Luminiscencia

Todo fenmeno de emisin de radiacin electromagntica desde un estado excitado

Clasificacin de fenmenos luminiscentes

Fotoluminiscencia la excitacin tiene lugar por absorcin de fotones ( Nicols Monardes 1565). Quimioluminiscencia la energa de excitacin proviene de una reaccin qumica. Bioluminiscencia Cuando la quimioluminiscencia tiene lugar en un ser vivo, Triboluminiscencia (del Griego, tribo = frotar) se produce al liberarse la energa almacenada en ciertas sustancias cristalinas, como azcar, y como consecuencia de su rotura.

Fotoluminiscencia
Para que una sustancia origine emisin fotoluminiscente es necesario que previamente tenga lugar la absorcin de radiacin electromagntica. y un electrn pasa a un nivel energtico superior

a singulete fundamental

b singulete excitado

c triplete excitado

Las transiciones desde el estado singulete fundamental hasta el estado triplete son muy poco probables; normalmente es necesario pasar a travs del estado singulete excitado.

Proceso de desactivacin
Relajacin vibracional

v2 S 2 v1 v0

Conversin interna

S1

Cruzamiento entre sistemas

..

desactivacin no radiante

E Absorcin

v2 T v1 1 v0
Fluorescencia Fosforescencia

So 2 1 3 4

v2 v1 v0

FACTORES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA

de Excitacin Tiempo de vida del estado excitado Estructura molecular: (transiciones >* y n>*
Efecto del tomo pesado. Rigidez Formacin de quelatos

Factores medioambientales
Influencia del disolvente. Influencia del pH Influencia del oxgeno disuelto Temperatura

 de Excitacin
Longitudes de onda de excitacin cortas puede provocar la ruptura de enlaces o incrementar un estado de predisociacin o de disociacin desactivndose la molcula por esa ruta

* *n * La emisin ocurre desde el estado excitado de menor energa, siendo por tanto la radiacion No Resonante

Tiempo de vida del estado excitado

La probabilidad de la transicion es medidapor la Grandes implica cortos tiempos de Vida La mayor fluorescencia se produce para cortos tiempos de vida o altos valores de * > *n (10-9-10-7 s > 10-7-10-5 s)

Estructura molecular
Fotoluminiscentes:
Capacidad de absorcin radiacin ultravioleta o visible, (transiciones >* y n>* Sustancias con dobles enlaces conjugados con alta energia de resonancia ( ej. PAHs) Anillos aromaticos que contengan heteroatomos( Tendencia a ser fosforescentes. Grupos donadores de electrones aumentan la fluorescencia - NH2 y -:H Aumentaprobabilidad de transicin S*->S0 Sustituyentesque interacionan debilmente con electrones (Alquilo-R,SO3H,-NH2 influyen poco Atomos de n Atomico elevadoen sistemas de electrones p aumentan la fosforescencia y disminuyen fluorescencia Grupos atrayentes de electrones( -COOH, -NO2, -N=N y X ) disminuyen o eliminan la fluorescencia

Rigidez
Todo lo que contribuye a establecer estructuras planas y rgidas favorecen la fluorescencia

Fluoreno
O

bifenilo

COO

COO

fluorescena

fenolftalena

Efecto Quelato
El aumento de fluorescencia de ciertos compuestos orgnicos cuando forman quelatos con iones metlicos parece ser debido a un incremento en la rigidez del sistema.

OH2

H2O

OH

Al
HO
O O

SO3Na

SO3Na

La formacin del quelato aumenta considerablemente la rigidez molecular, al impedir que la molcula gire alrededor del grupo azo

Efecto del Disolvente

Un cambio en la polaridad influye en la estabilizacin del estado excitado En la mayora de las molculas polares el estado excitado es ms polar que el estado fundamental; por ello, al aumentar la polaridad del disolvente se tiende hacia una estabilizacin del estado excitado

Estado excitado Franck-Condon

E. excitado de equilibrio Fluorescencia

Absorcin

A B C
Estado fundamental FranckCondon Estado fundamental polaridad disolvente
.

Influencia del pH
Los cambios en la emisin de los compuestos de este tipo provienen del nmero de especies resonantes diferentes que estn asociadas con las formas cidas o bsicas de las molculas Diferente valor de las Ka en el estado excitado
H H H H H N: . H
+

N (+)

H + H N

. ion anilinio anilina

Influencia del oxgeno disuelto

el oxgeno atenua la fluorescencia debido fundamentalmente a sus propiedades oxidantes y a sus caractersticas paramagnticas
el paramagnetismo del oxgeno molecular ,al igual que otros atomos paramagnticos, favorece el cruzamiento entre sistemas( lo cual conduce hasta el estado triplete), mediante colisiones con especies excitadas y por formacin transitoria de complejos de transferenciande carga

Influencia de la temperatura
Al aumentar la T debera aumentar la Intensidad de la fluorescencia E

N* No

=e

Por otra parte se produce una disminucin de la emisin fluorescente por el aumento de la frecuencia de choques lo que incrementa la probabilidad de desactivacin en forma de energa no radiante. El cambio en la fluorescencia es normalmente del 1 % al 5% por C,

Rendimiento Cuantico
Se define como la relacin entre el numero de molculas que emiten radiacin y el numero de las que son excitadas:

fluor =

n o defotonesF luor n o especiesEx citadas

fluor=0.0 a 1.0

En el rendimiento cuantico influyen todos los mecanismos de desactivacin de las molculas

fluor =

k fluor k fluor+kconvinterna+kconvextern +k predisoc +kdisociacio a +kcruceentre sistemas n

Espectros de excitacin y emision

Espectro de excitacin : (intensidad de fluorescencia observada en funcin de la longitud de onda de excitacin a una determinada longitud de onda de emisin)

ex variable y emfija

espectro de emisin
(intensidad de la emisin fluorescente en funcin de la longitud de onda de emisin, a longitud de onda de excitacin fija);

ex fifa y em variable

equipamiento
Muestra Fuente de radiacin . monocromador de excitacin
(o filtro)

Medidor o registro

Detector .

monocromador de emisin
(o filtro)

Relacin entre Ifluo y concentracin

=

If I abs

n FotonesEmitidos n FotonesAbsorbidos

Iabs=P0-P,

If=k(P0-P)= k Po(1-P/Po)

T=

P bC = 10 Po

P bC = 1 10 Po
110bC= Serie Mac Laren =1-e-2.3bC

f =k Po (1-10-bC)

Para C bajas solo se toma primer miembro del desarrollo de la serie

f=k Po.2.3 b C

Relacion If-Concentracion
K Po If
fluorescencia no uniforme

fluorescencia uniforme

C Es debido a fenmenos de : La no linealidad a concentraciones altas. 1. Autoatenuacin. ( del choque entre molculas excitadas, al aumentar la concentracin, aumentar la probabilidad de que se produzcan colisiones) 2. Autoabsorcin. la fluorescencia de una molcula es absorbida por otra molcula del mismo soluto

Aplicaciones
La metodologia practica de la Fotoluminiscencia es identica a la que se utiliza en espectrofotometria de Absorcin UV con la diferencia de una mayor sensibilidad y selectividad Anlisis Cuantitativo. 1.Determinacion directa 2.Determinacion mezclas Estudio de reacciones

Cuantitativo
Anlisis directo. ( recta calibrado, adicion Standard) Formacin de quelatos fluorescentes. Determinaciones indirectas
Incremento fluorescencia Atenuacin de la fluorescencia

Anlisis de Reacciones
Calculo de constantes de formacion. Estudio de complejos Marcaje de reactivos y seguimiento de reacciones Marcadores de Anticuerpos determinacin de antgenos

QUIMIOLUMINISCENCIA
La quimioluminiscencia se origina cuando se produce una especie excitada como consecuencia de una reaccin qumica que emite radiacin electromagntica en la zona UV .

A + B > X* X* > X + h

NH 2 .

O NH NH O + OH + O 2

NH 2 COO

+ N 2 + 2 H2 O + h COO

CH3-S-CH3 + Fluor

Productos + h

Aplicacin Quimiluminiscencia
NO + O3 NO2* + O2 NO2 + h NO2
UV 800

NO

Aplicacin quimiolum

O3 + C2H4 C2H2O SO2 + h SO2

* * 1

C2H2O
* SO2 2

C2H2O+h 1 SO2 + h

h 1 > h

Inmunoensayos basados en la medida de molculas fluorescentes

Los inmunoensayos estan basados en el empleo de anticuerpos para la determinacin de analitos, Ls anticuerpos son obtenidos a partir de un producto con estructura similar llamado hapteno e inoculado a un animal de experimentacin, se separa y purifica . A continuacin se efectua una derivatizacin con un reactivo fluorescente llamado marcador. El antigeno es atrapado por el anticuerpo al ponerse en contacto y se mide la fluorescencia del par antigenoanticuerpo Se relaciona la intensidad de fluorescencia con la concentracin del antigeno, puesto que la relacin antigeno-anticuerpo suele ser 1:1