimiento ms popular emplea amalgama de aluminio y mercurio (Al-Hg). El mecanismo de reduccin de la amalgama se produce mediante la reduccin de un aducto de base Schiff de P-2-P y la amina apropiada. En condiciones de clandestinidad difciles, este mtodo utiliza un recolector de aluminio o arenisca, y cloruro de mercurio (HgCl2). Las impurezas ms caractersticas de las aminaciones reductivas son las bases Schiff, que se supone son formadas por la condensacin de P-2-P y anfetamina, pero no son impurezas especficas del mtodo y pueden estar presentes en cualquier procedimiento de sntesis que incluya P-2-P. Los compuestos de tipo P-2-P e imina tambin pueden aparecer como impurezas. Las impurezas inorgnicas resultantes del empleo de un catalizador determinado pueden servir de marcadores. Otros mtodos de aminacin reductiva de uso menos frecuente son las reducciones de hidruro metlico, como el mtodo del nitropropano y el mtodo de la oxima, denominados en funcin de los intermedios caractersticos (fenil-nitropropeno y oxima, respectivamente), que se forman durante la reaccin. El mtodo de la oxima es una reaccin de P-2-P con hidroxilamina. El intermedio de oxima es posteriormente hidrogenado para obtener anfetamina. Un intermedio de oxima suele ser hidrolizado por reduccin metlica utilizando Pd/H2, o por reduccin de hidruro metlico utilizando LiAlH4. El mtodo del nitropropeno comprende la condensacin de benzaldehdo con nitroetano, que produce 1-fenil-2-nitropropeno. La hidrogenacin subsiguiente del doble enlace y la reduccin del grupo nitro produce anfetamina. La fase de reduccin se completa por lo general utilizando Pd/H2 o LiAlH4.

B. SNTESIS DE LA METANFETAMINA
La metanfetamina tambin se puede sintetizar utilizando los mtodos mencionados ms arriba pero sustituyendo el amonaco con metilamina. Ahora bien, los mtodos de sntesis de la metanfetamina ms populares emplean efedrina o seudoefedrina como precursor, en lugar de P-2-P. Las reacciones se logran por lo general mediante una de las reacciones siguientes (vase el grfico 4): a) b) Reducciones no metlicas, como el mtodo 'cido hidridico/fsforo rojo; La reduccin metlica por disolucin, como la reduccin Birch; o

c)

La reduccin cataltica heterognea utilizando tionilcloruro y paladio u xido de platino como catalizador (mtodo Emde).

Es raro encontrar otras reacciones, como el mtodo del nitropropeno o el de la oxima.

Grfico 4. Mtodos comunes para la fabricacin ilcita de metanfetamina La efedrina y la seudoefedrina estn presentes en muchos preparados farmacuticos contra la tos, muchos de los cuales se pueden obtener sin receta. La hierba china Ma-huang, que se encuentra en varios suplementos alimenticios y productos de estilo de vida, es otra fuente de esos precursores. A diferencia del P-2-P, la efedrina y la seudoefedrina son sustancias quirales. Son diasteremeros y existen en una dos formas enantiomricas cada una, (d- y l-efedrina, y d- y lseudoefedrina), adems de dos racematos. El anlisis quiral de los ismeros de efedrina o seudoefedrina tambin puede ayudar a determinar el proceso de fabricacin de la metanfetamina ilcita. Todos los mtodos de fabricacin que comienzan con la produccin de I-efedrina o dseudoefedrina producen (+)-(S)-metanfetamina como nico ismero ptico, que es por lo menos

dos veces ms potente que la mezcla racmica producida por reacciones a partir de P-2-P. El mtodo del cido hidridico-fsforo rojo se realiza normalmente calentando efedrina o seudoefedrina con fsforo rojo y cido hidridico. La mezcla de la reaccin se filtra, se hace bsica y se extrae en un disolvente. La metanfetamina base resultante es un lquido aceitoso, comnmente denominado meth oil. De este lquido se cristalizan sales de clorhidratos utilizando ter/acetona y cido clorhdrico. Alternativamente, un gas de cloruro de hidrgeno (de un cilindro, una solucin acuosa o generado utilizando cido sulfrico y cloruro sdico) se bulle en el meth oil para que la sal clorhdrica precipite fuera de la solucin. El Hl y el fsforo rojo se pueden sustituir por yodo y cido hipofosfrico (hipofosfato sdico), o por agua y yodo. Raras veces, la mezcla de la reaccin, a veces denominada ox-blood, se utiliza sin ms purificacin, principalmente por inyeccin. La mezcla de color rojo, causada por un exceso de yodo, contiene meth oil y diferentes impurezas provenientes del mtodo Hl/fsforo rojo. Las impurezas tpicas encontradas en muestras producidas por reducciones con Hl/fsforo rojo o yodo/cido hipofosfrico son efedrina o seudoefedrina, aziridinas y dimetilnaftalinas. Las aziridinas no se pueden considerar como impurezas especficas del mtodo, dado que tambin se producen a partir de la clorefedrina por eliminacin algena y cierre de los anillos (mtodo Emde), o de un intermedio de oxima y N-hidroximetanfetamina. El proceso de la reduccin Birch se realiza mediante una reduccin metlica por disolucin de efedrina o seudoefedrina en presencia de amonaco. La reaccin comprende mezclar efedrina o seudoefedrina con gases de amonaco anhidro y metal de sodio o de litio. La mezcla se deja reposar hasta que se evapora el amonaco. La separacin del meth oil se realiza mediante extraccin directa por disolvente y filtracin. El producto de la reaccin se purifica luego mediante la formacin de la sal de clorhidrato y la recristalizacin. En la prctica ilcita, la reduccin Birch se realiza normalmente en una reaccin de un paso utilizando amonaco, que est disponible en grandes cantidades, y cintas de litio de bateras. Pese a esto, la reduccin Birch produce normalmente un producto final muy limpio. En la literatura se informa de varias impurezas especficas del mtodo, como el N-metil-1-(1,4-ciclohexadienil))-2-propanamina. La reaccin que incluye amonaco anhidro es peligrosa y las explosiones en los laboratorios clandestinos no son raras. En el mtodo Emde, la efedrina o la seudoefedrina se hacen reaccionar normalmente con tionilcloruro para obtener el intermedio clorefedrina, que luego es hidrogenado sobre un catalizador de platino o paladio para obtener metanfetamina. En los procedimientos analticos basados en la CG, el intermedio clorefedrina se encuentra raras veces como impureza, porque se descompone durante el anlisis para formar aziridinas. La clorefedrina tambin se descompone rpidamente durante la extraccin bsica de metanfetamina.

C. SNTESIS DE ETA CON ANILLO SUSTITUIDO

El estimulante anfetamnico de tipo metilendioxi que se encuentra ms comnmente es MDMA, y ocasionalmente MDEA y MDA. En general, los mtodos de sntesis utilizados para la MDMA se aplican, con ligeras modificaciones, a otros anlogos metilendioxi con anillo sustituido. El principal precursor utilizado para esa sntesis es 3,4-metilendioxifenil-2-propanona (tambin conocido como 3,4-MDP-2-P, 3,4-metilendioxi-fenilacetona, piperonil metil cetona, o PMK). El 3,4-MDP-2P est disponible en el comercio como precursor sometido a fiscalizacin internacional. La MDMA se puede sintetizar tambin a partir del safrol (3,4-metilendioxialilbenceno), ya sea directamente o utilizando isosafrol obtenido por isomerizacin del safrol. El safrol est disponible

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en el comercio, o se puede extraer del aceite de sasafrs u otras partes de plantas o aceites esenciales con alto contenido de safrol. El piperonal (heliotropin, 3,4-metilendioxibenzaldehdo), un producto qumico industrial de gran uso, es otro precursor alternativo para la sntesis de 3,4MDP-2-P. El mtodo ms directo para la sntesis de la MDMA es la aminacin reductiva de 3,4-MDP-2-P con metilamina y gas de hidrgeno sobre un catalizador de platino (reduccin metlica cataltica). La reduccin se puede lograr tambin mediante una reduccin metlica disolvente utilizando amalgama de aluminio (hoja de aluminio y mercuriocloro), o por reduccin de hidruro metlico utilizando cianoborohidruro sdico (vase el grfico 5). Sustituyendo la metilamina por etilamina se obtiene MDE; el gas de amonaco produce MDA, y la dimetilamina produce MDDMA. Un mtodo anlogo para la fabricacin ilcita de anfetamina comnmente utilizado para la fabricacin ilcita de MDMA es el mtodo Leuckart. Se reducen 3,4-MDP-2-P y Nmetilformamida utilizando cido frmico. El intermedio resultante, N-formil-MDMA se hidroliza por reflujo con un cido o una base fuerte para producir MDMA.

Grfico 5. Aminacin reductiva utilizada en la fabricacin ilcita de MDMA El mtodo del nitropropeno adquiri popularidad a principios del decenio de 1990. Comprende la reaccin de piperonal con nitroetano en presencia de un catalizador bsico, normalmente n-butilamina. En la literatura se informa de diversos procedimientos para la produccin del intermedio fenil-nitropropeno, pero normalmente se deja reposar una mezcla de piperonal y nitroetano durante unos pocos das en la oscuridad. Alternativamente, se produce un reflujo de piperonal y nitroetano en cido actico y acetato amnico. Los intermedios formados en estas reacciones son muy caractersticos en cuanto a apariencia, y por lo general precipitan de la solucin de la reaccin como cristales amarillos brillantes. Para producir MDA, el intermedio se suele reducir con hidruro de aluminio-litio. Para la sntesis de MDMA, MDEA u otros ETA, el nitropropeno intermedio se convierte en 3,4-MDP-2-P, que luego se reduce mediante uno de los mtodos de aminacin reductiva descritos ms arriba. Los intermedios nitropropeno y nitroestireno son sustancias cristalinas de color amarillo o naranja brillante.

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La MDMA tambin se fabrica normalmente utilizando el denominado mtodo del bromosafrol. La reaccin se produce mediante la brominacin del safrol con cido hidrobrmico a baja temperatura, seguida de un tratamiento con metilamina para formar el producto final. El rendimiento depender del contenido de agua de la mezcla de la reaccin. La sustitucin de la metilamina con otras aminas produce diferentes productos de tipo MDMA (por ejemplo, MDA, MDEA, o MDDMA). Las drogas de tipo metoxianfetamina se sintetizan normalmente utilizando aldehdo y nitroetano con anillos sustituidos apropiados, mientras que para la mescalina, el 2C-B y otras fenetilaminas con anillo sustituido se utiliza nitrometano. El 2C-B se fabrica haciendo reaccionar 2,5 dimetoxibenzaldehdo y nitroetano, seguida de una reduccin LiALH4 para formar 2,5-dimetoxifenetilamina, que es luego brominada para obtener el producto final.

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VI.

ANLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE ETA

Por lo general, cuando se intenta determinar la identidad de una sustancia sometida a fiscalizacin en el material sospechoso, el enfoque analtico debe comprender la determinacin de por lo menos dos parmetros no correlacionados. Se reconoce que la seleccin de estos parmetros en cualquier caso particular tendr en cuenta la droga de que se trate y los recursos de laboratorio de que dispone el analista. Tambin se acepta que los requisitos especiales establecidos en diferentes jurisdicciones pueden determinar las prcticas que se sigan en un laboratorio particular.

A. ENSAYOS PRESUNTIVOS
Los ensayos presuntivos son procedimientos de clasificacin rpidos que por lo general consisten en dos o tres ensayos independientes. Estn diseados para dar una indicacin de la presencia o ausencia de tipos de drogas en la muestra ensayada y eliminar rpidamente las muestras negativas. Las buenas tcnicas de ensayos presuntivos, como todas las tcnicas analticas, maximizan la probabilidad de un resultado verdadero y reducen al mnimo la probabilidad de un positivo falso. Ahora bien, los ensayos presuntivos no se consideran suficientes para identificar drogas y los resultados deben ser confirmados mediante otros ensayos de laboratorio. En los ltimos tiempos, los ensayos presuntivos se utilizan con ms frecuencia en pruebas de campo, aunque tambin se realizan en laboratorios como primer procedimiento de clasificacin. Para la clasificacin de los ETA, se usan normalmente ensayos cromticos, o pruebas rpidas, aunque tambin se dispone de ensayos de inmunoanlisis y varias tcnicas rpidas y con instrumentos porttiles. Los mtodos de clasificacin con instrumentos, como el espectrmetro de movilidad de iones (escaneo de iones), el espectrmetro de masas porttil y los espectrmetros FTIR o Raman, han obtenido popularidad en los ltimos aos. Se dispone tambin de muchos estuches de ensayos comerciales para la clasificacin de ETA, aunque deben ser evaluados internamente en funcin de su especificidad y sensibilidad.

1.

Ensayos cromticos

Los ensayos cromticos suelen ser los ensayos clnicos ms sencillos y ms rpidos que un analista puede aplicar a una muestra. Los ensayos cromticos son muy sensibles; por lo tanto, slo se necesitan cantidades muy pequeas de la muestra para completar con xito el ensayo, y con frecuencia los mejores resultados se obtienen con las cantidades de muestras ms pequeas, generalmente menos de un miligramo. Dado que las muestras pueden variar en pureza (concentracin de ETA) y pueden contener sustancias ajenas, los colores que aparecen en estos ensayos deben interpretarse con cuidado. Adems, hay que tener presente el aspecto subjetivo de la evaluacin del color. Tcnicas de ensayos cromticos Normalmente se utilizan varios reactivos diferentes en los ensayos cromticos de sustancias de tipo anfetamnico y sus anlogos con anillo sustituido. Los ms importantes para estas sustancias son los ensayos de Marquis, de Simon y de Chen. El ensayo de Marquis permite distinguir entre la anfetamina y sus anlogos con anillo sustituido. El ensayo de Simon se utiliza generalmente para aminas secundarias, por ejemplo, la metanfetamina y las anfetaminas secundarias con anillo sustituido, incluidas la MDMA y la MDE. Ahora bien, otras aminas secundarias, por ejemplo la dietilamina y la piperidina, pueden dar colores similares. En general,

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los colores son intensos pero pueden desaparecer rpidamente en presencia de algunas impurezas. Por estas razones, es esencial que el analista confirme los resultados del ensayo de Simon realizando un ensayo suplementario, por ejemplo, un ensayo de Marquis. El ensayo de Chen se utiliza para distinguir la efedrina, la seudoefedrina, la norefedrina, la fenilpropanolamina y la metcatinona de la anfetamina y la metanfetamina, que no reaccionan con el reactivo del ensayo de Chen. Un cuarto ensayo, el ensayo del cido glico, proporciona un medio simple de distinguir MDMA, MDA y MDEA de la anfetamina o la metanfetamina, porque reacciona especficamente con los compuestos aromticos de metilendioxi sustituido. Tambin reaccionan los precursores que contienen la subestructura metilendioxi, como el safrol y el isosafrol. MTODOS En el anexo II se describe la preparacin de reactivos. Los reactivos se deben preparar en el momento. Ensayo de Marquis 1) Colocar una pequea cantidad (1-2 mg de polvo, o 1-2 gotas de lquido) del material sospechoso en una ranura de una placa de ensayos. 2) Agregar una gota de reactivo de Marquis 1, luego una gota de reactivo 2, y mezclar. 3) Observar el color de la mezcla. Ensayo de Simon 1) Colocar una pequea cantidad (1-2 mg de polvo, o 1-2 gotas de lquido) del material sospechoso en una ranura de una placa de ensayos. 2) Agregar una gota de reactivo de Simon 1, y mezclar. 3) Agregar una gota de reactivo de Simon 2, luego una gota de reactivo 3. 4) Observar el color de la mezcla. Ensayo de Chen 1) Colocar una pequea cantidad (1-2 mg de polvo, o 1-2 gotas de lquido) del material sospechoso en una ranura de una placa de ensayos. 2) Agregar 2 gotas de reactivo de Chen 1. 3) Agregar 2 gotas de reactivo de Chen 2, y luego 2 gotas de reactivo 3 y mezclar. 4) Observar el color de la mezcla. Ensayo del cido glico 1) Colocar una pequea cantidad (1-2 mg de polvo, o 1-2 gotas de lquido) del material sospechoso en una ranura de una placa de ensayos. 2) Agregar una gota de reactivo de cido glico. 3) Observar el color de la mezcla.

RESULTADOS En el cuadro 1 se proporcionan resultados de los tres principales ensayos cromticos para la mayora de los estimulantes de tipo anfetamnico y sus anlogos con anillo sustituido que se encuentran ms comnmente. Dado que el ensayo de cido glico se utiliza principalmente para identificar, por lo general, el sustitutivo metilendioxi del anillo y no un ETA individual con esa subestructura, en este cuadro los resultados no se incluyen separadamente para sustancias individuales. Un color verde oscuro

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brillante indica la presencia de MDA, MDMA, MDE, N-hidroxi-MDA o MMDA. En algunos casos, por ejemplo MDE y N-hidroxi-MDA, el color verde puede cambiar a pardo durante el ensayo. Cuadro 1. RESULTADOS DE LOS ENSAYOS CROMTICOS Compuesto Anfetamina Catinona Reactivo de Marquis Naranja, lentamente pasando a pardo SR Reactivo de Simon SR * SR * Reactivo de Chen SR * Pasa gradualmente del amarillo al naranja SR * Prpura

Dimetilanfetamina Efedrina Seudoefedrina N-Etilanfetamina Metanfetamina Metcatinona

Naranja SR Naranja, pasando a pardo Naranja, lentamente pasando a pardo SR

SR * SR *

Azul intenso Azul plido, precipitado como mancha o anillo SR SR * SR * SR * SR * SR * SR * Azul intenso SR * Azul (intenso)--> pardo Azul intenso SR * SR * SR * SR * SR *

SR * Pasa gradualmente del amarillo al naranja Prpura SR *

Norefedrina 2C-B 2C-T-2 2C-T-7 DMA DOB DOET FLEA MBDB MDA MDDM MDEA MDMA MDOH MMDA 4-MTA PMA STP / DOM TMA

SR Amarillo--> verde Rosa plido, naranja SR Verde-->verde oscuro Amarillo--> verde Pardo amarillento Azul oscuro/negro Azul oscuro/negro Azul oscuro/negro Azul oscuro/negro Azul oscuro/negro Azul oscuro/negro Azul oscuro/negro Prpura SR SR--> verde plido Amarillo Naranja

SR *

SR * SR * SR * SR * SR *

SR *

SR = sin reaccin. * El color del reactivo se debe considerar negativo.

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Notas analticas a) ETA especficos Dado que los ETA, en especial la metanfetamina y los anlogos con anillo sustituido en Asia sudoriental, se encuentran con frecuencia en forma de tabletas de colores brillantes, el resultado de los ensayos cromticos puede quedar oculto, o se puede producir un cambio en el resultado de esos ensayos. Aunque se utiliza una gran variedad de colores para producir tabletas de ETA, la mayora de los colores son solubles en agua, y su solubilidad se puede manipular cambiando el pH de la solucin. En esos casos, por lo tanto, el anlisis se debe ajustar al procedimiento de extraccin y se debe eliminar el color totalmente antes de proceder al ensayo cromtico propiamente dicho. En algunos casos, cuando el ensayo cromtico no se puede interpretar claramente debido a la presencia de un colorante en la tableta, el procedimiento siguiente suele producir resultados aceptables: Colocar una pequea cantidad (aproximadamente 10 mg) de la muestra en un tubo de ensayo pequeo. Agregar aproximadamente 1 ml de metanol (o una mezcla de 4:1 metanol:cloruro de metileno). Despus de filtrar la mezcla por lana de vidrio, se la evapora hasta que quede seca. La muestra se reconstituye en una pequea cantidad de agua y luego se procede a realizar el ensayo cromtico depositando cuidadosamente la solucin de la muestra acuosa en una placa de ensayos y agregando el reactivo de color. Dado que la muestra ya est diluida, bastarn 3 gotas de reactivo por una gota de muestra. La presencia de disolventes y adulterantes tambin puede perturbar las reacciones de coloracin y dar resultados negativos falsos. El ensayo de Simon puede dar resultados negativos falsos en muestras de ETA con adulterantes o disolventes; el ensayo de Marquis es menos sensible a las muestras adulteradas y, por lo tanto, es preferible cuando la concentracin de ETA en la muestra es muy baja. b) General

Los colores descritos son juicios subjetivos debido a que la percepcin de los colores es individual. Por esta razn, es decir, el aspecto subjetivo de la evaluacin del color, es necesario que cada analista ensaye estndares de referencia apropiados para asegurar que puede reconocer cada resultado del ensayo cromtico. Asimismo, es conveniente realizar un ensayo con una muestra en blanco sin la sustancia de que se trata para asegurar la familiaridad con el color del reactivo. Si se realiza adecuadamente, un ensayo de coloracin negativo es por lo general bastante fidedigno para establecer la ausencia de un compuesto determinado; no obstante, los resultados positivos son slo indicaciones presuntivas de la posible presencia de un compuesto. Muchos otros compuestos, con frecuencia benignos y no sometidos a fiscalizacin por las leyes nacionales o los tratados internacionales, pueden dar colores similares con un reactivo de ensayo cromtico determinado. Por lo tanto, es obligatorio que el analista confirme un ensayo cromtico positivo de cualquier compuesto sometido a fiscalizacin por ley utilizando otros ensayos de laboratorio. Para eliminar la posibilidad de que una placa de ensayo contaminada d un resultado positivo falso, conviene colocar el reactivo en la placa y luego agregar una cantidad pequea de la muestra al reactivo.

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Lecturas recomendadas Naciones Unidas (1995), Mtodos para el ensayo inmediato de drogas de uso indebido: Manual para uso del personal de laboratorios nacionales de estupefacientes y de los organismos de represin (ST/NAR/13/Rev.1) S. A. Johns, A. A. Wist y A. R.Najam (1979), Spot tests: a colour chart reference for forensic chemists, J. Forensic Sci., vol. 24, pgs.631 a 649. E. Jungreis (1985), Spot test analysis, Clinical, environmental, forensic and geochemical applications, John Wiley & Sons, Nueva York-Chichester-Brisbane-Toronto-Singapur. A. C. Moffat, M. D. Osselton y B. Widdop (eds.) (2004), Clarkes Analysis of Drugs and Poisons, 3ra. ed., Pharmaceutical Press, Londres-Chicago. C. L. ONeil y otros (2000), Validation of twelve chemical spot tests for the detection of drugs of abuse, Forensic Sci. Int., vol.109, pgs.189 a 201. R. A. Velapoldi y S. A. Wicks (1974), The use of chemical spot test kits for the presumptive identification of narcotics and drugs of abuse, J. Forensic Sci., vol. 19, pgs. 636 a 654.

2.

Ensayo de aniones

El ensayo de aniones con fines forenses utiliza normalmente las solubilidades combinadas con reacciones selectivas en que los resultados estn determinados por la presencia o ausencia, y la solubilidad, de un precipitado. A continuacin se describe la solubilidad de diferentes ETA y sus sales en agua y en varios sistemas de disolventes comunes. Anfetamina y sus sales Base Agua Metanol o etanol ter dietlico Cloroformo Ligeramente soluble Soluble Soluble Soluble Clorhidrato Soluble Soluble Insoluble Soluble Fosfato Soluble Ligeramente soluble Insoluble Insoluble Sulfato Soluble Ligeramente soluble Insoluble Insoluble

Metanfetamina y sus sales Base Agua Metanol o etanol ter dietlico Cloroformo Ligeramente soluble Soluble Soluble Soluble Clorhidrato Soluble Soluble Insoluble Soluble

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ETA con anillo sustituido y sus sales Las bases libres de ETA con anillo sustituido son por lo general insolubles en agua y solubles en etanol, ter dietlico, cloroformo y otros disolventes orgnicos. Sus sales clorhdricas son solubles en agua y etanol, ligeramente solubles en cloroformo, e insolubles en ter dietlico. Las solubilidades de las diferentes sustancias de este grupo dependen del ETA con anillo sustituido especfico de que se trate. MTODOS Todos los reactivos se deben preparar con arreglo a un procedimiento establecido. En el anexo II se describe detalladamente la preparacin de los reactivos. Ensayo del nitrato de plata La muestra del ETA desconocido se disuelve en varias gotas de agua desionizada y se trata con 1-2 gotas de solucin de AgNO3. A continuacin se dan los resultados para los aniones comunes. Dado que otros aniones pueden dar resultados similares, se deben realizar ensayos adicionales o trabajos de familiarizacin con las limitaciones del ensayo. Cloruro Forma un precipitado cremoso que es insoluble en cido ntrico concentrado. Despus de lavarlo con agua, el precipitado es soluble en una solucin de amonaco diluida, a partir de la cual se lo puede volver a precipitar aadiendo cido ntrico. Bromuro Forma un precipitado de color amarillo plido a crema que es insoluble en cido ntrico. Despus de lavarlo con agua, el precipitado se disuelve muy lentamente en soluciones de amonaco diluidas y es soluble en soluciones de amonaco concentradas. Se lo puede volver a precipitar a partir de ambas soluciones agregando cido ntrico. Yoduro Forma un precipitado amarillo brillante que es ligeramente soluble en una solucin de amonaco concentrada pero soluble en una solucin de tiosulfato. Sulfato Forma un precipitado cristalino ligeramente coloreado que se puede identificar fcilmente colocando la solucin de ensayo en una placa de microscopio y buscando los caractersticos cristales de sulfato de plata en forma de diamantes. Fosfato Forma un precipitado amarillo plido, que ese soluble en una solucin de amonaco diluida, o en cido ntrico fro. Para las sales sulfatadas y fosfatadas se pueden realizar otros ensayos especficos: Ensayo de sal sulfatada La muestra del ETA desconocido (unos 100 mg) se disuelve en agua y se trata con una solucin de cloruro de bario. Un precipitado blanco, que es insoluble en cido clorhdrico, indica la presencia de una sal sulfatada. Ensayo de sal fosfatada La muestra del ETA desconocido (unos 100 mg) se disuelve en una solucin compuesta de volmenes iguales (por ejemplo, 1 ml cada uno) de solucin de cido ntrico (10% v/v) y solucin de molibdato de amonio (10% p/v). Al calentarla lentamente, la formacin de un precipitado de color amarillo canario brillante, que es soluble en una solucin de amonaco, indica la presencia de una sal fosfatada.

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Notas analticas Dado que todos los ensayos de aniones se realizan en soluciones acuosas, la solubilidad en agua de las sales de ETA es una condicin para obtener resultados significativos. Es esencial lavar el precipitado con agua antes de realizar el ensayo de disolucin del precipitado, a fin de remover cualquier anin soluble (no precipitado).

Lecturas recomendadas McKibben, T., Chappell, J. S., Evans, H., Mausolf, N., Analyses of Inorganic Components Found in Clandestine Drug Laboratory Evidence, J. Cland. Lab. Invest. Chem. Ass., 5(4), 1995, 19 a 33.

3.

Ensayos de microcristales

Los ensayos de microcristales son rpidos, sencillos y extremadamente sensibles para identificar sustancias y sus ismeros pticos. Comprenden la formacin de cristales a partir de la reaccin del compuesto objetivo con un reactivo qumico, seguida del anlisis de los cristales resultantes utilizando un microscopio de polarizacin y comparndolos con los materiales de referencia, por lo general fotografas de cristales conocidos. MTODOS La forma ms simple del ensayo consiste en agregar una gota de un reactivo adecuado a la sustancia que se ensaya, y observar y analizar luego los cristales formados en el microscopio de polarizacin. A fin de mantener un registro preciso, se deben describir las caractersticas principales de los cristales. El registro ms preciso de los resultados del ensayo son las fotografas. Si no se dispone de fotografas, un esbozo de las formas de los cristales puede resultar til. En el captulo Anlisis de ismeros pticos (pgina 37) se describen mtodos y procedimientos detallados para el ensayo de microcristales de ETA. En el anexo III se dan trminos descriptivos para las formas de los cristales y fotografas de cristales de los principales ETA, as como los requisitos en materia de equipo e instrumentos bsicos.

Lecturas recomendadas Cunningham, M. D. (1973), Rapid and sensitive technique for the differentiation of the optical isomeric forms of methamphetamine and amphetamine, Microgram, vol. 6, No.6, pgs.87 a 95. Fulton, C. C. (1969), Modern Microcrystal Tests for Drugs, Wiley-Interscience, A Division of John Wiley & Sons, Nueva York-Londres-Sydney-Toronto. no, M., Microcrystal Test, Japn, 1996
Proporciona una introduccin amplia a la tcnica de los ensayos de microcristales, con fotografas de resultados de ensayos de microcristales de 39 ETA y sus precursores.

B. CROMATOGRAFA DE CAPA DELGADA (CCD)

La cromatografa de capa delgada (CCD) es una de las tcnicas usadas con ms frecuencia para separar e identificar drogas fabricadas ilcitamente. Es rpida (un anlisis rara vez toma

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ms de 30 minutos), sensible (se requieren cantidades inferiores a 1 mg del analito), extremadamente flexible en las fases estacionaria y mvil y, por lo tanto, adecuada para una amplia variedad de sustancias en forma de bases o de sales, que van desde los materiales ms polares hasta los ms no polares. Tambin se presta a una variedad de tcnicas de visualizacin, y es poco costosa. Pese a las ventajas obvias de la CCD, en muchos pases no se la acepta como tcnica nica de identificacin de drogas. Placas de CCD (fases estacionarias) Recubrimiento: Gel de slica G con un espesor de capa de 0,25 mm, y con un indicador inerte, que fluorece bajo luz UV de longitud de onda de 254 nm
Nota: Las placas preparadas por el analista debe ser activadas antes de utilizarlas, colocndolas en un horno por lo menos durante 10 a 30 minutos a 120 C. Las placas se almacenan luego en un desecador libre de grasas sobre gel de slica azul. La activacin por calor normalmente no se requiere para capas enlazadas qumicamente (placas comerciales).

Tamaos de placa tpicos:

20x20 cm, 20x10 cm, 10x5 cm (la placa de 10x5 cm se debe utilizar nicamente con el lado de 10 cm en posicin vertical en el tanque de CCD.

Sistemas de disolventes (fases mviles) Sistema A: Metanol Amonaco concentrado Sistema B: Acetato etlico Metanol Amonaco concentrado Sistema C: Cicloexano Tolueno Dietilamina 100 1,5 85 10 5 75 15 10

En relacin con sistemas de CCD ms normalizados, vase: Thin-layer chromatographic Rf values of toxicologically relevant substances on standardized systems, second, revised and enlarged edition, Report XVII of the DFG Commission for clinicaltoxicological analysis, volumen especial del boletn TIAFT, VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1992.

MTODOS A continuacin se proporcionan mtodos recomendados y resultados seleccionados, pero el analista deber familiarizarse con los resultados especficos para ETA individuales. Sistemas de disolventes Preparar sistemas de disolventes de desarrollo en la forma ms precisa posible utilizando pipetas y cilindros de medicin. Dejar el sistema de disolvente en el tanque de CCD durante un tiempo suficiente para permitir la saturacin de la fase de vapor antes del anlisis (con tanques revestidos con papel absorbente, esto toma aproximadamente 5 minutos).

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Preparacin de muestras y soluciones estndar de ETA La forma de los estndares y las muestras (en sales o bases), no tiene importancia. Cualquiera de las dos es satisfactoria. Debido a la naturaleza bsica de los disolventes de desarrollo, los compuestos emigran como bases libres. Soluciones estndar de ETA Las soluciones estndar de ETA se deben preparar a una concentracin de aproximadamente 2 mg/ml en metanol. Deben almacenarse a oscuras y en un lugar fro. Soluciones de muestras de ETA (muestra de ETA desconocido) Las soluciones estndar de ETA se deben preparar a una concentracin de aproximadamente 5 mg/ml en metanol. En algunos casos, cuando se sospecha que la pureza del ETA es demasiado baja debido a que ha sido adulterado, quiz sea necesario preparar soluciones de muestras ms concentradas (se recomiendan soluciones 10 veces ms concentradas como punto de partida). Para las muestras de ETA en otras formas distinta del polvo, las soluciones de muestra se deben preparar de la siguiente manera: Tabletas: Triturar un nmero representativo de tabletas (siguiendo planes generales de muestreo) hasta obtener un polvo fino y preparar una solucin con ese polvo. Cpsulas: Extraer el contenido de una muestra representativa de las cpsulas (siguiendo planes generales de muestreo) y preparar una solucin con ese polvo. Soluciones acuosas: Aplicar directamente sobre la placa, o el equivalente de 5 mg/ml, si se conoce la concentracin del ETA. Aplicacin y desarrollo Aplicar sobre la placa de CCD 1 l y 5 l de una solucin de la muestra, junto con 2 l de la solucin o soluciones estndar (de preferencia, aplicar tambin a la placa un disolvente como control negativo). La aplicacin se debe hacer con cuidado para no daar la superficie de la placa. El punto de partida del anlisis, es decir, la lnea de aplicacin, debe ser 2 cm desde el fondo de la placa. El espacio entre aplicaciones de la muestra (puntos de aplicacin) debe ser de por lo menos 1 cm, y las aplicaciones no se deben colocar a menos de 1,5 cm del borde lateral de la placa. Para evitar aplicaciones difusas durante el desarrollo, el tamao de la aplicacin de la muestra debe ser lo ms pequeo posible (>2 mm). Dejar que la aplicacin se seque, y colocar la placa en el tanque de CCD saturado de disolvente (la saturacin de la fase de vapor se logra utilizando almohadillas o papel de filtro saturados con disolvente como revestimiento del tanque). Extraer la placa del tanque de revelado tan pronto como el disolvente alcance la lnea de revelado marcada de antemano; de otra forma, se producirn puntos difusos. Visualizacin/deteccin Las placas se deben secar antes de la visualizacin: el disolvente se puede dejar secar a temperatura ambiente, o extraer con un secador de aire caliente. Si se utiliza aire caliente, hay que tener cuidado en razn de la volatilidad de las bases libres de ETA. Para el desarrollo del color apropiado, es importante que se eliminen de la placa todas las trazas de amonaco.

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La siguiente es una seleccin de mtodos de visualizacin. Sobre la base de los resultados de los ensayos presuntivos, los ETA previstos se deben seleccionar utilizando uno de los siguientes mtodos y reactivos, o una combinacin de ellos: Mtodo/ reactivo de visualizacin A. Luz UV a 254 nm

Analitos objetivo y resultados Mtodo universal. Muchas sustancias, incluidos los ETA, producen manchas prpura en una placa normalmente de color verde fluorescente. Muchas aminas primarias y secundarias, adheridas a un tomo de carbono aliftico, como la anfetamina y la metanfetamina, dan manchas violeta o rosa. Reactivo general sensible. Muchas aminas primarias y secundarias dan manchas de color azul plido. Las aminas primarias y secundarias dan manchas de diversos colores, desde el violeta (aminas primarias) hasta el naranja o el rojo-naranja (aminas secundarias). Distincin entre ETA con y sin anillo sustituido. Reactivo sensible para aminas primarias. Recomendado para la deteccin de concentraciones de aminas primarias. Reactivo general para aminas secundarias (la efedrina y la seudoefedrina no reaccionan). Reactivo general para alcaloides y bases nitrogenadas.

B.

Reactivo de ninhidrina

C.

Reactivo de yodoplatinato de potasio acidificado Reactivo negro slido de potasio Reactivo de Marquis Reactivo de fluorescamina (Fluram) Reactivo de Simon Reactivo de Dragendorff

D.

E. F. G. H.

A.

Luz UV Observar la placa seca bajo luz UV a 254 nm y 366 nm.

B.

Reactivo de ninhidrina Preparar una solucin en etanol al 10%. Rociar la placa con el reactivo de ninhidrina y calentar en un horno a 120 C por lo menos durante 15 minutos. Las aminas primarias, como la anfetamina, y las aminas secundarias, como la metanfetamina, producen manchas violetas o rosas. La efedrina tambin produce una mancha violeta.

C.

Reactivo de yodoplatinato de potasio acidificado Disolver 0,25 g de cloruro platnico y 5 g de cloruro potsico en agua y preparar hasta 100 ml. Agregar 2 ml de cido clorhdrico concentrado. Rociar la placa con la solucin de yodoplatinato de potasio acidificado y observar las manchas de colores. La anfetamina y la metanfetamina producen manchas difusas de color gris-violeta-pardo sobre un fondo rosa. La solucin tambin se puede utilizar para rociar las superficies de las placas que anteriormente haban sido rociadas con ninhidrina.

22

D.

Reactivo negro slido de potasio Solucin A: Preparar una solucin de sal de reactivo negro slido de potasio en agua al 1% [2,5-dimetoxi-4-((4-nitrofenil)azo)benceno diazonio tetraclorozincato (2:1)] Solucin B: 1N NaOH Rociar la placa con la solucin A y observar las manchas de colores. Las aminas secundarias como la metanfetamina y la MDMA producen manchas inmediatamente. El nuevo rociado con solucin B produce manchas de colores para la anfetamina y otros ETA con anillo sustituido. Secar las placas con aire y rociar una vez ms con la solucin A. Esto produce manchas de colores ms intensos. Los colores varan del violeta para las aminas primarias al naranja o el naranja-rojo para las aminas secundarias como la metanfetamina y el MDMA.

E.

Reactivo de Marquis Agregar de 8 a 10 gotas de solucin de formaldehdo al 40% a 10 ml de cido sulfrico concentrado. Preparar fresco antes de cada uso. No se recomienda rociar con el reactivo de Marquis debido a la presencia de cido sulfrico concentrado. No obstante, proporciona informacin adicional til para diferenciar entre los ETA, por ejemplo, despus de la deteccin con ninhidrina. A tal fin, verter el reactivo de Marquis con una pipeta Pasteur sobre las manchas ya detectadas.

F.

Reactivo de fluorescamina (Fluram) Disolver 10 mg de fluorescamina en 50 ml de acetona. Preparar diariamente. Rociar la placa con el reactivo de fluorescamina. Secar utilizando aire caliente. Observar la placa con una luz UV a 366 nm. La anfetamina da una mancha fluorescente amarilla brillante. La metanfetamina no se detecta. (Para la estabilizacin en 366 nm, rociar con una solucin de trietilamina al 10% v/v en diclorometano).

G.

Reactivo de Simon7 Disolver 100 mg de nitroprusiato de sodio y 2 g de carbonato de sodio en 10 ml de agua (es decir, una solucin acuosa que contiene nitroprusiato de sodio a una concentracin del 1% y carbonato de sodio al 20%). Preparar el reactivo fresco antes de usarlo. Rociar la placa con el reactivo de Simon. Colocar la placa en un tanque de desarrollo vaco junto con un vaso de precipitacin con acetaldehdo. Cubrir el tanque. El vapor de acetaldehdo har que una mancha de metanfetamina se vuelva de color azul intenso.

H.

Reactivo de Dragendorff Solucin madre: disolver 0,85 g de subnitrato de bismuto (bsico) en 10 ml de cido actico. Disolver 50 ml con agua y agregar 8 g de yoduro de potasio en 20 ml de agua. Rociar la placa con una solucin preparada de 1 ml de solucin madre de Dragendorff, 2 ml de cido actico y 10 ml de agua. Los colores varan del naranja al violeta.

Este mtodo modificado mejora la sensibilidad para la metanfetamina a 0,1 (LOD). Las aminas primarias no se pueden detectar en razn de la baja sensibilidad del sistema a este grupo de sustancias, y a la interferencia con el color de fondo cuando se utiliza amonaco en el disolvente de desarrollo.

23

Interpretacin Despus de la visualizacin, marcar las manchas (por ejemplo, con lpiz), y calcular los valores del factor de retardacin (Rf): Rf = Distancia de migracin: del origen al centro de la zona del analito (mancha) Distancia de desarrollo: del origen al frente del disolvente

Es muy comn expresar factores de retencin como Rf x 100, denominado hRf. RESULTADOS Comparar los colores y los valores Rf de la muestra del ETA desconocido con los de normas de referencia de ETA autnticos que se analizaron simultneamente en la misma placa. En el cuadro 2 se dan los valores Rf de algunos de los ETA ms comunes. Cuadro 2. Valores Rf de los ETA y adulterantes que se encuentran con mayor frecuencia A 0,48 (0,43)** 0,66 0,37 0,36 0,37 0,47 0,35 (0,31) 0,36 (0,39) 0,31 (0,33) 0,40 0,41 (0,73) 0,35 (0,51) 0,35 (0,30) (0,52) B 0,37 (0,43) 0,56 0,32 0,32 0,33 0,37 0,22 (0,42) 0,33 (0,42) 0,21 (0,39) 0,31 0,33 (0,43) 0,31 (0,41) 0,20 (0,25) (0,52) (0,05) (0,03) (0,23) (0,15) (0,13) (0,24) (0,19) (0,47) (0,28) (0,18) (0,24) C (0,20)

Sistema de CCD* Nombre del ETA Anfetamina Catinona DOB DOET DMA N-Etilanfetamina Metanfetamina MDA MDMA MMDA PMA STP/DOM TMA Efedrina Cafena

*Sistemas de disolventes: A, B o C; placa de CCD: Gel de slica G con espesor de capa de 0,25mm Sistema A: metanol : amonaco concentrado (100:1,5) Sistema B: acetato etlico: metanol : amonaco concentrado (85:10:5) Sistema C: ciclohexano : tolueno : dietilamina (75:15:10) ** Los valores Rf entre parntesis se obtuvieron utilizando placas de slica impregnadas con KOH metanlico (0,1mol/l).

24

Notas analticas Debido a que pequeos cambios en la composicin y activacin de la placa de CCD, los sistemas de disolventes, la saturacin del tanque o la distancia de desarrollo pueden resultar en cambios significativos en los valores Rf, los valores proporcionados deben considerarse slo como una indicacin del comportamiento cromatogrfico de los ETA y adulterantes enumerados. Es esencial que los patrones de referencia de los ETA se analicen simultneamente en la misma placa. Alternativamente, se puede aumentar significativamente la posibilidad de reproduccin utilizando compuestos de referencia y valores Rf corregidos (Rfc). A los fines de la identificacin, siempre se deben considerar tanto los valores Rf como los colores de las manchas despus del rociado con reactivos de visualizacin

Lecturas recomendadas Fried y J. Sherma (Eds.), Practical Thin-Layer Chromatography, A Multidisciplinary Approach, Boca Raton Press, 1995. Jork y otros, Thin-Layer Chromatography, Reagents and Detection Methods, Weinheim, VCH, vol.1 (1990), Vol.2 (1992). Neumann, H. (1987), Nachweis und Identifizierung von Feniletilaminen (Stimulantien und Halluzinogene), Sci. Pharm., 55, 1 a 11. Ojanper, I., Whl, K., y Hase, T. A. (1990): Fast black K salt: a versatile thin-layer chromatographic visualization reagent for the differentiation of aliphatic amines, Analyst, vol. 115, pgs. 263 a 267. Stead, A. H., Gill, R., Wright, T., Gibbs, J. P., Moffat, A. C. (1982), Standardized thin-layer chromatographic systems for the identification of drugs and poisons, Analyst, vol. 107, pgs. 1106-1168.

C.

CROMATOGRAFA EN FASE GASEOSA (CG) DETECTOR DE IONIZACIN POR LLAMA (FID)

Para el anlisis de ETA por CG, los principios generales de las tcnicas son vlidos. En la actualidad el instrumento preferido de CG para trabajos analticos de rutina es el cromatgrafo de columna capilar de calibre menor, utilizando columnas capilares con dimetros internos entre 0,2 y 0,32 mm. Se reconoce que, por diversas razones, hay laboratorios que quiz deseen mantener un sistema de columna rellena. Para esos laboratorios, en una edicin anterior del presente manual se describe un mtodo que utiliza columnas rellenas. Los procedimientos de CG que utilizan una columna capilar de calibre mayor (0,53 mm de dimetro interno) representan un medio de mejorar el poder de resolucin en comparacin con las columnas rellenas, y son ms robustos que los sistemas de columna capilar de menor calibre. Los sistemas de CG ms antiguos, que fueron diseados para columnas rellenas, se pueden adaptar para utilizarlos con columnas de mayor calibre.

25

MTODOS

1.

Anlisis cualitativo
a) Soluciones estndar de ETA

Preparacin de muestras y soluciones estndar de ETA Poner unos 25 mg de sales estndar de ETA8 (debidamente pesados), en una probeta graduada de 25 ml y aadir agua hasta la marca. Colocar con una pipeta una alcuota de 1 a 5 ml de esta solucin en un tubo de ensayo de vidrio con tapn de rosca de 10 ml. Aadir por goteo una solucin de hidrxido de sodio al 5% hasta obtener un pH 10. Luego aadir 5 ml de disolvente de extraccin9. Tapar e invertir el tubo de ensayo por lo menos 10 veces o mezclar en un mezclador Vortex durante 1 minuto y dejar reposar hasta que se separen las capas10. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir la capa de disolvente (por ejemplo, el cloroformo) a travs de la capa de sulfato de sodio anhidro a un vial de CG. Inyectar 1-2 l de la capa de disolvente en el CG. b) Soluciones de muestras de ETA (muestra de ETA desconocido)

Pesar de 25 a 150 mg de la muestra, segn la pureza anticipada, para obtener una concentracin final de aproximadamente 1 mg/ml de sal del analito, y colocarla en una probeta graduada y aadir agua hasta la marca. La pureza prevista de la muestra se determina empricamente11. Colocar con una pipeta una alcuota de 1 a 5 ml de esta solucin en un tubo de ensayo de vidrio con tapn de rosca de 10 ml. Aadir por goteo una solucin de hidrxido de sodio al 5% hasta obtener un pH 10. Aadir luego 5 ml de disolvente de extraccin (por ejemplo, cloroformo). Tapar e invertir el tubo de ensayo por lo menos 10 veces o mezclar en un mezclador Vortex durante 1 minuto y dejar reposar hasta que se separen las capas. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir la capa de disolvente a travs de la capa de sulfato de sodio anhidro a un vial de CG. Inyectar 1-2 l de la capa de disolvente en el CG. Si se requiere una muestra rpida del producto, se pueden tomar muestras directamente en etanol/amonaco acuoso (99:1), e inyectarlas en el cromatgrafo de fase gaseosa. Con el empleo de este mtodo, la condicin del inyector y la columna pueden deteriorarse ms rpidamente que

Ocasionalmente, los estndares de ETA se pueden obtener en forma de base. En esos casos, no se requiere extraccin. En general, sin embargo, es importante que la forma de los estndares y las muestras sea siempre la misma. 9 Todos los analitos deben ser completamente solubles en el disolvente de extraccin, y ste ltimo debe ser inmiscible con una capa acuosa. Los disolventes adecuados son, entre otros, n-hexano, cloroformo, cloruro de metileno y acetato de butilo. 10 Cuando se emplea cloroformo como disolvente de extraccin, se pueden formar emulsiones. En esos casos, la adicin de NaCI mejora la taza de extraccin al romper la emulsin. Si se utilizan agitadores modernos y luego se centrifuga la muestra para la separacin de las dos capas, normalmente no se forman emulsiones. 11 La pureza de la muestra se puede determinar en base a la experiencia del qumico, o utilizando el siguiente mtodo aproximativo: disolver 100 mg de la muestra en 2-3 ml de cloroformo; filtrar la solucin, recoger los insolubles, secar y pesar. La cantidad soluble (es decir, el peso original menos los insolubles secos) es la pureza prevista de la muestra. Hay que tener presente, sin embargo, que ste mtodo puede resultar en una pureza anticipada de la muestra inferior a la real para las sales que no son solubles en cloroformo (vase el captulo VI.A.2, sobre el ensayo de aniones, supra) 26

con las muestras extradas. (Nota: Este mtodo no es adecuado para anlisis cuantitativos dado que es difcil producir una buena cromatografa en presencia de amonaco.) Condiciones de trabajo con un CG Detector: Columna: Longitud: Espesor de la pelcula: Gas portador12: Tasa de desdoblamiento: Temperatura de la columna: FID (o NPD, si est disponible o es conveniente) DB-5 (5% fenil, 95% dimetilpolisiloxano), DB-1 (100% dimetilpolisiloxano), o equivalente 10-30 m, ID 0,20-0,53 mm 0,10-0,50 m Nitrgeno, helio o hidrgeno, a aprox. 0,8ml/min (N2) o 1-1,2 ml/min (He o H2) 20:1 a 50:1 La temperatura inicial debe ser suficientemente baja (por ejemplo, 60-90C) en razn de la alta volatilidad de los ETA bases, por ejemplo, 60C, mantener por 0,5 min, a 280C, a una tasa de 12C/min, mantener la temperatura final durante 30 min. 210-250C 310C

Temperatura de inyeccin: Temperatura del detector: RESULTADOS

La identificacin se realiza comparando el tiempo de retencin del analito con el de una norma de referencia. El orden de elucin es como sigue: anfetamina < metanfetamina < seudoefedrina < efedrina < PMA < PMMA < MDA < MDMA < 4-MTA < MDEA < MBDB < 2C-B. En las condiciones descritas, la cafena y la ketamina, que se encuentran con frecuencia en las muestras de ETA en algunas regiones, elucidan despus de 2C-B.

2.

Anlisis cuantitativo

A continuacin se presentan tres mtodos para el anlisis cuantitativo de ETA por CG-FID: Un mtodo estndar nico (A) y dos mtodos estndar mltiples (B y C). Los mtodos A y B no requieren derivatizacin, mientras que el mtodo C requiere sililacin. Los tres mtodos se describen para uso general. En el anexo IV hay ejemplos de mtodos de CG validados para la cuantificacin de ETA seleccionados.

i.

Mtodo A: mtodo estndar nico

El mtodo A es adecuado para la cuantificacin de la mayora de los ETA. Comprende la preparacin de slo una solucin estndar de ETA en una concentracin similar a la concentracin prevista del analito. Preparacin de la solucin estndar interna (SI) Pesar con precisin unos 25 mg de la solucin estndar interna seleccionada (por ejemplo, n-tetradecano u otros n-alcanos con un nmero par de tomos de carbono, o difenilamina) y disolver en 25 ml de disolvente de extraccin (por ejemplo, cloroformo). Si la solucin estndar
12

El flujo de gas depende de la columna ID; se puede utilizar la programacin del gradiente de presin, si est disponible.

27

interna se utiliza para la extraccin, la concentracin objetivo se debe preparar dentro del intervalo lineal del instrumento (no ms de 0,5 mg/ml). Preparacin de muestras y soluciones estndar de ETA13 Las muestras y soluciones estndar de ETA se deben preparar siguiendo los procedimientos esbozados ms arriba para el anlisis cualitativo, utilizando la solucin estndar interna para la extraccin de muestras y estndares de ETA, de la siguiente manera: a) Soluciones estndar de ETA

Pesar con precisin unos 25 mg de sales estndar14 del ETA de inters en una probeta graduada y aadir agua hasta la marca. Transferir con precisin una alcuota de 1 a 5 ml de esta solucin a un tubo de ensayo de vidrio con tapn de rosca de 10 ml. Aadir por goteo una solucin de hidrxido de sodio al 5% hasta obtener un pH 10. Aadir luego con precisin 5 ml de solucin estndar interna. Tapar e invertir el tubo de ensayo por lo menos 10 veces o mezclar en un mezclador Vortex durante 1 minuto y dejar reposar hasta que se separen las capas. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir la capa de disolvente a travs de la capa de sulfato de sodio anhidro a un vial de CG. Inyectar 1-2 l de la capa de disolvente en el CG. Analizar la solucin estndar tres veces o ms. b) Soluciones de muestras de ETA (muestra de ETA desconocido)

Pesar con precisin de 25 a 150 mg de la muestra, segn la pureza anticipada, para obtener una concentracin final de aproximadamente 1 mg/ml de sal del analito, ponerla en una probeta graduada y aadir agua hasta la marca. La pureza prevista de la muestra se determina empricamente. Con una pipeta, poner una alcuota de 1 a 5 ml de esta solucin en un tubo de ensayo de vidrio con tapa de rosca de 10 ml. Aadir por goteo una solucin de hidrxido de sodio al 5% hasta obtener un pH 10. Aadir luego con precisin 5 ml de la solucin estndar interna. Tapar e invertir el tubo de ensayo por lo menos 10 veces o mezclar en un mezclador Vortex durante 1 minuto y dejar reposar hasta que se separen las capas. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir la capa de disolvente a travs de la capa de sulfato de sodio anhidro a un vial de CG. Inyectar 1-2 l de la capa de disolvente en el CG. Analizar la solucin de la muestra del ETA desconocido de preferencia dos veces o ms. Condiciones de trabajo con CG Las mismas que para el anlisis cualitativo por CG (pg. 26).

Las muestras y soluciones estndar de ETA y sus concentraciones estn diseadas para usar con columnas capilares y los procedimientos que se describen ms abajo. El empleo de columnas y sistemas de CG alternativos puede requerir cambios en trminos tanto de la composicin relativa como de las concentraciones de los diferentes componentes. 14 Si se utilizan estndares de ETA en forma de base, no se requiere extraccin. En esos casos, pesar no menos de unos 10 mg del estndar de ETA y disolver directamente en 10 ml de solucin estndar interna dispensada con precisin. Para una cuantitacin precisa, es importante que la forma del analito (sal o base) sea igual a la del estndar de ETA.

13

28

Clculos De las inyecciones mltiples, calcular las tasas medias de las reas del pico: 1) del estndar de ETA pertinente en relacin con el estndar interno (ASt/IS), y 2) del ETA desconocido en relacin con el estndar interno (AATS/IS). El porcentaje de contenido de droga de la muestra se puede calcular utilizando la siguiente frmula: ATS (%) = donde ATS (%) = CSt CATS AATS/IS ASt/IS Contenido del ETA desconocido (como base o sal; vase la nota 14) en el material de muestra original (= pureza de la muestra) CSt CATS * AATS/IS ASt/IS * 100

= Concentracin de la solucin estndar de ETA (mg/ml), preparada de conformidad con a) supra (= peso del ETA estndar puro por mililitro de disolvente) = Concentracin de la solucin de la muestra del ETA desconocido (mg/ml), preparada de conformidad con b) supra (= peso de la muestra del ETA desconocido por mililitro de disolvente) = Recuentos del rea del pico del ETA desconocido dividido por el recuento del rea del pico del estndar interno (de preferencia, una media de dos determinaciones) = Recuentos del rea del pico del ETA estndar dividido por el recuento del rea del pico del estndar interno (de preferencia, una media de dos determinaciones)

El mtodo A se puede modificar de nico a mltiple diluyendo secuencialmente alcuotas de la solucin estndar de ETA con la solucin estndar interna utilizando probetas graduadas de 10 ml. De esta forma, se pueden preparar concentraciones estndar de ETA, en funcin de la concentracin apropiada dentro del intervalo lineal del instrumento, y lograr una calibracin de puntos mltiples.

ii.

Mtodo B: mtodo estndar mltiple sin derivatizacin

El que sigue es un mtodo de calibracin de puntos mltiples recomendado; en el anexo IV figuran mtodos de CG validados para el anlisis cuantitativo de ETA, con y sin derivatizacin. Preparacin de la solucin estndar interna (SI) Pesar cuidadosamente de 0,3 a 0,4 g de la solucin estndar interna seleccionada (ntetradecano, otros n-alcanos, difenilamina o ETA estructuralmente relacionado en forma de base)15 en una probeta graduada de 500 ml y diluir al volumen con cloroformo para obtener una solucin estndar interna de 0,6 a 0,8 mg/ml.

15 Si se utiliza un estndar interno en forma de sal (por ejemplo, la sal de un ETA estructuralmente relacionado), se requiere una extraccin. En esos casos, pesar no menos de unos 10 mg de estndar de ETA y disolver directamente en 10 ml de solucin estndar interna dispensada con precisin.

29

Preparacin de soluciones estndar de ETA (soluciones de calibracin de CG) Las soluciones madre estndar deben contener todos los compuestos de inters en concentraciones de aproximadamente 1000 mg/l. Se pueden mantener en una probeta cerrada en un refrigerador por un perodo de hasta un ao. Para la preparacin de soluciones madre: a) b) Pesar con precisin unos 1000 mg de la sal o sales del ETA de inters y ponerlos en una probeta graduada de 1000 ml; aadir agua hasta la marca; Transferir con precisin mediante una pipeta, 5 ml de esta solucin a un tubo de ensayo de vidrio con tapa de rosca de 20 ml. Hacer bsica al tornasol aadiendo unas pocas gotas de solucin de amonaco concentrada. Aadir con precisin 5 ml de cloroformo; Cerrar y agitar bien, y dejar reposar hasta que se separen las capas. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir aproximadamente 1 ml de la capa de cloroformo a travs de sulfato de sodio anhidro a un pequeo vaso de precipitacin. Esta solucin estndar no debe permanecer en reposo ms de media hora antes de utilizarla para la calibracin; Para la preparacin de los estndares de calibracin en una calibracin de 5 puntos, preparar los diferentes niveles de la siguiente manera: Preparacin de estndares de calibracin de puntos mltiples Nivel de calibracin Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4 Nivel 5 Solucin estndar de ETA (l) 20 40 60 80 100 Solucin SI (l) 100 100 100 100 100 CHCl3 (l) 880 860 840 820 800 Concentracin aproximada de sal de ETA (mg/l) 20 40 60 80 100

c)

d)

Inyectar, por lo menos tres veces, 1-2 l de cada nivel en el CG y utilizar los valores medios para establecer la curva de calibracin. Preparacin de soluciones de muestras de ETA (muestra de ETA desconocido) En general, pero especficamente para los anlisis cuantitativos, homogeneizar las muestras antes de iniciar cualquier ensayo o submuestreo. a) Pesar con precisin una cantidad de muestra suficiente en una probeta graduada de 25 ml para obtener una concentracin final de aproximadamente 0,2-1 mg/ml del analito. Agregar agua hasta la marca.
Nota: La cantidad de la muestra que se pese depender de la pureza anticipada, como se indica en el mtodo de clasificacin preliminar. Por ejemplo, si la pureza anticipada es de un 40%, la cantidad de muestra utilizada deber ser aproximadamente 60 mg;

b)

Transferir con precisin mediante una pipeta 5 ml de esta solucin a un tubo de ensayo de vidrio con tapa de rosca de 20 ml. Hacer bsica al tornasol aadiendo unas pocas gotas de solucin de amonaco concentrada. Aadir con precisin 5 ml de cloroformo;

30

c)

d)

Cerrar y agitar bien, y dejar reposar hasta que se separen las capas. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir aproximadamente 1 ml de esta muestra a travs de sulfato de sodio anhidro a un pequeo vaso de precipitacin. Medir 100 l de la solucin de la muestra, 100 l de la solucin estndar interna y 800 l de cloroformo y ponerlos en el vial de CG; Inyectar 1-2 l en el cromatgrafo de fase gaseosa. Analizar la solucin de la muestra del ETA desconocido, de preferencia dos veces o ms.

Condiciones de trabajo con un CG Para los anlisis cuantitativos, es preferible utilizar un CG equipado con un instrumento de muestreo automtico. Las condiciones de trabajo pueden ser las mismas que para el anlisis cualitativo (pg. 26). Clculos El porcentaje de droga contenido en la muestra se calcula a partir de la concentracin de la solucin de la muestra del ETA desconocido y los correspondientes valores de la curva de calibracin. Con instrumentos y programas informticos de CG modernos, y despus de conocer a travs del operador las concentraciones de los diferentes estndares de calibracin y la solucin de la muestra desconocida, se establece la curva de calibracin y se realizan los clculos automticamente para un punto nico de la curva a la terminacin del anlisis. Normalmente, el resultado se expresar como contenido porcentual de la droga desconocida en el material de muestra original, es decir, como la pureza de la muestra (peso del analito en relacin con el peso de la muestra).

iii.

Mtodo C: mtodo estndar mltiple con derivatizacin

Preparar muestras y soluciones estndar de ETA derivatizadas midiendo una alcuota (por ejemplo, 100 l de base seca liberada (es decir, despus de haber transferido las muestras y soluciones estndar a travs de sulfato de sodio anhidro a un pequeo vaso de precipitacin; pasos (c) supra) junto con una alcuota de 100 l de solucin estndar interna, 750 l de cloroformo y 50 l de BSTFA (o BSTFA + TMCS al 1%) a un vial de muestras de CG. Para la calibracin de puntos mltiples, seguir el mtodo B (vase el cuadro titulado Preparacin de estndares de calibracin de puntos mltiples), utilizando 50 l de BSTFA en cada paso para la preparacin de muestras y soluciones estndar, y aadiendo cloroformo hasta 1 ml.

D.

CROMATOGRAFA EN FASE GASEOSA ESPECTROMETRA DE MASAS (CG-EM)

La CG-EM es una de la tcnicas ms utilizadas para la identificacin, y recientemente tambin para la cuantificacin de muestras de drogas forenses. Como tcnica compuesta, combina el poder de separacin y la sensibilidad de la CG-FID con la especificidad por analito de una tcnica espectroscpica, produciendo datos espectrales muy especficos de compuestos individuales en una mezcla compleja de compuestos sin separacin previa. Preparacin de muestras y soluciones estndar de ETA: Se preparan las muestras en la forma descrita ms arriba para los mtodos de CG. Se mejoran la sensibilidad del anlisis y la especificidad del espectro de masas del ETA mediante derivatizacin (vase el anexo VII). La preparacin de derivativos es particularmente conveniente cuando el espectro de masas de la molcula no derivatizada tiene poco valor de

31

diagnstico. La mayora de los ETA no derivatizados tienen fragmentos de iones de bajo cociente masa/carga (m/z), baja intensidad y slo un ion fragmentado ms abundante (pico bsico). La derivatizacin de ETA produce por lo general iones fragmentados de cociente m/z ms alto y mayor abundancia. Los iones de gran masa son ms especficos y tienen un mayor valor de diagnstico, ya que no se ven afectados por iones de fondo que interfieren, como material de la purga de la columna u otros contaminantes. Igual que el anlisis de CG descrito ms arriba, si se requiere una muestra rpida, se puede tomar directamente en el etanol/amonaco acuoso (99:1) e inyectar en el CG-EM. Ahora bien, en este caso, la condicin del inyector y de la columna se puede deteriorar ms rpidamente que con las muestras extradas. Para utilizar en CG-EM, las muestras de aminas primarias tambin se pueden tomar directamente en disulfito de carbono (CS2), que resulta en la formacin de una isotiocianato, un derivativo que da un espectro de masas ms caracterstico que los compuestos iniciales. Condiciones de trabajo con CS-EM Condiciones del horno de CG: Columna: Igual que para el anlisis de CG (se pueden utilizar las condiciones de los mtodos A, B o C) Igual que para el anlisis de CG, por ejemplo: DB-5 (5% fenil, 95% dimetilpolisiloxano), DB-1 (100% dimetil-polisiloxano), 0,25mm x 30m x 0,25m, o equivalente Desdoblada/sin desdoblar 250C Helio, 1 ml/min Flujo constante (o presin constante)

Punto de inyeccin Modalidad: Temperatura: Gas portador: Modalidad: Detector Modalidad de ionizacin: Temperatura de la transferencia: Temperatura de la fuente de iones: Parmetros de escaneo:

Modalidad EI, 70 eV (Modalidad CI, si se prefiere) 280C 230C Cmaras de escaneo de imgenes trmicas (microscopio de escaneo de iones, si se requiere), intervalo de escaneo: 35-450 (para sustancias como 2C-B se puede comenzar a m/z 29)

RESULTADOS La identificacin se realiza comparando el tiempo de retencin y el espectro de masas del analito con el de un estndar de referencia. Todos los compuestos identificados por CG-EM y comunicados por el analista se deben comparar con un espectro de masas actual del estndar de referencia apropiado, de preferencia obtenido con el mismo instrumento y utilizado en las mismas condiciones. Se cuenta con varias bibliotecas de referencia comerciales sobre espectro de masas. Respecto de la mayora de los instrumentos de CG-EM, muchas de esas referencias estn disponibles en lnea. En general, sin embargo, es importante utilizar las bibliotecas de espectros de masas, ya sea de una fuente comercial o generada por el usuario, slo con fines de referencia.

32

Lecturas recomendadas No se dispone de una fuente de bibliografa nica para la interpretacin del espectro de masas de los ETA, pero hay varias fuentes generales buenas, que en conjunto presentan datos razonablemente amplios, por ejemplo: Karl Pfleger, Hans H. Maurer, Armin Weber (2000), Mass Spectral and GC Data of Drugs, Poisons, Pesticides, Pollutants and Their Metabolites: Parts I-IV, Wiley. La ONUDD tambin tiene una coleccin limitada de espectros de masas relativos a los principales ETA. La coleccin se puede consultar por la Internet o, previa peticin, tambin est disponible en un CD-ROM.

E.

CROMATOGRAFA LQUIDA DE GRAN RENDIMIENTO (CLGR)

Adems de la CG, la CLGR es otra importante tcnica de separacin utilizada comnmente en el anlisis de drogas forense. Para facilitar la preparacin de muestras y obtener una mejor reproducibilidad y estabilidad, se recomienda la cromatografa de fase inversa para el anlisis de ETA y sus anlogos con anillo sustituido. La columna ms universal y verstil es una columna de slica gel ligada con octadecilo (C18). La longitud y el dimetro de la columna, el tamao de las partculas, el tamao de los poros y la carga de carbono se deben examinar antes de la seleccin final de la columna. Dado que hay una gran variedad de fases estacionarias y mviles a disposicin del analista, a continuacin slo se dan directrices. MTODO Preparacin de muestras y soluciones estndar de ETA Disolver una cantidad apropiada del estndar o la muestra en la fase mvil, apuntando a una concentracin del componente activo entre 0,05-0,50 mg/ml. Las soluciones de la muestra se deben filtrar antes del anlisis. Las soluciones madre y estndar se deben preparar a partir de estndares de referencia. Los estndares de trabajo deben estar comprendidos en el intervalo lineal del detector y aproximadamente 80%-120% de la concentracin objetivo. Es conveniente realizar una calibracin de puntos mltiples pero tambin es aceptable un mtodo estndar nico.

Condiciones de trabajo Detector: Detector de ordenacin de diodos, escaneo rpido o longitud de onda variable, UV 200-210nm (utilizar tambin 280-290nm para las fenetilaminas con metilendioxi sustituido) C8 o C18 con partculas de 5 m o ms pequeas < 30 cm < 5,0 mm Dimetro: 2-4 mm, longitud: 25 mm, fase inversa C8 o C18 15-35C (se recomienda enrgicamente controlar la temperatura en entornos sin termostato) Tampn de fosfato pH 2,0-3,2 (por ejemplo, 50 mM fosfato de sodio monobsico ajustado con cido fosfrico). Para los picos de los residuos, se pueden necesitar aditivos de fase mvil como sulfatos de alkilo o sulfonatos de alkilo o aminas.

Fase estacionaria: Longitud de la columna: Dimetro de la columna: Columna preliminar: Temperatura de la columna: Tampn de la fase mvil:

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Modificador orgnico de fase mvil:

Tasa de flujo: Volumen de inyeccin: Separacin:

Metanol o acetonitrilo entre 2% y 20% (con grupos alkilos ms altos, sobre sulfatos de alkilo o sulfonatos de alkilo, se puedan requerir concentraciones orgnicas ms altas). 0,1-2,0 ml/min 1-100 l Se debe realizar un anlisis isocrtico o de gradiente referido a tiempos de retencin de menos de 30 minutos.

RESULTADOS La identificacin se realiza comparando el tiempo de retencin del analito con el del estndar de referencia y, si es posible, utilizando mltiples longitudes de onda UV o deteccin por ordenamiento de diodos o escaneo rpido. Para los anlogos con anillo sustituido como MDA, MDMA y MDEA, se pueden utilizar tambin escaneos fluorescentes. La especificidad del mtodo es importante, ya que siempre existe la posibilidad de que compuestos similares elucidan en el mismo tiempo de retencin. Un orden de elucin tpico es el siguiente: norefedrina, efedrina, anfetamina, metanfetamina, MDA, MDMA y MDEA. La separacin de los pares efedrina/seudoefedrina y norefedrina/ norseudoefedrina puede ser difcil, o puede requerir ligeros ajustes de las condiciones de la CLGR. Cuantitacin Se puede utilizar una calibracin estndar externa o interna (se recomienda la calibracin estndar externa especialmente si se utiliza un inyector basado en vlvulas en modalidad de sobrecarga). Se recomienda el uso del rea del pico para la cuantitacin CLGR, porque el aplastamiento del pico (disminucin de la altura del pico) puede ocurrir como resultado del deterioro de la fase estacionaria, haciendo que la altura del pico no sea adecuada para la cuantitacin. Se puede aumentar la especificidad de la deteccin utilizando mtodos de deteccin fluorescente o de longitudes de onda UV mltiples. En el anexo V se describe uno de mtodo de CLGR validado para la cuantitacin de ETA.

Lecturas recomendadas Aalberg, L., DeRuiter, J., Noggle, F. T., Sippola, E. y Clark, C. R. (2000), Chromatographic and Mass Spectral Methods of Identification for the Side-Chain and Ring Regioisomers of Methylenedioxymethamphetamine, J. Chromatogr. Sci., 38, pgs. 329 a 337. Clark, C. R., DeRuiter, J., Valer, A. y Noggle, F. T. (1995), Gas Chromatographic-Mass Spectrometric and Liquid Chromatographic Analysis of Designer Butanamines Related to MDMA, J. Chromatogr. Sci., 33, pgs. 328 a 337. Lurie, I. S. (1995), Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatographic Analysis of Drugs of Forensic Interest, cap. 4 en Analysis of Addictive and Misused Drugs, Adamovics, J. A., (Ed.), Marcel Dekker, Nueva York, NY, U.S.A., pgs. 51 a 132. Malone, J. V. (1998), HPLC Quantication of Clandestinely Manufactured Mixtures of Amphetamine and Methamphetamine, Microgram, 31, pgs. 304 a 307. Sadeghipour, F., Giroud, C., Rivier, L., y Veuthey, J.-L. (1997), Rapid Determination of anfetaminas by High-Performance Liquid Chromatography with UV Detection, J. Chromatogr., 761, pgs.71 a 78.

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Sadeghipour, F., y Veuthey, J.-L. (1997), Sensitive and Selective Determination of Methylenedioxylated Amphetamines by High-Performance Liquid Chromatography with Fluorimetric Detection, J. Chromatogr., 787, pgs.137 a 143. Schneider, R. C., y Kovar, K. A. (2003), Analysis of Ecstasy with a Monolithic Reversed-Phase Column, Chromatographia, 57, pgs. 287 a 291.

F. ESPECTROSCOPA INFRARROJA TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR)

La espectroscopa infrarroja se utiliza mucho como mtodo cualitativo, y desde hace tambin cuantitativo, para la determinacin y el anlisis estructural de ETA. El anlisis puede ser particularmente til para la clasificacin rpida de tabletas y polvos de proporcionando indicaciones sobre la homogeneidad de las tabletas o la presencia de mixtos. Preparacin de la muestra16 Los mtodos preferidos para la preparacin de muestras son la disolucin de la muestra en un disolvente apropiado, o su suspensin en una pasta aceitosa. Una tcnica menos conveniente es la del mtodo del disco de haluro, en que la muestra se dispersa en un haluro de potasio finamente molido (KBr o KCl) que se imprime en un disco delgado. Ahora bien, la mayora de los laboratorios forenses prefieren el mtodo del disco de haluro por dos razones: i) los haluros de potasio son transparentes en IR en la denominada regin de las huellas digitales ((2000-400 cm-1), y ii) el disco de haluro de potasio por lo general se puede volver a analizar muchas veces si se lo almacena sobre un desecante. El mtodo del disco de haluro17 consiste en golpear una muestra seca hasta obtener un polvo muy fino, mezclar luego aproximadamente 1 mg del polvo de la muestra homogeneizado con 200 mg de haluro lcali molido y secado. Tras la molienda, la mezcla se imprime en un disco transparente delgado. El KCl y el KBr son igualmente apropiados. Ahora bien, el KCI es ligeramente menos higroscpico y en general se lo recomienda en lugar del KBr, especialmente cuando el analito es una sal clorhdrica (para eliminar el problema del intercambio de haluros). El KBr o el KCl que se utilicen deben ser de pureza IR y haber sido secado a 110C durante por lo menos una hora. Se lo puede almacenar sobre un desecante fuerte (por ejemplo, pentxido de fsforo) en un desecador, o dejado en un horno y utilizado cuando se necesite. Esto puede ser importante en cualquier accin judicial subsiguiente. Asimismo, el material investigado se puede recuperar del disco de haluro para nuevos ensayos. El mtodo de la pasta de Nujol requiere la mezcla de una muestra de polvo fino (2-3 mg) con una gota de Nujol (parafina lquida o perfluorinato alcano de cadena larga), y luego moler la mezcla en un mortero de gata. La cantidad de Nujol aadido se ajusta para que la pasta final tenga la consistencia de una crema fina. La pasta resultante se distribuye en un disco de haluro lcali (por lo general, KBr) y un disco similar colocado encima. La pelcula entre los discos de haluro no debe contener burbujas de aire. La desventaja evidente de este mtodo es la interferencia del Nujol en el espectro. Un enfoque similar, la tcnica de la pelcula delgada, se
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poco FTIR ETA, lotes

Un manual separado complementa la serie de manuales de las Naciones Unidas sobre mtodos recomendados. Proporciona ms detalles sobre las caractersticas y usos prcticos para anlisis de drogas de diferentes tcnicas analticas. 17 Para slidos, es importante i) reducir el tamao de las partculas moliendo hasta una dimensin inferior a la longitud de onda analtica ms corta (para evitar la dispersin), y ii) diluir la muestra a fin de reducir al mnimo la absorcin en el disco preparado.

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utiliza tambin para el anlisis directo de bases libres de ETA, que por lo general son lquidos aceitosos. El mtodo ATR de diamante de reflexin simple (por ejemplo, el dispositivo Golden Gate) es un mtodo relativamente nuevo para lquidos y slidos, que no requiere de preparacin de muestras. Sin embargo, el espectro obtenido con este mtodo no se puede comparar directamente con los obtenidos con cualquiera de los mtodos descritos ms arriba. Por ltimo, el mtodo de la clula de gas es un instrumento prctico para el anlisis rpido de disolventes y algunos precursores de los laboratorios clandestinos.

Aislamiento de la droga pura de una muestra a) Aislamiento de la base libre del ETA Disolver 25-50 mg de la muestra en 1 ml de 0,1N de cido tartrico. Agregar 4-5 gotas de hidrxido de amonaco y extraer con cloroformo. Pasar la capa de cloroformo por una columna pequea tapada con un algodn para eliminar las partculas en suspensin. Dejar que una parte de la solucin de cloroformo se evapore directamente en un disco de KBr y registrar el espectro infrarrojo de la base libre, por ejemplo, utilizando la tcnica de la capa delgada en discos de KBr. b) Aislamiento de las sales del ETA

Triturar una porcin de 20-50 mg de la muestra con 1-2 ml de cloroformo. Filtrar, recoger el extracto y el concentrado utilizando un chorro suave de nitrgeno. Inducir la cristalizacin, filtrar, secar los cristales y analizar el espectro infrarrojo de la sal de ETA resultante utilizando uno de los mtodos que se describen a continuacin. MTODOS El espectro de las sales del ETA se registra utilizando muestras preparadas por los siguientes mtodos: Disco de haluro KBr (1-1,5%) Mtodo del aceite de Nujol Mtodo directo, por ejemplo, reflectancia difusa ATR Mtodo de la reflectancia difusa El espectro de bases de ETA se registra utilizando muestras preparadas por los siguientes mtodos: Mtodo de la pelcula delgada Tarjetas IR Mtodo directo, por ejemplo, la reflectancia difusa ATR

Mtodos alternativos de preparacin de muestras IR para la metanfetamina Mtodo de extraccin seca en serie Colocar 200 mg de muestra de metanfetamina en polvo en una pipeta Pasteur descartable con un tapn de lana de vidrio al final. Lavar la muestra con dos partes de 1 ml de acetona y recoger la fraccin de acetona. Despus de secarla con aire, lavar la columna con dos partes de 1 ml de cloroformo y recoger la fraccin de cloroformo. Dejar que la columna se vuelva a secar y luego enjuagarla con dos alcuotas de 1 ml de metanol y recoger la fraccin de metanol. El material insoluble se puede retirar luego de la pipeta. Todas las fracciones se examinan por espectroscopa infrarroja con fines de identificacin. Separacin fsica/recristalizacin selectiva

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Los procedimientos que se explican a continuacin funcionan bien para el tipo de mezclas indicado; no funcionan tan bien con hidrocloruro de anfetamina. Una mezcla con contenido de metanfetamina Mezclar en un vaso de precipitacin 25 mg de una muestra con 20 ml de una mezcla 2:1 de cloroformo y hexano, y concentrar la solucin hasta aproximadamente la mitad del volumen original. Aadir ter dietlico al precipitado de metanfetamina. Filtrar, secar y obtener el espectro IR (hidrocloruro de metanfetamina). Una mezcla con contenido de metanfetamina, seudoefedrina y efedrina Colocar 100 mg de muestra en un pedazo de papel de filtro y lavar con 40 ml de una mezcla 3:1 de cloroformo y hexano. Lavar la parte insoluble con cloroformo, secar y recuperar con fines de examen (hidrocloruro de efedrina). Evaporar la solucin original hasta que se seque y dividirla en dos partes iguales. Disolver la mitad de esta muestra en 20 ml de una mezcla 2:1 de cloroformo y hexano, concentrar hasta aproximadamente la mitad del volumen original y aadir ter dietlico para precipitar la metanfetamina. Filtrar, secar y obtener el espectro IR (hidrocloruro de metanfetamina). Disolver la otra mitad de la muestra en 2 ml de cloroformo y aadir 1,6 ml de hexano para precipitar la seudoefedrina. Filtrar, secar y obtener el espectro IR (hidrocloruro de seudoefedrina).

Lecturas recomendadas (mtodos alternativos de preparacin de muestras IR para la metanfetamina) Ely, R. A. (1993), Dry Serial Extraction of Illicit metanfetamina Powders For the Identification of Adulterants and Diluents By Infrared Spectroscopy, Journal of the Clandestine Laboratory Investigating Chemists Association (JCLIC), 3(1), pgs. 21 a 25. Oulton, S. R. (1997), Separation and Identification of Ephedrine, Pseudoephedrine and Methamphetamine Mixtures, Microgram, 30(12), pgs. 289 a 296. Stinson, S. B. y Berry, M. R. (1974), Separation and identification of amphetamine or methamphetamine in combination with ephedrine or caffeine, 7(4), pg. 51.

RESULTADOS La identificacin se logra comparando el espectro del analito con el del estndar de referencia, o de una biblioteca espectral.

Lecturas recomendadas Laboratory Methods in Vibrational Spectroscopy (third ed.), editado por Willis, H. A., van der Maas J. H. y Miller, R. G. J., John Wiley & sons, Chichester, 1987

G. ANLISIS DE ISMEROS PTICOS

La mayora de los ETA tiene un tomo de carbono asimtrico resultante en un par de enantimeros para cada ETA. En funcin de la fuente, por lo tanto, se pueden encontrar formas enantiomricas diferentes de anfetamina, metanfetamina y otros ETA en muestras incautadas sometidas a anlisis De conformidad con el Convenio sobre Sustancias Sicotrpicas de 1971 de las Naciones Unidas,

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cada ismero ptico ( d- y I-), as como la mezcla racmica (dl) de anfetamina y metanfetamina, estn sometidos a fiscalizacin. Con respecto a la mayora de los ETA con anillo sustituido, slo los racematos estn sometidos a fiscalizacin, y los enantimeros genricos se incluyen mediante una frase genrica. Los ismeros pticos difieren en cierta medida en cuanto a la actividad farmacolgica y en ciertos pases estn sujetos a diferentes medidas de reglamentacin. En los pases en que la legislacin nacional exige la identificacin del ismero ptico especfico presente, se pueden utilizar los siguientes procedimientos analticos.

1. Punto de fusin
La comparacin del punto de fusin de la mezcla de la muestra con el estndar de referencia enantiomricamente puro es un ensayo rpido y sencillo para distinguir ismeros pticos. Por ejemplo, d- y l-hidrocloruro de metanfetamina tienen el mismo punto de fusin (170-175C), pero una mezcla de cantidades iguales de ambos ismeros pticos (mezcla racmica) tiene un punto de fusin ms bajo (130-135C). Este mtodo requiere muestras bastante puras. En general, los puntos de fusin se deben determinar utilizando muestras secas.

2. Ensayos de microcristales
(Vase tambin la seccin sobre el ensayo de microcristales como ensayo presuntivo, supra.) Para los ETA, normalmente se utiliza la tcnica de la gota en suspensin, o ensayo de volatilidad. Esta tcnica requiere una placa con cavidades, una cubierta de vidrio, el reactivo de ensayo y un reactivo de volatilizacin. En el anexo III se describen los reactivos de ensayo y de volatilizacin. Ensayos de microcristales para ismeros pticos de anfetamina Ensayo del cloruro de oro [HAuCl4 al 5% en H3PO4] Transferir una pequea cantidad del polvo de la muestra a la depresin de la placa de cavidad, y aadir una o dos gotas del reactivo de volatilizacin (solucin de NaOH al 5%). Esto libera la amina libre en forma de base libre voltil, que emerge de la solucin como un vapor. Transferir inmediatamente una gota del reactivo de ensayo (HAuCl4 al 5% en H3PO4) a la placa de vidrio e invertir y cruzar la placa sobre la cavidad de muestra. El reactivo reacciona entonces con el vapor de aminas presente en la cavidad. Tras un intervalo apropiado, volver a invertir la placa del reactivo y examinar los cristales en el reactivo o en el borde de la cuota de reactivo. RESULTADOS La d- y la l-anfetamina dan microcristales idnticos, que se asemejan a largas varillas amarillas o agujas speras y largas hojas angostas. La forma de distinguirlas es formar el racemato, que produce cristales diferentes. El racemato de dl-anfetamina da al principio gotas aceitosas y luego cristales escamosos coloreados. Estos cristales se forman en general despus de la inversin. Distincin de d- y l-anfetamina Si el ensayo explicado ms arriba indica que la muestra es de d- o l-anfetamina, se debe determinar cul est presente. A tal fin, aadir parte del polvo de la muestra desconocida a una pequea cantidad de sal de d-anfetamina conocida en una cavidad y a una pequea cantidad de

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sal de l-anfetamina en otra. Repetir el ensayo. La mezcla que sea (d+d) o (l+l) producir largas varillas amarillas, etctera. La mezcla que sea (d+l) dar los cristales escamosos del racemato descritos ms arriba. Metanfetamina La d-metanfetamina ensayada con HAuCl4 al 5% en H3PO4 da hojas V con un lado ms corto que el otro. stas se desarrollan muy rpidamente si el ensayo se realiza directamente sobre la muestra seca, o ms lentamente si la muestra se diluye o el ensayo se realiza utilizando la tcnica de la gota en suspensin La l-metanfetamina da hojas cruzadas singulares y hojas V, que forman extremos en forma de cigarros caractersticos (afiladas a ambos lados en el extremo de la hoja). La d,l-metanfetamina forma hojas singulares y X, que a veces tienen forma de cuchillo. Los extremos de la hoja slo estn afilados en un lado, igual que un cuchillo. MDMA La MDMA ensayada con HAuCl4 al 5% en H3PO4 da cristales blancos en forma de X de doble refaccin con conglomerados en forma de estrella bajo luz polarizadora. Estos cristales son similares a los de la d,l-metanfetamina con cloruro de oro, pero con un poco de prctica se pueden diferenciar.
Nota: Dado que la MDMA es muy sensible a la reaccin con el reactivo de cloruro de oro, slo basta una parte muy pequea para obtener buenos resultados.

El ensayo del cloruro de oro es tambin til para los precursores efedrina y seudoefedrina, y puede ser til para la nicotinamida y la cafena. Se deben utilizar muestras de referencia de estas sustancias para obtener cristales de referencia. Ensayos de microcristales para ismeros pticos de la metanfetamina [H3BiI6 en H2SO4] Utilizar el procedimiento de la gota en suspensin descrito ms arriba para la anfetamina pero utilizando el reactivo de ensayo H3BiI6 en H2SO4 (vase el anexo III en relacin con la preparacin del reactivo). RESULTADOS La d-metanfetamina da agujas largas de color naranja. La dl-Metanfetamina da varillas naranjarojizas caractersticas con extremos sesgados.

Lecturas recomendadas Fulton, C.C. (1969), Modern Microcrystal Tests for Drugs, Wiley-Interscience, Nueva York no, M., Microcrystal Test, Japn, 1996 (presenta una introduccin amplia a la tcnica de los ensayos de microcristales, e incluye fotografas de resultados de ensayo de microcristales de 39 ETA y sus precursores). Ruybal, R. (1986), Microcrystalline test for MDMA, Microgram, 19 (6), pgs. 79 y 80.

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American Society of Analytical Chemistry: AOAC Official Methods of Analysis (1984), pgs. 704 a 714. Stall, W. J. (1981), The separation of methamphetamine and procaine utilizing the volatility test / hanging drop method for amphetamines, Microgram, 14 (10), pg. 148.

3.

Tcnicas instrumentales

Hay varios mtodos instrumentales directos (CG quiral, CLGR o EC) y mtodos de derivatizacin indirectos que se pueden utilizar en el anlisis de los ismeros pticos de ETA. La eleccin del mtodo depende del alcance del anlisis y la disponibilidad de equipo y otros instrumentos de laboratorio. Los mtodos directos e indirectos se deben considerar como complementarios, ya que ninguno ofrece una solucin universal para la separacin quiral. Las ventajas y desventajas de ambos criterios se deben examinar con cuidado. Los mtodos instrumentales directos permiten analizar los ismeros pticos sin derivatizacin, utilizando fases estacionarias quirales y/o aditivos quirales como tampn de corrida (EC). Los mtodos indirectos se basan en la derivatizacin del analito con un reactivo quiral para producir dos diastereoismeros diferentes con propiedades fsicas y qumicas diferentes que se pueden separar en una fase estacionaria aquiral. La eleccin del reactivo quiral depende de varios factores, como el poder de separacin, la sensibilidad, la eficiencia de la derivatizacin y sus compatibilidades con la tcnica instrumental. Los mtodos que emplean la derivatizacin quiral son normalmente menos costosos y no requieren columnas o equipo especializado. El uso de columnas aquirales normales facilita la integracin de las separaciones quirales en programas de anlisis de rutina.

i. Tcnicas de CG
La cromatografa de fase gaseosa es una tcnica probada de separacin quiral. Se puede realizar utilizando mtodos directos, empleando columnas capilares quirales, o mtodos indirectos, que logran la separacin utilizando reactivos quirales y fases estacionarias aquirales. a) Cromatografa en fase gaseosa quiral (mtodo directo de CG)

Las fases estacionarias disponibles en el comercio para la separacin de ismeros pticos por CG se producen normalmente aadiendo macromolculas de ciclodextrina a una fase estacionaria comn. La fase estacionaria quiral ms comn utilizada para los ETA es la betaciclodextrina hecha base. MTODO La preparacin (extraccin) de muestras para anlisis por CG quiral es igual a la de la CG normal (vase supra).

Condiciones de trabajo con CG Columna: Gas portador: Temperatura del horno: Volumen de inyeccin: Temperatura del inyector: Temperatura del detector: Dexcst, pelcula de 0,25 mm x 30m x 0,25 micrones, o equivalente Helio a aprox, 1,2 ml/min 120C durante 1 min, luego 1,5C/min a 175C, mantener durante 1,5 min 1 l 190 C 280 C

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Nota: Se pueden utilizar otras condiciones de trabajo con la CG, pero hay que ensayarlas para la separacin ptima de compuestos quirales. l empleo de nitrgeno como gas portador requiere tasas de flujo ms bajas (aprox. 0,8 ml/min) para la velocidad ptima, lo que da lugar a picos ms amplios.

b)

Derivatizacin quiral (mtodo de CG indirecto)

Se pueden preparar diastereoismeros de ETA utilizando diferentes reactivos como acilcloruros, alkilsulfonatos, isotiocianatos, cloroformatos. Los ms populares son el cido de Mosher [R(+)- o S(-)--metoxi-a-(trifluorometil)-cido fenilacetico], cloruro de cido de Moshers, y N-trifluoroacetil1-prolil cloruro (TPC, tambin conocido como TFAP-Cl). El cido de Mosher y el cido clorhdrico dan lugar a una derivatizacin cuantitativa de la mayora de las aminas, con excepcin de la efedrina y la seudoefedrina. Se pueden utilizar como reactivos para anlisis de CG y CLGR. Se sabe que el TPC produce de derivativos estables de casi todos los ETA, incluidas las efedrina. Se presta mejor al anlisis por CG. En el anexo VII figuran detalles de la preparacin de muestras de ETA utilizando cido de Mosher para las derivatizaciones quirales. Las condiciones de trabajo con CG para anlisis cualitativos (vase ms arriba) tambin se pueden utilizar para el anlisis de derivativos quirales.

Lecturas recomendadas Beckett, A. H. y Testa, B. (1972), Stereochemical separation and configural assignment by gasliquid chromatography of N-trifluoroacetyl-l-prolyl amides of asymmetric l-fenilisopropyl-amines, J. Chromatogr., 69, pg. 285. Cody, J. T., (1992), Determination of methamphetamine enantiomer ratios in urine by gas chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr., 580, pgs. 77 a 95. Jirovsk, D., y otros (1998), Methamphetamineproperties and analytical methods of enantiomer determination, Forensic Sci. Int., vol. 96, pgs. 61 a 70. Liu, J. H. y Ku, W. W. (1981), Determination of enantiomeric N-trifluoroacetyl-l-prolyl chloride amphetamine derivatives by capillary gas chromatography/mass spectrometry with chiral and achiral stationary phases, Anal. Chem., 53, pg. 2180. Liu, J. H., Ku, W. W., Tsay, J. T., Fitzgerald, M. P., y Kim, S. (1982), Approaches to drug sample differentiation. III: A comparative study of the use of chiral and achiral capillary column gas chromatography/mass spectrometry for the determination of methamphetamine enantiomers and possible impurities, J. Forensic Sci., 27 (1), pgs. 39 a 48. Liu, J. H., Ku, W. W. y Fitzgerald, M. P. (1983), Separation and characterization of amine drugs and their enantiomers by capillary column gas chromatographymass spectrometry, J. Assoc. Off Anal. Chem., 66, pgs. 1443. McKibben, T. (1992), Separation and Identification of Drug Enantiomers via N-TFA-(S)-Prolyl Chloride Derivatization, Journal of the Clandestine Laboratory Investigating Chemists Association, 2 (1), pgs. 21 a 20.
Esta referencia incluye la derivatizacin de enantimeros de anfetamina, metanfetaminas, efedrina, seudoefedrina, MDA, MDMA, DOB, DOM, 2,4,6-TMA, 3,4,5-TMA, propilhexedrina y PMA.

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Moshers acid, R. Kaslauskas, G. Trouth and A. Lissi (AGAL), 16 Seminario de Colonia sobre anlisis de presencia de drogas. Pastor-Navarro, M. D., Porras-Serrano, R., Herrez-Hernndez, R., Campins-Falco, P. (1998), Automated determination of amphetamine enantiomers using a two-dimensional columnswitching chromatographic system for derivatization and separation, Analyst, 123, pg. 319. Shin, H. S. y Donike, M. (1996), Stereospecific derivatization of amphetamines, phenol alkylamines, and hidroxiamines and quantification of the enantiomers by capillary GLC/MS, Anal. Chem., 68, pg. 3015. Wells, C. E. (1970), GLC determination of the optical isomers of anfetamina, J. Assoc. Off Anal. Chem., 53, pg.113.

ii. Tcnicas de CLGR

Para la CLGR se han utilizado varios criterios, incluida la derivatizacin con reactivos quirales, la incorporacin de aditivos quirales en la fase mvil, y el empleo de fases estacionarias quirales. En el comercio hay una variedad de columnas para CLGR quirales. El comportamiento de las fases estacionarias quirales se ha mejorado mucho en los ltimos aos, aunque esos anlisis siguen siendo costosos.

Lecturas recomendadas Lemr, K., Jirovsky, D. y Seveik, D. (1996), Effect of Some Parameters on Enantiomer Separation of Ephedrine, Methamphetamine and Selegiline using HPLC with -Cyclodextrin Stationary Phase, J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 19, pgs. 3173 a 3191. Makino, Y., Suzuki, A., Shirota, T. Ogawa, Shirota, O. (1999), Direct analysis of methamphetamine enantiomers in urine with strong cation exchange pre-column and bcyclodextrin-bonded semi-micro column, J. Chromatography B, 729, pgs. 97 a 101. Noggle, F. T., DeRuiter, J. y Clark, C. R. (1986), Liquid Chromatographic Determination of the Enantiomeric Composition of Methamphetamine Prepared from Ephedrine and Pseudoephedrine, Anal. Chem., 58, pgs. 1643 a 1648. Pihlainen, K. y Kostiainen, R. (2004), Effect of the Eluent on Enantiomer Separation of Controlled Drugs by Liquid Chromatography-Ultraviolet Absorbance Detection-Electrospray Ionisation Tandem Mass Spectrometry using Vancomycin and Native -Cyclodextrin Chiral Stationary Phases, J. Chromatogr. A., 1033, pgs. 91 a 99. Rizzi, A. M., Hirz, R., Cladrowa-Runge, S. y Jonsson, H. (1994), Enantiomeric Separation of Amphetamine, Methamphetamine and Ring Substituted Amphetamines by Means of a Cyclodextrin-Chiral Stationary Phase, Chromatographia, 39, pgs.131 a 137. Sadeghipour, F. y Veuthey, J. L. (1998), Enantiomeric Separation of Four Methylenedioxylated Amphetamines on -Cyclodextrin Chiral Stationary Phases, Chromatographia, 47, pgs. 285 a 290. Sellers, J. K., Duffitt, G. L., Gaines, M. L. y Liu, R. H. (1996), High Performance Liquid Chromatographic Analysis of Enantiomeric Composition of Abused Drugs, Forensic Sci. Rev., 8, pgs. 92 a 108.

iii. Tcnicas de EC
La electroforesis de zona capilar es muy ventajosa para el anlisis quiral ya que permite la separacin sumamente eficiente de enantimeros sin derivatizacin ni columnas especiales

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(capilares). Para la separacin de ETA, se utilizan normalmente aditivos quirales como tampones de corrida (como hidroxil-propil beta-ciclodextrin).

Lecturas recomendadas Iwata, Y. T., Garcia, A, Kanamori, T., Inoue, H., Kishi. T. y Lurie, I. S. (2002), The Use of Highly Sulfated Cyclodextrin for the Simultaneous Chiral Separation of Amphetamine-type Stimulants by Capillary Electrophoreis, Electrophoreis., 23, pgs 1328 a 1334. Lurie, I. S., Hays, P. A. y Parker, K. P. (2004), Capillary Electrophoreis Analysis of a Wide Variety of Seized Drugs Using the Same Capillary with Dynamic Coatings, Electrophoresis., 25, pgs. 1580 a 1591. Lurie, I. S., Klein, R. F. K., Dal Cason, T., LeBelle, M., Brenneisen y R., Weinberger, R. (1994), Chiral Resolution of Cationic Drugs of Forensic Interest by Capillary Electrophoresis with Mixtures of Neutral and Anionic Cyclodextrins, Anal. Chem., 66, pgs. 4019 a 4026. Varesio, E., Gauvrit, J. Y., Longeray, R., Lanteri, P., Veuthey, J. L. (1997), Central Composite Design in the Chiral Analysis of Amphetamines by Capillary Electrophoresis, Electrophoresis., 18, pgs. 931 a 937.

iv.

Tcnicas IR

Aunque los enantimeros tienen el mismo espectro infrarrojo, la espectroscopia IR se puede utilizar para distinguir los enantimeros de un compuesto determinado despus de convertirlos en los correspondientes diasteremeros. Los ETA, como todas las bases orgnicas, se pueden hacer reaccionar fcilmente con cidos orgnicos quirales para formar diasteremeros. Las d- y l-anfetamina, por ejemplo, se pueden acoplar con d-cido mandlico para formar dos diasteremeros, d-anfetamina-d-mandelato y lanfetamina-d-mandelato, que tiene un espectro IR diferente. MTODO Se hace bsica una solucin acuosa de sal de ETA (10-50 mg) y se extrae el ETA en cloruro de metileno. El cloruro de metileno se seca sobre sulfato de sodio anhidro y se concentra hasta aproximadamente 2 ml. Se aade una solucin saturada de d-cido mandlico en cloruro de metileno, varias gotas a la vez, hasta que la solucin de ETA se neutraliza (papel pH). Se deja cristalizar la sal de d-mandelato-ETA, la solucin se filtra por succin, y los cristales se lavan con una pequea parte de cloruro de metileno. Despus de secada, se prepara un disco de KBr con los cristales y se adquiere el espectro infrarrojo. El procedimiento se repite utilizando ismeros conocidos pticamente puros de los ETA correspondientes. RESULTADOS La identificacin de los ismeros pticos se logra comparando el espectro resultante con uno de los obtenidos a partir de los estndares de referencia puros. Las bandas de IR en la regin de 800-1600cm-1 proporciona la informacin analticamente ms diferenciada. El espectro IR de las sales de ismeros pticos de anfetamina con cido mandlico figuran en una edicin anterior de manual de las Naciones Unidas sobre Mtodos recomendados para el ensayo de anfetamina y metanfetamina (ST/NAR/9). Los datos se pueden consultar en la pgina web de la Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos.

43

Lecturas recomendadas Chappell, J.S. (1997), Infrared discrimination of enantiomerically enriched and racemic samples of methamphetamine salts, Analyst, 122, 755 a 760. Chappell, J.S. (1998), A novel infrared method for the determination of the enantiomeric composition of methamphetamine salts, Proceedings of the American Academy of Forensic Sciences, 4, 32. Heagy, J. (1970), Infrared method for distinguishing optical isomers of amphetamine, Analytical Chemistry, 42 (1970), pg. 1459.

44

VII.

OTRAS TCNICAS ANALTICAS PARA EL ANLISIS DE ETA

Hay otras tcnicas analticas adecuadas para la identificacin forense y/o la cuantitacin de ETA, entre ellas: Electroforesis capilar (EC) Cromatografa en fase gaseosa espectroscopa infrarroja transformada de Fourier (CG-FTIR) CL-EM y CG-EM Espectroscopa casi infrarroja (NIR) Espectroscopa de resonancia magntica nuclear (RMN) (cualitativa y cuantitativa) FTIR cuantitativa CCD cuantitativa Espectroscopa FTIR Raman Cromatografa en fase gaseosa-microextraccin en fase slida (CG-SPME) La descripcin de la mayora de estas tcnicas escapa al alcance del presente manual sobre mtodos recomendados para el anlisis de ETA, por lo que el analista debe remitirse a un manual complementario de carcter general sobre tcnicas analticas, sus caractersticas y sus usos prcticos para el anlisis de drogas. A continuacin se describen brevemente cuatro tcnicas cualitativas: RMN, EC, CG-SPME y CG-FTIR porque constituyen opciones especficas atractivas para el anlisis de ETA.

A. TCNICAS DE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR 1H (RMN)

La disponibilidad de un gran nmero de ismeros posicionales de ETA estructuralmente relacionados, especialmente ETA con anillo sustituido, requiere instrumentos eficaces que proporcionen la informacin estructural necesaria para su diferenciacin. La RMN permite al analista distinguir inequvocamente entre diferentes derivativos de anfetamina con anillo sustituido, aun en presencia de diluyentes y otros adulterantes. Aunque ciertas pautas de sustitucin se asemejan entre s en el rea correspondiente a los protones de la cadena lateral alkil, el espectro integrado y la pauta de las seales de protones aromticos permite distinguir unos de otros. Aunque se trata de un poderoso instrumento para la identificacin de anlogos, el costo de la espectroscopa de RMN y la experiencia tcnica necesaria impide su aplicacin en gran escala a los anlisis de rutina. MTODO Disolver unos 20 mg de la muestra de la droga en 1 ml de D2O. Si hay materiales insolubles, centrifugar; en caso contrario, transferir directamente el supernatante a un tubo de RMN. Registrar el espectro de esta solucin que contiene el ETA en forma de sal. Liberar la base libre del ETA in situ aadiendo 20-30 mg de K2CO3 slido y 0.5 ml de CDCl3 y registrar el espectro de la base libre. Comparar el espectro de la sustancia desconocida con el espectro de referencia, que se registr en un instrumento de transformacin de Fourier a 90 MHz utilizando un ngulo de 18 (1 sec) sin demora tras la adquisicin de los datos. El espectro de RMN de referencia del ETA seleccionado figura en una edicin anterior de los dos manuales de las Naciones Unidas relativos al anlisis de ETA, es decir, Mtodos recomendados para el ensayo de anfetamina y metanfetamina (ST/NAR/9) y Mtodos recomendados para el ensayo de los derivados anfetamnicos ilcitos con anillo sustituido ((ST/NAR/12). Los datos se pueden consultar tambin en la pgina web de la Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos.

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Lecturas recomendadas Dawson, B. A. (1991), The use of Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the detection and quantitation of abused drugs, en: The analysis of drugs of abuse, T. A. Gough (ed.), Wiley & Sons Ltd, pgs. 284 a 296. Lee G. S. H, Craig D. C., Kannangar G. S. K., Dawson, M., Conn C., Robertson J., Wilson M. A. (1999), Analysis of 3,4-methylenedioxy-N-methylamphetamine (MDMA) in ecstasy tablets by 13 C solid state nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, J. Forensic Sci., 44 (4), 761 a 771. Chew, S. L., y Meyers, J. A. (2003), Identification and quantitation of gamma-hidroxibutyrate (NaGHB) by nuclear magnetic resonance spectroscopy, J. Forensic Sci., 48 (2), 292. Rothchild, R. (2003), Identification of heroin diluent: one- and two-dimensional proton and carbon13 NMR studies of procaine hydrochloride: computational studies of procaine and its conjugate acid, Spectroscopy Letters, 36 (1 & 2), 35 a 42.

B.

ELECTROFORESIS CAPILAR (EC)

La EC, igual que la CLGR, no requiere pasos de derivatizacin o extraccin y, por lo tanto, es ms conveniente que la CG para el anlisis de compuestos de ETA. En contraste con la CLGR, la EC ofrece un mayor poder de resolucin para el anlisis de estos solubles, lo que confiere mayor rapidez al anlisis. El empleo de capilares revestidos dinmicamente constituye una importante mejora en la precisin, la eficiencia de los picos y/o los tiempos de separacin para los compuestos de ETA en comparacin con mtodos semejantes que utilizan capilares no revestidos. Adems, el enfoque de los capilares dinmicamente revestidos puede facilitar el anlisis quiral rpido de una muestra utilizando el mismo capilar y el mismo vial de muestra pero con una corrida de tampn diferente. En el anexo VI se incluye un mtodo de EC para la cuantitacin de ETA seleccionados y para la metodologa de diferenciacin de ismeros pticos.

Lecturas recomendadas Lurie, I. S., Hays, P. A. y Parker, K. P. (2004), Capillary Electrophoreis Analysis of a Wide Variety of Seized Drugs Using the Same Capillary with Dynamic Coatings, Electrophoresis., 25, pgs 1580 a 1591. Lurie, I. S., Bethea, M. J., McKibben, T. D., Hays, P. A., Pellegrini, P., Sahai, R., Garcia, A. G. y Weinberger R. (2001), Use of Dynamically Coated Capillaries for the Routine Analysis of Methamphetamine, Amphetamine, MDA, MDMA, MDEA and Cocaine using Capillary Electrophoresis, J. Forensic Sci., 46, pgs. 1025 a 1032. Piette, V. y Parmentier, F. (2002), Analysis of Illicit Amphetamine Seizures by Capillary Zone Electrophoreis, J. Chromatogr. A., 979, pgs. 345 a 352.

C.

CROMATOGRAFA EN FASE GASEOSA MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (CG-SPME)

La SPME (microextraccin en fase slida) es una tcnica de preparacin de muestras libres de disolventes, que se puede utilizar para anlisis de cabeza sobre soluciones o directamente sobre polvos de ETA, o que se puede utilizar para anlisis (de trazas) de soluciones acuosas que contienen ETA. La SPME se realiza normalmente con una jeringa especial con una fibra de silicio colocada en la punta del pistn de la jeringa. La fibra est revestida con una fase polimrica como las que se utilizan en las columnas capilares. Durante el muestreo, el revestimiento de fibra absorbe los compuestos de la fase gaseosa en la cabeza, o directamente 46

de la fase acuosa. Hay muchos revestimientos de fibra diferentes disponibles para el anlisis de ETA y otras sustancias. Uno de los ms utilizados es una fibra revestida de polidimetilsiloxano (PDMS).

1.

Mtodo de anlisis de cabeza

Una muestra acuosa de ETA se hace alcalina para convertir las aminas en bases libres, aumentando de esta forma su volatilidad. La muestra se puede tambin calentar para aumentar la cantidad de aminas en la fase gaseosa sobre la solucin de la muestra. La jeringa con la fibra expuesta se coloca en el espacio superior sobre la solucin y las bases libres del ETA son absorbidas en la fibra. En la situacin de equilibrio, la cantidad extrada de cada compuesto absorbido en la fibra es proporcional a su concentracin en la solucin, aunque con diferentes coeficientes de distribucin. Una vez completada la extraccin, la jeringa se transfiere al instrumento de anlisis escogido. Cuando la fibra se inserta en el punto calentado del inyector de CG, las aminas extradas son desorbidas en forma trmica. En CLGR, CEC y EC, la mezcla disolvente produce la elucin de las aminas de la fibra.

2.

Anlisis (de trazas) de muestras acuosas

La fibra se sumerge directamente en la solucin de la muestra acuosa, que se hizo alcalina a fin de liberar las bases libres de ETA. La solucin de la muestra se revuelve para aumentar el intercambio de los compuestos entre la solucin y la fibra, a fin de acelerar la extraccin. El anlisis de la muestra se realiza en la misma forma que se describi para el mtodo del anlisis de cabeza.

Lecturas recomendadas Battu, C., Marquet, P., Fauconnet, A. L., Lacassie, E. y Lachtre, G. (1998), Screening procedure for 21 amphetamine-related compounds in urine using solid-phase microextration and gas chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr. Sci., vol. 36, pgs. 1 a 7. Centini, F., Masti, A. y Barni Comparini, I. (1996), Quantitative and Qualitative analysis of MDMA, MDEA, MA and amphetamine in urine by head-space/solid phase micro-extraction (SPME) and GC-MS, Forensic Science International, vol. 83, pgs. 161 a 166. Pawliszyn, J., Solid Phase Microextraction, Wiley-VCH, Nueva York, 1997. Yashiki, M., Kojima, T., Miyazaki, T., Nagasawa, N., Iwasaki, Y. y Hara, K. (1995), Detection of amphetamines in urine using head space-solid phase microextration and chemical ionization selected ion monitoring, Forensic Science International, vol. 76, pgs. 169 a 177. Zhang, Z., Yang, M. J. y Pawliszyn, J. (1994), Solid-Phase Microextraction, Analytical Chemistry, vol. 66, No.17, pgs. 844A a 855A.

D.

CROMATOGRAFA EN FASE GASEOSA ESPECTROSCOPA INFRARROJA TRANSFORMADA DE FOURIER (CG-FTIR)

La CG-FTIR, otra tcnica compuesta, combina las ventajas de la tcnica de separacin por CG con la alta especificidad por analito de la IR. La CG-FTIR con una clula de flujo ligera no tiene limitaciones en cuanto a la corriente de gas portador, por lo que es ideal cuando se la utiliza con columnas cortas de gran calibre, que permiten anlisis eficientes y rpidos. Por ejemplo, los ETA ms comunes se pueden analizar en menos de cinco minutos. Sin embargo, como esta tcnica es ms bien insensible, hay que insertar grandes cantidades de sustancia, y el espesor de la pelcula de la fase estacionaria es fundamental para no sobrecargar la columna.

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MTODO Preparacin de muestras de ETA La preparacin de la muestra es similar a la del anlisis por CG cualitativo descrito ms arriba, pero las concentraciones del analito objetivo deben ser de 1-10 mg/ml. Condiciones de trabajo con CG Se pueden utilizar las condiciones de trabajo con CG indicadas ms arriba (por ejemplo, mtodos CG-FID or CG-EM), con las siguientes modificaciones: Columna del CG: Longitud de la columna: Espesor de la pelcula: Temperaturas de la lnea de transferencia: Resolucin espectral: RESULTADOS La identificacin se realiza comparando el tiempo de retencin y el espectro FTIR del analito con el de un estndar de referencia. Lecturas recomendadas Bergkvist, H., Eyem. J. y Lundberg, L. en: Sandra, P. (Ed), Proceedings of the Thirteenth International Symposium of Capillary Chromatography, Riva del Garda, 13 a 16 de mayo de 1991, Huertig, Heidelberg, pgs. 1160 a 1170. Duncan, W. y Soine, W. H., Identification of Amphetamine Isomers by GC/IR/MS, J. Chromatogr. Sci., 26, 1988, 521 a 526. Griffiths, P. R. y de Haseth, J. A., Fourier Transform Infrared Spectrometry, John Wiley & sons, Nueva York, 1986. Columna de calibre mayor 0,32-0,53 mm ID 3-10 m >1,0 m 300C 8 cm-1

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ANEXOS
Anexo I. Estructuras qumicas de ETA seleccionados
Cuadro 3. ANFETAMINAS SIN ANILLO SUSTITUIDO
R4 R1 N R3 R2

Nota: A menos que se indique especficamente, los nombres no se refieren a enantimeros individuales

Nombre comn Anfetamina Metanfetamina N-etilanfetamina Dimetilanfetamina N-hidroxianfetamina N-hidroximetanfetamina Catina Catinona Metcatinona Fenetillina Fenilpropilmetilamina (PPMA)

Nombre de la IUPAC 1-metil-2-feniletilamina N-metil-N-(1-metil-2-feniletil)amina N-etil-N-(1-metil-2-feniletil)amina N,N-dimetil-N-(1-metil-2-feniletil)amina N-(1-metil-2-feniletil)hidroxilamina N-metil-N-(1-metil-2-feniletil)hidroxilamina (1S,2S)-2-amino-1-fenilpropano-1-ol 2-amino-1-fenilpropano-1-ona 2-(metilamino)-1-fenilpropano-1-ona 1,3-dimetil-7-{2-[(1-metil-2-feniletil)amino] etil}-3,7dihidro-1H-purina-2,6-diona N-metil-N-(2-fenilpropil)amina

R1 H CH3 C2H5 CH3 H CH3 H H CH3 H CH3

R2 H H H CH3 OH OH H H H teofillina H

R3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

R4 H H H H H H OH =O =O H CH3

49

Cuadro 4. ANFETAMINAS SUSTITUIDAS CON METILENEDIOXI

R1 N R2 R3

R6

Nota: A menos que se indique especficamente, los nombres no se refieren a enantimeros individuales

Nombres comunes (acrnimos) 3,4-metilenedioxianfetamina (MDA, tenanfetamina) 3,4-metilenedioximetanfetamina (MDMA) 3,4-metilenedioxietilanfetamina (MDE, MDEA) 3,4-metilenedioxi-N,N-dimetilanfetamina (MDDM) N-hidroxi-3,4-metilenedioxianfetamina (Nhidroxi-MDA, N-hidroxitenanfetamina) N-hidroxi-N-metil-3,4-metilenedioxianfetamina (N-hidroxi-MDMA, FLEA) N-metil-1-(3,4-metilenedioxifenil)-2-butanamina (MBDB) 1-(3,4-metilenedioxifenil)-2-butanamina (BDB) 5-metoxi-3,4-metilenedioxianfetamina (MMDA)

Nombre IUPAC 1-(1,3-benzodioxol-5-il)propan-2-amina N-[2-(1,3-benzodioxol-5-il)-1-metiletil]-N-metilamina N-[2-(1,3-benzodioxol-5-il)-1-metiletil]-N-etilamina N-[2-(1,3-benzodioxol-5-il)-1-metiletil]-N,Ndimetilamina N-[2-(1,3-benzodioxol-5-il)-1-metiletil]hidroxilamina N-[2-(1,3-benzodioxol-5-il)-1-metiletil]-Nmetilhidroxilamina N-[1-(1,3-benzodioxol-5-ilmetil)propil]-N-metilamina 1-(1,3-benzodioxol-5-il)butan-2-amina 1-(7-metoxi-1,3-benzodioxol-5-il)propan-2-amina

R1 H CH3 C2H5 CH3 H CH3 CH3 H H

R2 H H H CH3 OH OH H H H

R3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 C2H5 C2H5 CH3

R6 H H H H H H H H OCH3

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Cuadro 5. OTRAS ANFETAMINAS CON ANILLO SUSTITUIDO

R1 R8 R3 NH

R7 R6

R5

Nota: A menos que se indique especficamente, los nombres no se refieren a enantimeros individuales Nombres comunes (acrnimos) 4-bromo-2,5-dimetoxifenetilamina (2C-B, Nexus) 4-metiltio-2,5-dimetoxifenetilamina (2C-T) 4-etiltio-2,5-dimetoxifenetilamina (2C-T-2) 4-propiltio-2,5-dimetoxifenetilamina (2CT-7) 4-cloro-2,5-dimetoxifenetilamina (2C-C) 4-yodo-2,5-dimetoxifenetilamina (2C-I) 2,4,5-trimetoxianfetamina (TMA-2) 4-metil-2,5-dimetoxianfetamina (DOM, STP) 4-bromo-2,5-dimetoxianfetamina (DOB, bromo-STP, BDMA) 4-cloro-2,5-dimetoxianfetamina (DOC) 4-yodo-2,5-dimetoxianfetamina (DOI) 4-etil-2,5-dimetoxianfetamina (DOET) Nombre de la IUPAC 2-(4-bromo-2,5-dimetoxifenil)etanamina 2-[2,5-dimetoxi-4-(metiltio)fenil]etanamina 2-[4-(etiltio)-2,5-dimetoxifenil]etanamina 2-[2,5-dimetoxi-4-(propiltio)fenil]etanamina 2-(4-cloro-2,5-dimetoxifenil)etanamina 2-(4-yodo-2,5-dimetoxifenil)etanamina 2,4,5-Anfetaminas con anillo sustituido 1-(2,4,5-trimetoxifenil)propan-2-amina 1-(2,5-dimetoxi-4-metilfenil)propan-2-amina 1-(4-bromo-2,5-dimetoxifenil)propan-2-amina 1-(4-cloro-2,5-dimetoxifenil)propan-2-amina 1-(4-yodo-2,5-dimetoxifenil)propan-2-amina 1-(4-etil-2,5-dimetoxifenil)propan-2-amina H H H H H H CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 H H H H H H OCH3 CH3 Br Cl I C2H5 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 R1 H H H H H H R3 H H H H H H R5 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 R6 H H H H H H R7 Br SCH3 SC2H5 SC3H7 Cl I R8 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 2,4,5-Fenetilaminas con anillo sustituido

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Otras pautas de sustitucin de anillos (fenetilaminas y anfetaminas) 3,4,5-trimetoxifenetilamina (mescalina) para-metoxianfetamina (PMA) para-metoximetanfetamina (PMMA) 2,5-dimetoxianfetamina (DMA) 3,4,5-trimetoxianfetamina (TMA) 4-metiltioanfetamina (4-MTA) 2-(3,4,5-trimetoxifenil)etanamina 3-(4-metoxifenil)-1-metilpropilamina N-[2-(4-metoxifenil)-1-metiletil]-N-metil- amina 1-(2,5-dimetoxifenil)propan-2-amina 1-(3,4,5-trimetoxifenil)propan-2-amina 1-[4-(metiltio)fenil]propan-2-amina H H CH3 H H H H CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H H H OCH3 H H OCH3 H H H OCH3 H OCH3 OCH3 OCH3 H OCH3 SCH3 OCH3 H H OCH3 OCH3 H

52

Anexo II. Preparacin de reactivos para ensayos cromticos y de aniones

Todos los reactivos se deben preparar de conformidad con un procedimiento establecido. Ensayo de Chen Reactivo 1: Reactivo 2: Reactivo 3: Aadir 1 ml de cido actico glacial a 100 ml de agua (= 1% (v/v) solucin de cido actico acuosa) Disolver 1 g de sulfato de cobre (II) en 100 ml de agua (= solucin acuosa (v/v) de CuSO4 al 1%) Disolver 8 g de hidrxido de sodio en 100 ml de agua (= 2N solucin acuosa de hidrxido de sodio).

Ensayo del cido glico Reactivo : Disolver 0,1 g de cido glico en 20 ml de cido sulfrico concentrado (= 0,5% (p/v) solucin)

Ensayo de Marquis Reactivo 1: Reactivo 2: Ensayo del fosfato Molibdato amnico: cido ntrico: Disolver 10 g de molibdato amnico [(NH4)6Mo7024 x 4H20] en 100 ml de agua (=solucin acuosa (p/v) de molibdato amnico al 10%) Aadir cuidadosamente 10 ml de cido ntrico a 90 ml de agua (= solucin de cido ntrico (v/v) al 10%) Aadir de 8 a 10 gotas (aproximadamente 0,25 ml) de solucin de formaldehdo al 37% a 10 ml de cido actico glacial cido sulfrico concentrado

Ensayo del nitrato de plata (tambin conocido como el ensayo del cloruro) Disolver 1,7 g de nitrato de plata en 100ml de agua (= solucin acuosa de nitrato de plata al 1,7%). Ensayo de Simon Reactivo 1: Reactivo 2: Reactivo 3: Disolver 2 g de carbonato de sodio en 100 ml de agua (= solucin acuosa de carbonato de sodio al 2%) Disolver 0,9 g de nitroprusiato de sodio en 90 ml de agua (= solucin acuosa de nitroprusiato de sodio al 1%) Mezclar 10 ml de solucin de acetaldehdo y 10 ml de etanol (= solucin etanlica de acetaldehdo (v/v) al 50%)

Ensayo del sulfato Disolver 5 g de cloruro de bario dihidrato en 100 ml de agua (= solucin acuosa de cloruro de bario aprox. al 5%). Hay tambin otros procedimientos establecidos para la preparacin de reactivos para ensayos cromticos, por ejemplo, el mtodo de Clarke, que muestra una ligera variacin en las recetas.

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Anexo III. Ensayos de microcristales

Microcristales tpicos clasificados Las formas tpicas de los microcristales se pueden clasificar en nueve grupos, empleando los trminos descriptivos que se indican a continuacin. A fin de describir todos los tipos de microcristales, se pueden aadir adjetivos como irregular, fino o cuadrangular a los trminos bsicos

Fuente: no, M., Microcrystal Test, Japn, 1996

Reactivos Reactivo de ensayo HAuCl4 en H3PO4 al 5% Disolver 1 g de cido tetracloro urico (HAuCl4.4H2O) en 20 ml de una solucin que contenga un volumen de H3PO4 concentrado y dos volmenes de agua. Reactivo de ensayo H3BiI6 in H2SO4 Disolver 1,25 g de yoduro de potasio en 2,0 ml de agua. Aadir 2,5 ml de una solucin de H2S04 diluida al 1:7 con agua, 0,5 ml de solucin de Bi(NO3)3 concentrada y 0,1 g de hipofosfito de sodio. La solucin madre de Bi(NO3)3 concentrada se prepara disolviendo 50 g de subnitrato de bismuto en 70 ml de una solucin de HNO3 (diluida al 1:1 con agua) y completada a 100 ml con agua. El reactivo de ensayo se puede mantener durante varios meses.

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Reactivo de volatilizacin Preparar una solucin acuosa de NaOH al 5%.

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Anexo IV. Mtodos de CG validados para la cuantitacin de ETA seleccionados

A continuacin se proporcionan ejemplos de mtodos de CG validados para el anlisis cuantitativo de ETA seleccionados. El mtodo B no requiere derivatizacin; el mtodo C requiere sililacin. Las soluciones estndar y muestras de ETA descritas y sus concentraciones estn diseadas para usar con columnas capilares y con los procedimientos que se describen ms abajo. El empleo de columnas y sistemas de CG alternativos puede requerir cambios tanto en la composicin relativa como en las concentraciones de componentes individuales. Equipo y reactivos Contenedores de cristal graduados de grado B o mejores. Cromatgrafo de gas con detector de llama de ionizacin. Balanza analtica capaz de pesar con una exactitud de 0,0001 g. Todos los reactivos deben ser de calidad analtica. Mtodo de calibracin de puntos mltiples sin derivatizacin

MTODO B:

El mtodo B es un mtodo validado para el anlisis cuantitativo por CG de ETA no derivatizados, especficamente los siguientes: anfetamina, metanfetamina, MDA, MDMA, MDEA y MBDB. Preparacin de la solucin estndar interna (SI): fenilbencilamina (PBA) Pesar con exactitud 0,3 a 0,4 g de PBA en una probeta graduada de 500 ml y diluir a volumen con cloroformo para obtener una solucin estndar interna de 0,6 a 0,8 mg/ml. Preparacin de soluciones estndar de ETA (soluciones de calibracin de CG) Las soluciones madre estndar deben contener todos los compuestos de inters en concentraciones de aproximadamente 1000 mg/l. Se pueden mantener en una probeta cerrada en un refrigerador hasta un ao. Para la preparacin de soluciones madre: a) b) Medir con exactitud unos 1000 mg del compuesto o los compuestos de inters en una probeta graduada de 1000 ml y completar hasta la marca con agua. Con una pipeta, transferir exactamente 5 ml de esta solucin a un tubo de ensayo de vidrio con tapa de rosca de 20 ml. Hacer bsica a tornasol aadiendo unas pocas gotas de solucin de amonaco concentrada. Aadir exactamente 5 ml de cloroformo. Tapar y batir bien, luego dejar reposar hasta que se separen las capas. Utilizando una pipeta de Pasteur, transferir aproximadamente 1 ml de la capa de cloroformo a travs de sulfato de sodio anhidro a un vial pequeo. Esta solucin estndar no se debe dejar reposar ms de media hora antes de utilizarla en la calibracin. Para la preparacin de estndares de calibracin para una calibracin de 5 puntos, preparar los diferentes niveles de la siguiente manera:

c)

d)

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Preparacin de estndares para una calibracin de 5 puntos Nivel de calibracin Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4 Nivel 5 Solucin estndar de ETA (l) 20 40 60 80 100 Solucin SI (l) 100 100 100 100 100 CHCl3 (l) 880 860 840 820 800 Concentracin aproximada de sal de ETA (mg/l) 20 40 60 80 100

Preparacin de soluciones de muestras de ETA (muestra de ETA desconocido) En general, pero especficamente para anlisis cuantitativos, homogeneizar las muestras antes de iniciar cualquier ensayo o submuestreo. a) Pesar exactamente una cantidad de muestra suficiente en una probeta graduada de 25 ml para obtener una concentracin final de aproximadamente 0,2-1 mg/ml del analito. Completar con agua hasta la marca.
Nota: La cantidad de muestra que se pese depender de la pureza anticipada en funcin del mtodo de clasificacin preliminar. Por ejemplo, si la pureza anticipada es del 40%, la cantidad de muestra debe ser aproximadamente 60 mg.

b)

Con una pipeta, transferir exactamente 5 ml de esta solucin a un tubo de ensayo de vidrio con tapa de rosca de 20 ml. Hacer base a tornasol aadiendo unas pocas gotas de solucin de amonaco concentrada. Agregar exactamente 5 ml de cloroformo. Cerrar y batir bien, y luego dejar reposar hasta que se separen las capas. Utilizando una pipeta de Pasteur, transferir aproximadamente 1 ml de esta solucin de muestra a travs de sulfato de sodio anhidro a un vial pequeo. Colocar 100 l de la solucin de muestra, 100 l de la solucin estndar interna y 800 l de cloroformo en un vial de muestra de CG. Inyectar en el cromatgrafo de gas.

c)

d)

Condiciones de trabajo con CG Para el anlisis cuantitativo, es preferible un CG equipado con un extractor de muestras automtico. Se reconoce que el empleo de instrumentos diferentes puede requerir ajustes en las condiciones de trabajo. Columna: Portador de gas: Temperatura del horno: Volumen de inyeccin: Temperatura del inyector: Detector: HP-5, 0,32mm x 30m x 0,5m Helio a aprox. 1,2 ml/min (presin de cabeza 12 psi) 100C durante 4 min, luego 10C /min a 270C, y mantener 1 minuto 1 l 190C Detector de llama de ionizacin a 270C

Tiempos de retencin aproximados Anfetamina Metanfetamina MDA 7,18 min 8,25 min 13,16 min

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MDMA MDEA MBDB Fenilbencilamina (IS) Cafena Ketamina Clculos

13,93 min 14,58 min 15,17 min 16,33 min 17,92 min 18,33 min

En los anlisis de rutina, el programa informtico realizar los clculos una vez terminado el ensayo analtico. El resultado se imprimir automticamente en un informe expresado como %w/w del analito como una base (es decir, peso del analito en relacin con el peso de la muestra). MTODO C: Mtodo de calibracin utilizando BSTFA como un reactivo de derivatizacin (calibracin de puntos mltiples o de punto nico) El mtodo C es un mtodo validado para el anlisis cuantitativo por CG de ETA derivatizados, especficamente los siguientes: efedrina, seudoefedrina, BDMA (4-bromo-2,5dimetoxianfetamina) y 2C-B El empleo del mtodo C se recomienda especficamente para muestras de ETA que contienen efedrina y/o seudoefedrina, que frecuentemente no se resuelven con otro tipo de analitos y producen picos amplios. Vase el anexo VII, que contiene detalles sobre derivatizacin. Preparacin de la solucin estndar interna (SI): fenilbencilamina (PBA) Igual que para el mtodo B, supra. Preparacin de soluciones estndar de ETA (soluciones de calibracin para CG) Para las calibracin de puntos mltiples utilizando BSTFA, preparar los diferentes niveles igual que para el mtodo B supra, de la siguiente manera: tomar 20, 40, 60, 80 y 100 l de soluciones madre estndar de ETA, para cada nivel de calibracin, aadir 100 l de la solucin estndar interna, y 50 l de BSTFA. Aadir cloroformo hasta completar 1 ml. Preparacin de soluciones de la muestra (muestra de ETA desconocido) a) Pesar con precisin la muestra en una probeta graduada de 25 ml hasta obtener una concentracin final de aproximadamente 0,2-1 mg/ml de analito. Completar con agua hasta la marca.
Nota: La cantidad de la muestra depender de la pureza anticipada en funcin del mtodo de clasificacin preliminar. Por ejemplo, si la pureza anticipada es de un 40%, la cantidad de muestra debe ser aproximadamente 60 mg.

b)

Con una pipeta, transferir exactamente 5 ml de esta solucin a un tubo de ensayo de vidrio con tapa de rosca de 20 ml. Hacer base a tornasol aadiendo unas pocas gotas de solucin de amonaco concentrada. Aadir exactamente 5 ml de cloroformo. Cerrar y batir bien, y luego dejar reposar hasta que se separen las capas. Utilizando una pipeta de Pasteur, transferir aproximadamente 1 ml de esta solucin a travs de sulfato de sodio anhidro a un vial pequeo. Colocar 100 l de la solucin de muestra, 750 l de cloroformo y 50 l de BSTFA en un vial de muestra de CG.

c)

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d)

Inyectar en el cromatgrafo de gas.

Condiciones de trabajo con CG Columna: Portador de gas: Temperatura del horno: Volumen de inyeccin: Temperatura del inyector: Detector (FID): HP-5, 0,32 mm x 30m x 0,5 m Helio a aprox. 1,2 ml/min (presin de cabeza 12 psi) 100C 4 min., luego 5C/min a 200C, luego 10C/min a 270C, y mantener 1 minuto 1 l 190 C 270C

Tiempos de retencin aproximados Seudoefedrina-TMS Efedrina-TMS Fenilbencilamina-TMS (SL) Cafena Ketamina-TMS 2C-B-TMS 14,99 min 15,16 min 23,49 min 26,22 min 26,75 min 27,91 min

Clculos En los anlisis de rutina, el programa informtico realizar los clculos una vez terminado el ensayo analtico. El resultado se imprimir automticamente en un informe expresado como %w/w del analito como una base (es decir, peso del analito en relacin con el peso de la muestra).

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Anexo V.

Mtodo CLGR para la cuantitacin de ETA seleccionados

A continuacin se examina un mtodo validado para la cuantitacin por CLGR de ETA seleccionados solubles, incluidas la anfetamina, la metanfetamina, la fentermina y la MDMA.

MTODO CLGR PARA LA CUANTITACIN DE ETA Preparacin de muestras y soluciones estndar de ETA Solucin estndar de ETA Pesar una cantidad apropiada de estndar de ETA en una probeta graduada hasta obtener una concentracin final de aproximadamente 0,50 mg/ml. Diluir a volumen con metanol. Solucin de la muestra del ETA Pesar una cantidad apropiada de muestra en una probeta graduada para obtener una concentracin final de fenetilamina aproximadamente igual a la de la solucin estndar. Diluir a volumen con metanol. Condiciones de trabajo con CLGR Columna: Temperatura de la columna: Inyeccin: Fase mvil: Longitud de onda UV: 5 m Luna C18 (Phenomenex, Torrance, CA, USA) 150 x 3,0 mm 35C 5 l 10% acetonitrilo, 90% (50 mM fosfato + 50 mM trietanolamina, pH 2,2)*; tasa de flujo 1,0 ml/min 210 nm

*El tampn se prepara disolviendo 22,5 ml de cido fosfrico concentrado en 4 l de agua de calidad para
CLGR. Aadir lentamente unos 25 ml de trietanolamina para ajustar la solucin a un pH de 2,2.

Tiempos de migracin relativos aproximados Nicotinimida Fenetilamina Fenilpropanolamina Doxilamina Procaina Efedrina Seudoefedrina Anfetamina Acetominifen metanfetamina MDA Quinina Cloroquina Dimetilanfetamina 0,28 0,55 0,56 0,56 0,62 0,64 0,65 0,82 0,93 1,00 (2,7 min) 1,00 1,04 1,09 1,12

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MDMA Cafena Lidocaina MDEA Ketamina Clorofeniramina P2P Safrol Quaifenesin Aspirina

1,18 1,48 1,50 1,55 1,95 1,99 3,17 3,50 3,61 5,09

Clculos El porcentaje de contenido de ETA de la muestra se calcula a partir del rea de pico del ETA y el rea de pico y la concentracin del estndar de ETA pertinente.

Lecturas recomendadas Malone, J. V. (1998), HPLC Quantification of Clandestinely Manufactured Mixtures of Amphetamine and Methamphetamine, Microgram, 31, pgs. 304 a 307

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Anexo VI. Mtodo de EC validado para cuantitacin de ETA seleccionados

A continuacin se explica un mtodo validado para la cuantitacin por EC de ETA seleccionados solubles, incluidas la anfetamina, la metanfetamina, MDA, MDMA y MDEA en un instrumento de EC Agilent HP3D. Hay que tener presente que algunas condiciones, como la longitud capilar, el voltaje, los tiempos de lavado y las presiones y parmetros de seccin pueden cambiar con otros fabricantes de instrumentos.

MTODO DE CAPILARES DINMICAMENTE REVESTIDOS PARA CUANTITACIN DE ETA Preparacin de muestras y soluciones estndar de ETA Disolvente de inyeccin Pesar 1034 mg de fosfato de sodio monobsico en una probeta graduada de 100 ml. Diluir a volumen con agua de calidad para CLGR (ajustar el pH a aproximadamente 2,6 utilizando cido fosfrico y aadir por goteo). Transferir el contenido a una probeta graduada de 2000 ml con ayuda de agua de calidad para CLGR. Diluir a volumen con agua de calidad para CLGR. Esta solucin final contiene 3,75 mM de fosfato, con un pH de 3,2. Alternativamente, transferir todo el contenido (con ayuda de agua de calidad para CLGR) de la botella de 250 ml de concentrado de disolvente de inyeccin (MicroSolv, Eatontown, NJ, USA) a una probeta de 5 litros. Diluir a volumen con agua de calidad para CLGR. Solucin estndar interna de ETA Pesar una cantidad apropiada de N-butilanfetamina HCl (o un estndar interno apropiado a una probeta graduada) y colocar en una probeta graduada para obtener una concentracin final de aproximadamente 1,0 mg/ml. Diluir a volumen con disolvente de inyeccin. Solucin estndar de ETA Pesar una cantidad apropiada de estndar de ETA en una probeta graduada para obtener una concentracin final de aproximadamente 0,08 mg/ml. Con una pipeta, transferir una cantidad apropiada de solucin estndar interna para obtener una concentracin final de 0,1 mg/ml. Diluir a volumen con disolvente de inyeccin. Solucin de muestra de ETA Pesar una cantidad apropiada de muestra en una probeta graduada para que la concentracin final de fenetilamina sea aproximadamente igual a la de la solucin estndar. Con una pipeta, transferir una cantidad apropiada de solucin estndar interna para obtener una concentracin final de 0,1 mg/ml. Diluir a volumen con disolvente de inyeccin.

Condiciones de trabajo para EC (aquiral) Capilaridad: Temperatura capilar: Acondicionamiento: Inyeccin: Corrida de tampn: Voltaje: Longitud de onda UV: Slica pura 32 cm (23,5 cm a la ventana del detector) por 50 m i.d. 15C 1 min 0,1N hidrxido de sodio; 1 min agua; 1 min CElixir A (MicroSolv); 2 min CElixir B, pH 2,5 (MicroSolv). 50 milibares x 2 s de muestra seguida de 35 milibares x 1 s de agua CElixir B, pH 2,5 10 kV 195 nm

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Tiempos de migracin relativa aproximados Doxilamina Clorfeniramina Quinina Beta-fenetilamina Cloroquina Nicotinimida Anfetamina Metanfetamina Procana MDA Norseudoefedrina MDMA Norefedrina Seudoefedrina Tetracana Efedrina Fenilefrina MDEA Ketamina Feniltoxilamina N-butilanfetamina (SI) Metorfn Lidocana Benzocana Acetominofn Cafena Quaifenesina P2P DMSO (marcador neutral) Aspirina 0,76 0,78 0,80 0,81 0,81 0,84 0,87 0,88 0,88 0,90 0,91 0,91 0,92 0,92 0,93 0,93 0,95 0,96 0,96 0,97 1,00 (4,6 min) 1,00 1,03 1,25 2,11 2,14 2,14 2,24 2,40 2,71

Clculos El contenido (%) del ETA desconocido se calcula a partir de su rea de pico, y el rea de pico y la concentracin del estndar de ETA, en relacin con el rea de pico del estndar interno (estndar y muestra).

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Condiciones de trabajo para EC (quiral) Capilaridad: Temperatura capilar: Acondicionamiento: Inyeccin: Voltaje: Longitud de onda UV: Slica pura 32 cm (23,5 cm a la ventana del detector) por 50 m i.d. 15C 1 min 0,1N hidrxido de sodio; 1 min agua; 1 min CElixir A (MicroSolv); 2 min CElixir B, pH 2,5 + 50 mM 2-hidroxipropil--Ciclodextrina (MicroSolv). 50 milibares x 2 s de muestra seguido de 35 milibares x 1 s de agua 20kV 195 nm (longitud de banda 10 nm)

Tiempos de migracin relativa aproximados l-norseudoefedrina d-norefedrina l-norefedrina l-seudoefedrina l-anfetamina d-efedrina d-anfetamina l-efedrina l-metanfetamina d-norseudoeferina d-metanfetamina d-seudoefedrina N-butilanfetamina* N-butilanfetamina* MDA* MDA* MDMA* MDMA* MDEA* MDEA* * d- o l-enantimero. 0,81 0,83 0,83 0,83 0,85 0,86 0,86 0,87 0,87 0,88 0,89 0,90 1,00 (3,75 min) 1,02 1,03 1,04 1,05 1,07 1,10 1,12

Lecturas recomendadas Lurie, I. S., Hays, P. A. y Parker, K. P. (2004), Capillary Electrophoresis Analysis of a Wide Variety of Seized Drugs Using the Same Capillary with Dynamic Coatings, Electrophoresis., 25, pgs. 1580 a 1591. Lurie, I. S., Bethea, M. J., McKibben, T. D., Hays, P. A., Pellegrini, P., Sahai, R., Garcia, A. G. y Weinberger R. (2001), Use of Dynamically Coated Capillaries for the Routine Analysis of Methamphetamine, Amphetamine, MDA, MDMA, MDEA and Cocaine using Capillary Electrophoresis, J. Forensic Sci., 46, pgs. 1025 a 1032.

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Anexo VII. Derivatizaciones

La derivatizacin de ETA no es obligatoria, ya que la mayora se presta a los anlisis por CG y son termoestables. No obstante, la derivatizacin de ETA (aminas primarias o secundarias) mejora sus propiedades cromatogrficas al reducir la absorcin en columnas no deseable y no especfica, as como las interferencias con la matriz. Los mtodos de derivatizacin que se recomiendan ms abajo funcionan bien para la mayora de los ETA que se encuentran con ms frecuencia; ahora bien, en raras ocasiones, algunas condiciones de la reaccin, como el tiempo o la temperatura de reaccin, deben ajustarse. Nota analtica Si se escoge la derivatizacin como mtodo de preparacin de muestras, la extraccin de la muestra se debe realizar en la forma descrita en las secciones pertinentes ms arriba. Despus de la extraccin, el disolvente debe secarse por evaporacin bajo una ligera corriente de nitrgeno a temperatura ambiente, o alternativamente a 30C. A fin de evitar prdidas del analito por evaporacin, este paso se debe realizar con mucho cuidado, especialmente para el anlisis cuantitativo de ETA. La forma ms eficiente de prevenir la evaporacin del analito es evaporar el disolvente hasta aproximadamente 1 ml y luego aadir unas pocas gotas (50 l) de un disolvente con alto punto de ebullicin (conservador de disolvente), por ejemplo, dimetilformamida. Tras aadir el conservador de disolvente, se puede continuar la evaporacin hasta que quede slo una delgada capa de disolvente. La muestra est ahora lista para la derivatizacin utilizando uno de los mtodos recomendados.

Procedimientos de derivatizacin Acetilaciones Anhdrido heptafluorobutrico (HFBA) Procedimiento A (acetilacin con anhdrido) Aadir 50 l de HFBA al residuo seco del ETA extrado en un vial de reaccin18. Tapar el vial, batir por 30 segundos e incubar durante 20 min a 75C. Evaporar el exceso de reactivo. Reconstituir el residuo seco en 50 l de acetato etlico, e insertar 1-2 l en la columna del CG. Procedimiento B (acetilacin con anhdrido en presencia de un catalizador bsico) Aadir 50 l de 0,5M hidrxido de potasio al residuo seco de ETA extrado y seguidamente 500 l de tolueno. Despus de mezclar y centrifugar, transferir la capa orgnica a un tubo de ensayo limpio, y aadir 50 l de HFBA. Mezclar cuidadosamente y en seguida aadir 500 l de bicarbonato de sodio p/v al 10% mezclando continuamente. Centrifugar el tubo de ensayo hasta que se separe la capa superior de tolueno. Inyectar 1-2 l de la capa de tolueno en la columna del CG. Anhdrido pentafluoroactico (PFAA) Aadir 50 l de PFAA al residuo seco del ETA extrado en un vial de reaccin. Tapar el vial, batir durante 30 segundos e incubar durante 20 min a 75C. Evaporar el exceso de reactivo. Reconstituir el residuo seco en 50 l de acetato etlico, e inyectar 1-2 l en la columna del CG.
18

Los viales de reaccin son viales con tapa de rosca de vidrio grueso resistente a las temperaturas, por lo general con un fondo cnico dentro del vial. Si no se dispone de viales especializados, la derivatizacin se puede hacer en cualquier tubo de ensayo revestido de Teflon con tapa de rosca.

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Anhdrido trifluoroactico (TFAA) Aadir 100 l de acetato etlico y 50 l de TFAA al residuo seco del ETA extrado en un vial de reaccin. Tapar el vial, batir durante 30 segundos e incubar durante 20 min a 60C. Evaporar el exceso de reactivo. Reconstituir el residuo seco en 50 l de acetato etlico, e inyectar 1-2 l en la columna del CG. N-metilbis-trifluoroacetamida (MBTFA) Aadir 500 l de MBTFA al residuo seco del ETA extrado en un vial de reaccin. Tapar el vial, batir durante 30 segundos e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Evaporar el exceso de reactivo. Reconstituir el residuo seco en 50 l de acetato etlico, e inyectar 1-2 l en la columna del CG. Dado que eluce temprano en el anlisis de CG, la evaporacin del exceso de reactivo puede no ser necesaria si se prev que la concentracin de analito ser suficientemente grande para la inyeccin directa de la mezcla de derivatizacin.

Lecturas recomendadas M. Doneke, J. Chromatography, 78, 273 (1973).

Sililacin N-metil-N-tert.-butil-dimetilsilil trifluoroacetamida (MTBSTFA) Aadir 100 l de acetonitrilo y 150 l de MTBSTFA al residuo seco del ETA extrado. Tapar el vial y calentar durante 15 min a 90C. Dejar la muestra a temperatura ambiente por otras 2 horas, o ms, especialmente si se han de sililizar grupos amino secundarios. Aadir 500 l de acetonitrilo, mezclar bien e inyectar 1-2 l en la columna del CG (si se prevn concentraciones bajas del analito, la muestra se puede inyectar directamente sin dilucin con acetonitrilo). Alternativamente, para evitar un pico temprano de MTBSTFA en el cromatograma de CG, combinar el residuo seco del ETA extrado con 100 l de acetonitrilo y 100 l de MTBSTFA en un vial de 3 ml. Sellar el vial y dejar reposar la mezcla durante 2 horas. Aadir 100 l de agua para hidrolizar cualquier parte de MTBSTFA que no haya reaccionado. Aadir 250 l de n-hexano, mezclar vigorosamente y centrifugar. Decantar la capa superior de hexano e inyectar 1-2 l en la columna del CG. Lecturas recomendadas R. Melgar, R. C. Kelly, J. Anal. Toxicol., 17 (nov./dec., 1993), pg. 399.

N,O-bis-[(trimetilsilil)trifluoroacetamida] (BSTFA) Aadir 50 l de BSTFA y 100 l de acetonitrilo al residuo seco del ETA extrado en un vial de reaccin. Tapar el vial, batir e incubar durante 15 min a 70 C. Inyectar 1-2 l en la columna del CG.

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Derivatizacin quiral Se puedan preparar sustratos de diastereoismero de ETA utilizando muchos reactivos diferentes, como los acilcloruros, alkilsulfonatos, isotiocianatos, cloroformatos, pero los dos que se indican a continuacin son los ms populares. 1. cido R(+)/S(-)-a-metoxi-a-(trifluorometil)-fenilactico (cido de Mosher), o cloruro de cido R(+)/S(-)-a-metoxi-a-(trifluorometil)-fenilactico (cloruro de cido de Mosher) Disolver el residuo seco de la muestra del ETA extrado en 1 ml de THF y mezclar con 0,5 ml de 0,2 M solucin de cido de Mosher en THF en un vial de reaccin revestido de Teflon con tapa de rosca. Aadir 0,5 ml de solucin de bicarbonato de sodio p/v al 10%, tapar el vial y calentar a 65C durante 1 hora. Extraer la fase acuosa con cloroformo, secar con un sulfato de magnesio y secar por evaporacin. Reconstituir el residuo en un disolvente adecuado para el anlisis por CG (por ejemplo, cloroformo; vase la seccin sobre anlisis cualitativo por CG, supra). En lugar del cido de Mosher, se puede utilizar el cloruro correspondiente. Est disponible en el comercio o se puede preparar por reflujo del cido con cloruro de tionilo. Los cloruros cidos suelen ser ms reactivos, aunque el propio cido de Mosher produce la derivatizacin cuantitativa de la mayora de las aminas, con excepcin de la efedrina y la seudoefedrina. El cido de Mosher o sus derivados se pueden utilizar como reactivos para anlisis tanto por CG como por CLGR. 2. Cloruro de N-trifluoroacetil-L-prolil (TPC, o TFAP-Cl) Disolver el residuo seco de la muestra del ETA extrado en 2 ml de cloroformo seco. Aadir 4 ml de reactivo de TPC. Revolver la mezcla, y luego aadir 40 mg de trietilamina seca. Continuar revolviendo durante 15 minutos. Lavar con 3 ml de 6 N HCl y luego con agua. Aadir MgSO4 y dejar reposar la mezcla durante 15 minutos. Inyectar 1-2 ml en la columna del CG. Se sabe que el TPC produce derivativos estables de casi todos los ETA, incluidas las efedrinas. Se presta mejor al anlisis por CG.

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