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Guía de Bioquímica 2009 II

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1

Guía de Prácticas

Bioquímica

Lima - Perú 2009-II

UNIVERSIDAD RICARDO PALMA

FACULTAD DE MEDICINA Y NUTRICION

GUIA DE BIOQUIMICA

FAMURP

Dr. Elio Iván Rodríguez Chávez
Rector

Dr. Manuel Huamán Guerrero
Decano de la Facultad de Medicina Humana

Autores:
Dra. Nancy Jo Vargas Q.F. Cecilia Rojas Guerrero
INDICE Página 1. Cronograma de Actividades de Practica…………………………………………………………..4 2. Reglamento Interno del Laboratorio………………………………………………………………..5 3. Normas de Seguridad en el Laboratorio……………………………………………………………6 4. Interconversión de unidades y manejo de concentración de soluciones.................................8 5. Buffers: pH y pK.........................................................................................................................10 6. Espectrofotometría : Curvas de Calibración………………………............................................13 7. Factores que afectan la actividad enzimática………...............................................................17

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8. Digestión enzimática del almidón............................................................................................21 9. Prueba de Tolerancia de la Glucosa……………………............................................................23 10.Acidósis diabética....................................................................................................................26 11.Perfil lipídico y Riesgo Coronario..........................................................................................29 12.Ictericia e Hiperbilirrubinemia..............................................................................................34 13.Transaminación......................................................................................................................36

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DE PRACTICA Semestre 2009-II
Actividad Interconversión de unidades y manejo de concentraciones de disoluciones. Buffer: Capacidad buffer en términos de pKa. Espectrofotometría Uso de la luz visible y UV en Medicina. Actividad enzimática: Efecto de factores en la transformación del sustrato. Acción de la amilasa en la digestión del almidón. Metabolismo de los C.H y prueba de sobrecarga de glucosa (TTG). Determinación e interpretación del HCO3- en la ácidosis diabética. I Examen Practico Aislamiento e identificación de lipoproteínas plasmáticas y su asociación con el riesgo coronario. Revisión de I Examen Practico Ictericia: Metabolismo de la bilirrubina y pigmentos biliares. Transaminación. Uso de la cromatografía. Semana 24 al 29 Agosto

31 Agosto al 05 Setiembre 07 al 11 Setiembre

14 al 18 Setiembre 21 al 25 Setiembre 28 Setiembre al 02 Octubre 05 al 09 Octubre 12 al 16 Octubre 19 al 23 Octubre 26 al 30 Octubre 26 al 30 Octubre 02 al 06 Noviembre

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Valoración Nutricional: Balance Nitrogenado Evaluación de la Masa Proteica Visceral y Esquelética: Marasmo- Kwashiorkor. Medidas Antropométricas y signos clínicos que evidencian desnutrición. Manejo de la Tabla de composición de alimentos. II Examen Practico Revisión de II Examen Practico Publicación y Revisión de promedios

09 al 13 Noviembre 16 al 20 Noviembre

23 al 27 Noviembre 30 Noviembre al 04 Diciembre 07 al 12 Diciembre 14 Diciembre

Reglamento Interno del Laboratorio 1. La asistencia a las practicas de laboratorio es de carácter obligatorio , con una tolerancia de 10 minutos. 2. Las inasistencias a las practicas de laboratorio no son recuperables, las justificaciones por enfermedad se realizan dentro de las 72 horas. 3. El ingreso al laboratorio será con mandil o guardapolvo y deberá portar su guía de prácticas. 4. Se tomará un paso escrito antes de iniciar cada práctica, con un puntaje de 06 como máximo. 5. Cada alumno entregará un informe de la práctica realizada en un máximo de 5 páginas (2Mb), que deberá ser colgada en intranet como máximo antes de realizarse la siguiente práctica, si algún alumno faltase a alguna práctica, no podrá entregar informe. 6. Los alumnos deben venir leyendo su guia de prácticas y deberán tener en cuenta las indicaciones del profesor sobre el procedimiento a realizar y el equipo de laboratório a utilizar. 7. A cada alumno se le asignará una mesa de trabajo, y por ningún motivo trabajará en una mesa distinta. 8. Los alumnos serán responsables por el material asignado, cuidándolo y dejándolo limpio y ordenado al finalizar la practica. 9. Si algún alumno rompe material de vidrio, deberá reponerlo, de lo contrario no podrá rendir el próximo examen. 10.En caso de deterioro de algún equipo de laboratorio toda la mesa será responsable del daño causado. 11.Si porta celulares y/o equipos de sonido (radios,walkman, MP3, Ipod, etc.) serán apagados, permaneciendo así durante el transcurso de la práctica. 12.No se permite ingresar con alimentos y/o bebidas al laboratorio. 13.Todo permiso para salir del Laboratorio deberá ser solicitado a su profesor de prácticas, otorgándosele permiso sólo si fuera absolutamente urgente. Universidad Ricardo Palma Página 4

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Normas de Seguridad en el Laboratorio
El trabajo en el Laboratorio requiere la observación de una serie de normas de seguridad que eviten posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se está haciendo o a una posible negligencia de los alumnos. 1. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material. 2. Es conveniente la utilización de mandil, ya que evita posibles proyecciones de sustancias químicas o biológicas lleguen a la piel. Por supuesto además, evitarás posibles deterioros en tus prendas de vestir. 3. Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleves recogido.

4. Y no haría falta decir esto; pero por supuesto en el laboratorio está
terminantemente prohibido fumar, ni tomar bebidas ni comidas.

Normas de utilización de productos químicos y/o material biológico
1. Antes de utilizar un compuesto, asegurarse bien de que es el que se necesita, fijarse bien en el rótulo. 2. Como regla general, no coger ningún producto químico. Tu profesor o profesora te lo proporcionará. 3. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el profesor. 4. Es muy importante que cuando los productos químicos de desecho se viertan en la pila de desagüe, aunque estén debidamente neutralizados, debe dejarse que circule por la misma, abundante agua. 5. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos y/o biológico. 6. No pipetear con la boca. Utilizar la bomba manual, un pipeteador o pipeta automática que se disponga en el Laboratorio de Bioquímica.

7. Los ácidos requieren un cuidado especial. Cuando queramos diluirlos, nunca echaremos
agua sobre ellos; siempre al contrario, es decir, ácido sobre agua.

8. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc) no deben estar cerca de fuentes de
calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se hará al baño María, nunca directamente a la llama. 9. Si se vierte sobre ti cualquier ácido o producto corrosivo, lávate inmediatamente con mucha agua y avisa al profesor. 10. Al preparar cualquier disolución se colocará en un frasco limpio y rotulado convenientemente.

Normas de utilización de vidrio
1. Cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio. 2. El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frío. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar antes de tocarlo.

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3. Las manos se protegerán con guantes o trapos cuando se introduzca un tapón en un tubo de vidrio. 4. Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, observa cuidadosamente estas dos normas:  Ten sumo cuidado y ten en cuenta que la boca del tubo de ensayo no apunte a ningún compañero. Puede hervir el líquido y salir disparado, por lo que podrías ocasionar un accidente. Calienta por el lateral del tubo de ensayo, nunca por el fondo; agita suavemente.

1

INTERCONVERSIÓN DE UNIDADES Y MANEJO DE CONCENTRACIÓN DE DISOLUCIONES

Por muchos años los científicos expresaron las mediciones en unidades métricas, relacionadas entre sí decimalmente, es decir, mediante potencias de 10. Sin embargo, en 1960, la Conferencia General de Pesas y Medidas, la autoridad internacional en unidades, propuso un sistema métrico revisado y actualizado al cual se denominó Sistema Internacional de Unidades (Abreviado SI, del francés Systéme Internationale d Unites). En la tabla Nº 1 se muestran las siete unidades SI fundamentales; las demás unidades de medición se pueden derivar a partir de estas unidades. Como las unidades métricas, las unidades SI cambian en forma decimal por medio de una serie de prefijos, como se muestra en la tabla Nº 2. En Bioquímica se suele usar éste sistema el cual significa un amplio dominio en su manejo toda vez que las concentraciones de los fluidos intra y extracelulares son generalmente en el orden de los submúltiplos. Tabla 1 .- Unidades SI básicas
CANTIDAD FUNDAMENTAL Longitud Masa Tiempo Corriente eléctrica Temperatura Cantidad de sustancia Intensidad luminosa NOMBRE DE LA UNIDAD Metro Kilogramo Segundo Ampere Kelvin Mol Candela SÍMBOLO m kg s A K mol cd

Tabla 2.- Prefijos utilizados con unidades SI

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MULTIPLOS

SUBMULTIPLOS

Prefijo tera giga mega kilo hecto deca deci centi mili micro nano pico femto atto

Símbolo T G M K H Da d c m u n p f a

Factor 1012 10 9 106 103 102 10 10-1 10-2 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 10-18

Equivalente 1 000 000 000 000 1 000 000 000 1 000 000 1 000 100 10 0,1 0,01 0,001 0,000 001 0,000 000 001 0,000 000 000 001 0,000 000 000 000 001 0,000 000 000 000 000 001

INFORME DE LA PRACTICA N° 1
Nombre del Alumno:-----------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: ---------------------------------1.- Realice los siguientes conversiones: X X X X ml mg ul L = = = = X ul X ng X ml X ml Xg = Xmg Xpg = Xmg XmMol= XnMol X Hg = X dg Fecha:
---------------------------

2.- Describa la estructura química y calcule el Peso molecular de los siguientes compuestos: a) Glucosa b) Cloruro de sodio c) Cloruro de potasio d) Cloruro de calcio e) Lactato de sodio f) Gluconato de calcio g) Urea h) Manitol 3.- Describa las siguientes expresiones: a) b) c) e) Molaridad Normalidad Equivalente m-Eq Osmolaridad

d)

4.- Calcule la Molaridad de 1 Litro de Solución de : a) Cloruro de sodio al 0.9% b) Suero glucosado al 10% c) Una ampolla de NaCl al 20% d) Una ampolla de 20cc de NaHCO3 al 10% 5.- Calculo los mEq: a) Cuantos mEq de Na y de Cl hay en una ampolla de 20cc de NaCl al 20% b) Cuantos mEq de K hay en una ampolla de 20 ml de KCl al 10%

c)

Cuantos mEq de HCO3 y cuantos mEq de Na hay en una ampolla de 20cc de HCO3Na al 10%.

-------------------------------------------

Firma del Alumno

-------------------------------------------------------

Firma del Profesor

--------------

Nota

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BUFFERS: pH y pKa TITULACION DE ACIDO DEBIL MONOPROTICO CON UNA BASE FUERTE

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La curva de titulación de un ácido débil como acético representa las variaciones de pH con respecto a diferentes proporciones relativas entre la sal y el ácido de una solución tampón. Antes de adicionar la base, el pH se debe solamente al ácido. Tan pronto como se agregue algo de base ésta reacciona con una cantidad equivalente de sal y agua. Pero el ácido débil , mas su sal disuelta constituye una solución tampón, cuyo pH puede calcularse mediante el uso de la ecuación de Henderson - Hasselbach.

pH = pKa + log

[ ACIDO]

[ SAL]

Los valores de pH representados frente a los ml de base agregados dan una curva de titulación para el ácido

OBJETIVO a) b) Obtener la curva de valoración de un ácido débil, HA, CH3COOH O.1N y una base fuerte NaOH 0.1N , pKa = 4.76 (Ka = 1.86 x 10-5) Calcular el pH haciendo uso de un potenciómetro y/o usando la ecuación de Henderson Hasselbach

POTENCIOMETRIA El método más confiable para medir el pH es mediante el uso de un medidor de pH comúnmente denominado potenciómetro, que mide la fuerza electromotriz (f.e.m.) de una celda formada por un electrodo de referencia, la solución problema y un electrodo de vidrio sensible a hidrogeniones. El electrodo de referencia puede ser de calomel (mercurio, cloruro mercurioso) sumergido en una solución concentrada de cloruro de potasio. El electrodo de medida o de vidrio, esta constituido por un tubo de vidrio grueso con un extremo en forma de bombilla, el cual es selectivo y sensible al paso de iones hidrógeno. Está conectado a un alambre de platino conectado al electrodo de Ag, Cl 2Ag, sumergido en HCl 0.1M. La fuerza electromotriz generada es leída en un galvanómetro es unidades de pH.

EXPERIMENTO 1 Mezclar los volúmenes de CH3-COOH 0.1N e NaOH 0.1N indicados en el esquema y medir los valores de pH usando el potenciómetro y/o aplicando la ecuación de Henderson - Hasselbach.

Tubo N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9

CH3-COOH 0.1N 10 ml 10 10 10 10 10 10 10 10

NaOH 0.1N 0.0 ml 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0

H2O DEST. 10 ml 9 8 7 6 5 4 3 2

pH

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10 11

10 10

9.0 10.0

1 0

INFORME DE LA PRACTICA N° 2 Nombre del Alumno:-----------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: ---------------------------------Fecha:
---------------------------

VALORACION DE UN ACIDO DEBIL MONOPROTICO pH

100% ACIDO A.
B. C. D.

ml de NaOH 0.1N añadidos

100% SAL

Obtener la curva de valoración del ácido débil HA- 0.1N con NaOH 0.1N. Calcular el valor semivalorado y puntos de equivalencia. Calcule el valor del pKa, haciendo uso del potenciómetro y la ecuación de Henderson-Hasselbach. Señale la región del buffer donde tiene la máxima capacidad de amortiguación.

-------------------------------------------

Firma del Alumno

-------------------------------------------------------

Firma del Profesor

--------------

Nota

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ESPECTROFOTOMETRIA - CURVA DE CALIBRACION

Ley de Lambert: Cuando un rayo de luz monocromática incide sobre un medio absorvente, su intensidad decrece en forma exponencial al espesor del medio. Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática incide sobre un medio absorvente su intensidad decrece en forma exponencial a la concentración. Ambas leyes se fusionan así: Ley Lambert – Beer I = I0 . 10-abc a = absortividad molecular b = espesor medio c = concentración I = luz emergente I0= luz incidente

I/I0 = 10-abc log(I/I0) = -abc log I0/I = abc log 100%/%T = 2-log%T 2-log%T = a.b.c Abs = a.b.c si b = k a.k = K = K.c

Abs

La Abs es directamente proporcional a la concentración . Luego establecemos la siguiente proporcionalidad :

Abs St CSt = Abs x Cx
Cx = Cx =

Abs Abs Cx CSt

x St

= = = =

Abs desconocido Abs standard Concentr. Desconocido Concentr. Standard

Abs x xCst Abs St C St xAbs _ desconocido Abs St
Concentración = Desconocido

FACTOR CALIBRACION:

Concetración st. Abs st

x Abs desconocido

Cuando previamente se ha determinado la linaridad de Absst=k.c:

Concetración st. Abs st

= Factor

Factor x Abs desconocido = Concentración desconocido Definiciones:

1. 2.

Absorbancia: A = log10T = -log Absortividad ó Coef. Extin.: a=

1 T

= 2-log10 % T

Absorbancia/Unidad de concentración y espesor ó absorbancia específica Concentración

a=A/bc

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espesor

3. 4.

Energía Radiante: I0 = Luz incidente Transmitancia: T=

5.

I.(emergente) I 0(incidente)

% Transmitancia: %T = 100T

UV IR Luz Visible

Región espectral de 200-380 nm Región espectral de 0.7 - 300um Región espectral de 380 – 780nm

M Absortividad molar cm ó Coeficiente de extinción molar o molecular Absortividad de una solución11 Mol/L, en 1 cm espesor cm M La relación matemática entre A y concentración:

A

A = a.b.c =

log 100 por 100 de T

A

1

A= 2 – log % T

Los espectrofotómetros reportan sus resultados en absorbancia (luz absorbida por las partículas de la solución) y transmitancia ( luz absorbida) A %T 2 0 1.0 10 0.5 31 0.25 56 0.125 75 0.06 87 0 100

La absorbancia o Densidad aplicada se expresa en valores semilogarítmicos y la trasmitancia en valores alfanuméricos. EXPERIMENTO N° 2 La práctica consiste en preparar soluciones de concentración creciente de un colorante azul de Metileno y leer sus D.O. y %T. Procedimiento.-

N° tubo ml. Azul de Metileno:2 mg% ml. Agua destilada ml. muestra problema % Transmitancia Calcular Absorbancia Calcular mg % de Azul de Metileno

1 2 8 -

2 4 6 -

3 6 4 -

4 8 2 -

5 10 -

6 8.5 1.5

Mezclar.

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Leer el % de Transmitancia a 540 nm , colocando a 0 con agua destilada.

INFORME DE LA PRACTICA N° 3 Nombre del Alumno:--------------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: ---------------------------------Fecha:
------------------------------

CURVA DE CALIBRACION

A

%T

Concentración 1) 2) 3) 4)
5) 5)

Concentración

Haciendo uso del espectrofotómetro registrar las A o D.O. de cada muestra y/o problema. Calcular los mg% de azul de metileno en cada uno de los tubos.(diluciones) Graficar en papel milimetrado : concentración vs A. Comentar. Resultados. Graficar en papel semilogarítmico : concentración vs % T. Comentar. Resultados. Calcular el Factor de Calibración. Calcular la concentración de una muestra problema haciendo uso del F.C. y curva de calibración.

---------------------------------------------

Firma del Alumno

--------------------------------------

Firma del Profesor

-----------

Nota

4FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Las enzimas son proteínas que intervienen en las reacciones bioquímicas, acelerando la velocidad de la reacción hasta su punto de equilibrio.

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ACTIVIDAD ENZIMATICA Es la capacidad de una enzima de acelerar Se puede expresar de diversas maneras: (a) Desaparición de un sustrato (b) Formación de producto (c) Modificación de cofactores

una reacción química. (S) (P) (C)

K1
E+S ES c'

K2
E+P e''

K3
E+S c' Diversos factores modifican la actividad enzimática: 1. pH 2. Concentración de la enzima 3. Concentración del sustrato 4. Tiempo de incubación 5. Temperatura 6. Inhibidores y activadores. Para la práctica buscamos el efecto de la pepsina, enzima proteica, sobre la albúmina. La mayor actividad enzimática se demostrará por desaparición del sustrato (menor turbidez de la albúmina por su transformación en aminoácidos). EXPERIENCIA NRO. 1 EFECTO DEL pH Cada enzima tiene un pH óptimo de trabajo. Para demostrar el pH óptimo de la pepsina , trabajaremos con 6 tubos de acuerdo al siguiente esquema: TUBO Nro. 1 2 3 4 5 6 B PH 1.0 1.5 6.0 9.5 11.5 Albúmina : ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 HCl 1N : ml 2.0 0.5 CO3Na2 10% : ml 0.5 2.0 Agua dest. : ml 1.5 2.0 1.5 5.0 Pepsina 1% : ml 20 Incubar los Tubos del 1 al 6 a 37°C x 5’ Añadir rápidamente del tubo N°6; 3ml de pepsina a los tubos N° 1,2,3,4 y 5. Mezclar, incubar 37° x 5' Leer D.O en el espectrofotómetro a 420nm de los tubos N°1,2,3,4 y 5 y el tubo Blanco(B). Llevando a cero el instrumento con un blanco de agua destilada. Restar la lectura del tubo Blanco(B) menos la lectura de cada uno de los 5 tubos. La diferencia será asumida como actividad enzimática. EXPERIENCIA NRO. 2 EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA Demostrar que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a [E]cuando la concentración del S es constante. Preparar el experimento de acuerdo al siguiente esquema: TUBO Nro. Albúmina : ml HCl 1N : ml Agua dest. : ml Pepsina 1% : ml B 5.0 0.5 4.5 1 5.0 0.5 4.0 2 5.0 0.5 3.5 3 5.0 0.5 2.5 4 5.0 0.5 1.5 5 E+P e''

10.0

Incubar los Tubos a 37°C x 5'. Añadir la pepsina del tubo 6 a los tubos 1 al 4 según el sgte. esquema: TUBO Nro.1 B 1 2 3 4 Pepsina incubada 0.0 0.5 1.0 2.0 3.0 Mezclar, incubar a 37°C x 5'.Detener la reacción colocando los tubos en baño de hielo. Leer las D.O en el espectrofotómetro a 420nm. Llevando a cero el instrumento con un blanco de agua destilada. La diferencia de las absorbancias entre el tubo Blanco y la lecturas de los otros tubos nos indicará la actividad enzimáticca para cada tubo.| EXPERIENCIA NRO. 3 EFECTO DE LA T°

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El incremento de la temperatura acelera la velocidad de las reacciones químicas por un aumento en nùmero de colisiones efectivas entre los elementos reaccionantes, sin embargo todo incremento de temperatura por encima de la velocidad máxima de reacción, produce una desnaturalización progresiva de la enzima. Para la experiencia, prepararemos 2 series de 5 tubos cada una. Serie N°1 TUBO Nro.(1° serie) Albúmina : ml HCl 1N : ml Agua dest. : ml Serie N°2 TUBO Nro.(2° serie) Pepsina 1% : ml 1b 1.0 2b 1.0 3b 1.0 4b 1.0 5b 1.0 1a 5.0 0.5 3.5 2a 5.0 0.5 3.5 3a 5.0 0.5 3.5 4a 5.0 0.5 3.5 5ª 5.0 0.5 3.5 Blanco 5.0 4.0

Incubar por 5´los tubos de acuerdo al siguiente esquema de temperaturas: TUBO Nro. 1a-1b 2a-2b 3a-3b 4a-4b 5a 5b T°.C° 0°C T°amb 37° 70° 37° 100° Agregar el contenido de los tubos 1b,2b,3b,4b y 5b a sus respectivos tubos 1a,2a,3a,4a y 5a . Luego incubar a las T° correspondientes 0°C, T°amb, 37°C, 70°C y 100°C a cada tubo por 5 minutos. Colocar los tubos en baño de agua helada para detener la reacción. Leer D.O. en el espectrofotómetro a 420nm. Llevando a cero el instrumento con un blanco de agua destilada. La actividad enzimática se encontrará restando la lectura del tubo blanco (B) menos la lectura de los otros 5 tubos. EXPERIENCIA NRO. 4 EFECTOS DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO Si aumentamos progresivamente la concentración del sustrato, aumentaremos la velocidad enzimática (velocidad inicial) hasta un punto en que la velocidad llega a una meseta y no se modificará aunque sigamos aumentando el sustrato (saturación). Preparar 8 tubos de acuerdo al siguiente esquema: TUBO Nro. Albúmina : ml HCl 1N : ml Agua dest. : ml Pepsina 1% : ml 1 1.0 0.5 8.0 2 2.0 0.5 7.0 3 3.0 0.5 6.0 4 4.0 0.5 5.0 5 5.0 0.5 4.0 6 6.0 0.5 3.0 7 7.0 0.5 2.0 8 5.0

Mezclar. Leer los tubos 1,2,3,4,5,6,7. Considerar las absorbancias como lectura inicial. Luego incubar los 8 tubos a 37° x 5'. Añadir 0.5ml de pepsina a cada tubo (del tubo 8 a los tubos 1,2,3,4,5,6 y7)Mezclar. Incubar 5' a 37°C. Detener la reacción en un baño de hielo. Leer D.O en el espectrofotómetro a 420 nm. Considerar las absorbancias como lectura final. Hacer la diferencia: Actividad Enzimática = Lectura Inicial – Lectura Final El resultado de ésta diferencia se considerará como actividad Enzimática.

INFORME DE LA PRACTICA N° 4 Nombre del Alumno:---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

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Grupo: --------------------------------EFECTO DEL pH Act. Enz.

Fecha:

------------------------------------

›pH Comentario:____________________________________ _________________________________________ EFECTO DE LA T° Act. Enz.

›T° Comentario:____________________________________ ___________________________

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EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA Act. Enz.

EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO Act. Enz.

[E] Comentario:_______________________________________________ __________________________ [S] Comentario:_______________________________________________ ________________

5DIGESTION ENZIMATICA DEL ALMIDON

INTRODUCCION El almidón es un polímero de glucosa y se caracteriza por dar un color azul con una solución de yodo. Esta constituido por amilosa (15-20%) y amilopeptina (80-85%) ambos constituyentes son hidrolizadas por la alfa-amilasa salival y pancreática produciendo maltotriosa, maltosa y dextrinas. La presencia de azúcares reductores se identifican por la formación de Cu2O en presencia del reactivo de Benedict. OBJETIVO a) b) c) Determinar la acción de la amilasa sobre el almidón. Determinar sustratos y productos producidos por acción de la amilasa salival. Efecto del pH sobre la amilasa salival.

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON (DIGESTION) Haciendo uso de cuatro tubos, seguir el siguiente esquema:
TUBO Nº ALMIDON 1%; ml BUFFER FOSFATO pH 6.8:ml HCL O,3N : ml CL Na 0,9%: ml Agua dest.:ml Amilasa Salival: ml 1 2.0 1.0 3.0 Baño María 37º x 5´ 2 2.0 1.0 2.4 0.6 3 2.0 1.0 2.4 0.6 4 2.0 3.4 0.6

Mezclar, Incubar en Baño María 37°C x 20’ DETERMINACION EL SUSTRATO
TUBOS Nº DIGERIDO DEL TUBO DIGERIDO DEL TUBO DIGERIDO DEL TUBO DIGERIDO DEL TUBO H CL 0.05N : ml Sol. de Lugol: ml 1: 2: 3: 4: ml ml ml ml 5 0.5 5 0.5 6 0.5 5 0.5 7 0.5 5 0.5 8 0.5 5 0.5

Mezclar, reposar 15´: Observar los resultados DETERMINACION DEL PRODUCTO
TUBOS DIGERIDO DEL TUBO 1: ml DIGERIDO DEL TUBO 2: ml DIGERIDO DEL TUBO 3: ml DIGERIDO DEL TUBO 4: ml SOLUCION DE GLUCOSA 1%: ml SOLUCION BENEDICT : ml 9 0.5 2 10 0.5 2 11 0.5 2 12 0.5 2 13 0.5 2

Mezclar, Incubar en Baño María a 100°C x 5’ Enfriar en agua helada e interpretar.

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INFORME DE LA PRACTICA N° 5

Nombre del Alumno:------------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: -------------------------RESULTADOS: A.- Determinación del sustrato: Tubo Nº 1 ...........................................................................Interprete el resultado……………………………........... Tubo Nº 2 .......................................................................... Interprete el resultado……………………………........... Tubo Nº 3 .......................................................................... Interprete el resultado……………………………........... Tubo Nº 4......................................................................... Interprete el resultado……………………………............. Fecha:
----------------------------

B.- Determinación del producto: Tubo Nº 1 ........................................................................ Interprete el resultado……………………………........... Tubo Nº 2 ......................................................................... Interprete el resultado……………………………........... Tubo Nº 3 .......................................................................... Interprete el resultado……………………………........... Tubo Nº 4 .......................................................................... Interprete el resultado……………………………........... • • Explique, cuales son las condiciones óptimas para una hidrólisis del sustrato almidón soluble. Interprete la reacción de Benedict.

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Nota

6
PRUEBA DE TOLERANCIA DE LA GLUCOSA La prueba de tolerancia a la glucosa (TTG) es empleada para evaluar pacientes en quienes se sospechan anormalidades del metabolismo de los carbohidratos. Esto es particularmente útil para la diabetes mellitus. La prueba de tolerancia a la glucosa por vía oral es más funcional , más confiable y más fácil de llevar a cabo que la prueba de tolerancia a la glucosa por vía intravenosa. La secreción de insulina como respuesta a la administración de glucosa es mayor debido a la estimulación de la secreción de hormonas entéricas, las cuales a su vez estimulan la secreción de insulina. OBJETIVO: 1 2 3 Determinar la concentración de glucosa sérica basal ( 0' ) y a los 30', 60', 90' y 120' después de una sobrecarga oral de glucosa ( 75 g ). Determinar el umbral renal de reabsorción de glucosa Presencia de Cuerpos Cetónicos

DETERMINACION DE GLUCOSA SERICA: La glucosa oxidasa cataliza la oxidación de la glucosa de acuerdo con la siguiente ecuación:

Glucosa
H O

Acido glucónico
HO O

δ -gluconolactona
O

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C O2, H2O H HO C C OH H Glucosa-oxidasa H H C C H2C OH OH OH H2O2 H H H HO

C C C OH H H HO

C C C OH H O

C C H2C

OH OH OH

H H

C C H2C

OH

OH

4-aminofenazona (4-aminoantipirina)
H3C

fenol

quinonaimina (coloreada, λ max=505nm)
H3C 2H2O2 4H2O N N CH3

N N

CH3

+
NH2 O

OH peroxidasa
N O O

El peróxido de hidrógeno formado reacciona con 4 amino-antipirina y fenol en presencia de peroxidasa, formando una quinonaimina coloreada, la cual es directamente proporcional a la concentración de glucosa en sangre. EXPERIMENTO 1 Determinar la concentración de glucosa sérica siguiendo el siguiente esquema: N° Tubo ST. Glucosa: 150 mg | dl: (ul) Suero : 0' (ul) 30' (ul) 60' (ul) 90' (ul) 120' (ul) Reactivo de glucosa: ml 1 2.5 2 25 2.5 3 25 2.5 4 25 2.5 5 25 2.5 6 25 2.5 7 25 2.5

1.
2.

Mezclar. Incubar 37° C x 10' o 20 minutos a T° ambiente Leer D.O. en el espectrofotómetro a 505 nm, frente al BL

CALCULO.-

Haciendo uso del factor de calibración expresar la glucosa en mg/dl

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VN EXPERIMENTO 2

=

70 - 110 mg/dl

Para determinar la presencia de glucosa en orina, seguir el siguiente esquema:

Tubo N° Orina React. Benedict.

1 0.5 2.0

1.
2.

Mezclar. Colocar a 100° C x 5'. Enfriar ( hielo). Observar la formación de precipitado.

INFORME PRACTICA N° 6 Nombre del Alumno:-----------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: -----------------------------------------------------------------Fecha:
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CURVA DEL T.T.G.

Glucosa mg | dl

Tiempo : minutos I. II.
III. Graficar mg/dl de glucosa vs tiempo (min) de un sujeto normal y un diabético. Correlacionar la curva y reabsorción renal. Comentario la presencia o ausencia de Cu2O en la orina correspondiente, con su tasa máxima de

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Nota DIABETICA

7ACIDOSIS

El sujeto diabético se caracteriza por presentar alteración del metabolismo de los carbohidratos, proteínas y de los lípidos. La lipólisis produce una elevación de los ácidos grasos libres y consecuentemente el incremento de cuerpos cetónicos. La cetonemia ocasiona una disminución del pH sanguíneo lo cual ocasiona una disminución de la concentración del HCO3sanguíneo. ( acidosis diabética) DETERMINACIÓN DEL BICARBONATO FUNDAMENTO: El CO3H sérico o plasmático es neutralizado con HCl desprende CO2. El ácido que no reacciona se determina a través de una titulación con NaOH, obteniéndose por diferencia la concentración de HCO3PROCEDIMIENTO Se usa suero o plasma obtenido en anaerobiosis , empleando aceite mineral en el momento de su obtención. NEUTRALIZACION DEL BICARBONATO Colocar en un beacker o matraz los siguientes componentes: a) 5 ml de HCl 0.01N b) 1 ml de suero ó plasma c) 1 gota de alcohol caprílico. d) Agitar suavemente por rotación por 2’ e) Incubar 15’ a 37°C f) Añadir 20 ml agua destilada hervida y fría. g) Añadir 3 gotas del colorante fenosulfonthaleina(PSP). TITULACION Usando una bureta, agregar solución de NaOH 0.01 N hasta que el color del colorante cambie de color amarillo(ph 6.8) al rosado(ph 8.2) EXPRESION Calcular los m Eq/L del sujeto normal y compararla con un sujeto diabético descompensado VN= 26-32 m Eq/L CETONURIA FUNDAMENTO La presencia de cuerpos cetónicos se determina por el test de Rothera, frente al reactivo de nitroprusiato de Na forma un anillo púrpura rojizo. PROCEDIMIENTO En un tubo de prueba colocar a) 1 ml orina b) 1 gr de SO4(NH4)2 c) 3 gotas de nitroprusiato de Na al 10% d) Mezclar e) 1 ml de NH4 (OH) en zona Observar: Aparición de un anillo púrpura o morado = (+)

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INFORME DE PRACTICA N. 7 Nombre del alumno ...................................................................................... Grupo .............................................. DETERMINACIÓN DE BICARBONATO

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a) Calcule los mEq/L de HCO-3 del sujeto normal b) Calcule los mEq/L de HCO-3 del sujeto D.M. c) Compare e interprete los resultados.

DETERMINACION DE CETONURIA COMENTARIO a) b) Describa las sustancias que dan el anillo rojo-violaceo. Correlacione la cifra de HCO-3 con la cetonuria del diabético y pH sanguíneo.

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Nota

8PERFIL LIPIDICO Y RIESGO CORONARIO
La enfermedad cardiaca coronaria ( E.C.C.) sigue siendo la principal causa de morbilidad prematura. Un factor de riesgo importante es el incremento del colesterol plasmático. Sin embrago el colesterol por si mismo no es un elemento de predicción en el paciente individual. Otros parámetros lipídicos como el HDL y triglicérido también son necesarios para cuantificar el riesgo de ECC con mayor precisión . Aplicando la formula de Fridewald podemos calcular las otras lipoproteínas séricas VLDL y LDL que completan la información de predicción de alteración vascular. OBJETIVO a) b) Determinar la concentración de colesterol total ,triglicérido , HDL, LDL y VLDL. Determinar el RC a través del perfil lipídico ( según Castelli )

DETERMINACION DE COLESTEROL TOTAL Fundamento El colesterol se determina por acción de la enzima colesterol éster hidrolasa y colesterol oxidasa. La primera libera el colesterol de los esteres de colesterol, y la segunda oxida el colesterol libre produciéndose peróxido de hidrogeno, el cual en presencia de la enzima peroxidasa reacciona con el sistema cromogénico dando origen a un compuesto coloreado que absorbe 505nm. Colesterol ester Colesterol 2H2O2 + O2 PAP CEH CHOD Colesterol + ácidos grasos

Colest-4-en-3-ona + H2O2 Comp. Coloreado + 4H2O

+ 4-AAP + p-HBA

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Tubo N° St-Colesterol: 200 mg/dl Suero –Pb Reactivo Color

Blanco 3.0 ml

Standard 30 ul 3.0 ml

Muestra 1 30 ul 3.0 ml

Muestra 2 30 ul 3.0 ml

Mezclar. Incubar 10 minutos a 37°C o 20 minutos a T°ambiente Leer en espectrofotómetro el St y Pb frente al BL a 505 nm. Expresión Haciendo uso del factor de Calibración, expresar el colesterol en mg/dl : VN = 160 - 200 mg / dl DETERMINACION DE TRIGLICERIDOS Fundamento Los triglicéridos presentes en la muestra, según las reacciones acopladas descritas a continuación, son un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometría. Triglicéridos + H20 Glicerol + ATP Glicerol – 3 – fosfato + O2 2H2O2 + 4-aminoantipirina + 4-clorofenol lipasa Glicerol-Kinasa GPO Peroxidasa Glicerol + ácidos grasos Glicerol-3-P + ADP Dihidroxiacetona fosfato + H2O2 Quinonaimina

Esquema Tubo N° St-Triglicérido: 200 mg| dl Suero -Pb Reactivo Color Blanco 3.0 ml Standard 30 ul 3.0 ml Muestra 1 30 ul 3.0 ml Muestra 2 30 ul 3.0 ml

Agitar. Incubar 10 minutos a 37°C o 20 minutos a T° ambiente Leer en espectrofotómetro el St y Pb frente al BL a 520 nm.

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Expresión Haciendo uso del factor de Calibración, expresar los triglicéridos en mg/dl : VN = 60 - 200 mg / dl

DETERMINACION DE COLESTEROL - HDL Fundamento del Método El HDL - Colesterol es obtenido precipitando selectivamente las lipopotreínas LDL y VLDL, quedando el primero en solución. El HDL - Colesterol en solución se determina por acción de las enzimas Colesterol ester hidrolasa y Colesterol oxidasa. La primera libera el colesterol de los ésteres de colesterol, y la segunda oxida el colesterol libre, produciéndose peróxido de hidrógeno, el cual en presencia de la enzima peroxidasa reacciona con el sistema cromogénico dando origen a un compuesto coloreado que absorbe a 505 nm. Colesterol ester Colesterol +O2 2H2O2 + 4-AAP + p-HBA CHOD PAP CEH Colesterol + ácidos grasos Colest-4-en-3-ona + H202 Comp. Coloreado + 4H2O

Técnica de Precipitación: Agregar en un tubo de centrífuga 0.5 ml de reactivo precipitante y 0.2 ml de muestra, mezclar y esperar 15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar 15 minutos a 3000 r.p.m. o 3 minutos a 10.000 r.p.m Colorimetría.LLevar el reactivo colesterol CHOD- PAP a la temperatura que se realizara el ensayo. Tubo N° Sobrenadante (ml) Standard (ml) Reactivo (ml) Blanco 3.00 Standard 0.03 3.00 Muestra 1 0.30 3.00 Muestra 2 0.30 3.00

Mezclar e incubar 10 minutos a 37° o 20 minutos a temperatura ambiente (20 a 25° C). Leer las absorbancias a 505 nm. llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco del reactivo. El color resultante es estable por lo menos 30 minutos. Cálculos.HDL-Colesterol : (mg%)=F.D. x D.O. Pb FD =76.5/D.O standard Ecuación de Friedewald:

LDL-C (mg/dl)=C.Tot.(mg/dl)-HDL(mg/dl)-VLDL. (mg/dl) •
VLDL (mg/dl) = TG 5

Esta fórmula es válida cuando los Tg son menores de 400 mg/dl.

Observaciones Después de centrifugar, el sobrenadante debe ser claro.

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-

Sueros con concentraciones de triglicéridos superior a 1000 (mg/dl) deben diluirse con suero fisiológico antes de precipitar. El resultado obtenido se multiplica por el factor de dilución.

Interpretación del Perfil Lipídico Mínimo

LIPIDO (mg/dl) CT LDL HDL : Hom : Muj TG :

DESEABLE < 200 < 130 > 35 > 45 < 200

RIESGO POTENCIAL 200-239 130-159 25-35 40-45 > 200

ALTO RIESGO >= 240 >= 160 < 25 < 40 > 200 (*)

(*) Si se acompaña de HDL < 35 mg/dl o relación CT/HDL >5

INFORME PRACTICA N° 8 Nombre del Alumno:-------------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: ----------------------------------------------------------------------A. Fecha:
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Calcular , en el sujeto normal y patológico , la concentración en mg/ dl del : CT TG HDL LDL VLDL : : : : :

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B.

Calcular el R. C.: CT/HDL LDL/HDL : :

C.

Comentario

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Firma del Profesor 9ICTERICIA E HIPERBILIRRUBINEMIA

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Nota

Las alteraciones del Metabolismo de la bilirrubina pueden evaluarse haciendo su dosaje en suero o plasma sanguíneo en forma fraccionada. Dichas alteraciones se deben a: 1. - Aumento de la producción del pigmento (hemólisis: incremento de la destrucción de los hematíes circulantes) 2. - Disminución de la captación hepática de la bilirrubina (medicamentosa, síndrome de Gilbert, déficit de glucoronil transferasa). 3. -Alteración de la conjugación hepática, disminución de la actividad de la glucoronil transferasa – ictericia neonatal (ictericia fisiológica del recién nacido). 4. - Excreción deficiente (obstrucción intrahepática o extrahepática – cálculos). Por último permite el estudio de las enfermedades hepatocelulares: hepatitis o cirrosis, enfermedades en las cuales suelen estar interferidas todos los pasos del metabolismo de la bilirrubina (captación conjugada y excreción). Método de Malloy y Evelyn Fundamento: La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico diazotado produciendo un pigmento color rojo – violáceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimétricamente a 530 nm. Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite su reacción. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción. VALORES NORMALES: BT = 0.3 – 1.1 mg/dl BD (Conjugada) = 0.1 – 0.4 mg/dl BI = 0.2 – 0.7 mg/dl PROCEDIMIENTO: Preparar St. 2mg% .D.O. st =0.09 Muestra Agua Destilada Desarrollador Reactivo sulfanílico Diazorreactivo Blanco 200 ul 2.4 ml 200 ul Directa 200 ul 2.4 ml 200 ul Total 200 ul 2.4 ml 200 ul

Mezclar por inversión suave e Incubar por 5 minutos a T° ambiente. Leer las absorbancias a 530nm, llevando a cero el instrumento con un blanco de agua destilada. La bilirrubina directa debe leerse exactamente a los 2 minutos.. CALCULOS: FC = Conc. St Abs St.

BT = FC x (Abs Total – Abs Blanco) = mg/dl BD = FC x (Abs Directa – Abs Blanco) = mg/dl

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BI = BT – BD = mg/dl INFORME PRACTICA N° 9 Nombre del Alumno:

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Grupo: ----------------------------------------------------------------------1. DETERMINACION DE BILIRRUBINA DIRECTA E INDIRECTA: •

Fecha:

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Fundamento de la Bilirrubina Directa y Bilirrubina Indirecta

Cálculo: Determine los mg/dl de Bilirrubina Total, Bilirrubina Directa y Bilirrubina Indirecta en cada sujeto.

Interpretación: Correlacione los valores de Bilirrubina con el urobilinógeno y urobilinas fecales y urinarios.

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Firma del Alumno

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Firma del Profesor

Nota

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10TRANSAMINACIÓN
La reacción de transaminación consiste en la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un cetoácido con la consiguiente formación de nuevos aminoácidos y cetoácidos. El objetivo es entender como el organismo a través de este proceso los carbohidratos se transforman en aminoácidos o como los aminoácidos se interconvierten. Las enzimas que catalizan estas reacciones se llaman transaminasas, que tienen como coenzima al fosfato de piridoxal (B6). La glutámico pirúvico y oxal- acético son de importancia en el diagnóstico de enfermedades hepáticas y cardiacas toda vez que se produce aumento en el torrente circulatorio tras la muerte celular del órgano. COOH | CH2 | CH2 | CH-NH2 | Ac. Glutámico COOH GLUTAMICO PO4B6 COOH | CH2 | CH2 | C=O | COOH Ac. Cetoglutarato

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COOH | CH2 | C=O | Ac. Oxalacético COOH

OXALACETICA

COOH | CH2 | C=NH2 | COOH Ac. Aspártico

1)

REACCION DE TRANSAMINACION

Para demostrar la reacción de la transaminación, se extraerá la enzima de homogenizado de hígado de pollo y se aplicará a el siguiente esquema :
Tubo N° 1 CETOGLUTARATO ALANINA PIRUVATO GLUTAMATO ARSENITO ENZIMA ACTIVA ENZIMA INACTIVA 0.2 M (ml) 0.2 M (ml) 0.2 M (ml) 0.2 M (ml) 0.2 M (ml) 1 0.3 0.3 ----0.4 0 1 2 0.3 0.3 ----0.4 1 0 3 ----0.3 0.3 0.4 0 1 4 ----0.3 0.3 0.4 1 0

0.2 M (ml) 0.2 M (ml)

Incubar a 37° x 45min . Agregar 6 ml. alcohol etílico en cada tubo centrifugar y usar los sobrenadantes para la cromatografía. Demostrar si hubo transaminación, utilizando el proceso de cromatografía ascendente. 2) EVIDENCIA DE LA TRANSAMINACION POR CROMATOGRAFIA: Cromatografía ascendente en placas con Silicagel: Por cromatografía en capa fina se entiende la técnica capaz de separar los componentes de una muestra entre dos fases, una móvil, que suele ser líquida y otra estacionaria, que puede ser líquida o sólida, y que está dispuesta como una capa de material poroso de un espesor determinado, colocada sobre un soporte plano inerte, de vidrio o de aluminio. Dos principios fisico-químicos participan en esta separación: partición por solvente y adsorción. Los aminoácidos Alanina, Ac. Aspártico, y Ac. Glutámico, se van a separar en función de sus diferentes solubilidades entre la fase móvil líquida, constituida por propanol:agua (80/20), y la fase estacionaria, también líquida al estar constituida por el agua adsorbida por el material sólido de la capa fina, en este caso celulosa. Por tanto, el fundamento de la separación implica que los aminoácidos cuya cadena lateral (R) tenga un carácter más apolar, tendrán tendencia a desplazarse con la fase móvil, mientras que los aminoácidos que sean polares, ya sean con carga o sin carga, serán retenidos por la fase estacionaria. Ello es así, porque la fase móvil está formada por solventes que son más apolares que el agua, que es el solvente de la fase estacionaria. 2. ¿Cómo realizar una cromatografía en capa fina? Primera etapa: Aplicación de las muestras a analizar.

Se coloca la placa encima de la mesa, y con un lápiz se traza una línea muy débil a unos 1,5 cm del borde inferior de la placa, procurando dañar lo mínimo posible la capa de celulosa y sin tocar la superficie de celulosa.

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En la línea se señalan débilmente cuatro puntos, distribuidos equitativamente a lo ancho de la placa. En cada punto de ellos se aplica cada uno de los muestras: patrón o standares y las muestras problemas con probable transaminación. La aplicación se realiza mediante capilares. La segunda precaución a considerar es la de no contaminar las disoluciones de los aminoácidos patrón y la muestra problema. Para ello, se utiliza un capilar para cada uno de las soluciones a aplicar. El capilar se introduce en el tubo de muestra y por capilaridad va a ascender la muestra a aplicar. Se aplica en la placa una gota de la muestra, procurando que se extienda lo menos posible y no dañe la capa. Se seca a continuación con el secador de aire. Se aplica una segunda gota y se vuelve a secar. Esta operación se repite para cada unas de las tres muestras restantes. Segunda etapa: Elución de las muestras. La cromatografía se realiza en la cubeta o cámara de desarrollo. La cubeta contiene un volumen de fase móvil, cuya altura de líquido debe de estar siempre por debajo de la línea de aplicación de las muestras.

La técnica de elución que se va a utilizar para la realización de la cromatografía es la ascendente, puesto que la fase móvil asciende por capilaridad por los poros e intersticios de la celulosa. La placa que contiene las muestras se introduce en la cubeta. Se coloca la tapa de la cubeta y se espera que la fase móvil ascienda por la capa hasta que alcance una altura de hasta unos 2-3 cm del extremo opuesto a la parte sumergida. Una vez realizada la elución, se abre la tapa de la cubeta y se saca la placa.

Tercera etapa: Secado y visualización de los aminoácidos.

Inmediatamente que se ha sacado la placa, con el lápiz se marca en un borde el nivel alcanzado. Se introduce en la estufa durante unos 5 min para que se seque. A continuación, con ayuda de un pulverizador se rosea por toda la placa el revelador Solución de ninhidrina 0.1% en butanol. Secar nuevamente y observe la visualización de los aminoácidos patrón y de la muestra problema que se realiza por la aparición de unas manchas de color púrpura, reacción específica del reactivo con los aminoácidos.

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Calcular los valores del Rf. Rf = distancia (cm) recorridos por la sustancia distancia (cm) recorridos por el solvente INFORME PRACTICA N° 10

Nombre del Alumno:

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Grupo: -----------------------------------------------------------------------

Fecha:

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TRANSAMINACIÓN: Haciendo uso de fórmulas químicas, explique el proceso de transaminación hecha en clase.

Medidas de los Rf e identificación de aminoácidos.

Discusión y/o comentarios

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Firma del Alumno

Firma del Profesor

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Nota

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