DETERMINACIN DE PENICILINA G POR ELECTROFORESIS CAPILAR DURANTE EL PROCESO DE FERMENTACIN

Mara E. Bautista Ramrez, Yolanda Gmez y Gmez, Enrique Duran Pramo

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa, Instituto Politcnico Nacional, Mxico

Resumen

El objetivo de este trabajo fue adaptar un mtodo de electroforesis capilar para cuantificar la produccin de penicilina G, utilizando P. chrysogenum durante la fermentacin El medio de produccin utilizado consta, bsicamente, de lactosa, agua de cocimiento de maz, farmamedia y sales minerales; se aadi cido fenilactico al 0,05 %, se realizaron determinaciones de consumo de azcares (DNS), pH, biomasa (peso seco) y bioensayo en placa. Para su deteccin por electroforesis capilar, se utiliz un equipo Beckman P/ACE MDQ Capillary Electrophoresis System, utilizando un buffer de fosfatos 10 mM, pH 7,0; un capilar de slice de 50 cm y 75 M de dimetro, aplicando un voltaje de 20 kV e inyeccin hidrodinmica 0,5 psi por 5 seg, y fue detectada a 200 nm. El tiempo de migracin de la penicilina G fue a los 3,7 min en las condiciones probadas que equivalen a 900 g/mL, por lo que es factible determinar la penicilina G por electroforesis capilar, donde el lmite de deteccin fue de 6,25 g/mL. Esta metodologa presenta la ventaja de que no es necesario realizar ningn pretratamiento a la muestra, solamente diluirla, lo que representa una ventaja sobre el tratamiento que se les da a las muestras para determinarlas en otros mtodos analticos (HPLC). La electroforesis capilar ofrece una alternativa para su determinacin, considerando las ventajas que ofrece esta tcnica como son tiempos cortos de anlisis, utiliza pequeas cantidades de muestra y el uso de pequeas cantidades de buffer, que adems de ser un ahorro en reactivos, representa menor contaminacin al ambiente. Palabras clave: penicilina G, electroforesis capilar, Penicillium chrysogenum.

Abstract

The objective of this work was to adapt a method of capillary electrophoresis to quantify the production of penicillin G using P. chrysogenum during fermentation. The culture medium of production used consists basically of lactose, cooking corn water, pharmamedia and minerals salts, phenylacetic acid was added to 0,05 %, were made determinations consumption of sugars (DNS), pH, biomass (dry cell weight ) And bioassay. For its detection by capillary electrophoresis was used a equipment Beckman P/ ACE MDQ capillary electrophoresis system using a buffer of phosphate 10 mM, pH 7,0, a silica capillary 50 cm and 75 micrometer in diameter, applying a voltage of 20 kV and hydrodynamic injection 0,5 psi for 5 seconds and was detected at 200 nm. Migration time of penicillin G was 3,7 min. It was detected 900 g/mL and it is feasible to determine the Penicillin G by capillary electrophoresis where the detection limit was 6,25 g/ml. This methodology has the advantage that there is no need to make any pretreatment sample is only necessary to dilute which represents an advantage over other analytical methods (HPLC). The capillary electrophoresis offers an alternative for its determination considering the advantages of this technique are as short analysis times, use small quantities of sample and use of small amounts of buffer that represents in reduced pollution to the environment. Key words: capillary electrophoresis, penicillins, Penicillium chrysogenum.

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Introduccin

Las penicilinas constituyen uno de los grupos de antibiticos de mayor importancia y, aunque han surgido otros antimicrobianos, las penicilinas siguen siendo de los ms importantes y de mayor uso, y se siguen sintetizando nuevos derivados del ncleo penicilnico bsico. Muchos de ellos ofrecen ventajas peculiares y, por tal razn, los miembros de este grupo constituyen los frmacos ms indicados contra un gran nmero de enfermedades infecciosas /1/. Los antibiticos lactmicos son medicamentos de gran utilidad que se prescriben a menudo;

comparten una estructura comn (figura 1) y el mismo mecanismo de accin; inhiben la sntesis de la pared celular bacteriana formada por peptidoglucanos. Comprende las penicilinas G y V, que son altamente activas contra cocos grampositivos sensibles como estafilococo, estreptococo y neumococo, presentandos escasa accin sobre los gramnegativos. La penicilina G es una penicilina natural producida durante el crecimiento de ciertas cepas de Penicillum notatum o Penicillum crhysogenum en la presencia de los precursores adecuados (cido fenilactico) /2/.

Fig 1. Estructura de la penicilina G.

Existen diferentes mtodos para determinar la penicilina G, entre los cuales se incluyen, ensayos microbiolgicos, titulaciones yodomtricas y potenciomtricas o bien ensayos cromatogrficos. Tambin se han implementado mtodos por electroforesis capilar para la separacin de bencilpenicilinas y sustancias relacionadas, o para monitorear los procesos de manufactura de penicilinas semisintticas /3-5/. Debido a que la demanda de penicilina es elevada, no solo en nuestro pas sino tambin en el resto del mundo, las cepas de penicillium han sido inducidas mediante procesos de mutacin y cultivos selectivos, para que sean capaces de producir grandes cantidades de penicilina. La electroforesis se refiere a la migracin de especies elctricamente cargadas en solucin o suspensin en un electrolito cuando se les hace pasar una corriente elctrica. Los cationes migran hacia el electrodo cargado negativamente (nodo) y los aniones son atrados hacia el electrodo cargado positivamente (ctodo). Los solutos neutros no son atrados a ninguno de los electrodos.

En electroforesis capilar es importante el flujo electroosmtico que se origina por la presencia del campo elctrico en una solucin inica, cuando entra en contacto un electrolito con una superficie slida cargada como son los capilares de slice. El equipo de electroforesis capilar es relativamente sencillo y verstil (figura 2) /6/. La computadora controla la fuente de poder y la seal del detector. La muestra se introduce al capilar, generalmente por presin. La entrada y salida del capilar deben estar inmersas en el buffer que realiza la separacin. Los electrodos, que estn conectados a la fuente de poder, se encuentran en cada extremo del capilar. La corriente se establece de ctodo a nodo. Cuando los analitos migran, pasan a travs de una ventana dentro del mismo capilar y la seal se transforma para poder ser interpretada. Se pueden distinguir diferentes modalidades de electroforesis capilar, siendo las ms comunes la electroforesis capilar de zona (CZE), la cual se basa en las diferencias de movilidad debidas al tamao y a la carga de los analitos.

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Fig 2. Componentes bsicos de un equipo de electroforesis capilar.

La electrocromatografa capilar micelar (MEKC) es un mtodo de separacin altamente eficiente utilizado para el anlisis de pequeas molculas neutras, compuestos cargados con idnticas movilidades o mezclas de compuestos con carga o sin carga. El mecanismo de separacin se basa en las diferencias en equilibrios de distribucin entre una fase acuosa y una fase pseudoestacionaria micelar. Estas fases se mueven con diferentes velocidades debido a una combinacin de electroforesis y electrosmosis. En MEKC se adiciona un surfactante al sistema electrolito a una concentracin alrededor de la concentracin micelar crtica. El surfactante aninico como el SDS es el ms comnmente usado en MEKC /7/. La produccin de penicilina, como en otros procesos biotecnolgicos, est dominada por su aspecto competitivo entre los grandes laboratorios productores que realizan permanentes esfuerzos de mejoramiento en cada rea de proceso: cepa, fermentacin, separacin y cuantificacin de sus productos. El desarrollo de mejores mtodos analticos que nos permitan detectar y cuantificar concentraciones altas o bajas de nuestro metabolito de inters de forma ms rpida, sencilla y econmica

evitando el menor consumo de solventes de muestras y tiempo de anlisis es de gran inters. El objetivo de este trabajo es adaptar la tcnica de electroforesis capilar para determinar la penicilina G durante el proceso de obtencin del metabolito secundario.

Material y mtodos

Cepa
Se estudi la cepa Penicillium chrysogenum ATCC 9840 perteneciente a la coleccin nacional de cepas microbianas y cultivos celulares del Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del Instituto Politcnico Nacional, de Mxico. sta se conserv en medio PDA 4 0C.

Medios de cultivo
Se utiliz el medio de produccin formulado con lactosa 3 %, agua de cocimiento de maz 5 %, pharmamedia 1 %, fosfato monobsico y dibsico de potasio 0,3 % y cloruro de calcio 0,01 % ajustando el pH a 5,0 Todos los medios se esterilizaron a 15 lbs durante 15 min.

Inculo
Se prepar una solucin de esporas en solucin salina que contena 108 esporas/mL.

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Fermentacin lquida
Se trabaj a escala de laboratorio, inoculando el medio de produccin al 1 % con la suspensin de esporas; se incub a 28o C y a las 72 h se aadi cido fenilactico al ..% durante los 7 das que dur la fermentacin se realizaron determinaciones de pH, consumo de azcares (DNS), biomasa (peso seco) y la concentracin del antibitico se determin por medio de bioensayo en placa, y por electroforesis capilar.

electroforesis capilar Beckman Coulter P/ACE MDQ con un detector UV y un capilar de slice fundida de 50 cm de longitud y 75 mm de dimetro interno. Se utiliz un buffer de fosfatos 10 mM; pH 7,0; voltaje de 20 kV e inyeccin hidrodinmica 0,5 psi por 5 seg, y una longitud de onda de 200 nm /8/.

Resultados y discusin

Sistema de electroforesis capilar

Las determinaciones de la concentracin de penicilina se realizaron en un equipo de

En la figura 3 se muestran los resultados obtenidos de pH y biomasa, determinados durante el proceso de produccin de la penicilina G, donde el pH de la fermentacin estuvo en un intervalo de 5 a 6, favorable para el crecimiento del microorganismo y la produccin del antibitico.

Fig 3. Determinacin del pH y la biomasa por peso seco a lo largo de la fermentacin.

En la figura 4 se muestran los resultados obtenidos de consumo de azcares determinados durante el proceso de produccin de penicilina G.

Fig 4. Determinacin del consumo de azcares a lo largo de la fermentacin.

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En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos de las reas y tiempo de migracin de la curva estndar de penicilina G, en donde se obtuvo un coeficiente de correlacin de 0,99, y

en la figura 5 se muestra el electroferograma obtenido de las diferentes diluciones de penicilina G, donde el tiempo de deteccin fue a los 3,7 min.

TABLA 1. CURVA ESTANDARD DE PENICILINA G

Fig 5. Electroferograma obtenido de las diferentes diliuciones realizadas de penicilina G.

En la figura 6 se muestra el electroferograma obtenido al analizar las muestras de la fermentacin; el tiempo de migracin cambia un

poco debido a la influencia del medio de fermentacin, ya que a la muestra no se le realiz ningn pretratamiento.

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Fig 6. Deteccin del estndar de penicilina G (negro) y de dos de las muestras de la fermentacin (azul y rosa).

Conclusiones
Se estableci la metodologa adecuada para la deteccin de penicilina G por electroforesis capilar, con la que se pudo detectar la produccin de penicilina G en el medio de cultivo, la cual fue de 900 microgramos/mL, y se detect a los 3,7 min en las condiciones de electroforesis probadas. Del anlisis de linealidad se obtuvo un coeficiente de correlacin de 0,99. La electroforesis capilar permite cuantificar la produccin de penicilina G directamente de las muestras de fermentacin, sin realizar ningn pretratamiento. Esta tcnica muestra grandes ventajas con respecto al HPLC como es la utilizacin de menores cantidades de solventes, lo que representa un ahorro en economa y proteccin al medio ambiente

Bibliografia
1. Goodman and Gilman: Las bases farmacolgicas de la teraputica.11ava. edicin, Mc Graw Hill,Mxico 2008. 2. Vandamme E.J: Biotechnology of industrial antibiotics Marcel Dekker Publishing, Co. New York, EUA, 1984. 3. Genowefa P., Katarzyna M., Stefan T. Application of Capillary Electrophoresis to the Determination of Various Benzylpenicillis Salts. Journal of Cromatography A,1032(2004) 265-272. 4. Genowefa P., Katarzyna M., Stefan T. Analysis of Phenoxymethylpenicillin Potassium by Capillary Electrophoresis. Journal of Cromatography A , 1087(2005)197-202. 5. Genowefa P., Stefan T. Adaptation of Capillary Electrophoresis to the Determination of Selected Cephalosporins for Injection. Journal of Cromatography A, 895(2000) 27-31. 6. P. Muijselaar, Micellar electrokinetic chromatography. Fundamentals and applications, NWO, Holanda,1996. 7. V.A. Robinson , Ciencia Nicolaita 37(2004)61. 8. Gotti R., Calleri E., Massolini G., Furlaetto S., Cavrini V. Penicillin G Acylase as Chiral Selector in CE Using a Pullulan-Coated Capillary. Electrophoresis 2006,27,4746-4754.

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