Exome RNA sequencing reveals rare and novel alternative transcripts

Objetivo
Mostrar que con la tecnica Exome RNA sequencing se pueden identificar exones de muy baja expresin.

Mtodos
Preparacin del cDNA Captura y secuenciamiento Mapeo Expresin gnica Identificacin diferencial de trasncriptos expresados Analsis de union de sitios de splicing PCR y secuenciamiento Q real time PCR

Preparacin de Libreras enriquecidas

Total RNA
SMARTer Pico PCR cDNA Synthesis kit Amplificacin

Librera

Agilent SureSelect 50Mb exome enrichment kit

Amplificacin/ secuenciamiento

Mapeo
TopHat

5 Libreras de cDNA
Bioscope

hg19 assembly version (GRCh37) of the human genome

 El RPKM (reads per kilobase per million mapped reads ) fue calculado para las regiones exnicas de cada transcripto. - Cut-off: El RPKM de las anotaciones del RefSeq fueron compardas con el background RPKM 98% ms que el background. Cufflinks Cuffcompare, se utiliz para comparar la expresin gnica diferencial.

Splice junctions

TopHat / Split seek

PCR and sequencing

Quantitative real-time PCR

RESULTADOS
Muestras de RNA:
Hgado (A) Corteza (A) Hgado (F) Corteza (F, 2)

Reproducibilidad
Se generaron (SOLID4) un promedio de 73 mill de reads mapeados por tejido.

Distribucin de la cobertura en el genoma

ExomeRNAseq >TotalRNAseq (30949 vs. 26206 transcriptos)

Pero.cuantitativamente
qRTPCR Corteza (F) expresin diferencial de 12 genes.
En 5 haba diferencias entre ExomeRNAseq y TotalRNAseq. Los restantes fueron al azar.

Splice junction
Los resultados de los dos software utilizados fueron similares. 100000 ExomeRNAseq > 44000 Poly(A) > 25000 TotalRNAseq.

Clasificacin
Exones conocidos en el mismo transcripto (Novel Junctions) Un exon conocido y el otro no (NovelExons) Dos regiones no exnicas (Novel/Novel), Transcriptos independientes (Transcript/Transcript).

Validacin Experimental

Conclusiones
Deteccin de transcriptos y variantes alternativas de splicing.
Mayor parte del genoma cubierto por exones. Variantes de 3UTRs. Las variantes de splicing de expresan a bajo nivel.

Conclusiones
No todos los transcriptos estn representados en los exome enrichment kits, y no todas las carnadas son eficientes a la hora de capturar su objetivo. La habilidad de cuantificar la expresin gnica es comparativamente menor que con las estrategias convencionales de RNA-seq.