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Guia de Microbiologia

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

Dr. Nicanor Domínguez Navarrete Coordinador del curso

AÑO 2009

Alumno: .........................................................

URP. Facultad de Medicina

INSTRUCCIONES GENERALES 1.- Recomendaciones Las personas que tienen que desarrollar alguna actividad dentro de un laboratorio manipulando materiales biológicos, tejidos o microorganismos, deben observan un comportamiento denominado “Normas de Bioseguridad”, que son un conjunto de disposiciones orientadas a proteger la salud y evitar la contaminación de las personas. La contención primaria es la protección del personal y del medio ambiente inmediato contra la exposición de agentes infecciosos, lo que se logra con el manejo de buena técnica microbiológica, el uso apropiado de equipos de seguridad y la prevención con vacunas. La contención secundaria se refiere a reducir la exposición del personal del laboratorio y de otras personas a agentes potencialmente peligrosos y prevenir el escape de éstos al exterior. a.- Usar mandil de mangas largas, que cubra la ropa de vestir b.- No está permitido comer, beber, fumar ni aplicarse cosméticos. c.- Desarrollar el hábito de mantener las manos lejos de la boca, nariz, ojos y cara, para evitar la autoinoculación. d.- Utilizar guantes cuando se manipulan líquidos orgánicos. e.- Sobre la mesa de trabajo sólo se podrá ubicar el cuaderno de notas. f.- Disponer siempre de un bocal con desinfectante (Fenol al 5 %) para descartar el material de vidrio reusable. g.- Al finalizar los trabajos prácticos, lavarse las manos con jabón. 2.- Manejo del microscopio En microbiología el manejo del microscopio es de gran ayuda para el reconocimiento de los microorganismos. En preparaciones “en fresco” se utilizan los objetivos secos de 10X ó 40X y en preparaciones “coloreadas” el objetivo de inmersión de 100X, el cual necesita de aceite de cedro en la interfase objetivo–portaobjeto. Después de usar el microscopio debe hacerse una limpieza con alcohol isopropílico. 3.- Manipulación de cultivos Los cultivos bacterianos deben ser tratados con el mayor cuidado, para evitar tanto la contaminación del operador como la de los cultivos mismos, recomendando: a.- Trabajar siempre frente a la llama de un mechero b.- Mantener los tubos en posición vertical y tapados c.- Colocar las placas petri en posición invertida, para evitar que el agua de condensación contamine la superficie y mantenerlas cerradas. d.- Eliminar los portaobjetos y laminillas en soluciones desinfectantes. e.- El asa de siembra debe ser esterilizada antes y después de su uso f.- Todos los cultivos deben tener las anotaciones siguientes: nombre del germen, nombre del alumno, número de mesa y fecha. g.- En caso de accidente durante el trabajo, avisar al profesor.

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GUIA DE PRACTICAS SEMANA Primera Segunda Tercera Cuarta Quinta Sexta Sétima Octava Novena Décima Onceava Doceava Treceava Catorceava Quinceava Dieciseisava --Clase I Introducción.Tema 05 Clase II Temas 01,02, 03,04 Temas 06 Tema 08 Tema 10 Seminario Temas 11 y 12 Tema 14 Seminario Temas 18, 19 y 21 Temas 20 y 27 Examen Seminario Protocolo III Seminario Tema 31 Examen

Tema 07 Tema 09 Examen Protocolo I Protocolo II Temas 15 y 16 Tema 17 Temas 23 y 27 Examen Temas 24 y 25 Tema 26 Seminario Temas 29 y 30 Examen

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TEMA 01 : EXAMEN EN FRESCO Introducción: El examen en fresco tiene por finalidad apreciar el tamaño de las bacterias, que es del orden de la micra (milésima de milímetro), su relación con las células humanas y algunas características de interés para su identificación, como la movilidad o presencia de cápsula. Este estudio se realiza mientras las bacterias se encuentran viables, en cultivos líquidos jóvenes (menos de 18 horas de incubación) o en muestras biológicas recién obtenidas. Materiales: Suspensión de mezcla de bacterias, levaduras y hematíes Láminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos Suero fisiológico (ClNa 8.5 %o) en gotero Asa de siembra o microgotero Procedimiento: Tomar dos a tres asadas o una microgota de la mezcla bacteriana y depositarla en un Porta objetos. Cubrir la preparación con un cubreobjetos. Observar al microscopio, utilizando objetivo de 40 X Resultados: Anotar la proporción del tamaño de las células humanas y las bacterias. Apreciar el tipo de movimiento bacteriano: vibratorio, polar o peritrico.

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TEMA 02 : OBSERVACIÓN DE CAPSULA Introducción: Algunos microorganismos tienen la capacidad de producir una estructura que rodea a la bacteria, denominada “cápsula”, que le otorga un factor de virulencia al germen, ya que impide la fagocitosis. Esta estructura se puede observar con facilidad en forma indirecta utilizando tinta china, que no penetra en las bacterias capsuladas, dejando un halo transparente alrededor del microorganismo. Materiales: 1. Suspensión de cultivo de Criptococcus n. 2. Solución de tinta china 3. Láminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos Procedimiento: 1. Depositar una microgota o asada de tinta china sobre un portaobjetos. 2. Depositar muy junto a la anterior una microgota o asada de la suspensión del cultivo de Criptococcus. 3. Seguidamente colocar una laminilla cubreobjetos sobre ambas muestras, de tal manera que se junten y obtener una gradiente de la mezcla. 4. Observar al microscopio con objetivo de 40 X Resultados: Registrar las levaduras redondeadas o gemadas de los Criptococcus, y el halo transparente que los rodea en un fondo oscuro proporcionado por las partículas de tinta china.

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TEMA 03 : COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO Introducción: La coloración de las bacterias permite estudiar la morfología (bacilar, redondeada o espirilar) y las diferentes agrupaciones de ellas (pares, tetradas, racimos, cadenas), características que son útiles para su identificación. Los colorantes con radical ácido coloreado (eosina, fucsina ácida, azul de anilina y fluoresceína) colorean el protoplasma de las células. En cambio los colorantes con radical básico coloreado (azul de metileno, violeta de genciana, fucsina básica, safranina) tiñen el núcleo de las células. La célula bacteriana es rica en ácido nucleico, el que se combina con colorantes básicos. Los colorantes ácidos no tiñen a las células bacterianas, son usados como contraste. Para proceder a colorear a las bacterias es necesario hacer un “frotis”, que es el resultado de depositar la muestra sobre un portaobjetos y fijarla con calor suave. Cuando el material es líquido se deposita una microgota o asada y cuando es sólido (agar) se debe realizar una suspensión ligera de la colonia en solución salina y luego fijarla. Se denomina coloración simple cuando se emplea un sólo colorante y compuesta cuando se emplean varios colorantes. Materiales: 1. Suspensión de mezcla bacteriana 2. Láminas portaobjetos 3. Asa de siembra 4. Solución de colorante Azul de metileno 5. Microscopio con objetivo de inmersión Procedimiento: 1. Preparar un frotis a partir de la mezcla bacteriana. Fijarlo con calor suave 2. Cubrir la preparación con Azul de Metileno y dejarlo actuar durante 10 minutos 3. Lavar la preparación con agua corriente. Secar la lámina con calor suave 4. Observar al microscopio con objetivo 100x, añadiendo una pequeña gota de aceite de inmersión. Resultados : Hacer esquema de las diversas formas bacterianas y agrupaciones observadas.

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TEMA 04 : COLORACIÓN DE VAGO Introducción: Las espiroquetas no toman con facilidad los colorantes usados con frecuencia en microbiología. Para colorearlas se emplean las técnicas de Giemsa o impregnación argéntica. Una técnica sencilla es la de Vago, que se describe. Materiales: 1. Mondadientes 2. Solución de Mercuro cromo al 2 % ( mertiolate coloreado ) 3. Solución de Violeta de Genciana al 1 % 4. Láminas portaobjetos. Procedimiento: 1. Con la ayuda de un mondadientes obtener una muestra de sarro dental y hacer un frotis. 2. Dejar secar al ambiente. Cubrir con mercuro cromo y dejar actuar durante 3 minutos 3. Lavar con agua corriente. Cubrir con Violeta de Genciana y dejar actuar durante 3 minutos. 4. Lavar con agua corriente y secar. 5. Observar al microcopio con objetivo de inmersión. Resultados: Hacer esquema de las diversas morfologías especial las fusiformes y espirilares. bacterianas observadas, buscar en

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OBSERVACIÓN DE ESPORAS: Algunos grupos bacterianos, como el Clostridium, tienen la capacidad de formar esporas, estructura que le otorga resistencia y supervivencia en condiciones ambientales adversas (temperatura, nutricionales, etc.). Observaremos frotices de heces de pacientes con diarrea, coloreados con Gram.

CUESTIONARIO: 1. ¿Qué bacterias poseen cápsula y cuál es su función?. Procedimientos para observarla. 2. Señale los tipos de movilidad bacteriana y su relación a la posición de los flagelos. 3. Esquematice las diferentes agrupaciones de los cocos. 4. Las espiroquetas, ¿a que géneros agrupa? 5. ¿De qué color se tiñeron las espora y qué ubicación tuvieron?. DESARROLLO

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TEMA 05 : COLORACIÓN DE GRAM Introducción: Es la coloración mas empleada en bacteriología, puesto que permite agrupar a las bacterias en dos categorías, las Gram Positivas que son las que retienen el colorante violeta de genciana y las Gram Negativas que pierden el colorante primario por acción del decolorante, para luego teñirse con un colorante básico de contraste (rojo). Esta coloración tiene relación con la composición química de la pared y se describen varias modificaciones. Materiales: 1. Suspensión de mezcla bacteriana 2. Juego de colorantes para Gram : a. Violeta de Genciana al 1 % b. Solución de Yodo c. Decolorante : alcohol-acetona al 50% d. Fucsina básica al 0.1 % 3. Láminas portaobjetos Procedimiento: 1. Hacer un frotis a partir de la mezcla bacteriana. Fijarla con calor suave. 2. Cubrir la lámina con violeta de genciana. Dejar actuar por 30 segundos 3. Lavar con agua. Cubrir con solución Yodo. Dejar actuar por 30 segundos 4. Decolorar con Alcohol-Acetona haciendo movimientos de vaiven durante diez segundos 5. Lavar con agua. Cubrir con solución de Fucsina. Dejar actuar durante 30 segundos 6. Lavar la lámina con agua y Secar. 7. Observar al microscopio con objetivo de inmersión. Resultados: Hacer esquema de la morfología y coloración de las bacterias. Las Gram positivas se tiñen de color azul violeta y las Gram negativas de color rojo.

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TEMA 06 : COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN Introducción: Algunos grupos bacterianos poseen un elevado contenido de lípidos en su estructura, que impide tomar los colorantes en soluciones acuosas. Las Mycobacterias y las Nocardias tienen ésta propiedad. La coloración de Ziehl-Neelsen utiliza fucsina con fenol y la ayuda del calor para que el colorante penetre en la pared celular. Como decolorante emplea una mezcla de alcohol con ácido clorhídrico. Luego las bacterias que retienen el colorante se les denomina ácido alcohol resistentes. Coloración útil para el diagnóstico de enfermedades como la tuberculosis y la lepra. Materiales: 1. Juego de colorantes para Ziehl-Neelsen a. Solución de Fucsina fenicada b. Solución de alcohol-ácido al 3 % c. Solución de Azul de metileno 5% d. Mechero de alcohol 2. Muestra de esputo Procedimiento: 1. Hacer un frotis a partir de la muestra de esputo. Fijarlo al calor suave. 2. Colocar el portaobjetos con frotis sobre un soporte en el lavatorio 3. Cubrir la lámina con colorante Fucsina fenicada 4. Con la ayuda del mechero de alcohol, calentar suavemente la preparación hasta que se desprendan vapores, retirar la llama y repetir por tres veces éste procedimiento. El colorante NO debe hervir ni secarse. 5. Eliminar el colorante y lavar la lámina con agua. 6. Decolorar con alcohol-ácido, cubriendo la preparación y hacer movimientos de vaiven durante 15 a 30 segundos, hasta que no se desprenda colorante. 7. Lavar con agua y cubrir la lámina con solución Azul de metileno. Dejar actuar durante 10 minutos. 8. Lavar con agua Secar. 9. Observar al microscopio con objetivo de inmersión Resultados: Hacer esquema de las estructuras celulares observadas de color azul y resaltar los bacilos ácido resistentes de color rojo con morfología característica.

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CUESTIONARIO: 1. Desarrolle el fundamento de la coloración de Gram 2. Señale cuatro géneros bacterianos Gram positivos y cuatro Gram negativos 3. Qué bacterias no toman la coloración de Gram? 4. Señale las diferencias entre la coloración de Gram y de Ziehl Neelsen? 5. Describa usted la morfología del bacilo tuberculoso observado: DESARROLLO

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TEMA 07 : METODOS DE ESTUDIO DE LAS BACTERIAS Introducción: Las bacterias son capaces de desarrollar en medios inertes provistos de sustancias nutritivas como compuestos nitrogenados, inorgánicos, energéticos, concentración apropiada de hidrogeniones, humedad, condiciones ambientales de temperatura, oxígeno, anhídrido carbónico, etc. De acuerdo a la consistencia los medios de cultivo se agrupan en líquidos, sólidos y semisólidos. Los medios líquidos se emplean como enriquecimiento para incrementar la población bacteriana y el desarrollo se observa por turbidez. En cambio el medio de cultivo sólido se obtiene añadiendo el compuesto “agar”, que a temperatura de 50º C mantiene la consistencia líquida y se dispensa en placas petri, que luego a temperatura ambiente se solidifica. Estas se utilizan para separar las bacterias y obtener colonias, cuyas características son propias de cada género bacteriano. Según la necesidad de oxígeno las bacterias pueden ser Aerobias estrictas que desarrollan sólo en presencia de oxígeno, Anaerobias facultativas que crecen en presencia o ausencia de oxígeno, Anaerobias estrictas que crecen sólo en ausencia de oxígeno y las Microaerófilas que desarrollan en tensiones bajas de oxígeno. Técnica de siembra: es el procedimiento por el cual se pone en contacto el microorganismo con el medio de cultivo, para que en condiciones óptimas de nutrición, temperatura y tiempo pueda desarrollarse la bacteria in vitro. El dispositivo empleado se denomina “asa de siembra”, “asa de platino” o “asa de Kolle” y se usan diversos métodos: puntura, estría, agotamiento, etc. Metabolismo bacteriano: Los microorganismos realizan diversas reacciones bioquímicas para su crecimiento. Algunas de estas reacciones corresponden a sistemas enzimáticos codificados por genes cromosómicos, que permite la identificación del género o especie bacteriano. Otras veces excretan compuestos, enzimas o toxinas, que son dañinos para el organismo humano y amerita demostrar su presencia, para identificar la especie patógena. La ubicación de un grupo bacteriano como Familia, Género o Especie depende en gran medida de la capacidad metabólica frente a sustratos definidos (marcadores) y la formación de compuestos químicos intermediarios específicos. A éste estudio se denomina “biotipo” bacteriano. En la práctica se demostrará algunas reacciones bioquímicas: Utilización del carbohidrato lactosa, la bacteria lo transforma en ácido pirúvico, que acidifica el medio, cambio de pH que puede ser demostrado a su vez, por cambio de color a amarillo del indicador Rojo de fenol.

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Utilización del aminoácido triptofano, produciendo ácido pirúvico, amoníaco, y otros metabolitos como Indol, éste último se demuestra su presencia porque reacciona con el p-dimetilamino benzaldehido originando un compuesto de color rojo soluble en alcohol amílico. Producción de toxinas: algunas bacterias elaboran enzimas o sustancias que destruyen células, cemento intercelular o alteran la coagulación, acciones que favorecen la virulencia. La actividad hemolítica se puede demostrar in vitro, añadiendo sangre al medio de cultivo, observando halos de hemólisis alrededor de las colonias.

Materiales: 1. Placas petri con cultivos de Bacillus subtilis, Escherichia coli y Staphylococcus 2. Tubos con medio de cultivo líquido de Staphylococcus sp. y Bacillus subtilis. 3. Tubos con medio semisólido sembrados por puntura con Escherichia coli y Pseudomona . 4. Tubos con Lactosa e indicador, sembrado con Escherichia coli y Pseudomonas 5. Tubos con caldo peptonado (triptofano) sembrados con Escherichia coli y Pseudomonas 6. Placas petri sembradas con bacteria hemolítica 7. Láminas portaobjetos 8. Juego de colorantes para Gram Procedimiento: 1. Observar y registrar las características de las colonias desarrolladas en los medios de cultivo sólidos: formación de colonia 2. Tamaño: medido en milímetros. Forma: circular, elíptica, puntiforme, filamentosa. Superficie: lisa, rugosa, granular. Elevación: plana, convexa, umbilicada. Borde: entero, ondulado, dentado, filamentoso. Consistencia: cremosa, membranosa, mucosa. Cromogénesis: amarillo, rojo, verde, negro 3. Seleccionar dos o tres colonias diferentes, preparar un frotis de ellas y colorearlas con Gram. Observar al microscopio con objetivo de inmersión. 4. Observar las características del desarrollo en los medios líquidos: turbidez, sedimento, presencia de nata. 5. Observar las características del desarrollo en los medios semi sólidos: turbidez uniforme (aero anaeróbico facultativo), turbidez sólo en superficie (aerobio) o sólo en el fondo (anaerobio) 6. Observar el cambio de color en el medio con lactosa 7. Añadir al caldo peptonado, gotas de reactivo Erlich o Kovac, apreciar el cambio de color 8. Observar las placas de agar sangre y apreciar la ausencia de hematíes en el área circundante a las colonias.

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Resultados: 1. Describir las colonias observadas. COLONIA Tamaño Forma Superficie Elevación Borde Consistencia Cromogénesis 2. Observar la movilidad en agar blando BACILLUS ESCHERICHIA STAPHYLOCOCCUS

3. Observar el metabolismo de Lactosa y Triptofano

4. Observar el desarrollo de una bacteria aerobia, Una anaerobia y otra anaerobia facultativa en medios semisólidos.

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5. Observar la hemólisis en el medio agar con sangre.

CUESTIONARIO: 1. Para agrupar a las bacterias por el biotipo, qué procedimiento debo seguir? 2. ¿Qué interés tiene para el campo médico evaluar la capacidad de una bacteria en producir enzimas, toxinas o metabolizar determinado sustrato? 3. ¿Cuál es la finalidad de conocer las características de una colonia bacteriana? 4. Defina usted el concepto de colonia bacteriana. 5. Describa usted su concepto de una medio de cultivo (características y utilidad) DESARROLLO

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TEMA 08 :

ESTERILIZACIÓN:

AGENTES FÍSICOS

Introducción: El término esterilización implica un procedimiento por el cual un material determinado queda libre de microorganismos. El comportamiento de los microorganismos frente a diversos agentes físicos es variable, en algunas condiciones puede estimular la multiplicación bacteriana, en otros inactiva su metabolismo e incluso logra destruirlos. Este último efecto es utilizado para obtener la esterilización de instrumentos médicos y material biológico. El calor seco (horno) necesita temperaturas de 180 oC durante 60 minutos de exposición para obtener esterilidad. El calor húmedo (baño maría hirviendo) necesita periodos superiores a 20 minutos para destruir a las bacterias. El calor húmedo a presión (autoclave) es el procedimiento de esterilización más confiable. A una presión de 15 libras por pulgada cuadrada se obtiene 121 oC de temperatura, que por un periodo de 15 minutos se consigue la esterilización total, libre de bacterias patógenas o no, esporuladas e incluso de virus. Radiaciones ultravioleta. Son radiaciones de una longitud de onda de 300 nm que tienen propiedad bactericida cuando actúan directamente sobre las bacterias y se le emplean en ambientes quirúrgicos, cubículos de laboratorio, para eliminar las bacterias suspendidas en el aire. Filtración. Demostración de filtro de Chamberland (porcelana) y Millipore (sintético). Materiales: 1. Suspensión de un cultivo de Staphylococcus sp, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Pseudomonas sp. 2. Placas petri con Agar nutritivo 3. Dispositivo para calentar agua hasta hervir 4. Lámpara de mercurio que emite radiaciones UV 5. Asas de siembra Procedimiento: A: CALOR HÚMEDO

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1. Calentar agua hasta hervir 2. Dividir la placa petri con agar nutritivo en cuatro partes y rotular con: 0, 1, 5, y 10. que son los tiempos de exposición. 3. Tomar de la suspensión bacteriana una asada y sembrar en la placa petri con Agar, en el área marcada con “0”, que será el control de viabilidad de la bacteria y de referencia. 4. Colocar la suspensión bacteriana en el baño maría hirviendo durante 1 minutos, seguidamente sembrar una asada en la zona rotulada con “1” 5. Volver a colocar la suspensión bacteriana en el baño maría hirviendo y completar el tiempo de exposición de 5 minutos. Luego sembrar una asada en la zona rotulada con “5”

6. Volver a colocar la suspensión bacteriana en el baño maria hirviendo hasta completar el tiempo de 10 minutos. Luego sembrar una asada en la zona de la placa rotulada con “10” 7. Incubar la placa petri a 37 oC durante 24 – 48 horas Resultados: La presencia de colonias indica desarrollo bacteriano (viabilidad). Las zonas marcadas con “0”, son los controles de viabilidad, donde siempre debe haber desarrollo. Registrar el desarrollo bacteriano (presencia de colonias): a) Escaso ó 1+ (menos de 10 colonias). b) Moderado ó 2+ (10 a 50 colonias) c) Abundante ó 3+ (colonias incontables)

Tiempo de STAPHYLOexposición a 100ºC COCCUS Cero minutos

BACILLUS SUBTILIS

ESCHERICHIA COLI

1 minuto

5 minutos

10 minutos Anotar el número de colonias presentes en cada area

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B. RADIACIONES ULTRA VIOLETA 1. Con una asa de platino humedecida en la suspensión bacteriana de Pseudomonas sp. sembrar por agotamiento toda la superficie del agar. 2. Llevar la placa sembrada al cubículo que tiene una lámpara de mercurio (UV) 3. Destapar la placa y exponerla a las radiaciones, pero cubrir la mitad de la superficie sembrada con un papel. Dejar en exposición durante 10 minutos 4. Retirar la placa del cubículo, rotularla e incubarla a 37 ºC durante 24 – 48 horas. Resultados: A. Leer las placas de cultivo, la presencia de colonias indica desarrollo bacteriano (viabilidad), en cambio la ausencia de colonias es expresión de muerte bacteriana. B. Observar y hacer un esquema de la presencia de colonias en la zona expuesta las radiaciones UV y la zona cubierta con el papel.

Comentarios de los resultados obtenidos en la presente práctica:

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TEMA 09 : ACCION DE AGENTES QUÍMICOS Introducción: Numerosos compuestos químicos inorgánicos como orgánicos son tóxicos para los microorganismos. Los agentes químicos que destruyen gérmenes patógenos suelen denominarse “desinfectantes” y a los que se aplican tópicamente se les denomina “antisépticos”. El efecto biológico de éstos agentes puede ser bactericida o bacteriostático. En la práctica se demostrará comparativamente la actividad de los compuestos químicos mas empleados en medicina. Materiales: 1. Suspensión bacteriana de Staphylococcus sp y Escherichia coli 2. Solución de desinfectante Mertiolate, Aseptil rojo y Alcohol 70º, (5 ml cada uno) 3. Placas petri con Agar nutritivo, divididas en cuatro areas. Una para cada bacteria. 4. Pipetas Pasteur estériles ( goteros ) Procedimiento: 1. Dividir la placa petri con Agar en cuatro areas : Control, Mertiolate , Aseptil Rojo y Alcohol 2. Con la ayuda de un gotero depositar una gota de la suspensión bacteriana en la zona marcada con “C” control de viabilidad 3. A cada solución de desinfectante, añadirle 5 gotas de la suspensión bacteriana. Dejar actuar durante 10 minutos. 4. Seguidamente tomar una gota de cada mezcla y depositarla en la superficie del agar rotuladas con “M”, “AR”y “A”, respectivamente. 5. Esperar unos minutos hasta que el inóculo se seque e incubar la placa a 37 oC durante 24 a 48 horas. Resultados: Registrar el desarrollo bacteriano por la formación de colonias.

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Comparar el desarrollo y número de colonias de la zona de control con los de la mezcla con desinfectantes.

Microorganismo: Staphylococcus sp CONTROL ASEPTIL ROJO MERTIOLATE ALCOHOL

Microorganismo: Escherichia coli CONTROL ASEPTIL ROJO MERTIOLATE ALCOHOL

Comentario ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------EVALUAR CONCENTRACIÓN EXPOSICIÓN DEL ANTISÉPTICO Y TIEMPO DE

1. Utilizar el Mertiolate: Concentrado, Diluido 1/5, 1/25 y 1/125 2. 4 Tubos que contienen 4 ml de la solución de Mertiolate (concentrado y diluidos) 3. Añadir 05.ml de un cultivo de 18 horas de incubación (Escherichia coli o Staphylococcus sp) 4. Luego de 1 minuto, 5 minutos y 10 minutos de exposición, sembrar una asada a tubos con caldo nutritivo respectivamente. (12 tubos) 5. Incubar a 37 ºC durante 24 a 48 horas. Observar turbidez (desarrollo bacteriano) Resultados:

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Concentrado 1 minuto 5 minutos 10 minutos Comentario ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TEMA 10 : ACCION DE AGENTES QUIMIOTERAPICOS ANTIBIOGRAMA Introducción: La actividad de los antibióticos y quimioterápicos debe ser evaluada “in vitro” para obtener la información que permita decir si un microorganismo es susceptible o resistente a determinado producto. La determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC) nos proporciona la dosis mínima necesaria del quimioterápico para impedir el desarrollo bacteriano, lo que permite hacer estudios de uso clínico y detectar mutantes resistentes. Dos son los procedimientos empleados para conocer ésta información, el método del tubo dilución y el del disco difusión en agar, a éste último se le denomina “antibiograma”. Método del Tubo dilución: Materiales: 1. Se presenta una gradilla con diez tubos en los que se han realizado diluciones sucesivas al medio, a partir de una solución de antibiótico con 200 microgramos, obteniendo concentraciones decrecientes de 100 – 50 – 25 – 12,5 – 6,25 – 3.12 – 1.56 – 0.78 – y 0.39 mcg/ml. El último tubo no contiene antibiótico, es control de viabilidad de la bacteria en estudio. A cada tubo se ha añadido 0.5 ml de un cultivo de 18 horas de la bacteria en estudio. Toda la gradilla de tubos ha sido incubada a 37 oC durante 24 horas. Lectura: Dilucido 1/5 Diluido 1/25 Diluido 1/125

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1. Leer el desarrollo bacteriano como turbidez, por lo tanto resistencia bacteriana al quimioterápico. 2. Los tubos que permanecen transparentes indican ausencia de desarrollo, luego susceptibilidad bacteriana al quimioterápico. 3. Iniciar la lectura por el tubo que contiene mayor concentración de quimioterápico 4. El último tubo transparente (ausencia de desarrollo) representa la dilución de quimioterápico denominada MIC 5. El útimo tubo, que no contiene quimioterápico, debe estar siempre turbio, control de viabilidad bacteriana. Resultados: Hacer esquema de lo observado Tubo Concentración de antibiótico MIC 1
100

2 50

3 25

4

5

6

7

8

9

10

12.5 6.25 3.12

1.56 0.78

0.39 ----

Método de Disco difusión en agar: Materiales: 1. Placas petri con Agar Mueller Hinton 2. Suspensión bacteriana a probar, con turbidez 4 de escala Mac Farland.(100,000/ml) 3. Hisopo de algodón estéril. 4. Discos de papel de filtro embebidos en antibióticos: Penicilina (P), Ampicilina (AM), Cefalotina (CF), Ceftriaxona (CTX), Sulfatrimetoprim (SXT), Kanamicina (K), Amikacina (AK), Nitrofuranos (FD), Acido nalidíxico (AN), etc. Procedimiento: 1. Humedecer el hisopo estéril en la suspensión bacteriana. 2. Frotar el hisopo en la superficie del agar Mueller Hinton en forma radiada, de tal manera que toda la superficie reciba el inóculo uniformemente. 3. Con la ayuda de una pinza, depositar los discos con antibióticos en la superficie del agar, con una separación superior a 2 cm. 4. Incubar el cultivo a 37 oC durante 24 horas. Lectura: 1. El desarrollo bacteriano se lee por la presencia de colonias. 2. Observar alrededor de los discos la formación de halos transparentes sin desarrollo bacteriano, indica que la bacteria es sensible a dicho producto. 3. El diámetro de los halos de ausencia de desarrollo deben ser medidos y llevados a la tabla de Bauer y Kirby para catalogar los resultados.

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Resultados: Hacer esquema de lo observado

Tabla de Bauer y Kirby:

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Quimioterápico Concentración del disco mcg Ampicilina AM 10 Amikacina AK 30 Ac nalidíxico AN 30 Cefalotina CF 30 Cefoxitina CTX 30 Ceftriaxona CRO 30 Cloranfenicol C 30 Kanamicina K 30 Nitrofuranos FD 300 SulfatrimetoprimSXT 231 Ciprofloxacina CIP 5 Tetraciclina T 30 Halo de inhibición de desarrollo Resistente Intermedio Sensible - 13 14 – 16 + 17 - 15 16 – 16 + 17 - 13 14 - 18 + 19 - 14 15 – 17 + 18 - 15 16 – 20 + 21 - 13 14 – 20 + 21 - 14 15 – 17 + 18 - 13 14 – 17 + 18 - 14 15 – 16 + 17 - 10 11 – 15 + 16 - 15 16 – 20 + 21 - 14 15 – 18 + 19

CUESTIONARIO: 1. Cuál es el procedimiento y temperatura conveniente para esterilizar los medios de cultivo? 2. Al esterilizar en baño de maría hirviendo, ¿Cuál es la duda de la esterilidad? 3. Enuncie el concepto de MIC y cual es la utilidad? 4. Señale los factores que pueden alterar el resultado en un antibiograma. 5. En la práctica dónde se utilizan las radiaciones ultravioletas? DESARROLLO

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PROTOCOLO I. :

CULTIVO DE EXUADO NASAL (1)

Materiales: • Hisopo de algodón de 6 pulgadas, estéril • Placas petri con Agar sangre y agar hipertónico (1)

Procedimiento: • Se tomará a un alumno muestra de exudado nasal, para lo cual el profesor hará la demostración respectiva. • Frotar (siembra) el hisopo en un tercio de la superficie de los medios de cultivo, luego con ayuda del asa de platino concluir la siembra por agotamiento. • Rotular e incubar a 37ºC durante 48 horas. Interpretación: • En el medio Hipertónico, selectivo para el desarrollo del Staphylococcus, seleccionar colonias y:

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A partir de ellas hacer un frotis y colorearlo con Gram, observar al microscopio. o Sobre un portaobjetos, ponerlas en contacto con una gota de Agua oxigenada. Apreciar la formación de burbujas por la actividad de la catalasa. o Seleccionar las colonias que han cambiado de color a amarillo (metabolismo del manitol) y sembrarlas en plasma humano, para detectar la producción de la enzima coagulasa. (incubar 37ºC x 24 horas. En el agar sangre, seleccionar colonias pequeñas aplanadas con alfa hemólisis, a partir de las cuales hacer frotices para colorear con Gram, en busca de diplococos lanceolados Gram positivos en cadenas cortas. Correspondientes a neumococo.
o

TEMA 11 : STAPHYLOCOCCUS Introducción: Este microorganismo se encuentra muy distribuido en la naturaleza y forma parte de la flora normal del hombre. La especie Staphylococcus aureus es causante de diversos procesos infecciosos como la forunculosis, impétigo, abscesos, intoxicaciones alimentarias, etc. Las características que permiten identificar al Género son la morfología de cocos agrupados en racimos, que se tiñen como Gram positivos, en los cultivos desarrollan en medios hipertónicos y producen una potente enzima catalasa. Estudiaremos las especies de interés médico: aureus, saprophyticus y epidermidis Materales: 1. Cultivo de Staphylococcus en caldo nutritivo 2. Cultivo de Stph.. aureus en medio hipertónico con manitol (MH) y Agar nutritivo con disco de Novobiocina. 3. Cultivo de Stph. epidermidis en medio hipertónico con manitos (MH) y Agar nutritivo con disco de Novobiocina 4. Cultivo de Stph. saprophyticus en medio hipertónico con manitol (MH) y Agar nutritivo con disco de Novobiocina. 5 Plasma humano diluido al 50 % 6. Agua oxigenada 30 vol.

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7. Juego de colorantes para Gram. Procedimiento: 1. Observar el desarrollo del Staphylococcus en caldo con turbidez uniforme. Hacer un frotis y colorearlo con Gram. 2. Observar las características de las colonias de las tres especies de Staphylococcus desarrolladas en medio hipertónico y apreciar el metabolismo del manitol. 3. Observar el comportamiento de las tres especies frente a la Novobiocina. 4. Depositar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos. Con el asa de siembra tomar una pequeña colonia de Staphylococcus y ponerla en contacto con el agua oxigenada, apreciar la formación de burbujas, por acción de la enzima catalasa. 5. Depositar 1 ml de plasma en tubo pequeño. Con el asa de siembra tomar una pequeña colonia del cultivo y depositarla en el plasma. Incubar a 37 oC durante 2 horas. Observar la formación de coágulo por acción de la enzima coagulasa. Proceder por separado con cada especie bacteriana.

Resultados: Registrar las observaciones

Caldo

Gram

Coagulasa

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Medio Hipertónico con manitol

Agar nutritivo y Novobiocina

PROTOCOLO II. CULTIVO DE EXUDADO FARINGEO Materiales: • Hispo de algodón de 6 pulgadas, estéril • Tubo con 15 ml de agar nutritivo licuado (50ºC) (1) • Frasco con 5 ml de caldo nutritivo estéril (1) • Tubo con 1.0 ml de sangre estéril • Placa de petri estéril

(1)

(1) (1)

Procedimiento: • Se tomará a un alumno muestra de exudado faríngeo, para lo cual deberá abrir la boca y pronunciar la letra “A”, para exponer la zona faringo- amigdaliana. • Con la ayuda del hisopo frotar la zona expuesta y luego depositar el hispo en el frasco con 5 ml de caldo

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nutritivo, rotarlo enérgicamente (muestra). Desechar el hispo. • Retirar del baño maría el tubo con agar licuado, añadirle dos “asadas” de la muestra. Taparlo y rotarlo entre las manos. • Inmediatamente añadir 1.0 ml de sangre al tubo con agar licuado y muestra. Taparlo. Rotarlo enérgicamente entre las manos, hasta la homogenización. • En condiciones adecuadas (junto al mechero, sin hablar ni toser, etc.), destapar la placa de petri vacía estéril y verter en ella el agar licuado con sangre y muestra. Tapar y esperar que se solidifique. • Rotular e Incubar a 37ºC durante 48 horas. Interpretación: • Observar el desarrollo de colonias dentro de agar. • Buscar las colonias aisladas, describirlas y apreciar el comportamiento con la sangre, si hay hemólisis total (beta) o parcial (alfa). Hacer uso del microscopio estereoscópico.

TEMA 12 : STREPTOCOCCUS Introducción: Este género comprende un grupo numeroso de microorganismos, muchos viven como comensales, algunos son patógenos para el hombre, como el pyógenes, agalactiae, pneumoniae. Producen infecciones focales como faringitis, impétigo, endocarditis, escarlatina, neumonía, meningitis, otitis y síndromes posinfecciosos como la cardiopatía reumática y la glomerulo nefritis aguda. Estos microorganismos son cocos esféricos o lanceolados que se orientan en cadenas o pares, Gram positivos. La clasificación mas práctica es la basada en el tipo de hemólisis que se produce en la placa con agar sangre. El St. pyógenes produce hemolisina tipo beta o total y es sensible a la bacitracina

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El St viridans produce hemólisis tipo alfa o parcial, El St pneuminae también produce hemólisis tipo alfa, pero es formador de cápsula y sensible a la etilhidrocupreina (optochin) El Enterococo tiene la capacidad de desarrollar en medio salino (6.5 % de Cl Na) Materiales: 1. Cultivo de Streptococcus sp.en caldo nutritivo 2. Cultivo de Streptococcus pyógenes en agar sangre , con disco de bacitracina 3. Cultivo de Streptococcus viridans en agar sangre con disco de optochin 4. Cultivo de Streptococcus pneumoniae en agar sangre con disco de optochin 5. Cultivo de Enterococcus en agar sangre y caldo salino 6. Juego de colorantes para Gram Procedimiento: 1. Observar la característica de desarrollo del Streptococcus en caldo nutritivo, con formación de sedimento y transparencia en el sobrenadante Mezclar el tubo y hacer un frotis, colorearlo con Gram 2. Observar las placas de agar sangre, estudiar las características de las colonias y su comportamiento con la sangre. Tipo de hemólisis alrededor de ellas. 3. Observar el comportamiento de cada especie bacteriana frente a la bacitracina y el optochin 4. Apreciar el desarrollo uniforme del Enterococcus en el caldo salino.

Resultados: Registrar lo observado

Caldo nutritivo Streptococcus

Gram

Caldo salino Enterococcus

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St beta pneumo St beta

Enterococo

St viridans

St

TEMA 13 : CORYNEBACTERIUM Introducción: El Corynebacterium diphtheriae es la única especie patógena de éste grupo, su rol patógeno está íntimamente relacionado con la producción de exotoxina y la transmisión es inter-humana. Hay varias especies saprofitas. Son microorganismos de forma bacilar, pleomórfica, que se agrupan en “letras chinas”, Gram positivas. Desarrollan con facilidad en los medios de cultivo que contengan plasma o sangre. Materiales: 1. Frotis de cultivo de Corynebacterium sp para colorear con Gram

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Procedimiento: 1. Colorear los frotices presentados con Gram y observar con lente de inmersión. Apreciar la forma bacilar corta , gruesa y en empalizada 2. Describir las colonias del cultivo en Agar sangre Resultados: Hacer esquema de lo observado en el microscopio

CUESTIONARIO: 1. Señale ocho características principales que aseguran que estamos frente a un Staphylococcus aureus. 2. Qué infecciones produce mas frecuentemente el Staphylococcus saprophyticus? 3. En pacientes con faringo amigdalitis aguda ¿qué finalidad tiene hacer un cultivo de exudado faringeo? Y porqué? 4. En las heces puede haber Streptococcus? 5. Características principales para diagnosticar Streptococcus pneumoniae. DESARROLLO

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PROTOCOLO HECES

III.

:

ESTUDIO BACTERIOLÓGICO DE

Materiales: • Frasco pequeño con suspensión de heces en solución salina (1)

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• •

Láminas portaobjetos (2) Placas de petri conteniendo selectivos: Agar SS. (Buscar composición)

medios de cultivo Agar Mac conkey y (1)

Procedimiento: • Con ayuda del asa de platino hacer un frotis de la suspensión de heces, fijarla al calor y colorearla con Gram. • Observar al microscopio la diversidad bacteriana. Hacer esquema en la guía de prácticas. • Con el asa de platino, sembrar por estría y agotamiento una asada de la suspensión de heces en la superficie de los medios selectivos. • Rotular la placa petri e incubarla a 37ºC durante 48 horas. Interpretación: • En los medios de cultivo utilizados el sustrato base empleado es la Lactosa y el indicador de pH rojo neutro. Luego las colonias de color rojo son aquellas que han metabolizado la lactosa (Escherichia, KJebsiella, Enterobacter , Citrobacter). En cambio las colonias incoloras son las que no han metabolizado la lactosa (Proteus, Salmonella, Shigella). • El medio de SS contiene además hierro, para detectar aquellas bacterias capaces de metabolizar el Azufre de los amnioácidos, (Salmonella, Citrobacter y Proteus), formando sulfuro de hierro que es de color negro, luego las colonias se teñirán de negro. • Se debe seleccionar una colonia aislada para realizar las diversas pruebas metabólicas (TSI, LIA, Citrato, urea, movilidad, etc) para identificar el “biotipo” o género. (DEMOSTRATIVO).

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TEMA 14 : ENTEROBACTERIAS Introducción: Son un grupo de microorganismos que habitan el suelo, agua, materia en descomposición e intestino del hombre y de los animales. La mayoría de las especies son saprofitas y oportunistas, producen infecciones nosocomiales, pero algunas son agentes causales de enfermedades gastrointestinales, la Fiebre tifoidea y la disentería bacilar. Estos gérmenes son bacilos Gram negativos, no esporulados, que desarrollan fácilmente en los medios de cultivo. Todos fermentan la glucosa y poseen una diversidad de enzimas que permite clasificarlos en diferentes géneros de acuerdo al substrato utilizado y al producto terminal del metabolismo. Carecen de la enzima citocromo oxidasa. Para la identificación se emplean estudios del metabolismo (biotipo) e inmunoserológicos (serotipo). Materiales: 1. Suspensión de heces en solución salina 2. Placas petri con medio de Mac Conkey, sembradas con cepas de Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Salmonella y Shigella. 3. Placas petri con medio de SS agar, sembradas con cepas de Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Salmonella y Shigella. 4. Tubos con medios diferenciales: TSI (tres azúcares y hierro), LIA (lisina hierro y agar), Citrato y Urea, todos sembrados con las cepas de Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Salmonella y Shigella. 5. Juego de colorantes para Gram. Procedimiento: 1. Hacer un frotis de la suspensión de heces y colorearlo con Gram. 2. Hacer un frotis de cada una de la cepas presentadas y colorearlo con Gram. 3. Estudiar comparativamente las características de desarrollo de las diversas especies bacterianas en los medios de Mac conkey y agar SS. 4. Estudiar las reacciones bioquímicas, producto del metabolismo bacteriano en los medios diferenciales. TSI
Lactosa y sacarosa ( pico ) Via oxidativa: acidez amarillo Producción de SH2 Color negro (sulfuro de hierro) Glucosa ( fondo ) Via fermentativa: acidez amarillo

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LIA

Via de utilización del aminoácido y producción de H2S Decarboxilación , color lila al fondo alcalinidad de los radicales amina libres Desaminación, color guinda por acidez de los radicales carboxilos libres. No utilización del aminoácido, Incoloro al fondo por ligera acidez del uso de la glucosa

Resultados : Registrar los cambios observados producto de la actividad metabólica de la especie bacteriana. Escherichia coli Mac Conkey SS agar Glucosa Gas Lactosa H2S Desaminación Decarboxi lación Citrato Urea Klebsiella Proteus Salmonella Shigella

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TEMA 15 : CAMPYLOBACTER - HELICOBACTER Introducción: Estos géneros agrupan a microorganismos con forma helicoidal, coma, en “S”, exigentes para desarrollar en medios de cultivo. El Campylobacter se asocia con infecciones intestinales, para su aislamiento se requiere de medios de cultivo selectivos, enriquecidos, e incubados en ambiente con 5% de CO2 y a 42 oC . Otra metodología es hacer uso del lo delgado que el germen y filtrar la muestra por milipore de 0.45 mu. El Helycobacter pylori se asocia con gastritis y úlcera gástrica, para su diagnóstico se debe investigar la producción de ureasa y la morfología típica en biopsias de la mucosa. Materiales : 1. Frotis de heces de lactante, coloreados con Gram y Vagó 2. Corte histológico de mucosa gástrica , coloreados con H-E 3. Cultivo de Campylobacter sp. en Agar sangre. Procedimiento: 1. Observar al microscopio con objetivo de inmersión las láminas presentados. Resultados:

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CUESTIONARIO: 1. Cuál es el sustrato que divide a las enterobacterias en dos categorías? 2. Señale las enterobacterias productoras de SH2, evidenciado por el ennegrecimiento del medio. 3. Señale el agente de úlceras gastro duodenales y la enzima útil para identificarlo 4. ¿Qué ocasiona el Campylobacter jejuni y cómo lo identifica? 5. Qué utilidad tiene el estudiar el metabolismo de la enterobacterias? DESARROLLO

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TEMA 16 : VIBRIOS Introducción: La familia Vibrionaceae comprende tres géneros de importancia médica: Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. Todos son de origen acuático, luego la contaminación humana es consecuencia de la ingesta de alimentos o agua con grandes cantidades de microorganismos. Los agentes patógenos mas importantes son Vibrio cholerae, Vibrio parahemolíticus y Aeromonas. Todos ellos son de forma bacilar o curvada, Gram negativos, con movilidad polar. Desarrollan con facilidad en los medios de cultivo, fermentan glucosa y poseen una potente enzima citocromo oxidasa. Materiales : 1. Cultivo de Vibrio cholerae en caldo tripticase y agar TCBS (sacarosa, bilis, citrato y thisulfato) 2. Cultivo de Vibrio cholerae en medio diferencial de TSI y Agar movilidad 3. Cultivo de Vibrio parahemolíticus en caldo tripticase y agar TCBS 4. Cultivo de Vibrio parahemoliticus en medio diferencial de TSI y Agar movilidad 5. Cultivo de Aeromonas en caldo nutritivo y Agar Mac Conkey 6. Cultivo de Aeromonas en medio diferencial de TSI 7. Reactivo para detectar oxidasa. 8. Juego de colorantes para Gram. Procedimiento: 1. Hacer un frotis de los cultivos en medio líquido, de todas las cepas presentadas, y colorearlos con Gram. Observar con objetivo de inmersión. 2. Observar comparativamente el desarrollo de las cepas presentadas sembradas en Agar TCBS, apreciar el cambio de color por la utilización de la sacarosa. 3. Observar las características de las colonias de las cepas sembradas en agar Mac conkey, apreciar el comportamiento con la lactosa. 4. Observar los cambios en el medio diferencial de TSI, producido por las cepas presentadas. 5. Observar el desarrollo en el trazo de siembra en el medio movilidad. 6. Realizar la reacción de oxidasa de las cepas presentadas.

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Resultados:
Vibrio cholerae Vibrio parahemolitico

Gram

Agar TCBS (sacarosa)

Agar M.Conkey.

Caldo

TSI

Oxidasa Movilidad

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TEMA 17 : BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES Introducción: Con éste término se agrupa a microorganismos de diferentes familias que habitan en el medio ambiente o forman parte de la flora normal del cuerpo. Son patógenos oportunistas, que tienen en común la incapacidad para metabolizar los carbohidratos por vía fermentativa. Incluye a las Pseudomonas, Alcalígenes, Acinetobacter, Cromobacterias, Flavobacterias, etc. En la práctica estudiaremos los mas comunes: Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter sp. Materiales: 1. Cultivo de Pseudomonas aeruginosa en Caldo nutritivo, Agar Mac conkey, Agar nutritivo. 2. Cultivo de Pseudomonas aeruginosa sembrado en medio TSI y Agar movilidad 3. Cultivo de Acinetobacter en Caldo nutritivo, Agar Mac conkey y Agar nutritivo 4. Cultivo de Acinetobacter en medio TSI y Agar movilidad 5. Reactivo para reacción de oxidasa 6. Juego de colorantes para Gram Procedimiento: 1. Observar el desarrollo en superficie de la Pseudomonas a. en caldo nutritivo. 2. Hacer frotis a partir del caldo con Pseudomonas y colorearlo con Gram 3. Estudiar comparativamente las colonias de Pseudomonas y Acinetobacter en los medios de Mac Conkey y Agar nutrtivo. Apreciar formación de pigmento verde que difunde en el medio de Agar nutrtivo sembrado con Pseudomonas. 4. Observar el comportamiento de ambas cepas en el medio de TSI ( desarrollo sólo en superficie ) y en el medio movilidad 5. Realizar la reacción para Oxidasa. Resultados:
Pseudomonas Acinetobacter

Gram Caldo Nutritivo Agar M.Conkey Agar Nutrititvo T.S.I.

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CUESTIONARIO: 1. De los vibrios estudiados, ¿cuál es de origen marino y cómo lo diferencia del otro? 2. Para infectarme con cólera ¿cuál es la dosis mínima infectante? 3. Señale las bacterias productoras de citocromo exidasa. 4. Describa las características de cultivo de la Pseudomonas útiles para su diagnóstico 5. ¿Qué utilidad tiene estudiar Acinetobacter? DESARROLLO

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TEMA 18 : LISTERIA Introducción: La Listeria monocitógenes, especie bacteriana saprofita, habita en los vegetales y en el intestino de los animales. La infección humana está relacionada a la ingesta de alimentos y a la contaminación de los genitales femeninos, con riesgo en la gestante y producir sepsis neonatal, en adultos inmunocomprometidos puede producir meningitis. La identificación se orienta por la morfología bacilar corta, Gram positivo, desarrolla en Agar sangre produciendo una discreta hemólisis. Lo más característico es la capacidad de desarrollar a bajas temperaturas y poseer movilidad sólo a 22 oC Materiales: 1. Frotis de cultivo de Listeria m, para colorear con Gram. 2. Cultivo de Listeria m. en Agar angre 3. Cultivo de Listeria m. en Agar blando movilidad, incubado a 22 oC y a 37 oC Procedimiento: 1. Colorear el frotis con Gram y observar con lente de inmersión. 2. Observar las características de las colonias del cultivo en Agar sangre 3. Observar el desarrollo móvil en agar blando a 22 oC, por la presencia de turbidez en el tercio superior del tubo dando una imagen de paraguas. Resultados: Hacer esquema de lo observado

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TEMA 19 : BRUCELLA Introducción: La brucelosis es una zoonosis. En los animales la infección es sistémica y de localización en los órganos genitales y glándulas mamarias. Produce aborto en animales Este microorganismo tiene cierta especificidad de especie animal, asi Brucella abortus es selectiva para ganado vacuno, Brucella mellitensis para ganado caprino y lanar, Brucella suis para el porcino. El humano se infecta ingiriendo productos lácteos contaminados, luego hace septicemia con localización en el tejido retículo endotelial (hígado, médula ósea y bazo). Este microorganismo es muy pequeño, tipo coco-bacilar, Gram negativo, que desarrolla con lentitud en los medios de cultivo (3 a 7 días) dando colonias características. Materiales: 1. Frotis de cultivo de Brucella mellitensis, para colorear con Gram 2. Hemocultivo en medio bifásico (Ruiz Castañeda) para aislar Brucella 3. Juego de colorantes para Gram 4. Suero de paciente con brucelosis 5. Antígeno de Brucella para aglutinación en lámina Procedimiento: 1. Colorear con Gram el frotis de cultivo. Observarlo al microscopio y apreciar el diminuto tamaño de éste microorganismo. 2. Observar el sistema bifásico para aislar la Brucella a partir de líquidos orgánicos, asi como las características de las colonias. 3. Sobre un portaobjetos depositar una microgota (0.04) del suero del paciente y añadirle una microgota del antígeno. Mezclar por rotación durante 3 minutos, apreciar la presencia de aglutinación (grumos), cuando hay anticuerpos. Resultados: Registrar lo observado

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TEMA 20 : LACTOBACILLUS - VAGINOSIS Introducción: Los Lactobacillus son un grupo de gérmenes saprofitos que tienen la capacidad de producir ácido láctico como producto final del metabolismo de los hidratos de carbono. La especie Lactobacillus acidóphilus habita las vías genitales femeninas (bacilo de Doderlein) y metaboliza el glucógeno manteniendo el pH ácido de la zona vaginal, evitando la sobrecontaminación. Cuando las de pH se modifican hacia la neutralidad se crean condiciones que permiten la proliferación de algunos microorganismos patógenos oportunistas. Un ejemplo típico es el cuadro clínico denominado “vaginosis”, que se inicia con la disminución de la producción estrogénica que condiciona la elevación del pH vaginal hacia la neutralidad, permitiendo la proliferación de microorganismos como Gardnerella, Mobiluncus, etc. Gardnerella, bacilo que colorea variablemente con el Gram, anaerobio facultativo, que invade las células vaginales dando una imagen característica denominada células clave (clu cells). Mobiluncus, bacilo curvado, en hoz, Gram variable, anaerobio. Materiales: 1. Frotis de flujo vaginal normal, coloreado con Gram 2. Frotis de flujo vaginal con vaginosis coloreado con Gram Procedimiento: 1. Observar con objetivo de inmersión el frotis coloreado Resultados: Hacer esquema de lo observado en el microscopio

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TEMA 21 : BARTONELLA Introducción: Siendo el Perú un país endémico de bartonelosis estamos obligados a pensar en ésta enfermedad cuando un paciente proviene de zonas verrucógenas. En la fase hemática el diagnóstico se hace mediante la búsqueda de los microorganismos en los hematíes, por estudios microscópicos de frotices sanguíneos coloreados con Wright o Giemsa , o mediante cultivos incubados a 22 oC. En la fase histioide el diagnóstico es sólo por cultivo, asociado a datos epidemiológicos y características histológicas de la verruga. Materiales: 1. Frotices sanguíneos de pacientes con bartonelosis, coloreados con Wright. Procedimiento: 1. Observar al microscopio con objetivo de inmersión, apreciar la variación del tamaño de los glóbulos rojos (anisocitosis), el diferente tono de color de los hematíes (policromatofilia) y la presencia de microorganismos coco-bacilares dentro de los glóbulos rojos. Resultados:

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CUESTIONARIO: 1. ¿Qué grupo humano es proclive a la listeriosis? 2. ¿Cuáles son las muestras ideales para aislar la Brucella? Y que medio se utiliza? 3. Describa el concepto de vaginosis y agentes condicionantes. 4. ¿A qué se denomina zona verrucógena?. Señale el agente transmisor de B. bacilliformis y de B quintana. 5. Señale las diferentes especies de Brucella y su hospedero. DESARROLLO

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TEMA 22 : BACILLUS Introducción: Este género agrupa a un gran número de especies bacterianas que habitan en el medio ambiente, algunas son utilizadas en el campo de la biotecnología como productoras de antibióticos (polimixina, bacitracina), alcoholes, enzimas y vitaminas. Sólo una especie, el Bacillus anthracis, es causante de enfermedad en humanos y animales, denominado “carbunco”. En la práctica estudiaremos la especie Bacillus subtilis, saprofito contaminante ambiental, para apreciar sus características de bacilo grande, Gram positivo, formador de espora no deformante y que cultiva en condiciones aeróbicas. Materiales: 1. Cultivo de Bacillus subtilis en caldo nutritivo 2. Cultivo de Bacillus subtilis en Agar nutritivo 3. Cultivo de Bacillus subtilis en tubo con Agar blando 4. Juego de colorantes para Gram Procedimiento: 1. Observar las características de desarrollo del B subtilis en la superficie de los medios líquidos y agar blando. 2. Estudiar las características de las colonias en agar nutritivo 3. Hacer un frotis a partir del caldo nutritivo y colorearlo con Gram Resultados: Hacer esquema de lo observado.

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TEMA 23 : CLOSTRIDIUM Introducción: Son microorganismos ampliamente distribuidos en la naturaleza y en el intestino de los animales herbívoros. La infección humana es circunstancial a un trauma, a la ingesta de alimento contaminado y a la presencia de exotoxina específica. Se pueden agrupar en citotóxicos, enterotóxicos y los productores de intoxicaciones específicas como el tétanos y el botulismo. Todos los Clostridium son bacilos, Gram positivos, formadores de esporas que deforman al bacilo y desarrollan en condiciones de anaerobiosis. Materiales: 1. Frotis de secreción de herida gangrenosa coloreada con Gram. 2. Cultivo de Clostridium sp, en medio de thioglicolato y agar semisólido 3. Sistemas para obtener anaerobiosis Procedimiento: 1. Observar con objetivo de inmersión los frotices coloreados, anotar las características de los bacilos. 2. Observar la forma de desarrollo, alejada de la superficie, en el medio de thioglicolato. 3. Evaluar los sistemas para obtener anaerobiosis. Resultados:

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TEMA 24 : NEISSERIAS Introducción: El humano es el único reservorio de género Neisseria, habitan el tracto respiratorio alto y sus mucosas. Dos especies tiene un rol patógeno definido, la Neisseria gonorrhoeae y la Neisseria meningitidis. Las neisserias son cocos Gram negativos que se agrupan en pares, son muy sensibles a las condiciones adversas para su desarrollo en medios de cultivo, requiriendo medios enriquecidos (Tayer Martín) , producen una enzima respiratoria que las identifica , la citocromo oxidasa. Materiales: 1. Frotis de secreción uretral de paciente con Gonorrea, coloreado con Gram y Azul de metileno. 2. Cultivo de Neisseria sp en Agar Tayer Martín, incubado a 37 oC en ambiente con CO2. 3. Reactivo tetrametil para fenil diamino al 1 % para detectar la enzima oxidasa 4. Juego de colorantes para Gram Procedimiento: 1. Observar con objetivo de inmersión los frotices de secreción uretral. Apreciar la forma de diplococo y su ubicación intracelular. 2. Observar las características de las colonias del cultivo de Neisseria 3. Realizar la reacción de oxidasa: tomar una pequeña porción de colonias y ponerla en contacto con el reactivo, observar de inmediato el cambio del color por la oxidación del reactivo. Resultados: Registrar lo observado.

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TEMA 25 : TREPONEMA Introducción: El Treponema pallidum es agente causal de la sífilis o Lues. Es una espiroqueta que no cultiva en medios inertes, luego el estudio de éste microorganismos debe hacerse en base a exámenes microscópicos de la muestra o a la demostración de anticuerpos en sangre. El examen microscópico con condensador de campo oscuro, se realiza a partir de las lesiones dérmicas, en la zona de inoculación, denominados chancro duro (en la primera etapa) y en las formaciones papulosas en toda la piel, denominada roseola (en la segunda etapa). Para la demostración de anticuerpos se dispone de dos categorías de pruebas, las que usan antígeno NO treponémico: VDRL, RPR, Kahn, Wasserman, de gran sensibilidad pero poca especificidad y las que utilizan un treponema como antígeno: Reiter, FTA, ITP, denominadas confirmatorias. Materiales: 1. Suero pacientes con Lues 2. Antígeno no treponémico :VDRL o RPR 3. Láminas portaobjetos. Procedimiento: 1. Depositar una gota (0.05 ml) de suero problema en una lámina o tarjeta. 2. Añadir una gota de antígeno y mezclar por rotación durante 3 minutos 3. Observar la formación de grumos o pérdida de la homogeneidad de la suspensión cuando la reacción es positiva (precipitación) Resultados:

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Negativo

Positivo

CUESTIONARIO: 1. Describa las condiciones para aislar un Clostridium. ¿Cómo lo apreció en la práctica? 2. Si un paciente tiene VDRL positivo 2 diluciones. Dé su opinión y recomendaciones. 3. Si todas la Neisserias (saprofitas y patógenas) morfológicamente son iguales, qué debo hacer para identificar a las especies patógenas? 4. Porqué es tan útil el frotis coloreado con Gram para diagnosticar infección por gonorrea? 5. Qué significa FTA, señale la utilidad. DESARROLLO

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TEMA 26 : MYCOBACTERIUM Introducción: Este género incluye a dos especies patógenas para el hombre, que producen enfermedades de importancia en Salud Pública, son la Tuberculosis y la Lepra. Estos micoorganismos tiñen con una coloración específica, la de Ziehl-Neelsen. El Mycobacterium tuberculosis (bacilo de Koch) desarrolla en medios de cultivo muy nutritivos como el Lowenstein Jensen, Ogawa, Middlebrook y tarda mas de 15 dias en formar colonias. Estas características obligan, a que las muestras que van a ser cultivadas (esputo, contenido gástrico) para aislar Mycobacterium, deban seguir un proceso de homogenización y decontaminación de gérmenes comunes de desarrollo rápido, lo que se consigue añadiendo a la muestra hidróxido de sodio, fosfato trisódico o N acetil cisteina, seguidamente se neutraliza la muestra con ácido hasta obtener un pH de 7.2 . Además del Mycobacterium tuberculosis y bovis se describen los “atípicos”, Runyon los clasifica de acuerdo a la velocidad de desarrollo y formación de pigmento en cuatro grupos: I Desarrollo lento foto cromógenos (Kansasii, simiae), II Desarrollo lento escoto cromógenos (gordonae, scrofulaceum), III Desarrollo lento no cromógeno (avium, térrea) y IV Desarrollo rápido antes de los siete días (fortuitum, smegmatis, phlei) El diagnóstico microscópico de la tuberculosis se realiza mediante la “baciloscopía”, procedimiento de bajo costo, de elevada especificidad y de gran utilidad en el diagnóstico y evolución del tratamiento. Materiales: 1. Frotices de esputo para colorear con Ziehl-Neelsen 2. Cultivo de Mycobacterium tuberculosis en medio Lowenstein Jensen 3. Cultivo de Mycobacterium atípicos en medio Lowenstein Jensen Procedimiento: 1. Colorear los frotices con el método de Ziehl-Neelsen. Observarlos con objetivo de inmersión. 2. Contar los bacilos ácido resistentes observados en 100 campos microscópicos.

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URP. Facultad de Medicina 3. Calificar la lámina de acuerdo a la siguiente tabla : Negativo: no se observan bacilos Positivo 1 + 1 a 10 bacilos en 100 campos observados Positivo 2 + de 10 a 100 bacilos en 100 campos observados Positivo 3 + mas de 100 bacilos en 100 campos observados. 4. Registrar las características de las colonias del Mycobacterium tuberculosis 5. Registrar las carácterísticas de las colonias de los Mycobacterium atípicos

Resultados: BACILOSCOPIA :

CULTIVOS: Revisar el fundamento de la homgenización, decontaminación y concentración previa de la muestra para ser cultivada. Observar la característica de las colonias y el pigmento en el medio de Lowenstein de cepas de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium atípicos. Sensibilidad o resistencia a los fármacos: La utilidad de estudiar éste comportamiento in Vitro es de vigilancia en paciente que no han recibido tratamiento previo (resistencia primaria) y en los paciente con recaidas o abandono del tratamiento (resistencia secundaria) como indicador de multidrogoresistencia (MDR) Para ello se utiliza el concepto de las proporciones, se emplean diluciones 1/1,000, 1/10,000 y 1/100,000 de una suspensión de las colonias problemas que luego se siembran en medios de Lowenstein sin antibiótico y con fármaco individual en concentraciones equivalentes al MIC. Luego se incuban a 37ºC y cuando hay desarrollo se cuentan las colonias, considerando como 100 % el tubo sin fármaco se obtiene así la proporción denominada crítica de resistencia a cada droga.

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TEMA 27 : FLORA BACTERIANA NORMAL Introducción: Los microorganismos que habitan el medio ambiente (suelo, agua, aire, residuos orgánicos) están en relación constante con los organismos vivientes. El cuerpo humano está poblado de microorganismos en las zonas expuestas al ambiente, asi como en la luz intestinal. Esta flora residente cumple una función determinada para conservar la salud como sintetizar vitamina K, completar el catabolismo de los alimentos, contribuir a su absorción, prevenir la colonización de bacterias patógenas, etc. En determinadas circunstancias como traumatismos, heridas, sistema inmune deprimido, o sobrepoblación bacteriana, la flora residente puede producir enfermedades. En la práctica se va a demostrar la presencia de microorganismos en diversas áreas del cuerpo para comprobar la presencia de bacterias autóctonas. 1. Exudado faríngeo 2. Región interdigital de la mano 3. Región axilar 4. Región conducto auditivo externo 5. Ambiente del dormitorio de un alumno Materiales: 1. Hisopos de algodón estéril 2. Baja lengua 3. Placas petri con agar sangre y Agar Sabouraud 4. Tubos con 3 ml de caldo Nutritivo 5. Juego de colorantes para Gram Procedimiento: 1. Seguir las instrucciones del Profesor para la toma de las diferentes muestras: 2. Con ayuda del hisopo y baja lengua tomar una muestra de exudado faríngeo.

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3. Humedecer un hisopo en Caldo nutritivo para cada una de las regiones señaladas 4. Sembrar el hisopo en la superficie de Agar sangre e Incubar a 37 oC /24 horas. 5. La placa de Agar Sabouraud usada por el alumno en su dormitorio, se incubará a temperatura ambiente. 6. Observar el tipo de colonias aisladas, presencia de hemólisis, pigmento, etc. 7. Realizar frotices y coloraciones de Gram para hacer una identificación primaria.

Resultados: Muestra Exudado faríngeo Cultivo/colonias Coloración de Gram Posibilidad diagnóstica

Región interdigital de mano Región axilar

Conducto auditivo externo Ambiente

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CUESTIONARIO: 1. ¿Porqué los Mycobacterium no toman fácilmente los colorantes acuosos? 2. Señale las ventajas de la bacilosocopía en el diagnóstico de la tuberculosis. 3.¿Qué microorganismos se encontraron en los cultivos tomados en las diversas regiones del cuerpo? 4.¿Qué microorganismos infectan con mas frecuencia a pacientes de cuidados intensivos o neonatos prematuros? Y porqué? DESARROLLO

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PROTOCOLO V: AGUA POTABLE 1. Introducción: Muchos procesos infecciosos son transmitidos por vía oral, siendo el agua el vehículo principal. Se puede señalar infecciones como la Hepatitis A (infecciosa), Enterovirus (polio), Rotavirus, Vibrio cholerae, Salmonelosis, entre otras. El agua de bebida debe tener características organolépticas, químicas y bacteriológicas aceptables para no producir daño al humano, denominándole “potable”. Desde el punto de vista microbiológico el agua potable debe reunir las siguientes características: 1. Bacterias mesófilas : En número inferior a 500 UFC en 100 ml de agua 2. Bacterias coliformes: En número inferior a 3 UFC en 100 ml de agua 3. Escherichia coli: Ausente en 100 ml de agua

4. Pseudomonas aeruginosa: Ausente en 100 ml de agua Nota: UFC unidades formadoras de colonias 2. Procedimiento: para demostrar el número más probable de bacterias contenidas en una muestra de agua, se siembra por triplicado, en medio líquido, tres volúmenes de agua (10 ml, 1.0 ml y 0.1 ml). Incubar a 37ºC por 24 horas. Observar la turbidez de los cultivos y referirlos a la Tabla de Hoskins. 10 ml agua ----1 1 1.0 ml 0.1 ml NMP en agua agua 100 ml AGUA --1 3 1 --3 ----4 --1 7 10 ml agua 3 3 3 3 1.0 ml 0.1 ml NMP en agua agua 100 ml AGUA ----23 --1 39 --2 64 1 --43

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URP. Facultad de Medicina 1 1 1 2 2 2 2 2 2 1 1 2 --0 1 1 2 2 --1 ----1 --1 0 1 7 11 11 9 14 15 20 21 28 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 --1 2 --1 2 75 120 93 150 210 240 460 1,100

Se anota el número de tubos positivos (turbios) con cada volumen de agua y se obtiene el número de bacterias más probable en 100 ml de agua.

I. SEMINARIO Temario: Resistencia bacteriana a los antibacterianos.
GRUPO 1: Señalar la estructura bacteriana y el mecanismo de acción de los anti microbianos a) De la síntesis de la pared, ejemplos b) A nivel de la membrana citoplasmática, ejemplos c) Sobre las moléculas de ácido nucleico, ejemplos d) En la síntesis de las proteinas, ejemplos e) Mecanismos competitivos, ejemplos GRUPO 2: Describir los mecanismos No genéticos mediante los cuales las bacterias resisten la acción antibacteriana. a) Ubicación de la infección, ejemplos b) Estado de la bacteria, ejemplos c) Característica química del antibacteriano, ejemplos GRUPO 3: Describir los mecanismos genéticos de resistencia bacteriana a) Selección de mutante: cromosómico, ejemplos b) Intercambio genético: extra cromosómico, ejemplos GRUPO 4: Mecanismos bioquímicos de resistencia a) Permeabilidad celular a la droga, ejemplos b) Inactivación de la droga, ejemplos c) Modificación del receptor (zona blanco), ejemplos 59

URP. Facultad de Medicina d) Síntesis de metabolito, ejemplos CONCEPTOS: 1. Antibiótico 2. Quimioterápico 3. Bactericida 4. Bacteriostático 5. Resistencia cruzada

II. SEMINARIO Temario: VACUNAS 1. Historia, Definición y Finalidad 2. Clasificación. Cadena de frío
4. Indicaciones. Contraindicaciones. Riesgos de la vacunación

5. Esquema de vacunación del Ministerio de Salud 6. Vacunas preparadas con agente vivo (atenuadas), características y ejemplos. . 7. Vacunas preparadas con agente muerto (inactivadas), características y ejemplos. 8. Vacunas preparadas con fracciones antigénicas y conjugadas, características y ejemplos.
9. Vacunas elaboradas a partir de toxinas, características y ejemplos.

10. Vacunas elaboradas por ingeniería genética, características y ejemplos.
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TEMA 28 : HONGOS AMBIENTALES Introducción: Los hongos ambientales son los que viven a expensas de la materia inerte. La mayoría son saprofitos, algunas especies son productoras de antibióticos y otros pueden actuar como alergenos ocasionando sensibilización. Estos hongos pueden ser oportunistas y producir infecciones secundarias en pacientes con inmunodeficiencias, con infecciones crónicas En los medios de cultivo desarrollan con gran facilidad en 24 a 48 horas. Materiales: 1. Cultivo de Penicillium, Aspergillus, Fusarium y Ryzopus en medio de Sabouraud 2. Microcultivos en lámina de cada una de los hongos en estudio. 3. Cultivo de Rhodotórula en medio Sabouraud. Procedimiento: 1, Estudiar las características macroscópicas de las colonias (aspecto, color, consistencia, pigmento difundido etc.) 2. Con objetivo de menor aumento (10X) observar los microcultivos y describir la característica de los micelios, conidias y conidióforos. Resultados: PENICILLIUM: colonias pulverulentas de color azul verdoso. Hifas tabicadas con conidióforos ramificados en su extremo distal con la apariencia de pincel y conidias dispuestas en cadena .

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ASPERGILLUS: colonias filamentosas de color blanco, amarillo, verde, marrón o negro. Hifas tabicadas con ensanchamiento en su extremo distal que da origen a esterigmas de donde nacen las conidias en cadena.

FUSARIUM: colonias algodonosas de color rosado . Hifas tabicadas que dan origen a conidióforos y macroconidias multiseptadas fusiformes, curvadas.

RHIZOPUS : colonias algodonosas blanco grisaceas con puntos negros (esporangios). Hifas no septadas agrupadas como raices, a partir de las cuales se proyectan filamentos largos (esporangióforo) formando en su extremo una estructura redonda oscura que contiene gran cantidad de esporas.

RHODOTÓRULA : colonias cremosas de color rosado.

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Al microscopio se observan células ovoides o redondas.

TEMA 29 : HONGOS DERMATOFITOS Introducción: Son hongos filamentosos que tienen predilección por la queratina, por lo que afectan piel, pelo y uña. Por su habitat pueden clasificarse en Geofílicos, Zoofílicos y Antropofílicos, pueden infectar al hombre y a los animales. Tres géneros patógenos son de interés: Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton que producen tiña corpis, capitis, cruris, pedis y onicomicosis. La identificación de cada uno está basada en la morfología de la colonia y de las estructuras de reproducción (microconidias o macroconidias) Materiales: 1. Muestras patológicas de piel pelo y uña en preparaciones en fresco con KOH 2. Cultivo de T. rubrum, T mentagrophytes, T tonsurans, M canis, M gypseum y E floccosum en agar sabouraud glucosado 3. Microcultivos de los mismos hongos con azul de lactofenol Procedimiento: Toma de muestra: En lesiones de piel se obtiene por raspado de los bordes de la lesión En cuero cabelludo se retiran los pelos de la zona afectada. Las uñas son previamente humedecidas con alcohol y luego recortadas asi como raspado del lecho ungueal. Examen directo: Se prepara un examen en fresco con hidróxido de potasio al 20%. Se observa al microscopio con objetivo 40X buscando la presencia de esporas redondeadas aisaladas o agrupadas en racimos refringentes, hifas cortas o largas cilíndricas con los extremos redondeados. En los pelos se puede observar esporas ubicadas en el interior (endotrix) o alrededor del pelo (exotrix).

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Cultivo: El medio de cultivo de elección es el Sabouraud que contiene 40 g/L de dextrosa. La siembra se hace por puntura e incuba a medio ambiente, esperando desarrollo entre el 5º y l5vo día. Resultados: A) Examen en fresco de escamas de piel B) Examen en fresco de pelo infectado

TRICHOPHYTON RUBRUM : Colonias algodonosas de color blanco con pigmento rojo en el reverso del tubo. Hifas septadas con microconidias piriformes sésiles.

TRICHOPHYTON MENTAGROPHYTES: Colonias pulverulentas granulosas yesosas, blanquecinas con pigmento amarillo pardusco en el reverso. Hifas septadas con abundantes microconidias esféricas en racimos

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TRICHOPHYTON TONSURANS : Colonias membranosas crateriformes, acartonadas. Hifas septadas en raqueta, microconidias piriformes y clamidosporas.

MICROSPORUM CANIS: Colonia blanquecina con pigmento amarillo naranja en el reverso. Hifas septadas con macroconidias elípticas o fusiformes con tabiques transversales y excrecencias en la superficie.

MICROSPORUM GYPSEUM: Colonia algodonosa o finamente pulverulenta de color blanco cremoso. Hifas septadas con macroconidias de superficie lisa con tabiques transversales.

EPIDERMOPHYTON FLOCCOSUM : Colonias aterciopeladas o finamente pulverulentas, con pliegues en el centro, de color amarillo azufre. Hifas septadas con macroconidias grandes con el extremo distal romo y ancho, tabicadas transversalmente.

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TEMA 30 : HONGOS LEVADURIFORMES Introducción: Las levaduras son habitantes del medio ambiente y forman parte de la flora normal. Situaciones del huésped como terapia antibiótica prolongada, corticoterapia, radiaciones, diabetes, inmunodeficiencias, etc pueden permitir la colonización de las levaduras oportunistas y producir infección. Las levaduras mas importantes en patología humana son la Cándida albicans, que produce micosis superficiales y sistémicas, el Criptococcus neoformans (torula) que produce meningoencefalitis y el Pityrosporum ovale, causante de la pitiriasis versicolor. Materiales: 1. Frotis de flujo vaginal coloreado con Gram 2. Cultivo de Cándida albicans en medio Sabouraud. 3. Suspensión de Cándida albicans en suero incubado a 37 oC / 2 horas 4. Cultivo de Critococcus neoformans en medio Sabouraud 5. Cultivo de Criptococcus neoformans en agar urea. 6. Preparaciones en fresco con tinta china y líquido cefaloraquideo de paciente con Criptococosis. 7. Examen directo con KOH de escamas de piel con pitiriasis versicolor (Malassezia furfur) Procedimiento: 1. Observar con objetivo de inmersión el frotis de flujo vaginal. Apreciar las formaciones levaduriformes y pseudomicelios de Cándida albicans.

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2. Describir las características del cultivo de Cándida albicans. 3. Hacer una preparación en fresco a partir de la suspensión de cándida en suero. Observar con objetivo 40X y apreciar las prolongaciones digitiformes, característico de la Cándida albicans (tubo germinativo) 4. Describir las características del cultivo de Criptococcus y apreciar el metabolismo de la urea. 5. Observar las preparaciones en fresco con tinta china, apreciar la presencia de cápsula del Critococcus neoformans como un halo transparente alrededor de las esporas. Resultados: Tubo germinativo Cultivo de Cándida Frotis de secreción vaginal

Cultivo de Criptococcus neoformans

Observación de cápsula

CUESTIONARIO: 1. Importancia de llegar a un diagnóstico etiológico micótico de una lesión dérmica. 2. Siendo la Cándida una levadura que forma parte de la flora microbiana del cuerpo humano, ¿cuándo le daría importancia clínica que amerite tratamiento? 3. Señale los hongos saprofitos productores de antibióticos 4. Qué hongo produce meningo encefalitis y señale un método práctico y rápido para diagnosticarlo? 5. Qué función tiene el KOH al 20 % en las preparaciones en fresco para investigar hongos? DESARROLLO

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TEMA 31 : MICOSIS SISTEMICAS (Hongos dimórficos) MICOSIS SUBCUTANEAS Introducción: Estos hongos se encuentran distribuidos en la naturaleza (suelo, fragmentos de vegetales, excretas de aves y murciélagos). Se les denomina dimórficos por su doble comportamiento, en el huésped y a temperatura de incubación de 37 oC son levaduriformes, en cambio a temperatura ambiental se comportan como filamentosos. Las personas y animales se contaminan con los hongos dimórficos por inhalación produciendo infecciones sistémicas. Representan a éste grupo el Paracoccidioides brasiliensis (blastomyces br) y el Hystoplasma capsulatum. Las micosis subcutáneas son producidas por diversos hongos, siendo el mas frecuente el Sporothrix schenckii, que se transmite por inoculación traumática con espinas o restos de plantas produciendo infección crónica del sistema linfático. Materiales: Cultivo de Paracoccidiodes br. en Agar Sabouraud y en Agar cerebro corazón (BHI) Preparaciones en fresco con azul de lactofenol de Paracoccidioides br en BHI Frotis de esputo de paciente infectado con Paracoccidiodes br. Cultivo de Histoplasma c. en Agar sabouraud y en Agar cerebro corazón (BHI) Preparaciones en fresco con azul de lactofenol de Histoplasma c. en sabouraud. Preparaciones histológicas de tejidos infectados con Histoplasma c. Cultivo de Sporotrix sch. en Agar Sabouraud y en BHI incubado a 37 ºC

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Preparaciones coloreadas con Gram de cultivo de Sporotrix sch. en BHI. Procedimiento: 1. Observar las características de las colonias de cada una de las tres especies de hongos dimórficos presentados tanto en agar sabouraud como en agar BHI 2. Observar al microscopio, con objetivo de 40X, las preparaciones en fresco presentadas. 3. Observar con objetivo de inmersión las preparaciones histológicas presentadas Resultados: Registrar las observaciones macroscópicas y microscópicas.

Paracoccidioides brasiliensis

Esputo coloreado con Wright Observar las esporas grandes de 10-60 mu de pared gruesa con varias gemaciones

Cultivo a 37 oC

Cultivo a 22 oC

Esporas “timón

multigemadas de barco”

en

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Histoplasma capsulatum

Corte histológico (hígado): Observar levaduras pequeñas de 1 a 3 micras en el citoplasma de los histiocitos.

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Cultivo a 37 oC

Cultivo a 22 oC

------------------------------------------------------------------------------------------------------Sporotrix schenkii

: Cultivo a 22 oC

Cultivo a 37 oC

TEMA 32 : ESTUDIO DE LOS VIRUS Introducción: El diagnóstico de las enfermedades virales se ha fortalecido con los avances en los conocimientos y técnicas en inmunología, pero nunca se puede obviar la confección de la historia clínica del paciente, la que nos da información muy importante como tiempo de enfermedad, sintomatología, entorno epidemiológico, etc., datos que permiten llegar a un diagnóstico presuntivo, necesario para orientar los estudios en el laboratorio. Para facilitar la interpretación de los estudios inmunológicos muchas veces es recomendable obtener dos muestras de sangre con intervalo de 3 semanas, que permite establecer si la enfermedad está en sus inicios, periodo de estado o convalecencia. Examen microscópico: Si bien los virus tienen un tamaño muy pequeño que no pueden ser observados con el microscopio de luz, algunos virus tienen la capacidad de formar estructuras intracelulares denominadas “cuerpos de inclusión” que se pueden reconocer con el microscopio corriente, estructuras patognomónicas de ciertos virus.

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Virus Nombre Ubicación Característica

Viruela /Vacuna Rabia Molusco contagioso Conjuntivitis de inclusión Fiebre amarilla Herpes simples Citomegalovirus

Guarnieri Negri Henderson Paterson -Margarino Torres Lipschutz --

citoplasma citoplasma citoplasma citoplasma nuclear nuclear nuclear

Acidófilo Acidófilo Basófilo Basófilo Acidófilo Acidófilo Acidófilo

Aislamiento: Para aislar los virus se requiere previamente preparar cultivos de células donde se puedan multiplicar y observar los cambios celulares producto de la infección viral, denominado “efecto citopático”, caracterizado por disminución del tamaño celular, redondeamiento, picnosis y por último lisis celular. Los cultivos celulares pueden ser primarios, que sólo duran uno o dos pasajes, como los que provienen de fibroblastos de embrión de pollo, riñón de mono, etc y los de línea, que son células tumorales adaptadas en el laboratorio y de multiplicación indefinida (Hela, Hep2, etc). No olvidemos que el primer cultivo celular fué la membrana corio alantoidea del embrión de pollo (huevo).

Identificación: Para identificar un virus que ha producido efecto citopático en un cultivo celular, debemos disponer de los sueros específicos de las diversas especies de la familia viral que se sospecha, razón por la cual necesitamos tener un diagnóstico presuntivo que oriente el estudio. Los anticuerpos contenidos en dicho suero inhibirán en forma específica el efecto citopático u otra propiedad (hemaglutinación o hemadsorción) de dicho virus. Las técnicas inmunológicas permiten reconocer en el paciente la presencia de anticuerpos, tipo de inmunoglobulina y medir el nivel. La presencia de anticuerpos no siempre nos indica infección viral, en infecciones crónicas o endémicas es muy útil investigar la presencia de inmunoglobulinas M que son expresión de infección aguda o periodo de estado. Los procedimientos inmunológicos antígeno-anticuerpo en sus diversas formas: Aglutinación de latex, Inmunofluorescencia, Enzima inmuno ensayo, Radio inmuno ensayo Electroforesis e Inmunoprecipitación son empleados en virología. Con éstas técnicas se puede investigar tanto la presencia de antígeno viral como la de anticuerpos formados por el huésped.

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Cuando se investiga la presencia de anticuerpos es necesario obtener dos muestras de sangre al paciente, con intervalo de 15 a 20 días, para demostrar conversión serológica La titulación de anticuerpos contra los diversas infecciones virales en la población es el parámetro que las entidades de Salud Pública emplean para establecer sus políticas de vacunación. ---------

III. SEMINARIO Temario: El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) 1. Definición y clasificación de los Retrovirus. 2. Describa la estructura del virus de inmunodeficiencia humana.(VIH). 3. Importancia del conocimiento de los antígenos del virus
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4. Haga un resumen de la patogenia de la enfermedad por VIH 5. Definición de SIDA. 6. Vías de transmisión del VIH. 7. Pruebas de laboratorio para diagnosticar una infección por VIH. 8. Haga un esquema de la reacción ELISA 9. Marcadores serológicos para diagnosticar infección por VIH 10 ¿Qué investigamos en la prueba de Western blott?

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IV. SEMINARIO: Temario: Arbovirus: Fiebre amarilla y Dengue
1. Definición y clasificación de los arbovirus. 2. Características estructurales de los arbovirus.

3. Epidemiología. Vector
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4. Fiebre amarilla, patogenia 5. Dengue, patogenia 6. Diagnóstico 7. Prevención y Tratamiento
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PATOGENOS - BACTERIANOS Ref.: Murray, Patrick et al.
Microorganismo 1. Enterococcus faecalis, faecium 2. Staphylococcus aureus Clínica Bacteriemia, abscesos, Inf. urinaria, endocarditis Infecciones cutáneas, diseminadas, shock tóxico, Intoxicación alimentaria. Epidemiología Pacientes hospitalizados Coloniza piel y mucosas, prolifera a temperaturas extremas y en áreas hipertónicas.

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3. Staphylococcus coagulasa negat. 4. Streptococcus pyógenes Patógeno oportunista con cuerpo extraño e infec. urinarias. Coloniza piel y mucosas, prolifera a temperaturas extremas y en áreas hipertónicas.

Infecciones supurativas Poblaciones diversas de piel, mucosas, partes blandas, shock tóxico. No supurativa: fiebre reumática Infecciones urinarias, Enfermedad neonatal Bacteriemias. Infecciones cutáneas, partes blandas y ORL Bacteriemias, endocarditis Endocarditis subaguda. abscesos, septicemias, Infecciones odontógenas Neumonía. Meningitis. Bacteriemia. Infecciones Gestantes. Neonatos, Pacientes con afecciones crónicas. Poblaciones diversas Adultos con Ca. de colon Pacientes con alteraciones en válvulas cardiacas. Poblaciones diversas Neonatos, adultos, ancianos

5. Streptococcus agalactiae

6. Streptococcus beta hemolíticos 7. Streptococcus bovis 8. Streptococcus viridans 9. Streptococcus Pneumoniae

respiratorias. Endocarditis. ----------------------------------------------------------------------------------------------------10. Bacillus Carbunco cutáneo, Población que trabaja con anthracis respiratorio y digestivo ganado, consumo de carne y terrorismo. 11. Bacillus cereus Gastroenteritis, Infecciones oculares Clínica Alimentos contaminados, trauma ocular con tierra Epidemiología Contagio vía respiratoria Pacientes inmunodeprimidos con mayor riesgo. Pacientes inmunodeprimidos,

Microorganismo

12. Corynebacterium Difteria diphteriae 13. Corynebacterium Infección de heridas a jeikeium cuerpo extraño. Septicemias. 14. Corynebacterium Infecciones urinarias.

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urealyticum 15. Erysipelothrix Rhusiopathie 16. Listeria monocytógenes Septicemia. Lesión cutánea inflamatoria prurítica. con factores de riesgo, o post quirúrgicos. Manipuladores de carne, pescado. Granjeros. Veterinarios.

Enfermedad neonatal. Neonatos. Gestantes. Ancianos Bacteriemia en adultos. Inmunodeprimidos. (gestantes) ------------------------------------------------------------------------------------------------------17. Mycobacterium Enfermedad pulmonar y Pacientes con enfermedad avium/intracelular y diseminada. cónica (VIH, Inmundeficien.) 18. Mycobacterium leprae 18. Nocardia sp. Lepra tuberculoide o lepromatosa Contacto íntimo con enfermo

Infecciones cutáneas, Patógeno oportunista broco pulmonares y abscesos. -----------------------------------------------------------------------------------------------------19. Neisseria Gonorrea. Enfermedad Transmisión sexual. gonorrhoeae inflamatoria pélvica. Sintomática / Asintomática Artritis. 20. Neisseria meningitidis Meningitis. Bacteriemia Estado de portador sano. Contagio via respiratoria. Niños y adultos

jóvenes. ------------------------------------------------------------------------------------------------------21. Acinetobacter Neumonía. Septicemia. Patógeno oportunista. Infecciones diversas Infecciones nosocomiales 22. Aeromonas 23. Bartonella bacilliformis Microorganismo 24. Bartonella henselae 25. Bartonella quintana Gastroenteritis. Infección de heridas. Fiebre y anemia aguda verruga numular Clínica Enfermedad del arañazo del gato. Angiomatosis bacilar. Endocarditis. Angiomatosis bacilar Fiebre de las trincheras Patógeno oportunista Exposición en zona verrucógena Epidemiología Poblaciones diversas

Poblaciones diversas

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26. Bordetella pertussis 27. Brucella sp.

Tos ferina Brucelosis

Contagio vía respiratoria Ingesta de leche o derivados de vaca, cabra u ovejas infectados. (zoonosis) Zoonosis. Ingesta de alimentos o agua contaminados. Paciente anciano e inmuno deprimidos Patógeno oportunista Pacientes con daño valvular “ “ Niños, adultos, gestantes, Alimentos y aguas

28. Campylobacter jejuni / coli 29. Campylobacter fetus

Gastroenteritis Septicemia. Aborto.

30. Cardiobacterium Endocarditis sub aguda hominis. Eikenella corrodens “ Kingella kingae “ 31. Escherichia coli uropatógena Infecciones urinarias Cistitis, pielonefritis

32. Escherichia coli contaminadas a) enteropatógena b) enterohemorrágica c) enterotoxigénica d) enteroagregadora e) enteroinvasiva 33. Francisella tularensis 34. Haemóphilus Influenzae

Diarrea acuosa y vómitos de preferencia en niños. Diarrea acuosa con sangre y Uremia Diarrea acuosa …. Diarrea en viajeros. Diarrea con moco Diarrea acuosa con sangre Picadura de garrapata Contaminación con conejos Infectados. Contagio via respiratória

Tularemia ulcero glandular neumonía. Capsuladas: septicemia meningitis No capsuladas: sinusitis, otitis, bronquitis, neumonía. Gastritis. Ülcera duodenal

35. Helicobacter pylori Microorganismo 36. Klebsiella pneumoniae

Frecuente.

Clínica Neumonía. Infecciones urinarias

Epidemiología Infecciones nosocomiales

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37. Legionella pneumophila 38. Moraxella Catarrhalis 39. Proteus Neumonía Proceso seudo gripal Infecciones de ojo, oido y respiratorias. Infecciones urinarias y de heridas. 40. Pseudomonas aeruginosa 41. Salmonella: typhi enteritidis 42. Serratia / Enterobacter 43. Shigella 44. Streptobacillus moniliformis contaminado 45. Vibrio cholerae contaminados 46. Vibrio parhaemolíticos Fiebre tifoidea Diarrea Infeccions urinarias y de heridas Disentería bacilar Fiebre por mordedura Infecciones nosocomiales Infecciones cutáneas, óticas, oculares, urinarias, bacteriemia. Pacientes ancianos, inmuno deprimidos. Niños y adultos Contaminación? Anomalía del tracto Infecciones nosocomiales

Alimentos

contaminados

Alimentos contaminados Mordedura de roedor Ingesta de alimento Agua y alimentos

Diarrea acuosa intensa Diarrea acuosa

Ingesta de mariscos

47. Vibrio Infección de heridas Pacientes con enfermedades vulnificus Septicemia. crónicas. -------------------------------------------------------------------------------------------------------48. Actinomyces Actinomicosis cérvicoColoniza mucosas facial, torácica, abdominal, pélvica. 49. Bacteroides fragilis 50. Clostridium residuales Infecciones en abdomen, zona pelviana y cutánea. Botulismo alimentario Habitante normal del Intestino. Ubicuitario de aguas

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botulinum Microorganismo 51. Clostridium difficile 52. Clostridium residuales perfringes hombre

Clínica Diarrea asociada a uso de antibióticos.

Epidemiologia Coloniza tracto intestinal suelo, de aguas y

Infecciones de partes blandas Habitat: Mionecrosis. Septicemia. Intoxicación alimentaria. Intestino

animales

53. Clostridium residuales tetani hombre

Tétanos

Habitat: Intestino

suelo, de

aguas y

animales

54. Propinibacterium Acné. Prótesis Coloniza piel y mucosas -------------------------------------------------------------------------------------------------------55. Chlamydia Neumonía Niños y adultos pneumoniae 56. Chlamydia psitaci 57. Chlamydia Trachomatis 58. Coxiella burnetii 59. Micoplasma pneumoniae 60. Rickettsia prowatzekii 61. Ricketrsia Neumonía Tracoma: conjuntiva, uretra, cérvix, trompas. Linfogranuloma venéreo Fiebre Q Neumonía atípica Tifus exantemático Fiebre manchada Exposición a pájaros Tracoma. Transmisión sexual. Personas expuestas a ganado Infectado. Niños y adultos Transmitido por picadura del piojo infectado. Por mordedura de garrapata

rickettsii -----------------------------------------------------------------------------------------------------62. Borrelia Eritema migratório y Transmitido por garrapatas bugdorferi compromisos diversos 63. Borrelia Fiebre recidivante Transmitida por el piojo

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recurrentis 64. Lepstospira interrogans 65. Treponema congénita pallidum Enfermedad de Weil fiebre e ictericia Sífilis ----------Exposición a orina de roedores perros, animales salvajes. Transmisión sexual y

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