En 1986, Kary B.

Mullis, un investigador de la
Corporación Cetus, inventó un método para
lograr la multiplicación in vitro de fragmentos
definidos de ADN Se trata de la reacción en
cadena de la polimerasa, ya muy conocida
como PCR, siglas provenientes del inglés
Polymerase Chain Reaction. Gracias a su
trabajo de PCR se le otorgó el PREMIO
NOBEL en química en 1993.

Es importante destacar el descubrimiento de

la Taq polimerasa, pues gracias a esto se pudo
realizar la metodologia.
Esta técnica revolucionó muchos aspectos de
la investigación, entre estos, el diagnóstico de
defectos genéticos y del VIH.
 Es una metodología que permite amplificar un ADN
obtenido a partir de una región seleccionada del genoma.

DEFINICION

“Es un método de síntesis enzimática in vitro de múltiples copias de

una secuencia concreta de DNA (el RNA también puede utilizarse
mediante la previa transcripción inversa a cDNA).

Este procedimiento permite la detección y el análisis de secuencias

génicas específicas en una muestra del paciente, sin necesidad de
clonación ni técnicas de manchas Southern o Northern.

Los análisis pueden realizarse incluso en una sola célula obtenida

de la raíz de un cabello, de las pocas células presentes en raspados
bucales o de una gota de sangre seca.
 DNA PCR
Muchas
moleculas
amplificación
(molecule sencilla)
 5’ 3’
 -T A C G
 -A T G C A T G C A T G C * *

Cortos primers de DNA específicos hibridizan con la

cadena que tiene que ser copiada
 5’ 3’
 -T A C G T
 -A T G C A T G C A T G C *
*
 5’ 3’
 -T A C G T A
 -A T G C A T G C A T G C *
*
 5’ 3’
 -T A C G T A C
 -A T G C A T G C A T G C * *
 5’ 3’
 -T A C G T A C G
 -A T G C A T G C A T G C * *
 5’ 3’
 -T A C G T A C G T
 -A T G C A T G C A T G C * *
 5’ 3’
 -T A C G T A C G T A
 -A T G C A T G C A T G C *
*
Primer 1 Extensión de la cadena

Cadena original de DNA

¿Cómo produce este proceso una

AMPLIFICACIÓN?
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100°C)
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta tem
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100°C)
Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva
cadena con la DNA polimerasa
2

Al mismo tiempo, la cadena original se copia

nuevamente, dado que hay un rexceso de Primer 1

Ahora tenemos dos copias de la molécula original

 Fusión Hibridización Extensión de 2do Ciclo
95°C 50-60ºC La cadena 95ºC
75ºC 50 - 60ºC
75ºC
Primer Ciclo
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en
el número de copias
 Desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP y dTTP.
 Dos cebadores (o primers), oligonucleótidos que son, cada uno,
complementarios a una de las dos hebras del ADN.
 Iones de magnesio (Mg 2+ ), agregado comúnmente como cloruro de
magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente.
 Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento
de la ADN polimerasa.
 ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas (la más común es la
Taq Polimerasa, perteneciente a la arqueobacteria Thermus aquateus).
 ADN molde, que es la muestra que se va a amplificar.
 Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en
cada una de las tres etapas que conforman un ciclo.
Las altas temperaturas de desnaturalización aplicadas en cada ciclo
de amplificación. Por lo cual se utilizó la Taq. polimerasa procedente
de la Thermus aquaticus. Su actividad óptima se logra a una
temperatura de 70 a 75°C aunque resiste temperaturas superiores a
90°C y mantiene su actividad enzimática después de la temperatura
de desnaturalización por lo que no necesita ser reemplazada en
cada ciclo. Con esta enzima es posible amplificar fragmentos de
hasta 10000 bases a una velocidad de extensión de unos 150
nucleótidos por segundo y molécula de enzima con una probabilidad
de error en la copia extremadamente baja.
 Se conoce su secuencia
 Es el factor mas importante para la eficiencia y la
especificidad del proceso
 Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 cycles, 1 kb)
 Requieren de un cuidadoso diseño
 Reglas de diseño:
 (a) longitud = 18-25
 (b) Contenido de G+C entre 40-60%
 (c) Evitar las secuencias repetidas
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 5’-NNNNNNNNTATA-3’
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 3’-ATATNNNNNNNN-5’

3´ repetido
5´ 3´ PCR
3´ 5´

5´ 3´
3´ 5´

Dímero de primer
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 5´-TATANNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 3´-NNNNNNNNATAT-5´

5´ repetido
5´ 3´ PCR
3´ 5´

5´ 3´
3´ 5´

no hay extensión
5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’ 5’-NNNNNNNNNNNGCA
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-CGT

Formación de horquillas
5´ PCR
3´

5´
3´ 5´ 3´

Productos de PCR no deseados

 Segmento de doble cadena
 ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo
que el ADN lineal
 Se puede amplificar a partir de una sola molécula de
ADN molde, pero las condiciones deben estar muy
optimizadas
ElPCR consta de 3 pasos
importantes:

DESNATURALIZACION

HIBRIDACION “Annealing”-
Anillamiento O UNION DEL
CEBADOR A LA CADENA MOLDE

EXTENSION DE LA CADENA
• Esta consiste en separar las
dos hebras por las cuales
esta constituido por medio
del rompimiento de puentes
de hidrógeno. Esto se
puede realizar de varios
modos, siendo el mas
habitual el
CALENTAMIENTO a 94ºC –
95ºC de la muestra.
 A continuación se producirá la
HIBRIDACION del cebador o primer,
es decir el cebador se unirá o se
aparea a su secuencia
complementaria de ADN molde.
Para que esto sea posible , es
necesario un descenso de la
temperatura , generalmente a 55ºC,
aunque pueda variar según sea el
caso entre 45ºC y 65ºC .
 Estos cebadores o primers no solo
actuaran como sustrato para la ADN
polimerasa, sino que actuaran
como límites de la región de la
molécula que va a ser amplificada
Incorporación de Nucleótidos en el
extremo 3’ utilizando un prymer por
medio de la Taq Pol. Empleando la
cadena molde de DNA desnaturalizada
 Obtención de resultados con una muestra mínima de
ADN.
 En un espacio corto de tiempo genera un elevado
número de copias de ADN.
 Uso en estudios de criminalística cuando el ADN se
encuentra degradado.
 Rapidez
 Los resultados son informatizados
 ESPECIFICIDAD
 BAJA sensibilidad

 ALTA probabilidad de contaminación.

 Tiene aplicaciones médicas para el diagnóstico de
diversas enfermedades. Algunas de ellas son.
-Fibrosis Quística
-Hemofilias
-Deficiencia de la glucosa 6-P-DH
-Mutaciones
 También es útil para encontrar parásitos, virus o
bacterias en alguna muestra de ADN.
 Estudios evolutivos