Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa

Captulo 4 Txicos Voltiles y Gaseosos

Autores: Dra. Leda Giannuzzi Profesora Adjunta de la Ctedra de Toxicologa y Qumica Legal de la UNLP. Dra. Mabel Tomas Jefe de Trabajos Prcticos de la Ctedra de Toxicologa y Qumica Legal de la UNLP. Dr. Luis A. Ferrari Perito Qumico Judicial. Profesor de Toxicologa en la Universidad de Morn

Introduccin
Se clasifican como txicos voltiles y gaseosos a todas las sustancias que independientemente de su estado fsico, puedan separarse de la matriz que los contienen por destilacin simple, destilacin por arrastre con vapor, microdifusin y cromatografa gaseosa empleando head-space. En forma general podramos decir que las vas de entrada de estos txicos al organismo es la digestiva y la pulmonar, siendo tambin importante la va cutnea para las sustancias ms lipoflicas. Entre los txicos gaseosos ms relevantes encontramos: monxido de carbono, cido cianhdrico, cido sulfhdrico, arsina, estibidina, cloro, xidos de nitrgeno, bromo, ozono, amonaco, fosfina, entre otros. Entre los txicos voltiles ms importantes encontramos: cido actico, cetonas, aldehdos, benceno, fenol, alcoholes primarios (etanol, metanol), glicoles, nitro y dinitrobenceno, ter, cloroformo, tetracloruro de carbono, fsforo, plaguicidas organoclorados, carbamatos, organofosforados, piridina, etc. La mayora de los compuestos provocan intoxicacin aguda y muerte rpida, por ello, las investigaciones toxicolgicas se realizan en sangre y en muestras obtenidas del tracto gastrointestinal o respiratorio donde se encuentran estos txicos en grandes cantidades. En el presente captulo se presentan diversos protocolos de anlisis de los txicos gaseosos y voltiles que con mayor frecuencia se presentan en un laboratorio de toxicologa.

Txicos gaseosos
Los txicos gaseosos son venenos presentes en el aire que generalmente se encuentran en estado gaseoso y alcanzan el cuerpo por inhalacin. Un adulto inhala una masa de 15 kg de aire por da y simultneamente expone una gran superficie de su cuerpo a xenobiticos. Los efectos txicos pueden desarrollarse muy rpidamente ya sea en forma sistmica (cido clorhdrico, sulfuro de hidrgeno) o localmente en el tracto respiratorio (cloro o dixido de azufre). Por otro lado, la exposicin crnica a cloro, dixido de azufre, dixido de nitrgeno y ozono en pequeos niveles encontrados en el aire ambiental puede afectar la funcin pulmonar. Altas concentraciones de gases txicos como monxido de carbono y cianhdrico se encuentran en situaciones de desastre qumico debido a fuegos o explosionesy rpidamente pueden causar la muerte a las personas que toman contacto con ellos. La exposicin a gases txicos ya sea en la industria o en aire urbano ha sido objeto de regulaciones. As la American Conference of Governmental Industrial Hygienist (ACGIH, 1996) regula la exposicin en el ambiente de trabajo. Ha establecido el llamado TLV-TWA (Threshold Limit Values-Time Weighted Average) para cada txico siendo la concentracin media de sustancia qumica en el aire ambiental tras una exposicin repetida de 8 horas al da, durante 5 das de la semana, durante toda una vida profesional y que no producen efectos nocivos en la mayora de los trabajadores. Tambin se encuentra el valor de STEL (Short Time Exposicin Level) referido a la concentracin mxima a la cual un individuo puede estar expuesto durante un perodo continuo y hasta 15 minutos, sin sufrir efectos adversos, siempre y cuando no reproduzcan mas de cuatro de estas situaciones por da y estando separadas como mnimo en 60 minutos. Otros valores de exposicin desarrollados y peridicamente revisados son el RELs
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa (Recommended Exposure Limits) publicados por National Institute of Occupational Safety and Health (NIOSH, 1994). Tambin el Occupational Safety and Health Administration (OSHA, 1993) recomienda niveles de exposicin dados por (PELs Permisible Exposure Limits como valores lmite de exposicin permitido). Estos lmites y los valores alemanes MAK (Maximun Concentration in the Workplace) son comparables a los valores TLV-TWA. Estas concentraciones son dadas en ppm, (ml/m3) o (mg/m3) a 20C y presin de 1013 hPa.

Investigacin de monxido de carbono en medios biolgicos

1. Caractersticas generales y mecanismo de accin
El monxido de carbono es un gas incoloro, inodoro, inspido y no irritante que se origina durante la combustin incompleta del carbn o derivados combustibles con carbono. Las fuentes productoras ms frecuentes son braseros, estufas, calefones, hornos, incineradores, plsticos y automviles en mal estado de funcionamiento. La toxicidad del monxido de carbono (CO) se debe a su combinacin con la hemoglobina para formar carboxihemoglobina (COHb). En dicha forma la hemoglobina no libera oxgeno, dado que ambos gases (O2 y CO) reaccionan con el grupo hemo en la molcula tetramrica de la hemoglobina. Sin embargo, la afinidad del monxido de carbono por la hemoglobina es cerca de 240 veces mayor que por el oxgeno, de esta manera, la intoxicacin puede ocurrir an cuando pequeas cantidades de CO se encuentren presentes en la atmsfera. En el caso de personas intoxicadas, cuando el paciente es removido del ambiente contaminado, la carboxihemoglobina desaparece rpidamente, particularmente cuando se administrada oxgeno al 100 %. Slo trazas pueden ser detectadas cuando el paciente alcanza el hospital y de esta manera la determinacin de carboxihemoglobina es raramente justificada en la clnica toxicolgica. Sin embargo, no deja de ser til la investigacin de la metahemoglobina sobre todo cuando se han inhalado sustancias oxidantes (xidos del nitrgeno, por ejemplo).

CO

+ Hb.Fe.O2 <=======> Hb.Fe.CO

O2

La formacin de oxihemoglobina (Hb.Fe.O2) como de carboxihemoglobina (Hb.Fe.CO) son reacciones reversibles y dependen principalmente de la presin parcial de los gases respirados y del pH sanguneo, aunque otros factores como la temperatura y la concentracin inica tienen tambin incidencia. La toxicidad del CO se manifiesta no slo en la interferencia en el aporte de oxgeno por la sangre sino tambin ejerce efecto directo al unirse a los citocromos celulares como los presentes en las enzimas respiratorias y la mioglobina.

2. Consideraciones generales en la analtica toxicolgica

En casos de sujetos muertos debido a intoxicacin con CO, el aspecto del cadver y el color carminado de las vsceras constituyen manifestaciones propias de la intoxicacin aguda. Dicho color resulta visible en los rganos como el cerebro, corazn, pulmones y la musculatura voluntaria. En los casos en que el sujeto est vivo, la sangre deber extraerse, a lo sumo hasta dos horas despus de la exposicin, puesto que gran parte del monxido resulta eliminado por va pulmonar. Para casos mortales, la muestra de sangre deber extraerse lo ms rpido posible antes que se inicien los procesos putrefactivos. Se ha demostrado que el monxido de carbono no se absorbe post-mortem constituyendo su determinacin un ndice del contenido en el momento de la muerte. La carboxihemoglobina es un derivado muy estable y su presencia en sangre puede demostrarse despus de la descomposicin cadavrica as como en cadveres sometidos a altas temperaturas. El color carminado tpico de la carboxihemoglobina se observa en muestras de sangre cuando el porcentaje de saturacin es del 30% o superior, distinguindose fcilmente de la oxihemoglobina o de la hemoglobina misma. 3. Toma de muestra La recoleccin de la muestra de sangre debe ser obtenida por puncin venosa con anticoagulante (heparina) evitando la formacin de burbujas o la entrada de aire a la jeringa. Se recomienda obtener sangre del corazn o de las venas gruesas como la femoral. El recipiente
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa a utilizar para la conservacin de la muestra debe estar escrupulosamente limpio, seco y cerrado en forma hermtica.

4. Determinacin analtica de carboxihemoglobina

La determinacin cuantitativa de la carboxihemoglogina en sangre puede realizarse por mtodos espectroscpicos que se basan en los diferentes espectros de absorcin que presentan la carboxihemoglobina respecto de la hemoglobina. En todos ellos se realizan medidas de absorcin a distintas longitudes de onda de diluciones adecuadas de la sangre en estudio. Estas longitudes de onda corresponden a los mximos, mnimos o puntos isosbsticos de absorcin de cada una de las especies de hemoglobina que coexisten en la muestra. Otra propiedad que es utilizada por estos mtodos es la gran estabilidad que presenta la carboxihemoglobina respecto de la oxihemoglobina frente a reactivos reductores o metahemoglobinizantes. A ojo desnudo, la sangre con alto contenido de carboxihemoglobina presenta un marcado tono carmn, mientras que la sangre con alto contenido de metahemoglobina es chocolate. Se describen a continuacin ensayos de tipo cualitativos que presentan carcter prctico para su identificacin. a ) Ensayo de dilucin: consiste en preparar soluciones sanguneas al 1% en agua destilada de muestra a analizar y de sangre normal. Se observa simultneamente ambos tubos de ensayo con luz natural difusa. La sangre normal presenta color rojo amarillento, mientras la muestra, si contiene carboxihemoglobina, presenta color carminado neto. Este ensayo es seguro y prctico. b) Ensayo alcalino: se basa en la mayor estabilidad de la carboxihemoglobina con respecto a la hemoglobina en similares condiciones alcalinas. En un tubo de ensayo colocar 3 a 4 gotas de la sangre a analizar y en otro tubo similar colocar igual nmero de gotas de sangre normal, agregar 15 ml de agua destilada y mezclar bien. Agregar a cada tubo 5 gotas de solucin de hidrxido de sodio al 10% y mezclar bien. La sangre normal adquiere color castao a castao verdoso (hematina alcalina), mientras que la sangre oxicarbonada permanece inalterada (color carminado durante cierto tiempo). El ensayo ofrece un neto contraste y resulta positivo cuando la concentracin de carboxihemoglobina es superior al 10%. La sangre fetal interfiere en este ensayo dado que esta ltima produce una transformacin retardada frente al hidrxido de sodio. A continuacin se describen diferentes mtodos para la cuantificacin de carboxihemoglobina en sangre: espectrofotomtrico, qumico e infra rojo.

5. Determinacin cuantitativa de la carboxihemoglobina por el mtodo espectrofotomtrico

Algunos mtodos espectrofotomtricos emplean el sistema oxihemoglobinacarboxihemoglobina. El siguiente mtodo se basa en que la sangre normal contiene varias formas de hemoglobina (la forma reducida, la forma oxidada, y pequea cantidades de metahemoglobina), y si un agente reductor como el ditionito de sodio es agregado a la sangre, la forma oxigenada y la metahemoglobina son cuantitativamente convertidas a la forma reducida que presenta un espectro como se presenta en la Fig.4.1. Debe recordarse que en caso de que la persona haya estado expuesta a sustancias metahemoglobinizantes esta determinacin es poco recomendada. El monxido de carbono presenta mayor afinidad por la hemoglobina que el oxgeno mientras que la carboxihemoglobina no es reducida por el ditionito de sodio. As, la carboxihemoglobina permanece sin modificarse como se muestra en la curva A del espectro en la Fig.1 an cuando se ha realizado un tratamiento con ditionito de sodio.
En la Fig.1 se observa que la mxima diferencia de absorbancia para los espectros de carboxihemoglobina (A) y hemoglobina reducida (B) se presenta a 540 nm, mientras que 579 nm presenta la misma absorbancia (punto isosbstico). Fig. 4.1: Espectros de absorcin de (A) carboxihemoglobina, (B) hemoglobina reducida y (C) muestra de sangre de paciente intoxicado con monxido de carbono. 3

Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa El porcentaje de saturacin de monxido de carbono en una muestra de sangre puede calcularse de la medida de la absorbancia a esa longitud de onda de la muestra saturada con monxido de carbono (A), la muestra libre de monxido de carbono (B) y la muestra sin tratar (C) luego de la reduccin con ditionito de sodio. Reactivos Solucin 0,1% de hidrxido de amonio.

Equipo
Espectrofotmetro UV visible

Procedimiento
Diluir 0,2 ml de la muestra de sangre homogenizada con 25 ml de solucin 0,1% de hidrxido de amonio y dividir la solucin resultante en tres parte iguales A, B, y C. Saturar la solucin A con monxido de carbono mediante el burbujeo de gas a una velocidad que minimice la formacin de espuma. Unos pocos minutos de burbujeo resultan suficientes. Por otra parte, la solucin B se trata con oxgeno puro durante 10 minutos a los efectos de desplazar completamente el monxido de carbono unido a la muestra. Agregar una pequea cantidad de ditionito a cada una de las soluciones A, B y C y tambin a 10 ml de la solucin de amonio 0,1% y mezclar bien. Medir la absorbancia de cada solucin a 540 y a 579 nm para cada solucin A, B, y C. Se calcula la relacin de absorbancias a 540 a 579 para cada solucin. El porcentaje de saturacin de carboxihemoglobina se calcula por la siguiente frmula

%saturacin

( A 540 /A 579 ) C - (A 540 /A 579 ) B 100 ( A 540 / A 579 ) A ( A 540 A 579 ) B

Los valores normales aproximados para la relacin de absorbancia son: carboxihemoglobina saturada 1,5% y hemoglobina reducida 1,1%. Considerando que el contenido de hemoglobina en sangre puede variar, el volumen de diluyente tambin debe ser modificado. La dilucin que arroje un valor mximo de absorbancia cercano a 1 es la ideal.

6. Determinacin cuantitativa de carboxihemoglobina mediante separacin fsica de la carboxihemoglobina de otras hemoglobinas

El mtodo se basa en la alta resistencia relativa de HbCO al calor mientras que las otras formas de hemoglobina sufren coagulacin. Esta tcnica es simple de realizar y permite ser aplicada con resultados reproducibles si se mantienen estrictamente las condiciones indicadas: calentamiento a 55 0,5C durante 5 minutos y pH 5,05 0,05. Reactivos 1. Buffer acetato. Mezclar 1 volumen de solucin 1 (300 ml de cido actico glacial en 1 litro de agua destilada) mas 3 volmenes de solucin 2 (408 gr de acetato de sodio trihidratado disuelto en 1 litro de agua). El pH no debe variar de 5,05 0,05. 2. Antiespumante. Mezclar el antiespumante con agua al 1% y se agita vigorosamente con algunas perlas de vidrio.

Equipos
Bao termosttico de agua a 55 0,05C Centrfuga a 5000 rpm. Capacidad 4 o ms tubos de 10-15 ml. Especrofotmetro UV- visible.

Procedimiento
1) 5 ml de sangre a analizar previamente homogenizada se mezclan con 15 ml de agua destilada y 1 ml de antiespumante por inversin. La mitad de esta solucin es separada en un tubo, rotulada y guardada en oscuridad. La otra mitad es saturada con CO durante 30 minutos asegurndose que el volumen de la solucin sangunea no cambie. 2) De las soluciones, aquella sin tratar y la tratada con CO se toma dos alcuotas de 1,0 ml son ubicadas en 4 tubos de centrfuga conteniendo 4,0 ml de buffer acetato. 3) Despus de mezclar por inmersin dos veces cada tubo, los tubos se ubican en un bao termosttico de agua a 55,0 0,5C exactamente por 5 minutos. 4) Luego los tubos se enfran en agua fra durante otros 5 minutos y centrifugados a 5000 rpm durante 5 minutos.
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 5) 2,0 ml de cada uno de los cuatro sobrenadantes se diluyen con 10,0 ml de agua destilada y se mezclan 2 o 3 veces por inmersin en el tubo. 6) Para la lectura se requieren tres cubetas: la cubeta 1 (blanco) emplea agua destilada, la cubeta 2 es llenada con la solucin de sangre sin tratar y la cubeta 3 con solucin de sangre saturada con CO. La absorbancia de las dos soluciones se leen contra agua a 570 mn y 630 nm. Luego de la lectura, la cubeta 2 es vaciada y llenada con el duplicado de la solucin de sangre sin tratar. La cubeta 3 tambin luego de la lectura es vaciada y llenada con el duplicado de la solucin de sangre saturada con CO. Se repite la lectura a 570 y 630 nm. Los clculos se realizan mediante la siguiente relacin

%COHb

( A 570 /A 630 ) solucion sin tratar 100 ( A 570 / A 630 ) sulucionconCO

7) Los valores duplicados no deben variar mas de 2 a 3 % de saturacin de COHb con valores de saturacin de COHb menores a 20%, dos tipos de dificultades pueden presentarse: primero, la lectura en el espectrofotmetro de muestra sin tratar es baja e incierta. Segundo, la coprecipitacin de COHb con el precipitado de los derivados de hemoglobina puede ser un factor importante que tiende a disminuir la cantidad residual de COHb en el sobrenadante. El mtodo arroja resultados reproducibles cuando la saturacin de COHb es superior al 20%. Asimismo, el mtodo es moderadamente sensible a los cambios que ocurren en la sangre luego del proceso postmortem.

7. Determinacin cuantitativa de carboxihemoglobina por el mtodo de Cromatografa gaseosa (CG)

La cromatografa gaseosa (CG) se considera una metodologa universal para la determinacin de compuestos con una presin de vapor lo suficientemente alta, por lo que en general se considera adecuada para txicos voltiles y gaseosos. Sin embargo, la determinacin de monxdo de carbono por CG presenta diversos inconvenientes que es necesario tomar en cuenta en el momento de optar o no por la utilizacin de esta metodologa. Por un lado la elevada presin de vapor del monxido de carbono requiere de columnas y/o de programas que sean capaces de separar al analito de los gases utilizados como carrier, generalmente helio o nitrgeno, de otros gases que pudiesen coexistir con el monxido de carbono como el dixido de carbono. Este inconveniente se subsana utilizando columnas capilares y programas de corrida cromatogrfica que trabajan comenzando a temperaturas subambiente, tpicamente a -20C. Los equipos requeridos para estas condiciones cromatogrficas son muy poco frecuentes en laboratorios de toxicologa. Por otro lado, la deteccin de la seal del monxido de carbono a la salida de la columna CG se realiza mediante dos metodologas posibles. Una forma es la utilizacin de una post columna con un catalizador y condiciones de hidrogenacin adecuadas para transformar al monxido de carbono cuantitativamente en metano, luego de lo cual se mide con un detector comn inico de llama (FID). La otra forma es la utilizacin de un detector de conductividad trmica. Ni el detector de conductividad trmica, ni el catalizador post columna son elementos comunes en un laboratorio dedicado a la toxicologa. Finalmente, se ha informado que la cromatografa gaseosa de monxido de carbono tiene una adecuada respuesta seal vs concentracin slo para niveles de monxido por encima del 20% en sangre, de manera que no es adecuado para medidas en individuos con intoxicaciones subclnicas o para comparar individuos con niveles normales de CO en sangre.

8. Determinacin cuantitativa de carboxihemoglobina por el mtodo de Espectrofotometra Infrarroja

En la determinacin de monxido de carbono en sangre y aire espirado, la espectrofotometra infrarroja confiere adecuada especificidad, condicin que no presentan otros recursos analticos depurados tales como cromatografa gaseosa. El procedimiento comienza con una extraccin de los gases totales fsicamente disueltos o combinados con la hemoglobina. El monxido de carbono presenta al infrarrojo dos picos de absorcin a 2120 y 2170 cm-1 (4,6-4,7 m) y no presenta otra absorcin en el rango comprendido entre 700-4000 cm-1. Los gases que absorben en esta regin del espectro y que por lo tanto interfieren, son el diazometano, cloruro de nitrosilo y propano que muy difcilmente pueden hallarse en muestras de
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa sangre. El dixido de carbono puede mostrar interferencias cuantitativas por su elevada concentracin relativa an si su absorcin mxima difiere de la del monxido de carbono. Estas interferencias quedan excluidas con la adopcin de sistemas de compensacin o filtros adecuados. Los equipos permiten determinar monxido de carbono en un rango de 0 a 1000 ppm. En el anlisis de sangre, la espectrofotometra infrarroja utiliza un volumen total de 1 a 5 ml. El mismo se trata con ferrricianuro cido y los gases liberados se analizan en el espectrofotmetro infrarrojo. Para establecer el porcentaje de saturacin o el coeficiente de intoxicacin debe saturarse otra fraccin de la muestra con monxido de carbono y analizarse en la misma forma, efectuando la pertinente correccin por el monxido de carbono fsicamente disuelto. Con adecuadas modificaciones, la espectrofotometra infrarroja posibilita el registro continuo de monxido de carbono en aire (detectores o registradores continuos). Por otra parte, los ensayos en aire espirado permitieron revelar su presencia en forma inmediata as como despus de 30 minutos de haber fumado un cigarrillo.

9. Determinacin de monxido de carbono por cooximetra

De todos los mtodos que se disponen hoy da para la determinacin de monxido de carbono, el mtodo instrumental co-oximtrico es el de mayor uso en laboratorios toxicolgicos clnicos y forenses. Ello resulta comprensible dada la facilidad de operacin del instrumental que, prcticamente requiere de personal no muy entrenado para su manejo, poca muestra sangunea (alrededor de 0.1 mililitros) y resultados rpidos. La muestra es tomada de sangre arterial o grandes vasos, con anticoagulante (heparina o EDTA), luego hemolizada con una solucin surfactante y posteriormente introducida en el instrumental por aspiracin. Los equipos actuales poseen una lmpara de ctodo hueco de Talio/Nen que emite luz a la longitud de onda conveniente. Generalmente son aisladas seis lneas espectrales en el rango de 530 nm a 670 nm, utilizando filtros de interferencia. El haz luminoso emerge del aislador reflectivo como onda partida donde un haz se dirige al detector de referencia y el otro en el detector de la muestra. Dado que el sistema trabaja con seis longitudes de onda, se obtendrn seis registros de blanco y seis registros de muestra. En la figura puede observarse los espectros de absorcin al UV de la hemoglobina reducida (HHb), oxihemoglobina (O2Hb methahemoglobina (MetHb), carboxihemoglobina (COHb) y sulfohemoglobina (SHb). Estos tipos de hemoglobinas son analizadas e informadas por el instrumental, al igual que otros parmetros, como la hemoglobina total y el contenido de oxgeno. Interpretacin y factores de error en los resultados: Existen circunstancias propias de las muestras o del contexto de la intoxicacin, que deben ser tenidos en cuenta a la hora de interpretar el resultado final. Lee et al. (2003), han comprobado que la putrefaccin de las muestras sanguneas procedentes de casos postmortem poseen bajos niveles de hemoglobina total (tHb) y muy alta turbidz debida a la presencia de aceites y otros desechos de tejidos biolgicos. Esto provoca errores en las medidas producidas por el cooximetro. Asimismo, la metahemoglobina (en concentarciones superiores al 10%) y la sulfohemoglobina generada por accin bacteriana constituyen factores de perturbacin de los resultados analticos. Generalmente las muestras con tHb mayor a 3-4 g/dl son aptas para el ensayo de carboxihemoglobina. Algunos autores han propuesto se efecte un tratamiento previo de la muestra hemtica sometindola a evaporacin en centrfuga y/o uso de agregados estndar de carboxihemoglobina, para mejorar la precisin del anlisis.
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa En cuanto al contexto de la intoxicacin. Hemos observado que en muestras sanguneas conteniendo significativa concentracin de cido cianhdrico, provenientes de incendios de materiales plsticos de tipo poliuretano, el tenor de metahemoglobina no posee correlacin con la concentracin de hemoglobina total y con las concentraciones de HCN y CO.

10. Determinacin de monoxido de carbono en sangre por mtodos qumicos

Los mtodos qumicos emplean la propiedad del monxido de carbono de reducir diversas sales metlicas. Uno de los elementos metlicos de mayor aceptacin es el paladio (II). La capacidad reductora del monxido de carbono se observa en la siguiente ecuacin:

Pd+2 + CO + H2O

Pd + CO2 + 2H+

Este principio se emplea de diversas formas, una de ellas es el mtodo de Gettler y Freimuth y mediante la microdifusin en cmaras de Conway. 10.1. Mtodo de Gettler y Freimuth El monxido de carbono liberado de la carboxihemoglobina por el ferrocianuro de potasio es arrastrado por aireacin y pasado a travs de un disco de papel embebido con Cl2Pd. El CO produce una mancha oscura sobre el papel de filtro debido a la reaccin del paladio que se reduce a Pdo. Por comparacin de la intensidad de la mancha con muestras patrones, se puede obtener una concentracin aproximada a la cantidad de CO presente en la muestra. Tcnica a) Reactivos. Solucin de cloruro de paladio (0,5 g de cloruro de paladio, 0,5 ml de cido clorhdrico concentrado que se llevan a 50 ml con agua destilada). Solucin de ferricianuro de potasio-saponina: ferricianuro de potasio 32 g, saponina 0,8 g , agua bidestilada c.s.p 100 ml. Solucin de cido lctico (D:1,20) y llevar a 100 ml. Solucin de acetato de plomo al 10%. Alcohol caprlico. Solucin de cloruro cuproso amoniacal. b) Procedimiento. El dispositivo se presenta en la Figura 4.2. El tubo A contiene 5 ml de solucin de cloruro cuproso amoniacal para retener el monxido de carbono del aire e interferencias del medio del laboratorio. El tubo B contiene 2,0 ml de sangre, se aaden 4 ml de ferricianuro-saponina y 2 ml de solucin de cido lctico junto con 2 gotas de alcohol caprlico. El tubo C contiene perlas de vidrio en cantidad que alcancen 4 cm de altura y 5 ml de acetato de plomo. Entre los discos del flange se coloca un disco de papel de filtro Whatman N3 cortado en forma circular humectado con la solucin de cloruro de paladio y sujetado en forma segura mediante una pinza metlica para lograr el cierre hermtico. Se hace burbujear aire a travs del dispositivo A aflojando la llave del frasco de Mariotte. La velocidad de flujo del aire debe ser de 26 ml/minuto. Despus de 15 minutos, se detiene el burbujeo y se retira el papel reactivo, se lava con agua destilada para eliminar el exceso de solucin de cloruro de paladio y la mancha obtenida. Finalmente se compara con la escala obtenindose el grado de saturacin de la sangre con respecto al monxido de carbono. La preparacin de la escala se realiza saturando 10 ml de sangre oxalatada con un contenido de carboxihemoglobina de 80%-90% con monxido de carbono puro, el cual se obtiene por descomposicin del cido frmico por accin del cido sulfrico concentrado. Se hace burbujear el gas en la muestra de sangre durante 15 minutos. Mezclando volmenes iguales de la muestra saturada con sangre normal, se obtiene un grado de saturacin equivalente al 50%, el cual se utiliza para la preparacin de la escala mezclando diferentes volmenes de sangre normal y sangre saturada con monxido de carbono (Tabla 1). Cada muestra diluida en la forma expresada se somete al procedimiento sealado a fin de obtener las manchas testigo. La preparacin de manchas para grados de saturacin mayores al 50% no es necesaria en la prctica debido a que nunca se alcanzan valores superiores al 50% de saturacin.

Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa Dado que la capacidad de saturacin de la sangre para el monxido de carbono reside en el contenido de hemoglobina debe aplicarse el factor de correccin correspondiente para cada caso, debiendo valorarse el contenido de hemoglobina total del mismo.

Fig. 2: Dispositivo empleado en la determinacin de monxido de carbono en sangre

Tres tubos de vidrio grueso con borde de 13 a 15 cm de largo y 2 cm dimetro. Flange (dos discos de vidrio enfrentados para retencin de papel de filtro) Trampa de vaco, o bomba de extraccin de HP. Pinzas de Hoffman. Perlas de vidrio.

Tabla 1: Preparacin de la escala de saturacin de monxido de carbono Volumen de sangre con 50% Volumen de sangre Porcentaje de saturacin CO (ml) normal (ml) saturacin obtenido 4 1 40% 3 2 30% 2 3 20% 1 4 10% 1 5 5% 10.2 Mtodo de Microdifusin. Se basa en el poder reductor del monxido de carbono que al actuar sobre una solucin de Cl2Pd lo transforma en Pd. La reaccin se realiza en cmaras de Conway que posen en el compartimiento externo la muestra de sangre y el agente liberador (cido sulfrico) y en el interno el agente atrapante (Cl2Pd). En este caso se produce la captacin y la oxidacin del monxido de carbono forzndose la remocin completa del mismo al cabo de un tiempo y temperatura determinado. El exceso de Cl2Pd se valora espectrofotomtricamente con IK en presencia de goma arbiga. Reactivos: Solucin de cloruro de paladio: disolver 0,222 g de cloruro de paladio en 25 ml. de cido clorhdrico 0,01N y completar a 250 ml con cido clorhdrico. Se prepara en el momento. Acido sulfrico 10% (p/v) Goma arbiga al 0,1% Solucin de ioduro de potasio al 15% (p/v)
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa Equipos: Centrfuga a 5000 rpm. Especrofotmetro UV visible Procedimiento: En el centro de la cmara de Conway colocar 0,5 ml de Cl2Pd (0,01N), en la periferia y separados se colocan 0,25 ml de H2SO4 y 0,25 ml de la muestra (sangre entera). Cubrir con la tapa sellando con grasa siliconada para evitar posibles prdidas. Mezclar la sangre con el cido sulfrico mediante un suave movimiento de balanceo. Dejar difundir 1 hora a temperatura ambiente. La existencia de monxido de carbono se evidencia en forma indirecta a travs de la aparicin de una ptina platina de paladio metlico en el compartimento interno. Con una pipeta capilar se extrae la totalidad de la solucin del compartimento interno (Pd y exceso de cloruro de paladio). Luego se centrifuga con el objeto de separar el precipitado de Pd y se transfiere 0,1 ml del sobrenadante a un matraz de 10ml. En otro matraz de 10 ml, se coloca 0,1 ml de solucin de Pd (blanco). A cada matraz se agrega 1,0 ml de solucin de goma arbiga al 0,1% y 1,0 ml de IK al 15 %, se mezcla bien y se lleva a volumen. Se realiza la determinacin de la densidad ptica a 500 nm llevando a cero con agua destilada. El exceso de sal de Pd origina con el ion ioduro el complejo I4Pd-2. En forma paralela se trabaja con una solucin de Cl2Pd no difundida de manera de tener un punto de referencia de absorbancia. Luego se lee la absorbancia a 500 nm. Expresin de resultados: Con el punto de referencia se calcula la concentracin de CO en la muestra inicial.

mgCO%

DO t - DO D 0,05335* 520 DOt

Donde DOt y DOD representan la densidad ptica del testigo y la muestra desconocida, respectivamente. El valor 0,053 corresponde a 0,1 ml de la solucin de paladio 0,01N con peso equivalente de 106,7/2 = 53,35. El factor 520 corresponde al factor de conversin (CO/Pd) provenientes de 0,1 ml solucin expresados en los 2,0 ml de muestra de sangre analizada y multiplicada por 100 para expresar el resultado en porcentaje mgCO% (28/106,7). (2/0,1).100=520). El resultado puede expresarse en ml % aplicando el factor 0,8. Para expresar el resultado en porcentaje (saturacin de la hemoglobina), es necesario conocer la concentracin de la misma y teniendo en cuenta que 1g de hemoglobina fija 1,34 ml de CO, se puede calcular el valor correspondiente de saturacin.

Interpretacin de Resultados
El monxido de carbono es el producto endgeno del catabolismo del hemo con un valor de saturacin de carboxihemoglobina entre 0,4-0,7%. El valor promedio de carboxihemoglobina encontrada en sangre de individuos no fumadores que habitan zonas urbanas es del 1-2%. Dicho valor llega a 5-6% en individuos fumadores. El valor TWA es de 25 y 30 ppm dado por American Conference of Governmental Industrial Hygienist (ACGIH) y Maximun Concentration in the Workplace (DFG, 1996) (MAK) con un valor mximo de 6% de HbCO para una persona que trabaja 8 hs. en condiciones de actividad fsica normal. El Occupational Safety and Health Administration (OSHA) recomienda un valor de 50 ppm y National Institute of Occupational Safety and Health (NIOSH) de 35 ppm con un valor de (Short exposicin) referido a 15 minutos de exposicin (STEL) de 200 ppm. Estos valores deben ser menores para personas de mayor riesgo como son mujeres embarazadas cuyo valor de HbCO no debe exceder 2,7%. Los valores encontrados en los casos de envenenamiento fatales registrados representan valores superiores a 50% de saturacin. En vctimas de incendios se han registrado niveles de carboxihemoglobina entre 25-55% con un valor medio de 40%. Sin embargo, tambin se ha informado que la carboxihemoglobina en vctimas de incendio puede no ser significativamente alta, en especial si el cuerpo est parcialmente carbonizado o si el episodio involucra polmeros que liberan rpidamente cido cianhdrico.

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Investigacin de cido cinahdrico en medios biolgicos

1. Identificacin y dosaje de cido cianhdrico en medios biolgicos El cido cianhdrico (HCN) es un lquido voltil, incoloro de olor caracterstico a almendras amargas que presenta gran difusibilidad debido su elevada presin de vapor. Las sales de cianuro (sodio o potasio) son de inters toxicolgico. El cianuro de sodio es ms txico que el de potasio porque desprende ms HCN por gramo de compuesto. El mecanismo de accin txica lo ejerce inhibiendo la citocromo c oxidasa bloqueando de este modo la respiracin celular generando hipoxia o anoxia citotxica. Tambin se combina con protenas que posean hierro en su mximo estado de oxidacin (III) como la metahemoglobina. Existe una enzima cuyo funcionamiento depende de la provisin de aminocidos azufrados, la cianuro azufre transferasa, que degrada el cianuro a tiocianato. La exposicin de grandes cantidades de cianuro puede ser mortal. La severidad de los efectos depende en parte de la forma qumica del cianuro, la cual puede ser cianuro de hidrgeno gaseoso o sus sales. La exposicin a elevados niveles de cianuro durante corto tiempo daa el cerebro y el corazn, y puede causar coma y muerte. Personas que han respirado cianuro de hidrgeno en concentraciones de 546 ppm han muerto despus de 10 minutos de exposicin, mientras que 110 ppm fueron un riesgo cierto de muerte despus de una hora de exposicin. Estos sntomas se desarrollan rpidamente, dependiendo de la cantidad ingerida. Los efectos son similares si grandes cantidades de cianuro son ingeridos, bebidos, respirados o tocados. El contacto de la piel con sales de cianuro produce irritacin. La exposicin crnica a cianuro produce daos en la glndula tiroidea. La sintomatologa puede ser de tipo superaguda con prdida inmediata del conocimiento, convulsiones, rigidez muscular y la muerte ocurre en pocos minutos (alrededor de 10). La intoxicacin aguda presenta tres perodos. 1) En el primero se presenta ardor y anestesia en la boca estmago, luego vrtigos y zumbidos. 2) En el segundo perodo se manifiesta prdida del conocimiento con convulsiones, contractura espasmdica de maxilares, pulso irregular, cianosis. 3) En el tercer perodo se presenta relajacin muscular y muerte por parlisis del centro respiratorio bulbar y paro cardaco. La etiologa de la intoxicacin con cido cianhdrico (HCN) descripta es muy variada. Las principales fuentes de compuestos cianurados son ciertas industrias en las cuales el HCN presenta aplicaciones comerciales como son la galvanoplastia, extraccin de metales preciosos (oro y plata), produccin de gomas sintticas como resinas acrlicas, poliuretano, manufactura de plsticos, as como el empleo de HCN para desinfeccin como insecticida y raticida. Otra fuente de compuestos cianurados son los alimentos, como algunos productos vegetales que contienen glucsidos cianogenticos que por hidrlisis (cida, alcalina o enzimtica) dan origen al HCN. Entre estos se encuentran especies de porotos, semillas de lino, sorgo, almendras amargas, mandioca, habas, as como en semillas de manzanas y peras y en bebidas fermentadas como el Kirsh, el aguardiente de cerezas. El uso de races de cassava como fuente primaria de alimento en pases tropicales produce niveles elevados de cianuro en sangre. Se ha observado daos al sistema nervioso central, debilidad en las extremidades, caminar dificultoso y sordera. La exposicin crnica a las races de cassava tambin se ha vinculado a funcin tiroidea disminuda. Debe recordarse que la combustin de plsticos conteniendo nitrgeno (uretanos) es una fuerte de cianhdrico gaseoso en incendios. La presencia de plsticos en los ambientes modernos obliga, en casos de muertes por incendio, a determinar no slo el monxido de carbono sino el cianuro, debido a que por su elevada toxicidad suele ser el responsable real de la muerte. Tambin se ha descripto otra fuente de compuestos cianurados en el uso farmacolgico como en antiguos antitusgenos como agua de laurel cerezo. Se lo ha empleado en ejecuciones en la llamada cmara de gas y se han registrado muchos casos de intoxicaciones voluntarias y homicidas.

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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa Todos los anlisis de cualquier material sospechoso de contener cianuro deben realizarse bajo campana de extraccin. Resulta til tener a mano hipoclorito de sodio para fijar y destruir el cianuro en casos de derrames.

2. Consideraciones generales de la analtica toxicolgica

La investigacin de cido cianhdrico puede realizarse con diferentes tipos de muestra: vsceras (que necesitarn de una previa homogenizacin), lquidos biolgicos, sangre u orina, alimentos (productos vegetales o animales) y medicamentos. La sangre venosa presenta un color rojo vivo caracterstico. En cadveres frescos se observa color rojo cereza as como manchas de color rojo ms o menos intenso. Junto al olor tpico de almendras amargas que desprenden los rganos se observan numerosas hemorragias pequeas en las serosas. Se debe prestar especial cuidado en casos de suicidio con cianuro al realizar la autopsia, en especial al retirar o manipular el contenido gstrico, dado que por su pH puede liberar cantidades peligrosas de cianhdrico. Cualquier envase obtenido del lugar del hecho debe ser analizado bajo campana de extraccin de gases. El recipiente que contiene la muestra debe estar escrupulosamente limpio, seco y cerrado hermticamente para evitar prdidas. Si el material son vsceras, no deben conservarse en formol porque este reacciona con el cido cianhdrico formando cianhidrinas de las que no se puede liberar HCN. Las muestras deben conservarse en fro para evitar la accin enzimtica y bacteriana sin agregado de conservantes. Existen tres tipos de determinaciones del cido cianhdrico: los ensayos inmediatos o preliminares, los ensayos mediatos y los ensayos cuantitativos.

3.1. Ensayos cualitativos o inmediatos

La identificacin directa del HCN en el recipiente que contiene el material es posible gracias a su elevada presin de vapor a temperatura ambiente y procesos hidrolticos que ocurren con cierta rapidez por las condiciones del medio, pH, temperatura, etc. Guatelli, M.A ha revisado en detalle las reacciones y mtodos analticos para cianuros y cido cianhdrico. En la atmsfera del recipiente se libera HCN que puede deberse a dos tipos de procesos: hidrolticos y putrefactivos Hidrolticos CN- + H2O HCN + OHEl equilibrio se desplaza hacia la derecha. En vsceras en estado putrefactivo se libera HCN de acuerdo con CN+ CO2 + H2O HCN + H CO3-

Los ensayos inmediatos son tcnicas que se realizan en la atmsfera del recipiente que contiene la muestra mediante el empleo de los llamados papeles sensibles. Se utilizan papeles impregnados en diferentes reactivos: 3.1.1 Utilizacin de papel de guayaco El ensayo se fundamenta en el aumento del potencial de oxidacin de las sales cpricas al pasar a sales cuprosas insolubles o poco disociadas. El sistema Cu(II)-cianuro se acopla a un compuesto reductor (resina de guayaco) que por oxidacin origina un derivado coloreado (de color castao vira al azul). Reactivos: Solucin acuosa de sulfato de cobre al 0,2% Solucin alcohlica de resina de guayaco al 10% recin preparada. Procedimiento En el momento de su uso, se embebe una franja de papel de filtro en una solucin de SO4Cu al 0,2 % dejando escurrir el exceso. Luego se embebe en una solucin alcohlica de resina de guayaco al 10% de reciente preparacin. El reactivo del papel de guayaco colocado en la boca del recipiente que contiene el material a analizar y el O2 producido en la reaccin forman un compuesto de color azul en forma inmediata.
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 8 HCN + 8 SO4Cu + 4 H2O 2 (CN Cu)2(CN Cu)2 + 8 SO4H2 + 2 O2

Un ensayo negativo permite descartar la presencia de HCN dada su sensibilidad. Un ensayo positivo no entrega mayores datos y requiere confirmacin con ensayos especficos. El ensayo presenta interferencias de tipo oxidantes directos de la resina de guayaco y reductores que actan de la misma forma que el cianuro sobre las sales de cobre. Es un ensayo clsico, sensible pero inespecfico, pudiendo detectarse hasta 0,25 g de cido cianhdrico. 3.1.2 Ensayo con o-tolidina Presenta igual fundamento que la reaccin anterior pero la visualizacin se realiza con otolidina. Tambin se puede usar bencidina, fenoftalena o cualquier sustancia que al oxidarse forme un complejo coloreado. Esta reaccin es altamente sensible pero inespecfica. Reactivos Solucin acuosa de sulfato de cobre al 0,2% Solucin alcohlica de o-tolidina al 1%. Procedimiento El ensayo es similar al anterior. En presencia de cido cianhdrico se observa en forma inmediata color azul verdoso que rpidamente vira al azul neto. Presenta mayor sensibilidad que el ensayo guayaco-cprico. 3.1.3 Ensayo de Grignard El ensayo se fundamenta en que el cido pcrico en presencia del HCN, liberado de la muestra cida, forma isopurpurato alcalino, de color rojo al rojo naranja en el transcurso de cinco minutos. Reactivos Solucin acuosa de cido pcrico 1% caliente que antes del enfriamiento se agregan 10 gr de CO3Na2.

Procedimiento

Embeber tiras de papel filtro con solucin acuosa de cido pcrico y escurrir el exceso. Si el papel se prepara en el momento, el ensayo presenta su mxima sensibilidad. El reactivo dura indefinidamente. El papel es puesto en la boca del recipiente que contiene la muestra a analizar. Un color rojo naranja indica resultado positivo.

3.1.4 Ensayo de Magnin

Se basa en la formacin de azul de Prusia HCN + OHLuego 6CN- + Fe+2 Fe+2 + 2OH+ 1/2O2 + CN+ H2O

[Fe(CN)6] - 4 Fe(OH)2 H2O precipitado verde 2Fe(OH)3

2Fe(OH)2 en medio HCl Fe(OH)3

+ [Fe(CN)6] - 4 + 3H + + Na+

Fe(CN)6FeNa + azul de prusia

3H2O

Reactivos Solucin acuosa de hidrxido de sodio al 2% Solucin acuosa de sulfato ferroso al 2% recientemente preparada. Procedimiento Se impregna una tira de papel con hidrxido de sodio al 2% y se expone en el interior del recipiente unos minutos. Se retira y se extiende sobre una cpsula de porcelana. Se distribuyen sobre la superficie expuesta 4 gotas de solucin de sulfato ferroso 2%. Se observa un precipitado verdoso que luego pasa a castao (hidrxido frrico). Finalmente por agregado de unas gotas de cido clorhdrico concentrado se observa color azul por formacin azul de Prusia. Es una reaccin poco sensible pero muy especfica
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa Siempre se efectan por lo menos dos reacciones: una muy sensible y otra muy especfica. Si las dos reacciones arrojan resultados positivos se realiza el aislamiento. 4. Ensayos mediatos

4.1 Aislamiento e identificacin del cido cianhdrico de cianuros alcalinos Aislamiento

Cuando se sospecha la presencia de cido cianhdrico mediante los ensayos antes especificados, se procede al aislamiento y posterior identificacin. Para la realizacin de los ensayos mediatos, se requiere de una separacin previa del HCN de la muestra. Son adecuadas una destilacin simple o una microdifusin. En la destilacin simple se agrega al material cido tartrico. El destilado se recoge en hidrxido de sodio para evitar prdidas del cido cianhdrico liberado. En el caso de muestras en estado de putrefaccin se debe agregar al material a destilar acetato bsico de plomo para retener el cido sulfhdrico. Reactivos: Acido tartrico al 10%. Hidrxido de sodio al 10%. Equipos Aparato de destilacin simple. Procedimiento Colocar 10 gr del material biolgico en un matraz de destilacin y cubrir con agua (aproximadamente 60 ml). Agregar 10 ml de cido tartrico al 10% y destilar recogiendo sobre 5 ml de NaOH 10%. Se calienta al principio suavemente para evitar la formacin de espuma y una vez alcanzado el punto de ebullicin se eleva lentamente la temperatura. Es importante que la extremidad del tubo de desprendimiento conectado al extremo del refrigerante tome contacto con la solucin alcalina. Suspender la destilacin cuando hayan pasado alrededor de 1/3 del volumen inicial. Medir el volumen destilado para realizar posteriormente determinaciones cuantitativas. 4.2 Tcnica del Azul de Prusia modificada o tcnica de Chellen-Klassen El ensayo se fundamenta en la formacin de un precipitado azul por formacin de azul de prusia (ferricianuro frrico) a partir del destilado, afectuando un ajuste previo del pH a un valor de 8 para favorecer la precipitacin. Reactivos Solucin alcohlica de fenoftalena al 1%. Acido sulfrico 0,1N. Solucin acuosa de carbonato de sodio al 10%. Solucin de sulfato ferroso al 1% recientemente preparada. Acido clorhdrico concentrado. Solucin acuosa de hidrxido de bario al 10%. Procedimiento A 1ml de destilado se le agrega 2 gotas de solucin de fenolftalena (medio bsico rosada), y luego lentamente solucin diluida de cido sulfrico hasta virar el indicador a incolora. Luego se lleva a pH alcalino con solucin de carbonato de sodio al 20% gota a gota hasta viraje al rojo. Agregar 3 gotas de solucin de sulfato ferroso al 2% y dejar reposar 3 minutos. Acidificar con clorhdrico concentrado. Color azul indica HCN. Si aparece color verde suave agregar gotas de cido fosfrico. Si an no se observa color azul, se puede aumentar la sensibilidad de la reaccin y agregar gotas de solucin de cloruro de bario al 10% y dejar reposar unas horas. Si se observan puntos azules sobre fondo blanco, indica presencia de HCN. Las reacciones correspondientes son las siguientes: 2 CNK + Fe(OH)2 Fe(CN)2 + KOH Fe(CN)2 + CNK [Fe(CN)6K]4 Se agrega HCl y se agita: [Fe(CN)6]K4 + Fe(OH)3 [Fe(CN)6]FeK + H2O [Fe(CN)6]FeK + FeCl3 [Fe(CN6]3Fe4 (Azul de Prusia ) + KCl Se intensifica con H3PO4 o Cl2Ba, pues forman sales insolubles de SO4Ba que sedimentan arrastrando el Azul de Prusia al fondo del tubo, donde se observar un botn blanco azulado. La sensibilidad de la reaccin es de hasta 10 g de in cianuro. Con el agregado de cloruro de bario se puede revelar hasta 5 g de in cianuro.
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 4.3 Reaccin sulfocinica o de Von Liebig El mtodo consiste en el agregado de un exceso de polisulfuro al destilado y posterior calentamiento para formar sulfocianuro. Luego se acidifica la solucin formndose cido sulfocianhdrico que con cloruro frrico aparece color rojo. Reactivos Solucin de sulfuro de amonio amarillo (polisulfuro). Acido clorhdrico concentrado. Solucin rojo Congo. Solucin acuosa de cloruro frrico al 0,5%. Eter etlico. Procedimiento Unos 5 ml de destilado se colocan en una cpsula de porcelana y se agregan unas gotas de polisulfuro de amonio (amarillo). Se procede calentando suavemente durante 5 minutos sobre tela metlica, agitando el lquido con varilla y agregando sulfurente a medida que la solucin se decolora. Cuando el contenido se haya concentrado (1 ml) y se observe persistencia de color amarillo se considera prcticamente realizada la transferencia en sulfocianuro. Se deja enfriar y se acidifica con solucin concentrada de HCl hasta reaccin cida frente al rojo congo. El compuesto puede aislarse por tratamiento con ter etlico realizando tres extracciones con 20, 5 y 10 ml de ter cada una. Los extractos etreos se evaporan en cpsula de porcelana y dejar evaporar el eter a temperatura ambiente. Luego se trata el residuo con 2 o 3 gotas de cloruro frrico al 0.5% y aparece color rojo intenso de intensidad variable (50 g de HCN transformado en SCN- el color aparece rpidamente) CN - + (S)m- 2 SCN + (S)n-1- 2 2SCN- + Fe+3 [Fe(SCN)2]+ (complejo color rojo) El ensayo es altamente sensible y especfico. Algunos autores estiman que es posible revelar in cianuro en la proporcin de 100 g/L.

5. Ensayos cuantitativos
5.1 Mtodo de Denigs Constituye una valoracin en donde se forma una sal estable de AgCN y el exceso de Ag+ en el punto final forma un compuesto de color amarillo con el in ioduro de acuerdo con las siguientes reacciones. Este procedimiento es apto para concentraciones elevadas. CN- + AgNO3 AgCN + CN[Ag(CN)2]- + Ag+ Se corrige con NH3 Ag(CN)2- + NH3 Ag+(exceso) + IAg(NH3)2+ + 2 Ag(CN)2 AgI amarillo AgCN +NO3 [Ag(CN)2]- (complejo soluble) Ag(CN)2Ag (se forma antes del pto. final)

Reactivos Amonaco concentrado Ioduro de potasio al 10% Solucin de nitrato de plata 0,01N Procedimiento Tomar 10 ml de destilado y agregar 10 ml de amonaco concentrado y 1 ml de KI al 10%. Titular con solucin de nitrato de plata 0.01N hasta aparicin de turbiedad permanente. Clculos = 1 ml de NO3Ag (0.01 N) = 5.4 10-4 gr HCN = 0.54 mgr de HCN

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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 5.2 Determinacin de cianuro en alimentos, sangre e hgado. Mtodo de formacin de manchas de Azul de Prusia El mtodo se fundamenta en que el cianuro de la muestra es liberado por accin del cido sulfrico o cido tricloroactico y aspirado a travs de un disco de papel impregnado en sulfato ferroso dentro de un flange y se forma ion frrico visualizado como manchas de ferrocianuro ferrico (azul de Prusia). El disco es luego sumergido en cido clorhdrico hasta que toda la porcin sin reaccionar sea eliminada. La intensidad de la mancha es proporcional a la cantidad de cianuro presente en la muestra. Reactivos glucosidasa. Agente antiespumante. Solucin acuosa al 11% de cloruro frrico: pesar 11g de cloruro frrico y llevar a 100 ml con agua destilada. Solucin acuosa de sulfato ferroso amnico al 19%: pesar 19 g de (NH4)2Fe(SO4)2) y llevar a 100 ml con agua destilada. Solucin acuosa al 10% de hidrxido de sodio: pesar 10 g de NaOH y llevar a 100 ml con agua destilada. Solucin acuosa de 1N de hidrxido de sodio: pesar 40 g de NaOH y llevar a 1000 ml con agua destilada. Solucin stock de cianhdrico (1000 g/ml): pesar 0,2503 g de cianuro de potasio y transferir en un matraz de 100 ml agregar 10 ml de NaOH 1N y diluir al volumen con agua destilada. Solucin standard intermedia de cianhdrico (100 g/ml): diluir 1 ml de la solucin stock de cianhdrico en 10 ml de agua destilada. Preparar diariamente. Solucin de trabajo de cianhdrico (10 g/ml): diluir 5 ml de la solucin intermedia standard de cianhdrico en 50 ml de agua destilada. Preparar diariamente. Solucin acuosa al 20% de cido sulfrico: agregar 50 ml de agua a un frasco graduado de 100 ml. Agregar 20 ml de cido sulfrico concentrado y llevar al volumen con agua destilada. Solucin de cido clorhdrico 25%: agregar 50 ml de agua en una probeta de 100 ml, agregar 25 ml de HCl concentrado y llevar a volumen con agua destilada. Papel de filtro Watman N 40 cortado en forma de discos 16 mm dimetro. Aparatos y equipos Aparato para cianhdrico Bao de agua a 75C. Bomba de aire Bao de vapor o evaporador. Procedimiento: Pretratamiento de alimentos 1. Pesar cerca de 10 g de alimento y transferir a un homogeneizador 2. Agregar 200 ml de agua y 0,02g de glucosidasa 3. Homogenizar durante 4 minutos. 4. Dejar decantar 1 hora. 5. Proceder al paso 10 del anlisis. Pretratamiento en muestras de sangre 1. Agregar 300 ml de agua, 5 ml de sangre y 2 ml de antiespumante a una probeta de 500 ml. 2. Reemplace el tapn de goma en el aparato de cianhdrico con el tapn ajustado en la probeta de 500 ml. 3. Prepare suficiente cantidad de agua caliente (paso 5 del anlisis) que pueda contener la probeta de 500 ml. Procedimiento 1) Agregar aproximadamente 20 ml de agua al tubo muestra. Pipetear 0,5 ml de solucin standard de trabajo en el tubo. 2) Agregar 20 l de cada uno de los siguientes reactivos FeCl3 11%, (NH4)2Fe(SO4)2) 19%, y NaOH 10% en el centro del papel de filtro de 16 mm de dimetro. 3) Ubicar el papel de filtro en el aparato de cianhdrico mientras est hmedo y ensamble el aparato.
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 4) Agregar 1,0 ml de cido sulfrico/g de estndar con una jeringa a travs de la entrada del tubo de aire al tubo muestra. 5) Ubicar el tubo en bao de agua a 75C. 6) Aplicar succin durante 4 minutos. Menor tiempo de succin puede dar incompleta recuperacin y mayor tiempo puede condensar agua arriba del disco. 7) Revelar el papel con HCl al 25% caliente (en bao de vapor o en plancha calefactora) hasta que el papel es vea blanco con manchas azul. 8) Enjuagar el disco con agua destilada y secar. Alinear las manchas standard en lnea sobre un fondo blanco. Si las manchas son de color oscuro excesivo, puede deberse a sulfuros que tienden a desaparecer al ubicar el papel en HCl. 9) Repetir los pasos 2-8 con standard de 10 g, 20 g y 50 g standard. 10) Colocar una porcin de la muestra homogeneizada (1-5g) estimando que contiene un total de 5 20 g de cianuro en el tubo muestra. Agregue 20 ml de agua al tubo de la muestra. 11) Agregue 1ml de cido sulfrico por gramo de muestra. Como mnimo de 1 ml, pudiendo agregarse ms volumen si la muestra es bsica. 12) Repetir los paso 5-8. 13) Repetir el anlisis de la muestra con un sobreagregado de 5 g. 14) Puede usarse una comparacin visual o cuantificar en un densitmetro. 15) Construir la curva de calibracin usando los estndares de cianuro y determinar los niveles en la muestra por comparacin de absorbancia. Informar en ppm. Consideraciones generales: Medir el pH del contenido estomacal. Si el pH es cido, el in cianuro es probable que se haya perdido. Precauciones: Este mtodo emplea soluciones de HCN siendo importante realizar esta preparacin y manipuleo con sumo cuidado y siempre bajo campana de extraccin de gases. 5.3 Mtodo de microdifusin de Feldstein-Klendshoj Fundamento En la cpsula de Conway el cido cianhdrico difunde del compartimiento externo al interno siendo fijado como cianuro en la solucin alcalina. Se toma una alcuota del compartimiento interno y se agrega cloramina T, formndose cloruro de ciangeno. Luego por el agregado de piridina se forma cloruro de cianopiridina. La accin hidroltica determina la apertura del anillo piridnico, para dar lugar a la formacin del cido glutacnico. Si este derivado se hace reaccionar con cido barbitrico se forma un complejo rojo que se lee a 580 nm. Muestra: sangre entera con heparina, orina u homogenato de vsceras. Reactivos Hidrxido de sodio 0,1N Acido sulfrico 10% en volumen Lubricante: a base de siliconas o mezclar 2 partes de vaselina slida y 1 parte de parafina. Fosfato monosdico 1M. Cloramina T al 0,25%. Se guarda en heladera hasta el momento de usar. Reactivo piridina-barbitrico: en un matraz aforado de 50 ml colocar 3 g. de cido barbitrico, 15 ml de piridina pursima y 3 ml de cido clorhdrico concentrado. Mezclar hasta disolucin total, llevar a volumen con agua destilada y filtrar. Instrumental Espectrofotmetro. Cubetas de seccin cuadrada de 1 cm de paso de luz. Cmaras de Conway. Procedimiento 1. Colocar en el compartimiento interno de la unidad de microdifusin de Conway 3,3 ml de hidrxido de sodio 0,1N y en el compartimiento externo 2 a 4 ml de sangre total u orina, o 5 ml de homogenato de tejido (equivalente a 1 g de tejido). Como reactivo liberador se agregan 2 a 3 gotas de cido sulfrico al 10% en el compartimiento externo. 2. Tapar inmediatamente y homogenizar por rotacin. Sellar perfectamente las cmaras con vaselina. El tiempo de difusin es de 3 a 4 horas a temperatura ambiente.
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa 3. Transcurrido el tiempo indicado se toma 1 ml de la solucin alcalina del compartimiento interno y se coloca en un tubo de ensayo. Se prepara un blanco colocando en otro tubo 1 ml de hidrxido de sodio 0,1N. A cada tubo agregar 2 ml de fosato monosdico 1M y 1 ml de cloramina T al 0,25%. Mezclar y dejar en reposo 2 a 3 minutos, agregar por ltimo 3 ml de reactivo piridina-barbitrico, mezclar y dejar en reposo 10 minutos. En presencia de in cianuro aparece color rosado cuya absorbancia se mide a 580 nm. Se compara la absorbancia con testigos de cianuro en concentraciones comprendidas entre 0,1 a 2,0 g/ml de solucin de hidrxico de sodio 0,1N. 6. Valores normales de cianuro en individuo adulto El cianuro aparece como producto del catabolismo normal en pequeas cantidades. Hasta 15 g/100 ml sangre es considerado como valor normal.

7. Interpretacin de los resultados

El valor de TWA es de 10 ppm (OSHA, MAK) mientras que ACGIH y NIOSG recomienda un valor de STEL de 4,7 ppm. En una intoxicacin por inhalacin de cido cianhdrico valores mayores de 100 g/100 ml suelen ser fatales pero puede variar de un individuo a otro. La ingestin de 150- 200 mg de NaCN puede provocar la muerte en un individuo adulto de 70 Kg pudiendo llegar la concentracin sangunea a valores 1 2 mg/100 ml o superiores. En muestras de sangre cadavrica, el cianuro desaparece rpidamente por accin enzimtica y bacteriana. Hasta 15 g/100 ml de sangre en cianuro aparece como producto del catabolismo normal en pequeas cantidades. En sangre, niveles de cianuro mayores de 1 mg/l es asociado con casos fatales. Dosis txica: una concentracin de 1 mg/Kg de peso corporal es mortal. Generacin de monxido de carbono y cido cianhdrico en Incendios de polmeros Actualmente se pone especial nfasis en la investigacin de cido cinahdrico (HCN) junto al monxido de carbono (CO) en personas expuestas a incendios de materias plsticas que contienen nitrgeno en su estructura. En nuestro pas, han sucedido episodios trgicos durante los ltimos aos que tuvieron como desenlace la muerte masiva de personas (Por ejemplo: incendio en unidades penitenciarias en 1990 y 2005 y la denominada tragedia de Once en 2004). En un episodio de incendio de colchones de poliuretano con 35 vctimas fatales, Ferrari et al (2001, 2005) consignaron que el CO oscilaba entre un 4%-18% con un promedio de 9%, expresado como % de saturacin de COHb (carboxihemoglobina); mientras que el HCN mostraba un intervalo de 2.0-7.2 mg/l, con un promedio de 3.5 mg/l. Estos ltimos valores exceden ampliamente los valores letales, mayores a 1 mg/l, consignados en bibliografa para el gas cianhdrico en sangre (Ballantyne, 1974; Baselt, 2000; Moffat et al, 2004). Repetto y Martnez (1976) informaron que en vctimas fatales de un incendio en un night club, se observaba altos niveles de CO y dosis sub-letales de cido cianhdrico en 4 de los 6 occisos. Elkius y Coleman, citado por Guatelli (1992), sealaron que se obtiene una mayor proporcin de CO con respecto a HCN en la descomposicin pirogenada de plsticos nitrogenados, mientras que Montgomery (1986) consigna que el HCN en forma masiva es desprendido en ambientes con muy poco oxgeno. Guatelli (1964, 1992), con autoridad reconocida en el tema, comenta detalladamente ensayos experimentales y accidentes provocados por incendios en los que se generaron el HCN. Si bien existe un considerable nmero de trabajos que mencionan la posible produccin de HCN en incendios de plsticos nitrogenados, poco en cambio se ha informado sobre el rol del HCN como agente letal respecto del CO, especialmente en combustiones de plsticos o espumas como las de poliuretano. La produccin de HCN en diversos procesos, segn los materiales involucrados, ha sido demostrada por diversos investigadores (Terril et al, 1978; Symington et al, 1978; Birky y Clarke, 1981; Montgomery, 1986; Lundquist et al, 1989; Alarie, 2002; Walsh et al, 2004; Yeoh y Braitberg, 2004). Se observa no obstante, una tendencia a atribuir un papel ms relevante al CO generado que al HCN. Inclusive algunos autores sostienen que la produccin de distintos
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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa compuestos nitrogenados (derivados nitrilos), podran competir con el HCN limitando los efectos txicos de este ltimo (Guatelli, 1992). Estos estudios sugeriran que el HCN podra provocar una rpida inhibicin inicial sobreviniendo posteriormente la muerte por intoxicacin con CO (Purser et al, 1984). Nuestros hallazgos para el poliuretano, se contraponen a esta postura. La combustin inicial descompone al poliuretano entre 150-300C, liberando entre otros productos HCN y CO. Montgomery (1986) basado en experimentos animales consign que la temperatura en la que se formara el temido HCN puede variar segn los distintos tipos de polmero, notndose una diferencia relevante en las espumas rgidas y las espumas flexibles. Adems, parecera que estas diferencias se equlibran cuando se alcanzan o sobrepasan los 800C. Por otro lado Kimmerle (cit. por Montgomery, 1986) encontr que la temperatura de descomposicin de una espuma flexible de poliuretano a la cual produca una atmsfera letal en ratas era menor a 300C, mientras que las espumas rgidas lo hacan por sobre los 650C. Al escindirse en una combustin ms fcilmente el grupo CN- del polmero con el aumento de la temperatura, teniendo en cuenta que esta puede alcanzar entre 500-1000C en un tiempo de 2 a 5 minutos, se deduce la rpida liberacin masiva de HCN. Cabe sealar que la propagacin de la combustin en este caso es significativamente ms rpida que la observada en un incendio con cantidad equivalente de madera. La descripcin de incendios incontrolables con poliuretanos sin retardantes de ignicin, indica que existe una rpida diseminacin de fuego y humo que puede contribuir en forma relevante al potencial letal de estos sucesos. Guatelli (1992) en nuestro medio, nota que en unidades carcelarias se han producido incendios intencionales de colchones, con relleno de goma espuma, sealando que la muerte de muchos internos se habra producido por intoxicacin oxicarbonada, sin practicar la determinacin de HCN. Manifiesta adems, que la incorporacin de agentes retardantes de la combustin en este tipo de polmeros puede modificar los productos de degradacin. Expresa tambin que la adicin de cobre a la espuma flexible de poliuretano redundara en una significativa reduccin del HCN generado en incendios, como tambin otros productos de combustin. Nosotros opinamos que se debe realizar la determinacin de ambos txicos voltiles, con el objeto de alcanzar una idea ms acabada sobre la presunta influencia de ambos venenos en el proceso de intoxicacin. Esta opinin se encuentra en lnea con una publicacin muy reciente de Walsh et al. (2004) que enfatiza seriamente la importancia del cido cianhdrico en incendios de materiales diversos, consignando que entre 5,000 y 10,000 personas mueren cada ao en Estados Unidos por motivo de intoxicacin cianhdrica proveniente de la inhalacin de gases en incendios. Aunque el efecto letal del gas cianhdrico es bien conocido en el hombre, poca es la informacin disponible acerca del curso y severidad en la accin incapacitante para huda en situaciones de incendio, durante los estadios tempranos de la exposicin. Tambin debe tenerse en cuenta que la disminucin de la concentracin de oxgeno en el ambiente en combustin puede ser causa de incapacitacin y muerte, especialmente si disminuye en niveles inferiores al 10% (Alarie, 2002). Por ltimo, es muy importante realizar ensayos sobre muestras de materiales combustionados con el objeto de verificar la formacin o no del HCN.

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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa

Bibliografa
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