A N A L I T I C O S

M E T O D O S

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A L I M E N T A R I A
D E A N A L I S I S

O F I C I A L E S

Leche y productos lcteos

PANREAC QUIMICA, S.A. publica una nueva edicin de sus folletos de Mtodos Analticos en Alimentaria, en la que podrn apreciar a simple vista un cambio de formato respecto a las anteriores.
M E T O D O S A N A L I T I C O S E N A L I M E N T A R I A

Esta nueva imagen, pretende ser una expresin de los cambios que con el tiempo hemos experimentado en nuestros campos de actividad, puesto que si continuamos manteniendo una importante implantacin en el sector alimentario como fabricantes de reactivos para anlisis PANREAC y de los aditivos alimentarios ADITIO, actualmente hemos aumentado nuestra aportacin de productos para el anlisis alimentario con nuestras lneas de Cromatografa en Capa Fina PANREAC-TLC y Medios de Cultivo Deshidratados para Microbiologa CULTIMED. La coleccin Mtodos Analticos en Alimentaria se compone de 6 folletos monogrficos, por campos de alimentos, que recogen una transcripcin ntegra de los mtodos oficiales de anlisis en Espaa, que a su vez son publicados en los correspondientes B.O.E. mencionados en el ndice de cada monografa incorporando los reactivos y productos auxiliares PANREAC en la calidad considerada ms idnea, as como los medios de cultivo CULTIMED.

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Los ttulos de las 6 monografas son:

Aceites y grasas Aguas potables de consumo pblico y aguas de bebida envasadas Carne y productos crnicos Cereales, derivados de cereales y cerveza Leche y productos lcteos Productos derivados de la uva, aguardientes y sidras
Obviamente esta edicin ha sido actualizada con las disposiciones publicadas hasta el momento, que establecen nuevos procedimientos o que modifican notablemente caractersticas anteriormente establecidas. Por ltimo, comentarles que estn a su disposicin adems de esta coleccin, nuestros: Catlogo General de Reactivos PANREAC Catlogo ADITIO de Aditivos Alimentarios Catlogo CULTIMED de Medios de Cultivo Deshidratados Catlogo PANREAC-TLC de Placas, Folios y Accesorios para Cromatografa en Capa Fina.

I N D I C E

Leche: I. Leches natural, certificada, higienizada, esterilizada, desnatada, concentrada, evaporada, condensada y en polvo
METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 20-7-1977, 21-7-1977, 31-5-1990 Y 3-1-1994) Mtodos oficiales de toma de muestras de leches parcialmente deshidratadas y en polvo ..................... 1a- Grasa (Leches natural, certificada, higienizada y esterilizada) ..................... 1b- Grasa (Leche desnatada) ..................... 1c- Grasa (Leche concentrada, evaporada y condensada) .................... 1d- Grasa (Leche en polvo) ........................ 1e- Grasa (Leche natural) (Mtodo Gerber) . 2Protenas ............................................. 3Casena ............................................... 4Lactosa ............................................... 5a- Extracto seco (Leches natural, certificada, higienizada y esterilizada) ... 5b- Extracto seco (Leches concentrada, evaporada y condensada) .................... 6Cenizas ............................................... 7Potasio Dicromato ............................... 8a- Acidez (Leches natural, certificada, higienizada y esterilizada) ..................... 8b- Acidez (Leche en polvo) ....................... 9Sacarosa (Determinacin polarimtrica en la leche condensada) ...................... 10- Humedad (Leche en polvo) .................. 11- Indice de solubilidad (Leche en polvo) .. 12- Calcio .................................................. 13- Fsforo ................................................ 14a- Harina de alfalfa (Mtodo comparativo) (B.O.E. 30-8-1979).......... 14b- Harina de alfalfa (Mtodo gravimtrico). 15- Fenolftalena en leche desnaturalizada (Mtodo cualitativo) ..... 16- Fcula (Mtodo comparativo) ............... 17- Salvado ............................................... 18- Fcula + Salvado ................................. 19- Sustancias proteicas reductoras (B.O.E. 14-10-81) ................................ 20- Residuo insoluble de sangre (B.O.E. 20-1-1982) .............................. 21- Deteccin de leche de vaca en mezclas con leche de oveja y cabra ..... 22- Sangre soluble ..................................... 0-

8 14 16 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 27 28 28 31 31 32 34 35 36 37 37 37 38 38 40 40 42

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23a- Determinacin de leche de vaca en leche de oveja o de cabra (por electroforesis) ...................................... 23b- Determinacin de leche de vaca en leche de oveja o de cabra (mtodo inmunolgico) ...................................... 24a- Determinacin de leche de cabra en leche de oveja (por electroforesis).... 24b- Determinacin de leche de cabra en leche de oveja (mtodo inmunolgico) ...................................... 25- Determinacin de suero de quesera en leche mediante anlisis de los glicomacropptidos por cromatografa lquida de alta eficacia.......................... 543 6745 47 8910Deteccin de grasa vegetal en grasa de leche por cromatografa de gases de esteroles.............................................. Fosfatasa residual en mantequilla ......... Indices de cidos grasos voltiles solubles e insolubles .................................. Indice de Kirschner .............................. Acidos grasos de cadena corta............ Extraccin de la grasa en mantequilla .. 74 76 78 80 80 84

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Queso
I. ORDEN DE 29 DE NOVIEMBRE DE 1985 POR LA QUE SE APRUEBAN LAS NORMAS DE CALIDAD PARA QUESOS Y QUESOS FUNDIDOS DESTINADOS AL MERCADO INTERIOR. (B.O.E. 6-12-1985) ................ 86 II. METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 30-8-1979 Y 30-10-1991) 012345678Tcnica de toma de muestra (B.O.E. 5-8-1970) ............................................ Extraccin de la grasa del queso ......... Determinacin del contenido en materia grasa....................................... Determinacin del contenido de extracto seco....................................... Determinacin del contenido en fsforo Determinacin del contenido en cido ctrico .................................................. Determinacin del contenido en lactosa . Nitratos y nitritos.................................... Determinacin de leche de vaca en queso de oveja o de cabra (por electroforesis) ................................................... Determinacin de leche de cabra en queso de oveja (por electroforesis).........

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Leche: II. Leches evaporada rica en grasa, entera condensada, en polvo rica en grasa o extragrasa, concentrada.
METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 4-2-1989) 0Preparacin de la muestra para el anlisis qumico y consideraciones generales............................................. Extracto seco (Estufa) .......................... Humedad (Estufa) ................................ Materia grasa (Mtodo Rose-Gottlieb) .. Materia grasa (Mtodo Rose-Gottlieb) .. Sacarosa (Mtodo polarimtrico) .......... Acido lctico y lactatos ........................ Actividad de la fosfatasa (Mtodo de Sanders y Sager modificado) .......... Actividad de la fosfatasa (Mtodo de Aschaffenburg y Mullen) ..................

91 92 93 95

12345678-

53 54 55 56 58 61 63 64 66

97 98 105

108 109

9-

Yogur
I. ORDEN DE 1 DE JULIO DE 1987 POR LA QUE SE APRUEBA LA NORMA DE CALIDAD PARA EL YOGUR O YOGHOURT DESTINADO AL MERCADO INTERIOR. (B.O.E. 3-7-1987) ....................................... 111 II. METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 3-7-1987). 1Preparacin de la muestra. Norma Chimie Ministerio de Agricultura francs XIV-1 ................................................... 113 Determinacin del contenido en materia grasa (Mtodo Acido Butiromtrico). Norma Chimie Ministerio de Agricultura francs XIV-3 ....................................... 113

Mantequilla
METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 21-71977, 22-7-1977, 30-8-1979, 30-10-91) 01234Toma de muestra (B.O.E. 5-1-1975, Anejo nico apartado 1.)......................... Indice de acidez de la grasa ................... Indice de refraccin de la grasa .............. Sodio Cloruro ......................................... Agua, extracto seco magro y grasa en una sola muestra .................................

70 71 71 72 72

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6-

Determinacin de la materia seca (Mtodo por secado). Norma Chimie Ministerio de Agricultura francs XIV-2 ............ 115 Identificacin de colorantes, edulcorantes,espesantes y conservadores .......... 116 Mtodos seleccionados y recomendados por el Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin. Analisis microbiolgico. Mtodos seleccionados y recomendados por el Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin .............................................. 116 Fenolftalena (Mtodo cualitativo) (B.O.E. 30-8-1979 apartado 15(b)) ....... 116

Cuajada
ORDEN DE 14 DE JUNIO DE 1983 POR LA QUE SE APRUEBA LA NORMA DE CALIDAD PARA LA CUAJADA EN EL MERCADO INTERIOR. ............................... 118

Nata
ORDEN DE 12 DE JULIO DE 1983 POR LA QUE SE APRUEBAN LAS NORMAS DE CALIDAD PARA LA NATA Y NATA EN POLVO CON DESTINO AL MERCADO INTERIOR. ..................................................... 121

Relacin de reactivos y productos auxiliares que se utilizan en los mtodos analticos, Leche y Productos Lcteos ........................................... 127 Aditivos y coadyuvantes tecnolgicos para uso alimentario industrial .................................... 131

Leche: I. Leches natural, certificada, higienizada, esterilizada, desnatada, concentrada, evaporada, condensada y en polvo.

METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 20-7-1977, 21-7-1977, 31-5-1990 Y 3-1-1994) 0. METODOS OFICIALES DE TOMA DE MUESTRAS DE LECHES PARCIALMENTE DESHIDRATADAS Y EN POLVO 0(a). TOMA DE MUESTRAS DE LECHES PARCIALMENTE DESHIDRATADAS 0(a).1. Objeto. Obtener de una partida determinada una muestra representativa, con carcter oficial, para poder comprobar a partir de ellas sus caractersticas fsico-qumicas. 0(a).2. Ambito de aplicacin. Este mtodo de toma de muestras se aplicar a: Leche concentrada. Leche evaporada. Leche condensada. Bien sean desnatadas, semidesnatadas, enteras y/o ricas en grasa. 0(a).3. Definiciones. Partida: La cantidad de producto que constituye una unidad de caractersticas presuntamente uniformes. Cuando la cantidad de producto a muestrear sea superior a 100 Tm, se fraccionar, tericamente y a efectos de muestreo, en tantas partidas de hasta 100 Tm como sea necesario. Toma elemental: Cantidad tomada en un punto de la partida. Muestra global: Conjunto constituido por las tomas elementales efectuadas de la misma partida, homogeneizada o no segn se indica ms adelante. Muestra reducida: Parte representativa de la muestra global obtenida por reduccin de sta. Muestra final: Parte de la muestra reducida o de la muestra global, previamente homogeneizada. 0(a).4. Material y aparatos. 0(a).4.1. Condiciones generales.- Los aparatos y utensilios destinados a la toma de muestras de leches parcialmente deshidratadas debern ser de acero inoxidable u otro material idneo, no absorbente, de resistencia adecuada, que no provoque alteracin alguna que pudiera afectar a los resultados de los anlisis. El equipo ser de construccin lo suficientemente fuerte para evitar que se deforme durante su utilizacin. Todas las superficies debern estar pulidas y exentas de grietas, y todos los ngulos debern ser redondeados. 0(a).4.2. Agitadores para lquidos.- Los agitadores para mezclar lquidos a granel tendrn una superificie suficiente para remover el producto de

manera adecuada sin que se produzcan malos olores. Considerando los diferentes tamaos y formas de los recipientes, no puede recomendarse ningn diseo especfico de agitador para todos los fines, pero se disearn de forma que se evite araar la superficie interna de los recipientes durante la agitacin. Una forma recomendada de agitador para homogeneizar lquidos en cubos o bidones tiene las siguientes dimensiones (figura 1):
DIMENSIONES EN MILIMETROS

Figura 1 Agitador de lquidos para bidones y cubos

Disco de 150 mm de dimetro, perforado con seis agujeros de 12,5 mm de dimetro cada uno, siguiendo una circunferencia de 100 mm de dimetro: el centro del disco se fija a una barra metlica, cuyo otro extremo es un mango en forma de asa. La longitud de la barra, incluyendo el mango, ser de un metro aproximadamente. Un agitador adecuado para las cisternas de camiones, granjas y trenes deber tener las siguientes dimensiones aproximadas (figura 2):
DIMENSIONES EN MILIMETROS

Figura 2 Agitador de lquidos adecuado para cisternas de camiones, granjas y trenes

Una barra de no menos de dos metros de longitud, con un disco de 300 mm de dimetro, perforado con doce agujeros de 30 mm de dimetro cada uno siguiendo una circunferencia de 230 mm de dimetro. Para homogeneizar el contenido de recipientes grandes, es recomendable la agitacin elctrica o mecnica o mediante aire comprimido limpio. Se utilizar un mnimo de presin y de volumen de aire para evitar la formacin de malos olores. Siempre que en este mtodo se requiera "aire comprimido limpio", es necesario utilizar aire comprimido exento de contaminantes (incluyendo aceite, agua y polvo).

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0(a).4.3. Agitador.- De hoja ancha, de suficiente profundidad para alcanzar el fondo del recipiente del producto y que tenga preferentemente un borde adaptado al contorno del recipiente (ver figura 3). de la muestra y en un informe se anotar esta circunstancia. 0(a).5.1.1. Toma de muestras de productos envasados en recipientes pequeos para la venta al por menor.- La muestra ser constituida por el recipiente intacto y sin abrir. Se tomar uno o ms recipientes del mismo lote o nmero de cdigo para formar una muestra de no menos de 200 g. 0(a).5.2. Toma de muestras de leche condensada. 0(a).5.2.1. Generalidades.- La toma de muestras de recipientes a granel de leche condensada puede ser de gran dificultad, especialmente cuando el producto es muy viscoso y no est homogeneizado. Pueden surgir problemas por la presencia de grandes cristales de sacarosa o de lactosa, o por la precipitacin de algunas sales que pueden aparecer en toda la masa del producto o adherirse a las paredes, o por la presencia de grumos. Estas condiciones pueden apreciarse si se introduce una varilla de muestreo en el recipiente del producto y se retira despus de explorar una superficie del recipiente tan amplia como sea posible. Si el tamao de los cristales de azcar no es mayor de 6 mm, no debern encontrarse dificultades en la toma de muestras por esta causa. Si el producto no es homogneo, hay que anotarlo en la etiqueta de la muestra y en el informe. Como la leche condensada se almacena con frecuencia a temperatura ambiente, se recomienda que para obtener una muestra representativa se mantenga el contenido a una temperatura no inferior a 20C. 0(a).5.2.2. Recipientes abiertos (barriles).- Se separar la tapa del recipiente previamente limpia y seca para evitar que caiga materia extraa durante el proceso de apertura. El contenido se homogeneizar utilizando un agitador (ver figura 3). Se pasar la hoja por los lados y el fondo del recipiente para eliminar cualquier producto que estuviera adherido. Se homogeneizar totalmente el contenido mediante una combinacin de movimientos de rotacin y verticales, con el agitador inclinado en diagonal, teniendo cuidado para evitar la incorporacin de aire a la muestra. Se extraer el agitador y la leche condensada adherida a l pasar a un recipiente de cinco litros (0(a).4.6.) utilizando una esptula o una cuchara. Se repetir el proceso de homogeneizacin y extraccin hasta que renan dos-tres litros. Estos se agitarn hasta homogeneidad y se tomar una muestra de no menos de 200 gramos. 0(a).5.2.3. Bidones cerrados con tapones en el extremo o en el lado.- Por las razones descritas en 0(a).5.2.1. la toma de muestras a travs del agujero del tapn slo es adecuada con leche condensada que fluye fcilmente y que sea de consistencia uniforme. El contenido se mezclar

Figura 3 Agitador adecuado para homogeneizar leche condensada en barriles.

Figura 4 Cazo adecuado para lquidos

0(a).4.4. En la figura 4 se muestra un cazo de forma y tamao adecuado para la toma de muestras. El cazo deber estar dotado de un mango slido de al menos 150 mm de longitud. La capacidad del cazo ser de al menos 50 ml. Es preferible que el mango sea curvado. Tambin puede utilizarse un cazo de capacidad semejante pero que tenga lados paralelos graduados en cinco secciones iguales para facilitar la toma de muestras, proporcionalmente, de ms de un recipiente. 0(a).4.5. Varilla.- Redonda, de un metro de longitud y 35 mm de dimetro aproximadamente. 0(a).4.6. Recipiente.- Para el submuestreo, con cinco litros de capacidad y boca ancha. 0(a).4.7. Cuchara o esptula de rama larga.- De hoja ancha. 0(a).4.8. Recipientes para muestra.- Sern preferentemente opacos. En caso de que fueran transparentes, el recipiente con su contenido deber colocarse en lugar oscuro. Ver 0(a).4.1, 0(a).7.1, 0(a).7.3 y 0(a).7.4. 0(a).5. Procedimiento. 0(a).5.1. Toma de muestras de leche concentrada y evaporada.- La muestra se homogeneizar convenientemente utilizando los procedimientos manuales o mecnicos adecuados. Tomar la muestra inmediatamente despus de la homogeneizacin utilizando un cazo, siendo su peso de no menos de 200 g. En este caso, en la etiqueta

introduciendo una varilla a travs del agujero y, despus de moverlo y agitarlo en la medida de lo posible en todas las direcciones, se extraer la varilla y se preparar una muestra segn se describe en 0(a).5.2.2. Tambin puede efectuarse dejando que el contenido pase a un recipiente adecuado, teniendo cuidado de que pase la mayor cantidad posible del bidn. Despus de agitar con un agitador se formar la muestra segn se describe en 0(a).5.2.2. 0(a).5.2.4. Toma de muestras de productos envasados en recipientes pequeos para la venta al por menor.- La muestra estar constituida por el recipiente intacto y sin abrir. Tomar uno o ms recipientes del mismo lote o nmero de cdigo para formar una muestra de no menos de 200 gramos. 0(a).6. Exigencias cuantitativas. El acceso a la partida debe ser tal que permita tomar muestras de todas las partes que la componen. Todos los envases debern ser de la misma partida y tomados en distintos puntos de ella. 0(a).6.1. Tomas elementales.- El muestreo debe ser representativo de la partida examinada, por lo

que el nmero mnimo de tomas elementales sern las indicadas en el cuadro. 0(a).6.2. Muestra global.- La totalidad de la masa o volumen de las tomas elementales destinadas a construir la muestra global no puede ser inferior a: Cuatro kilos en los graneles y productos envasados en envases con un contenido superior a 1 kilo. Seiscientos gramos en productos envasados con un contenido inferior a 1 kilo. 0(a).7. Instrucciones referentes a las tomas, preparacin y el acondicionamiento de las muestras. 0(a).7.1. Generalidades.- Tomar y preparar las muestras lo ms rpidamente posible, teniendo en cuenta las precauciones necesarias para evitar que el producto se altere o contamine. Los aparatos y utensilios, as como las superficies y recipientes destinados a recibir las muestras deben estar limpios y secos. 0(a).7.2. Preparacin de las muestras globales.- Reunir las tomas elementales para constituir una sola muestra global. 0(a).7.3. Preparacin de las muestras para su anlisis.- Tomar las precauciones necesarias para

Nmero de tomas elementales 0(a).6.1.1 Graneles: Partidas que no excedan de 2,5 toneladas Partidas de ms de 2,5 toneladas..................

0(a).6.1.2 Productos envasados: 0(a).6.1.2.1 Envases con un contenido superior a 1 kilogramo. Partidas compuestas de 1 a 4 envases.......... Partidas compuestas de 5 a 16 envases........ Partidas compuestas de ms de 16 envases..

7 20 veces el nmero de toneladas de que conste la partida, limitado a un mximo de 40 tomas elementales.

Todos los envases 4 Del nmero de envases que compongan la partida, limitado a un mximo de 20 envases.

10

0(a).6.1.2.2 Envases con un contenido igual o inferior a 1 kilogramo: Partidas hasta 100 envases........................... Partidas de 101 a 1.000 envases................... Partidas de 1.001 a 10.000 envases.............. Partidas de ms de 10.000 envases..............

3 6 12 12+3 ms por cada fraccin de 2.500 envases (que exceda de 10.000).

Cuando la cifra obtenida sea un nmero fraccionario, se redondear ste hasta el nmero entero inmediatamente superior.

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evitar cualquier modificacin de la composicin de los ejemplares de la muestra, contaminacin o alteracin que pueda sobrevenir en el transcurso de la toma, del transporte o del almacenamiento. 0(a).7.3.1. Productos a granel o envasados para venta al por mayor superiores a 1 kilogramo.Mezclar con cuidado cada muestra global para obtener una muestra homognea. Si es necesario, reducir la muestra global hasta dos kilos (muestra reducida). Preparar a continuacin tres ejemplares de la muestra final que tengan la misma masa o el mismo volumen, aproximadamente. Introducir cada ejemplar en un recipiente apropiado. 0(a).7.3.2. Productos envasados para la venta al detalle: La muestra final estar formada por la totalidad de las tomas elementales, las cuales se repartirn en tres bloques iguales, cada uno de los cuales constituir un ejemplar de la muestra final. 0(a).7.4. Acondicionamiento de las muestras para anlisis.- Etiquetar y precintar o sellar los recipientes o los envases que las contenga (la etiqueta debe estar incorporada en el sello o precinto) de manera que le sea imposible abrirlos sin deteriorar el precinto o sello, manteniendo la temperatura adecuada en cada caso. 0(a).8. Personal autorizado. Las tomas de muestras destinadas a controles oficiales se llevarn a cabo por personal autorizado y acreditado por los Organismos competentes. 0(a).9. Acta de la toma de muestra. Cada muestra deber estar identificada por un acta que permita determinar sin ambigedad la partida controlada. 0(b). METODO DE TOMA DE MUESTRAS DE LECHES EN POLVO 0(b).1. Objeto. Obtener de una partida determinada una muestra representativa, con carcter oficial, para poder comprobar a partir de ella sus caractersticas fsico-qumicas. 0(b).2. Ambito de aplicacin. Este mtodo de toma de muestras se aplicar a: Leche entera en polvo. Leche descremada en polvo. Leche en polvo parcialmente descremada. Leche en polvo con alto contenido en grasa. 0(b).3. Definiciones Partida: La cantidad de producto que constituye una unidad de caractersticas presuntamente uniformes. Cuando la cantidad de producto a muestrear sea superior a 100 toneladas, se fraccionar, tericamente y a efectos de muestreo, en tantas partidas de hasta 100 toneladas como sea necesario. Toma elemental: Cantidad tomada en un punto de la partida. Muestra global: Conjunto constituido por las tomas elementales efectuadas en la misma partida, homogeneizada o no segn se indica ms adelante. Muestra reducida: Parte representativa de la muestra global obtenida por reduccin de sta. Muestra final: Parte de la muestra reducida o de la muestra global, previamente homogeneizada. 0(b).4. Material y aparatos. 0(b).4.1. Condiciones generales.- Los aparatos y utensilios destinados a la toma de muestras de leche en polvo debern ser de acero inoxidable u otro material idneo, no absorbente, de resistencia adecuada, que no provoque alteracin alguna que pudiera afectar a los resultados de los anlisis. El equipo ser de construccin lo suficientemente fuerte para evitar que se deforme durante su utilizacin. Todas las superficies debern estar pulidas y exentas de grietas y todos los ngulos debern ser redondeados. 0(b).4.2. Sondas: Larga (tipo A) y corta (tipo B) (ver figura 1).- Las dimensiones de las sondas, ya sean de hendidura larga o dividida en compartimentos, corta o de cualquier otro tipo, debern adaptarse a las caractersticas de la partida (profundidad del recipiente, dimensiones del saco, etc.) y al tamao de las partculas que componga la leche en polvo.

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Figura 1. Sondas para leche en polvo (todas las dimensiones se expresan en mm)

La hoja y el cierre debern ser de metal pulido, preferentemente de acero inoxidable. El mango de tipo largo tambin deber ser preferentemente de acero inoxidable. La sonda de tipo corto tendr un mango desmontable de madera o plstico, fijado a la hoja por una unin o bayoneta. La forma, el material y el acabado debern ser tales que la sonda pueda limpiarse fcilmente. El borde sobresaliente de la hoja del tipo A deber ser lo bastante agudo como para que pueda servir de raspador. La punta de la hoja deber ser bastante aguda para facilitar la toma de muestras. Las sondas debern presentar las dimensiones que se indican (con una tolerancia del 10 por 100) (dimensiones en milmetros): Tipo A larga 800 1a2 Tipo B corta 400 1a2

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Longitud de la hoja ................. Espesor del metal de la hoja ... Dimetro interno de la hoja en la punta ............................. 18 32 Dimetro interno de la hoja en el mango o en el eje................ 22 28 Anchura de la ranura en la punta 4 20 Anchura de la ranura en el mango o en el eje ................... 14 14 Advertencias sobre el uso de las sondas: En el caso de la leche en polvo, ms o menos adherentes, las sondas pueden introducirse verticalmente. Las sondas del tipo A se llenan completamente girando y se extraen verticalmente. Las sondas del tipo B se llenan completamente durante la introduccin pero deben extraerse en posicin oblicua para evitar prdidas en el extremo inferior. En el caso de leche en polvo, ms o menos fluida, se inclinarn los recipientes, se introducirn las sondas casi horizontalmente con la ranura hacia abajo y se extraern con la ranura hacia arriba. 0(b).4.3. Cuchara o esptula de mango largo. 0(b).4.4. Recipiente de muestreo en cintas transportadoras.- Su forma y dimensiones se ajustarn aproximadamente a las que se indican en la figura n 2. En su defecto se utilizar cualquier otro recipiente que, alcanzando la misma finalidad, cumpla las condiciones generales sealadas en 4.1. 0(b).4.5. Bolsa portaporciones.- Ha de ser de utilizacin nica, preferentemente de material plstico flexible y de dimensin aproximada de 30 por 40 centmetros. Se utilizar acoplada a la boca posterior de las sondas o para almacenamiento de cualquier otra toma elemental de alimentos no lquidos (figura 3). 0(b).4.6. Fraccionador.- Para las tomas elementales, as como para la preparacin de las mues-

Figura 2 Dimensiones aproximadas en mm

Figura 3 Dimensiones aproximadas en cm

tras reducidas y de las muestras finales, se podrn utilizar aparatos o utensilios destinados a dividir las muestras en partes aproximadamente iguales. 0(b).5. Procedimiento. 0(b).5.1. Generalidades.- Se pondr cuidado en evitar la absorcin de humedad atmosfrica por el producto contenido en el recipiente duran-

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te la toma de muestras para el anlisis. El recipiente se volver a cerrar perfectamente despus de realizar la toma de muestras. 0(b).5.2. Toma de muestras.- Se tomar una muestra no inferior a 200 gramos. Se pasar la sonda limpia y seca a travs del producto; en caso necesario inclinado o poniendo de lado el recipiente. Se orientar la ranura hacia abajo y se adoptar un ritmo uniforme de penetracin. Cuando la sonda alcance el fondo del recipiente se har girar 180 grados, se extraer y se descargar el contenido en el recipiente de la muestra. Se efectuar una o varias tomas para obtener una muestra no inferior a 200 gramos. El recipiente de la muestra se cerrar inmediatamente despus de tomar la misma. En caso de productos envasados en recipientes pequeos para la venta al por menor, la muestra estar constituida por el recipiente intacto y sin abrir. Se tomar uno o ms recipientes del mismo lote o con el mismo nmero de cdigo para obtener una muestra de no menos de 200 gramos. Las muestras debern tomarse siempre de esta forma cuando se necesite determinar propiedades que puedan alterarse fcilmente. 0(b).6. Exigencias cuantitativas. El acceso a la partida debe ser tal que permita tomar muestras de todas las partes que la componen. Todos los envases debern ser de la misma partida y tomados en distintos puntos de ella. 0(b).6.1. Tomas elementales.- El muestreo debe ser representativo de la partida examinada, por lo que el nmero mnimo de tomas elementales ser: 0(b).6.2. Muestra global.- La totalidad de la masa o volumen de las tomas elementales desti-

Nmero de tomas elementales 0.6.1.1 Graneles: Partidas que no excedan de 2,5 toneladas Partidas de ms de 2,5 toneladas 0.6.1.2 Productos envasados: 0.6.1.2.1 Envases con un contenido superior a 1 kilogramo: Partidas compuestas de 1 a 4 envases ....... Partidas compuestas de 5 a 16 envases ..... Partidas compuestas de ms de 16 envases 0(b).6.1.2.2 Envases con un contenido igual o inferior a 1 kilogramo: Partidas hasta 100 envases ........................ Partidas de 101 a 1.000 envases ................ Partidas de 1.001 a 10.000 envases ........... Partidas de ms de 10.000 envases............ 7

20 veces el nmero de toneladas de que conste la partida, limitado a un mximo de 40 tomas elementales.

Todos los envases 4 Del nmero de envases que compongan la partida, limitado a un mximo de 20 envases. 3 6 12 12+3 ms por cada fraccin de 2.500 envases (que exceda de 10.000).

Cuando la cifra obtenida sea un nmero fraccionario, se redondear ste hasta el nmero entero inmediatamente superior.

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nadas a construir la muestra global no puede ser inferior a: - Cuatro kilos en los graneles y productos envasados en envases con un contenido superior a un kilo. - Seiscientos gramos en productos envasados con un contenido inferior a un kilo. 0(b).7. Instrucciones referentes a las tomas, preparacin y el acondicionamiento de las muestras. 0(b).7.1. Generalidades.- Tomar y preparar las muestras lo ms rpidamente posible, teniendo en cuenta las precauciones necesarias para evitar que el producto se altere o contamine. Los aparatos y utensilios, as como las superficies y recipientes destinados a recibir las muestras deben estar limpios y secos. 0(b).7.2. Preparacin de las muestras globales.- Reunir las tomas elementales para constituir una sola muestra global. 0(b).7.3. Preparacin de las muestras para su anlisis.- Tomar las precauciones necesarias para evitar cualquier modificacin de la composicin de los ejemplares de la muestra, contaminacin o alteracin que pueda sobrevenir en el transcurso de la toma, del transporte o del almacenamiento. 0(b).7.3.1. Productos a granel o envasados para venta al por mayor superiores a un kilogramo.- Mezclar con cuidado cada muestra global para obtener una muestra homognea. Si es necesario, reducir la muestra global hasta dos kilos (muestra reducida). Preparar a continuacin tres ejemplares de la muestra final que tengan la misma masa o el mismo volumen, aproximadamente. Introducir cada ejemplar en un recipiente apropiado. 0(b).7.3.2. Productos envasados para la venta al detalle.- La muestra final estar formada por la totalidad de las tomas elementales, las cuales se repartirn en tres bloques iguales, cada uno de los cuales constituir un ejemplar de la muestra final. 0(b).7.4. Acondicionamiento de las muestras para anlisis.- Etiquetar y precintar o sellar los recipientes o los envases que las contengan (la etiqueta debe estar incorporada en el sello o precinto) de manera que le sea imposible abrirlos sin deteriorar el precinto o sello, manteniendo la temperatura adecuada en cada caso. 0(b).8. Personal autorizado. Las tomas de muestras destinadas a controles oficiales se llevarn a cabo por personal autorizado y acreditado por los Organismos competentes. 0(b).9. Acta de la toma de muestras.

Cada muestra deber estar identificada por un acta que permita determinar sin ambigedad la partida controlada. 1(a). GRASA (Leches natural, certificada, higienizada y esterilizada) 1(a).1. Principio. Este mtodo es aplicable a las leches naturales, certificada, higienizada y esterilizada, enteras o parcialmente desnatadas, definidas en el Reglamento de Centrales Lecheras y otras Industrias Lcteas. Se entiende por contenido en materia grasa de las leches natural, certificada, higienizada y esterilizada, el porcentaje en masa de las sustancias determinadas por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde al descrito en la norma FIL-1A: 1969 de la Federacin Internacional de Lechera. El contenido en materia grasa se determina gravimtricamente, por extraccin de la citada materia grasa de una solucin alcohlico-amoniacal del tipo de leche de que se trate, mediante ter tilico y ter de petrleo, evaporacin de los disolventes y pesado del residuo, segn el principio del mtodo de Rse-Gottlieb. 1(a).2. Material y aparatos. 1(a).2.1. Balanza analtica. 1(a).2.2. Probetas o matraces de extraccin adecuados, provistos de tapones de vidrio esmerilado, de tapones de corcho y otros dispositivos de cierre inatacables por los disolventes utilizados. Los tapones de corcho sern de buena calidad y se tratarn sometindolos sucesivamente a extracciones con ter etlico y con ter de petrleo. Despus se introducirn durante 20 minutos, por lo menos, en agua a una temperatura de 60 C o superior, y se dejarn enfriar tambin en agua, con objeto de que estn saturados cuando se utilicen. 1(a).2.3. Matraces de paredes delgadas y bases planas, de una capacidad de 150 a 250 ml. 1(a).2.4. Estufa de desecacin, bien ventilada y controlada termostticamente (ajustada para que funcione a una temperatura de 102 2 C), o una estufa de desecacin por vaco (temperatura 70-75 C, presin menor de 50 mm de Hg). 1(a).2.5. Materiales para facilitar la ebullicin, exentos de materia grasa, no porosos ni deleznables al ser utilizados, como, por ejemplo, perlas de vidrio o trozos de carburo de silicio (el empleo de estos materiales es facultativo, vase el apartado 1(a).4.3. 1(a).3. Reactivos Todos los reactivos debern ser de calidad

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pura para anlisis y no dejar en la evaporacin mayor cantidad de residuos que la autorizada para el ensayo en blanco (1(a).4.2.). En caso necesario, los reactivos podrn destilarse de nuevo en presencia de 1 g aproximadamente de mantequilla deshidratada por 100 ml de disolvente. El agua que se utilice deber ser destilada o, por lo menos, de igual pureza que el agua destilada. 131074 131129 131270 131085 132770 Agua PA-ACS Amonaco 25% (en NH3) PA Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO Etanol 96% v/v PA Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS 131315 Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO 131542 Potasio Yoduro PA-ISO 1(a).4. Procedimiento. 1(a).4.1. Preparacin de la muestra.- Poner la muestra a una temperatura de 20C. Mezclarla cuidadosamente hasta obtener una distribucin homognea de la materia grasa. No agitar muy enrgicamente para evitar la formacin de espuma en la leche o el batido de la materia grasa. Si resulta dificultoso dispersar la capa de nata, calentar lentamente hasta 35-40C, mezclando cuidadosamente y teniendo la precaucin de reincorporar a la muestra la nata que pudiera haberse adherido a las paredes del recipiente. Enfriar rpidamente la muestra hasta la temperatura ambiente. Si se desea se puede utilizar un homogeneizador apropiado para facilitar la dispersin de la grasa. Si se separa la materia grasa lquida o se observa la presencia de partculas blancas de forma irregular adheridas a las paredes del recipiente que contiene la muestra, el anlisis no dar los resultados correctos. 1(a).4.2. Ensayo en blanco.- Al mismo tiempo que se determina el contenido en materia grasa de la muestra, efectuar un ensayo en blanco con 10 ml de Agua PA-ACS en lugar de la muestra, empleando el mismo tipo de aparato de extraccin, los mismos reactivos en las mismas cantidades y siguiendo el mismo procedimiento que se describe a continuacin. Si el resultado del ensayo en blanco excede de 0,5 mg, habr que comprobar los reactivos, y aqul o aqullos que resulten impuros debern sustituirse o purificarse. 1(a).4.3. Determinacin.- Secar el matraz (si se desea con algn material 1(a).2.5., que facilite una ebullicin moderada durante la subsiguiente eliminacin de los disolventes) en la estufa durante un intervalo de media a una hora. Dejar que se enfre el matraz hasta la temperatura ambiente de la balanza y, una vez enfriado, pesarlo con una aproximacin de 0,1 mg. Invertir tres o cuatro veces el recipiente que contiene la muestra preparada y pesar inmediatamente en el aparato de extraccin, directamente o por diferencia de 10 a 11 g de la muestra bien mezclada, con una aproximacin de 1 mg. Aadir 1,5 ml de la solucin de Amonaco 25% (en NH 3) PA, o un volumen equivalente de una solucin ms concentrada, y mezclar convenientemente. Aadir 10 ml de Etanol 96% v/v PA y mezclar suavemente, pero de modo homogneo, manteniendo abierto el aparato de extraccin. Aadir 25 ml de Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS, cerrar el aparato y agitarlo vigorosamente, invirtindolo varias veces, durante 1 minuto. Si es necesario, enfriar el aparato con agua corriente. Quitar el tapn cuidadosamente y aadir 25 ml de Eter de Petrleo, utilizando los primeros ml para enjuagar el tapn y el interior del cuello del aparato, dejando que los lquidos de los enjuagues penetren en el ltimo. Cerrarlo, volviendo a

1(a).3.1. Amonaco 25% (en NH 3) PA (densidad aproximada a 20/4 0,910) o una solucin ms concentrada conocindose dicha concentracin. 1(a).3.2. Etanol 96% v/v PA o, en su defecto, 153973 Etanol 96 totalmente desnaturalizado PR. 1(a).3.3. Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS, exento de Perxidos. Para el ensayo de los perxidos, aadir a 10 ml de Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS contenidos en una pequea probeta con tapn de vidrio, previamente enjuagada con un poco de ter, 1 ml de solucin al 10% de Potasio Yoduro PA-ISO, recien preparada. Agitar y dejar reposar durante 1 minuto. No debe aparecer coloracin amarilla en ninguna de las dos capas. El Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS puede mantenerse exento de perxidos, aadiendo una lmina de Zinc hmeda, que deber sumergirse completamente en una solucin cida diluida de Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO durante 1 minuto y despus lavarse con Agua PA-ACS. Por litro de Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS, utilizar una superficie de 80 cm2 aproximadamente de lmina de Zinc cortada en bandas lo suficientemente largas para que lleguen por lo menos hasta el centro del recipiente. 1(a).3.4. Eter de Petrleo de puntos de ebullicin entre 30 C y 60 C. En su defecto usar Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO. 1(a).3.5. Disolvente mixto, preparado poco tiempo antes de su utilizacin, mezclando volmenes iguales de Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS y Eter de Petrleo 4060C PA-ISO (se podr sustituir la mezcla de disolventes en aquellos casos en que su utilizacin est prevista por Eter Dietlico o por Eter de Petrleo.

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colocar el tapn, y agitarlo e invertirlo repetidamente durante 30 segundos. Si no est previsto centrifugar, en la operacin descrita, no agitar muy enrgicamente. Dejar el aparato en reposo hasta que la capa lquida superior est completamente lmpida y claramente separada de la fase acuosa. Podr efectuarse igualmente la separacin mediante el uso de una centrfuga adecuada. Si se utiliza una centrfuga cuyo motor no sea trifsico, puede producirse chispas y ser preciso tomar las debidas precauciones para evitar una explosin o un incendio debido a la presencia de vapores de ter (por ejemplo, en caso de rotura de un tubo). Quitar el tapn y enjuagarlo, as como tambin el interior del cuello del aparato, con algunos ml de la mezcla de disolventes, y dejar que los lquidos de los enjuagues penetren en el aparato. Transvasar con cuidado el matraz, lo ms completamente posible, la capa superior de decantacin o con la ayuda de un sifn. Si el transvase no se efecta mediante sifn, tal vez sea necesario aadir un poco de Agua PA-ACS para elevar la separacin entre las dos capas, con objeto de facilitar la decantacin. Enjuagar el exterior e interior del cuello del aparato, o el extremo y la parte inferior del sifn, con algunos ml de la mezcla de disolventes. Dejar deslizar los lquidos del enjuague del exterior del aparato dentro del matraz y los del interior del cuello y del sifn, dentro del aparato de extraccin. Proceder a una segunda extraccin repitiendo las operaciones descritas, desde la adicin de Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS y 15 ml de Eter de Petrleo. Efectuar una tercera extraccin procediendo como se indica anteriormente, pero omitiendo el enjuague final. Eliminar con cuidado por evaporacin o destilacin la mayor cantidad posible de disolvente (incluido el etanol). Si el matraz es de pequea capacidad, ser necesario eliminar un poco de disolvente despus de cada extraccin de la manera antes indicada. Cuando ya no subsiste el olor a disolvente, calentar el matraz, tumbado durante 1 hora en la estufa. Dejar que el matraz se enfre hasta la temperatura ambiente de la balanza como se indic y pesar con una aproximacin de 0,1 mg. Repetir la operacin calentando a intervalos de 30 a 60 minutos hasta obtener una masa constante. Aadir de 15 a 25 ml de Eter de Petrleo para comprobar si la materia extrada es totalmente soluble. Calentar ligeramente y agitar el disolvente mediante un movimiento rotatorio hasta que toda la materia grasa se disuelva. Si la materia extrada es totalmente soluble en el Eter de Petrleo, la masa de materia grasa ser la diferencia entre las pesadas efectuadas. En caso contrario o de duda, extraer completamente

la materia grasa contenida en el matraz, mediante lavados repetidos con Eter de Petrleo caliente, dejando que se deposite la materia no disuelta antes de cada decantacin. Enjuagar tres veces el exterior del cuello del matraz. Calentar el matraz tumbado durante 1 hora en la estufa y dejar que se enfre hasta la temperatura ambiente de la balanza, como lo indicado anteriormente, y pesar con una aproximacin de 0,1 mg. La masa de la materia grasa ser la diferencia entre la masa obtenida y la obtenida en esta pesada final. 1(a).5. Clculo. La masa, expresada en gramos, de la materia grasa extrada es: (M1 M2) (B1 B2) y el contenido en materia grasa de la muestra, expresado en porcentaje de la masa, es: (M1 M2) (B1 B2) x 100 S en donde M1 = masa, en gramos, del matraz M, que contiene la materia grasa despus de desecar hasta masa constante. M2 = masa, en gramos, del matraz M, sin materia grasa, o en el caso de presencia de materias insolubles, despus de extraer completamente la materia grasa. B1 = masa, en gramos, del matraz B, del ensayo en blanco, despus de desecar hasta masa constante. B2 = masa, en gramos, del matraz B, o en el caso de presencia de materias insolubles, despus de extraer completamente la materia grasa. S = masa, en gramos, de la cantidad de muestra utilizada en la determinacin. La diferencia entre los resultados en dos determinaciones repetidas (resultados obtenidos simultneamente o uno inmediatamente despus de otro, por el mismo analista) no debe ser mayor de 0,03 g de materia grasa de 100 g de producto. 1(a).6. Referencias. 1(a).6.1. Norma Internacional FIL-IDF 1A: 1969. 1(b). GRASA (Leche desnatada) 1(b).1. Principio. Este mtodo es aplicable a las leches lquidas, no concentradas, y concretamente a la leche esterilizada desnatada, definida en el Reglamento de Centrales Lecheras y otras Industrias Lcteas. Se entiende por contenido en materia grasa de la leche desnatada el porcentaje en masa de la cantidad total de lpidos y sustancias lipoides,

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determinada por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde al descrito en la norma FIL-22: 1968 de la Federacin Internacional de Lechera. El contenido en materia grasa se determina gravimtricamente por adicin de amonaco y alcohol a una cantidad conocida de leche desnatada, extraccin por un disolvente de los lpidos y de las sustancias lipoides, evaporacin del disolvente y pesado del residuo, obtenido por aplicacin del mtodo Rse-Gottlieb. 1(b).2. Material y aparatos. 1(b).2.1. Balanza analtica, de sensibilidad mnima 0,1 miligramos. 1(b).2.2. Probetas o matraces de extraccin apropiados provistos de tapones para cierre hermtico (corcho o vidrio esmerilado). 1(b).2.3. Erlenmeyer o matraces de fondo plano, de 150 a 250 ml de capacidad, con zona esmerilada para identificacin. 1(b).2.4. Materiales que faciliten la ebullicin, exentos de materia grasa; por ejemplo, perlas de vidrio. 1(b).2.5. Dispositivos apropiados para la evaporacin de los disolventes. 1(b).2.6. Estufa que permita obtener una temperatura constante de 102-104C o estufa de desecacin por vaco. 1(b).2.7. Pipetas graduadas de 10 ml. 1(b).3. Reactivos. 131074 Agua PA-ACS 131085 Etanol 96% v/v PA 131129 Amonaco 25% (en NH3) PA 132770 Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS 131315 Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO 1(b).3.1. Etanol 96% v/v PA o Etanol desnaturalizado con metanol o con ter de petrleo. 1(b).3.2. Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS, exento de perxidos. 1(b).3.3. Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO. 1(b).3.4. Amonaco 25% (en NH3) PA (densidad 0,91 a 20C) lmpida e incolora. Los reactivos no deben dejar residuos despus de la evaporacin. 1(b).4. Procedimiento. 1(b).4.1. Preparacin de la muestra.- Mezclar la muestra cuidadosamente. En caso necesario, calentar la muestra a 35-40C y mezclar. Enfriar a 20C antes del anlisis. 1(b).4.2. Determinacin.- Con una aproximacin de 10 miligramos, pesar alrededor de 10 g, o introducir exactamente 10 mililitros (a 20 2C) de leche desnatada en el aparato de extraccin. Aadir 1 ml de la solucin Amonaco 25% (en NH3) PA y mezclar cuidadosamente. Aadir 10 ml de Etanol 96% v/v PA y mezclar el contenido. Aadir 25 ml de Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS y, despus de cerrar el aparato de extraccin, mezclar el contenido agitando e invirtiendo varias veces durante 1 minuto. Aadir 25 ml de Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO, cerrar el aparato de extraccin y mezclar el contenido agitando e invirtiendo repetidas veces. Dejar reposar el aparato de extraccin por lo menos 2 horas o centrifugar (por lo menos 5 minutos a 500-600 revoluciones por minuto) hasta que la capa Eter Dietlico-Eter de Petrleo est totalmente lmpida y completamente separada de la fase acuosa. Transvasar lo ms completamente posible, la capa Eter Dietlico-Eter de Petrleo por decantacin o, con ayuda de un dispositivo de sifn (teniendo cuidado de no traspasar la fase acuosa), a un erlenmeyer o matraz de fondo plano, que contenga un material destinado a facilitar la ebullicin, previamente desecado y pesado. Realizar una segunda extraccin utilizando 15 ml de Eter Dietlico PA y 15 ml de Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO, siguiendo el procedimiento indicado. Transvasar al mismo matraz la capa de Eter Dietlico-Eter de Petrleo como se indica anteriormente. Destilar con cuidado los disolventes contenidos en el matraz. Despus de la evaporacin de los disolventes, secar la materia grasa durante 1 hora en estufa de vaco a 70-75C (presin inferior a 50 mm de mercurio), o en una estufa de presin normal a 102-104C, colocando al matraz en posicin horizontal. Dejar enfriar el matraz y pesar cuando haya alcanzado la temperatura ambiente. Continuar el proceso de desecacin hasta peso constante (desecacin en vaco) o hasta un ligero aumento del peso (desecacin a presin normal). En el ltimo caso, tomar para el clculo el ltimo valor encontrado antes del aumento del peso. Si se considera necesario, la materia grasa puede volver a disolverse en Eter de Petrleo 40-60C PAISO para comprobar el resultado del anlisis. 1(b).4.3. Ensayo en blanco.- Para el control de los reactivos es necesario efectuar un anlisis en blanco siguiendo exactamente la forma de operar indicada y utilizando 10 ml de Agua PA-ACS en lugar de leche desnatada. El ensayo en blanco no deber indicar ms que una cantidad inapreciable. Para determinar la influencia de las variaciones de temperatura y humedad del aire, pesar un matraz y tratarlo como el utilizado para el anlisis, pero sin llenarlo con los disolventes. 1(b).5. Clculo. En el clculo de porcentaje de materia grasa se tendrn en cuenta, si es necesario, los valores encontrados en los ensayos en blanco. Si la cantidad de leche tomada para el anlisis se ha toma-

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do con ayuda de una pipeta, es necesario tener en cuenta la densidad de la leche. La diferencia entre los resultados en dos determinaciones repetidas no debe ser mayor de 0,005 g de materia grasa por 100 g de producto. 1(b).6. Referencia. 1(b).6.1. Norma Internacional FIL-IDF 22: 1963. 1(c). GRASA. (Leches concentrada, evaporada y condensada) 1(c).1. Principio. Este mtodo es aplicable a las leches concentrada, evaporada y condensada, enteras o desnatadas, definidas en el Reglamento de Centrales Lecheras y otras Industrias Lcteas. Se entiende por contenido en materia grasa de las leches concentrada, evaporada y condensada el porcentaje en masa de las sustancias determinadas por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde al descrito en la norma FIL-13A: 1969 de la Federacin Internacional de Lechera. El contenido en materia grasa se determina gravimtricamente por extraccin de la citada materia grasa en una solucin alcohlico-amoniacal del tipo de leche de que se trate, mediante ter dietlico y ter de petrleo, evaporacin de los disolventes y pesado del residuo, segn el principio del mtodo de Rse-Gottlieb. 1(c).2. Material y aparatos. 1(c).2.1. Balanza analtica. 1(c).2.2. Probetas o matraces de extraccin adecuados provistos de tapones de vidrio esmerilado, de tapones de corcho u otros dispositivos de cierre inatacables por los disolventes utilizados. Los tapones de corcho sern de buena calidad y se tratarn sometindolos sucesivamente a extracciones con ter dietlico y con ter de petrleo. Despus se introducirn, durante 20 minutos por lo menos, en agua a una temperatura de 60C o superior y se dejarn enfriar tambin en agua con objeto de que estn saturados cuando se utilicen. 1(c).2.3. Matraces de paredes delgadas y bases planas de una capacidad de 150 a 250 ml. 1(c).2.4. Estufa de desecacin bien ventilada y controlada termostticamente (ajustada para que funcione a una temperatura de 102 2C) o una estufa de desecacin por vaco (temperatura 70-75C, presin menor de 50 mm de Hg). 1(c).2.5. Materiales para facilitar la ebullicin, exentos de materia grasa, no porosos ni deleznables al ser utilizados, como, por ejemplo, perlas de vidrio o trozos de carburo de silicio (el empleo de estos materiales es facultativo).

1(c).3. Reactivos. Todos los reactivos deben de ser de calidad pura para anlisis y no dejar en la evaporacin mayor cantidad de residuos que la autorizada para el ensayo en blanco. En caso necesario, los reactivos podrn destilarse de nuevo en presencia de 1 g, aproximadamente, de mantequilla deshidratada por 100 ml de disolvente. El agua que se utilice deber ser destilada o por lo menos de igual pureza que el agua destilada. 131074 131129 131270 131085 132770 Agua PA-ACS Amonaco 25% (en NH 3) PA Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO Etanol 96% v/v PA Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS 131315 Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO 131542 Potasio Yoduro PA-ISO

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1(c).3.1. Amonaco 25% (en NH 3) PA (densidad aproximada a 20/4 0,910) o una solucin ms concentrada, conocindose dicha concentracin. 1(c).3.2. Etanol 96% v/v PA o, en su defecto, 153973 Etanol 96 totalmente desnaturalizado PR. 1(c).3.3. Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS, exento de Perxidos. Para el ensayo de los perxidos, aadir a 10 ml de Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS contenidos en una pequea probeta con tapn de vidrio, previamente enjuagada con un poco de ter, 1 ml de solucin al 10% de Potasio Yoduro PA-ISO, recin preparada. Agitar y dejar reposar durante 1 minuto. No debe aparecer coloracin amarilla en ninguna de las dos capas. El Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS puede mantenerse exento de perxidos, aadiendo una lmina de Zinc hmeda, que deber sumergirse completamente en una solucin cida diluida de Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO durante 1 minuto y despus lavarse con Agua PA-ACS. Por litro de Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS, utilizar una superficie de 80 cm2 aproximadamente de lmina de Zinc cortada en bandas lo suficientemente largas para que lleguen por lo menos hasta el centro del recipiente. 1(c).3.4. Eter de Petrleo de puntos de ebullicin entre 30C y 60C. En su defecto usar Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO. 1(c).3.5. Disolvente mixto, preparado poco tiempo antes de su utilizacin, mezclando volmenes iguales de Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS y Eter de Petrleo 4060C PA-ISO (se podr sustituir la mezcla de disolventes en aquellos casos en que su utilizacin est prevista por Eter Dietlico estabilizado

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con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS o por Eter de Petrleo). 1(c).4. Procedimiento. 1(c).4.1. Preparacin de la muestra. 1(c).4.1.1. Leche concentrada y leche evaporada.- Agitar e invertir el recipiente que contiene la muestra. Abrir y transvasar lentamente la leche a un segundo recipiente (provisto de cierre hermtico). Mezclar mediante transvases sucesivos, teniendo cuidado de incorporar a la muestra toda la materia grasa u otro constituyente adheridos a las paredes o al fondo del primer recipiente. Finalmente, transvasar la leche lo ms completamente posible al segundo recipiente y cerrar ste ltimo. En caso necesario, templar el envase original, cerrado, en bao de Mara a 40-60C. Sacarlo y agitar vigorosamente cada 15 minutos. Al cabo de 2 horas, retirar el envase y dejarlo enfriar hasta temperatura ambiente. Quitar totalmente la tapadera y mezclar cuidadosamente removiendo el contenido con una cuchara o esptula (si se separa la materia grasa no se debe efectuar el anlisis de la muestra). En el caso de envases flexibles, abrirlos y transvasar el contenido a un vaso. Rasgar los envases, despegar todas las materias adheridas a las paredes e introducirlas en el vaso. 1(c).4.1.2. Leche condensada.- Abrir el recipiente que contiene la muestra y mezclar cuidadosamente la leche con una cuchara o una esptula. Imprimir a este instrumento un movimiento rotativo ascendente y descendente de manera que las capas superiores e inferiores se mezclen bien con el resto del contenido. Tener cuidado de reincorporar a la muestra toda la masa de leche que pudiera haberse adherido a las paredes y a los fondos del recipiente. Transvasar la leche lo ms completamente posible a un segundo recipiente (provisto de cierre hermtico) y cerrar ste ltimo. En caso necesario, templar el bote original, cerrado, en bao de Mara a 30-40C. Abrir el bote, desprender toda la leche adherida a las paredes del mismo, transvasar a una cpsula lo suficientemente grande para permitir un manejo cuidadoso y mezclar hasta que toda la masa sea homognea. En el caso de tubos flexibles abrirlos y transvasar el contenido a un vaso. Rasgar los tubos, despegar todas las materias adheridas a las paredes e introducirlas en el vaso. 1(c).4.2. Ensayo en blanco.- Al mismo tiempo que se determina el contenido en materia grasa de la muestra, efectuar un ensayo en blanco con 10 ml de Agua PA-ACS en lugar de la muestra, empleando el mismo tipo de aparato de extraccin, los mismos reactivos en las mismas cantidades y siguiendo el mismo procedimiento que se describe a continuacin. Si el resultado del ensayo en blanco excede de 0,5 mg, habr que comprobar los reactivos y aqul o aqullos que resulten impuros debern sustituirse o purificarse. 1(c).4.3. Determinacin.- Proceder como en 1(a).4.3., excepto que se pesa de 4 a 5 g de la muestra, aadiendo a continuacin 7 ml de Agua PA-ACS, agitando suavemente y calentando ligeramente (40-50C) hasta la dispersin total del producto. 1(c).5. Clculo. Como en 1(a).5. 1(c).6. Referencia. 1(c).6.1. Norma Internacional FIL-IDF 13A: 1969. 1(d). GRASA (Leche en polvo) 1(d).1. Principio. Este mtodo es aplicable a las leches en polvo, entera, parcialmente desnatada y desnatada, definidas en el Reglamento de Centrales Lecheras y otras Industrias Lcteas. Se entiende por contenido en materia grasa de la leche en polvo el porcentaje en masa de las sustancias determinadas por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde al descrito en la norma FIL-9A: 1969 de la Federacin Internacional de Lechera. El contenido en materia grasa se determina gravimtricamente por extraccin de la citada materia grasa de una solucin alcohlico-amoniacal de leche en polvo mediante ter etlico y ter de petrleo, evaporacin de los disolventes y pesado del residuo, segn el principio del mtodo Rse-Gottlieb. 1(d).2. Material y aparatos. 1(d).2.1., 2, 3, 4, 5 y 6, como 1(a).2.1., 2, 3, 4, 5 y 6. 1(d).3. Reactivos. 1(d).3.1., 2, 3, 4 y 5, como 1(a).3.1., 2, 3, 4 y 5. 1(d).4. Procedimiento. 1(d).4.1. Preparacin de la muestra.- Transvasar la leche en polvo a un recipiente limpio y seco (provisto de cierre hermtico) de una capacidad que corresponda, aproximadamente, a dos veces el volumen del polvo. Cerrar en seguida el recipiente y mezclar cuidadosamente la leche en polvo agitndolo e invirtindolo repetidamente. Durante la preparacin de la muestra deber evitarse, en la medida de lo posible, la exposicin de la leche en polvo al aire atmosfrico con objeto de reducir al mnimo la absorcin de humedad.

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1(d).4.2. Ensayo en blanco.- Como en 1(a).4.2. 1(d).4.3. Determinacin.- Como en 1(a).4.3., excepto que se pesa, aproximadamente, 1 g de leche entera en polvo o 1,5 g de leche parcialmente desnatada en polvo o de leche desnatada en polvo aadiendo 10 ml Agua PA-ACS y agitando hasta la dispersin total del polvo de leche. Despus de aadir la solucin de Amonaco 25% (en NH3) PA, calentar en bao Mara a una temperatura de 60-70C durante 15 minutos, agitando de cuando en cuando, y enfriar a continuacin con agua corriente, si se desea. 1(d).5. Clculo. Como en 1(a).5. Referencia. 1(d).6.1. Norma Internacional FIL-IDF 9A: 1969. 1(e). GRASA (Leche natural) (Mtodo Gerber) En el caso de leche natural se puede emplear, como alternativo, el mtodo Gerber. 1(e).1. Principio. Liberacin total de la grasa por disolucin de las sustancias proteicas, separacin de la grasa por centrifugacin y posterior medida volumtrica de sta. Aplicable a leche natural, pasterizada y esterilizada. 1(e).2. Material y aparatos. 1(e).2.1. Pipetas aforadas de 11 ml. 1(e).2.2. Dosificador de mbolo de 10 ml para el cido sulfrico. 1(e).2.3. Bao de agua regulable a 65C. 1(e).2.4. Centrfuga Gerber. 1(e).2.5. Butirmetros original Gerber. Se pueden utilizar de varios tipos. 1(e).2.5.1. Graduacin de 0-5 por 100 divisiones en 0,1. Cuello ranurado. 1(e).2.5.2. Graduacin de 0-5 por 100 divisiones en 0,1. Cuello liso. 1(e).2.5.3. Graduacin de 0-7 por 100 divisiones en 0,1. Cuello ranurado. 1(e).2.5.4. Graduacin de 0-9 por 100 divisiones en 0,1. Cuello ranurado. 1(e).2.6. Tapones de caucho. 1(e).2.7. Empujador metlico.

1(e).3.2. Alcohol iso-Amlico segn Gerber mezcla de ismeros RE 1(e).4. Procedimiento. Colocar en el butirmetro 10 ml de Acido Sulfrico 90-91% segn Gerber RE y agregar 11 ml de leche con cuidado y lentamente para que no se mezclen, observndose claramente la separacin de ambas capas, cida y de leche. Agregar a continuacin 1 ml de Alcohol isoAmlico segn Gerber mezcla de ismeros RE (con dosificador) y cerrar el butirmetro. Agitar enrgicamente, envuelto en un pao para evitar posibles proyecciones hasta la total disolucin de la fase proteica de la leche. Verter y dejar en reposo algn tiempo para observar mejor si la disolucin ha sido completa. Llevar a la centrfuga durante 5 minutos. Sacar de la centrfuga con cuidado para no mover la capa superior de grasa ya separada. Colocar en el bao (65C) durante 5 minutos. Sacar y leer rpidamente. 1(e).5. Clculo. Se lee directamente en la escala del butirmetro. 1(e).6. Observaciones. 1(e).6.1. A veces el volumen de lquidos en el butirmetro no es suficiente para que la columna de grasa quede en la escala graduada; en este caso, antes de centrifugar, aadir unas gotas de cido sulfrico o simplemente agua si es despus de la centrifugacin, para conseguir que dicha columna pueda ser leda. 1(e).6.2. Puede ser conveniente despus de la agitacin del butirmetro y antes de centrifugar, colocarlo en el bao a 65C de 5 a 15 minutos para que el ataque sea lo ms completo posible, aunque presenta el inconveniente de hacer el glbulo graso ms pequeo, producindose un ligero aumento de volumen de grasa, obtenindose un valor ligeramente por exceso. A pesar de todo, si dicho tiempo de resistencia en el bao no se prolonga ms all de esos 15 minutos, la variacin apenas es apreciable, quedndose dentro del error experimental 0,05% en MG propio del mtodo. Sin embargo, presenta la ventaja de apreciar claramente antes de la centrifugacin si la disolucin ha sido total, factor fundamental en la determinacin. 1(e).6.3. En leches conservadas mediante formol, la disolucin de la protena es imposible o incompleta, por lo que la separacin de la capa grasa en la centrifugacin no es completa ni ntida. No es aconsejable en dicho caso el empleo de este mtodo.

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1(e).3. Reactivos. 171010 Acido Sulfrico 90-91% segn Gerber RE 171865 Alcohol iso-Amlico segn Gerber mezcla de ismeros RE 1(e).3.1. Acido Sulfrico 90-91% segn Gerber RE.

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2. PROTEINAS (*) 2.1. Principio. Se entiende por contenido en protenas de la leche el contenido en nitrgeno expresado en porcentaje en peso y multiplicado por el factor de conversin, que se determina por el mtodo expuesto a continuacin, el cual corresponde al descrito en la norma FIL-20: 1962 de la Federacin Internacional de Lechera. Este mtodo es aplicable a las leches no alteradas, natural, certificada, higienizada, esterilizada y a las reconstituidas asimismo no alteradas, posteriormente de las leches concentrada, evaporada, condensada y en polvo. La determinacin del nitrgeno total se realiza por aplicacin del mtodo Kjeldahl: una determinada cantidad pesada de leche se trata con cido sulfrico en presencia de mercurio II xido como catalizador con objeto de transformar el nitrgeno de los compuestos orgnicos en nitrgeno amoniacal. El amonaco se libera por adicin de sodio hidrxido, se destila y se recoge a una solucin de cido brico. A continuacin se valora el amonaco. 2.2. Material y aparatos. 2.2.1. Balanza analtica de 1 mg de sensibilidad mnima. 2.2.2. Aparato de digestin que permita mantener el matraz Kjeldahl en una posicin inclinada y provisto de un sistema de calentamiento que no afecte ms que a la parte del matraz ocupada por el lquido. 2.2.3. Matraz Kjeldahl de 500 ml de capacidad. 2.2.4. Refrigerante Liebig de tubo interior rectilneo. 2.2.5. Un tubo de salida con bulbo de seguridad esfrico, conectado a la parte inferior del refrigerante por unin esmerilada. 2.2.6. Una alargadera conectada al matraz Kjeldahl y al refrigerante Liebig por medio de goma. Uniones esmeriladas. 2.2.7. Un matraz erlenmeyer de 500 ml de capacidad. 2.2.8. Probetas graduadas de 25, 50, 100 y 150 ml. 2.2.9. Bureta de 50 ml graduados a 0,1 ml. 2.2.10. Materiales para facilitar la ebullicin. En la digestin, pequeos trozos de porcelana dura o perlas de vidrio, y en la destilacin, pequeos trozos de piedra pmez recin calcinados. 2.3. Reactivos. 172222 Acido Brico solucin 4% RE 181023 Acido Clorhdrico 0,1 mol/1 (0,1N) SV 131058 Acido Sulfrico 96% PA-ISO 131074 Agua PA-ACS 251170 Azul de Metileno (C.I. 52015) DC 172430 Indicador Mixto (Rojo de Metilo-Azul de Metileno) RE 141427 Mercurio II Oxido rojo PRS 211835 Piedra Pmez grnulos QP 131532 Potasio Sulfato PA-ACS-ISO 171617 Rojo de Metilo (C.I. 13020) RE-ACS 131644 di-Sodio tetra -Borato 10-hidrato PAACS-ISO 131687 Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO 211682 Sodio Sulfuro 9-hidrato QP 2.3.1. Potasio Sulfato PA-ACS-ISO 2.3.2. Mercurio II Oxido rojo PRS 2.3.3. Acido Sulfrico 96% PA-ISO 2.3.4. Solucin de Sodio Hidrxido: 500 g de Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO y 12 g de Sodio Sulfuro 9-hidrato QP disueltos en 1.000 ml de Agua PA-ACS. 2.3.5. Acido Brico solucin 4% RE. 2.3.6. Acido Clorhdrico 0,1 mol/l (0,1N) SV 2.3.7. Indicador Mixto (Rojo de Metilo-Azul de Metileno) RE. En su defecto puede prepararse disolviendo 2 g de Rojo de Metilo (C.I. 13020) REACS y 1 g de Azul de Metileno DC en 1.000 ml de Etanol 96% v/v PA. 2.3.8. Solucin de di-Sodio tetra -Borato 10hidrato PA-ACS-ISO para la valoracin del Acido Clorhdrico. Los reactivos y las soluciones utilizadas no deben contener sustancias nitrogenadas. 2.4. Procedimiento. 2.4.1. Preparacin de la muestra.- Antes del anlisis poner la muestra a 20 2C y mezclarla cuidadosamente. Si no se obtiene una dispersin homognea de la materia grasa, calentarla lentamente a 40C, mezclar suavemente y enfriarla de nuevo a 20 2C. 2.4.2. Determinacin.- Introducir sucesivamente en el matraz Kjeldahl algunas perlas de vidrio o pequeos trozos de porcelana, alrededor de 10 g de Potasio Sulfato PA-ACS-ISO, 0,5 g de Mercurio II Oxido rojo PRS y alrededor de 5 g de leche exactamente pesados, con aproximacin de 1 mg. Aadir 20 ml de Acido Sulfrico 96% PA-ISO y mezclar el contenido del matraz. Calentar cuidadosamente el matraz Kjeldhal sobre el dispositivo para la reaccin hasta que no se forme espuma y el contenido se vuelva lquido. Continuar la reaccin por calentamiento ms intenso, hasta que el contenido se vuelva lquido. Continuar la reaccin por calentamiento ms intenso, hasta que el contenido del matraz est perfectamente lmpido e incoloro. Durante el calentamiento, agitar de cuando en cuando el contenido del matraz. Cuando el lquido est perfectamente lmpido, proseguir la ebullicin durante una hora y media, evitando todo sobrecalentamiento local.

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Dejar enfriar el contenido del matraz a la temperatura ambiente, aadir alrededor de 150 ml de Agua PA-ACS y algunos fragmentos de Piedra Pmez grnulos QP, mezclar cuidadosamente y dejarlo todava enfriar algo ms. Con la ayuda de una probeta graduada, verter 50 ml de Acido Brico solucin 4% RE en el matraz erlenmeyer, aadir cuatro gotas de indicador y mezclar. Situar el matraz erlenmeyer bajo el refrigerante, de manera que el extremo del tubo de salida se introduzca en la solucin de Acido Brico. Con la ayuda de una probeta graduada aadir al contenido del matraz Kjeldahl 80 ml de la solucin de Sodio Hidrxido que contiene sulfuro. Durante esta operacin, mantener el matraz inclinado, de tal manera que el Sodio Hidrxido se deslice a lo largo de la pared del recipiente y que los lquidos no se mezclen. Conectar inmediatamente el matraz Kjeldahl al refrigerante por medio de la alargadera. Mezclar el contenido del matraz por agitacin. Calentar a ebullicin evitando la espuma. Proseguir la destilacin hasta el momento en que el contenido del matraz presente ebullicin a saltos. Regular el calentamiento de manera que la destilacin dure por lo menos 20 minutos. Enfriar bien el destilado para evitar que se caliente la solucin de Acido Brico. Poco tiempo antes de terminar la destilacin, bajar el matraz erlenmeyer para que el tubo de salida no est introducido en la solucin de Acido Brico. Detener el calentamiento, elevar el tubo de salida y enjuagar sus paredes exteriores e interiores con un poco de Agua PA-ACS. Valorar el destilado con Acido Clorhdrico 0,1 mol/l (0,1N) SV. 2.4.3. Ensayo en blanco.- Efectuar un ensayo en blanco, aplicando el mtodo operatorio descrito, pero utilizando cinco mililitros de Agua PA-ACS en lugar de leche. 2.5. Clculo. 2.5.1. Nitrgeno total.- Se calcula el contenido en nitrgeno total mediante la frmula. 1,40N (V1 - V0) Nitrgeno total % = P N = normalidad del cido clorhdrico. V1 = volumen en mililitros de cido clorhdrico utilizado en la determinacin. V0 = volumen en mililitros de cido clorhdrico utilizado en el ensayo en blanco. P = peso en gramos de la leche empleada en el anlisis. La diferencia mxima entre dos determinaciones repetidas no debe sobrepasar el 0,005% de nitrgeno. 2.5.2. Protenas.- Para expresar el contenido en protenas de la leche analizada es preciso multiplicar la cantidad de nitrgeno total, obtenida

segn el mtodo descrito, por un factor de conversin que se fija en 6,38. En consecuencia, el contenido en protenas viene dado por la frmula 1,40N (V1 - V0) Protenas % = x 6,38 P 2.6. Referencia. 2.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 20: 1962. (*) En el Real Decreto 1679/1994, captulo I, artculo 5, apartado 9, publicado en BOE, n 229, de fecha 24/9/94, se indica que la leche de vaca contiene un mnimo de 28 gramos de materia proteica por litro, obtenida al multiplicar el contenido en nitrgeno total de la leche expresado porcentualmente por 6,38. 3. CASEINA 3.1. Principio. Se entiende por contenido en casena de la leche el contenido en protenas, expresado en porcentaje en peso, obtenidas despus de una precipitacin a pH 4,6, siguiendo el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde a la norma FIL-20: 1964 de la Federacin Internacional de Lechera. Este mtodo es aplicable a las leches no alteradas, natural, certificada, higienizada, esterilizada y a las reconstituidas tambin, no alteradas posteriormente, de las leches concentrada, evaporada, condensada y en polvo. Asimismo puede aplicarse a las muestras de leche conservadas por adicin de formaldehdo (1:2.500). Se determina la cantidad total de nitrgeno de la leche. A continuacin la casena se precipita con un tampn actico-acetato y se filtra. Se determina luego la cantidad de nitrgeno del filtrado. La cantidad de casena se calcula con estas dos determinaciones de nitrgeno, que se realizan por el mtodo Kjeldahl, segn el mtodo 2. 3.2. Material y aparatos. 3.2.1. Pipetas de 0,5, 1 y 10 ml. 3.2.2. Probeta graduada de 100 ml. 3.2.3. Matraz graduado de 100 ml. 3.2.4. Papel filtro, lavado en cido, velocidad media: de 11 a 12,5 cm. 3.2.5. Embudos. 3.3. Reactivos. 131008 Acido Actico glacial PA-ACS 131074 Agua PA-ACS 171634 Sodio Acetato 1 mol/1 (1M) RE 3.3.1. Solucin de Acido Actico al 10% p/v. 3.3.2. 171634 Sodio Acetato 1 mol/I (1M) RE.

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3.4. Procedimiento. 3.4.1. Preparacin de la muestra.- Antes del anlisis poner la muestra a 20 2C y mezclar cuidadosamente. Si no se obtiene una dispersin homognea de la materia grasa, calentar la muestra lentamente a 40C; mezclar suavemente y enfriar a 20 2C. 3.4.2. Determinacin.- Determinar el contenido total en nitrgeno (NT) de la leche utilizando el mtodo Kjeldahl, segn el mtodo 2. Precipitar la casena de la siguiente manera: Llevar con pipeta 10 ml de leche a un matraz aforado de 100 ml. Aadir 75 ml de Agua PA-ACS a 40C; despus un ml de la solucin de Acido Actico. Mezclar suavemente el contenido del matraz y esperar 10 minutos. Aadir con pipeta un ml de la solucin de Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RE. Mezclar de nuevo. Dejar enfriar el contenido del matraz a unos 20C, completar hasta 10 ml con Agua PA-ACS y mezclar invirtiendo lentamente el matraz. Cuando el precipitado de casena y materia grasa se haya depositado, filtrar con filtro seco y recoger el filtrado en un recipiente seco. Determinar el contenido en nitrgeno de 50 ml del filtrado lmpido (nitrgeno no casenico: NNC), utilizando el mtodo Kjeldahl segn el mtodo 2. 3.4.3. Ensayo en blanco.- Adems del ensayo en blanco previsto en el mtodo 2, relativo a la determinacin del contenido en nitrgeno total de la leche, conviene hacer un ensayo en blanco para comprobar los reactivos que precipitan la casena, utilizando 50 ml de Agua PA-ACS, 0,5 ml de la solucin de Acido Actico y 0,5 ml de la solucin de Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RE. 3.5. Clculo. Calcular el porcentaje en peso de NT en la leche y del NNC en el suero lmpido con tres cifras significativas. Corregir la cifra obtenida para NNC por el volumen del precipitado, multiplicando el valor obtenido por 0,994. Calcular la cantidad de casena mediante la frmula. Cantidad de casena % = 6,38 (NT - NNC) La aplicacin de este factor a todas las leches enteras no entraa error sensible; sin embargo, si se aplica el mtodo a leche desnatada, el factor de correccin utilizado deber ser 0,998. La diferencia entre dos determinaciones repetidas no debe sobrepasar el 0,04% de casena. 3.6. Referencia. 3.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 29: 1964. 4. LACTOSA 4.1. Principio. Se entiende por contenido en lactosa de la leche el contenido en lactosa monohidratada expresado en porcentaje en peso, determinado por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde al descrito en la norma FIL-28: 1964 de la Federacin Internacional de Lechera. Este mtodo es aplicable a las leches no alteradas natural, certificada, higienizada, esterilizada y a las reconstituidas, asimismo no alteradas y posteriormente; de las leches concentrada, evaporada, condensada y en polvo. Tambin puede aplicarse a las muestras de leche conservadas por adicin de formaldehdo (1:2.500). El contenido en lactosa se determina indirectamente, una vez desproteinizada la leche, por valoracin de la cantidad de halgeno reducido al final de la reduccin entre lactosa y yoduro potsicocloramina T. 4.2. Material y aparatos. 4.2.1. Balanza analtica. 4.2.2. Matraces aforados de 100 ml. 4.2.3. Pipetas de 5, 10, 20, 25 y 40 ml. 4.2.4. Papel filtro (lavado en cido, velocidad media: 11 a 12,5 cm). 4.2.5. Embudos filtrantes. 4.2.6. Matraces erlenmeyer, de una capacidad de 150 a 200 ml. 4.2.7. Matraces erlenmeyer, de 150 ml con cierre esmerilado. 4.2.8. Bureta de 10 ml graduada a 0,02 ml. 4.3. Reactivos. 182108 Acido clorhdrico 2 mol/l (2N) SV 131032 Acido orto-Fosfrico 85% PA-ACS-ISO 131058 Acido Sulfrico 96% PA-ISO 180159 Acido Sulfrico 0,5 mol/l (1N) SV 131074 Agua PA-ACS 171096 Almidn soluble RE 142323 Cloramina T 3-hidrato PRS 131542 Potasio Yoduro PA-ISO 182160 Sodio Tiosulfato 0,05 mol/l (0,05N) SV 131724 Sodio Tungstato 2-hidrato PA 4.3.1. Reactivo del Acido Tungstnico: Disolver 7 g de Sodio Tungstato 2-hidrato PA en 870 ml de Agua PA-ACS; aadir 0,1 ml de una solucin de Acido orto-Fosfrico 85% PA-ACS-ISO y 70 ml de Acido Sulfrico 0,5 mol/l (1N) SV. 4.3.2. Solucin de Cloramina T, 0,040 N(5,70 g por litro). 4.3.3. Solucin Tiosulfato solucin normalizada a un poco ms de 0,040N. Usese Sodio Tiosulfato 0,05 mol/l (0,05N) SV. 4.3.4. Solucin de Potasio Yoduro PA-ISO del 10%, recientemente preparada (incolora). 4.3.5. Acido Clorhdrico 2 mol/l (2N) SV. 4.3.6. Solucin de Almidn soluble RE al 1%. 4.4. Procedimiento. 4.4.1. Preparacin de la muestra.- Antes del anlisis poner la muestra a 20 2C y mezclarla

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con cuidado. Si no se obtiene una dispersin homognea de la materia grasa, calentar la muestra lentamente a 40C, mezclar suavemente y enfriar a 20 2C. 4.4.2. Determinacin.- Llevar con pipeta 10 ml de leche a matraz aforado de 100 ml. Aadir 25 ml de Agua PA-ACS, 40 ml del reactivo de Acido Tungstnico y mezclar suavemente. Completar hasta 100 ml con Agua PA-ACS, mezclar y dejar que se deposite el precipitado. Filtrar con un filtro seco y recoger en un matraz seco. Con una pipeta tomar 10 ml de filtrado y ponerlo en un matraz erlenmeyer de 150 ml provisto de tapn esmerilado. Aadir 5 ml de la solucin de Potasio Yoduro PA-ISO y exactamente 20 ml de la solucin de Cloramina T 3-hidrato PRS. Mezclar. Tapar el matraz con su tapn, previamente humedecido con un poco de solucin de Potasio Yoduro PAISO y mantenerlo en la oscuridad durante una hora y media a 18-20C. Quitar el tapn, enjuagarlo en el matraz con un poco de Agua PA-ACS y aadir 5 ml de la solucin de Acido clorhdrico 2 mol/l (2N) SV. Aadir exactamente 10 ml de la solucin de Sodio Tiosulfato 0,05 mol/l (0,05N) SV. Valorar con una aproximacin de 0,02 ml con la solucin de Sodio Tiosulfato 0,05 mol/l (0,05N) SV. Hacia el final de la valoracin, aadir dos o tres gotas de la solucin de Almidn soluble RE. 4.4.3. Ensayo en blanco.- Efectuar un ensayo en blanco siguiendo exactamente el mtodo operatorio descrito, pero empleando 10 ml de Agua PA-ACS en lugar del filtrado. 4.5. Clculo. Calcular la diferencia entre los valores de tiosulfato obtenidos para el ensayo en blanco y para el de la leche. Corregir el valor en funcin del volumen del precipitado, multiplicando por 0,992. Convertir la cifra obtenida en lactosa monohidratada, teniendo en cuenta que 1 ml de solucin de tiosulfato 0,040N corresponde a 0,00720 g de lactosa monohidratada. Expresar los resultados en porcentajes de lactosa monohidratada. La aplicacin de este factor 0,992 a todas las leches enteras no ocasiona ningn error sensible; sin embargo, si el mtodo se aplica a la leche desnatada, debe utilizarse 0,996 como factor de correccin. La diferencia mxima entre dos determinaciones repetidas no debe sobrepasar de 0,05% de lactosa.

La concentracin de la solucin de tiosulfato ha sido elegida de tal forma que la lectura en bureta sea de 2 a 3,5 ml para la mayor parte de las muestras de leche y de 9,5 a 9,7 ml para los ensayos en blanco. NOTA: Para esta normalizacin peridica del Sodio Tiosulfato 0,05 mol/l (0,05N) SV puede emplearse: 182150 Potasio Yodato 0,025M SV. Cuando se proceda a una serie de anlisis se deben preparar los filtrados y los ensayos en blanco hasta la adicin de potasio yoduro inclusive. Finalmente se aade rpidamente la solucin de cloramina T a cada matraz y se anota la hora. Despus de una hora y media (se admite una tolerancia de una hora veinte minutos a una hora cuarenta minutos) se aade el cido clorhdrico en todos los matraces y siguiendo el mismo orden. As se paraliza la reaccin y los matraces se pueden valorar por turno. 4.7. Referencia. 4.7.1. Norma Internacional FIL-IDF 28: 1967. 5(a). EXTRACTO SECO (*) (Leches natural, certificada, higienizada y esterilizada) 5(a).1. Principio. Se entiende por contenido en extracto seco de las leches natural, certificada, higienizada y esterilizada, el residuo, expresado en porcentaje en peso, obtenido despus de efectuada la desecacin de la leche de que se trate por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde al descrito en la norma FIL-21: 1962 de la Federacin Internacional de Lechera. Una cantidad conocida de leche se deseca a temperatura constante hasta peso constante. El peso obtenido despus de desecar representa el de la materia seca. 5(a).2. Material y aparatos. 5(a).2.1. Balanza analtica, de sensibilidad 0,1 mg como mnimo. 5(a).2.2. Desecador provisto de un buen deshidratante (211335 Gel de Slice 3-6 mm con indicador QP). 5(a).2.3. Estufa de desecacin que permita conseguir una temperatura constante de 102 2C. 5(a).2.4. Cpsulas metlicas planas, en metal inoxidable o de vidrio de 2 cm de altura aproximadamente y de 6 a 8 cm de dimetro, aproximadamente, con tapas adecuadas. 5(a).2.5. Bao de agua. 5(a).3. Procedimiento. 5(a).3.1. Preparacin de la muestra.- Antes del

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4.6. Observaciones. La solucin de tiosulfato se debe normalizar peridicamente, por ejemplo, por valoracin de 10 ml de Potasio Yodato 0,04N, a los que se habr aadido 5 ml de solucin de Potasio Yoduro PA-ISO y 5 ml de la solucin de Acido Clorhdrico 2 mol/l (2N) SV.

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anlisis, poner la muestra a 20 2C y mezclarla cuidadosamente. Si no se obtiene una buena reparticin de la materia grasa, calentar lentamente a 40C, mezclarla suavemente y enfriarla, a 20 2C. 5(a).3.2. Determinacin.- Secar la cpsula y la tapa a 102 2C durante 30 minutos. Colocar la cpsula tapada en un desecador, dejarla enfriar a la temperatura ambiente y pesarla. Poner aproximadamente 3 ml de la muestra en la cpsula, tapar la cpsula con la tapa y pesarla. Poner la cpsula destapada en bao de agua durante 30 minutos. Poner la cpsula y la tapa en una estufa de desecacin a 102 2C durante 2 horas. La tapa se debe poner a un lado de la cpsula. Cubrir la cpsula con la tapa y ponerla en el desecador; dejarla enfriar y pesarla. Ponerla 1 hora ms en la estufa de desecacin; dejarla enfriar y pesarla. Repetir la desecacin hasta que la diferencia entre dos pesadas consecutivas no sea mayor de 0,5 mg. 5(a).4. Clculo. P' Contenido en extracto seco % = x 100 P P' = peso en gramos de la muestra despus de la desecacin. P = peso en gramos de la muestra antes de la desecacin. Si a la muestra de la leche se le han adicionado como conservadores sustancias no voltiles, como, por ejemplo, potasio dicromato, se debe corregir la expresin del extracto seco como sigue: P' C' Contenido en extracto seco % = x 100 PC C' = cantidad de conservante no voltil en la muestra analizada. P C = porcentaje de conservante x 100 En caso de ser potasio dicromato, el contenido porcentual de conservante se determina segn el mtodo 7. La diferencia entre dos determinaciones repetidas no debe ser mayor de 0,05% del extracto seco. 5(a).5. Referencia. 5(a).5.1. Norma Internacional FIL-IDF 21: 1962. (*) En el Real Decreto 1679/1994, captulo I, artculo 5, apartado 9, publicado en BOE n 229, de fecha 24/9/1994, se indica que la leche de vaca contiene un extracto seco magro igual o superior a 85 gramos por litro. 5(b). EXTRACTO SECO (Leches concentrada, evaporada y condensada) 5(b).1. Principio. Se entiende por contenido en extracto seco de las leches concentrada, evaporada y condensada, el residuo, expresado en porcentaje en peso obtenido despus de efectuada la desecacin de la leche de que se trate, por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde al descrito en la norma FIL-15: 1961 de la Federacin Internacional de Lechera. El mtodo consiste en la dilucin con agua de una cantidad conocida de muestra y la desecacin con arena a temperatura constante. El peso obtenido despus de desecar representa el de la materia seca. 5(b).2. Material y aparatos. 5(b).2.1. Balanza analtica de sensibilidad: 0,1 mg como mnimo. 5(b).2.2. Desecador provisto de un buen deshidratante 211335 Gel de Slice 3-6 mm con indicador QP. 5(b).2.3. Estufa de desecacin que permita obtener una temperatura constante de 98100C. 5(b).2.4. Cpsulas metlicas, planas, en metal inoxidable o de vidrio de 2,5 cm de altura aproximadamente, y de 7,5 cm de dimetro aproximado, con tapas adecuadas. 5(b).2.5. Arena de cuarzo o 211160 Arena de Mar lavada, grano fino QP que pase a travs de un tamiz de diez aberturas por cm, pero que no pase a travs de un tamiz de 40 aberturas por cm y, si es necesario, lavada con 131019 Acido Clorhdrico 35% PA-ISO, despus con 131074 Agua PA-ACS y finalmente secada y calcinada. Para comprobar si la arena es adecuada, desecar una pequea cantidad a 98-100C hasta peso constante, aadir Agua PA-ACS, desecar de nuevo y pesar. No debe haber diferencia entre las dos pesadas. 5(b).2.6. Varillas cortas de vidrio. 5(b).2.7. Bao de agua. 5(b).3. Procedimiento. 5(b).3.1. Preparacin de la muestra.- Si se observa una separacin parcial ms o menos importante de algunos componentes, por ejemplo, materias proteicas, materia grasa, sales de calcio o lactosa, es necesario mezclar la muestra. 5(b).3.1.1. Leche concentrada o evaporada.Abrir el envase al borde de la tapa, verter la leche despacio en otro recipiente y mezclar bien por sucesivos transvases. La leche o la grasa que se adhiere a la tapa debe reincorporarse a la muestra. Calentar entonces la muestra tapada a una

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temperatura de 40C y mezclar ntimamente removiendo. Dejar enfriar. 5(b).3.1.2. Leche condensada.- Abrir el bote al borde de la tapa. La leche o grasa adherida a la tapa deber incorporarse a la muestra. Calentar a 40C y mezclar ntimamente removiendo de arriba abajo con una cuchara. Dejar enfriar. 5(b).3.2. Determinacin.- Colocar en la cpsula, aproximadamente, 25 g de arena y una pequea varilla de vidrio. Secar la cpsula y su contenido, con la tapa abierta, a 98-100C durante 2 horas. Colocar la cpsula tapada en un desecador, dejarla enfriar a la temperatura ambiente y pesar. Arrastrar la arena hacia un borde de la cpsula, pesar exactamente y poner en el espacio libre, aproximadamente 1,5 g de la muestra. Aadir cinco ml de Agua PA-ACS, mezclar los lquidos y la arena mediante una varilla de vidrio. Dejar la varilla en la mezcla. Colocar la cpsula en bao de agua hirviendo durante 20 minutos y remover con cuidado la mezcla de cuando en cuando. Colocar la cpsula con la varilla y la tapa en una estufa de desecacin a 98-100C durante 1 hora 30 minutos. La tapa se debe colocar al lado de la cpsula. Cubrir la cpsula con la tapa y ponerla en el desecador; dejarla enfriar y pesar. Colocar 1 hora ms en la estufa de desecacin; dejarla enfriar y pesar como antes. Repetir la desecacin hasta que la diferencia en peso entre dos pesadas sucesivas no exceda de 0,5 mg. 5(b).4. Clculo. P' Contenido en extracto seco % = x 100 P P' = peso en gramos de la muestra despus de desecar. P = peso en gramos de la muestra antes de desecar. La diferencia entre dos determinaciones repetidas no debe ser mayor de 0,1% del extracto seco. 5(b).5. Referencia. 5(b).5.1. Norma Internacional FIL-IDF 15: 1961. 6. CENIZAS

6.2. Material y aparatos. 6.2.1. Balanza de sensibilidad: 0,1 mg como mnimo. 6.2.2. Desecador provisto de un buen deshidratante (211335 Gel de Slice 3-6 mm con indicador QP). 6.2.3. Estufa de desecacin, regulada a 120C. 6.2.4. Horno elctrico con circulacin de aire, provisto de un regulador de temperatura. 6.2.5. Cpsula de platino o de un material inalterable en las condiciones del ensayo de aproximadamente 55 ml de dimetro y 25 de altura. 6.2.6. Bao de agua a temperatura de ebullicin. 6.3. Procedimiento. Colocar la cpsula en la estufa de desecacin a 102 2C durante 30 minutos. Pasarla luego al desecador, dejarla enfriar a la temperatura ambiente y pesar. Pesar exactamente alrededor de 10 g de leche en la cpsula. Poner la cpsula en bao de agua hirviendo hasta secado por evaporacin (aproximadamente siete horas). Incinerar el extracto seco, procedente de la desecacin anterior, por calentamiento durante 2 o 3 horas en un horno regulado entre 520 y 550C (no deben existir en ste ltimo partculas carbonosas). Poner a enfriar la cpsula en un desecador. Pesar con una aproximacin de 0,5 mg. 6.4. Clculo. El contenido en cenizas de la leche, expresado en porcentaje en peso, es igual a: M-m Cenizas % = 100 P M = peso de la cpsula y de las cenizas despus de la incineracin y enfriamiento posterior. m = peso de la cpsula vaca. P = peso en gramos de la leche empleada en la determinacin de las cenizas. 6.5. Observaciones. El peso de las cenizas es variable segn las condiciones de incineracin. La tcnica descrita anteriormente proporciona los resultados ms constantes; las diferencias no pasan generalmente de un 2% por trmino medio, y el 95% por lo menos de los cloruros se encuentran en las cenizas. Cuando la temperatura del horno se haya elevado ligeramente por encima de 550C, determinar los cloruros y corregir en consecuencia el peso de las cenizas. Si a la muestra se le ha aadido potasio dicromato, es necesario efectuar dos correcciones para obtener un valor aproximado de las cenizas de la leche inicial, operando como sigue:

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6.1. Principio. Se entiende por contenido en cenizas de la leche el producto resultante de la incineracin del extracto seco, expresado en porcentaje en peso, obtenido segn el procedimiento descrito a continuacin. El extracto seco se incinera a una temperatura determinada y en una lenta corriente de aire.

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1 Determinar el potasio dicromato y restar su peso del de las cenizas. 2 Determinar los cloruros en las cenizas, expresarlos en NaCl y aadir al peso de las cenizas la diferencia entre los cloruros totales de la leche y los cloruros resultantes. 7. POTASIO DICROMATO 7.1. Principio. La determinacin se realiza sobre las cenizas de la leche, por reduccin de los cromatos mediante una solucin de sulfato ferroamnico (sal de Mohr) Fe(NH4)2 (SO4)2. 6H2O cuyo exceso se valora con potasio permanganato. 7.2. Reactivos. 131058 Acido Sulfrico 96% PA-ISO 131074 Agua PA-ACS 131368 Amonio Hierro II Sulfato 6-hidrato PAISO 182114 Potasio Permanganato 0,01 mol/l (0,05N) SV 7.2.1. Solucin acuosa de Sal de Mohr de 8 g por l, (Amonio Hierro II Sulfato 6-hidrato PA-ISO), para valorar en el momento de su empleo (esta solucin se estabiliza por adicin de 12 ml de Acido Sulfrico 96% PA-ISO por litro). 7.2.2. Solucin valorada de Potasio Permanganato 0,02N en la cual 1 ml corresponda a 0,00098 g de Cr2O7K2. NOTA: En un matraz aforado de 250 ml introducir 100 ml de Potasio Permanganato 0,01 mol/l (0,05N) SV, diluir y enrasar con Agua PA-ACS. Determinar el factor de la solucin 0,02N resultante. 7.2.3. Acido Sulfrico 96% PA-ISO (d = 1,84). 7.3. Procedimiento. Agotar las cenizas por lavados sucesivos con Agua PA-ACS; despus, con una solucin acuosa de Acido Sulfrico al 5% en volumen, obtener un total de 25 a 30 ml de lquido. Recogerlo en un vaso para valorar. Aadir alrededor de 5 ml de Acido Sulfrico 96% PA-ISO y 20 ml exactamente medidos de la solucin sulfrica de Sal de Mohr con la solucin valorada de Potasio Permanganato 0,02N hasta coloracin rosa permanente. Por otra parte, valorar en las mismas condiciones 20 ml de la misma solucin sulfrica de Sal de Mohr mediante la solucin valorada de Potasio Permanganato 0,02N. 7.4. Clculo. El contenido de la leche en potasio dicromato, expresado en porcentaje en peso, es igual a: (V' - V) 0,098 Potasio Dicromato % = P V = volumen en ml de potasio permanganato empleados en la valoracin del exceso de sal de Mohr. V' = volumen en ml de potasio permanganato empleados en la prueba en blanco. P = peso en gramos de la leche empleada en la determinacin de las cenizas. 8(a). ACIDEZ (Leches natural, certificada, higienizada y esterilizada) 8(a).1. Principio. Se entiende por acidez en las leches natural, certificada, higienizada y esterilizada el contenido aparente en cidos, expresado en g de cido lctico por 100 ml de leche, determinado por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde al descrito en la norma UNE 34.100 del Instituto de Racionalizacin del Trabajo. Un determinado volumen de leche se valora en solucin de sodio hidrxido, empleando solucin alcohlica de fenolftalena y luego se expresa el resultado en peso de cido lctico, mediante la correspondiente transformacin. 8(a).2. Material y aparatos. Bureta graduada cada 0,05 ml, o cada 0,1 ml que permita apreciar la semidivisin. 8(a).3. Reactivos. 171327 Fenolftalena solucin 1% RE 181694 Sodio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) SV Indicador: Fenolftalena 183154 Sodio Hidrxido 0,111 mol/l (0,111N) 8(a).3.1. Solucin 0,111N (N/9) o 181694 Sodio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) SV. 8(a).3.2. Indicador: 0,5 ml de Fenolftalena solucin 1% RE. 8(a).4. Procedimiento. 8(a).4.1. Preparacin de la muestra.- Antes del anlisis poner la muestra a 20 2C y mezclarla cuidadosamente. Si no se obtiene una dispersin homognea de la materia grasa, calentar lentamente la muestra a 40C, mezclar nuevamente y enfriarla de nuevo a 20 2C. 8(a).4.2. Determinacin.- Se determina volumtricamente operando sobre 10 ml de leche con solucin de Sodio Hidrxido 0,111N o sobre 9 ml de leche con solucin de Sodio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) SV. Como indicador se emplean 0,5 ml de Fenolftalena solucin 1% RE (dar por terminada la valoracin cuando aparece una coloracin rosa fcilmente perceptible por comparacin con

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un testigo tomado de la misma leche. Dicha coloracin desaparece progresivamente, pero se considera, obtenido el viraje cuando el tinte rosa persiste durante unos segundos). 8(a).5. Expresin de los resultados. Los resultados se expresan en peso de cido lctico por 100 mililitros de leche, dividiendo por 10 el nmero de mililitros empleados de solucin de sosa. Si a la muestra de leche se le ha adicionado potasio dicromato, es preciso tener en cuenta la acidez debida a dicho conservador. En el caso de leches no alteradas se puede considerar que 1 g de potasio dicromato aumenta la acidez en las mismas proporciones que 0,6 g de cido lctico. 8(a).6. Referencia. 8(a).6.1. Instituto Nacional de Racionalizacin del Trabajo. Una norma espaola 34.100. 8(b). ACIDEZ (Leche en polvo) 8(b).1. Principio. Se entiende por acidez en la leche en polvo el contenido aparente en cidos expresado en gramos de cido lctico por 100 g de leche en polvo determinado por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde al descrito en la norma UNE 34.101 del Instituto Nacional de Racionalizacin del Trabajo. El mtodo es aplicable a las leches en polvo, entera y desnatada. Una determinada cantidad pesada de leche en polvo disuelta en agua se valora con una solucin de sosa empleando fenolftalena como indicador hasta igualarla en color con otra cantidad igual de leche en polvo disuelta y mezclada con rosanilina acetato. 8(b).2. Material y aparatos. 8(b).2.1. Cpsulas de porcelana blanca de aproximadamente 100 ml de capacidad. 8(b).3. Reactivos. 131008 Acido Actico glacial PA-ACS 131074 Agua PA-ACS 131085 Etanol 96% v/v PA 131325 Fenolftalena PA-ACS 181694 Sodio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) SV Indicador: Fenolftalena 183154 Sodio Hidrxido 0,111 mol/l (0,111N) 8(b).3.1. Solucin 0,111N (N/9) o Sodio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) SV, exento de carbonato. 8(b).3.2. Solucin indicadora de Fenolftalena: Se disuelve un gramo de Fenolftalena PA-ACS en 110 ml de Etanol 96% v/v PA, se aade Sodio

Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) SV, hasta que una gota d una dbil coloracin rosa, y se completa hasta 200 ml con Agua PA-ACS. 8(b).3.3. Solucin concentrada de Rosanilina Acetato: Se disuelven 0,12 g de Rosanilina Acetato en 50 ml de Etanol 96% v/v PA que contenga 0,5 ml de Acido Actico glacial PA-ACS y se completa hasta 100 ml con Etanol 96% v/v PA. 8(b).3.4. Solucin diluida de Rosanilina Acetato: Se diluye un mililitro de solucin concentrada de Rosanilina Acetato hasta 500 ml con una mezcla, a partes iguales en volumen, de Agua PA-ACS y Etanol 96% v/v PA. Las soluciones de Rosanilina Acetato se conservan en la oscuridad en frascos hermticamente cerrados con tapones de caucho. 8(b).4. Procedimiento. Se toman dos cpsulas de porcelana blanca de una capacidad aproximada de 100 ml, pesndose en cada una de ellas 1 g de leche en polvo. A una y otra cpsulas se aaden 10 ml de Agua PA-ACS hirviente, se agita con la extremidad aplastada de una varilla de vidrio hasta obtener un lquido perfectamente homogneo y se deja enfriar durante 10 minutos. A una de las cpsulas se le aade 1 ml de solucin diluida de Rosanilina Acetato y se mezcla. A la otra cpsula se le agrega 1 ml de solucin de Fenolftalena PA-ACS y, gota a gota y agitando enrgicamente todo el tiempo, solucin valorada de Sodio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) SV hasta obtener una coloracin igual a la primera. El tiempo empleado en la valoracin no ha de exceder de 20 segundos y sta se ha de efectuar con una luz difusa. 8(b).5. Clculo. El nmero de mililitros consumidos de solucin 0,111N (N/9) representa la acidez, expresada en gramos, de cido lctico por 100 g de leche en polvo. Si se opera con solucin 0,1N (N/10), el nmero de mililitros multiplicado por 0,9 da el mismo porcentaje de acidez. 8(b).6. Referencia. 8(b).6.1. Instituto Nacional de Racionalizacin del Trabajo. Una norma espaola 34.101.

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9. SACAROSA (Determinacin polarimtrica en la leche condensada) 9.1. Principio. Se entiende por contenido en sacarosa de la leche condensada el contenido en sacarosa no transformada, expresado en porcentaje en peso, determinado por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde al descrito en la

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norma FIL-35: 1966 de la Federacin Internacional de Lechera. Este mtodo es aplicable a la leche condensada, entera o desnatada, de composicin normal, preparada a partir de leche y sacarosa nicamente que no contenga sacarosa transformada. El mtodo se basa en el principio de inversin de Clerget: Un tratamiento suave con un cido hidroliza completamente la sacarosa. La lactosa y los otros azcares prcticamente no se hidrolizan. La cantidad de sacarosa se deduce del cambio del poder rotatorio de la solucin. Se prepara un filtrado lmpido de la muestra, sin mutarrotacin debida a la lactosa, por tratamiento de la solucin con amonaco seguido de netralizacin y clarificacin por adiciones sucesivas de soluciones de zinc acetato y de potasio hexacianoferrato II. En una parte del filtrado de sacarosa se hidroliza en las condiciones especiales que corresponden a este tipo de operacin. Partiendo de los poderes rotatorios del filtrado, antes y despus de la inversin, se calcula la cantidad de sacarosa. 9.2. Material y aparatos. 9.2.1. Balanza analtica de sensibilidad: 10 mg como mnimo. 9.2.2. Vasos de precipitados de 100 ml de vidrio. 9.2.3. Matraces graduados, de 200 y 50 ml. 9.2.4. Pipetas de 40 ml. 9.2.5. Probetas graduadas de 25 ml. 9.2.6. Pipetas graduadas de 10 ml. 9.2.7. Embudos filtrantes de dimetro entre 8 y 10 cm y filtros (plegados) de 15 cm de dimetro. 9.2.8. Tubo de polarmetro de 2 cm de longitud, exactamente calibrado. 9.2.9. Polarmetro o sacarmetro. 9.2.9.1. Polarmetro con luz de sodio o con luz verde de mercurio (lmpara de vapor de mercurio con prisma o pantalla Wratten nmero 77 A), permitiendo lecturas con una precisin por lo menos igual a 0,05 grados de ngulo. 9.2.9.2. Sacarmetro con escala internacional de azcar utilizando luz blanca que pasa a travs de un filtro de 15 ml de una solucin al 6 por 100 de potasio dicromato, o bien luz de sodio, y permitiendo la lectura con una precisin por lo menos igual a 0,1 grados de la escala sacarimtrica internacional. 9.2.10. Bao de agua a 60 1C. 9.3. Reactivos. 131008 Acido Actico glacial PA-ACS 182119 Acido Actico 2 mol/l (2N) SV 131019 Acido Clorhdrico 35% PA-ISO 131074 Agua PA-ACS 131129 Amonaco 25% (en NH3) PA 171168 Azul de Bromotimol solucin 0,04% RE 131505 Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS 131775 Zinc Acetato 2-hidrato PA 9.3.1. Solucin de Zinc Acetato 2,0N: Disolver 21,9 g de Zinc Acetato 2-hidrato PA y 3 ml de Acido Actico glacial PA-ACS en Agua PA-ACS y completar hasta 100 ml. 9.3.2. Solucin de Potasio Hexacianoferrato II 1,0N: Disolver 10,6 gramos de Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS en Agua PA-ACS y completar hasta 100 ml. 9.3.3. Solucin de Acido Clorhdrico, 6,35 0,20N (20-22%). Usese Acido Clorhdrico 35% PA y diluir convenientemente. 9.3.4. Solucin diluida de amonaco, 2,0 0,2N (3,5%). Usese Amonaco 25% (en NH 3) PA y diluir convenientemente. 9.3.5. Solucin diluida de Acido Actico 2 mol/l (2N) SV 9.4. Procedimiento. 9.4.1. Preparacin de la muestra. Para muestras de productos recientemente preparados en los que no se puede prever separacin alguna apreciable de los componentes. Abrir el recipiente, introducir en l el producto adherido a la tapa y mediante movimientos de arriba abajo, con ayuda de una cuchara, conseguir que se mezclen ntimamente las capas superiores as como el contenido del fondo del recipiente. Transvasar el contenido de un bote a un frasco provisto de tapn bien adaptado. Para muestras de productos ms antiguos y muestras en las que se pueda prever una separacin de componentes, calentar en bao de agua, aproximadamente a 40C, hasta que la muestra casi haya alcanzado esta temperatura, abrir el recipiente y operar de la misma manera que arriba. En el caso de un bote, transvasar el contenido a un frasco, raspar el producto que se haya adherido a las paredes, continuar la mezcla hasta que toda la masa sea homognea. Cerrar el frasco con una tapadera que se adapte perfectamente. Dejar enfriar. 9.4.2. Comprobacin del mtodo.- Proceder como en 9.4.3., utilizando una mezcla de 100 g de leche desnatada y de 18 g de sacarosa pura, que corresponde a 40 g de una leche concentrada conteniendo el 45% de sacarosa. Calcular la cantidad de sacarosa como en 9.5.1., utilizando en la frmula D, para W, F y P, la cantidad de leche pesada y la riqueza en materia grasa y protenas de esta leche, y en la frmula ID, para W, la cifra de 40. La media de los valores encontrados no debe diferir de dicho valor (45%) en ms del 0,1%. 9.4.3. Determinacin.- En un vaso de 100 ml pesar aproximadamente 40 g de la muestra bien mezclada con una aproximacin de 10 mg, aadir

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50 ml de Agua PA-ACS caliente (80-90C) y mezclar cuidadosamente. Transvasar cuantitativamente la mezcla a un matraz aforado de 200 ml, enjuagar el vaso con cantidades sucesivas de Agua PA-ACS a 60C hasta que el volumen total sea de 120 a 150 ml. Mezclar y enfriar a temperatura ambiente. Aadir 5 ml de la solucin de Amonaco diluida. Mezclar de nuevo y dejar reposar durante 15 minutos. Neutralizar el Amonaco aadiendo una cantidad equivalente de la solucin diluida de Acido Actico. Determinar previamente la cantidad exacta de mililitros por valoracin de la solucin de Amonaco diluida empleando el Azul de Bromotimol solucin 0,04% RE como indicador. Mezclar. Aadir, mezclando suavemente por rotacin del matraz inclinado, 12,5 ml de solucin de Zinc Acetato. De la misma forma que para la solucin de acetato, aadir 12,5 ml de solucin de Potasio Hexacianoferrato II. Poner el contenido del matraz a 20C y aadir Agua PA-ACS (a 20C) hasta alcanzar el enrase de 200 ml. Hasta este momento todas las adiciones de agua o reactivos debern haberse efectuado de tal manera que se haya evitado la formacin de burbujas de aire y por esa misma razn todas las mezclas se habrn realizado por rotacin de matraz y no por agitacin violenta. Si se observa la presencia de burbujas de aire antes de alcanzar los 200 ml se puede eliminar aplicando al matraz una bomba de vaco o imprimindole un movimiento de rotacin. Tapar el matraz con un tapn seco y mezclar ntimamente sacudiendo con energa. Dejar reposar durante algunos minutos, filtrar a continuacin por un papel filtro seco. Despreciar los primeros 25 ml del filtrado. 9.4.3.1. Polarizacin directa.- Determinar la rotacin ptica del filtrado a 20 2C. 9.4.3.2. Inversin.- Introducir con la pipeta en un matraz graduado de 50 ml, 40 ml del filtrado obtenido de la manera indicada antes. Aadir 6 ml de Acido Clorhdrico 6,35 N. Poner el matraz en bao de agua a 60C durante 15 minutos, sumergindolo hasta el nacimiento del cuello. Mezclar por rotacin durante los 5 primeros minutos, al final de los cuales el contenido deber haber alcanzado la temperatura del bao. Enfriar a 20C y completar hasta 50 ml con Agua PA-ACS a 20C, mezclar y dejar reposar 1 hora a esta temperatura. 9.4.3.3. Polarizacin despus de inversin.Determinar el poder rotatorio de la solucin invertida a 20 2C (cuando la temperatura del lquido en el tubo de polarizacin difiera en ms de 0,2C de 20C durante la medida, se debe aplicar la correccin de la temperatura indicada en el apartado 9.5.2.). 9.5. Clculo. 9.5.1. Riqueza en sacarosa

W I) v = (1,08E + 1,55 P) 100

5 D I Vv V 4 II) S = x x x 100 Q V LxW S = cantidad de sacarosa. W = peso de la muestra en gramos. P = porcentaje de protenas (N x 0,38) de la muestra. F = porcentaje de materia grasa de la muestra. V = volumen en mililitros de la muestra diluida antes de filtrar. D = lectura polarimtrica directa (polarizacin antes de la inversin). I = lectura polarimtrica despus de la inversin. L = longitud en decmetros del tubo del polarmetro. Q = factor de inversin cuyos valores se indican ms adelante. Pesando exactamente 40 g de leche condensada y utilizando un polarmetro con luz de sodio provisto de escala en grados de ngulo y un tubo de 2 cm de longitud, el contenido en sacarosa de las leches condensadas normales (C = 9) a 20 0,1C se puede calcular con ayuda de la siguiente frmula: S = ((d).5/4I) (2,833 - 0,00612 F - 0,00878 P) Si la medida de la polarizacin despus de la inversin se efecta a una temperatura diferente a 20C, las cifras obtenidas se deben multiplicar por: [I + 0,0037 (T-20)] 9.5.2. Calores del factor de inversin Q.- Las frmulas siguientes dan valores precisos de Q para diversas clases de luz con correcciones, si es necesario, para la concentracin y la temperatura. Luz de sodio y polarmetro con escala en grados de ngulo. Q = 0,8825 + 0,0006 ((c).9) - 0,0033 (T-20) Luz verde de mercurio y polarmetro con escala en grados de ngulo: Q = 1,0392 + 0,0007 ((c).9) - 0,0039 (T-20) Luz blanca con filtro de dicromato y sacarmetro con escala sacarimtrica: Q = 2,549 + 0,0017 (C-9) - 0,0095 (T-20) En las frmulas precedentes: C = porcentaje de azcares totales en la solucin invertida, segn lectura polarimtrica. T = temperatura de la solucin invertida en la lectura del polarmetro. El porcentaje de azcares totales C en la solucin invertida se puede calcular a partir de la lectura directa y de la variacin despus de la inver-

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sin segn el mtodo habitual, utilizando los valores usuales de rotacin especfica de sacarosa, de lactosa y de sacarosa invertida. La correccin 0,0006 (C-9), etctera, no es exacta ms que cuando C es aproximadamente 9; para leche concentrada normal esta correccin se puede despreciar, por ser C prximo a 9. Variaciones en la temperatura de 20C influyen escasamente en la lectura de la polarizacin directa. Por el contrario, diferencias de ms de 0,2C, en la lectura de polarizacin despus de la inversin necesitan una correccin. La correccin 0,003 (T-20), etc., no es exacta ms que para temperaturas comprendidas entre 18C y 22C. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultneamente o una inmediatamente despus de la otra por el mismo analista no debe ser mayor de 0,3 g de sacarosa para 100 g de leche condensada. 9.6. Referencia. 9.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 35: 1966 10. HUMEDAD (Leche en polvo) 10.1. Principio. Se entiende por humedad de la leche en polvo el contenido en agua libre, es decir, la prdida de peso, expresado en porcentaje en peso, determinado por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde al descrito en la norma FIL26: 1964 de la Federacin Internacional de Lechera. Este mtodo es aplicable a las leches en polvo, entera y desnatada. El agua, contenida en la leche en polvo, se elimina por calentamiento de la muestra en una estufa de desecacin, a una temperatura de 102 2C, hasta peso constante. 10.2. Material y aparatos. 10.2.1. Balanza analtica, de sensibilidad 0,1 mg como mnimo. 10.2.2. Cpsulas apropiadas, preferentemente en aluminio, nquel, acero inoxidable o vidrio. Las cpsulas debern estar provistas de tapas que se adapten convenientemente, pero que se puedan quitar con facilidad. Las dimensiones ms convenientes son: dimetro aproximado 50 mm; profundidad aproximada, 25 mm. 10.2.3. Un desecador provisto de 211335 Gel de Slice 3-6 mm con indicador QP de humedad. 10.2.4. Una estufa de desecacin bien ventilada, provista de termostato y regulada a 102 2C. Es importante que la temperatura sea uniforme en toda la estufa. 10.2.5. Frascos provistos de tapones hermticos para el mezclado de la leche en polvo. 10.3. Procedimiento. 10.3.1. Preparacin de la muestra.- Transvasar toda la muestra de la leche en polvo a un frasco seco y tapado, de un volumen igual al doble, aproximadamente, del de la muestra, mezclar ntimamente por rotacin y agitacin (en el caso de que no se pueda obtener una homogeneizacin completa por este procedimiento, extraer, con objeto de realizar determinaciones paralelas, dos muestras en dos puntos, lo ms distantes posible el uno del otro). 10.3.2. Determinacin.- Colocar la cpsula destapada y la correspondiente tapa en la estufa de desecacin durante 1 hora, a la temperatura de 102 2C. Colocar la tapa sobre la cpsula y pasarla de la estufa al desecador. A continuacin enfriar a la temperatura ambiente y pesar. Introducir aproximadamente 1 g de leche en polvo en la cpsula, tapar la cpsula y pesar rpidamente con la mayor exactitud posible. Destapar la cpsula y colocarla con su tapa en la estufa a una temperatura de 102 2C durante 2 horas. Volver a colocar la tapa, poner la cpsula en el desecador, dejar enfriar a temperatura ambiente y pesar rpidamente con la mayor exactitud posible. Calentar la cpsula abierta y su tapa a 102 2C en la estufa durante 1 hora suplementaria, volver a tapar y dejar enfriar en el desecador a temperatura ambiente; pesar de nuevo. Repetir la operacin hasta que las pesadas sucesivas no difieran en ms de 0,0005 g. La desecacin se acaba aproximadamente en 2 horas. 10.4. Clculo. Calcular la humedad mediante la frmula siguiente: M1 M2 Humedad (cantidad de agua) % = x 100 M3 M1 = la masa inicial, en gramos, de la cpsula y su tapa ms la leche en polvo utilizada para el anlisis. M2 = la masa final, en gramos, de la cpsula y su tapa ms la leche en polvo. M3 = la masa, en gramos, de la leche en polvo utilizada para el anlisis. La diferencia entre dos determinaciones repetidas no debe sobrepasar el 0,06% de agua. 10.5. Referencia. 10.5.1. Norma Internacional FIL-IDF 26: 1964.

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11. INDICE DE SOLUBILIDAD (Leche en polvo) 11.1. Principio. Se entiende por ndice de solubilidad de la leche en polvo la cantidad de sedimento, expre-

sada en volumen, determinada por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde al descrito en la norma UNE 34.101 del Instituto Nacional de Racionalizacin del Trabajo. Este mtodo es aplicable a la leche en polvo, entera o desnatada. 11.2. Material y aparatos. 11.2.1. Centrfuga con soportes para la colocacin de los tubos centrfugos cnicos. La velocidad requerida vara, como a continuacin se indica, con el dimetro.

Dimetro

Revoluciones por minuto 1.083 988 916 856 807 766 730 700

250 300 350 400 450 500 550 600

milmetros .............. milmetros .............. milmetros .............. milmetros .............. milmetros .............. milmetros .............. milmetros .............. milmetros ..............

Despus de separada la espuma se mezcla completamente con una cuchara durante 5 segundos y, seguidamente, se llena un tubo cnico hasta la marca de 50 ml. Se centrifuga durante 5 minutos a las revoluciones por minuto requeridas, segn la tabla del apartado 11.2.1. A continuacin se sifona el lquido que sobrenada, hasta 2 ml del nivel del sedimento, teniendo cuidado de no remover ste. Se vierten en el tubo 25 ml de Agua PA-ACS a 24C y se agita para dispersar el sedimento, desalojando si fuera necesario con un alambre. Se llena con Agua PA-ACS, 24C, hasta la marca de 50 ml, se invierte y se agita para la perfecta mezcla del contenido, y se centrifuga de nuevo durante 5 minutos a la velocidad requerida. Se mantiene el tubo en posicin vertical, de modo que el nivel superior del sedimento quede a nivel del ojo; se refieren los mililitros de sedimento a la divisin de la escala ms prxima. La lectura se efecta fcilmente, cuando se observa el tubo, colocado delante de una luz fuerte. Cuando se opere con leches en polvo parcialmente desnatadas, las cantidades que se han de aadir a los 100 ml de Agua PA-ACS son, segn sus porcentajes grasos, las siguientes: Hasta el 4 % ............................... Desde el 4,1 al 9% ...................... Desde el 9,1 al 13% .................... Desde el 13,1 al 17% .................. Desde el 17,1 al 21% ................. Desde el 21,1 al 24% .................. Ms del 24 % ............................. 10,0 10,5 11,0 11,5 12,0 12,5 13,0 gramos gramos gramos gramos gramos gramos gramos

El "dimetro" es la distancia entre los fondos internos de dos soportes opuestos, medida a travs del centro de rotacin de la cabeza de la centrfuga, estando los soportes extendidos horizontalmente. 11.2.2. Tubos de centrfuga cnicos, graduados como se indica a continuacin: -De 0 a 1,0 ml en divisiones de 0,1 ml. -De 1,0 a 2,0 en divisiones de 0,2 ml. -De 2,0 a 10,0 ml en divisiones de 0,5 ml. -De 10,0 a 20,0 ml en divisiones de 1,0 ml. y a 50 ml una marca que quede, por lo menos, a 13 mm del borde del tubo. 11.2.3. Mezclador elctrico. 11.2.4. Tubo sifn de vidrio. 11.3. Procedimiento. Se aaden 10 o 13 g de la muestra, segn se trate de leche desnatada o completa, respectivamente, a 100 ml de Agua PA-ACS, a la temperatura de 24C, en el vaso especial del mezclador que seguidamente se pone en ste para agitar durante 90 segundos exactos. Si hay necesidad inmediata de volver a emplear el vaso del mezclador, puede verterse la solucin total en un vaso de precipitacin apropiado. Se deja reposar la solucin hasta que la espuma se separe lo suficiente, para poder quitarla completamente con una cuchara. El periodo de reposo despus de la mezcla no ha de exceder de 15 minutos.

11.4. Referencia. 11.4.1. Instituto Nacional de Racionalizacin del Trabajo. Una norma espaola 34.101. 12. CALCIO 12.1. Principio. Se entiende por contenido en calcio de la leche la cantidad total de calcio expresada en porcentaje en peso, determinada por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde a la norma FIL-36: 1966 de la Federacin Internacional de Lechera. Este mtodo se aplica a todas las leches lquidas normales, as como a las leches reconstituidas por dilucin o disolucin de leches concentradas o de leches desecadas. El calcio total se lleva a disolucin por precipitacin de las materias proteicas con cido tricloroactico. El calcio contenido en el filtrado es precipitado bajo forma de calcio oxalato, que se separa por centrifugacin y se valora con potasio permanganato.

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12.2. Material y aparatos. 12.2.1. Balanza analtica. 12.2.2. Matraz aforado de 50 ml. 12.2.3. Pipeta para leche de 20 ml. 12.2.4. Papel filtro sin cenizas para filtracin lenta. 12.2.5. Centrfuga que pueda desarrollar una aceleracin centrfuga de 1,400 g (g = aceleracin de la gravedad). 12.2.6. Tubos de centrfuga cilndricos con fondo redondo de 30 ml, aproximadamente, marcados a 20 ml. 12.2.7. Pipetas de 2 y 5 ml. 12.2.8. Dispositivo de sifn por succin, provisto de un tubo capilar. 12.2.9. Bao de agua, a temperatura de ebullicin. 12.2.10. Bureta graduada. 12.3. Reactivos. 131008 Acido Actico glacial PA-ACS 252373 Acido Tricloroactico solucin 20% p/v DC 131074 Agua PA-ACS 131058 Acido Sulfrico 96% PA-ISO 131129 Amonaco 25% (en NH3) PA 131136 Amonio Oxalato 1-hidrato PA 131085 Etanol 96% v/v PA 182114 Potasio Permanganato 0,01 mol/l (0,05N) SV 171617 Rojo de Metilo RE-ACS 12.3.1. Acido Tricloroactico solucin 20% p/v DC. 12.3.2. Acido Tricloroactico solucin acuosa al 12% p/v. Usese Acido Tricloroactico solucin 20% p/v DC y diluir convenientemente. 12.3.3. Amonio Oxalato 1-hidrato PA: Solucin acuosa saturada en fro. 12.3.4. Rojo de Metilo (C.I. 13020) RE-ACS: solucin al 0,05% p/v en Etanol 96% v/v PA. 12.3.5. Acido Actico: solucin acuosa al 20% v/v. Usese Acido Actico glacial PA-ACS y diluir convenientemente. 12.3.6. Amonio Hidrxido: solucin acuosa obtenida mezclando volmenes iguales de Amonaco 25% (en NH3) PA y de Agua PA-ACS. 12.3.8. Acido Sulfrico: solucin acuosa obtenida aadiendo 20 ml de Acido Sulfrico 96% PAISO a 80 ml de Agua PA-ACS. 12.3.9. Potasio Permanganato 0,02N: NOTA: En un matraz aforado de 250 ml. introducir 100 ml. de Potasio Permanganato 0,01 mol/l (0,05N) SV, diluir y enrasar con Agua PA-ACS. Determinar el factor de la solucin 0,02N resultante. Todos los reactivos deben ser puros para anlisis. 12.4. Procedimiento. 12.4.1. Preparacin de la muestra.- Antes del anlisis, poner la muestra a 20 2C y mezclar con cuidado. Si no se obtiene una dispersin homognea de la materia grasa, calentar lentamente la muestra a 40C, mezclar suavemente y enfriar a 20 2C. 12.4.2. Defecacin de la muestra.- En un matraz aforado de 50 ml pesar exactamente alrededor de 20 g de leche, con una aproximacin de 10 mg. Aadir poco a poco mientras se agita una solucin acuosa de Acido Tricloroactico 20% p/v DC y completar hasta 50 ml con este reactivo. Agitar fuertemente durante algunos segundos. Dejar reposar 30 minutos. Filtrar sobre papel filtro sin cenizas. El filtrado obtenido debe ser lmpido. 12.4.3. Precipitacin del calcio en forma de oxalato y separacin del oxalato. En un tubo de centrfuga cilndrica de fondo redondo, introducir 5 ml del filtrado lmpido; despus 5 ml de Acido Tricloroactico al 12%, 2 ml de una solucin acuosa saturada de Amonio Oxalato 1 hidrato PA, dos gotas de solucin alcohlica de Rojo de Metilo RE-ACS y 2 ml de Acido Actico al 20%. Mezclar mediante agitacin circular y aadir poco a poco solucin de Amonaco (12.3.6.) hasta coloracin amarillo plido; despus, algunas gotas de Acido Actico al 20% hasta coloracin rosa. Dejar reposar 4 horas a la temperatura ambiente. Diluir hasta 20 ml con Agua PA-ACS y centrifugar 10 minutos a 1.400 g (g = aceleracin de la gravedad). Mediante un dispositivo de succin, decantar el lquido lmpido que sobrenada. Lavar las paredes del tubo de centrifugacin (sin remover el depsito de calcio oxalato) con 5 ml de solucin de Amonaco diluido (12.3.7.). Centrifugar 5 minutos a 1.400 g. Decantar el lquido que sobrenada con el dispositivo de succin. Proceder a tres lavados sucesivos. 12.4.4. Valoracin del oxalato.- Despus de haber extrado con sifn el agua del ltimo lavado, aadir 2 ml de solucin acuosa de Acido Sulfrico y 5 ml de Agua sobre el precipitado de calcio oxalato. Poner el tubo en bao de agua hirviendo, y cuando el oxalato est completamente disuelto, valorar con solucin de Potasio Permanganato 0,02N, hasta coloracin rosa persistente. La temperatura debe permanecer superior a los 60C durante la valoracin. 12.4.5. Ensayo en blanco.- Efectuar un ensayo en blanco con todos los reactivos, utilizando 20 ml de Agua PA-ACS en vez de leche. 12.5. Clculo. Contenido 1.000 en calcio% = 0,0004 x (V-v) x x K = P

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K = 0,4 x (V-v) x P V = volumen en ml de MnO4K (0,02N) gastados en la valoracin de la muestra. v = volumen en ml de MnO4K (0,02N) gastados en el ensayo blanco. P = peso en gramos de la muestra inicial (alrededor de 20 g). K = coeficiente de correccin del volumen del precipitado resultante de la precipitacin tricloroactica. Para leche entera (3,5 a 4,5 por 100 ria grasa): K = 0,972 Para leche con 3 por 100 de materia K = 0,976. Para leche con 2 por 100 de materia K = 0,980. Para leche con 1 por 100 de materia K = 0,985. Para leche desnatada: K = 0,989. de mate-

13.2.3. Bao de agua. 13.2.4. Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml. 13.2.5. Matraces aforados, de 25 ml con tapones esmerilados, de 100 y de 1.000 ml. 13.2.6. Horno mufla. 13.2.7. Estufa a 105 2C. 13.2.8. Espectrofotocolormetro. 13.3. Reactivos. 181021 Acido Clorhdrico 1 mol/l (1N) SV 132175 Acido Perclrico 70% PA-ACS-ISO 131074 Agua PA-ACS 131134 Amonaco Molibdato 4-hidrato PAACS-ISO 131509 Potasio di-Hidrgeno Fosfato PA 131698 Sodio Disulfito PA-ACS 13.3.1. 181021 Acido Clorhdrico 1 mol/l (1N) SV. 13.3.2. Acido Perclrico 65% (d. 1,61). Usese Acido Perclrico 70% PA-ACS-ISO y diluir convenientemente. 13.3.3. Solucin de Amidol: Disolver en Agua PA-ACS 1 gramo de Amidol (2,4-Diaminofenol Diclorhidrato: (NH2)2C6H3OH. 2HCl y 20 g de Sodio Disulfito PA-ACS o Sodio Pirosulfito (Na2S2O5) Completar hasta 100 ml en un matraz aforado con tapn esmerilado. Preparar cada da una solucin nueva. 13.3.4. Solucin de molibdato: Disolver en Agua PA-ACS 8,3 g de 131134 Amonio Molibdato 4-hidrato PA-ACS-ISO: (NH 4)6Mo7O24.4H2O. Completar hasta 100 ml. 13.3.5. Solucin acuosa de Potasio di-Hidrgeno Fosfato PA (a partir de KH2PO4, desecado durante 2 horas a 105C), que permite trazar una curva de diferencia para la determinacin del Fsforo: Pesar 4,393 g de Potasio di-Hidrgeno Fosfato PA KH2PO4, disolver en Agua PA-ACS y completar hasta 1.000 ml (solucin A). Diluir 10 ml de solucin A hasta 1.000 ml (solucin B). Un ml de solucin B = 10 microgramos de P. Todos los reactivos deben ser puros para anlisis. 13.4. Procedimiento. 13.4.1. Preparacin de la muestra: Antes del anlisis poner la muestra a 20 2C y mezclar cuidadosamente. Si no se obtiene una dispersin homognea de la materia grasa, calentar lentamente la muestra a 40C, agitar suavemente y enfriar a 20 2C. 13.4.2. Ensayo en blanco: Efectuar un ensayo en blanco con todos los reactivos, operando como se prescribe en 13.4.3.3., pero reemplazando los 5 ml de la dilucin por 5 ml de Agua PAACS. 13.4.3. Determinacin: 13.4.3.1. Mineralizacin por va seca: En una

grasa: grasa: grasa:

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultneamente o una inmediatamente despus de otra por el mismo analista, no debe ser mayor de 0,002 g calcio por 100 g de leche. 12.6. Referencia. 12.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 36: 1966. 13. FOSFORO 13.1. Principio. Se entiende por contenido en fsforo de la leche la cantidad total de fsforo expresada en porcentaje en peso, determinada por el procedimiento expuesto a continuacin, que corresponde a la norma FIL-42: 1967 de la Federacin Internacional de Lechera. Este mtodo se aplica a todas las leches lquidas normales, as como a las leches reconstituidas por dilucin o disolucin de las leches concentradas o de las leches desecadas. Las materias orgnicas de la leche se destruyen por mineralizacin en seco (incineracin). El fsforo se determina colorimtricamente, reduciendo el amonio fosfomolibdato con diamonifenol (amidol) y midiendo la densidad ptica de la solucin obtenida. 13.2. Material y aparatos. 13.2.1. Balanza analtica. 13.2.2. Cpsulas de platino o de cuarzo (de 55 mm de dimetro aproximadamente) provista de vidrio de reloj.

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M
cpsula de platino o de cuarzo pesar exactamente alrededor de 10 g de leche con una aproximacin de 10 mg. Evaporar, hasta sequedad, al bao de agua hirviendo. Despus de la desecacin completa, calcinar en la mufla a una temperatura comprendida entre 500C y 550C hasta la obtencin de cenizas blancas. 13.4.3.2. Preparacin de la solucin de cenizas: Despus de enfriar la cpsula, cubrirla con vidrio de reloj, disolver las cenizas en 2 o 3 ml de Acido Clorhdrico 1 mol/l (1N) SV y diluir con Agua PA-ACS. Transvasar la solucin de las cenizas a un matraz aforado de 100 ml, lavar el vidrio de reloj y la cpsula, recogiendo las aguas de lavado en el matraz. Completar hasta 100 ml con Agua PA-ACS, agitar y filtrar. Tomar 10 ml del filtrado, introducirlos en un matraz de 100 ml. Completar hasta 100 ml con Agua PA-ACS y agitar. 13.4.3.3. Determinacin colorimtrica del fsforo: Tomar 5 ml de la dilucin preparada en 13.4.3.2. e introducirlos en un matraz aforado de 25 ml. Aadir sucesivamente 2 ml de Acido Perclrico, 2 ml de la solucin de Amidol, 1 ml de la solucin de Amonio Molibdato. Completar hasta 25 ml con Agua PA-ACS y mezclar. Esperar 5 minutos y medir la densidad ptica utilizando cubeta de 1 cm en un espectrofotocolormetro a 750 nanmetros. Buscar en la curva patrn la cantidad de Fsforo contenida en el matraz de 25 ml, expresada en microgramos y correspondiente a la densidad ptica leda. 13.4.3.4. Determinacin de la curva patrn: En cuatro matraces aforados de 25 ml introducir 3, 5, 7, y 10 ml de la solucin B. Las cantidades as introducidas son iguales a 30, 50, 70 y 100 microgramos de Fsforo. Proceder a continuacin como en 13.4.3.3. Situar sobre una grfica las densidades pticas obtenidas en funcin de las cantidades de Fsforo presentes en los matraces. Trazar la curva patrn (que es una recta). 13.5. Clculo. El contenido en fsforo de la leche expresada en g de fsforo por 100 g de leche viene dado por la frmula siguiente: m - m' Fsforo % = 50M m = masa de fsforo, expresada en microgramos, obtenida segn 13.4.3.4. y contenida en el matraz de 25 ml con la muestra de aproximadamente 50 mg de leche. m' = masa de fsforo, expresada en microgramos, obtenida segn 13.4.3.4. y contenida en el ensayo en blanco. M = masa de leche, expresada en gramos, empleada para la mineralizacin. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultneamente o una inmediatamente despus de otra por el mismo analista no debe ser mayor de 0,008 g de fsforo por 100 g de leche. 13.6. Referencia. 13.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 42: 1967. 14(a). HARINA DE ALFALFA (Mtodo comparativo, B.O.E. 30-81979) 14(a).1. Principio. Determinacin de harina de alfalfa en leche desnaturalizada por comparacin visual y microscpica frente a muestras patrn. 14(a).2. Material y aparatos. 14(a).2.1. Tamiz de 0,25 mm de luz de malla. 14(a).2.2. Lupa para 10 a 20 aumentos. 14(a).2.3. Material necesario para observacin microscpica. 14(a).3. Procedimiento. 14(a).3.1. Preparacin de la muestra patrn de harina de alfalfa. Mezclar ntimamente muestra de harina de alfalfa adquiridas en el mercado finamente molidas. Tamizar la harina obtenida empleando el tamiz 14(a).2.1. Separar las dos fracciones y mezclarlas en la siguiente proporcin: 98 partes de la fraccin ms fina y 2 de la ms gruesa. Dicha mezcla se considera como muestra patrn de harina de alfalfa. 14(a).3.2. Preparacin de las muestras patrn de leche en polvo-harina de alfalfa. Mezclar y homogeneizar leche en polvo sin desnaturalizar y la muestra patrn de harina de alfalfa obtenida, segn las siguientes proporciones: Gramos de leche en polvo 99 98,5 98 97,5 97 96,5 96 Gramos de harina de alfalfa 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 Porcentaje de harina de alfalfa 1% 1,5 % 2% 2,5 % 3% 3,5 % 4%

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Realizar con estas muestras patrn una serie de preparaciones, colocando en el centro de un portaobjetos 0,6 g aproximadamente de cada una

de las muestras. Cubrir con otro portaobjetos y extender el polvo mediante compresin y giro de los dos vidrios, hasta lograr una lmina circular de unos 2 cm de dimetro. Sujetar los dos portaobjetos fijando los extremos con papel adhesivo transparente. La coleccin de patrones as obtenida se conserva para ulteriores determinaciones. 14(a).3.3. Determinacin de la harina de alfalfa contenida en la muestra de leche en polvo a analizar. Obtener una preparacin en forma anloga a la anteriormente descrita y comparar con las muestras patrn de leche en polvo-harina de alfalfa, separando aqullas que, a simple vista, sean anlogas o muy prximas a la muestra problema. Proceder a una comparacin microscpica entre la muestra a analizar y cada una de las muestras separadas, empleando lupa de 10 a 20 aumentos, considerando tanto el tamao como la densidad de las partculas que aparecen en una serie de campos, obteniendo valores medios y expresando los resultados en porcentaje de harina de alfalfa contenida en la leche en polvo analizada. 14(a).4. Referencia. 14(a).4.1. A. Lpez, M. del C. Daz-Pealver y J. Gutirrez: "Leches desnaturalizadas". Comprobacin de la desnaturalizacin de las mismas". 14(b). HARINA DE ALFALFA (Mtodo gravimtrico) 14(b).1. Principio. Separacin de las partculas de alfalfa, por lavado con agua y posterior determinacin gravimtrica. 14(b).2. Material y aparatos. 14(b).2.1. Vaso de precipitados de 250 ml. 14(b).2.2. Tamiz de 0,25 mm de luz de malla. 14(b).2.3. Embudo. 14(b).2.4. Matraz erlenmeyer de 2.000 ml. 14(b).2.5. Trompa de vaco 14(b).2.6. Placa filtrante de vidrio del nmero 1. 14(b).2.7. Estufa de desecacin. 14(b).3. Procedimiento. Pesar 50 g de leche desnaturalizada en un vaso de precipitados de 250 ml y adicionar 150 ml de Agua PA-ACS. Una vez bien impregnada la leche desnaturalizada, formar una papilla fina por agitacin mediante una varilla con el extremo curvado en forma de U. Aadir a continuacin otros 100 ml de Agua PA-ACS, agitar y pasar la papilla a travs del tamiz 14(b).2.2. (previamente desecado a 100C hasta peso constante, con precisin de 0,01 g) coloca-

do sobre un embudo y ste a su vez sobre un matraz erlenmeyer de 2.000 ml. Lavar el vaso y el tamiz aadiendo poco a poco Agua PA-ACS a 40C en chorro fino, removiendo los pequeos grumos con ayuda de la varilla hasta que toda la leche haya sido arrastrada por el agua. Se precisan aproximadamente 1,5 litros. Dejar escurrir el tamiz y desecarlo en estufa a 100C, colocado sobre un papel de filtro. Una vez desecado el tamiz hasta peso constante, se pesa con aproximacin de 0,01 g, recogindose en l previamente las partculas que pudieran haber cado en el papel de filtro a medida que se produca la desecacin de la harina de alfalfa. Se obtiene as un peso p 1. Las partculas de alfalfa, a causa de la humedad, sufren un hinchamiento, por lo que es necesario tamizar de nuevo despus de la desecacin y de exponer el tamiz a humedad ambiente durante dos horas, obtenindose as el peso p 2 de la cantidad retenida por el mismo. Filtrar a vaco la leche recogida en el erlenmeyer a travs de la placa filtrante 14(b).2.6., cuyo fondo y paredes se han recubierto de algodn . Antes de iniciarse la filtracin, pesar con aproximacin de 0,01 g, la placa y el algodn previamente desecados a 100C. La filtracin se realiza aadiendo la leche poco a poco sobre el centro de la placa, cuidando que el vaco no sea demasiado intenso para evitar la formacin de espuma. Lavar con abundante Agua PA-ACS a 40C hasta que sta pase completamente transparente. Desecar la placa a 100C hasta peso constante y pesar con aproximacin de 0,01 g. Se obtiene as el peso de las partculas de alfalfa p3. 14(b).4. Clculo. La humedad propia de la harina de alfalfa se estima en un 8%. Los valores reales de la harina de alfalfa total contenida en 50 g de muestra (P) y de la retenida por el tamiz (p), sern: 8 (p1 + p2) % de harina de alfalfa P = p2 p1 + p3+ 100 P = p2

14(b).5. Referencia. 14(b).5.1. A. Lpez, M. del C. Daz-Pealver y J. Gutirrez: "Leches desnaturalizadas". Comprobacin de la desnaturalizacin de las mismas".

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15. FENOLFTALEINA EN LECHE DESNATURALIZADA (Mtodo cualitativo) Patrn Leche descremada en polvo (g) 85 80 75 Desnaturalizante patrn (g) 15 20 25

15.1. Principio. Deteccin de fenolftalena en leche desnaturalizada en presencia de una solucin alcalina. 15.2. Material y aparatos. Tubos de ensayo 160/60. 15.3. Reactivos. 131074 Agua PA-ACS 182158 Sodio Hidrxido 2 mol/l (2N) SV 15.4. Procedimiento. Poner en un tubo de ensayo 160/60, aproximadamente 0,5 g de leche en polvo, aadir 10 ml de Agua PA-ACS y agitar hasta lograr una emulsin uniforme. Aadir 2 ml de solucin de Sodio Hidrxido 2 mol/l (2N) SV. La presencia de Fenolftalena en la muestra se manifiesta por la aparicin de una serie de puntos rojo-rosados que se ensanchan, intensificando su color hasta llegar a un mximo, para empalidecer seguidamente y llegar a desaparecer transcurrido un cierto tiempo. Comparar con un patrn de leche en polvo conteniendo Fenolftalena al 1/20.000.

Nm. 1 ............ Nm. 2 ............ Nm. 3 ............

16.4.3. Determinacin de la muestra. Pesar exactamente un gramo de la muestra con precisin de 0,01 g. Pasar a un mortero y preparar una papilla con 25 ml de Agua PA-ACS hirviendo y verter en un matraz aforado de 100 ml. Lavar el mortero con Agua PA-ACS caliente repetidas veces vertiendo los lquidos de lavado en el matraz hasta obtener unos 75 ml; agitar enrgicamente y llevar a un bao de Mara durante diez minutos, agitando de cuando en cuando; enfriar el matraz al chorro de agua fra y llevar el contenido exactamente a 100 ml. Tomar 10 ml exactamente medidos y pasar a una probeta de 100 ml. Aadir 80 ml de Agua PAACS, 1 ml de solucin de Yodo 0,05 mol/l (0,1N)SV, completar hasta el enrase con Agua PAACS; agitar enrgicamente. Verificar el mismo mtodo con los tres patrones preparados. El color desarrollado en la muestra se compara a los cinco minutos con el de los tres patrones. 17. SALVADO 17.1. Principio. Separacin por tamizado del salvado y determinacin gravimtrica. 17.2. Material y aparatos. 17.2.1. Tamiz de 0,210 mm de luz de malla. 17.2.2. Tamiz de 0,074 mm de luz de malla. 17.2.3. Estufa de desecacin. 17.3. Procedimiento. Pesar con precisin de 0,01 g, 20 g de leche y tamizarla exhaustivamente a travs del tamiz 17.2.1. estndar. Recoger cuidadosamente la fraccin de salvado retenida por el tamiz y pesar. A continuacin, empastar con Agua PA-ACS la parte tamizada, deshaciendo todos los grumos que puedan formarse con ayuda de una varilla de vidrio con el extremo curvado en forma de U y diluir con Agua PA-ACS hasta completar unos 300 ml. Verter la emulsin sobre el tamiz 17.2.2., previamente desecado a 100C hasta peso constante; lavar repetidamente el residuo que permanece en el tamiz hasta que las aguas de lavado pasen

16. FECULA (Mtodo comparativo) 16.1. Principio. Determinacin de fcula en leche desnaturalizada por comparacin con muestras patrn. 16.2. Material y aparatos. 16.2.1. Matraz aforado de 100 ml. 16.2.2. Probeta de 100 ml. 16.2.3. Pipeta de 10 ml. 16.3. Reactivos. 131074 Agua PA-ACS 181772 Yodo 0,05 mol/l (0,1N) SV 16.4. Procedimiento. 16.4.1. Preparacin del desnaturalizante patrn. Mezclar ntimamente 80 g de salvado y 20 g de fcula de la misma naturaleza que la que se pretende identificar. 16.4.2. Preparacin de patrones de leche descremada en polvo y desnaturalizante patrn. Mezclar haciendo uso del mortero, segn las siguientes proporciones:

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transparentes e incoloras. Desecar el tamiz en una estufa a 100C hasta peso constante. 17.4. Clculos. El contenido en salvado en 100 g de la muestra viene dado por: Ps = 5 (a + 1,3 b) Siendo: b = peso, en g, de la fraccin de salvado retenida por el tamiz de 17.2.2. a = peso, en g, de la fraccin de salvado retenida por el tamiz de 17.2.1. 17.5. Observaciones. 17.5.1. Se estima que la prdida que sufre el salvado por lavado y desecacin es del 30%. 18. FECULA + SALVADO 18.1. Principio. Separacin por centrifugacin de la fcula y del salvado y determinacin gravimtrica. 18.2. Material y aparatos. 18.2.1. Centrfuga de 3.000 r.p.m. 18.2.2. Estufa de desecacin al vaco. 18.3. Reactivos. 131074 Agua PA-ACS 251774 Lquido de Lugol DC. En su defecto prepararla como sigue: Mezclar 1 g de 141771 Yodo resublimado PRS y 1 g de 131542 Potasio Yoduro PA-ISO en Agua PA-ACS hasta 200 ml. Mantener la solucin en el frasco cuentagotas. 18.4. Procedimiento. Pesar con aproximacin de 0,001 g, 0,5 g de la muestra de leche a analizar y colocarla en un tubo de centrfuga previamente pesado con igual exactitud. Aadir 10 ml de Agua PA-ACS fra y agitar con una varilla de vidrio hasta disolucin de la leche. A continuacin, centrifugar a 3.000 r.p.m. Decantar la emulsin sobrenadante y aadir 10 ml de Agua PA-ACS fra al residuo insoluble; agitar de nuevo con una varilla, centrifugar otros quince minutos a idnticas revoluciones y decantar. Repetir estas operaciones al menos cuatro veces. Los lquidos obtenidos por decantacin tras la centrifugacin no deben dar colocacin azul con Lquido de Lugol. Desecar a 80C en estufa de vaco el residuo final contenido en el tubo de centrfuga, hasta peso constante. El peso del residuo presentar el peso total del desnaturalizante contenido en 0,5 g de la leche desnaturalizada.

18.5. Clculo. El salvado contiene una humedad media que puede cifrarse en un 10%; por ello, el peso del residuo centrifugado debe incrementarse en la humedad correspondiente al salvado contenido en 0,5 g de leche, que en un producto correctamente desnaturalizado al 20% ser 0,008 g. El peso del desnaturalizado total ser: 100 (Rs + h) % desnaturalizado = P Siendo: Rs = peso, en g, del residuo. h = factor de correccin de humedad del salvado = 0,008 g. P = peso, en g, de la leche desnaturalizada. 19. SUSTANCIAS PROTEICAS REDUCTORAS (B.O.E. 14-10-1981) 19.1. Principio. Determinacin de las sustancias proteicas reductoras de la leche, mediante reaccin con potasio ferricianuro y posterior valoracin colorimtrica. Este mtodo es aplicable a la deteccin de leche en polvo reconstituida en leche cruda o pasterizada. 19.2. Material y aparatos. 19.2.1. Espectrofotmetro que permite lecturas de 610 nm con cubetas de 1 cm. 19.2.2. Centrfuga 1.000-1.500 r.p.m. 19.2.3. Tubos de centrfuga graduados a 50 ml. 19.2.4. Bao de agua de temperatura regulable hasta 80C. 19.3. Reactivos. 131008 Acido Actico glacial PA-ACS 131067 Acido Tricloroactico PA-ACS 131074 Agua PA-ACS 141358 Hierro III Cloruro 6-hidrato PRS 131503 Potasio Hexacianoferrato III PA-ACS 131505 Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS 131481 Potasio Hidrgeno Ftalato PA-ISO 131687 Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO 131754 Urea PA 19.3.1. Solucin de Acido Actico 5%. Diluir 50 ml de Acido Actico glacial PA-ACS con Agua PA-ACS a 1 litro. 19.3.2. Solucin saturada de Urea PA en Agua PA-ACS. 19.3.3. Solucin tampn. Disolver 2 g de Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO en Agua PA-ACS y diluir a 250 ml. Disolver 10,2 g de Potasio Hidr-

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geno Ftalato PA-ISO en Agua PA-ACS y diluir a 250 ml. Mezclar 150 ml de la solucin de Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO con 200 ml de la solucin de Potasio Hidrgeno Ftalato PA-ISO, diluirlo hasta 800 ml y ajustar la solucin final a un pH 5,6 por adicin de las soluciones de Sodio Hidrxido o Potasio Hidrgeno Ftalato. 19.3.4. Solucin de Potasio Hexacianoferrato III PA-ACS al 1%- Disolver 10 g de Potasio Hexacianoferrato III PA-ACS en Agua PA-ACS y diluir a 1 litro. Desechar la solucin si presenta color verde o contiene precipitado azul. Esta solucin debe utilizarse recin preparada. 19.3.5. Solucin de Acido Tricloroactico 10%. Disolver 100 g de Acido Tricloroactico PA-ACS en Agua PA-ACS y diluir a 1 litro. 19.3.6. Solucin de Hierro III Cloruro 6-hidrato 0,1%. Disolver 0,1 g de Hierro III Cloruro 6-hidrato PRS en Agua PA-ACS y diluir a 100 ml. Esta solucin debe utilizarse recin preparada. 19.3.7. Solucin de Potasio Hexacianoferrato II 0,05 mg/ml. Pesar 0,1147 g de Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS y diluir a 1 litro con Agua PA-ACS. Diluir 50 ml de esta solucin a 100 ml en matraces aforados. Cada ml contiene 0,05 mg de Potasio Hexacianoferrato II anhidro. Debido a que este reactivo se oxida fcilmente con el aire se debe utilizar inmediatamente despus de su preparacin. 19.4. Procedimiento. 19.4.1. Preparacin de la curva de referencia. Pipetear 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 ml de la solucin de Potasio Hexacianoferrato (0,05 mg/ml) en tubos de ensayo. Aadir Agua PA-ACS hasta un volumen total de 5 ml. A todos los tubos se les aade 5 ml de la "solucin blanco" preparada como se describe a continuacin: Diluir 3 ml de la solucin de Urea PA a 15 ml con Agua PA-ACS en un tubo de centrfuga, aadir 5 ml de la solucin tampn, 5 ml de la solucin Potasio Hexacianoferrato III y 5 ml de la solucin de Acido Tricloroactico. Mezclar bien con una varilla de vidrio (La "solucin blanco" no necesita ser calentada, ni filtrada para la curva de referencia. Sin embargo, cuando analizan las muestras, el blanco se calienta y se filtra igual que en las condiciones del ensayo). A intervalos convenientes aadir 1 ml de la solucin de Hierro III Cloruro 0,1%, para desarrollar el color, agitar y dejar en reposo exactamente durante 10 minutos. Ajustar el 100% de transmitancia con la solucin control (0,0* ml de disolucin de Potasio Hexacianoferrato II) a 610 nm. Leer a continuacin en transmitancia las distintas preparaciones de las soluciones patrones y representar los valores obtenidos frente a concentraciones en mg de Potasio Hexacianoferrato II en papel semilogartmico. Preparar la curva de referencia con cada serie de anlisis. (*) Se refiere al tubo n. 1 19.4.2. Determinacin. Mantener las muestras aproximadamente a 3C. Las muestras congeladas o conservadas son inadecuadas para la determinacin. Pipetear 15 ml de la muestra previamente homogeneizada en un tubo de centrfuga graduado de 50 ml, que contenga 15 ml de Agua PA-ACS. Aadir 3 ml de la solucin de Acido Actico 5%, agitar bien con una varilla de vidrio y centrifugar durante 5 minutos. Decantar el lquido sobrenadante. (Una pequea parte del precipitado puede quedar flotando en la parte superior del tubo despus de centrifugar; si la mayor parte del precipitado queda en el fondo del tubo, se puede despreciar. Sin embargo, si la muestra contiene excesiva nata, el precipitado flotar y no podr separarse el sobrenadante. Desechar la determinacin y volver a mezclar la muestra completamente. Lavar el precipitado dos veces con porciones de 15 ml de Agua PA-ACS, mezclando cada vez el precipitado con una varilla de vidrio, centrifugar 15 minutos y decantar. Al precipitado y a un tubo centrfuga limpio que se llevar paralelamente como blanco, aadir 3 ml de solucin de Urea y entonces diluir a 15 ml con Agua PA-ACS. Agitar, aadir 5 ml de la solucin tampn y 5 ml de la solucin de Potasio Hexacianoferrato III 1%, y agitar de nuevo. Colocar en un bao de agua a 70C, exactamente 20 minutos y enfriar en hielo. Una vez fro, aadir 5 ml de la solucin de Acido Tricloroactico 10%, agitar y filtrar a travs de un papel Whatman n 40 de 11 cm o similar. Usar los primeros 5 ml del filtrado para lavar las paredes y el fondo del recipiente, desechndolos. Verter el resto de la solucin sobre el filtro y dejar que filtre completamente; filtrar de nuevo si el filtrado es turbio. Introducir 5 ml de Agua PA-ACS en un tubo de ensayo, aadir 5 ml del filtrado claro. Adicionar 1 ml de la solucin de Hierro III Cloruro 0,1% para que se desarrolle el color, agitar y dejar en reposo exactamente 10 minutos. Ajustar el 100% de transmitancia a 610 nm con el blanco y efectuar la lectura. Con las series de muestras, aadir la solucin de Hierro III Cloruro a intervalos convenientes para permitir las lecturas despus del periodo de 10 minutos. 19.5. Clculo. A partir de la curva de referencia, determinar la cantidad de sustancias reductoras como mg de Potasio Hexacianoferrato II por 100 ml de leche, multiplicando el valor obtenido de la curva por 40.

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19.6. Observaciones. Los anlisis deben terminarse el mismo da que se comiencen. Es importante que las muestras no permanezcan demasiado tiempo despus de enfriamiento o despus de la filtracin. Durante la determinacin el laboratorio debe estar libre de vapores oxidantes o reductores (H2S, Cl2, NHO3, etc.). 19.7. Referencia. 19.7.1. "Official Methods of Analysis of The AOAC" Ed. 1975, N 16.047-16.050. 20. RESIDUO INSOLUBLE DE SANGRE (B.O.E. 20-1-1982) 20.1. Principio. Mediante dilucin de la sangre en suero fisiolgico, posterior filtracin y desecacin se obtiene el residuo insoluble, cuyo porcentaje se determina por pesada. Este mtodo es aplicable a leches en polvo, que pueden contener harina de sangre de las denominadas comercialmente solubles. 20.2. Material y aparatos. 20.2.1. Embudo cilndrico esmerilado con placa filtrante, soldada al mismo de 65 mm de dimetro y porosidad 1. Su peso debe ser inferior al lmite mximo de pesada de las balanzas analticas, lo que normalmente se consigue con una altura del cilindro igual o inferior a 4 cm. 20.2.2. Agitador electromagntico. 20.2.3. Estufa de desecacin. 20.3. Reactivos. 131007 Acetona PA-ACS-ISO 131020 Acido Clorhdrico 37% PA-ACS-ISO 131074 Agua PA-ACS 141076 Hidrgeno Perxido 30% p/v (100 vol.) PRS 131659 Sodio Cloruro PA-ACS-ISO 20.3.1. Suero Salino Fisiolgico. Se obtiene disolviendo 9 g de Sodio Cloruro PA-ACS-ISO en 1.000 ml de Agua PA-ACS. 20.3.2. Acetona PA-ACS-ISO. 20.3.3. Hidrgeno Perxido 30% p/v (100 vol.) PRS. 20.3.4. Acido Clorhdrico 37% PA-ACS-ISO.

previamente desecado y pesado con la precisin del miligramo y filtrar con ayuda de vaco. Lavar agitador y vaso con pequeas cantidades de Suero Salino Fisiolgico, que se vierten luego en el embudo hasta completar la filtracin con una cantidad aproximada de 200 ml de lquido de lavado. Lavar a continuacin embudo y placa dos veces con Agua PA-ACS y aadir despus 10 ml de Acetona PA-ACS-ISO, de forma que empapen bien la placa. Someter a vaco durante unos minutos. A continuacin pasar el embudo a una estufa y desecar a 100-105C hasta peso constante (precisin del miligramo). 20.4.2. Limpieza del embudo cilndrico con placa filtrante. Acoplar el embudo cilndrico en un erlenmeyer y verter sobre la placa filtrante unos 50 ml de Hidrgeno Perxido 30% p/v (100 vol.) PRS y de 1 a 5 ml de Acido Clorhdrico 37% PAACS-ISO. Dejar reposar durante unas veinticuatro horas y aadir, si es necesario, ms Hidrgeno Perxido 30% p/v (100 vol.) PRS y Acido Clorhdrico 37% PA-ACS-ISO para ultimar la limpieza. A continuacin lavar repetidamente cilindro y placa con Agua Desionizada. 20.5. Clculo. P1 x 100 R (porcentaje) = P2 siendo: R = % de residuo insoluble. P1 = peso, en gramos del residuo obtenido por diferencia de pesadas del embudo cilndrico. P2 = peso, en gramos, de la muestra. 21. DETECCION DE LECHE DE VACA EN MEZCLAS CON LECHE DE OVEJA Y CABRA 21.1. Principio. Se puede detectar la leche de vaca en mezclas con leche de oveja o cabra mediante extracciones de la casena y posterior separacin por electroforesis en gel de poliacrilamida. La casena SI de leche de vaca presenta una mayor movilidad electrofortica que las casenas S de leches de oveja o cabra. 21.2. Material y aparatos. 21.2.1. Centrfuga. 21.2.2. Equipo de electroforesis. 21.2.3. Fuente de alimentacin. 21.2.4. Tubos para electroforesis de 11 cm de longitud y 0,7 cm de dimetro. 21.2.5. pH-metro.

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20.4. Procedimiento. 20.4.1. Tomar aproximadamente un gramo de muestra, medida con la precisin del miligramo, y diluir en un vaso de precipitados de 250 ml con 50 ml de Suero Salino Fisiolgico agitando con un agitador electromagntico durante cinco minutos. A continuacin verter y filtrar el lquido poco a poco en el embudo cilndrico con placa filtrante,

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21.2.6. Material de uso corriente en laboratorio de pipetas, tubos, micropipetas, etc. 21.3. Reactivos. 131008 Acido Actico glacial PA-ACS 181009 Acido Actico 1 mol/l (1N) SV 181021 Acido Clorhdrico 1 mol/l (1N) SV 253309 Acrilamida DC 131074 Agua PA-ACS 131138 Amonio Peroxodisulfato PA 171165 Azul de Bromofenol RE-ACS 131340 Glicina PA 131091 Metanol PA-ACS-ISO 252036 Negro Amido 10B DC 181691 Sodio Hidrxido 1 mol/l (1N) indicador: Azul de Bromofenol SV 131940 Tris (Hidroximetil) Aminometano PA-ACS 131754 Urea PA 21.3.1. Acido Actico 1 mol/l (1N) SV o diluir Acido Actico glacial PA-ACS en Agua PA-ACS hasta la concentracin indicada. 21.3.2. Sodio Hidrxido 1 mol/l (1N) indicador: Azul de Bromofenol SV. 21.3.3. Solucin de urea 7M. Disolver Urea PA en Agua PA-ACS y diluir hasta la concentracin indicada. 21.3.4. Solucin A. Tampn pH 8,9. Disolver 48 ml de Acido Clorhdrico 1 mol/l (1N) SV, 36,3 g de Tris (Hidroximetil) Aminometano PA-ACS y 0,46 ml de TEMED en Agua PA-ACS hasta 100 ml. 21.3.5. Solucin B de Acrilamina. Disolver 60 g de Acrilamida DC y 1,6 g de NN' Metilenbisacrilamida (Bis) en Agua PA-ACS hasta 200 ml. 21.3.6. Solucin tampn para depsitos de los electrodos pH 8,4. Disolver 0,60 g de Tris (Hidroximetil) Aminometano PA-ACS y 2,88 g de Glicina PA en Agua PA-ACS hasta 100 ml. Se puede preparar un tampn concentrado 10 veces y guardar en nevera diluyndolo en el momento de su utilizacin. 21.3.7. Solucin de Amonio Peroxodisulfato. Disolver 0,56 g de Amonio Peroxodisulfato PA en Agua PA-ACS hasta 100 ml. Este reactivo debe prepararse nuevo cada semana. 21.3.8. Solucin de tincin. Disolver 0,56 g de Negro Amido 10B DC en una mezcla de 250 ml de Metanol PA-ACS-ISO, 650 ml de Agua PA-ACS y 100 ml de Acido Actico glacial PA-ACS. 21.3.9. Solucin de lavado. Mezclar 400 ml de Metanol PA-ACS-ISO, 50 ml de Acido Actico glacial PA-ACS y 550 ml de Agua PA-ACS. 21.3.10. Solucin de Azul de Bromofenol RE. Disolver 1 mg de 171165 Azul de Bromofenol REACS en 100 ml de 131074 Agua PA-ACS. 21.4. Procedimiento. 21.4.1. Preparacin de la muestra: Diluir la leche, previamente desnatada por centrifugacin a 1/5 con Agua PA-ACS. Calentar a 35C y llevar a pH 4,6 mediante adicin de Acido Actico 1 mol/l (1N) SV. Separar la casena precipitada por centrifugacin y lavar varias veces con Agua PAACS. Disolver la casena en un volumen de Agua igual a la mitad del volumen de la leche original, aadiendo solucin de Sodio Hidrxido 1 mol/l (1N) (indicador: Azul de Bromofenol) SV. Inmediatamente antes de la electroforesis, disolver un volumen igual de Urea 7M, preparada recientemente. Para la electroforesis es suficiente aplicar de 100 a 200 ug de casena disuelta. 21.4.2. Preparacin del gel: Mezclar 5 ml de solucin A (21.3.4.), 10 ml de solucin B (21.3.5.) y 11,5 g de Urea PA en una probeta de 50 ml. Aadir Agua PA-ACS con agitacin hasta 35 ml de disolucin. Desairear mediante vaco y aadir 5 ml de la solucin de Peroxodisulfato. Agitar la solucin e inmediatamente llenar con la misma los tubos (previamente tapados por su parte inferior) hasta 1 cm del extremo superior, evitando la formacin de burbujas de aire. Completar el llenado de los tubos con una pequea cantidad de agua que asegura la superficie plana del gel, a la vez que evita la posible inhibicin de la polimerizacin por el oxgeno atmosfrico. La polimerizacin tiene lugar en veinte treinta minutos. 21.4.3. Electroforesis: Colocar los geles, una vez polimerizados y despus de eliminar el agua, en los mdulos del aparato de electroforesis en posicin vertical y llenar las dos cmaras de los electrodos con el tampn pH 8,4. Aplicar con micropipeta en la superficie del gel una cantidad de la solucin de casena en urea que contenga de 100 a 200 ug de casena. Aadir una gota de Azul de Bromofenol y completar el llenado de los tubos con una pequea cantidad de tampn. Utilizar el depsito superior como ctodo y el inferior como nodo. Conectar la corriente y aplicar una intensidad constante de 1 mA por tubo durante 1,5 a 2 horas (hasta que el Azul de Bromofenol llegue al extremo del gel). 21.4.4. Separacin, teido y desteido de los geles: Para desprender el gel del tubo de vidrio se puede utilizar una jeringa con una aguja sin punta, colocndola entre el gel y el tubo. Inyectar agua a presin y rotar el tubo, con lo que entra sta y se desprende el gel. Una vez desprendido, colocar cada gel en un tubo con solucin colorante de Negro Amido 10B durante una hora. Eliminar la solucin de teido y aadir solucin de lavado, que debe renovar hasta que se observe las bandas de nitidez. Los geles se pueden conservar durante meses en solucin de Acido Actico glacial PA-ACS al 7%.

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21.5. Clculos. 21.5.1. Identificacin de las bandas: El diagrama electrofortico de las casenas de leche de oveja contiene dos grupos de bandas de protenas. El primer grupo, de dos bandas, corresponde a las casenas, y el segundo, consistente en tres bandas, a las S casenas, que se designan como S1, S2 y S3. La leche de vaca se puede detectar en mezclas con leche de oveja o cabra, debido a la mayor migracin eletrofortica de la casena S1 de vaca, que se hace visible por encima de las bandas de casena de oveja o cabra. La intensidad de la banda S1 de vaca aumenta cuando es mayor el porcentaje de mezcla. 21.5.2. Determinacin cuantitativa: La determinacin cuantitativa de la proporcin de leche de vaca aadida a la leche de oveja o cabra se puede realizar por el anlisis densitomtrico de las bandas obtenidas en las electroforesis, midiendo en la mezcla el contenido de casena S1 de leche de vaca y comparando este valor con el contenido medio de casena S de leche de vaca pura. Es necesario efectuar una curva patrn. 21.5.3. Lmite de deteccin: La tcnica descrita permite detectar un 2% de leche de vaca en leche de oveja o en leche de cabra. 21.6. Observaciones. 21.6.1. La electroforesis en gel de acrilamida se puede efectuar tambin en un equipo para electroforesis en gel plano. 21.6.2. Todas las soluciones se deben preparar con agua destilada reciente o hervida, ya que el oxgeno inhibe la polimerizacin y se pueden formar burbujas en el gel. 21.6.3. Todas las soluciones se deben almacenar en botellas oscuras en el frigorfico. 21.6.4. La acrilamida es neurotxica, por lo que se debe manejar con cuidado. 21.7. Bibliografa. 21.7.1. Pierre, A., y Portmann, A., 1970. Ann Teechnol. Ag. 19, 107-130. 21.7.2. Ramos, M.: Martnez-Castro, I., y Jurez, M. 1977. J. of Dairy Sci. 60, 870-877. 21.7.3. Adroid, P. (1968) "Separation of milk proteins", en Smith "Chromatographic and electrophoretic tecniques". Vol. II, pg. 399. William Heineimann Medical Books, Ltd. London. 22. SANGRE SOLUBLE 22.1. Principio. Disolucin de la hemoglobina en una mezcla actico-agua y posterior determinacin de su absorbancia a 396 nanmetros. Este mtodo es aplicable a muestras de leche o suero de leche en polvo que contengan menos del 5% de grasa.

22.2. Material y aparatos. 22.2.1. Espectrofotmetro y accesorios (cubeta para 1 cm de espesor de lquido). 22.2.2. Agitador electromagntico. 22.2.3. Centrfuga y tubos de 10 ml. 22.3. Reactivos. 131008 Acido Actico glacial PA-ACS 131074 Agua PA-ACS 22.3.1. Mezcla Acido Actico glacial PA-ACSAgua PA-ACS. 22.4. Procedimiento. Pesar con precisin de 0,001 g, 10 g de leche o suero de leche en polvo e introducir en un vaso de precipitados de 250 ml. Aadir 150 ml de Agua PA-ACS previamente calentada a 40-50C y agitar hasta que se forme una emulsin; a continuacin, trasvasar esta emulsin a un matraz aforado de 250 ml, lavar el vaso repetidas veces con Agua PA-ACS, enfriar y enrasar a 250 ml. Tomar 20 ml de la emulsin y verter en un matraz aforado de 100 ml, enrasar con la mezcla de Acido Actico glacial PA-ACS. Si la solucin resulta turbia, centrifugar 10 ml durante 15 minutos a unas 5.700 revoluciones; retirar a continuacin con ayuda de una esptula la pelcula sobrenadante; filtrar el centrifugado y repetir las operaciones si es necesario de forma que la solucin quede finalmente transparente. A continuacin medir la absorbancia en cubeta de 1 cm a 396 nm, usando como blanco la solucin actico-agua. 22.5. Clculos. El porcentaje de sangre soluble se deduce por aplicacin de la siguiente frmula: A 1.250 S = x 1 P E1

Siendo: S = Porcentaje de sangre soluble presente en la muestra. A = Absorbancia leda de la muestra. P = Peso en gramos de la leche o suero de leche en polvo. 1 E1 = Absorbancia especfica de la sangre. 22.6. Observaciones. 22.6.1. En el caso de disponer de la harina de sangre utilizada como desnaturalizante, el valor de E1 se obtendr como se indica a continuacin: Pesar con precisin de 0,0001 g 100 mg de harina de sangre, e introducirla en un vaso de precipitados de 250 ml. Aadir 150 ml de Agua PA-ACS, agitar durante cinco minutos la solucin, transferir

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M
a un matraz aforado de 250 ml. A continuacin, tomar 20 ml de esta solucin, llevar a un matraz aforado de 100 ml y enrasar con la mezcla de cido actico glacial-agua. Centrifugar 10 ml de esta solucin y medir su absorbancia en cubeta de 1 cm a 396 nanmetros usando como blanco la solucin actico-agua.
1 1

A = 12,5 x P

Siendo: 1 E1 = Absorbancia especfica. A = Absorbancia leda. P = Peso en gramos de la harina de sangre. 1 La absorbancia especfica E 1 no deber ser inferior a 50. En caso contrario, la harina de sangre no debe ser utilizada como desnaturalizante. 22.6.2. Si no se ha podido determinar este valor previamente a la adicin de la harina de sangre a la leche o suero se tomar como valor medio 1 de referencia E 1 = 52,4. 23(a). DETERMINACION DE LECHE DE VACA EN LECHE DE OVEJA O DE CABRA (Por electroforesis) 23(a).1. Principio. La fraccin srica de la muestra se extrae por adicin de solucin tampn a pH 4,6 y posterior centrifugacin. Las protenas de suero son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida a pH 8,3. Las lactoglobulinas de leche de vaca presentan una mayor movilidad electrofortica que las lactoalbminas y las lactoglobulinas de la leche de oveja y de la leche de cabra. El mtodo es aplicable a la leche cruda o pasterizada a una temperatura mxima de 90C, durante treinta segundos, fresca o conservada mediante congelacin o adicin de dicromato potsico. 23(a).2. Material y aparatos. 23(a).2.1. Material de uso corriente en laboratorio. 23(a).2.2. Microjeringa. 23(a).2.3. pHmetro. 23(a).2.4. Centrfuga. 23(a).2.5. Equipo de electroforesis. 23(a).2.6. Fuente de alimentacin. 23(a).2.7. Densitmetro. 23(a).3. Reactivos 131008 Acido Actico glacial PA-ACS 131019 Acido Clorhdrico 35% PA-ISO

132838 Acido 5-Sulfosaliclico 2-hidrato PAACS 182105 Acido Sulfrico 1 mol/l (2N) SV 131067 Acido Tricloroactico PA-ACS 253309 Acrilamina DC 131074 Agua PA-ACS 131138 Amonio Peroxodisulfato PA 171165 Azul de Bromofenol RE-ACS Azul de Coomassie R-250 Azul de Coomassie R-250 141339 Glicerina (USP, BP, Ph. Eur.) PRSCODEX 131340 Glicina PA 131085 Etanol 96% v/v PA NN Metilenbisacrilamina 131515 Potasio Hidrxido 85% lentejas PA 171634 Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RE N,N,NN Tetrametilendiamina (TEMED). 131940 Tris (Hidroximetil) Aminometano PAACS 23(a).3.1. Reactivos para la obtencin de la fraccin srica. 23(a).3.1.1. Solucin de Acido Actico al 10%. Diluir 100 ml de Acido Actico glacial PA-ACS con Agua PA-ACS a 1 litro. 23(a).3.1.2. 171634 Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RE. 23(a).3.2. Reactivos para la electroforesis. 23(a).3.2.1. Tampn de los geles pH 8,9: Pesar 46 g de Tris (Hidroximetil) Aminometano PA-ACS, medir 4 ml de Acido Clorhdrico 35% PA-ISO, y disolver ambos en Agua PA-ACS. 23(a).3.2.2. Solucin de Acrilamida Bisacrilamida (T=9, 4%; c=4,2): -Acrilamida DC: 9g. -NN'Metilenbisacrilamida: 0,4 g. -Tampn de los geles: 100 ml 23(a).3.2.3. Tampn de los electrodos de pH 8,3: -Tris (Hidroximetil) Aminometano PA-ACS: 1,2 g. -Glicina PA: 5,8 g. -Agua PA-ACS: hasta 2.000 ml. 23(a).3.2.4. -Solucin de Amonio Peroxodisulfato PA al 10% (este reactivo debe prepararse cada semana): Disolver unos grs. de Amonio Peroxodisulfato en Agua PA-ACS hasta concentracin dada. 23(a).3.2.5. N,N,N',N'- Tetrametilendiamina (TEMED). 23(a).3.2.6. Solucin de Azul de Bromofenol RE-ACS al 1/1000: Disolver 0,1 g de Azul de Bromofenol RE-ACS en 100 ml de Agua PA-ACS. 23(a).3.2.7. Solucin de Glicerina al 40%: Mezclar Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRS-CODEX con Agua PA-ACS hasta la concentracin indicada. 23(a).3.3. Reactivos para la tincin.

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23(a).3.3.1. Tincin con Azul Coomassie R-250: 23(a).3.3.1.1. Solucin fijadora: -Acido 5-Sulfosaliclico 2-hidrato PA-ACS: 17,3 g. -Acido Tricloroactico PA-ACS: 57,5 g. -Agua PA-ACS: hasta 500 ml. 23(a).3.3.1.2. Solucin decolorante: -Etanol 96% v/v PA: 500 ml. -Acido Actico glacial PA-ACS: 160 ml. -Agua PA-ACS: hasta 2.000 ml. 23(a).3.3.1.3. Solucin de tincin: -Azul Coomassie Brillante R-250: 0,46 g. -Solucin decolorante -23(a).3.3.1.2.-: 400 ml. 23(a).3.3.2. Tincin con Azul Comassie G-250. Solucin nica de fijacin y tincin: -Azul Coomassie G-250: 1 g. -Agua PA-ACS: 500 ml. -Acido Sulfrico 1 mol/l (2N) SV: 500 ml. -Solucin de Potasio Hidrxido 10N: Disolver unos gramos de Potasio Hidrxido 85% lentejas PA en Agua PA-ACS hasta la concentracin indicada. Valorar. -Acido Tricloroactico PA-ACS. Disolver el Azul de Coomassie G-250 en 131074 Agua PA-ACS y aadir la solucin Acido Sulfrico 1 mol/l (2N) SV. Mezclar bien agitando durante una hora y filtrar por papel Whatman nmero 1. Medir el volumen de filtrado y aadir 1/9 de este volumen de la solucin de Potasio Hidrxido 10N. Aadir Acido Tricloroactico PAACS a esta disolucin hasta que la concentracin final sea de 12%. Esta solucin de teido es estable durante varios meses si el pH se mantiene por debajo de 1. Se puede utilizar varias veces pero es conveniente filtrarla antes de cada uso. 23(a).4. Procedimiento. 23(a).4.1. Obtencin de la fraccin soluble a pH 4,6. Aadir a 10 ml de leche 5 ml de solucin de Acido Actico glacial PA-ACS al 10% y 5 ml de solucin de Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RE, mezclar y comprobar con pHmetro que el pH de la mezcla es exactamente 4,6. Centrifugar a 3.000 r.p.m. durante diez minutos y filtrar el sobrenadante a travs de un papel de filtro de velocidad media. 23(a).4.2. Preparacin de la curva patrn. Dependiendo del tipo de muestra que desee analizar, preparar patrones puros de leche de oveja o de leche de cabra y de leche de vaca y mezclas de leche de vaca en leche de oveja o de leche de vaca en leche de cabra en concentraciones del 5%, 10% y 20%. La leche utilizada para la preparacin de estos patrones podr ser cruda o pasterizada, en este ltimo caso la leche deber ser pasterizada a una temperatura mxima de 74C durante un tiempo mximo de treinta segundos. La fraccin soluble de los patrones se obtiene siguiendo el procedimiento descrito en 23(a).4.1. 23(a).4.3. Inmediatamente antes de su aplicacin en el gel mezclar:

-1 volumen de la fraccin soluble obtenida segn 23(a).4.1. -1 volumen de la solucin de Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRS-CODEX al 40% (23(a).3.2.7.). -1/2 volumen de la solucin Azul de Bromofenol RE-ACS al 1/1000. (23(a).3.2.6.). 23(a).4.4. Preparacin del Gel de Poliacrilamida. Preparar el gel laminar de espesor comprendido entre 0,5 mm y 1 mm. Para 50 ml de la solucin de acrilamida-bisacrilamida, aadir 0,5 ml de solucin de Amonio Peroxodisulfato PA al 10% (23(a).3.2.4.), desairear en un kitasato mediante vaco y aadir como agente polimerizante 50 ml de TEMED (23(a)., 3.2.5.). 23(a).4.5. Electroforesis. Colocar el gel en el aparato de electroforesis y llenar las cmaras de los electrodos con el tampn pH 8,3 (23(a).3.2.4.). Aplicar con microjeringa en cada uno de los pocillos del gel un volumen comprendido entre 10 I y 20 I de las soluciones obtenidas segn 23(a).4.3., tanto de la muestra como de los patrones. La electroforesis se realiza a 60 mA (220 V) dejando correr el frente hasta que la lnea del azul de bromofenol est a 0,5 mm del extremo inferior del gel. La duracin es aproximadamente de tres horas. 23(a).4.6. Mtodos de tincin. 23(a).4.6.1. Tincin con Azul Coomassie R250. Una vez completada la electroforesis, introducir el gel sucesivamente en: 1 La solucin fijadora 23(a).3.3.1.1.: Una hora. 2 La solucin decolorante 23(a).3.3.1.2.: Diez minutos. 3 La solucin de tincin 23(a).3.3.1.3.: Doce horas. 4 La solucin decolorante 23(a).3.3.1.2., que se renovar con frecuencia, hasta eliminar el fondo. 23(a).4.6.2. Tincin con Azul Coomassie G250. Una vez completada la electroforesis, introducir el gel sucesivamente en: 1 La solucin de fijacin/tincin 23(a).3.3.2.: Doce horas. 2 Agua PA-ACS, que se renovar con frecuencia: Una hora. 23(a).5. Interpretacin de los resultados. 23(a).5.1. Identificacin de las bandas. En el diagrama se observa el orden de las bandas de las protenas de menor a mayor movilidad electrofortica en cada una de las especies.

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M
+

F E D C B A 1 2 3

Expresar el contenido en leche de vaca segn los siguientes intervalos: -Menor del 5 por 100. -Entre el 5 y el 10 por 100. -Entre el 10 y el 20 por 100. -Mayor del 20 por 100. Siendo el lmite de deteccin prctico del 2 por 100 de leche de vaca, en leche de oveja o en leche de cabra. 23(a).7. Observaciones. Un resultado negativo debe obligatoriamente ser confirmado por la tcnica electrofortica de las casenas (21. Deteccin de leche de vaca en mezclas con leche de oveja y cabra). 23(a).8. Referencias. 23(a).8.1. Ramos, M.; Jurez, M. (1986): "Chromatographie, electrophoretic and immunological methods for detecting mixtures of milks from different species". Bulletin of International Dairy Federation nmero 202, pginas 175-187. 23(a).8.2. Amigo, L.: Santamara, G.; Gonzlez del Llano, D.; Ramos, M. (1986): "Polyacrilamide gel electrophoresis of whey proteins in cheeses made from milk of different species. Milk the vital force", XII Internat Dairy Congress, The Hague, 152. 23(a).8.3. Amigo, L.; Calvo, M. (1987): "Quantitative determination cow's milk in goat's and ewe's milk by PAGE using a internal standard". II Congreso Mundial de Tecnologa de Alimentos, Barcelona, 151. 23(a).8.4. Calvo, M.; Amigo, L.; Olano Martn, P.J.: Ramos, M. (1989): "Effect of thermal treatments on the determination of bovine milk added to ovine or caprine milk". Food Chemistry 32 (99-108). 23(b).DETERMINACION DE LECHE DE VACA EN LECHE DE OVEJA O DE CABRA (Metodo inmunlogico) 23(b).1. Principio. El mtodo est basado en la precipitacin de las inmunoglobulinas de la leche de vaca por la accin de un antisuero especfico. La muestra es depositada en los pocillos practicados en una capa de agar que contiene el antisuero especfico de la leche de vaca. Cuando la muestra contiene leche de vaca se produce una reaccin que se observa en forma de halo alrededor del pocillo donde se haba depositado dicha muestra. El dimetro de este halo es proporcional a la concentracin. El mtodo es aplicable a la leche cruda o pasterizada a una temperatura mxima de 74C durante un tiempo mximo de treinta segundos,

Diagrama electrofortico de las protenas de suero de 1) Leche de vaca, 2) Leche de cabra, 3) Leche de oveja. A) Seroalbmina (BSA). B) Lactoglobulina de cabra. C) Lactoalbmina (cabra y oveja). D) Lactoalbmina de vaca y Lactoglobulina de oveja. E) Lactoglobulina B de vaca. F) Lactoglobulina A de vaca. 23(a).5.2. Densitometra. Medir la intensidad de las bandas con densitmetro a una longitud de onda de 560 nm si se utiliza Coomassie R-250 en la tincin y de 600 nm si se utiliza el mtodo del Coomassie G-250. 23(a).5.3. Cuantificacin. Como se puede observar en el diagrama, las lactoglobulinas A y B en leche de vaca presentan una mayor movilidad electrofortica que las de las otras dos especies. Al aumentar el porcentaje de leche de vaca presente en la muestra, aumenta la intensidad de las bandas correspondientes a dichas lactoglobulinas y por tanto aumenta la altura de los picos obtenidos en el densitograma. Medir las alturas, de los picos de las lactoglobulinas A y B de leche de vaca y del pico de la seroalbmina (BSA). A partir de los datos obtenidos para los patrones, resulta la recta de regresin y = ax + b, donde altura 1g A + altura 1g B y = altura BSA x = Porcentaje de leche de vaca El porcentaje de leche de vaca en la muestra se determina sustituyendo en la recta de regresin calculada con los patrones, el valor altura 1g A + altura 1g B BSA obtenido para la muestra. 23(a).6. Expresin de los resultados.

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fresca o conservada mediante congelacin o adicin de dicromato potsico. 23(b).2. Material y aparatos. 23(b).2.1. Material de uso corriente en laboratorio. 23(b).2.2. Centrfuga. 23(b).2.3. Microjeringa. 23(b).2.4. Placas Petri preparadas con agar conteniendo el antisuero especfico de leche de vaca. En la capa de agar se han practicado 10 pocillos cilndricos. 23(b).2.5. Estufa regulada a 37C. 23(b).2.6. Agitador magntico o equivalente. 23(b).2.7. Dispositivo de lectura: Lupa equipada con micrmetro o un retroproyector. En su defecto se puede utilizar un doble decmetro graduado al medio milmetro. 23(b).3. Reactivos. 131008 Acido Actico glacial PA-ACS 131074 Agua PA-ACS Cuajo de titulo 1/10.000 141339 Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRSCODEX 252036 Negro Amido 10B DC 131659 Sodio Cloruro PA-ACS-ISO 23(b).3.1. Cuajo de ttulo 1/10.000. 23(b).3.2. Solucin de Sodio Cloruro al 9/1.000: Disolver 9 g de Sodio Cloruro PA-ACSISO en Agua PA-ACS y diluir a 1 litro. 23(b).3.3. Solucin acuosa de Glicerina al 5% (v/v): Mezclar 50 ml de Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRS-CODEX con Agua PA-ACS y completar con Agua hasta 1 litro. 23(b).3.4. Solucin acuosa de Acido Actico glacial PA-ACS al 2% (V/V): Mezclar 20 ml de Acido Actico glacial PA-ACS con la cantidad necesaria de Agua PA-ACS hasta completar 1 litro. 23(b).3.5. Solucin de tincin: -Negro Amido 10B DC: 1g. -Solucin acuosa de Acido Actico glacial al 2% (V/V): 1.000 ml. 23(b).3.6. Solucin actica de Glicerina: -Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRS-CODEX 5 ml. -Acido Actico glacial PA-ACS: 2 ml. -Agua PA-ACS: Hasta completar 100 ml. 23(b).4. Procedimiento. 23(b).4.1. Obtencin de la fraccin srica. Aadir a 10 ml de leche una gota de cuajo de ttulo 1/10.000 (23(b).3.1.), mezclar, incubar a 37C durante cinco a diez minutos y centrifugar a 3.000 r.p.m. durante diez minutos. Tomar con cuidado el lactosuero evitando arrastrar materia grasa. 23(b).4.2. Preparacin de la curva patrn. Preparar mezclas de leche de vaca en leche de oveja o en leche de cabra a concentraciones del 2%,

5%, 10% y 20%. La fraccin srica de los patrones se obtiene siguiendo el procedimiento descrito en 23(b).4.1. 23(b).4.3. Inmunodifusin. Depositar con la ayuda de una microjeringa, 10 ml de la fraccin srica preparada segn 23(b).4.1. de cada uno de los patrones y de la muestra a analizar en los pocillos de una misma placa. Dejar difundir de doce a veinticuatro horas a 37C en una cmara hmeda (estufa hermtica regulada a 37C en cuyo fondo se coloca un pliego de papel de filtro humedecido con agua). Para una valoracin rpida, transcurrido este tiempo, se puede proceder a la lectura segn 23(b).4.5. 23(b).4.4 Tratamiento de la placa. Lavar la placa dentro de la solucin de Sodio Cloruro al 9/1000 (23(b).3.2.) bajo agitacin durante ocho a doce horas. Llenar la placa con la solucin acuosa de Glicerina al 5% (V/V) (23(b).3.3.) y mantenerla llena diez minutos. Depositar en la superficie de la solucin un disco de papel de filtro del mismo dimetro que el de la placa, dejndolo deslizar hasta el fondo. Mantener el disco de papel de filtro contra el agar mientras se elimina la solucin de Glicerina. Verificar que no haya presencia de burbujas de aire. Dejar secar veinticuatro horas o acelerar el proceso con la ayuda de un secador de aire, manteniendo la distancia que permita no sobrepasar los 45C a 50C al nivel de la placa. Cuando la placa est perfectamente seca, recubrirla con agua durante algunos minutos para permitir que el papel de filtro se despegue progresivamente. Una vez despegado, retirarlo con unas pinzas. Teir durante quince minutos, con la solucin de tincin 23(b).3.5. Lavar, durante unos minutos cada vez, tres o cuatro veces, con la solucin de Acido Actico glacial al 2% (23(b).3.4.) para eliminar el fondo. Enjuagar durante cinco minutos en la solucin actica de Glicerina (23(b).3.6.). Vaciar y dejar secar. 23(b).4.5. Lectura de los resultados. Medir los dimetros de los halos con la ayuda de un doble decmetro graduado al medio milmetro o mejor con una lupa equipada con micrmetro o con un retroproyector. 23(b).5. Interpretacin de los resultados. 23(b).5.1. Curva de calibrado. En un papel milimetrado trazar la curva, llevando en ordenadas los dimetros de los halos obtenidos con las mezclas preparadas para la curva patrn y en abcisas las races cuadradas de las concentraciones en leche de vaca. 23(b).5.2. Determinacin del porcentaje de leche de vaca en la muestra. Llevar sobre la curva de calibrado el dimetro medido para la muestra. Elevar al cuadrado el dato obtenido para expresar el resultado en porcentaje de leche de vaca.

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23(b).5.3. Lmite de deteccin. La tcnica descrita permite detectar un 1% de leche de vaca en leche de oveja o en leche de cabra. 23(b).6. Observaciones. 23(b).6.1. Una reaccin negativa debe obligatoriamente ser confirmada por la tcnica electrofortica de las casenas (21. Deteccin de leche de vaca en mezclas con leche de oveja y cabra). 23(b).6.2. En el caso de una reaccin positiva, se tendr en cuenta que el resultado obtenido puede ser inferior al valor real, dado el efecto de un tratamiento trmico efectuado en condiciones de temperatura y/o de tiempo superiores a los fijados en 23(b).1. 23(b).7. Referencia. 23(b).7.1. Journal Officiel de la Republique Franaise (1 de junio de 1978). grama se observa el orden de las bandas de las protenas de menor a mayor movilidad electrofortica en la leche de cabra y en la leche de oveja.
+

D C B A

24(a). DETERMINACION DE LECHE DE CABRA EN LECHE DE OVEJA (Por electroforesis) 24(a).1. Principio. La fraccin srica de la muestra se extrae por adicin de solucin tampn a pH 4,6 y posterior centrifugacin. Las protenas de suero son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamina a pH 8,3. La lactoglobulina de leche de cabra presenta una menor movilidad electrofortica que la lactoalbmina y la lactoglobulina de la leche de oveja. 24(a).2. Material y aparatos. 24(a).2.1., 2, 3, 4, 5, 6 y 7, como 23(a).2.1., 2, 3, 4, 5, 6 y 7. 24(a).3. Reactivos. 24(a).3.1., 2 y 3, como 23(a).3.1., 2 y 3. 24(a).4. Procedimiento 24(a).4.1. como 23 (a).4.1. 24(a).4.2. Preparacin de la curva patrn. Preparar patrones puros de leche de oveja y de leche de cabra y mezclas de leche de cabra en leche de oveja en concentraciones del 5%, 10% y 20%. La leche utilizada para la preparacin de estos patrones podr ser cruda o pasterizada, en este ltimo caso la leche deber ser pasterizada a una temperatura mxima de 74C durante un tiempo mximo de 30 segundos. La fraccin soluble de los patrones se obtiene siguiendo el procedimiento descrito en 24(a).4.1. 24(a).4.3., 4, 5 y 6 como 23(a).4.3., 4, 5 y 6. 24(a).5. Interpretacin de los resultados 24(a).5.1. Identificacin de las bandas. En el dia-

Diagrama electrofortico de las protenas de suero. 1) Leche de cabra. 2) Leche de oveja. A) Seroalbmina (BSA). B) Lactoglobulina de cabra. C) Lactoalbmina (cabra y oveja). D) Lactoglobulina de oveja. 24(a).5.2. Densitometra. Medir la intensidad de las bandas con densitmetro a una longitud de onda de 560 nm si se utiliza Coomassie R-250 en la tincin y de 600 nm si se utiliza el mtodo de Coomassie G-250. 24(a).5.3. Cuantificacin. Como se puede observar en el diagrama, la lactoglobulina de leche de cabra presenta una menor movilidad electrofortica que la lactoalbmina y la lactoglobulina de oveja. Al aumentar el porcentaje de leche de cabra presente en la muestra, aumenta la intensidad de la banda correspondiente a la lactoglobulina de la leche de cabra y, por tanto, aumenta la altura del pico obtenido en el densitograma. Medir la altura del pico de la lactoglobulina de leche de cabra y del pico de la seroalbmina (BSA). A partir de los datos obtenidos para los patrones, resulta la recta de regresin y = ax + b, donde altura 1 g cabra y = altura BSA x = Porcentaje de leche de cabra. El porcentaje de leche de cabra en la muestra se determina sustituyendo en la recta de regresin calculada con los patrones, el valor altura 1 g cabra BSA obtenido por la muestra. 24(a).6. Expresin de los resultados. Expresar el contenido en leche de cabra segn los siguientes intervalos: -Menor del 5 por 100. -Entre el 5 y el 10 por 100.

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-Entre el 10 y el 20 por 100. -Mayor del 20 por 100. Siendo el lmite de deteccin prctico del 2 por 100 de leche de cabra en leche de oveja. 24(a).7. Referencias 24(a).7.1., 2, 3 y 4, como 23(a).8.1., 2, 3 y 4. 24(b). DETERMINACION DE LECHE DE CABRA EN LECHE DE OVEJA (Mtodo inmunolgico) 24(b).1. Principio El mtodo est basado en la precipitacin de las inmunoglobulinas de la leche de cabra por accin de un antisuero especfico. La muestra es depositada en los pocillos practicados en una capa de agar que contiene el antisuero especfico de la leche de cabra. Cuando la muestra contiene leche de cabra se produce una reaccin que se observa en forma de halo alrededor del pocillo donde se haba depositado dicha muestra. El dimetro de este halo es proporcional a la concentracin de leche de cabra. El mtodo es aplicable a la leche cruda o pasterizada a una temperatura mxima de 74C durante un tiempo mximo de treinta segundos, fresca o conservado mediante congelacin o adicin de dicromato potsico. 24(b).2. Material y aparatos. 24(b).2.1., 2, 3, 4, 5, 6 y 7, como 23(b).2.1., 2, 3, 4, 5, 6 y 7. 23(b).3. Reactivos. 24(b).3.1., 2, 3, 4, 5 y 6, como 23(b).3.1., 2, 3, 4, 5 y 6. 24(b).4. Procedimiento. 24(b).4.1. como 23(b).4.1. 24(b).4.2. Preparacin de la curva patrn. Preparar mezclas de leche de cabra en leche de oveja en concentraciones de 2%, 5%, 10% y 20%. La fraccin srica de los patrones se obtiene siguiendo el procedimiento descrito en 24(b).4.1. 24(b).4.3., 4 y 5 como 23(b).4.3., 4 y 5. 24(b).5. Interpretacin de los resultados. 24(b).5.1. Curva de calibrado. En un papel milimetrado trazar la curva, llevando en ordenadas los dimetros de los halos obtenidos con las mezclas preparadas para la curva patrn y en abcisas las races cuadradas de las concentraciones en leche de cabra. 24(b).5.2. Determinacin del porcentaje de leche de cabra en la muestra. Llevar sobre la curva de calibrado el dimetro medido para la muestra. Elevar al cuadrado el dato obtenido para

expresar el resultado en porcentaje de leche de cabra. 24(b).5.3. Lmite de deteccin. La tcnica descrita permite detectar un 1% de leche de cabra en leche de oveja. 24(b).6. Observaciones. 24(b).6.1. Una reaccin negativa debe obligatoriamente ser confirmada por la tcnica electrofortica de las protenas del suero (24(a). Determinacin de leche de cabra en leche de oveja (Mtodo Electrofortico)). 24(b).6.2. En el caso de una reaccin positiva, se tendr en cuenta que el resultado obtenido puede ser inferior al valor real, dado el efecto de un tratamiento trmico efectuado en condiciones de temperatura y/o de tiempo superiores a los fijados en 24(b).1. 24(b).7. Referencia Journal Officiel de la Republique Franaise (1 de junio de 1978). 25. DETERMINACION DE SUERO DE QUESERIA EN LECHE MEDIANTE ANALISIS DE LOS GLICOMACROPEPTIDOS POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA 25.1. Principio. El mtodo permite poner de manifiesto la presencia de suero de quesera mediante la determinacin de glicomacropptidos por CLAE, previa eliminacin de grasas y protenas con cido tricloroactico. El mtodo es aplicable a leches lquidas UHT y esterilizadas en el plazo de siete das a partir de la fecha de envasado y a leches pasterizadas y en polvo dentro del plazo de vida comercial del producto establecido de acuerdo con las disposiciones vigentes en la materia. 25.2. Material y aparatos 25.2.1. Material de uso corriente en laboratorio. 25.2.2. Equipo de cromatografa lquida de alta eficacia, que comprende: 25.2.2. a) Dos columnas en serie de permeacin de gel TSK 2000 SW (30 cm de longitud, dimetro interior de 0,75 cm) o de eficacia equivalente. Alternativamente puede utilizarse una de estas columnas con precolumna previa (3 cm x 0,3 cm) rellena de I 125 o material de eficacia equivalente. 25.2.2. b) Horno de columna con termostato regulado a 35C 1C. Se puede trabajar con columnas, mantenidas a temperatura ambiente, pero su poder de resolucin es ligeramente menor. En este caso, las variaciones de temperatura durante una misma serie de anlisis debern ser inferiores a 5C.

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25.2.2. c) Detector ultravioleta que permita efectuar lecturas a 205 nm. 25.2.2. d) Integrador que pueda integrar de valle a valle. 25.3. Reactivos 131881 Acetonitrilo PA 131032 Acido orto-Fosfrico PA-ACS-ISO 131067 Acido Tricloroactico PA-ACS 131074 Agua PA-ACS 131512 di-Potasio Hidrgeno Fosfato anhidro PA 131509 Potasio di-Hidrgeno Fosfato PA 131515 Potasio Hidrxido lentejas PA 131716 Sodio Sulfato PA 25.3.1. Solucin de Acido Tricloroactico. Disolver 240 g de Acido Tricloroactico PAACS en agua PA-ACS hasta 1.000 ml. 25.3.2. Solucin eluyente pH 6,0. Disolver 1,74 g de di-Potasio Hidrgeno Fosfato anhidro PA, 12,37 de Potasio di-Hidrgeno Fosfato PA y 21,41 g de Sodio Sulfato anhidro PA en 700 ml de agua aproximadamente. Ajustar, si es necesario, a pH 6,0 con ayuda de una solucin de cido fosfrico o de hidrxido potsico. Completar hasta 1.000 ml con agua y homogeneizar. En caso de utilizar una columna diferente a la TSK 2000 SW emplear una solucin eluyente adecuada. Esta solucin se debe filtrar antes de su utilizacin a travs de una membrana filtrante de 0,45 mm de dimetro de poro. 25.3.3. Solucin de lavado y de conservacin de columnas. Mezclar un volumen de acetonitrilo en nueve volmenes de agua. Filtrar la mezcla, antes de su utilizacin, a travs de una membrana filtrante de 0,45 mm de dimetro de poro. Puede utilizarse cualquier otra solucin de lavado que tenga efecto bactericida y que no altere la eficacia de resolucin de las columnas. 25.3.4. Muestras patrn. 25.3.4. a) Leche desnatada en polvo que responda a las exigencias del Reglamento CEE nmero 625/78, exenta de suero de quesera. 25.3.4. b) La misma leche anterior adicionada con un 5 por 100 m/m de suero de quesera de composicin media. 25.4. Procedimiento. 25.4.1. Preparacin de la muestra. 25.4.1. a) Leche en polvo. Trasvasar la leche en polvo a un recipiente de capacidad aproximadamente doble del volumen de sta, provisto de cierre hermtico. Cerrar el recipiente inmediatamente y mezclar bien. Pesar 2.000 g 0,001 g y aadir 20,0 g de agua a 50C. Disolver agitando durante cinco minutos con ayuda de un agitador. Llevar a temperatura de 25C. Aadir en dos minutos 10,0 ml de la solucin de cido tricloroactico (3.1) bajo agitacin magntica. Mantener a 25C durante sesenta minutos. Centrifugar a 2.200 ges durante diez minutos o filtrar sobre papel desechando los cinco primeros ml de filtrado. 25.4.1. b) Leche lquida. Tomar 20 ml de leche y continuar el proceso de igual forma a la que figura a partir del segundo punto y seguido del prrafo segundo del apartado a). 25.4.1. c) Patrones. Aplicar exactamente a la leche en polvo (3.4.a) y a la leche en polvo adicionada con el 5 por 100 de suero de quesera (3.4.b) el procedimiento descrito en el apartado 4.1.a. 25.4.2. Anlisis cromatogrfico. 25.4.2. a) Inyectar de 15 a 30 ml medidos exactamente de sobrenadante o de filtrado obtenido segn el apartado 4.1. en el aparato de cromatografa lquida de alta eficacia con un flujo de 1,0 ml/min de la solucin eluyente (3.2.). En cada interrupcin lavar las columnas con agua y en toda interrupcin superior a veinticuatro horas, despus del lavado con agua, se les debe pasar solucin de lavado (3.3.) por lo menos tres horas a un flujo de 0,2 ml por minuto o seguir las instrucciones del fabricante. 25.4.2. b) Antes de proceder al anlisis cromatogrfico de las muestras, inyectar el patrn de leche en polvo adicionada con el 5 por 100 de suero de quesera (3.4.b) preparado segn el apartado 4.1.c) las veces que sean necesarias hasta que la superficie y el tiempo de retencin del pico correspondiente a los GMP sea constante. 25.5. Clculos 25.5.1. En las figuras 1 y 2 (ver pg. 51) se representan los cromatogramas de una leche en polvo exenta de suero de quesera (3.4.a) y de la misma leche en polvo adicionada con el 5 por 100 (m/m) de suero de quesera (3.4.b), respectivamente. El pico III es el correspondiente a los GMP. Con el fin de detectar cualquier anomala, ya sea debida al mal funcionamiento del cromatgrafo o de las columnas, ya sea debido a la muestra a analizar, es necesario observar el aspecto de cada cromatograma antes de efectuar cualquier interpretacin cuantitativa. 25.5.2. Clculo del coeficiente de respuesta: P R= A(5) - A(0)

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donde: R: es el coeficiente de respuesta. A(5): es el rea del pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico del patrn de leche en polvo adicionada con 5 por 100 (m/m) de suero de quesera 25.3.4.b. A(0): es el rea del pico III, obtenido en el anlisis cromatogrfico del patrn de leche en polvo exenta de suero de quesera 25.3.4.a. P: es el porcentaje de suero de quesera presente en el patrn 25.3.4.b, en este caso 5. 25.5.3. Clculo del rea relativa del pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico de la muestra (E). S(E) = R x A(E) donde: S(E): rea relativa del pico III en la muestra (E). A(E): rea correspondiente al pico III obtenida en el anlisis cromatogrfico de la muestra. R: Coeficiente de respuesta calculado segn (25.5.2.). 25.5.4. Clculo del rea relativa del pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico del patrn de leche en polvo exento de suero de quesera (25.3.4.a). S(O) = R x A(O) donde: S(O): rea relativa del pico III en el patrn de leche en polvo exenta de suero de quesera (25.3.4.a). A(O): rea correspondiente al pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico del patrn de leche en polvo exenta de suero de quesera (25.3.4.a). R: coeficiente de respuesta calculado segn (25.5.2.). 25.5.5. Clculo del tiempo de retencin relativo del pico III en la muestra (E). TR(E) TRR(E) = TR(5) donde: TRR(E): tiempo de retencin relativo del pico III de la muestra (E). TR(E): tiempo de retencin del pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico de la muestra (E). TR(5): tiempo de retencin del pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico del patrn de leche en polvo adicionada con 5 por 100 (m/m) de suero de quesera (25.3.4.b). 25.5.6. Por la experimentacin, est demostrado que existe una relacin lineal entre el tiempo relativo del pico III en la muestra y el porcentaje de suero de quesera en polvo aadido hasta el 10 por 100: -Con un contenido < 5 por 100, el TRR(E) es > 1,000. -Con un contenido 5 por 100, el TRR(E) es 1,000.

-La incertidumbre admitida para los valores del TRR(E) es de 0,002. 25.5.7. Clculo de porcentaje de suero de quesera en polvo presente en la muestra. W = S(E) - [1,3 + (S(O) - 0,9)] donde: W: porcentaje m/m de suero de quesera presente en la muestra (E). S(E): rea relativa del pico III para la muestra obtenida segn (25.5.3.). 1,3 +: media experimental del rea relativa del pico III expresada en gramos de suero de quesera en 100 g de leche en polvo no adulterada. S(O): rea relativa del pico III para el patrn de leche en polvo exenta de suero de quesera (25.3.4.a) obtenida segn (25.5.4.). (S(O) - 0,9): correccin que hay que efectuar en el rea relativa media 1,3 cuando el valor S(O) no es igual a 0,9. 25.5.8. Repetibilidad. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultneamente o en un corto intervalo de tiempo por el mismo analista que utilice los mismos aparatos, con la misma toma de muestra, no debe sobrepasar el 0,2 por 100 m/m. 25.5.9. Reproducibilidad. La diferencia entre dos resultados individuales e independientes obtenidos en dos laboratorios diferentes, con la misma toma de muestras no debe sobrepasar el 0,4 por 100 m/m. 25.5.10. Lmite de deteccin. Se considerar que una muestra contiene suero de quesera aadido cuando el porcentaje cuantificado sea superior a cinco en el caso de leches UHT y superior a tres en leches pasterizadas, esterilizadas y en polvo. 25.6. Referencias. 25.6.1. Olieman (et al) 1983. A sensitive HPLC method of detecting and stimating rennet whey total soolids in skim milk powder; Neth Milk Dairy J. 37 27-36). 25.6.2. Reglamento CEE nmero 3711/1986, de la Comisin, de 4 de diciembre de 1986.

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INYECCION

INYECCION

FIGURA 1

FIGURA 2

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II. Leches evaporada rica en grasa, entera condensada, en polvo rica en grasa o extragrasa, concentrada.

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METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 4-2-1989) 0. PREPARACION DE LA MUESTRA PARA EL ANALISIS QUIMICO Y CONSIDERACIONES GENERALES 0.1. Preparacin de la muestra: 0.1.1. Leche evaporada rica en grasa. Leche evaporada entera o leche evaporada. Leche evaporada semidesnatada o parcialmente desnatada. Leche evaporada desnatada. Agitar el bote cerrado dndole la vuelta. Abrir el bote y transvasar la leche lentamente a un segundo recipiente que pueda cerrarse hermticamente, mezclndola mediante sucesivos transvases; asegrese de que todos los restos de grasa y de leche adheridos al casco y al fondo del bote se han mezclado con la muestra. Cierre el recipiente. Si el contenido no apareciera homogneo, pngalo a calentar al bao Mara a 40C. Agitar vigorosamente cada 15 minutos. Dos horas ms tarde, saque el recipiente del bao Mara y deje que se enfre a temperatura ambiente. Levante la tapa y mezcle cuidadosamente el contenido con la ayuda de una cuchara o de una esptula (si la grasa se ha desemulsionado no es conveniente proceder al anlisis de la muestra). Consrvese en lugar fresco. 0.1.2. Leche condensada o leche entera condensada. Leche condensada semidesnatada. Leche condensada desnatada. Botes: Calentar el bote cerrado al bao Mara de 30 a 40C durante unos treinta minutos. Abrir el bote y mezclar cuidadosamente su contenido con una esptula o con una cuchara, efectuando movimientos ascendentes, descendentes y circulares, con el fin de obtener una ntima mezcla de las capas superiores e inferiores con el conjunto del contenido. Asegurarse de que los restos de leche adheridos al casco y al fondo del bote se han mezclado con la muestra. Siempre que sea posible, transvasar el contenido a un segundo recipiente dotado de un sistema de cierre estanco. Cerrar el recipiente y conservar en lugar fresco. Tubos: Cortar el fondo y transvasar el contenido a un recipiente dotado de cierre estanco. Despus cortar el tubo en el sentido de su longitud, despegar todas las materias adheridas al interior del tubo y mezclarlas cuidadosamente con el resto del contenido. Conservar el recipiente en lugar fresco. 0.1.3. Leche en polvo rica en grasa o extragrasa. Leche en polvo entera o leche entera en polvo. Leche en polvo parcialmente desnatada o semidesnatada. Leche en polvo desnatada o leche desnatada en polvo. Transvasar la leche en polvo a un recipiente limpio y seco (con cierre estanco) con una capacidad equivalente al doble del volumen del polvo. Cerrar inmediatamente el cierre y mezclar ntimamente la leche en polvo agitndolo y dndole vueltas sucesivamente. Durante la preparacin de la muestra se ha de evitar, siempre que sea posible, exponer la leche en polvo al aire atmosfrico para reducir al mnimo la absorcin de agua. 0.2. Reactivos: 131074 Agua PA-ACS Agua: Cuando se utilice el agua para soluciones, disoluciones o lavados, se ha de utilizar Agua Destilada, Agua Desmineralizada o agua de una pureza al menos equivalente. Cuando utilicemos el trmino "solucin" o "disolucin" sin otra indicacin, nos referimos a solucin en el agua o disolucin en el agua. Productos qumicos: Todos los productos qumicos utilizados han de ser de calidad analtica reconocida, salvo especificaciones especiales. 0.3. Equipo. Lista de aparatos: Las listas de aparatos slo contienen los artculos de uso especializado y los artculos de especificacin especial. Balanza analtica: El trmino "balanza analtica" hace referencia a una balanza capaz de pesar con precisin mnima de 0,1 mg. 0.4. Expresin de resultados. Clculo del porcentaje: Salvo especificacin en contra, el resultado se calcular en porcentaje de la masa de la prueba analizada en el laboratorio. Nmero de cifras significativas: Los resultados no contendrn un nmero de cifras significativas superior al justificado por la precisin del mtodo de anlisis utilizado. 0.5. Redaccin del acta de la prueba. En el acta de la prueba se indicar el mtodo de anlisis utilizado, as como los resultados. Adems, ha de mencionar todos los detalles del procedimiento no especificados en el mtodo de anlisis o facultativos, as como las condiciones susceptibles de haber influido el resultado obtenido. El acta de la prueba deber suministrar todas las informaciones necesarias para la identificacin completa de la muestra.

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METODO 1: EXTRACTO SECO (Estufa) 1.1. Principio. Se entiende por extracto seco de la leche evaporada, de la leche concentrada, o de la leche condensada, el extracto seco determinado por el mtodo descrito a continuacin. Una cantidad conocida de la muestra se diluye con agua, luego se mezcla con arena y se deseca a una temperatura de 99 1C. La masa obtenida tras desecacin constituye la masa de extracto seco. El extracto seco se expresa en porcentaje de la masa de la muestra. Este mtodo permite determinar el contenido en extracto seco de los siguientes tipos de leche: Leche evaporada rica en grasa. Leche evaporada entera o leche evaporada. Leche evaporada semidesnatada o parcialmente desnatada. Leche evaporada desnatada. Leche concentrada rica en materia grasa (no existe). Leche concentrada entera o leche concentrada. Leche concentrada semidesnatada. Leche concentrada desnatada. Leche condensada. Leche condensada semidesnatada. Leche condensada desnatada. 1.2. Material y aparatos. 1.2.1. Balanza analtica. 1.2.2. Cpsulas metlicas preferentemente de nquel, de aluminio o de acero inoxidable. Las cpsulas han de estar dotadas de tapas que se adapten perfectamente pero que puedan ser fcilmente levantadas. Las dimensiones ms idneas son: Dimetro, de 60 a 80 mm; profundidad, de unos 25 mm. 1.2.3. Estufas de desecacin a presin atmosfrica, bien ventiladas y controladas por termostato, con la temperatura regulada a 99 1C, es muy importante que la temperatura del conjunto de la estufa sea uniforme. 1.2.4. Desecador, lleno de gel de slice activado recientemente o de un desecante equivalente. 1.2.5. Varillas de vidrio, una de cuyas extremidades ser plana y de una longitud similar a las dimensiones interiores de las cpsulas metlicas (1.2.2.). 1.2.6. Bao de agua hirviendo.

vs de un tamiz de 500 micras y retenida por un tamiz de 180 micras). Ha de corresponder al test de control que se indica a continuacin: Calentar unos 25 g de arena durante dos horas en la estufa (punto 1.2.3.), tal como se indica en los puntos 1.4.1. a 1.4.3. Aadir 5 ml de Agua PAACS, calentar de nuevo en la estufa durante dos horas, enfriar y volver a pesarlos. La diferencia entre las dos pesadas consecutivas no ha de ser superior a 0,5 mg. Llegado el caso, tratar la arena durante tres das con Acido Clorhdrico 35% PA-ISO; mezclar de vez en cuando. Lavarla con agua hasta que desaparezca la reaccin cida o hasta que el agua del lavado est exenta del cloruro. Secarla a 160C y repetir el test tal como se indica anteriormente. 1.4. Procedimiento. 1.4.1. Colocar en la cpsula (punto 1.2.2.) unos 25 gramos de arena (punto 1.3.) y una varilla de vidrio (punto 1.2.5.). 1.4.2. Calentar la cpsula, la tapa y el contenido con la tapa levantada, durante dos horas en la estufa (punto 1.2.3.). 1.4.3. Colocar de nuevo la tapa en la cpsula y pasar sta al desecador (punto 1.2.4.). Dejar enfriar a temperatura ambiente y pesar con una precisin mnima de 0,1 mg (Mo). 1.4.4. Inclinar la tapa, amontonando la arena en un lado de la cpsula. Introducir en el espacio libre que queda, aproximadamente, 1,5 g de la muestra si se trata de leche condensada y 3 g si se trata de leche evaporada y leche concentrada. Volver a colocar la tapa y pesar con una precisin mnima de 0,1 mg (M1). 1.4.5. Retirar la tapa. Aadir 5 ml de agua y mezclar los lquidos con la varilla de vidrio (punto 1.2.5.), luego la arena y la parte lquida. Dejar la varilla en la mezcla. 1.4.6. Colocar la cpsula en el bao de agua (punto 1.2.6.) hasta que el agua se evapore (generalmente unos veinte minutos). Remover la mezcla de vez en cuando con la varilla para que la masa se airee bien y no se aglutine tras la desecacin. Colocar la varilla en el interior de la cpsula 1.4.7. Colocar la cpsula y la tapa durante una hora y treinta minutos en la estufa. 1.4.8. Volver a poner la tapa. Transferir la cpsula al desecador y dejarla enfriar hasta temperatura ambiente. Pesar con una precisin mnima de 0,1 mg. 1.4.9. Destapar la cpsula y calentarla, junto con su tapa, durante una hora en la estufa. 1.4.10. Repetir la operacin del punto 1.4.8. 1.4.11. Repetir las operaciones descritas en los puntos 1.4.9. y 1.4.8., hasta que dos pesadas sucesivas no difieran en ms de 0,5 mg o que aumente la masa. En el punto 1.5. utilizar la pesada ms baja (M2).

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1.3. Reactivos. 131019 Acido Clorhdrico 35% PA-ISO 131074 Agua PA-ACS 211160 Arena de Mar lavada, grano fino QP Arena de cuarzo o Arena de Mar lavada gr. fino QP (tamao de los granos: 0,18-0,5 mm, tratada con Acido Clorhdrico 35% PA-ISO, pasada a tra-

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1.5. Clculos. El contenido en extracto seco, expresado en porcentaje de la masa de muestra, se indica segn la frmula: M2 - M0 x 100 M1 - M0 METODO 2: HUMEDAD (Estufa) 2.1. Principio. Se entiende por humedad la prdida de masa durante el proceso de desecacin determinado por el mtodo descrito a continuacin. La masa residual de la muestra se determina tras desecacin a presin atmosfrica en una estufa a 102 1C hasta obtencin de una masa constante. La prdida de masa se calcula en porcentaje de la masa de muestra. Este mtodo permite determinar la prdida de masa durante el proceso de desecado de los tipos de leche citados a continuacin: Leche en polvo rica en grasas o extragrasa. Leche en polvo entera o leche entera en polvo. Leche en polvo parcialmente desnatada o semidesnatada. Leche en polvo desnatada o leche desnatada en polvo. 2.2. Material y aparatos. 2.2.1. Balanza analtica. 2.2.2. Cpsulas, preferentemente de vidrio, de nquel, de aluminio o de acero inoxidable. Las cpsulas han de estar dotadas de tapas que se adapten perfectamente pero que puedan ser fcilmente levantadas. Las dimensiones ms idneas son: Dimetro, de 60 a 80 ml; profundidad, de unos 25 cm. 2.2.3. Estufa a presin atmosfrica, bien ventilada y controlada por termostato, con la temperatura regulada a 102 1C. Es muy importante que la temperatura del conjunto de la estufa sea uniforme. 2.2.4. Desecador, lleno con gel de slice activado recientemente o de un desecante equivalente. 2.2.5. Frascos provistos de tapones hermticos para el mezclado de la leche en polvo. 2.3. Procedimiento 2.3.1. Quitar la tapa de la cpsula (punto 2.2.2.) y colocar tapa y cpsula en la estufa (punto 2.2.3.) durante una hora. 2.3.2. Volver a poner la tapa, transferir la cpsula al desecador (punto 2.2.4.) y dejar enfriar hasta alcanzar la temperatura ambiente; pesar con una precisin de 0,1 mg (M0). 2.3.3. Colocar en la cpsula unos dos gramos de muestra de leche en polvo, poner la tapa sobre la cpsula y proceder rpidamente a pesar la cpsula equipada de su tapa con una precisin de 0,1 mg (M1). 2.3.4. Retirar la tapa y colocar cpsula y tapa durante dos horas en la estufa. 2.3.5. Poner de nuevo la tapa, transferir la cpsula tapada al desecador y dejar enfriar hasta

en donde: M0 = masa, en gramos, de la cpsula, de su tapa, de la arena y de la varilla tras la operacin del punto 1.4.3. M1 = masa, en gramos, de la tapa, de la cpsula, de la arena, de la varilla y de la muestra tras la operacin del punto 1.4.4. M2 = masa, en gramos, de la tapa, de la cpsula, de la arena, de la varilla y de la muestra desecada, tras la operacin del punto 1.4.11. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas, efectuadas simultnea o inmediatamente una despus de otra por el mismo analista de la misma muestra y en las mismas condiciones, no ha de exceder 0,2 gramos de extracto seco por 100 gramos de producto. 1.5.1. Clculo del contenido en extracto seco total y del contenido en extracto seco no graso en la leche. El contenido en extracto seco lcteo de los distintos tipos de leche condensada viene dado por a - b, siendo: a = el contenido en extracto seco total (obtenido segn el mtodo 1). b = el contenido en sacarosa (obtenido segn el mtodo 5). El contenido en extracto seco lcteo no graso, de los distintos tipos de leche condensada viene dado por a-b-c, siendo: a = el contenido en extracto seco total (obtenido segn el mtodo 1). b = el contenido en sacarosa (obtenido segn el mtodo 5). c = el contenido en materia grasa (obtenido segn el mtodo 3). El contenido en extracto seco no graso de los distintos tipos de leche evaporada y concentrada viene dado por a - c, siendo: a = el contenido en extracto seco total (obtenido segn el mtodo 1). c = el contenido en materia grasa (obtenido segn el mtodo 3). 1.6. Referencias. Primera Directiva de la Comisin de 13 de Noviembre de 1979 (79/1067/CEE); "Diario Oficial de las Comunidades Europeas" nmero L 327/29, de 24 de Diciembre.

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alcanzar la temperatura ambiente; pesar rpidamente con una precisin de 0,1 mg. 2.3.6. Destapar la cpsula y calentar, junto con su tapa, durante una hora en la estufa. 2.3.7. Repita la operacin del punto 2.3.5. 2.3.8. Repetir las operaciones de los puntos 2.3.6. y 2.3.5. hasta que dos pesadas no difieran en ms de 0,5 mg o aumente la masa. En el punto 2.4. utilizar la pesada ms baja (M 2). 2.4. Clculos Calcular la prdida de masa de la muestra durante el proceso de desecacin, expresada en porcentaje de la masa, utilizando la frmula: M1 - M2 x 100 M1 - M0 en donde M0 = masa, en gramos, de la cpsula y de su tapa, tras la operacin del punto 2.3.2. M1 = masa, en gramos, de la cpsula, de su tapa y de la muestra, tras la operacin del punto 2.3.3. M2 = masa, en gramos, de la cpsula, de la tapa y de la muestra final, tras la operacin del punto 2.3.5. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas, efectuadas simultneamente o inmediatamente una despus de la otra por el mismo analista de la misma muestra y en las mismas condiciones, no ha de exceder 0,1 g de agua por 100 g de producto. 2.5. Referencias. Primera Directiva de la Comisin de 13 de Noviembre de 1979 (79/1067/CEE); "Diario Oficial de las Comunidades Europeas" nmero L 327/29, de 24 de Diciembre). METODO 3: MATERIA GRASA (Mtodo Rose-Gottlieb) 3.1. Principio. Se entiende por contenido en materia grasa de los distintos tipos de leche evaporada, leche concentrada o de leche condensada, al contenido en materia grasa determinado por el mtodo descrito a continuacin. El contenido en materia grasa se determina por extraccin de la materia grasa de una solucin amoniacal-alcohlica de la muestra con ayuda de Eter Etlico y de Eter de Petrleo, evaporacin de los disolventes, pesada de los residuos y clculo en porcentaje de la muestra, segn el mtodo Rose-Gottlieb. Este mtodo permite determinar el contenido en materia grasa de los siguientes tipos de leche:

Leche evaporada rica en grasa. Leche evaporada entera o leche evaporada. Leche evaporada semidesnatada o parcialmente desnatada. Leche evaporada desnatada. Leche concentrada rica en materia grasa (no existe). Leche concentrada entera o leche concentrada. Leche concentrada semidesnatada. Leche concentrada desnatada. Leche condensada. Leche condensada semidesnatada. Leche condensada desnatada. 3.2. Material y aparatos 3.2.1. Balanza analtica. 3.2.2. Tubos de extraccin apropiados, dotados de tapones de vidrio esmerilado o de otro tipo de cierre, insensible a la accin de los disolventes empleados. 3.2.3. Matraces de fondo plano y pared delgada, de 150 a 250 mililitros de capacidad. 3.2.4. Estufa de desecacin a presin atmosfrica, bien ventilada, controlada por termostato (temperatura a 102 1C). 3.2.5. Grnulos destinados a facilitar la ebullicin, exentos de materia grasa, no porosos, no desmenuzables, como por ejemplo perlas de vidrio trocitos de carburo de silicio (el empleo de estos grnulos es facultativo; ver al respecto el punto 3.4.2.1.). 3.2.6. Sifn correspondiente a los tubos de extraccin. 3.2.7. Centrfuga. 3.3. Reactivos Todos los reactivos han de conformarse con las condiciones requeridas en la prueba en blanco (punto 3.4.1.). Llegado el caso, podrn destilarse de nuevo los reactivos en presencia de 1 g de grasa de mantequilla por 100 ml de disolvente. 131074 131129 131270 131085 132770 Agua PA-ACS Amonaco 25% (en NH 3) PA Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO Etanol 96% v/v PA Eter Ditlico estabilizado con 6 ppm de BHT PA-ACS 131315 Eter Petrleo 40-60C PA-ISO 131542 Potasio Yoduro PA-ISO

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3.3.1. Solucin de Amonaco 25% (en NH 3) PA (densidad a 20C, unos 0,91 grs. por ml). 3.3.2. Etanol 96% v/v PA o, en su ausencia, 153973 Etanol 96 totalmente desnaturalizado PR. 3.3.3. Eter Ditlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS, exento de perxidos. Nota 1: Para asegurarse de que el Eter Dietlico est exento de perxidos, aadir a 10 ml de Eter

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Dietlico contenidos en una pequea probeta con tapn, de vidrio, enjuagada previamente con un poco de Eter Dietlico, 1 ml de una solucin con un 10% de Potasio Yoduro PA-ISO, recientemente preparada. Agitar y dejar reposar durante un minuto. No ha de aparecer coloracin amarilla alguna en ninguna de las dos capas. Nota 2: Eter Ditlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS puede ser mantenido exento de perxidos adicionando una hoja de cinc hmeda previamente sumergida durante un minuto en una solucin cida diluida de Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO y posteriormente lavada con Agua PA-ACS. Para un litro de Eter Dietlico, utilizar unos 8.000 mm cuadrados de hoja de cinc, cortada en bandas suficientemente largas para llegar a la mitad del recipiente, como mnimo. 3.3.4. Eter de Petrleo, de punto de ebullicin entre 30 y 60C. En su defecto usar Eter Petrleo 40-60C PA-ISO. 3.3.5. Mezcla de disolventes, preparada inmediatamente antes de su empleo y mediante la mezcla de igual volumen de Eter Dietlico (punto 3.3.3.) y de Eter de Petrleo (punto 3.3.4.). (Se puede sustituir la mezcla de disolventes, siempre que sea indicado, por el Eter Dietlico o por el Eter de Petrleo). 3.4. Procedimiento. 3.4.1. Prueba en blanco: Al tiempo que se efecta la determinacin de la materia grasa de la muestra, efectuar una prueba en blanco con 10 ml de Agua PA-ACS utilizando el mismo tipo de aparato de extraccin, los mismos reactivos en las mismas proporciones y el mismo procedimiento que el descrito a continuacin, salvo el punto 3.4.2.2. Si el valor de la prueba en blanco es superior a 0,5 mg, habr que comprobar la pureza de los reactivos y en el caso de que sean impuros habrn de ser purificados o sustituidos. 3.4.2. Determinacin: 3.4.2.1. Secar el matraz (punto 3.2.3.) despus de haber depositado los grnulos (punto 3.2.5.), para facilitar una ebullicin moderada durante la evaporacin de los disolventes en la estufa (punto 3.2.4.) durante una media hora a una hora. Dejar enfriar el matraz hasta que adquiera la temperatura ambiente y pesar el matraz ya enfriado, con una precisin de 0,1 mg. 3.4.2.2. Agitar la muestra preparada de 5 grs. y pesar inmediatamente despus con una precisin de 1 mg, directamente o por diferencia, 4 grs. de leche evaporada o de leche concentrada o 2 a 2,5 g de leche condensada en el tubo de extraccin (punto 3.2.2.). Aadir agua hasta un volumen de 10,5 ml y agitar suavemente calentando al mismo tiempo ligeramente (40 a 50C), hasta la total dispersin del producto. La muestra ha de estar totalmente dispersa, ya que en caso contrario habr de repetir la determinacin. 3.4.2.3. Aadir 1,5 ml de la solucin de Amonaco 25% (en NH3) PA (punto 3.3.1.) o un volumen correspondiente de una solucin ms concentrada y mezclar convenientemente. 3.4.2.4. Aadir 10 ml de Etanol 96% v/v PA (punto 3.3.2.) y mezclar los lquidos, suave pero totalmente, en el tubo de extraccin. Enfriar convenientemente, si es necesario, el tubo bajo el agua corriente. 3.4.2.5. Aadir 25 ml de Eter Dietlico (punto 3.3.3.). Cerrar el tubo, agitar enrgicamente, moviendo varias veces, durante un minuto. 3.4.2.6. Retirar el tapn con precaucin y aadir 25 ml de Eter de Petrleo (punto 3.3.4.) utilizando los primeros mililitros para enjuagar el tapn y el interior del cuello del tubo y dejando que se deslicen los lquidos de enjuague al interior del aparato. Cerrar el tubo volviendo a colocar el tapn agitar e invertir varias veces durante treinta segundos. Si no se prev centrifugado durante la operacin indicada en el punto 3.4.2.7., no agitar demasiado enrgicamente. 3.4.2.7. Dejar reposar el tubo hasta que la capa lquida superior quede transparente y se separe ntidamente de la fase acuosa. Se puede realizar tambin la separacin con ayuda de una centrfuga adecuada (punto 3.2.7.). Nota: Si se utiliza una centrfuga cuyo motor no es trifsico, pueden producirse chispas y por ello habr que estar atento para evitar una explosin o un incendio como consecuencia de la presencia de vapores de ter (en caso de ruptura de un tubo, por ejemplo). 3.4.2.8. Retirar el tapn y enjuagarlo, as como el interior del cuello del tubo, con unos ml de mezcla de solventes (punto 3.3.5.) y dejar que los lquidos del enjuague se deslicen al interior del aparato. Trasvasar con mucho cuidado, lo ms completamente posible, la capa superior al matraz (punto 3.4.2.1.) mediante decantacin o con ayuda de un sifn (punto 3.2.6.). Nota: Si el trasvase no se realiza con ayuda de un sifn, puede ser necesario aadir un poco de agua para elevar el nivel de separacin de las dos capas con el fin de facilitar la decantacin. 3.4.2.9. Enjuagar el interior y el exterior del cuello del tubo o la punta y la parte inferior del sifn con unos ml de la mezcla de disolventes. Dejar que los lquidos del enjuague del exterior del tubo se deslicen al interior del matraz y que los del interior del cuello y del sifn se deslicen al interior del tubo de extraccin. 3.4.2.10. Proceder a una segunda extraccin repitiendo las operaciones descritas en los puntos 3.4.2.5. a 3.4.2.9., incluido, pero utilizando nicamente 15 ml de Eter Dietlico y 15 ml de Eter de Petrleo.

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3.4.2.11. Efectuar una tercera extraccin procediendo tal como se indica en el punto 2.4.2.10, pero sin realizar el enjuague final (punto 3.4.2.9.). Nota: En el caso de la leche desnatada evaporada, de la leche desnatada concentrada y de la leche desnatada condensada, no es necesario efectuar esta tercera extraccin. 3.4.2.12. Eliminar con cuidado por evaporacin o destilacin el mximo de disolvente (incluido el Etanol). Si el matraz fuera de pequea capacidad, habr que eliminar un poco de disolvente de la manera anteriormente indicada tras cada extraccin. 3.4.2.13. Cuando ya no exista olor alguno de disolvente, calentar el matraz inclinado, durante una hora, en la estufa. 3.4.2.14. Retirar el matraz de la estufa, dejar enfriar hasta que adquiera la temperatura ambiente y pesar con precisin de 0,1 mg. 3.4.2.15. Repetir las operaciones de los puntos 3.4.2.13. y 3.4.2.14. calentando a intervalos de treinta a sesenta minutos hasta que dos pesadas consecutivas no difieran en ms de 0,5 mg o que aumente la masa. En el punto 3.5. utilizar la pesada tomando el valor ms bajo (M 1). 3.4.2.16. Aadir de 15 a 25 ml de Eter de Petrleo para verificar si la materia extrada es totalmente soluble. Calentar ligeramente y agitar el disolvente mediante un movimiento circular hasta que se disuelva toda la materia grasa. 3.4.2.16.1. Si la materia extrada es totalmente soluble en Eter de Petrleo, la masa de materia grasa es la diferencia entre la pesada del punto 3.4.2.1. y la pesada del punto 3.4.2.15. 3.4.2.16.2. Si aparecieran materias insolubles o siempre en caso de duda, extraer completamente la materia grasa contenida en los matraces mediante repetidos lavados con Eter de Petrleo caliente, dejando que la materia no disuelta se deposite antes de cada decantacin. Enjuagar tres veces el exterior del cuello del matraz. Calentar el matraz inclinado, durante una hora, en la estufa y dejar enfriar tal como se indic anteriormente (punto 3.4.2.1.) hasta que adquiera la temperatura ambiente; pesar con una precisin de 0,1 mg. La masa de la materia grasa es la diferencia entre la pesada del punto 3.4.2.15. y esta pesada final. 3.5. Clculos. La masa expresada en gramos de la materia grasa extrada viene dada por la siguiente frmula: (M1 - M2) - (B1 - B2) y el contenido en materia grasa de la muestra, expresado en porcentaje, por la frmula:

(M1 - M2) - (B1 - B2) x 100 S en donde: M1 = masa, en gramos, del matraz M conteniendo la materia grasa tras la operacin del punto 3.4.2.15. M2 = masa, en gramos, del matraz M tras la operacin del punto 3.4.2.1. o, en caso de que aparezcan materias insolubles o en caso de duda, tras la operacin del punto 3.4.2.16.2. B1 = masa, en gramos, del matraz B de la prueba en blanco tras la operacin del punto 3.4.2.15. B2 = masa, en gramos, del matraz B, tras la operacin del punto 3.4.2.1. o, en el caso de que aparezcan materias insolubles o en caso de duda, tras la operacin del punto 3.4.2.16.2. S = masa, en gramos, de la muestra utilizada. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultneamente o inmediatamente una despus de la otra por el mismo analista sobre la misma muestra y en las mismas condiciones, no ha de exceder 0,05 grs. de materia grasa por 100 g de producto. 3.6. Referencias Primera Directiva de la Comisin de 13 de Noviembre de 1979 (79/1067/CEE); "Diario Oficial de las Comunidades Europeas" nmero L 327/29, de 24 de Diciembre de 1979. METODO 4: MATERIA GRASA (Mtodo Rose-Gottlieb) 4.1. Principio. Se entiende por contenido en materia grasa de los distintos tipos de leche en polvo al contenido en materia grasa determinado por el mtodo descrito a continuacin. El contenido en materia grasa se determina por extraccin de la materia grasa de una solucin amoniacal-alcohlica de la muestra con ayuda de Eter Etlico y de Eter de Petrleo, evaporacin de los disolventes, pesada de los residuos y clculo en porcentaje de la muestra, segn el mtodo Rose-Gottlieb. Este mtodo permite determinar el contenido en materia grasa de las siguientes leches: Leche en polvo rica en grasa o extragrasa. Leche en polvo entera o leche entera en polvo. Leche en polvo parcialmente desnatada o semidesnatada. Leche en polvo desnatada o leche desnatada en polvo. 4.2. Material y aparatos. 4.2.1. Balanza analtica.

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4.2.2. Tubos de extraccin apropiados, dotados de tapones de vidrio esmerilado o de otro tipo de cierre insensible a la accin de los disolventes empleados. 4.2.3. Matraces de fondo plano y pared delgada, de 150 a 250 ml de capacidad. 4.2.4. Estufa de desecacin a presin atmosfrica, bien ventilada, controlada por termostato (temperatura a 102 1C). 4.2.5. Grnulos destinados a facilitar la ebullicin, exentos de materia grasa, no porosos, no desmenuzables, como por ejemplo perlas de vidrio trocitos de carburo de silicio (el empleo de estos grnulos es facultativo; ver al respecto el punto 4.4.2.1.). 4.2.6. Bao de agua a 60-70C. 4.2.7. Sifn correspondiente a los tubos de extraccin. 4.2.8. Centrfuga. 4.3. Reactivos. 131074 Agua PA-ACS 131129 Amonaco 25% (en NH3) PA 131085 Etanol 96% v/v PA 132770 Eter Ditlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS 131315 Eter Petrleo 40-60C PA-ISO 131542 Potasio Yoduro PA-ISO Todos los reactivos han de conformarse con las condiciones requeridas en la prueba en blanco (punto 4.4.1.). Llegado el caso, podrn destilarse de nuevo los reactivos en presencia de 1 g de grasa de mantequilla por 100 ml de disolvente. 4.3.1. Solucin de Amonaco 25% (en NH 3) PA (densidad a 20C, unos 0,91 g/ml) una solucin ms concentrada de una concentracin conocida. 4.3.2. Etanol 96% v/v PA o, en su ausencia, 153973 Etanol 96 totalmente desnaturalizado PR. 4.3.3. Eter Ditlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS, exento de perxidos. Nota 1: Para asegurarse de que el Eter Dietlico est exento de perxidos, aadir a 10 ml de Eter Dietlico contenidos en una pequea probeta con tapn de vidrio, enjuagada previamente con un poco de Eter Dietlico, 1 ml de una solucin con un 10% de Potasio Yoduro PA-ISO, recientemente preparada. Agitar y dejar reposar durante un minuto. No ha de aparecer coloracin amarilla alguna en ninguna de las dos capas. Nota 2: El Eter Ditlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS puede ser mantenido exento de perxidos adicionando una hoja de cinc hmeda previamente sumergida durante un minuto en una solucin cida diluida de Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO y posteriormente lavada con Agua PA-ACS. Para 1 litro de Eter Dietlico, utilizar unos 8.000 mm2 de hoja de cinc, cortada en bandas suficientemente largas para llegar a la mitad del recipiente, como mnimo. 4.3.4. Eter de Petrleo, de punto de ebullicin entre 30 y 60C. En su defecto usar Eter Petrleo 40-60C PA-ISO. 4.3.5. Mezcla de disolventes, preparada inmediatamente antes de su empleo, mediante la mezcla de igual volumen de Eter Dietlico (punto 4.3.3.) y de Eter de Petrleo (punto 4.3.4.), (se puede sustituir la mezcla de disolventes, siempre que sea indicado, por el Eter Dietlico o por el Eter de Petrleo). 4.4. Procedimiento. 4.4.1. Prueba en blanco. Al tiempo que se efecta la determinacin de la materia grasa de la muestra, efectuar una prueba en blanco con 10 ml de agua utilizando el mismo tipo de tubo de extraccin, los mismos reactivos en las mismas proporciones y el mismo procedimiento que el descrito a continuacin, salvo el punto 4.4.2.2. Si el valor de la prueba en blanco es superior a 0,5 mg, habr que comprobar la pureza de los reactivos, en caso de que sean impuros habrn de ser purificados o sustituidos. 4.4.2. Determinacin. 4.4.2.1. Secar el tubo (punto 4.2.3.) despus de haber depositado los grnulos (punto 4.2.5.) para facilitar una ebullicin moderada durante la evaporacin de los disolventes en la estufa (punto 4.2.4.) durante una media hora a una hora. Dejar enfriar el matraz hasta que adquiera la temperatura ambiente y pesar el matraz ya enfriado, con una precisin de 0,1 mg. 4.4.2.2. En el tubo de extraccin (punto 4.2.2.) pesar con una precisin de 1 mg, bien directamente bien por diferencia, aproximadamente 1 g de leche en polvo o 1,5 g de leche semidesnatada en polvo o de leche desnatada en polvo. Aadir 10 ml de agua y agitar hasta la total dispersin de la leche (en algunas muestras habr que proceder a calentarlas). 4.4.2.3. Aadir 1,5 ml de la solucin de Amonaco 25% (en NH3) PA (punto 4.3.1.) o un volumen correspondiente de una solucin ms concentrada y calentar al bao de agua (4.2.6.) durante quince minutos, de 60 a 70C, agitando de vez en cuando. Posteriormente enfriarlo, por ejemplo mediante agua corriente. 4.4.2.4. Aadir 10 ml de Etanol 96% v/v PA (punto 4.3.2.) y mezclar los lquidos suave, pero totalmente, en el tubo de extraccin. Enfriar, convenientemente, si es necesario, el tubo bajo el agua corriente. 4.4.2.5. Aadir 25 ml de Eter Dietlico (punto 4.3.3.). Cerrar el tubo, agitar enrgicamente invirtiendo varias veces durante un minuto. 4.4.2.6. Retirar el tapn con precaucin y aadir 25 ml de Eter de Petrleo (punto 4.3.4.) utili-

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zando los primeros ml para enjuagar el tapn y el interior del cuello del tubo y dejando que se deslicen los lquidos de enjuague al interior del aparato. Cerrar el tubo volviendo a colocar el tapn, agitar e invertir varias veces durante treinta segundos. Si no se prev centrifugado durante la operacin indicada en el punto 4.4.2.7., no agitar demasiado enrgicamente. 4.4.2.7. Dejar reposar el tubo hasta que la capa lquida superior quede transparente y se separe ntidamente de la fase acuosa. Se puede realizar tambin la separacin con ayuda de una centrfuga adecuada (punto 4.2.7.). Nota.- Si se utiliza una centrfuga cuyo motor no es trifsico pueden producirse chispas y por ello habr que estar atento para evitar una explosin o un incendio como consecuencia de la presencia de vapores de ter (en caso de ruptura de un tubo, por ejemplo). 4.4.2.8. Retirar el tapn y enjuagarlo, as como el interior del cuello del tubo con unos ml de mezcla de solventes (punto 4.3.5.) y dejar que los lquidos del enjuague se deslicen al interior del tubo. Trasvasar con mucho cuidado, lo ms completamente posible, la capa superior al matraz (punto 4.4.2.1.) mediante decantacin o con ayuda de un sifn (punto 4.2.6.). Nota.- Si el trasvase no se realiza con ayuda de un sifn, puede ser que necesitemos aadir un poco de agua para elevar el nivel de separacin de las dos capas con el fin de facilitar la decantacin. 4.4.2.9. Enjuagar el interior y el exterior del cuello del tubo o la punta y la parte inferior del sifn con unos ml de la mezcla de disolventes. Dejar que los lquidos del enjuague del exterior del tubo se deslicen al interior del matraz y que los del interior del cuello y del sifn se deslicen al interior del tubo de extraccin. 4.4.2.10. Proceder a una segunda extraccin repitiendo las operaciones descritas en los puntos 4.4.2.5. a 4.4.2.9. incluido, pero utilizando nicamente 15 ml de Eter Dietlico y 15 ml de Eter de Petrleo. 4.4.2.11. Efectuar una tercera extraccin procediendo tal como se indica en el punto 4.4.2.10, pero sin realizar el enjuague final (punto 4.4.2.9.). Nota.- En el caso de la leche desnatada en polvo no es necesario realizar la tercera extraccin. 4.4.2.12. Eliminar con cuidado por evaporacin o destilacin el mximo de disolvente (incluido el Etanol). Si el frasco fuera de pequea capacidad habr que eliminar un poco de disolvente de la manera anteriormente indicada tras cada extraccin. 4.4.2.13. Cuando ya no exista olor alguno de disolvente, calentar el matraz, inclinado, durante una hora, en la estufa. 4.4.2.14. Retirar el matraz de la estufa, dejar

enfriar hasta que adquiera la temperatura ambiente y pesar con precisin de 0,1 mg. 4.4.2.15. Repetir las operaciones de los puntos 4.4.2.13. y 4.4.2.14. calentando a intervalos de treinta a sesenta minutos hasta que dos pesadas no difieran en ms de 0,5 mg o que aumente la masa. En el punto 4.5. utilizar la pesada tomando el valor ms bajo (M1). 4.4.2.16. Aadir de 15 a 25 ml de Eter de Petrleo para verificar si la materia extrada es totalmente soluble. Calentar ligeramente y agitar el disolvente mediante un movimiento circular hasta que se disuelva toda la materia grasa. 4.4.2.16.1. Si la materia extrada es totalmente soluble en Eter de Petrleo, la masa de materia grasa es la diferencia entre la pesada del punto 4.4.2.1. y la pesada del punto 4.4.2.15. 4.4.2.16.2. Si aparecieran materias insolubles o siempre en caso de duda, extraer completamente la materia grasa contenida en los matraces mediante repetidos lavados con Eter de Petrleo caliente, dejando que la materia no disuelta se deposite antes de cada decantacin. Enjuagar tres veces el exterior del cuello del matraz. Calentar el matraz, inclinado, durante una hora en la estufa y dejar enfriar tal como se indic anteriormente (punto 4.4.2.1.) hasta que adquiera la temperatura ambiente; pesar con una precisin de 0,1 mg. La masa de la materia grasa es la diferencia entre la pesada del punto 4.4.2.15. y esta pesada final. 4.5. Clculos La masa expresada en gramos de la materia grasa extrada viene dada por la siguiente frmula: (M1-M2) - (B1 - B2) y el contenido en materia grasa de la muestra, expresado en porcentaje, por la frmula: (M1 - M2) - (B1 - B2) x 100 S en donde: M1 = masa, en gramos, del matraz M conteniendo la materia grasa tras la operacin del punto 4.4.2.15. M2 = masa, en gramos, del matraz M tras la operacin del punto 4.4.2.1. o, en caso de que aparezcan materias insolubles o en caso de duda, tras la operacin del punto 4.4.2.16.2. B1 = masa, en gramos, del matraz B de la prueba en blanco tras la operacin del punto 4.4.2.15. B2 = masa, en gramos, del matraz B, tras la operacin del punto 4.4.2.1. o, en el caso de que aparezcan materias insolubles o en caso de duda, tras la operacin del punto 4.4.2.16.2. S = masa, en gramos, de la muestra utilizada.

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La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultneamente o inmediatamente una despus de la otra por el mismo analista sobre la misma muestra y en las mismas condiciones, no ha de exceder 0,2 g de materia grasa por 100 g de producto, salvo en el caso de la leche desnatada en polvo, en donde la diferencia no ha de exceder 0,1 g de materia grasa por 100 g de producto. 3.6. Referencias Primera Directiva de la Comisin de 13 de Noviembre de 1979 (79/1067/CEE); "Diario Oficial de las Comunidades Europeas" nmero L 327/29, de 24 de Diciembre de 1979. METODO 5: SACAROSA (Mtodo polarimtrico) 5.1. Principio. El contenido en sacarosa de los distintos tipos de leche condensada es el determinado por el mtodo que se describe a continuacin. El mtodo se basa en el principio de inversin de Clerget: un tratamiento suave con un cido hidroliza completamente la sacarosa. La lactosa y los restantes azcares no son prcticamente hidrolizados. El contenido en sacarosa se deduce del cambio de poder rotatorio de la solucin. Para ellos se prepara un filtrado lmpido de solucin de muestra, sin mutarrotacin debida a la lactosa, por tratamiento con amonaco seguido de neutralizacin y posterior clarificacin mediante adiciones consecutivas de soluciones de acetato de cinc y Potasio Hexacianoferrato II. En una parte del lquido filtrado la sacarosa se hidroliza en condiciones determinadas. Partiendo de los poderes rotatorios del lquido filtrado antes y despus de la inversin, se calcula el contenido en sacarosa aplicando las frmulas que se indican. Este mtodo permite determinar el contenido en sacarosa de los siguientes tipos de leche: -Leche condensada o leche entera condensada. -Leche condensada semidesnatada. -Leche condensada desnatada. Las muestras no han de contener azcar invertido. 5.2. Material y aparatos. 5.2.1. Balanza analtica, sensibilidad 10 mg. 5.2.2. Tubo de polarmetro de 2 dm de longitud, calibrado exactamente. 5.2.3. Polarmetro o sacarmetro. 5.2.3.1. Polarmetro con luz de sodio o luz verde mercurio (lmpara de vapor de mercurio con prisma o pantalla Wraten especial, nmero 77 A), que permita lecturas con una precisin, como mnimo, igual a 0,05 grados de ngulo. 5.2.3.2. Sacarmetro con escala internacional, que utilice luz blanca que pase a travs de un filtro de 15 mm de solucin al 6% de Potasio Dicromato o bien luz de sodio, y que permita la lectura de una precisin, como mnimo, igual a 0,1 grados de la escala sacarimtrica internacional. 5.2.4. Bao de agua a una temperatura de 60 1C. 5.3. Reactivos. 131008 Acido Actico glacial PA-ACS 182119 Acido Actico 2 mol/l (2N) SV 131019 Acido Clorhdrico 35% PA-ISO 131074 Agua PA-ACS 131120 Amonaco 25% (en NH3) PA 171167 Azul de Bromotimol RE 131085 Etanol 96% v/v PA 131505 Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS 131775 Zinc Acetato 2-hidrato PA 5.3.1. Solucin de Zinc Acetato 1M: Disolver 21,9 g de Zinc Acetato 2-hidrato PA, [Zn(C2H3O2)22H2O] y 3 ml de Acido Actico glacial PA-ACS en Agua PA-ACS y completar hasta 100 ml. 5.3.2. Solucin de Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato 0,25M: Disolver 10,6 g de Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS [K4(Fe(CN)6)3H2O] en Agua PA-ACS y completar hasta 100 ml. 5.3.3. Solucin de Acido Clorhdrico 6,35 0,20M (20 a 22%) o 5,0 0,2M (16 a 18%). Usese Acido Clorhdrico 35% PA-ISO y diluir convenientemente. 5.3.4. Solucin diluida de Amonio Hidrxido 2,0 0,2M (3,5%). Usese Amonaco 25% (en NH3) PA y diluir convenientemente. 5.3.5. Solucin de Acido Actico 2 mol/l (2N) SV 2,0 0,2M (12%). 5.3.6. Indicador Azul de Bromotimol RE, solucin al 1% (m/v) en 131085 Etanol 96% v/v PA. 5.4. Procedimiento. 5.4.1. Comprobacin del mtodo: Para comprobar el mtodo, los reactivos y los aparatos, realizar dos determinaciones aplicando el mtodo descrito en 5.4.2. a mezclas de 100 g de leche y 18 g de sacarosa pura, o bien de 110 g de leche descremada y 18 g de sacarosa pura, equivalentes a 40 g de leche condensada conteniendo 45% de sacarosa. Calcular el contenido de sacarosa como se indica en el apartado 5.5. utilizando, en la frmula 1, para M, F y P la cantidad de leche pesada y los porcentajes respectivos de materia grasa y protenas de esta leche, y, en la frmula 2, para M, la cifra de 40 g. La media de los dos resultados obtenidos no debe diferir del valor citado (45%) en ms de 0,2%.

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5.4.2. Determinacin. En un vaso de vidrio, pesar exactamente, con aproximacin de 10 mg, unos 40 g de la muestra convenientemente mezclada. Aadir 50 ml de agua caliente (80 a 90C) y mezclar cuidadosamente. Trasvasar cuantitativamente la mezcla a un matraz aforado de 200 ml, enjuagar el vaso con sucesivas cantidades de agua a 60C hasta que el volumen total sea de 120 a 150 ml. Mezclar y dejar enfriar a temperatura ambiente. Aadir 5 ml de la solucin de Amonaco diluida (5.3.4.). Mezclar de nuevo y dejar reposar durante quince minutos. Neutralizar el amonaco aadiendo una cantidad equivalente de la solucin diluida de Acido Actico (5.3.5.). Determinar previamente el volumen exacto necesario mediante valoracin de solucin de Amonaco diluida utilizando Azul de Bromotimol como indicador (5.3.6.). Mezclar a continuacin. Aadir, mezclando suavemente por rotacin del matraz inclinado, 12,5 ml de solucin de Zinc Acetato (5.3.1.). De la misma manera que para la solucin de Acetato, aadir 12,5 ml de solucin de Potasio Hexacianoferrato II (5.3.2.). Llevar el contenido del matraz a 20C y aadir agua (a 20C) hasta el enrase. Hasta este momento, todas las adiciones de agua o de reactivos debern haberse realizado evitando que se formen burbujas y, por esta razn, todas las mezclas se habrn efectuado mediante rotacin del matraz en vez de por agitacin violenta. Si se observa la presencia de burbujas antes de enrasar a 200 ml, pueden ser eliminadas conectando el matraz con una bomba de vaco e imprimindole un movimiento de rotacin. Tapar el matraz con un tapn seco y mezclar ntimamente por agitacin intensa. Dejar reposar durante unos minutos, y a continuacin filtrar a travs del papel de filtro seco. Desechar los 25 primeros mililitros del lquido filtrado. 5.4.2.1. Polarizacin directa: Determinar la rotacin ptica del lquido filtrado a 20 1C. 5.4.2.2. Inversin: Pipetear en un matraz aforado de 50 ml, 40 ml del lquido filtrado obtenido de la manera indicada anteriormente. Aadir 6,0 ml de Acido Clorhdrico 6,35 M o 7,6 ml de Acido Clorhdrico 5,00M. Colocar el matraz en un bao de agua a 60C durante quince minutos, estando sumergido el matraz hasta el nacimiento del cuello. Mezclar por rotacin durante los cinco primeros minutos, durante los cuales el contenido deber haber alcanzado la temperatura del bao. Enfriar hasta 20C y enrasar con agua a 20C; mezclar y dejar reposar durante una hora a esta temperatura.

5.4.2.3. Polarizacin tras la inversin. Determinar el poder rotatorio de la solucin invertida a 20 0,2C (cuando la temperatura T del lquido contenido en el tubo de polarizacin difiera de 20C en ms de 0,2C durante la medicin, se ha de aplicar la correccin de temperatura indicada en los puntos 5.5.1. y 5.5.2. 5.5. Clculos. 5.5.1. Contenido en sacarosa: Calcular el contenido en sacarosa con ayuda de las siguientes frmulas: M I-V= (1,08 F+1,55 P) 100 D-1, 25 I V-v V 2-S= X X por 100 Q V LxM Siendo: S = Contenido en sacarosa. M = Masa de la muestra expresada en gramos. F = Porcentaje de materia grasa de la muestra. P = Porcentaje de protenas (Nx6,38) de la muestra. V = Volumen en mililitros de la solucin de la muestra antes de la filtracin. v = Correccin expresada en ml para el volumen del precipitado formado durante el proceso de clasificacin. D = Lectura polarimtrica directa (polarizacin antes de inversin). I = Lectura polarimtrica tras la inversin. L = Longitud en decmetros del tubo del polarmetro. Q = Factor de inversin cuyos valores se indican a continuacin. Si se pesan exactamente 40 grs. de leche condensada y se utiliza un polarmetro de luz de sodio, con escala en grados de ngulo y un tubo de polarmetro de 2 dm de longitud a 20,0 0,1C, se puede calcular el contenido en sacarosa de las leches condensadas normales (C=9) mediante la siguiente frmula: S = (D-1,25 I) (2,833 - 0,00612 F - 0,00878 P) Si se efecta la medicin de la polarizacin tras inversin a temperatura diferente de 20C, los valores que se obtengan habrn de multiplicarse por: [1+0,0037 (T - 20)] 5.5.2. Valores del factor de inversin Q: Las frmulas siguientes dan valores precisos

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de Q para diversas fuentes de luz con correcciones, dado el caso, para la concentracin y la temperatura: Luz de sodio y polarmetro con escala en grados de ngulo: Q = 0,8825 + 0,0006 (C-9)-0,0033(T-20) Luz verde de mercurio y polarmetro con escala en grados de ngulo: Q = 1,0392 + 0,0007 (C-9)-0,0039 (T-20) Luz blanca con filtro de dicromato y sacarmetro con escala sacarimtrica internacional: Q = 2,549 + 0,0017 (C-9)-0,0095 (T-20) En las frmulas anteriores: C = Porcentaje de azcares totales en la solucin invertida segn la lectura polarimtrica. T = Temperatura de la solucin invertida durante la lectura en el polarmetro. El porcentaje de azcares totales C en la solucin invertida puede calcularse a partir de la lectura directa y de la variacin posterior a la inversin segn el mtodo habitual, utilizando los valores usuales de rotacin especfica de la sacarosa, de la lactosa y del azcar invertido. La correccin 0,006 (C-9) etc., slo es exacta si C es aproximadamente igual a 9; dado que el caso de la leche condensada normal C es aproximadamente 9, se puede despreciar esta correccin. Variaciones de temperatura de 1C respecto a 20C influencian slo ligeramente la lectura directa. En cambio, en caso de existir variaciones de ms de 0,2C durante la lectura tras inversin, ser necesario proceder a una correccin, La correccin -0,0033 (T-20), etc., slo es exacta para temperaturas comprendidas entre 18 y 22C. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultnea o inmediatamente una despus de la otra por el mismo analista, sobre la misma muestra y en las mismas condiciones, no debe ser superior a 0,3 grs. de sacarosa por 100 grs. de leche condensada. 5.6. Referencia. Primera Directiva de la Comisin de 13 de Noviembre de 1979 (79/1067/CEE), "Diario Oficial de las Comunidades Europeas" nmero 327/29, de 24 de Diciembre de 1979. METODO 6: ACIDO LACTICO Y LACTATOS 6.1. Principio. Se define como contenido en cido lctico y lactatos de los distintos tipos de leche en polvo, el contenido en cido lctico y lactatos determinado por el mtodo especificado. El mtodo se basa en que previa eliminacin de la materia grasa, las protenas y la lactosa, el cido lctico y los lactatos se transforman en acetaldehdo que se determina colorimtricamente a 570 nm por reaccin con p-hidroxidifenilo. Aplicable a la determinacin de cido lctico y lactatos en los siguientes tipos de leche: -Leche en polvo rica en grasa o extragrasa. -Leche en polvo entera o leche entera en polvo. -Leche en polvo parcialmente desnatada o semidesnatada. -Leche en polvo desnatada o leche desnatada en polvo. 6.2. Material y aparatos. 6.2.1. Espectrofotmetro que permita la lectura a 570 nm. 6.2.2. Material de uso normal en laboratorios. 6.3. Reactivos 131058 Acido Sulfrico 96% PA-ISO 131074 Agua PA-ACS 142400 Calcio Hidrxido, polvo (USP) PRSCODEX 131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO p-Hidroxidifenilo Litio Lactato Sodio Hidrxido sol. 5% 6.3.1. Solucin de Cobre Sulfato. Disolver 250 g de Cobre II Sulfato 5-hidrato PAACS-ISO (CuSO4.5H2O) en Agua PA-ACS y diluir a 1.000 ml. 6.3.2. Suspensin de Calcio Hidrxido. Triturar 300 g de Calcio Hidrxido, polvo (USP) PRS-CODEX en un mortero con Agua PA-ACS utilizando un total de 900 ml. La suspensin se debe preparar poco antes de su utilizacin. 6.3.3. Solucin de Acido Sulfrico-Cobre Sulfato. Aadir 0,5 ml de solucin (6.3.1.) a 300 ml de Acido Sulfrico de concentracin 95,5-97%. En su defecto usar Acido Sulfrico 96% PA-ISO. 6.3.4. Solucin de p-Hidroxidifenilo. Disolver agitando y calentando ligeramente 0,75 g de p-Hidroxidifenilo (C6H5C6H4OH) en 5 ml de una solucin acuosa de Sodio Hidrxido al 5%. Diluir con Agua PA-ACS hasta 50 ml en un matraz aforado. Conservar la solucin en un frasco de vidrio topacio, al abrigo de la luz y en lugar fresco. No utilizar la solucin si cambia el color o se enturbia. El periodo mximo de conservacin es de setenta y dos horas. 6.3.5. Solucin patrn. Disolver poco antes de su empleo 0,1067 g de Litio Lactato (CH3CHOHCOOLi) en Agua PA-ACS y diluir hasta 1.000 ml 1 ml de esta solucin corresponde a 0,1 mg de Acido Lctico. 6.3.6. Leche reconstruida patrn. Analizar previamente varias muestras de leche en polvo de alta calidad. Para la preparacin de la curva de calibrado tomar la muestra que tenga menor contenido en

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Acido Lctico (menos de 30 mg de Acido Lctico por 100 g de materia seca desgrasada en cualquier caso). Seguir el procedimiento descrito en 6.4.2. 6.4. Procedimiento. 6.4.1. Prueba en blanco. Efectuar una prueba en blanco con 30 ml de Agua PA-ACS como muestra y siguiendo el procedimiento descrito en 6.4.2. Si el resultado de la prueba en blanco frente a agua sobrepasa el equivalente de 20 mg de Acido Lctico por 100 g de materia seca desgrasada, ser necesario comprobar los reactivos y sustituir los que se encuentren alterados. Llevar a cabo la prueba en blanco al mismo tiempo que el anlisis de las muestras. 6.4.2. Determinacin. 6.4.2.1. Determinar el porcentaje de materia seca desgrasada de la muestra (a) y pesar 1.000 g/a-10 con precisin de 0,1 g. Aadir esta cantidad de muestra a 100 ml de Agua PA-ACS y mezclar cuidadosamente. 6.4.2.2. Pipetear 5 ml de la solucin obtenida a un matraz aforado de 50 ml y diluir con agua hasta 30 ml aproximadamente. Aadir lentamente y agitando 5 ml de la solucin de Cobre Sulfato (6.3.1.) y dejar reposar diez minutos. Aadir lentamente y agitando 5 ml de la suspensin de Calcio Hidrxido (6.3.2.) y diluir a 50 ml con Agua PAACS. Agitar vigorosamente, dejar reposar diez minutos y filtrar, desechando las primeras gotas del filtrado. 6.4.2.3. Pipetear 1 ml del filtrado a un tubo de ensayo. Aadir 6 ml de la solucin de Acido Sulfrico-Cobre Sulfato (6.3.3.) y mezclar. Calentar en bao de agua hirviendo durante cinco minutos y enfriar hasta temperatura ambiente bajo corriente de agua. Aadir dos gotas de reactivo de p-hidroxidifenilo (6.3.4.) y agitar vigorosamente. Sumergir el tubo en bao de agua a 30 2C y mantenerlo durante quince minutos agitando de vez en cuando. Sumergir el tubo en bao de agua hirviendo durante noventa segundos y enfriar hasta temperatura ambiente bajo corriente de agua. 6.4.2.4. Medir la absorbancia a 570 nm con relacin a la prueba en blanco durante las tres horas siguientes. Si la absorbancia es superior a la del punto ms alto de la curva de calibrado, repetir la prueba utilizando una dilucin adecuada del filtrado obtenido en (6.4.2.2.). 6.4.3. Curva de calibrado. 6.4.3.1. Pipetear 5 ml de leche constituida (6.3.6.) en cinco matraces aforados de 50 ml. Aadir a cada uno de los matraces 0, 1, 2, 3 y 4 ml de la solucin patrn de lactato (6.3.5.) correspondientes a 0, 20, 40, 60 y 80 mg de Acido Lctico aadido por 100 g de materia seca desgrasada de leche en polvo. Diluir con agua hasta unos 30 ml y proceder segn lo establecido en los apartados 6.4.2.2. y 6.4.2.4.

6.4.3.2. Medir la absorbancia a 570 nm con relacin a la prueba en blanco. 6.4.3.3. Llevar las absorbancias a un diagrama en funcin de las cantidades aadidas de Acido Lctico, es decir, 0, 20, 40, 60 y 80 mg por 100 g de materia seca desgrasada. Ajustar la recta ms adecuada y preparar la curva de calibrado desplazando dicha recta paralela a s misma de manera que pase por el origen. 6.5. Clculos. A partir de la curva de calibrado, de la absorbancia medida en 6.4.2.4. y de la dilucin efectuada en 6.4.2.4., calcular la concentracin de Acido Lctico expresada en mg de Acido Lctico por 100 g de materia seca desgrasada. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultneamente o inmediatamente una despus de la otra por el mismo analista sobre la misma muestra, no podr ser superior a 8 mg de Acido Lctico por 100 g de materia seca desgrasada, en muestras con un contenido en Acido Lctico de hasta 80 mg. Para valores superiores dicha diferencia no podr ser superior al 10% del valor ms bajo. 6.6. Referencia. Primera Directiva de la Comisin de 13 de Noviembre de 1979 (79/1.067/CEE), "Diario Oficial de las Comunidades Europeas" nmero L 327/29, de 24 de Diciembre. METODO 7: ACTIVIDAD DE LA FOSFATASA (Mtodo de Sanders y Sager, modificado) 7.1. Principio. La actividad de la fosfatasa de la leche en polvo viene dada por la cantidad de fosfatasa alcalina presente. Se expresa por la cantidad de fenol liberado en microgramos por ml de leche reconstituida, determinada por el procedimiento que se indica a continuacin. La actividad de la fosfatasa de la leche en polvo se determina por el poder de la fosfatasa de liberar el fenol de fenilfosfato disdico. Se mide la cantidad de fenol liberado en las condiciones prescritas, por la medida espectrofotomtrica de la coloracin, desarrollada con el reactivo de Gibbs. El mtodo permite determinar la actividad de la fosfatasa en los siguientes tipos de leche: -Leche en polvo rica en grasa o extragrasa. -Leche en polvo entera o leche entera en polvo. -Leche en polvo parcialmente desnatada o semidesnatada. -Leche en polvo desnatada o leche desnatada en polvo.

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7.2. Material y aparatos 7.2.1. Balanza analtica. 7.2.2. Bao de agua con termostato a 37C 1C. 7.2.3. Espectrofotmetro que permita la lectura a longitud de onda de 610 nm. 7.2.4. Papel de filtro (Shcleicher y Schull 597, Whatman 42 o similar). 7.2.5. Bao de agua hirviendo. 7.2.6. Hoja de aluminio. 7.3. Reactivos. 131015 Acido Brico PA-ACS-ISO 131074 Agua PA-ACS 131188 Bario Hidrxido 8-hidrato PA 131082 1-Butanol PA 131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO Dibromo-2, 6 Quinona Cloro-1,4 Imida 131085 Etanol 96% v/v PA 141322 Fenol (USP, BP, F, Eur.) PRS-CODEX Sodio meta-Borato 131659 Sodio Cloruro PA-ACS-ISO 171674 di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato RE 131787 Zinc Sulfato 7-hidrato PA 7.3.1. Solucin A Tampn de Borato y de Bario Hidrxido: pH 10,6 0,1 a 20C. Disolver 25 g de Bario Hidrxido 8-hidrato PA (Ba (OH)2.8H2O) en Agua PA-ACS y diluir hasta 500 ml. Disolver 11 g de Acido Brico PA-ACS-ISO (H3BO3) en Agua PA-ACS y diluir hasta 500 ml. Calentar las dos soluciones a una temperatura de 50C y mezclar. Agitar y enfriar la mezcla a temperatura ambiente. Ajustar el pH a 10,6 0,1 con la solucin de Bario Hidrxido y filtrar. Conservar la solucin en recipiente bien cerrado. Antes de su uso, diluir la solucin tampn con la misma cantidad de agua. 7.3.2. Solucin B. Tampn para el desarrollo del color. Disolver 6 g de Socio meta-Borato (NaBO2) (o 12,6 g de NaBO2.4H2O) y 20 g de Sodio Cloruro PA-ACSISO (NaCl) en Agua PA-ACS y diluir hasta 1.000 ml. 7.3.3. Solucin C. Sustrato tamponado. 7.3.3.1. Disolver 0,5 g de di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato RE (Na2C6H3PO4.2H2O) en 4,5 ml de solucin B (7.3.2.). Aadir dos gotas de solucin E (7.3.5.) y dejar reposar durante 30 minutos. Extraer el color formado con 2,5 ml de 1-Butanol PA (7.3.10.) Si fuese necesario, repetir la extraccin del color. Tras separacin, tirar el 1-Butanol. Esta solucin puede conservarse algunos das en refrigerador. Desarrollar y extraer el color, una vez ms antes de su empleo. 7.3.3.2. Pipetear 1 ml de esta solucin en un matraz aforado de 100 ml y aadir la solucin A (7.3.1.) hasta el enrase. Preparar el sustrato tamponado inmediatamente antes de su uso. 7.3.4. Solucin D. Precipitarse. Disolver 3 g de Zinc Sulfato 7-hidrato PA (ZnSO4.7H2O) y 0,6 g de Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO (CuSO5.5H2O) en Agua PA-ACS y llevar a 100 ml. 7.3.5. Solucin E. Reactivo de Gibbs. Disolver 0,040 g de Dibromo 2,6 Quinona Cloro 1,4 Imida (C6H2Br2C1NO) en 10 ml de Etanol 96% v/v PA. Conservar la solucin en frasco de topacio en refrigerador. Desechar el reactivo cuando cambie de color. 7.3.6. Tampn de dilucin de la coloracin. Diluir 10 ml de solucin tampn B para desarrollo del color (7.3.2.) con Agua PA-ACS y completar hasta 100 ml. 7.3.7. Solucin de Cobre Sulfato Disolver 0,05 g de Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO (CuSO4.5H2O) en Agua PA-ACS y completar a 100 ml. 7.3.8. Solucin patrn de Fenol. Disolver 0,200 0,001 g de Fenol (USP, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX en Agua PA-ACS y llevar a 100 ml en matraz aforado. Esta solucin puede conservarse durante algunos meses en refrigerador. Diluir 10 ml de esta solucin hasta 100 ml con agua. Esta solucin diluida contiene 200 mg de Fenol (USP, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX por ml y puede utilizarse para preparar soluciones ms diluidas. 7.3.9. Agua PA-ACS, hervida. 7.3.10. 1-Butanol PA. 7.4. Procedimiento. 7.4.1. Precauciones a tomar. 7.4.1.1. Evitar la exposicin directa a la luz del sol. 7.4.1.2. Limpiar perfectamente todo el material de vidrio, tapones y material de trasvase. Se recomienda enjuagarlos y hervirlos con agua o tratarlos por vapor. 7.4.1.3. Evitar el empleo de material plstico (tapones por ejemplo que pudieran contener Fenol). 7.4.1.4. Evitar cuidadosamente todo indicio de saliva, puesto que sta contiene fosfatasa. 7.4.2. Preparacin de la muestra. 7.4.2.1. Disolver 10 g de la muestra, pesados con precisin de 0,1 g en 90 ml de Agua PA-ACS. La temperatura de disolucin del polvo no debe sobrepasar los 35C. 7.4.3. Determinacin. 7.4.3.1. Introducir en cada uno de los dos tubos de ensayo 1 ml de leche reconstituida preparada segn se indica en 7.4.2.1.

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7.4.3.2. Calentar uno de los tubos en agua hirviendo durante dos minutos. Cubrir el tubo y el bao de agua (7.2.5.) o, por ejemplo, un vaso de precipitados, con una hoja de aluminio (7.2.6.) para que se caliente todo el tubo. Enfriar en agua fra a temperatura ambiente. Este tuvo servir para la prueba en blanco. A partir de este punto, tratar los dos tubos de idntica manera. 7.4.3.3. Aadir 10 ml de la solucin C (7.3.3.) Mezclar y colocar los tubos en el bao de agua (7.2.2.) a 37C. 7.4.3.4. Incubar durante sesenta minutos en el bao de agua, agitando de vez en cuando. 7.4.3.5. Inmediatamente despus introducir los dos tubos en el bao de agua hirviendo y calentar durante dos minutos, y enfriar a temperatura ambiente con agua fra. 7.4.3.6. Aadir 1 ml de la solucin D (7.3.4.) mezclar y filtrar con papel de filtro seco; tirar las primeras porciones del filtrado hasta obtener un lquido ntido. 7.4.3.7. Introducir 5 ml de cada filtrado en tubos de ensayo, agregar 5 ml de solucin B (7.3.2.) y 0,1 ml de solucin E (7.3.5.). Mezclar. 7.4.3.8. Dejar que se desarrolle el color a temperatura ambiente y al abrigo de la luz solar durante treinta minutos. 7.4.3.9. Medir la absorbancia de la solucin de la muestra por referencia a la prueba en blanco a 610 nm. 7.4.3.10. Repetir la determinacin si la absorbancia de la solucin es superior a la de la solucin patrn de 20 microgramos de Fenol preparada segn el punto (7.5.). Si dicho lmite es sobrepasado, diluir un volumen conveniente de leche reconstituida, segn 7.4.2.1., con un volumen apropiado de esta misma leche cuidadosamente hervida, como se indica en 7.4.3.2., para inactivar la fosfatosa presente. 7.5. Preparacin de la curva patrn. 7.5.1. Pipetear en cuatro matraces de 100 ml, 1, 3, 5 y 10 ml de la solucin patrn diluida segn 7.3.8. y completar hasta enrase con agua; estas soluciones contienen respectivamente 2, 6, 10 y 20 microgramos de fenol por ml. 7.5.2. Pipetear 1 ml de cada solucin testigo (7.5.1.) en tubos de ensayo para obtener una serie de muestras conteniendo 0 (valor cero), 2, 6, 10 y 20 microgramos de Fenol. El blanco se obtiene pipeteando 1 ml de agua. 7.5.3. Pipetear sucesivamente en cada tubo de ensayo 1 ml de la solucin de Cobre II Sulfato (7.3.7.) 5 ml de solucin tampn coloreada (7.3.6.), 3 ml de agua, 0,1 ml de la solucin E (7.3.5.); mezclar. 7.5.4. Dejar reposar los tubos de ensayo a temperatura ambiente y al abrigo de la luz solar directa durante treinta minutos.

7.5.5. Medir la absorbancia del contenido de los tubos por referencia al valor cero, a 610 nm. 7.5.6. Establecer la curva patrn anotando los valores de las absorbancias en funcin de las cantidades de Fenol en microgramos, tal como se ha indicado en 7.5.2. 7.6. Clculos. Convertir la cifra obtenida en 7.4.3.9. en microgramos de Fenol con referencia a la curva patrn (P). Calcular la actividad de la fosfatasa expresada en microgramos de Fenol por ml de leche reconstituida, segn la frmula siguiente: Actividad de la fosfatasa = 2,4 x P Si hubiera sido necesario diluir segn 7.4.3.10., multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilucin. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultneamente o inmediatamente una despus de la otra, por el mismo analista y sobre la misma muestra, y en las mismas condiciones, no debe exceder de 2 microgramos de Fenol liberado por ml de leche reconstituida. 7.7. Referencias. Primera Directiva de la Comisin de 13 de Noviembre de 1979 (79/1.067/CEE), "Diario Oficial de las Comunidades Europeas" nmero L 327/29, de 24 de Diciembre. METODO 8: ACTIVIDAD DE LA FOSFATASA (Mtodo Aschaffenburg y Mullen) 8.1. Principio. La actividad de la fosfatasa de la leche en polvo se mide por la cantidad de fosfatasa alcalina activa presente en el producto. Se expresa por la cantidad de p-nitrofenol liberado en microgramos por ml de leche reconstituida, determinada por el procedimiento que se explica a continuacin. La muestra de leche reconstituida se diluye en substrato en solucin tampn (pH 10,2) y se incuba durante dos horas a una temperatura de 37C. Toda cantidad de fosfatasa alcalina presente en la muestra libera, en semejantes condiciones, p-nitrofenol derivado del p-nitrofenilfosfato disdico. El p-nitrofenol liberado se mide mediante comparacin directa con cristales de color patrones en un colormetro simple de luz reflejada. El presente mtodo permite determinar la actividad de la fosfatasa en los siguientes tipos de leche: -Leche en polvo rica en grasa o extragrasa. -Leche en polvo entera o leche entera en polvo. -Leche en polvo parcialmente desnatada o semidesnatada.

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-Leche en polvo desnatada o leche desnatada en polvo. 8.2. Material y aparatos. 8.2.1. Balanza analtica. 8.2.2. Bao de agua a 37C 1C, controlado por termostato. 8.2.3. Comparador colorimtrico, con disco especial conteniendo cristales de color patrones calibrados en microgramos de p-nitrofenol por ml de leche y dos clulas de 25 mm cada una. 7.3. Reactivos. 131074 Agua PA-ACS 131505 Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS 131648 Sodio Carbonato anhidro PA Sodio Nitrofenilfosfato 131638 Sodio Hidrgeno Carbonato PA 131788 Zinc Sulfato 1-hidrato PA 8.3.1. Solucin tampn de Sodio Carbonato y Sodio Hidrgeno Carbonato. Disolver 3,5 g de Sodio Carbonato anhidro PA y 1,5 g de Sodio Hidrgeno Carbonato PA en Agua PA-ACS y diluir hasta 1.000 ml en un matraz aforado. 8.3.2. Substrato en solucin tampn. Disolver 1,5 g de p-Nitrofenilfosfato disdico en la solucin tampn de Sodio Carbonato anhidro PA y de Sodio Hidrgeno Carbonato PA (8.3.1.) y diluir hasta 1.000 ml en un matraz aforado. Esta solucin se mantiene estable durante un mes en el refrigerador (<4C) pero habr que efectuar antes un test de control de color en las soluciones conservadas de esta forma (8.4.1.3.). 8.3.3. Precipitantes. 8.3.3.1. Zinc Sulfato. Disolver 30 g de Zinc Sulfato PA (ZnSO4) en Agua PA-ACS y completar hasta 100 ml en un matraz aforado. 8.3.3.2. Potasio Ferrocianuro en solucin. Disolver 17,2 g de Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS (K4Fe(CN)6.3H2O) en Agua PAACS y completar hasta 100 ml en un matraz aforado. 8.4. Procedimiento. 8.4.1. Precauciones a observar. 8.4.1.1. Tras su utilizacin, vaciar los tubos, enjuagarlos con agua, lavarlos con agua caliente con un detergente alcalino, enjuagarlos cuidadosamente luego con agua del grifo caliente y clara. Finalmente, enjuagarlos con agua; secarlos antes de su empleo. 8.4.1.2. Los tapones de los tubos de anlisis han de ser enjuagados cuidadosamente con agua del grifo caliente inmediatamente despus de su utilizacin; posteriormente hay que hervirlos en agua durante dos minutos. 8.4.1.3. El substrato en solucin tampn (8.4.2.) se puede conservar estable durante un mes, como mnimo, en el refrigerador a una temperatura de 4C. Toda inestabilidad se traduce por formacin de un color amarillo. Dado que la prueba siempre se lee con respecto a un control del producto hervido que contiene el mismo substrato en solucin tampn, se recomienda no utilizar este substrato cuando el color indique un exceso de 10 microgramos, efectundose la lectura en una clula de 25 mm en el colormetro y utilizando Agua PA-ACS en la otra clula de 25 mm. 8.4.1.4. Utilizar una pipeta para cada muestra y evitar la contaminacin por la saliva. 8.4.1.5. Evitar en todo momento la exposicin directa de la luz solar. 8.4.2. Preparacin de la muestra. Disolver 10 g de polvo en 90 ml de agua. La temperatura de disolucin no ha de exceder los 35C. 8.4.3. Determinacin. 8.4.3.1. Pipetear 15 ml de substrato en solucin tampn (8.3.2.) en un tubo de anlisis limpio y seco, luego 2 ml de la muestra de leche reconstituida (8.4.2.) a analizar. Cerrar el tubo con un tapn, mezclar dando vueltas al tubo y colocarlo en bao de agua a 37C (8.2.2.). 8.4.3.2. Colocar simultneamente en el bao de agua un tubo de control conteniendo 15 ml de substrato en solucin tampn y 2 ml de muestra de leche reconstituida hervida del mismo tipo que la del anlisis. 8.4.3.3. Sacar los dos tubos del bao de agua al cabo de dos horas, aadir 0,5 ml de precipitante de Zinc Sulfato (8.3.3.1.) poner de nuevo el tapn, agitar vigorosamente y dejar reposar durante tres minutos. Aadir 0,5 ml de precipitante de Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PAACS (8.3.3.2.); mezclar por completo y filtrar en papel plegado (8.4.2.); recoger el lquido filtrado ntido en el tubo de anlisis limpio. 8.4.3.4. Transvasar el lquido filtrado a una clula de 25 mm y comparar con respecto al lquido filtrado de la muestra de control hervida en el colormetro, utilizando el disco especial (8.3.2.). 8.5. Clculos. La lectura directa obtenida segn el punto (8.4.3.4.) se expresa en microgramos de p-Nitrofenol por ml de muestra o por ml de muestra de leche reconstituida. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultneamente o inmediatamente una despus de la otra, por el mismo analista sobre la misma muestra y en las mismas condiciones, ha de ser inferior a 2 micro-

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gramos de p-Nitrofenol liberado por ml de leche reconstituida. 8.6. Referencias. Primera Directiva de la Comisin de 13 de Noviembre de 1979 (79/1.067/CEE), "Diario Oficial de las Comunidades Europeas" nmero L 327/29 de 24 de Diciembre.

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Mantequilla

METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 21-7-1977, 22-7-1977, 30-8-1979, 30-10-1991) 0. TOMA DE MUESTRA (B.O.E. 5-1-1975, Anejo nico apartado 1) Obtencin a partir de una unidad (recipiente o paquete) de una parte (submuestra) que sea lo ms representativa posible de dicha unidad. 0.1. MATERIALES Podrn utilizarse los siguientes materiales: Sondas de acero inoxidable, con longitud suficiente para alcanzar diagonalmente la base del recipiente y con un dimetro igual o superior a 30 mm. Esptulas o cuchillos de acero inoxidable, para retirar parte de la muestra tomada con la sonda. Recipientes cilndricos de boca ancha, de vidrio o de acero inoxidable, esterilizables, de capacidad adecuada al tamao de la muestra a tomar y que cerrarn hermticamente. Todos los materiales utilizados debern estar secos y limpios, y no debern comunicar otros olores ni sabores extraos. Si la muestra se destina a anlisis microbiolgicos, el material se esterilizar por tratamiento con alcohol, seguido de flameado, o por inmersin en agua a + 100C, por lo menos treinta segundos, y se enfriarn a temperatura ambiente antes de su uso. 0.2. TECNICA Se tomar un nmero suficiente de muestras parciales para que el peso de la muestra sea, por lo menos, de 200 g. El nmero de muestras tomadas ser el que determina la legislacin vigente. Segn la forma y peso de la mantequilla, se aplicar una de las tcnicas siguientes: a) Mantequilla en bloques o recipientes autorizados de peso unitario superior a un kilogramo: Se harn dos sondajes de la mantequilla. Uno de stos, se obtendr introduciendo una sonda en diagonal a travs del bloque de mantequilla, desde una esquina de la extremidad abierta del recipiente. El segundo sondaje se obtendr introduciendo la sonda verticalmente desde un punto arbitrario de la superficie, hasta la base del recipiente. La muestra comprender porciones tomadas de diferentes puntos de los dos sondajes, para dar un peso total mnimo de 200 g. Los recipientes para las muestras no se llenarn menos de dos tercios ni ms de nueve dcimas de la capacidad. Inmediatamente despus de cerrados los recipientes que contienen la mantequilla, sern envueltos en papel y almacenados en sitio oscu-

ro. La mantequilla no estar en contacto ni con el papel ni con ninguna superficie absorbente de agua o grasa. b) Mantequilla en recipientes autorizados de peso unitario comprendido entre 0,25 kilogramos y un kilogramo: Dividir en cuatro partes aproximadamente iguales las unidades, y elegir como muestra dos partes opuestas o la fraccin correspondiente de dos partes opuestas para dar un peso mnimo de 200 g. Los recipientes para las muestras no se llenarn menos de dos tercios ni ms de nueve dcimas de su capacidad. Inmediatamente despus de cerrados sern envueltos en papel y almacenados en sitio oscuro. c) Mantequilla en recipientes autorizados de peso unitario inferior a 0,25 kilogramos: Se tomar como muestra el nmero de unidades enteras necesarias para conseguir un peso mnimo de la muestra de 200 g. El nmero de unidades enteras se tomarn con su envase y, en este caso, aparte de los recipientes autorizados, se podrn emplear bolsas de plstico protegidas por una bolsa de papel. Estas bolsas no se llenarn menos de dos tercios ni ms de nueve dcimas de su capacidad til. 0.3. CONSERVACION DE LAS MUESTRAS No se adicionarn conservadores de ningn tipo a las distintas muestras de mantequilla, que se almacenarn en cmara fra. Para anlisis microbiolgicos o examen organolptico, se conservarn las muestras a temperaturas comprendidas entre 0C y 5C. 0.4. TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS Las muestras sern transportadas al laboratorio lo ms rpidamente posible despus de la toma de muestras, a temperaturas inferiores a + 10C. Para anlisis microbiolgicos, las temperaturas no deben sobrepasar los + 5C. 0.5. PREPARACION DE LA MUESTRA PARA LAS DISTINTAS DETERMINACIONES En los apartados a) y b) del punto 0.2., se colocar el recipiente con la muestra al bao Mara, sin sobrepasar la temperatura de + 39C, hasta obtener una consistencia ptima y fluidez homognea. La emulsin queda intacta, pero fluida, notndose claramente el nivel. Sacar del bao Mara y dejar reposar hasta enfriamiento.

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1. INDICE DE ACIDEZ DE LA GRASA 1.1. Principio. El ndice de acidez de la materia grasa en la mantequilla es el nmero de mg de potasio hidrxido que se necesita para neutralizar 1 g de materia grasa. La materia grasa, despus de separarla por fusin de la mantequilla, se disuelve en una mezcla de alcohol-ter, y luego se titula con una solucin alcalina valorada. 1.2. Material y aparatos. 1.2.1. Balanza analtica. 1.2.2. Matraces erlenmeyer de 300 ml. 1.2.3. Bureta graduada contrastada en divisiones de 0,1 ml. 1.3. Reactivos. Los reactivos que se utilicen deben ser de calidad pura para anlisis. 131086 131085 131091 131313 Etanol absoluto PA Etanol 96% v/v PA Metanol PA-ACS-ISO Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS 131325 Fenolftalena PA-ACS 182146 Potasio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) etanlica SV 1.3.1. Potasio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) etanlica SV. 1.3.2. Mezcla de volmenes iguales de Etanol 96% v/v PA y de Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS. 1.3.3. Solucin neutra de Fenolftalena PA-ACS al 1% (m/v) en Etanol 96% v/v PA desnaturalizado con Metanol PA-ACS-ISO. NOTA: Alcohol desnaturalizado con Metanol PA-ACS-ISO: 100 partes Etanol absoluto PA y 5 Metanol PA-ACS-ISO. 1.4. Procedimiento. Para separar la materia grasa, fundir la muestra, dejarla reposar a 50-60 2 o 3 horas, decantar y filtrar con papel de filtro seco. Filtrar nuevamente si el primer filtro no est claro. Utilizar la materia grasa fundida, clarificada, bien mezclada. En un matraz erlenmeyer pesar con precisin de 1 miligramo 5-10 g de materia grasa. Aadir 50-100 ml de la mezcla de Etanol 96% v/v PA y Eter Dietlico est. con ~ 6 ppm de BHT y disolver en esta mezcla la materia grasa. Aadir 0,1 ml de la solucin de Fenolftalena PA-ACS. Valorar con la solucin alcalina hasta que aparezca una coloracin rosa plido que persista al menos 10 segundos. 1.5. Clculo. V t 56,1 Indice de acidez = A V = volumen, en ml, de la solucin alcalina empleada. t = normalidad de la solucin alcalina. A = masa, en gramos, de la porcin ensayada. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas no debe ser mayor de 0,1 mg de potasio hidrxido por 1 g de materia grasa. 1.6. Referencia. 1.6.1. Norma FIL-IDF - G A - 1969.

2. INDICE DE REFRACCION DE LA GRASA 2.1. Principio. El ndice de refraccin de la materia grasa en la mantequilla es la razn entre la velocidad de una luz de longitud de onda determinada (luz de sodio) en el aire y la velocidad de esta misma luz en la materia grasa de la mantequilla a 40C. Mediante un refractmetro apropiado se determina el ndice de refraccin de la materia grasa obtenida por fusin de la mantequilla. 2.2. Material y aparatos. 2.2.1. Refractmetro provisto de escala graduada en ndices de refraccin, que permita efectuar lecturas hasta la tercera cifra decimal y cuyos prismas pueden calentarse mediante un lquido circulante, regulndose la temperatura termostticamente con una aproximacin de 0,1C. 2.2.2. Luz de sodio. Se puede utilizar tambin la luz blanca si el refractmetro tiene un dispositivo de compensacin cromtica. 2.3. Procedimiento. Para separar la materia grasa, fundir la muestra y dejarla reposar 2 o 3 horas a 50-60C; decantar y filtrar con papel de filtro seco. Filtrar nuevamente si el primer filtrado no est claro. Utilizar la materia grasa fundida, clarificada, bien mezclada sin agua. Preparar y regular el refractmetro segn el modo de empleo del aparato. Ajustar la temperatura del lquido circulante a 40 0,1C. Colocar algunas gotas de materia grasa, preparada en la forma anteriormente descrita, entre los prismas del refractmetro, de manera que se llene por completo el espacio comprendido entre ellos. Dejar transcurrir algunos minutos para que la materia grasa alcance la temperatura de los prismas. Efectuar la lectura con cuatro cifras decimales. Corregir el ndice de refraccin obtenido

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aadiendo 0,000045 unidad de ndice de acidez si ste ltimo (determinado segn 1) es igual o superior a dos. Redondear la cuarta cifra decimal. 2.4. Clculo. La diferencia entre los resultados de determinaciones paralelas no debe ser mayor de 0,0002 de la unidad de ndice de refraccin. 2.5. Referencia. 2.5.1. F.A.O. - B-5 - 1967. 3. SODIO CLORURO 3.1. Principio. Se entiende por contenido de sal (sodio cloruro) de la mantequilla el porcentaje en masa de la sal (sodio cloruro) determinado por el procedimiento que se describe a continuacin. Despus de fundir la mantequilla aadiendo agua hirviendo, los cloruros de las mezclas se valoran con una solucin de plata nitrato, empleando potasio cromato como indicador, segn el procedimiento de Mohr, y se calcula el contenido de sal. 3.2. Material y aparatos. 3.2.1. Balanza analtica. 3.2.2. Matraces erlenmeyer de 250 ml de capacidad. 3.2.3. Bureta graduada y contrastada en divisiones de 0,1 mililitros. 3.3. Reactivos. 131074 Agua PA-ACS 181464 Plata Nitrato 0,1 mol/l (0,1N) SV 171498 Potasio Cromato solucin 5% p/v RE 3.3.1. Plata Nitrato 0,1 mol/l (0,1N) SV. 3.3.2. Potasio Cromato solucin 5% p/v RE. 3.4. Procedimiento. Ablandar la muestra en un recipiente cerrado, calentndola en bao de agua a la temperatura ms baja posible, con objeto de no romper la emulsin. Frecuentemente es adecuada una temperatura comprendida entre 23 y 28C y en ningn caso la temperatura podr exceder de 39C. Agitar el recipiente que contiene la muestra a intervalos frecuentes durante el proceso de ablandamiento con objeto de que la muestra se mezcle homogneamente. Sacar el recipiente del bao de agua y agitarlo vigorosamente a intervalos frecuentes hasta que la muestra se haya enfriado adquiriendo una consistencia espesa y cremosa. Esta operacin puede realizarse con un agitador mecnico. Efectuar una determinacin en blanco, empleando los mismos reactivos, en las mismas can-

tidades y siguiendo el mismo procedimiento que se describe a continuacin. Pesar con una precisin de 10 mg, 5 mg de muestra e introducirla en un matraz erlenmeyer. Aadir cuidadosamente 100 ml de Agua PAACS hirviendo. Dejar en reposo durante 5-10 minutos, agitando por rotacin de (temperatura de valoracin). Aadir 2 ml de solucin de Potasio Cromato. Mezclar agitando por rotacin. Mientras se agita continuamente, valorar con la solucin de Plata Nitrato 0,1 mol/l (0,1N) SV hasta que el cambio de color anaranjado pardo persista durante 30 segundos. 3.5. Clculo. El contenido de sal (expresado en porcentaje por masa de NaCI) es: 5,85 t (v1 - ve) a t = normalidad de la solucin de plata nitrato. v1 = volumen, en ml, de solucin de plata nitrato, utilizados en la valoracin. ve = volumen, en ml, de solucin de plata nitrato en el ensayo en blanco. a = masa, en gramos, de la muestra utilizada. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas no deber ser mayor de 0,02 g de sodio cloruro por 100 g de producto. 3.6. Referencia. 3.6.1. Norma FIL-12A - 1969. 4. AGUA, EXTRACTO SECO MAGRO Y GRASA EN UNA SOLA MUESTRA 4.1. Principio. Se define el contenido de agua en la mantequilla como la prdida de masa, expresado como porcentaje, en masa, segn se determina por el procedimiento descrito. Se define el contenido de extracto seco magro en la mantequilla como el porcentaje, en masa, de sustancias, segn se determina. Se define el contenido de materia grasa en la mantequilla como el porcentaje, en masa, que se obtiene restando de 100 el contenido de agua y el del extracto seco magro. El contenido de agua se determina gravimtricamente secando una cantidad conocida de mantequilla a 102 2C. El contenido de extracto seco magro se determina gravimtricamente despus de extraer con ter de petrleo la grasa de la mantequilla secada. 4.2. Material y aparatos. 4.2.1. Balanza analtica con una tolerancia de 0,1 mg.

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4.2.2. Estufa de desecacin bien ventilada y controlada con termostato, ajustada para que funcione a una temperatura de 102 2C. 4.2.3. Cpsulas metlicas, de porcelana o de vidrio, resistentes a la corrosin, que tengan por lo menos 25 mm de altura y 50 mm de dimetro. 4.2.4. Crisoles filtrantes de vidrio sintetizado (porosidad nmero 3) con matraces de filtracin a la trompa. 4.2.5. Varilla con pieza final de material adecuado. 4.3. Reactivos. Eter de Petrleo con lmites de ebullicin entre 30 y 60C. En su defecto usar 131315 Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO. Este reactivo no debe dejar ningn residuo por evaporacin. 4.4. Procedimiento. 4.4.1. Preparacin de la muestra.- Excepto cuando el mezclado no se considere necesario, la muestra debe mezclarse agitando con una varilla o con un agitador mecnico, lo ms rpidamente posible, sin exceder de 1 minuto. La temperatura del mezclado deber estar comprendida normalmente entre 23C y 28C, pero en ningn caso deber exceder de 35C. Antes de pesar, la muestra deber ponerse siempre a la temperatura ambiente. 4.4.2. Determinacin de agua.- Secar la cpsula en la estufa hasta masa constante. Dejar enfriar la cpsula en desecador hasta la temperatura ambiente (30-35 min.) y pesar. Pesar en la cpsula, de 5 a 10 g de la muestra de mantequilla. Mantener la cpsula en la estufa durante una hora, por lo menos. Dejar que se enfre la cpsula en desecador a la temperatura ambiente (de 30-35 min.) y pesar. Repetir el secado a intervalos de media hora hasta masa constante (variacin igual o inferior a 0,5 miligramos). Todas las pesadas se harn con una precisin de 0,1 miligramo. En el caso de que aumente la masa, se toma la masa mnima para el clculo. No deben emplearse en esta determinacin materiales absorbentes. 4.4.3. Determinacin del extracto seco magro.Secar el crisol de vidrio filtrante en la estufa hasta masa constante. Dejar enfriar el crisol a temperatura ambiente (30-35 min.) y pesar. Aadir de 10 a 15 ml de Eter de Petrleo caliente a la cpsula, que contiene el extracto seco procedente de la determinacin de agua, de manera que se disuelva la grasa. Separar la mayor cantidad posible del sedimento adherido a la cpsula utilizando una varilla y pasar cuantitativamente la solucin sobre la punta de la varilla al crisol. Repetir las operaciones cinco veces. Lavar el sedimento que queda en el crisol con 25 ml de Eter de Petrleo caliente. Secar la cpsula y el crisol en la estufa durante 2 horas. Dejar que la cpsula y el crisol se enfren a la temperatura ambiente (30-35 min.) y pesar. Repetir las operaciones durante periodos de 30 minutos a la temperatura de secado hasta que la masa no disminuya ms. Todas las pesadas se harn con una precisin de 0,1 mg. 4.5. Clculo. 4.5.1. Mtodo de clculo de contenido de agua.- Emplear la frmula: M-n agua % = x 100 M Siendo: M = masa, en gramos, de la muestra. n = masa, en gramos, de la muestra despus de secar. 4.5.2. Mtodo de clculo del extracto seco magro.- Emplear la frmula: (A2 - A1) + (B2 - B1) x 100 Extracto seco magro = M Siendo: A1 = masa, en gramos, del crisol vaco. A2 = masa, en gramos, del crisol conteniendo sedimento. B1 = masa, en gramos, de la cpsula vaca. B2 = masa, en gramos, de la cpsula con sedimento residual. M = masa, en gramos, de la muestra. 4.5.3. Mtodo de clculo del contenido de grasa. Grasa % = 100 - (E + S) E = porcentaje, en masa, de agua (calculada en 4.5.1.). S = porcentaje, en masa, de extracto seco magro (calculado en 4.5.2.). Para la determinacin del contenido de agua, la diferencia entre el resultado de determinaciones paralelas no deber exceder de 0,1 g de agua para 100 g de mantequilla. Para la determinacin del contenido de extracto seco magro, diferencia entre resultados de determinaciones paralelas no deber exceder de 0,05 g de extracto seco magro para 100 g de mantequilla.

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5. DETECCION DE GRASA VEGETAL EN GRASA DE LECHE POR CROMATOGRAFIA DE GASES DE ESTEROLES 5.1. Principio. Los digitnidos de esterol se disuelven en una mezcla de formamida y N,N-dimetilformamida, y los esteroles liberados se extraen con n-pentano, y se separan por cromatografa de gases. Si se obtiene en el cromatograma un pico con el tiempo de retencin del beta-sitosterol, se concluye la presencia de grasa vegetal en la muestra de grasa examinada. 5.2. Material y aparatos. 5.2.1. Cromatgrafo de gases, equipado de un detector de ionizacin de llama, con un inyector de plata o de vidrio con un sistema de inyeccin directa en la columna y con un registrador. 5.2.2. Columna de cromatografa de gases, de vidrio o de acero inoxidable, en forma de U o en espiral, de 1 o 2 m de longitud, dimetro interior de 3-4 mm. Se recomienda el vidrio, pues algunos tipos de acero inoxidable dan resultados errneos por alteracin de los esteroles. 5.2.3. Microjeringa, capaz de proporcionar dosis de 5 o 10 microlitros. 5.3. Reactivos. 131074 Agua PA-ACS 251274 Colesterol DC Digitonina solucin alcohlica 1% 131785 N, N-Dimetilformamida PA 131085 Etanol 96% v/v PA 132770 Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS Fitosterol de Aceite de Colza Fitosterol de Aceite de Soja 141956 Formamida PRS 132006 n-Pentano PA 131515 Potasio Hidrxido 85% lentejas PA 5.3.1. Mezcla de volmenes iguales de Formamida PRS y N,N-Dimetilformamida PA. 5.3.2. n-Pentano PA. 5.3.3. Relleno de la columna: fase estacionaria de goma de silicona (tipo metlico), estable hasta por lo menos 300C que impregna en m2 a 4%, una tierra de diatomeas calcinada, lavada al cido y silanizada, de granulometra 80/100 o 100/120 de malla. 5.3.4. Solucin para el ensayo de sensibilidad: 1 mg de Colesterol DC de 1 ml de n-Pentano PA, recientemente preparado a partir de la grasa de leche, como se describe en 5.4.2. 5.3.5. Solucin para el ensayo de resolucin de los picos: 0,9 mg de Fitosterol de Aceite de Colza y 0,1 mg de Colesterol DC en 1 ml de n-Pentano PA. Los esteroles deben estar recientemente

preparados segn el procedimiento descrito en 5.4.2. 5.3.6. Solucin para el ensayo de referencia: 1 mg de Fitosterol de Aceite de Soja en 1 ml de nPentano PA recientemente preparado, segn se describe en 5.4.2. 5.3.7. Gas portador, nitrgeno. 5.3.8. Hidrgeno. 5.3.9. Oxgeno o aire. 5.4. Procedimiento. 5.4.1. Preparacin de la muestra.- Fundir aproximadamente 50 g de la muestra de mantequilla en una estufa corriente a temperatura inferior a 50C hasta separacin de las fases acuosa y grasa. Separar la capa grasa por decantacin y clarificar la grasa en una estufa a una temperatura de aproximadamente 40C filtrando sobre un papel de filtro seco y evitando que pase la fase acuosa sobre el filtro. 5.4.2. Preparacin de esteroles.- Pesar en un matraz erlenmeyer de 500 ml, aproximadamente 15 g de materia grasa con una precisin de 0,1 g. Aadir 10 ml de solucin de Potasio Hidrxido y 20 ml de Etanol 96% v/v PA. Colocar sobre el matraz erlenmeyer el refrigerante de aire, calentar en bao de agua hirviendo, agitando por rotacin, hasta que la solucin se haga clara, y continuar la ebullicin media hora ms. Aadir 60 ml de Agua PA-ACS y luego 180 ml de Etanol 96% v/v PA y llevar la temperatura a aproximadamente 40C. Aadir 30 ml de la solucin alcohlica de Digitonina (1%), agitar y dejar enfriar. Colocar el matraz en un refrigerante regulado a 5C, aproximadamente, durante 12 horas o una noche. Recoger el precipitado del digitnido de esterol por filtracin sobre un papel de filtro de velocidad media en un embudo Buchner (8 cm de dimetro). Lavar el precipitado con Agua PA-ACS aproximadamente a 5C hasta que el filtrado no forme espuma, luego lavar una vez con 25-50 ml de Etanol 96% v/v PA y despus una vez con 25-50 ml de Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS. Desecar el papel de filtro con el precipitado en un vidrio de reloj en estufa a 102 2C, durante 10 a 15 minutos. Separar el precipitado en forma de pelcula, plegando en dos partes el papel de filtro. Disolver en un pequeo tubo de ensayo, aproximadamente, 10 mg de digitnido de esterol en 0,5 ml de una mezcla de volmenes iguales de Formamida PRS y N,N-Dimetilformamida PA. Calentar ligeramente, si es necesario. Despus enfriar, aadir 2,5 ml de n-Pentano PA y agitar. Dejar reposar hasta que la separacin entre las capas sea neta y usar la capa superior, que contiene los esteroles liberados para el anlisis cromatogrfico.

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5.4.3. Condiciones de la cromatografa de gases.- Temperatura de la columna 220-250C. Temperatura del sistema de inyeccin, si puede calentarse por separado, 20-40C por encima de la temperatura de la columna. Gasto de nitrgeno 30/60 ml/min. Desconectar el detector y equilibrar las columnas nuevas en estas condiciones durante 16-24 horas. Conectar el detector, encender la llama y regular el gasto de hidrgeno y oxgeno o aire para obtener una altura de llama y una sensibilidad adecuada. Poner en marcha el registrador y dejar que el papel se desenrolle a una velocidad adecuada, ajustar el cero y el atenuador. Si la lnea de base es estable, el aparato est listo para usarse. 5.4.4. Ensayo de sensibilidad.- Inyectar 3 a 5 l de la solucin para el ensayo de sensibilidad (5.3.4.). Slo aparecer un pico de colesterol en el cromatograma (fig. 5.I.). Ajustar el atenuador de modo que se utilice aproximadamente toda la escala del registrador. 5.4.5. Ensayo de resolucin de los picos.- Inyectar 3 a 5 l de la solucin para el ensayo de resolucin de los picos (5.3.5.). Aparecern en el cromatograma los picos de colesterol, brasicosterol, camposterol) (fig. 5.II.). Medir las distancias de retencin (distancia desde el punto de inyeccin hasta el punto de altura mxima del pico) de los picos, dch para el colesterol, db para el brasicosterol, dc para el camposterol y el ds para el beta-sitosterol y las anchuras de la base de los picos (dimensin de retencin entre las intersecciones con la lnea de base de las tangentes en los puntos de inflexin situados en la parte anterior y posterior del pico) Wch para el colesterol y Wb para el brasicosterol. La resolucin de los picos, expresada por la frmula. PR = 2(db - dch) (Wb + Wch) debe ser por lo menos igual a 1. Calcular los tiempos de retencin relativos (colesterol 1,00) para el brasicosterol, el camposterol y el beta-sitosterol. 5.4.6. Ensayo de referencia.- Inyectar 3 a 5 l de la solucin para el ensayo de referencia (5.3.6.). Los picos de camposterol, estigmasterol y de beta-sitosterol deben aparecer sobre el cromatograma (fig. 5.III.). Medir las distancias de retencin de los picos, dc para el camposterol, dst para el estigmasterol y ds para el beta-sitosterol. Calcular los tiempos de retencin relativos, que son, aproximadamente: Colesterol ....... 1,00 (aproximadamente 15 min.) Brasicosterol... 1,13-1,15 Camposterol ... 1,32-1,34 Estigmasterol .. 1,44-1,46 Beta-sitosterol 1,66-1,68 5.4.7. Anlisis.- Inyectar 3 a 5 l de la solucin a analizar y dar al botn del atenuador hasta obtener un factor de atenuacin cuatro veces inferior

Fig. 5.I Esteroles de la materia grasa de la leche

Fig. 5.II Esteroles del aceite de colza adicionados de colesterol

(se obtiene generalmente en dos pases del botn). Registrar el cromatograma. 5.5. Clculo. Si en el cromatograma un pico tiene un tiempo de retencin relativo igual al de beta-sitosterol y una altura que corresponde al menos a un 2% de la escala, se concluye la presencia de beta-sitosterol y la muestra de grasa examinada, a partir de la cual se han aislado los esteroles, se considera que contiene grasa vegetal. La presencia en el

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6.2.8. Fotmetro con filtro de transmitancia mxima a 610 nm. 6.2.9. Centrfuga. 6.2.10. Pera de goma para pipetar. 6.3. Reactivos. 131015 Acido Brico PA-ACS-ISO 131074 Agua PA-ACS 131082 1-Butanol PA 131188 Bario Hidrxido 8-hidrato PA 131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACSISO 2, 6-Dibromoquinona Clorimida (BQC) 131086 Etanol absoluto PA 131322 Fenol PA-ACS Sodio meta-Borato 131659 Sodio Cloruro PA-ACS-ISO 171674 di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato RE 131788 Zinc Sulfato 1-hidrato PA 6.3.1. Tampn Bario Hidrxido-Borato: Disolver 18 g de Bario Hidrxido 8-hidrato PA y 8 g de Acido Brico PA-ACS-ISO en Agua PA-ACS y diluir a 1 litro con Agua PA-ACS. 6.3.2. Tampn de desarrollo de color: pH 9,8 0,15 a 25C. Disolver 6,0 g de Sodio meta-Borato (NaBO2) y 20 g de Sodio Cloruro PA-ACS-ISO en Agua PA-ACS y diluir a 1 litro con Agua PA-ACS. 6.3.3. Tampn de dilucin de color. Diluir 100 ml de tampn de desarrollo de color a 1 litro con Agua PA-ACS. 6.3.4. Sustrato tampn: Disolver 0,10 g de diSodio Fenilfosfato 2-hidrato RE cristalino libre de Fenol en 100 ml de tampn Bario Hidrxido-Borato (6.3.1.) (los cristales de di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato RE, deben guardarse en congelador o en desecador). Si di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato RE, no est libre de Fenol, purificarlo como sigue: Disolver 0,5 g con 4,5 ml de Agua PA-ACS, aadir 0,5 ml de tampn Bario Hidrxido-Borato (6.3.1.) y dos gotas del reactivo BQC (6.3.5.) y dejar reposar 30 minutos. Extraer el color con 2,5 ml de 1-Butanol PA (6.3.7.) y dejar reposar hasta que el alcohol se separe. Retirar el alcohol con un cuentagotas y desecharlo. Diluir 1,0 ml de la solucin acuosa a 100 ml de tampn Bario-Hidrxido Borato (6.3.1.). Calentar la solucin a 85C 2 minutos, tapar inmediatamente y conservar en refrigerador. La solucin es estable un ao si las porciones son recogidas con mnima exposicin a la atmsfera. 6.3.5. Solucin de 2,6-Dibromoquinona Clorimida (BQC) o reactivo de Gibbs: Disolver 40 mg BQC en polvo en 100 ml de Etanol absoluto PA o Metanol PA-ACS-ISO y pasarlo a un frasco cuentagotas oscuro. El reactivo permanece estable por lo menos un mes, si se guarda en congelador; no usarlo despus de que empiece a ponerse pardo. Guardar BQC en polvo en congelador o en desecador (nota: ha habido explosiones del reactivo

Fig. 5.III Esteroles del aceite de soja

cromatograma de picos de otros fitosteroles como el camposterol o el estigmasterol, refuerza esta conclusin. Por este mtodo se puede demostrar la presencia de al menos un 0,5% de beta-sitosterol en la mezcla de esteroles. El lmite de deteccin de la grasa vegetal en la grasa de leche no se puede indicar porque depende del contenido en beta-sitosterol de la grasa aadida, es decir, de la naturaleza de esta grasa o de la mezcla de grasas aadidas a la grasa de leche. 5.6. Referencia. 5.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 54: 1970. 6. FOSFATASA RESIDUAL EN MANTEQUILLA 6.1. Principio. El ensayo se basa en la accin del enzima fosfatasa sobre el substrato sodio fenilfosfato di-bsico, con liberacin del fenol y fosfato. La cantidad de fenol liberada se determina por adicin de un reactivo que da color azul en presencia de fenol. Cantidades superiores a dos equivalentes de fenol en 0,5 g de mantequilla indican una pasterizacin insuficiente.

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6.2. Material y aparatos. 6.2.1. Cuchillo o esptula de acero inoxidable. 6.2.2. Bao de agua a 37-38C. 6.2.3. Termmetro. 6.2.4. Pipetas de 1 ml. 6.2.5. Embudo de 5 cm de dimetro. 6.2.6. Papel Whatman nm. 42 o nm. 2. 6.2.7. Tubos graduados a 5 y 10 ml.

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BQC guardado en botella en la estantera de reactivos). Comprobar los nuevos lotes de BQC antes de usarlo, preparando una curva patrn con Fenol y comparando la curva obtenida con la de BQC que se sabe es satisfactorio. Repetir la prueba al menos semestralmente. 6.3.6. Solucin Cobre II Sulfato 5-hidrato PAACS-ISO para los patrones: Disolver 0,05 g Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO en Agua PA-ACS y diluir a 100 ml. 6.3.7. 1-Butanol PA: Usar 1-Butanol PA, punto de ebullicin 116-118C. Para ajustar el pH, mezclar 1 litro con 50 ml de tampn de desarrollo de color. Guardar en recipiente con tapn de vidrio. 6.3.8. Solucin patrn de Fenol: 6.3.8.1. Solucin madre: Pesar exactamente 1,000 g de Fenol PA-ACS puro, llevarlo a un matraz aforado de 1 litro, diluirlo con Agua PA-ACS hasta 1 litro y mezclar (1 ml = 1 mg de Fenol). La solucin es estable varios meses en refrigerador. 6.3.8.2. Patrones de trabajo: Diluir 10,0 ml de la solucin madre con Agua PA-ACS hasta 1 litro y mezclar (1 ml = 10/g, 0,00001 g o 10 unidades de Fenol). Usar esta solucin patrn para preparar soluciones patrn ms diluidas: p. e., diluir 5, 10, 30, 50 ml con Agua PA-ACS hasta 100 ml para preparar soluciones patrn, que contenga 0,5; 1,0; 3,0 y 5,0 g o unidades de Fenol/ml, respectivamente. Guardar estas soluciones patrn en refrigerador no ms de una semana. Anlogamente preparar, a partir de la solucin madre (6.3.8.1.), soluciones patrn que contengan 20, 30 y 40 unidades/ml. Medir las cantidades adecuadas de las soluciones patrn de trabajo en una serie de tubos (preferiblemente graduados a 5,0 y 10,0 ml) para conseguir un intervalo adecuado de patrones, segn se necesite, que contengan 0 (control o prueba en blanco), 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0 y 40,0 unidades. Para aumentar el brillo de las soluciones azules y mejorar la estabilidad de los patrones, aadir 1,0 ml de solucin de Cobre II Sulfato (6.3.6.) a cada tubo. Luego aadir 5,0 ml de tampn de solucin de color (6.3.3.) y diluir con 131074 Agua PA-ACS hasta 10,0 ml, aadir 4 gotas (0,08 ml) de la solucin BQC (6.3.5.), mezclar y dejar desarrollar el color azul 30 minutos a temperatura ambiente. Leer las intensidades de color en el fotmetro con filtro de 610 nm, restar el valor de la prueba en blanco del color de cada patrn de Fenol y preparar la curva patrn (debe ser una lnea recta). Si los patrones han de usarse para comparacin visual, guardar en refrigerador. Preparar semanalmente una serie nueva. 6.4. Procedimiento. Tomar la muestra por debajo de la superficie con cuchillo y esptula limpios y proceder como sigue: Pesar 1,0 g de muestra (preferiblemente por duplicado) sobre un pedazo de papel encerado de aproximadamente 1 pulgada cuadrada e introducir el papel con la muestra dentro del tubo. Anlogamente, pesar otra muestra y colocarla en un tubo como control o patrn. Calentar el patrn aproximadamente 1 minuto a 85-90 en vaso de agua hirviendo (cubierto as el tubo entero se calienta a 85-90) y se enfra a temperatura ambiente. A partir de este momento, tratar en la misma forma el patrn y el problema. Aadir 10,0 ml de sustrato patrn (6.3.4.). Tapar el tubo y mezclar. Inmediatamente despus de aadir el sustrato, incubar 1 hora en bao de agua a 37-38, mezclando o agitando el contenido de cuando en cuando. Calentar en vaso de agua hirviendo casi 1 minuto, calentando hasta 85-90 (utilizar termmetro en otro tubo del mismo tamao y forma que contenga el mismo volumen de lquido) y enfriar a temperatura ambiente en recipiente de agua fra. Pipetar en 1 ml de solucin de Zinc Sulfato de 6,0 g/100 ml y mezclar por completo (el pH de la mezcla debe ser de 9,0-9,1). Filtrar (se recomienda embudo de 5 cm y papel Whatman nmero 42 o nm. 2) y recoger 5,0 ml de filtrado en el tubo, preferentemente graduado a 5,0 y 10,0 ml. Aadir 5,0 ml de tampn de desarrollo de color (6.3.2.). El pH de la mezcla ha de ser 9,3-9,4. Aadir 4 gotas de la solucin BQC (6.3.5.) y dejar 30 minutos a temperatura ambiente para desarrollo de color (para detectar nicamente la pasterizacin, aadir solamente 2 gotas de solucin BQC). Determinar la intensidad del color azul por uno de los siguientes mtodos: a) Con fotmetro.- Leer intensidades de color de soluciones en blanco y problema (utilizando filtro con transmitancia mxima a aproximadamente 610 nm, restar la lectura de la prueba en blanco de la del problema, y expresar el resultado en equivalentes Fenol mediante referencias a la curva patrn obtenida con las correspondientes soluciones (6.3.8.2.). Generalmente es innecesaria la extraccin con 1-Butanol PA cuando se utiliza el fotmetro; si se hace la extraccin con 1-Butanol PA como en (b), centrifugar la muestra 5 minutos para romper la emulsin y separar el agua suspendida en la capa de alcohol (para esta finalidad puede adaptarse una centrfuga Babcock haciendo adaptadores especiales para tubos en la forma siguiente. Cortar una seccin de 1/4" de grueso de un tapn de goma de dimetro adecuado, que ajuste en el fondo del vaso de centrifugacin. Pegar dos tapones de corcho de dimetro adecuado, perforar en el centro un orificio de dimensiones adecuadas para alojar un tubo ajustadamente e introducir la seccin doble de corcho en

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el vaso. Despus de centrifugar, quitar casi todo el 1-Butanol PA con pipeta provista de pera de goma en el extremo superior. Filtrar dentro de la cubeta del fotmetro y leer con filtro cuyo mximo de transmitancias es aproximadamente de 650 nm). b) Con patrones visuales.- Con muestras que producen ms de 5 unidades, comparar colores en tubos con los de patrones de Fenol en solucin acuosa (6.3.8.2.). Para cuantificar resultados en los casos dudosos (p. ej., problemas que producen 0,5-5 unidades de color) extraer con 1-Butanol PA (6.3.7.). Aadir 5,0 ml de Alcohol (6.3.7.) e invertir el tubo lentamente varias veces; centrifugar como en (a) si es necesario incrementar la transparencia de la capa de alcohol, y comparar el color azul con los colores de los patrones de Fenol (6.3.8.2.), anlogamente tratados. En los problemas que se consideren muy positivos durante el desarrollo de color (p. ej., 20 unidades), en los que 4 gotas de solucin BQC (6.3.5.) pueden ser insuficientes para combinar con todo el Fenol, pipetar proporcin adecuada de contenidos dentro de otro tubo, diluir hasta 10,0 ml con tampn de dilucin de color (6.3.3.), y aadir 2 gotas adicionales de solucin BQC (6.3.5.). Con cada problema diluir y tratar la prueba en blanco anlogamente. Si la prueba sobre la muestra diluida es todava muy fuertemente positiva, diluir de nuevo en la misma forma hasta que el color final est dentro del intervalo de los patrones visuales o de la curva patrn del fotmetro. Dejar 30 minutos para el desarrollo de color despus de la ltima adicin de la solucin BQC (6.3.5.) antes de hacer la lectura final. Para corregir lecturas por dilucin, multiplicar por 2 para dilucin 5 + 5, por 10 para dilucin 1 + 9 y por 50 dilucin 1 + 9 seguida de dilucin 2 + 8, etc. 6.5. Clculo. Cuando se utilice 1,0 g de mantequilla y se aadan 11,0 ml de lquido, multiplicar el valor de la lectura por 1,1 para convertir el resultado en equivalentes de fenol/0,5 g de mantequilla (valores mayores de 2 equivalentes/0,5 g de mantequilla indican pasterizacin insuficiente). 6.6. Referencia. 6.6.1. A.O.A.C. Official Methods of Analysis, lla. Ed. (1970).

nmero de ml de una solucin acuosa de lcali 0,1N, requerido para neutralizar los cidos grasos voltiles solubles en agua de 5 g de grasa en las condiciones que se especifican. El ndice de cidos grasos voltiles insolubles (ndice de Polenske) es el nmero de ml de solucin acuosa de lcali 0,1N, requerido para neutralizar los cidos grasos voltiles insolubles en agua, obtenidos en 5 g de grasa, en las condiciones especificadas en el mtodo. Despus de saponificar la grasa con una solucin de sodio hidrxido en glicerina, la solucin jabonosa se diluye con agua y se acidifica con cido sulfrico. Los cidos grasos voltiles se destilan y los cidos grasos insolubles se separan de los solubles por filtracin. La solucin acuosa de cidos solubles y la solucin etanlica de cidos insolubles se valoran separadamente con una solucin de lcali normalizada. El mtodo es emprico porque slo determina una parte de estos cidos. Por tanto, las especificaciones referentes al procedimiento y aparatos se deben seguir rigurosamente para obtener resultados exactos y reproducibles.

APARATO DE DESTILACION

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7. INDICES DE ACIDOS GRASOS VOLATILES SOLUBLES E INSOLUBLES 7.1. Principio. El ndice de cidos grasos voltiles solubles (ndice de Reichert o Reichert-Meissl-Mellny) es el
Figura 7.I Determinacin de los ndices de Reichert y de Polenske

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7.2. Material y aparatos (figura 7.I). 7.2.1. Matraz de fondo plano de vidrio al borosilicato de 300 ml de capacidad (A). 7.2.2. Cabeza de destilacin (E). 7.2.3. Refrigerante (C). 7.2.4. Receptor, que consiste en un matraz aforado con las rayas circulares de aforo a 100 y 110 ml (D). 7.2.5. Lmina de asbesto de 120 mm de dimetro, 6 mm de espesor con una abertura central circular de 40 a 50 mm de dimetro, para sostener el matraz durante el calentamiento (E). 7.2.6. Piedra pmez triturada que pasa a travs de un tamiz de malla circular de 1,44 mm. En la figura se representan las dimensiones en mm y el montaje del aparato de destilacin; para las conexiones se puede utilizar tapones de caucho, neopreno o silicona, o juntas de vidrio esmerilado "estndar" 24/40. 7.3. Reactivos. 181059 Acido Sulfrico 0,5 mol/l (1N) SV 131074 Agua PA-ACS 131085 Etanol 96% v/v PA 171327 Fenolftalena solucin 1% RE 141339 Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRSCODEX 211456 Piedra Pomez grnulos QP 131687 Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO 181694 Sodio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) SV 7.3.1. Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRS-CODEX (d = 1,26; 98% p/p). 7.3.2. Solucin acuosa de Sodio Hidrxido (44% p/p). Usese Sodio Hidrxido lentejas PAACS-ISO y disolver convenientemente con Agua PA-ACS. Conservar en botella protegida del dixido de carbono. Usar la porcin limpia libre de precipitado de carbonatos. 7.3.3. Agua PA-ACS, hervida durante 15 minutos, para eliminar el dixido de carbono. 7.3.4. Solucin de Acido Sulfrico 0,5 mol/l (1N) SV. 7.3.5. Solucin acuosa de Sodio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) SV (o Potasio Hidrxido 0,1N), exactamente normalizada. 7.3.6. Solucin indicadora de Fenolftalena solucin 1% RE. 7.3.7. Etanol 96% v/v PA neutro a la Fenolftalena. El agua usada debe ser destilada o de una pureza por lo menos equivalente. 7.4. Procedimiento. 7.4.1. Preparacin de la muestra. Como en 5.4.1. 7.4.2. Determinacin del ndice de cidos grasos voltiles solubles: Pesar 5 g con aproximacin de 0,01 g de grasa en el matraz A. Aadir 20 g (16 ml) de Glicerina (USP, BP, F, Eur.) PRS-CODEX y 2 ml de solucin de Sodio Hidrxido (44%). Para aadir la solucin de Sodio Hidrxido, usar una bureta protegida de la entrada de dixido de carbono y limpiar la punta de la bureta desechando las primeras gotas. Calentar el matraz a fuego directo, evitando sobrecalentar y agitando continuamente hasta que el lquido no forme espuma y se vuelva lmpido. Dejar enfriar el matraz hasta 90C. Aadir 90 ml de Agua PA-ACS recientemente hervida a la misma temperatura aproximadamente y mezclar. El lquido debe quedar lmpido. Aadir de 0,6 a 0,7 g de Piedra Pmez QP y despus 50 ml de solucin de Acido Sulfrico 0,5 mol/l (1N) SV. Conectar inmediatamente el matraz al aparato de destilacin y calentarlo ligeramente hasta que los cidos grasos libres formen una capa superficial limpia. Empezar a calentar y regular la llama de modo que se recojan en el matraz aforado 110 ml de destilado en 19-21 minutos, tomando como principio del periodo de destilacin el momento en que se forma la primera gota en el refrigerante. Regular el flujo de agua del refrigerante de modo que se mantenga la temperatura del agua que sale del refrigerante a 20 1C. Cuando se hayan recogido exactamente 110 ml de destilado, quitar el mechero inmediatamente y sustituir el matraz aforado por un pequeo vaso. Mezclar el contenido del matraz aforado agitando suavemente y sumergir el matraz en un bao de agua a 20 1C durante 10-15 minutos, estando la seal de 110 ml del matraz aforado por debajo del nivel del agua del bao. Agitar el matraz de cuando en cuando. Tapar el matraz y mezclar invirtindolo 4 o 5 veces sin agitar. Filtrar los 110 ml de destilado por un papel filtro seco de velocidad media (dimetro 80-90 mm), que se ajusta cmodamente en un embudo. El filtrado debe ser lmpido (el filtro debe ser de tales dimensiones, que un volumen de 15 ml lo llene completamente). Pipetar 100 ml de filtrado y pasarlos a un matraz Erlenmeyer de 300 ml, aadir 0,5 ml de la solucin indicadora de Fenolftalena solucin 1% RE y valorar con la solucin acuosa de lcali "estndar" 0,1N hasta un color rosa persistente durante 0,5-1 minuto. 7.4.3. Ensayo en blanco: Hacer un ensayo en blanco sin grasa y en lugar de saponificar a fuego directo calentar en bao de agua hirviendo durante 15 minutos. No se requerirn para la valoracin ms de 0,5 ml de la solucin de lcali normalizada. En otro caso, se deben preparar nuevas soluciones del reactivo. 7.4.4. Determinacin del ndice de cidos grasos voltiles insolubles (Polenske): Lavar el filtro con tres porciones sucesivas de 15 ml de Agua PA-ACS a la temperatura de 20 1C, habiendo pasado previamente cada una a travs del refrigerante del vaso pequeo y del matraz aforado.

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Poner el embudo y el filtro en el cuello de un matraz cnico, limpio y seco, de 200 ml de capacidad. Disolver los cidos grasos insolubles repitiendo los lavados, usando ahora porciones de 15 ml de Etanol 96% v/v PA. Valorar con la solucin acuosa de lcali normalizada (0,1N) el conjunto de los lavados con Etanol 96% v/v PA usando 0,5 ml de solucin indicadora de Fenolftalena solucin 1% RE, hasta un color rosa persistente durante 0,5-1 minuto. 7.5. Clculo. 7.5.1. Indice de cidos grasos voltiles solubles (ndice de Reichert). Indice de Reichert = 11 . t . (V1 - b) Siendo: V1 = volumen en mililitros de la solucin normalizada (0,1N) de lcali, utilizados en la valoracin de la muestra. b = volumen en mililitros de la solucin normalizada (0,1N) de lcali, utilizados en el ensayo en blanco. t = normalidad exacta de la solucin normalizada (0,1N) de lcali. Redondear el resultado a la primera cifra decimal. 7.5.2. Indice de cidos grasos voltiles insolubles (ndice de Polenske). Indice de Polenske = 10 . t . V 2 Siendo: V2 = volumen en militros de la solucin normalizada (0,1N) de lcali utilizada en la valoracin de la muestra. t = normalidad exacta de la solucin normalizada (0,1N) de lcali. Redondear el resultado a la primera cifra decimal. 7.5.3. Reproduccin de resultados: La diferencia entre los resultados de dos determinaciones duplicadas (resultados obtenidos simultneamente o inmediatamente uno detrs de otro por el mismo analista) no debe exceder de 0,5 para el ndice de Reichert o de 0,3 para el ndice de Polenske. 7.6. Referencia. 7.6.1. Norma Internacional FIL-IDF 37: 1966.

141801 Plata Sulfato PRS 182415 Sodio Hidrxido 1 mol/l (1N) indicador: Fenolftalena SV 8.1. Mtodo operatorio. 1 Neutralizar 100 ml del destilado ReichertMeissl con solucin de Bario Hidrxido 0,1N, (preparada a partir de Bario Hidrxido 8-hidrato PA), con toda precisin hasta lograr un dbil color rosado empleando 0,5 ml del indicador. Realizar la titulacin en un matraz cerrado para evitar la absorcin de CO2. 2 Aadir 0,3 g de Plata Sulfato PRS en forma de polvo fino. Dejar reposar la mezcla una hora, agitando con frecuencia y filtrndola despus. 3 Recoger 100 ml del filtrado, colocarlo en un frasco de destilacin de 300 ml, aadir 35 ml de Agua PA-ACS y 10 ml de Acido Sulfrico diluido. Aadir un trozo de alambre de aluminio o varios trozos de Piedra Pmez para evitar que el lquido rebose. Unase al destilador y comincese la destilacin a la velocidad de 110 ml en unos 20 minutos. 4 Despus de recoger 110 ml del destilado, filtrar esta cantidad total y titular 100 ml con Sodio Hidrxido 1 mol/l (1N) indicador: Fenolftalena SV, empleando 0,5 ml de Fenolftalena solucin 1% RE hasta lograr un tono rosado que persista durante 2-3 minutos. 5 Preparar y realizar una prueba en blanco semejante a la anterior en todos sus aspectos. 8.2. Clculo.

A 121 (100 + B) Valor de Kirschner = 10.000 A = titulacin de la muestra - titulacin en blanco. B = volumen, en ml, de bario hidrxido 0,1N, requeridos para neutralizar los 100 ml originales del destilado de Reichert-Meissl. 8.3. Referencia. 8.3.1. Norma Internacional AOCS 5-40. 9. ACIDOS GRASOS DE CADENA CORTA 9.1. Principio. Obtencin de los steres metlicos de los cidos grasos mediante reaccin con una solucin de potasio hidrxido en alcohol metlico y subsiguiente inyeccin directamente de la disolucin de steres metlicos en el cromatgrafo. El mtodo es aplicable a las grasas de mantequillas u otras que contengan cidos grasos de

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8. INDICE DE KIRSCHNER Reactivos. 131058 Acido Sulfrico 96% PA-ISO 131074 Agua PA-ACS 131188 Bario Hidrxido 8-hidrato PA 171327 Fenolftalena solucin 1% RE

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longitud de cadena inferior al C 14 y siempre que el contenido de cidos libres no exceda de 1% expresados en cido oleico. 9.2. Material y aparatos 9.2.1. Matraces con boca esmerilada y fondo redondo de 50 y 100 ml de capacidad. 9.2.2. Pipetas aforadas de 1,2 y 10 ml. 9.2.3. Matraces aforados de 50 y 100 ml de capacidad. 9.2.4. Probeta graduada de 10 ml. 9.2.5. Jeringa de caractersticas adecuadas para la inyeccin de la muestra, graduada en dcimas de ml, con una capacidad total de 1 a 10 ml. 9.2.6. Cromatgrafo apto para trabajar en fase gaseosa, provisto de horno capaz de ser calentado hasta 250-300C y sistema de regulacin que permita controlar la temperatura con un error de 1,0C. Equipado con programador de temperatura capaz de llevar la temperatura del horno de 60C a 180C a una velocidad de 4C/min. Provisto de regulacin independiente de la temperatura del inyector, que podr ser calentado a una temperatura superior por lo menos en 50 a la mxima alcanzable por el horno provisto de un sistema de deteccin sensible, de ionizacin de llama de hidrgeno, que pueda ser mantenido a la temperatura de la columna, a unos 50C por encima de la del horno. 9.2.7. Registrador con una tensin de entrada adecuada a la salida del amplificador del cromatgrafo, con una velocidad de respuesta mnima capaz de producir la deflexin completa de la escala en un segundo; y una velocidad de desplazamiento del papel de 5 mm/min, que permita la posibilidad de variar esta velocidad, acelerando o retardando el desplazamiento. 9.2.8. Tubo de nitrgeno a presin, utilizable como gas portador, debiendo tener una riqueza mnima del 99,8%. 9.2.9. Tubos de hidrgeno y aire a presin necesarios para el caso en que se utilice detector de llama de hidrgeno. El hidrgeno deber tener una riqueza mnima del 99,8%, debiendo estar seco. Como medida de seguridad, es muy conveniente colocar a la entrada de los gases en el cromatgrafo, sendos tubos de desecacin, provistos de tamiz molecular 13X. 9.2.10. Columna cromatogrfica. 9.2.10.1. Columna que satisfaga las condiciones que se indican en 9.6.1. 9.2.10.2. Columna de vidrio con dimetro interior de 4 mm y una longitud aproximada de 2 mm. Rellenada con Chromosorb G, W o Q (80-100 mallas), conteniendo de 2,5 a 5 por 100 de un polister, recomendndose cualquiera de los tres siguientes: dietilenglicolsuccinato (DEGS); etilenglicolsuccinato o adipato (EGS o EGA); polietilenglicoladipato (PEGA). Antes de emplear una columna nueva en la resolucin de problemas analticos, debe ser acondicionada, eliminando todos aquellos productos voltiles que perturbaran la marcha de la cromatografa. Para ello, se monta en el cromatgrafo, sin conectarla al detector, y se calienta el horno a unos 10C por encima de la temperatura mxima a que vaya a ser utilizada la columna en trabajos posteriores; haciendo pasar al mismo tiempo, una corriente de nitrgeno de 30 a 40 ml/minuto, que se mantiene durante veinticuatro horas como mnimo. La columna ser apta para su utilizacin si, una vez conectada al detector y en funcionamiento normal, la lnea base dibujada por el registrador acusa la estabilidad del sistema. 9.3. Reactivos. 131091 Metanol PA-ACS-ISO 131315 Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO 132062 n-Heptano PA 131515 Potasio Hidrxido 85% lentejas PA 9.3.1. Metanol PA-ACS-ISO. 9.3.2. Potasio Hidrxido 85% lentejas PA. 9.3.3. Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO o n-Hexano PA. Eter de Petrleo (p. ej: 40-60C), cuyo contenido en Benceno no sea superior a 0,1%. n-Hexano, que cumpla las mismas especificaciones del Eter de Petrleo. 9.3.4. n-Heptano PA, con una riqueza mnima del 99%. 9.3.5. Disolucin de Potasio Hidrxido 2N en Metanol. Disolver 11,2 g de Potasio Hidrxido 85% lentejas PA en 100 ml de Metanol PA-ACSISO. 9.3.6. Esteres metlicos de pureza adecuada para su utilizacin como patrones en cromatografa gaseosa.- Se dispondr de los steres metlicos de los cidos mencionados a continuacin, debiendo tener una pureza mnima de 99%, determinada por cromatografa gaseosa: Acido butanoico (butrico). Acido pentanoico (valerinico). Acido hexanoico (caproico). Acido octanoico (caprlico). Acido decanoico (cprico). Acido dodecanoico (lurico). Acido tetradecanoico (mirstico). Acido hexadecanoico (palmtico). Acido octadecanoico (esterico). Acido 9-octadecanoico (oleico). Acido 9,12-octadecadienoico (linoleico). Acido sicosanoico (arquico). 9.3.7. Solucin de referencia I.- En un matraz aforado de 50 ml se pesa, con exactitud de 0,1 mg, 1 g de Metilo Pentanoato, disolvindolo en n-Heptano PA y completando hasta el enrase.

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9.3.8. Solucin de referencia II.- En un matraz aforado de 100 ml se pesa, con exactitud de 0,1 mg, 200 g de Metilo Pentanoato, disolvindolo en n-Heptano PA y completando hasta el enrase. 9.4. Procedimiento. 9.4.1. Preparacin de los steres metlicos. En un matraz de fondo redondo de 50 ml, pesar con exactitud de 0,1 mg, 1 g de grasa. Aadir 10 ml de Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO o n-Hexano PA y agitar suavemente hasta disolucin de la grasa. En el caso de que se quiera efectuar una determinacin cuantitativa de los Acidos Butrico y Caproico en la muestra, agregar a la disolucin en Eter de Petrleo de la grasa 1 ml, exactamente medido, de la solucin de referencia ms adecuada; para muestras conteniendo de 1-4% de Acido Butrico se utilizar la solucin de referencia I; para muestras conteniendo menos de 1% de Acido Butrico se utilizar la solucin de referencia II. Si se desea efectuar solamente un anlisis completo de la fraccin de cidos grasos, para lo que se aplica el mtodo de normalizacin interna, no ser necesario el empleo de solucin de referencia. A la solucin de Eter de Petrleo de la muestra, adicionada o no de solucin de referencia, agregar 0,5 ml de disolucin de Potasio Hidrxido 2N. Agitar suavemente la mezcla hasta que se ponga transparente, para lo cual son suficientes unos veinte a treinta segundos. Casi inmediatamente despus de observar la clarificacin de la solucin suele apreciarse un enturbiamiento debido a la separacin de glicerol, que se sedimenta rpidamente. Inmediatamente despus de terminada la reaccin y observada la sedimentacin, tomar la cantidad necesaria con la jeringa e inyectar en el cromatgrafo; una demora en la inyeccin de los steres metlicos dara lugar a la formacin de jabones, con error en la determinacin. 9.4.2. Determinacin cromatogrfica. 9.4.2.1. Condiciones de trabajo. Temperatura de la columna: Temperatura programada de 60C a 160C, con una velocidad de 4C/minuto. Temperatura de inyector: 200C. Temperatura del detector: 200C. Gas portador: Nitrgeno (o helio) con un flujo de 60 ml/min. Flujo de hidrgeno y aire para la alimentacin del detector: Los flujos dependern del tipo de detector utilizado, debiendo determinarse previamente para optimizar la respuesta. El registro obtenido del cromatograma debe satisfacer las condiciones que se indican a continuacin; caso contrario, se repite la inyeccin modificando la cantidad inyectada o la sensibili-

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dad de trabajo hasta obtener un cromatograma satisfactorio. Los requisitos exigibles son los siguientes: a) El rea total descrita en el registro, referida a la sensibilidad mxima utilizada en el curso de la operacin, debe ser de un orden aproximado de 2.000 mm2 con una velocidad del papel en el registrador de 5 mm/min. De esta forma, los componentes presentes en una cuanta del 0,1% deben dar un pico, como mnimo, de 2 mm 2, siendo, por tanto, perfectamente reconocibles. b) Con el fin de conseguir que todos los picos caigan dentro del papel registrador, se utilizar, en cada caso, la atenuacin de sensibilidad que sea necesaria, cuidando que el pico de mayor intensidad no sea atenuado ms de ocho veces. Una vez conseguido un registro satisfactorio, y habiendo alcanzado nuevamente la pluma la lnea base, se interrumpe el funcionamiento del registrador y se retira el papel con el registro para la identificacin de los picos y/o clculos cuantitativos. 9.4.2.2. Identificacin de los picos.- Se seguirn los criterios establecidos en el apartado 9.6.2. 9.4.2.3. Determinaciones cuantitativas.- La determinacin cuantitativa se basa en el principio de que los pesos de cada uno de los componentes separados en la mezcla son proporcionales a las reas comprendidas dentro de los tringulos dibujados debajo de cada pico. El rea de cada tringulo se obtiene trazando rectas tangentes a las lneas dibujadas en el registro, prolongndolas hasta su interseccin con la lnea base y multiplicando la altura del tringulo por la mitad de la base. En el caso de haber trabajado con atenuaciones diferentes para cada pico, se referirn todas las medidas a una misma sensibilidad del registrador, multiplicando la altura por el factor de atenuacin correspondiente en cada caso, y el valor de la altura as corregida por la mitad de la base. 9.4.3. Determinacin del contenido de los Acidos Butrico y Caproico en la materia grasa.- Esta determinacin se realiza por el mtodo del patrn interno, siendo el patrn elegido el metilo pentanoato. 9.4.3.1. Preparacin de la mezcla de calibracin. Con una exactitud de 0,1 mg y en un matraz aforado de 50 ml, pesar unos 100 mg de cada uno de los siguientes patrones: metilo butanoato, metilo pentanoato y metilo caproato. Se disuelve la mezcla de n-Heptano y se diluye completando hasta el enrase. Inyectar la cantidad necesaria de la solucin anterior, normalmente 0,2-0,4 l, para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar los mximos de los picos en una posicin del 70-80% del recorrido total de la pluma del registrador. Los tres picos debern registrarse a la misma sensibilidad. Si fuese necesario, se diluir

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la solucin anterior con n-Heptano en la relacin necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre s ms del 1%. 9.4.4. Anlisis cuantitativo de la totalidad de los componentes de la fraccin de cidos grasos, comprendiendo del C4 al C20 y C18:3. 9.4.4.1. Preparacin de la mezcla de calibracin.- Determinar previamente el factor de correccin para cada cido componente de la mezcla, referido a uno cualquiera de ellos que se toma como patrn, eligindose normalmente para este fin el Acido Palmtico, y, debiendo tener la mezcla de calibracin una composicin anloga a la de la mezcla problema. Para ello, si no se conoce previamente el orden de composicin del problema, se realizar una determinacin cromatogrfica de orientacin, realizndose en el registro la cuantificacin de los componentes suponiendo el mismo factor de respuesta para todos ellos, efectuando un reparto proporcional entre las reas medias. En un matraz aforado de 50 ml, pesar, con una exactitud de 0,1 mg, cantidades de los steres metlicos patrones que se indican a continuacin proporcionales a las cifras de composicin encontradas en el anlisis de orientacin anteriormente aludido, o previstas con anterioridad para la muestra. Los patrones que deben pesarse son los siguientes: metilo butanoato, metilo hexanoato, metilo octanoato, metilo decanoato, metilo dodecanoato, metilo tetradecanoato; metilo hexadecanoato, metilo octadecanoato, metilo oleato, metilo linoleato y metilo eicosanoato. Se disuelve la mezcla de n-Heptano agregando la cantidad adecuada de disolvente en relacin al peso total de steres metlicos que se hayan pesado; para unos 500 mg en total, se deben emplear, como orientacin, unos 50 ml de n-Heptano PA. A continuacin, inyectar 0,2-0,4 l para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar el mximo del pico correspondiente al componente mayoritario, en una posicin del 70-80% del recorrido total de la pluma del registrador. Todos los picos deben registrarse a la misma sensibilidad, lo cual suele ser perfectamente factible en la grasa de leche; en aquellos casos en que la relacin entre el pico mayoritario y el pico minoritario no permita registrar ste ltimo con las dimensiones adecuadas para efectuar una cuantificacin correcta de su rea, se podr efectuar el cambio necesario en la atenuacin del registro, procurando que sta no sobrepase la relacin de 4:1. Si fuese necesario, se diluir la solucin con n-Heptano en la relacin necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre s ms del 1%. 9.5. Clculo. 9.5.1. Clculo de los factores de correccin para los cidos butrico y caproico. Se determinan las reas de los tres picos, siguiendo las normas que se contienen en el apartado 5.4., y se calculan los dos factores correspondientes al C 4 y C6, con la frmula siguiente: x Ap fx = P Ax Siendo: f = factor de correccin del cido x. x = cantidad pesada del cido x. Ap = rea medida en el registro para el patrn de pentanoato. Ax = rea medida en el registro para el cido x. P = peso del patrn pentanoato. 9.5.2. Clculo del contenido de cidos.- Los contenidos de cido butrico y cido caproico en la muestra de grasa se calculan por la frmula siguiente: fx Ax P Porcentaje de cido = 100 Ap M fx = factor de correccin determinado para cada cido, segn se indica en el prrafo anterior. Ax = rea medida en el registro para el cido. P = peso del patrn interno (pentanoato). Ap = rea medida en registro para el patrn interno. M = peso de la muestra de grasa. 9.5.3. Clculo de los factores de correccin.Una vez determinadas las reas de todos los picos, siguiendo las normas que se contienen en el apartado 9.4.2.2., se calcula el factor de cada cido, referido al cido palmtico tomado como unidad, utilizando la frmula que se incluye en el apartado 9.5.1., sustituyendo el rea Ap y el paso P del compuesto patrn por los valores correspondientes al metilo palmitato. 9.5.4. Clculo de composicin de la fraccin de cidos grasos.- Se calcularn las reas corregidas de cada uno de los componentes de la fraccin multiplicando el rea medida en el registro por el factor de correccin determinado segn se indica en el apartado anterior. El contenido de cada componente vendr dado por la expresin:

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fx Ax Porcentaje X = 100 (fx Ax)

Siendo: fx = factor de correccin del componente x. Ax = rea medida en el registro para el componente x. (fx Ax) = suma de todas las reas corregidas correspondientes a los componentes de la fraccin. 9.6. Observaciones. 9.6.1. La puesta a punto de la columna se determina obteniendo la resolucin de dos productos crticos como son el metilo oleato y el estearato. La resolucin viene determinada por la expresin: 2D Resolucin = O+E Siendo: D = distancia entre los dos mximos de los picos del oleato y el estearato. O = ancho de la base del pico correspondiente al oleato. E = ancho de la base del pico correspondiente al estearato. Estos valores se determinan sobre el cromatograma obtenido con una muestra conteniendo cantidades aproximadamente iguales de metilo estearato y oleato, inyectando una cantidad tal que la altura de estos picos alcance al 25-50% del ancho del papel de registro. Si la resolucin calculada es igual o mayor que 1,0 la columna y el instrumento se encuentran en condiciones satisfactorias. Todas las columnas en el transcurso de su utilizacin sufren una prdida gradual en la resolucin de los picos; cuando el valor llegue a ser inferior a 1,0, deber instalarse una nueva columna. 9.6.2. Para la identificacin de los picos se pueden seguir dos criterios: 9.6.2.1. Criterio basado en los tiempos de retencin.- Refirindose exclusivamente a los cidos que entran normalmente en la composicin de las grasas naturales, sus steres aparecen en el cromatograma en orden creciente de sus tomos de carbono y a su insaturacin. Esto es, el palmtico (C16) aparece delante del estarico (C 18), y los steres en C18 aparecen en el orden estearato, oleato, linoleato y linolenato. El ster del cido arquico (C20:0), usualmente, aparece antes del linolnico (C18:3), pero puede ocurrir lo contrario en algunos casos, dependiendo del tipo de columna y de las condiciones de su utilizacin, o incluso superponerse el uno al otro. Operando en condiciones constantes, los tiempos de retencin son reproductibles en cada especie qumica, siendo el criterio ms frecuente empleado para su identificacin.

El tiempo de retencin viene dado por la distancia, medida en el cromatograma, entre el mximo del pico del aire y la posicin del mximo de la banda. Trabajando con detector de llama de hidrgeno, la salida del aire no se detecta, pudindose tomar, en este caso, el momento en que se inicia la salida del disolvente, acusada por una fuerte deflexin de la pluma del registrador. 9.6.2.2. Criterio basado en los tiempos de retencin relativos. Los tiempos de retencin relativos son ms reproductibles. Las retenciones relativas vienen determinadas por el cociente de dividir el tiempo de retencin de cada pico por el tiempo registrado para el pico del metilo palmitado, o bien por otro ster que se tome como comparacin, determinados todos ellos segn el criterio expuesto en el prrafo anterior. 9.7. Referencia. 9.7.1. Instituto de Racionalizacin y Normalizacin del Trabajo. Una Norma Espaola 55.118. 10. EXTRACCION DE LA GRASA EN MANTEQUILLA 10.1. Principio. Separacin de las fases acuosa y grasa mediante fusin, decantacin y filtracin. 10.2. Material y aparatos. 10.2.1. Estufa de desecacin. 10.3. Procedimiento. Tomar aproximadamente 50 g de la muestra de mantequilla en una cpsula de porcelana e introducirla en una estufa de desecacin a una temperatura entre 45C y 50C hasta separacin de las fases acuosa y grasa. Separar la capa grasa por decantacin y filtrar a travs de papel de filtro seco, evitando que pase la fase acuosa, manteniendo una temperatura de unos 40C. 10.4. Referencias. 1. Norma Internacional FIL-IDF 32: 1965.

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Queso

I ORDEN DE 29 DE NOVIEMBRE DE 1985 POR LA QUE SE APRUEBAN LAS NORMAS DE CALIDAD PARA QUESOS Y QUESOS FUNDIDOS DESTINADOS AL MERCADO INTERIOR (B.O.E. 6-12-1985). Excelentsimos seores: De conformidad con lo establecido en el Decreto 1043/1973, de 17 de mayo por la que se regula la normalizacin de productos ganaderos en el mercado interior, y teniendo en cuenta los Decretos de Presidencia del Gobierno 2481/1967, de 21 de septiembre, por el que se aprueba el texto del Cdigo Alimentario Espaol y el 2519/1974, de 9 de agosto, sobre su entrada en vigor, aplicacin y desarrollo, parece oportuno dictar las presentes Normas Generales de Calidad para Quesos y Quesos Fundidos. En su virtud, previo informe de la Comisin Interministerial para la Ordenacin Alimentaria, de conformidad con los acuerdos del FORPPA y a propuesta de los Ministros de Economa y Hacienda, de Agricultura, Pesca y Alimentacin y de Sanidad y Consumo, esta Presidencia del Gobierno dispone: Artculo nico: Se aprueban las Normas Generales de Calidad para Quesos y Quesos Fundidos con destino al mercado interior, que se recogen, respectivamente, en los anejos 1 y 2 de esta Orden. Disposicin final. La presente Orden entrar en vigor en todo el territorio del Estado espaol el 1 de enero de 1986. Disposiciones adicionales Primera.- Las determinaciones analticas se realizarn de acuerdo con los mtodos oficiales vigentes. Segunda.- Los Departamentos competentes velarn por el cumplimiento de lo dispuesto en la presente Orden a travs de sus rganos administrativos encargados, que coordinarn sus actuaciones; en todo caso, sin perjuicio de las competencias que correspondan a las Comunidades Autnomas y a las Corporaciones Locales. Disposicin derogatoria A la entrada en vigor de la presente Orden quedan derogadas cuantas disposiciones de igual o inferior rango se opongan a los aspectos que la misma regula y, de forma especfica, los incluidos en las siguientes disposiciones: Ordenes del Ministerio de Agricultura, de 27 de julio de 1970 ("Boletn Oficial del Estado" de 5 de agosto); de 9 de abril de 1975 ("Boletn Oficial del Estado" del 18); de 24 de noviembre de 1975 ("Boletn Oficial del Estado" de 2 de diciembre); de

22 de julio de 1977 ("Boletn Oficial del Estado" del 30); de 17 de abril de 1978 ("Boletn Oficial del Estado" del 27), y Resolucin de la Direccin General de Industrias Agrarias de 26 de octubre de 1977 ("Boletn Oficial del Estado" de 8 de noviembre). Lo que comunico a VV. EE. para su conocimiento y efectos. Madrid, 29 de noviembre de 1985. MOSCOSO
DEL

PRADO

MUOZ

Excmos. Sres. Ministros de Economa y Hacienda; de Agricultura, Pesca y Alimentacin, y de Sanidad y Consumo. ANEJO I Norma general de calidad para quesos con destino al mercado interior 1. NOMBRE DE LA NORMA Norma General de Calidad para Quesos. 2. OBJETO DE LA NORMA La presente norma tiene por objeto definir aquellas condiciones y caractersticas que deben reunir los quesos para su comercializacin y consumo en el mercado interior. 3. AMBITO DE APLICACION La presente norma general abarca a todos los quesos destinados a su comercializacin en el mercado interior. Podrn estipularse requisitos ms especficos en normas individuales o de grupo de quesos, en cuyo caso se aplicarn dichos requisitos a la variedad particular o grupo de quesos en cuestin, con independencia a lo establecido con carcter general por la presente disposicin. 4. DEFINICION Se entiende por queso el producto fresco o maduro, slido o semislido, obtenido por separacin del suero despus de la coagulacin de la leche natural, de la desnatada total o parcialmente, de la nata, del suero de mantequilla o de una mezcla de algunos o de todos estos productos por la accin del cuajo u otros coagulantes apropiados, con o sin hidrlisis previa de la lactosa. Asimismo, se entiende por queso el conseguido mediante tcnicas de elaboracin que comprendan la coagulacin de la leche y/o de mate-

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rias obtenidas de la leche y que den un producto final que posea las mismas caractersticas del producto definido en el prrafo anterior y siempre que la relacin entre la casena y las proteinas sricas sea igual o superior a la de la leche. 5. DENOMINACIONES 5.1. Todos los productos denominados "queso" o que utilicen el nombre de alguna variedad de queso debern ajustarse a las disposiciones de esta norma general. Los quesos que no tengan una denominacin concreta o aqullos que aun tenindola no estn protegidos por una norma individual de composicin y caractersticas especficas, que se fabriquen con leche de oveja, leche de cabra o con mezclas de ambas entre s y con la de vaca, debern incluir en su denominacin, despus de la palabra "queso" o del nombre de la variedad de que se trate, la indicacin de la especie o especies animales de las que proceda la leche empleada por orden descendente de proporciones, en caracteres claros y legibles, de las mismas dimensiones que las utilizadas en el resto de la denominacin. Para que un queso pueda ostentar una denominacin distinta habr de hacerlo al amparo de la correspondiente norma individual de calidad; tras su aprobacin y publicacin en el "Boletn Oficial del Estado". 5.2. Atendiendo a su maduracin, los quesos se denominarn de la siguiente forma: 5.2.1. Queso curado o madurado: Es el que, tras el proceso de fabricacin, requiere mantenerse durante cierto tiempo a una temperatura y en condiciones tales que se produzcan los cambios fsicos y/o qumicos necesarios y caractersticos del mismo. 5.2.2. Queso curado o madurado con mohos: Es aqul en el que el curado se ha producido principalmente como consecuencia del desarrollo caracterstico de mohos en su interior y/o sobre la superficie del mismo. 5.2.3. Queso fresco: Es el que est dispuesto para el consumo al finalizar el proceso de fabricacin. 5.2.4. Queso blanco pasterizado: Es aquel queso fresco en el que el cogulo obtenido se somete a un proceso de pasterizacin de "72C" durante diecisis segundos u otras combinaciones de temperatura y tiempo de efecto equivalente, quedando dispuesto para el consumo al finalizar su proceso de fabricacin. 5.3. De acuerdo con su contenido en grasa lctea, expresado en porcentaje masa/masa sobre el extracto seco lcteo, los quesos se denominarn: -Extragraso: El que contenga un mnimo de 60%. -Graso: El que contenga un mnimo del 25 y menos del 60%. -Semigraso: El que contenga un mnimo del 25 y menos del 45%. -Semidesnatado: El que contenga un mnimo del 10 y menos del 25%. -Desnatado: El que contenga menos del 10%. 6. FACTORES ESENCIALES DE COMPOSICION Y CALIDAD 6.1. Ingredientes esenciales. 6.1.1. Leche, leche desnatada total o parcialmente, nata, suero de mantequilla o una mezcla de algunos o de todos estos productos. 6.1.2. Otras materias obtenidas de la leche y que sean propias de su composicin. 6.1.3. Cuajo animal o vegetal. 6.2. Ingredientes facultativos. 6.2.1. Sodio cloruro, en dosis limitadas por la buena prctica de su fabricacin. 6.2.2. Sustancias aromticas naturales e idnticas naturales, especias, aderezos vegetales y otros ingredientes naturales que no procedan de la leche y se hallen autorizados en proporcin suficiente para caracterizar el producto, pero inferior al 30% en masa/masa expresado sobre el producto terminado, y que en la denominacin del producto se declare la presencia de la sustancia aadida, "queso con..." (aqu el nombre de dicha sustancia). 6.2.3. Sacarosa, dextrosa y glucosa, solas o en combinacin, exclusivamente en quesos frescos y quesos blancos pasterizados en dosis no superior al 17% masa/masa, quedando incluido este porcentaje en el indicado en el apartado 6.2.2. 6.2.4. Leche en polvo para el ajuste del extracto seco lcteo en porcentaje mximo del 5% masa/masa, sobre dicho extracto. 6.2.5. Gelatina, en cantidad mxima de 5 g/kg de queso y solamente en quesos frescos y quesos blancos pasterizados. Cuando adems de la gelatina se utilicen estabilizantes de los contenidos en el apartado 7.3.3., la cantidad mxima total ser de 5 g/kg de queso, sin que los estabilizantes sobrepasen las dosis fijadas en dicho apartado. 6.3. Caractersticas fsico-qumicas. Las caractersticas fsico-qumicas de la grasa estarn comprendidas entre los siguientes valores: a) Para queso de vaca: Indice de refraccin a 40C: De 1,4540 a 1,4557. Indice de Reichert: De 26 a 32. Indice de Polenske: De 1 a 4. Indice de Kirchner: De 19 a 27.

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b) Para queso de cabra: Indice de refraccin a 40C: De 1,4520 a 1,4545. Indice de Reichert: De 21 a 28. Indice de Polenske: De 5 a 9. Indice de Kirchner: De 14 a 21. c) Para queso de oveja: Indice de refraccin de 40C: De 1,4530 a 1,4557. Indice de Reichert: De 26 a 32. Indice de Polenske: De 5 a 8. Indice de Kirchner: De 19 a 27. En el caso de los quesos curados o maduros con mohos, estos ndices sern de aplicacin solamente durante las setenta y dos horas siguientes a la coagulacin. Para los quesos elaborados con leche de vaca, cabra y oveja, el lmite mnimo de colesterol, dentro de los esteroles, ser de un 98% sobre la fraccin esterlica del insaponificable determinados por cromatografa gaseosa. En todo caso la presencia de fitosteroles no deber considerarse aisladamente del conjunto de los ndices fsico-qumicos anteriormente expuestos. 8. NORMA MICROBIOLOGICA Y CONTAMINANTES 8.1. Norma microbiolgica para quesos frescos y blancos pasterizados. 8.1.1. Toma, transporte y conservacin de muestras. La toma de muestras de los quesos frescos y quesos blancos pasterizados se har por triplicado, segn la legislacin vigente y de acuerdo con los siguientes mtodos: a) Como norma general, se tomarn cinco unidades del mismo lote, para cada uno de los tres ejemplares de la muestra. Cada unidad estar constituida por un envase original e ntegro cuando su contenido neto sea inferior a un kilogramo, y por porciones de 300 gramos aproximadamente, recogidas con utensilios estriles en recipientes asimismo estriles para piezas con contenido neto igual o superior a un kilogramo. b) Excepcionalmente, en los supuestos en que no fuese posible tomar el nmero de muestras indicado en el apartado a), por falta de cantidad suficiente de un mismo lote, se tomar una unidad para cada ejemplar de muestra. En ambos casos, en el acta de toma de muestras, debern reflejarse las condiciones de conservacin y temperatura de la muestra, as como la fecha de caducidad o la de consumo preferente, debiendo reflejarse asimismo si la muestra ha sido tomada de un envase ntegro o de envases abiertos.

El transporte de muestras y su conservacin hasta el momento del anlisis se realizar a una temperatura no superior a 8C para que la muestra mantenga, en todo momento, las caractersticas adecuadas al objeto de no desvirtuar la finalidad de aqul. El anlisis de los tres ejemplares deber estar iniciado antes de la fecha de caducidad del producto o, en su caso, de la de consumo preferente del mismo. La porcin de la muestra que se tome para la prctica del anlisis deber ser representativa del conjunto de su respectiva unidad. 8.1.2. Tolerancias microbiolgicas. Las tolerancias sern las indicadas en el cuadro siguiente: n Enterobactericeas totales/g .................. E. coli/g ..................... Staph. aureus enterotoxignico/g ... Salmonella o c m M

5 5 5

2 2 1

1x103 1x104 1x102 1x103 1x102 1x103

Shigella/25 g ...........

n = nmero de unidades de muestra de un lote que se analizan segn el programa de muestreo establecido. c = nmero de muestras que pueden rebasar el lmite m sin ser superior al lmite M. m = lmite microbiolgico que nicamente c de las n muestras pueden sobrepasar. Se admite para este nivel una variabilidad: 3 m para medio slido. 10 m para medio lquido. M = nivel lmite de aceptabilidad. Los valores superiores a M no son aceptables. Los valores de M se fijan en: M = 10 m para medios slidos. M = 30 m para medios lquidos. Para las muestras tomadas segn el procedimiento b) del apartado 8.1.1. las tolerancias sern las indicadas a continuacin: Enterobactericeas totales/g............ E. coli/g........................................... Staph. aureus enterotoxignico/g..... Salmonella o Shigella/25 g............... 1x104 1x103 1x103 Ausencia

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8.2. Contaminantes. Las tolerancias de productos contaminantes y sustancias txicas no debern sobrepasar los lmites contenidos en la legislacin vigente y, en su defecto, en las normas internacionales aceptadas por el Estado espaol, que velar por su cumplimiento como garante de las mismas, con la determinacin y exigencia de responsabilidades en este punto por el rgano del Estado correspondiente. El contenido mximo en nisina procedente exclusivamente de cepas nisingenas ser de 100 mg/kg de queso. ANEJO 2 Norma General de Calidad para los Quesos Fundidos con destino al mercado interior 1. NOMBRE DE LA NORMA Norma General de Calidad para los Quesos Fundidos. 2. OBJETO DE LA NORMA La presente norma tiene por objeto definir aquellas condiciones y caractersticas que deben reunir los quesos fundidos para su comercializacin y consumo en el mercado interior. 3. AMBITO DE APLICACION La presente norma abarca a todos los quesos fundidos destinados a su comercializacin en el mercado interior. 4. DEFINICION Se entiende por queso fundido el producto obtenido por molturacin y/o mezcla, fusin y emulsin con tratamiento trmico de una o ms variedades de queso con o sin adicin de agentes emulgentes, de leche y productos lcteos y de otros productos alimenticios. 5. DENOMINACIONES En las denominaciones utilizadas para designar los distintos quesos fundidos se cumplirn las condiciones que se fijan a continuacin, en el bien entendido que en todos los apartados de este punto la expresin "extracto seco total" se refiere al producto terminado, descontando los ingredientes contemplados en 6.2.3. 5.1. De acuerdo con su contenido en grasa lctica, expresado en porcentaje en masa/masa sobre el extracto seco total, los quesos fundidos se denominarn como sigue: -Extragraso: El que contenga un mnimo del 60%. -Graso: El que contenga un mnimo del 45 y menos del 60%. -Semigraso: El que contenga un mnimo del 25 y menos del 45%. -Semidesnatado: El que contenga un mnimo del 10 y menos del 25%. -Desnatado: El que contenga menos del 10%. 5.2. Cuando el producto contenga el mnimo del 50% masa/masa de extracto seco total, la denominacin ser "queso fundido..." seguido del calificativo que le corresponda, segn la clasificacin del apartado 5.1. 5.3. Si dichas denominaciones se contemplan con la expresin "para untar" o "para extender", el extracto seco total ser como mnimo del 40% masa/masa e inferior al 50% masa/masa sobre el producto terminado en origen. El mnimo del extracto seco total ser del 25% masa/masa e inferior al 40% masa/masa en origen, si en la denominacin se incluye la expresin "queso blanco fundido... para untar" o "queso blando fundido... para extender". 5.4. El queso fundido, cuya denominacin incluya el nombre de una o ms variedades de queso, se designar de una de las siguientes formas: "queso(s)... y ... fundido(s)" o "queso(s) fundido(s) de... y..." y en su elaboracin no podrn emplearse otra u otras variedades de queso ms que las especificadas, debiendo contener un mnimo del 50% masa/masa de extracto seco total. En el caso que en la denominacin figuren nombres de variedades de quesos, se indicarn todas ellas por orden decreciente de proporciones, y la menor no deber ser inferior a un 10% masa/masa del queso utilizado como materia prima. Si dichas denominaciones se contemplan con las expresiones "para untar" o "para extender", el extracto seco total deber ser, como mnimo, del 40% masa/masa e inferior al 50% masa/masa. En el caso que se completen con las de "blando fundido... para untar" o "blando fundido... para extender", el extracto seco total deber ser, como mnimo, del 25% masa/masa e inferior al 40% masa/masa. En todos los casos, la materia grasa se ajustar a las exigencias del apartado 5.1. de esta norma.

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6. FACTORES ESENCIALES DE COMPOSICION Y CALIDAD 6.1. Ingredientes esenciales: Queso. 6.2. Ingredientes facultativos: 6.2.1. Nata, mantequilla y grasa de mantequilla deshidratada, as como leche en polvo y, en general, slidos lcteos. En cualquier caso la adicin en todas estas materias primas viene limitada por el porcentaje de lactosa, que no exceder del 6% expresado en masa/masa sobre el producto terminado, descontando los ingredientes contemplados en 6.2.3. 6.2.2. Sodio cloruro en cantidades limitadas por la prctica normal de fabricacin. 6.2.3. Sustancias aromticas naturales e idnticas naturales, especias, aderezos vegetales y otros ingredientes naturales no lcteos, autorizados, con incidencia organolptica apreciable, siempre que el extracto seco incorporado no exceda del 30% en masa del extracto seco total expresado sobre el producto terminado. En la denominacin del producto se declarar la presencia de la sustancia o sustancias aadidas, agregando las palabras "con..." (aqu, el nombre de dichas sustancias). 6.3. Caractersticas fsico-qumicas. 6.3.1. Exclusivas para quesos fundidos sin adiciones de las contempladas en el apartado 6.2.3. a) Para queso de vaca: Indice de refraccin a 40C: De 1,4540 a 1,4557. Indice de Reichert: De 26 a 32. Indice de Polenske: De 1 a 4. Indice de Kirchner: De 19 a 27. b) Para queso de oveja: Indice de refraccin a 40C: De 1,4520 a 1,4545. Indice de Reichert: De 26 a 32. Indice de Polenske: De 5 a 8. Indice de Kirchner: De 19 a 27. c) Para queso de cabra: Indice de refraccin a 40C: De 1,4530 a 1,4547. Indice de Reichert: De 21 a 28. Indice de Polenske: de 5 a 9. Indice de Kirchner: De 14 a 21. Estos ndices no son aplicables a los quesos fundidos en cuya elaboracin se hayan utilizado quesos madurados por mohos. Para todos estos quesos, el lmite mnimo de colesterol dentro de los esteroles ser del 98% de la fraccin esterlica del insaponificable determinados por cromatografa gaseosa. En todo caso, la presencia de fitosteroles no deber considerarse aisladamente del conjunto de los ndices fsico-qumicos anteriormente expuestos.

6.3.2. Para quesos fundidos con adiciones de las contempladas en el apartado 6.2.3. se contemplar la posible modificacin de los anteriores ndices en funcin de las transferencias que hayan podido tener lugar y, en especial, de la grasa. 8. NORMA MICROBIOLOGICA Y CONTAMINANTES 8.1. Norma microbiolgica aplicable a los quesos fundidos. 8.1.1. Toma, transporte y conservacin de muestras. La toma de muestras de los quesos fundidos se har por triplicado, segn la legislacin vigente y de acuerdo con los siguientes mtodos: a) Como norma general, se tomarn cinco unidades del mismo lote para cada uno de los tres ejemplares de la muestra. Cada unidad estar constituida por un envase original e ntegro. b) Excepcionalmente, en los supuestos en que no fuera posible tomar el nmero de muestras indicado en el apartado a) por falta de cantidad suficiente de un mismo lote, se tomar una unidad para cada ejemplar de la muestra. En ambos casos, en el acta de toma de muestras debern reflejarse las condiciones de conservacin de la muestra y la fecha de consumo preferente. El anlisis de los tres ejemplares deber estar iniciado antes de su fecha de consumo preferente. La porcin de la muestra que se tome para la prctica del anlisis deber ser representativa del conjunto de su respectiva unidad. 8.1.2. Tolerancias microbiolgicas. 8.1.2.1. Para quesos fundidos: n Enterobactericeas totales/g .................. E. coli/g ................. Staph. aureus enterotoxignico/g ... Salmonella o c m M

5 5 5

2 1 2

1x102 1x103 1 1 1x101 1x101

Shigella/25 g ...........

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8.1.2.2. Para quesos fundidos rallados, quesos fundidos en polvo y quesos fundidos con los ingredientes facultativos indicados en el epgrafe 6.2.3. de esta norma.

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n Enterobactericeas totales/g .................. c m M Responsabilidades, publicados en este mismo B.O.E., no se han incluido en esta recopilacin por carecer de inters analtico. II METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 30-8-1979 Y 30-10-1991) 0. TECNICA DE TOMA DE MUESTRA (B.O.E. 5-8-1970) 0.1. Ambito de aplicacin. Las tcnicas que se indican en este ttulo, son aplicables exclusivamente a los productos definidos como quesos y quesos fundidos. Podrn estipularse tcnicas especficas en normas individuales o de grupos de quesos, en cuyo caso se aplicarn dichas tcnicas a la variedad particular o grupos de quesos en cuestin. 0.2. Toma de muestras. 0.2.1. Materiales. Todos los materiales utilizados debern estar secos y limpios y no debern comunicar olores ni sabores extraos. Podrn utilizarse los siguientes materiales: Sondas de forma y dimensiones apropiadas para la clase de queso de la que ha de tomarse la muestra. Cuchillo de acero inoxidable con hoja puntiaguda. Recipientes cilndricos, de boca ancha, de vidrio, metal inoxidable, materia plstica apropiada o de otro material autorizado que satisfaga los requisitos que posteriormente se sealan, con capacidad adecuada para el tamao de la muestra. Podrn tambin utilizarse sacos de plstico adecuados. Los recipientes se cerrarn hermticamente, por medio de tapones de caucho o plstico, o mediante cpsulas de metal o de materia plstica que cierren a rosca y que estn provistos interiormente, si fuera necesario, de un revestimiento plstico, impermeable a los lquidos, insoluble, no absorbente e inatacable por las grasas y que no pueda transmitir olor ni sabor. 0.2.2. Tcnica. Se tomar un nmero suficiente de muestras parciales para que el peso de la muestra total sea por lo menos de 50 g. Segn la forma, peso, clase y madurez del queso, se aplicar una de las tcnicas siguientes: Mediante cuchillo. Mediante sonda. Utilizacin de una pieza entera. Toma de muestra de queso en salmuera. El primer mtodo es preferible respecto al segundo, pero ste es aceptable especialmente cuando se trata de quesos de pasta dura de gran tamao.

1x102 1x103 1x101 1x102 1x102 1x103

E. coli/g ...................
Staph. aureus enterotoxignico/g ... Salmonella o

5
5

2
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Shigella/25 g ...........

n = nmero de unidades de muestra de un lote que se analizan segn el programa de muestreo establecido. c = nmero de muestras que pueden rebasar el lmite m sin ser superior al lmite M. m = lmite microbiolgico que nicamente c de las n muestras pueden sobrepasar. Se admite para este nivel una variabilidad: 3 m para medio slido. 10 m para medio lquido. M = nivel lmite de aceptabilidad. Los valores superiores a M no son aceptables. Los valores de M se fijan en: M = 10 m para medios slidos. M = 30 m para medios lquidos. Para las muestras tomadas segn el apartado b) del apartado 8.1.1. las tolerancias sern las indicadas a continuacin: Quesos fundidos: Enterobactericeas totales/g............ 1x103 E. coli/g........................................... 1x101 Staph. aureus enterotoxignico/g..... 1x101 Salmonella o Shigella/25 g............... Ausencia Quesos fundidos rallados, quesos fundidos en polvo y quesos fundidos con los ingredientes facultativos indicados en el epgrafe 6.2.3. de la norma: Enterobactericeas totales/g............ 1x103 E. coli/g........................................... 1x102 Staph. aureus enterotoxignico/g..... 1x103 Salmonella o Shigella/25 g............... Ausencia 8.2. Contaminantes. Las tolerancias de productos contaminantes y sustancias txicas no debern sobrepasar los lmites contenidos en la legislacin vigente y, en su defecto, en las Normas Internacionales aceptadas por el Estado espaol, que velar por su cumplimiento como garante de las mismas con la determinacin y exigencia de responsabilidades en este punto por el rgano del Estado correspondiente. NOTA: Los apartados, 7. Aditivos autorizados, 9. Prohibiciones, 10. Higiene, 11. Envasado, 12. Etiquetado y rotulacin, 13. Especificaciones y 14.

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Para los quesos fundidos en porciones o lonchas, en tubos o vasos, en polvo o rallados, as como para los quesos preenvasados y los de pequeo tamao, se utilizar el tercer procedimiento. a) Toma de muestra mediante cuchillo. Con ayuda de un cuchillo de hoja puntiaguda, se darn dos cortes radiales desde el centro del queso, si ste tiene base circular, o paralelo a los lados, si la base del queso o del queso fundido es rectangular o cuadrangular. El tamao del trozo as obtenido deber ser tal, que despus de haber retirado la capa superficial no comestible, la parte restante no tenga un peso inferior a 50 gramos. b) Toma de muestras mediante sonda. Segn el tamao, peso y clase del queso, se emplear una de las tcnicas siguientes: La sonda podr introducirse oblicuamente en direccin al centro del queso una o varias veces en una de las caras planas, en un punto situado a una distancia mnima de 10 a 20 centmetros del borde. La sonda podr introducirse horizontalmente en la pared vertical del queso, a igual distancia entre las dos superficies planas hasta el centro del queso. La sonda podr introducirse perpendicularmente por una de las caras del queso, para alcanzar la zona opuesta pasando por el centro. Cuando se trate de quesos transportados en barriles, cajas u otros recipientes a granel, o de quesos que formen grandes bloques compactos, la toma de muestras, podr realizarse haciendo pasar la sonda oblicuamente de arriba a abajo, atravesando todo el contenido del recipiente. En los quesos grandes la parte externa del cilindro, por lo menos 2 centmetros, tomados de muestra por la sonda y comprendiendo la corteza, podr utilizarse para tapar el agujero hecho en el queso. Los agujeros dejados por la sonda, debern taparse con gran cuidado, y si es posible, se recubrirn con un producto obturador aprobado. El resto de cilindro o cilindros, constituir la muestra. c) Toma de muestras utilizando una pieza entera. Este mtodo deber reservarse normalmente para los quesos de tamao pequeo preenvasado o no, y para los quesos y quesos fundidos presentados en cajitas conteniendo porciones envasadas o lonchas, en polvo o rallados y quesos fundidos en tubos o vasos. Deber tomarse un nmero suficiente de porciones, de lonchas o de piezas en general para obtener una muestra cuyo peso sea de 50 gramos como mnimo. d) Toma de muestras de quesos en salmuera.

Las muestras de quesos en salmuera, se obtendrn retirando fragmentos de 200 gramos cada uno por lo menos y, al mismo tiempo, una cantidad de salmuera suficiente para recubrir el queso en el recipiente de la muestra. Antes de efectuar los anlisis, la muestra se colocar sobre un papel de filtro durante una o dos horas. 0.2.3. Tratamiento y conservacin. Inmediatamente despus de la toma de muestras, stas debern colocarse en el recipiente adecuado, a no ser que se trate de porciones, lonchas, trozos o piezas enteras envasadas en recipientes pequeos para la venta al por menor, en cuyo caso dichos recipientes servirn al efecto. En el primer supuesto, las muestras podrn cortarse en trozos para introducirlas en los recipientes, pero no debern ser comprimidas ni desmenuzadas. A las muestras podr aadrseles una sustancia conservadora adecuada, siempre que no afecte al anlisis subsiguiente, indicndose en la etiqueta y en los informes su naturaleza y cantidad utilizada. Los recipientes que contengan las muestras debern enviarse inmediatamente al laboratorio, en donde se iniciarn los anlisis con la mayor rapidez posible. Las muestras de queso debern conservarse en forma tal que se evite la separacin de la materia grasa o del agua, y si se trata de quesos de pasta blanda, se mantendrn a una temperatura comprendida entre 0 y 5C. Al preparar la muestra, sea cual fuere el mtodo de toma de muestra que se haya empleado, deber tenerse cuidado para no eliminar ms que la capa superficial no comestible del queso, como son las partes mohosas y la corteza, salvo indicacin en contrario. 1. EXTRACCION DE LA GRASA DEL QUESO 1.1. Principio. Extraccin de la grasa del queso mediante pentano o ter de petrleo. 1.2. Material y aparatos 1.2.1. Mortero. 1.2.2. Aparato de extraccin continuo. 1.2.3. Bao de agua. 1.3. Reactivos. 132006 n-Pentano PA 131315 Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO 131716 Sodio Sulfato anhidro PA 1.3.1. Sodio Sulfato anhidro PA. 1.3.2. n-Pentano PA o Eter de Petrleo 4060C PA-ISO.

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1.4. Procedimiento. Moler la muestra en un mortero con Sodio Sulfato anhidro PA hasta obtener una masa granulosa. Extraer la masa con n-Pentano PA o Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO (se puede usar un aparato de extraccin continuo) y evaporar el disolvente al bao de agua o a presin reducida. 1.5. Referencia. 1.5.1. Norma internacional FIL-IDF 32: 1965. 131085 Etanol 96% v/v PA 132770 Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS Eter de Petrleo 30-60C. En su defecto, usar 131315 Eter de Petrleo 40-60C. PA-ISO 131542 Potasio Yoduro PA-ISO 2.3.1. Acido Clorhdrico 25% p/p (d20 = 1,125). Usar Acido Clorhdrico 35% PA-ISO y diluir convenientemente. 2.3.2. Etanol 96% v/v PA (2.6.1.). 2.3.3. Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS, exento de perxidos (2.6.2.). 2.3.4. Eter de Petrleo que destile a una temperatura que oscile entre 30 y 60C. 2.3.5. La mezcla de disolventes se prepara poco antes de utilizarla, mezclando volmenes iguales de 2.3.3. y 2.3.4. (2.6.3.). 2.4. Procedimiento. 2.4.1. Preparacin de la muestra.- Antes de efectuar el anlisis, eliminar la corteza, capa o superficie mohosa que recubre el queso, con objeto de obtener una muestra representativa del queso tal como se consume normalmente. Triturar la muestra con 2.2.8., mezclar la masa triturada rpidamente, y si es posible triturarla por segunda vez y mezclarla de nuevo concienzudamente (2.6.4.). Pasar la muestra preparada a un recipiente cerrado hermticamente hasta el momento del anlisis, que se efectuar en el mismo da (2.6.5.). 2.4.2. Determinacin.- Secar el matraz 2.2.3. con 2.2.5. en la estufa durante un intervalo de media hora. Dejar que se enfre el matraz a la temperatura ambiente de la balanza y pesar el matraz enfriado con aproximacin de 0,1 mg. Pesar, con aproximacin de 1 mg en el aparato de extraccin 2.2.2. o en un vaso o matraz de 100 ml, de 1 a 3 g de la muestra de queso preparada. La muestra del ensayo podr tambin pesarse utilizando una lmina de celulosa 2.2.7., que posteriormente se plegar e introducir en el tipo de vasija seleccionada. Aadir de 8 a 10 ml de Acido Clorhdrico (segn la forma del aparato de extraccin) y agitar la vasija ligeramente en un bao de agua hirviendo o sobre una llama hasta que el queso est completamente disuelto. Dejar la vasija en reposo durante veinte minutos en el bao de agua hirviendo y despus enfriar, por ejemplo, en agua corriente. Si la digestin del queso se ha hecho en el aparato de extraccin, aadir 10 ml de Etanol 96% v/v PA y mezclar el contenido, removindolo ligeramente, pero de un modo homogneo en el aparato sin cerrar. Si la digestin del queso se ha hecho en una vasija distinta del matraz de extraccin, verter el

2. DETERMINACION DEL CONTENIDO EN MATERIA GRASA 2.1. Principio. El contenido de grasa se determina gravimtricamente por digestin del queso con cido clorhdrico y subsiguientemente extraccin de la grasa de una solucin cido-alcohlica con la ayuda de ter etlico y ter de petrleo, evaporacin de los disolventes y posterior pesada de los residuos. La precisin del mtodo es de 0,2 g. de grasa por 100 g. del producto. 2.2. Material y aparato. 2.2.1. Balanza analtica. 2.2.2. Probetas o matraces de extraccin adecuados provistos de tapones de vidrio esmerilado o corcho; dispositivos del cierre que no puedan ser atacados por los disolventes utilizados. Si se usan tapones de corcho debern ser de buena calidad, sometindolos a extraccin sucesivamente con ter etlico y ter de petrleo. Despus se introducirn, al menos durante veinte minutos, en agua a una temperatura de 60C o superior, dejndose enfriar en agua de forma que estn saturados cuando se utilicen. 2.2.3. Matraces de paredes delgadas y bases planas de 150 a 250 ml de capacidad. 2.2.4. Estufa de desecacin regulable que permita trabajar a 102 2C, o una estufa de desecacin por vaco (temperatura de 70 a 75C, presin menor de 50 mm de Hg). 2.2.5. Perlas de vidrio o trozos de carburo de silicio, exento de grasa. 2.2.6. Bao de agua. 2.2.7. Hojas de pelcula de celulosa, sin barnizar, solubles en cido clorhdrico, de 0,03-0,05 mm de espesor y de 50 x 75 mm de superficie, aproximadamente. Las pelculas de celulosa no deben afectar al resultado del anlisis. 2.2.8. Aparato adecuado para la trituracin de la muestra. 2.3. Reactivos. 131019 Acido Clorhdrico 35% PA-ISO 131074 Agua PA-ACS 131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO

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contenido de la vasija en este matraz. Enjuagarlo sucesivamente con 10 ml de Etanol 96% v/v PA, 25 ml. de Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS y 25 ml de Eter de Petrleo, vertiendo cada vez el disolvente en el matraz de extraccin. Despus de cada adicin mezclar y agitar el matraz de extraccin, segn se indica a continuacin. Aadir 25 ml de Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS, cerrar el aparato y agitar vigorosamente, invirtindolo repetidamente durante un minuto. Enfriarlo, si es necesario, en agua corriente. Quitar el tapn cuidadosamente y aadir 25 ml de Eter de Petrleo, empleando los primeros ml para enjuagar el tapn y la superficie interna del cuello del aparato, dejando que el lquido de los enjuagues penetre en el mismo. Cerrarlo, volviendo a colocar el tapn, agitar e invertirlo repetidamente durante treinta segundos; no debe agitarse demasiado enrgicamente. Dejar el aparato en reposo hasta que la capa lquida superior est completamente lmpida y claramente separada de la capa acuosa. La separacin podr tambin efectuarse mediante el uso de una centrfuga adecuada (2.6.6.), quitar el tapn y enjuagarlo, as como tambin el interior del aparato con algunos ml de la mezcla de los disolventes y dejar que los lquidos de los enjuagues penetren en el aparato. Transvasar cuidadosamente el matraz 2.2.3., lo ms completamente posible la capa superior por decantacin o con ayuda de un sifn (2.6.7.). Enjuagar el exterior y el interior del cuello del aparato o el extremo de la parte interior del sifn con unos cuantos mililitros de la mezcla de disolventes. Dejar que los lquidos de los enjuagues de la parte exterior del aparato penetren en el matraz y que los lquidos de los enjuagues de la parte interior del cuello y del sifn penetren en el aparato de extraccin. Hacer una segunda extraccin repitiendo el procedimiento descrito anteriormente (desde la adicin de 25 ml de Eter de Petrleo), utilizando solamente 15 ml de Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS y 15 ml de Eter de Petrleo. Hacer una tercera extraccin, pero omitiendo el enjuague final. Evaporar o destilar cuidadosamente la mayor cantidad posible de disolvente (incluido el Etanol). Si el matraz es de poca capacidad, parte del disolvente tendr que eliminarse en la forma citada anteriormente, despus de cada extraccin. Cuando haya desaparecido el olor a disolvente, calentar el matraz, apoyndolo sobre un lado durante una hora en la estufa. Dejar que el matraz se enfre a la temperatura ambiente de la balanza y pesar con aproximacin de 0,1 mg. Repetir las operaciones de calentar el matraz en estufa y pesar calentando a intervalos de treinta a sesenta minutos, hasta que se obtenga una masa constante.

Aadir de 15 a 25 ml de Eter de Petrleo, con objeto de verificar si la materia extrada es totalmente soluble. Calentar ligeramente y agitar el disolvente mediante un movimiento rotatorio, hasta que se haya disuelto toda la grasa. Cuando la materia extrada sea totalmente soluble en el Eter de Petrleo, la masa de grasa ser la diferencia entre las pesadas del matraz 2.2.3. y de la masa constante. En caso contrario extraer completamente la grasa del matraz mediante lavados repetidos con Eter de Petrleo caliente, dejando que se deposite la materia no disuelta antes de cada decantacin. Enjuagar tres veces la parte exterior del cuello del matraz. Calentar el matraz, apoyndolo sobre un lado durante una hora en la estufa y dejar que se enfre a la temperatura ambiente de la balanza y pesar con aproximacin de 0,1 mg. La masa de la grasa ser la diferencia entre la masa obtenida anteriormente y esta masa final. 2.4.3. Ensayo en blanco. Al mismo tiempo que se determina el contenido de grasa de la muestra, efectuar una determinacin en blanco con 10 ml de Agua PA-ACS, empleando el mismo tipo de aparato de extraccin, los mismos reactivos en las mismas cantidades y el mismo procedimiento. Si el resultado del ensayo en blanco excede de 0,5 mg debern comprobarse los reactivos, y el reactivo o reactivos impuros debern purificarse o sustituirse. 2.5. Clculos. La masa, expresada en gramos, de la muestra extrada es: (M1 - M2) - (B1 - B2) y el contenido de grasa en la muestra, expresado en porcentaje, de la masa es: (M1 - M2) - (B1 - B2) x 100 S Siendo: M1 = masa, en g, del matraz con la materia grasa extrada. M2 = masa, en g, del matraz sin grasa. B1 = masa, en g, del matraz del ensayo en blanco despus de eliminar los disolventes. B2 = masa, en g, del matraz del ensayo en blanco. S = masa, en g, de la porcin ensayada. 2.6. Observaciones. 2.6.1. Si no se dispone de Etanol 96% v/v PA se puede utilizar etanol desnaturalizado con alcohol metlico, metiletilcetona, benceno o ter de petrleo.

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2.6.2. Para el ensayo de los perxidos verter 10 ml de Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS en una pequea probeta tapada con tapn de vidrio, previamente enjuagada con Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS, aadir 1 ml de solucin al 10% de Potasio Yoduro PA-ISO, recin preparada. Agitar y dejar reposar durante un minuto. No debe aparecer ningn color amarillo en ninguna de las capas. El Eter Dietlico estabilizado con ~ 6 ppm de BHT PA-ACS podr mantenerse exento de perxidos, aadiendo una lmina de zinc hmeda, que deber sumergirse completamente en una solucin cida diluida de Cobre II Sulfato 5-hidrato PAACS-ISO durante un minuto y despus lavar con agua. Utilizar por litro una superficie de 80 cm2 aproximadamente de lmina de zinc, cortarla en bandas suficientemente largas para que lleguen por lo menos hasta la mitad del recipiente. 2.6.3. La mezcla de disolventes podr sustituirse en aquellos casos en que su utilizacin se haya previsto por Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS o Eter de Petrleo. 2.6.4. Si la muestra no se pudiera triturar mezclarla cuidadosamente mediante un amasado intenso. 2.6.5. En caso de que haya que retrasar inevitablemente esta operacin, tomar las precauciones necesarias para asegurar la conservacin adecuada de la muestra e impedir la condensacin de la humedad en la superficie interior. 2.6.6. Cuando se utilice una centrfuga que no est provista de un motor trifsico pueden producirse chispas y entonces habr que tomar las debidas precauciones para evitar explosiones o incendios debido a la presencia de los vapores de ter, por ejemplo, en el caso de una rotura de un tubo. 2.6.7. Si el trasvase no se efecta mediante un sifn, quiz sea necesario tener que aadir un poco de agua para elevar el plano intermedio entre las dos capas, con objeto de facilitar la decantacin. 2.7.. Referencia. 2.7.1. Cdigo de Principios referente a la leche y a los Productos Lcteos. Norma B-3. FIL-IDF 5A: 1969. 3. DETERMINACION DEL CONTENIDO DE EXTRACTO SECO 3.1. Principio. El extracto seco del queso y de los quesos fundidos es la masa, expresada en porcentaje ponderal, que queda despus del proceso de desecacin. La precisin del mtodo es de 0,1%. 3.2. Material y aparatos 3.2.1. Balanza analtica, sensibilidad 0,1 mg. 3.2.2. Desecador provisto de un buen deshidratante (211335 Gel de Slice con indicador QP o 141219 Calcio Cloruro anhidro 95% escoriforme PRS). 3.2.3. Estufa de desecacin que permita obtener una temperatura constante hasta 110C. 3.2.4. Cpsulas de nquel o de aluminio de 2 cm de altura, aproximadamente, y de 6 a 8 cm. de dimetro. 3.2.5. Arena de cuarzo de granos gruesos o 211161 Arena de Mar lavada, grano grueso QP purificada con 131019 Acido Clorhdrico 35% PAISO, lavada y calcinada. 3.2.6. Agitadores de vidrio con una extremidad plana. 3.3. Procedimiento. Colocar 20 g de Arena de Mar QP, aproximadamente, y un agitador de vidrio en la cpsula de nquel o de aluminio. Secar la cpsula con la arena y el agitador en la estufa a 105C, hasta peso constante. Dejar enfriar la cpsula en el desecador y pesar. Colocar rpidamente en la cpsula, aproximadamente, 3 g de la muestra de queso preparada y pesar de nuevo. Triturar cuidadosamente la masa de queso con la arena con ayuda del agitador (3.4.1.). Secar la cpsula en la estufa durante cuatro horas a 105C. Dejar enfriar en el desecador y pesar. Proseguir el secado hasta peso constante separando cada pesada por una permanencia en la estufa de media hora. 3.4. Observaciones. 3.4.1. Para los quesos que fundan a la temperatura de 105C en una masa crnea, se recomienda guardar primero la cpsula con la masa del queso triturado en el desecador durante diecisis horas, a la presin atmosfrica normal y a la temperatura del laboratorio. Se remover de vez en cuando el contenido de la cpsula con el agitador, para evitar la formacin de costras. 3.5. Referencias. 3.5.1. Federacin Internacional de Lechera. Norma FIL-IDF 4: 1958. 4. DETERMINACION DEL CONTENIDO EN FOSFORO 4.1. Principio. Mineralizacin de determinada cantidad de muestra con ayuda de cido sulfrico en presencia de hidrgeno perxido. El fosfato se trata con sodio molibdato e hidracina sulfato como agente reductor. El azul de molibdeno as formado se

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mide por fotometra, calculndose el contenido en fsforo. La presin del mtodo es de 0,04 g de fsforo por 100 de producto. 4.2. Material y aparatos 4.2.1. Balanza analtica. 4.2.2. Colormetro fotoelctrico que permita lecturas a una longitud de onda de 700 nm. 4.2.3. Aparato apropiado para triturar la muestra. 4.2.4. Matraces erlenmeyer de 25 ml. 4.2.5. Aparato de mineralizacin que mantenga los matraces erlenmeyer en una posicin inclinada y provisto de un sistema de calentamiento que no caliente la parte del matraz situada por encima de la superficie del lquido. 4.2.6. Cuerpos que faciliten la ebullicin para la mineralizacin: trozos de porcelana o perlas de vidrio. 4.2.7. Matraces aforados de 50, 100, 200, 500 y 1.000 ml. 4.2.8. Pipetas y/o buretas de 1, 2, 5, 10, 20 y 25 ml. 4.3. Reactivos. 131058 Acido Sulfrico 96% PA-ISO 131074 Agua PA-ACS 131350 Hidracinio Sulfato PA 141076 Hidrgeno Perxido 30% p/v (100 vol.) PRS 131509 Potasio di-Hidrgeno Fosfato PA 131701 Sodio Molibdato 2-hidrato PA 4.3.1. Acido Sulfrico 96% PA-ISO. 4.3.2. Hidrgeno Perxido 30% p/v (100 vol.) PRS. 4.3.3. Reactivo de Molibdato y de Hidracina Sulfato. 4.3.3.1. Solucin 2,5% de Sodio Molibdato.Disolver 12,5 g de Sodio Molibdato 2-hidrato PA en Acido Sulfrico 10N (usar Acido Sulfrico 96% PA-ISO y diluir convenientemente con Agua PAACS), completando hasta 500 ml. 4.3.3.2. Solucin 0,15% de Hidracinio Sulfato.Disolver 0,30 g de Hidracinio Sulfato PA, en Agua PA-ACS, completando hasta 200 ml. 4.3.3.3. Inmediatamente antes de su empleo, mezclar 25 ml. de 4.3.3.1. con 10 ml de 4.3.3.2. y diluir la mezcla hasta 100 ml con Agua PA-ACS para preparar el reactivo de Molibdato y de Hidracinio Sulfato. Esta solucin no puede conservarse. 4.3.3.4. Solucin normalizada de fosfato.Disolver 0,4390 g. de Potasio di-Hidrgeno Fosfato PA en Agua PA-ACS hasta obtener una solucin de 1.000 ml. Esta solucin contiene 100 g. de fsforo en 1 ml. El Potasio di-Hidrgeno Fosfato PA debe haber sido secado durante cuarenta y ocho horas en presencia de un agente de desecacin eficaz, por ejemplo, el Acido Sulfrico 96%

PA-ISO. Todos los reactivos deben ser de calidad analtica. 4.4. Procedimiento. 4.4.1. Preparacin de la muestra. Antes del anlisis se quitar la corteza o la cara superficial mohosa del queso de modo que se obtenga una muestra representativa del queso tal como se consume habitualmente. La muestra ser triturada a continuacin en un triturador u otro aparato apropiado y mezclada ntimamente, evitando las prdidas por evaporacin. La muestra as preparada ser conservada en un recipiente al abrigo del aire hasta su anlisis, que deber efectuarse el mismo da. 4.4.2. Determinacin. Introducir sucesivamente en el matraz erlenmeyer 0,5 g de la muestra, pesados con exactitud de 1 mg, algunas perlas de vidrio o pequeos trozos de porcelana y 4 ml de Acido Sulfrico 96% PAISO. Calentar con precaucin el matraz erlenmeyer sobre el aparato de mineralizacin. Al cesar la formacin de espuma, enfriar a la temperatura ambiente; aadir con precaucin algunas gotas de Hidrgeno Perxido 30% p/v PRS, calentar de nuevo y repetir estas operaciones hasta que el contenido del matraz se encuentre lmpido e incoloro. Durante el calentamiento, mezclar el contenido del matraz de tiempo en tiempo por agitacin. Evitar los recalentamientos locales. Enjuagar el cuello del matraz con unos 2 ml de Agua PA-ACS y calentar de nuevo hasta que el agua se haya evaporado. Dejar hervir el lquido durante una media hora despus de la decoloracin, con el fin de eliminar todo indicio de hidrgeno perxido. Evitar los recalentamientos locales. Despus del enfriamiento a la temperatura ambiente, traspasar el contenido del matraz a un matraz aforado de 100 ml, completar hasta el aforo con Agua PA-ACS y mezclar. Llevar con la pipeta 1 ml de la solucin a un matraz aforado de 50 ml y diluir con unos 25 ml. de Agua PA-ACS. Aadir 20 ml del reactivo de Molibdato y de Hidracinio Sulfato, llenar el matraz hasta el aforo con Agua PA-ACS y mezclar. Colocar el matraz en agua hirviendo y dejar que se forme el color durante quince minutos. Enfriar a la temperatura ambiente en agua fra y, antes de una hora, medir la densidad ptica con relacin al ensayo en blanco (4.4.4.) a una longitud de onda de 700 nm. 4.4.3. Preparacin de la curva patrn. Diluir en un matraz aforado 10 ml de la solucin normalizada 4.3.4. con Agua PA-ACS y completar hasta 100 ml. Introducir en cinco matraces aforados de 50 ml, 0, 1, 2, 5 y 10 ml de la solucin normalizada diluida con el fin de obtener una serie de soluciones testigos que contengan 0 (valor cero), 10, 20, 50 y 100 g de fsforo.

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Aadir Agua PA-ACS a los matraces para obtener un volumen aproximado de 25 ml, aadir 20 ml del reactivo de Molibdato y de Hidracinio Sulfato, llenar hasta el aforo con Agua PA-ACS, mezclar, colocar el matraz con agua hirviendo y dejar que se forme el color durante quince minutos. Enfriar a la temperatura ambiente en agua fra y medir la densidad ptica de los testigos con respecto al de valor cero, a una longitud de onda de 700 nm. Determinar la curva patrn sealando las diferencias de densidad ptica con respecto a las cantidades de microgramos de fsforo. 4.4.4. Ensayo en blanco. Efectuar un ensayo en blanco siguiendo el procedimiento expresado en 4.4.2., pero sin queso. 4.5. Clculo. Calcular el contenido en fsforo de la muestra por medio de la frmula: P Contenido en fsforo (%) = 100 W Siendo: P = peso, en g, de fsforo obtenido al convertir la medida obtenida en el colormetro utilizando la curva patrn. W = peso, en g, de la muestra tomada para el anlisis. 4.6. Referencia. 4.6.1. Federacin Internacional de Lechera. Norma FIL-IDF 33A: 1971. 5. DETERMINACION DEL CONTENIDO EN ACIDO CITRICO 5.1. Principio. Obtencin de un filtrado claro por dispersin de la muestra en agua y clarificacin por la adicin de cido tricloroactico. El filtrado se trata con piridina y anhdrido actico y se forma con el cido ctrico un compuesto de color amarillo. El color obtenido se mide por fotometra. La precisin del mtodo es de 0,1 g de cido ctrico anhidro por 100 g de producto. 5.2. Material y aparatos. 5.2.1. Balanza analtica, con precisin que permita de 0,001 g. 5.2.2. Colormetro fotoelctrico que permita lecturas a una longitud de onda de 428 nm. 5.2.3. Bao de agua con control termosttico que permita una regulacin a 32 1C. 5.2.4. Aparato apropiado para triturar la muestra. 5.2.5. Tubos de ensayo con tapones de vidrio o de plstico de 16 o 18 por 150 nm. 5.2.6. Mortero y mano de porcelana de unos 50 ml 5.2.7. Matraces aforados de 50, 100 y 1.000 ml. 5.2.8. Pipetas y buretas de 1; 1,3; 4; 5,7; 8; 12; 16 y 20 ml 5.2.9. Embudos de vidrio de dimensiones apropiadas, por ejemplo, de 5 cm de dimetro. 5.2.10. Papel de filtro duro. Whatman nmero 540, S y S 5893 o equivalente. 5.3. Reactivos. 131067 Acido Tricloroactico PA-ACS 131074 Agua PA-ACS 131147 Anhdrido Actico PA 131457 Piridina PA-ACS 131655 tri-Sodio Citrato 2-hidrato PA-ACS 5.3.1. Acido Tricloroactico 30% (p/v).- Disolver 300 g. de Acido Tricloroactico PA-ACS en Agua PA-ACS y diluir hasta 1.000 ml. 5.3.2. Piridina PA-ACS. 5.3.3. Anhdrido Actico PA. 5.3.4. Solucin normalizada de citrato.- Disolver 0,9565 g de tri-Sodio Citrato 2-hidrato PAACS en Agua PA-ACS y diluir hasta 1.000 ml. Todos los reactivos deben ser de calidad analtica. 5.4. Procedimiento. 5.4.1. Preparacin de la muestra. Antes del anlisis se quitar la corteza o la capa superficial mohosa del queso de modo que se obtenga una muestra representativa del queso tal como se consume habitualmente. La muestra ser triturada a continuacin con un triturador u otro aparato apropiado y/o mezclada ntimamente evitando las prdidas por evaporacin. La muestra as preparada ser conservada en un recipiente al abrigo del aire hasta su anlisis, que deber efectuarse el mismo da. 5.4.2. Determinacin. Colocar 0,5 g de la muestra, pesada con precisin de 0,001 g en un mortero de porcelana. Dispersar la muestra machacndola con la mano del mortero y aadiendo pequeas cantidades de agua caliente (60-70C). Traspasar el contenido del mortero a un matraz aforado de 100 ml., empleando unos 50 ml. de Agua PA-ACS. Enfriar a la temperatura ambiente. Aadir 40 ml de la solucin de Acido Tricloroactico, mezclar por agitacin, llenar con Agua PAACS hasta el aforo y mezclar de nuevo. Dejar reposar a la temperatura ambiente durante treinta minutos y filtrar sobre un papel de filtro seco. Desechar la primera porcin del filtrado

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hasta que se obtenga un lquido lmpido; se desechar al menos 10 ml. Introducir con ayuda de una pipeta 1 ml de filtrado claro en un tubo de ensayo provisto de tapn. Aadir al tubo 1,3 ml de Piridina PA-ACS. Mezclar y aadir inmediatamente 5,7 ml de Anhdrido Actico PA. Tapar el tubo y mezclar ntimamente su contenido, colocndolo inmediatamente en un bao de agua a 32C, dejndolo durante treinta minutos. Retirar el tubo del bao de Mara, secarlo y medir la densidad ptica con relacin al ensayo en blanco (5.4.4.) a una longitud de onda de 428 nm antes de treinta minutos. 5.4.3. Preparacin de la curva patrn. Introducir en seis matraces de 50 ml 0, 4, 8, 12, 16 y 20 ml de la solucin normalizada de citrato (5.3.4.); aadir a cada matraz Agua PA-ACS hasta obtener un volumen aproximado de 25 ml. Aadir 20 ml. de la solucin de Acido Tricloroactico (5.3.1.); mezclar por agitacin, llenar hasta el aforo con Agua PA-ACS y mezclar de nuevo. Introducir con una pipeta 1 ml de cada solucin patrn diluida en tubos de ensayo provistos de tapn, con el fin de obtener una serie de testigos que contengan 0 (valor cero), 50, 100, 150, 200 y 250 g de cido ctrico anhidro; aadir a cada tubo 1,3 ml de Piridina PA-ACS. Mezclar y aadir inmediatamente 5,7 ml de Anhdrido Actico PA. Tapar el tubo y mezclar ntimamente su contenido. Colocar los tubos sin demora en un bao de agua a 32C y dejarlos durante treinta minutos. Retirar los tubos del bao de agua, enfriar a temperatura ambiente, secarlos y medir la densidad ptica de los testigos con relacin al valor cero, a una longitud de onda de 428 nm antes de treinta minutos. Determinar la curva patrn sealando la diferencia de densidad ptica con relacin a la cantidad de cido ctrico anhidro en g. 5.4.4. Ensayo en blanco. Efectuar un ensayo en blanco siguiendo el procedimiento expresado anteriormente, pero sin muestra. 5.5. Clculos. Calcular el contenido en cido ctrico anhidro por medio de la frmula: C Contenido en cido ctrico anhidro % 100 x W

5.6. Referencia. 5.6.1. Federacin Internacional de Lechera. Norma FIL-IDF 34B: 1971. 6. DETERMINACION DEL CONTENIDO EN LACTOSA 6.1. Principio. Preparacin de un filtrado claro del queso por dispersin de la muestra en agua y defecacin por zinc ferrocianuro. A una parte del filtrado se le aade una solucin que contiene un complejo cprico. Se determina gravimtricamente el precipitado de cobre I xido, formado por la accin reductora de la lactosa y los resultados obtenidos se convierten, con la ayuda de tablas, en lactosa anhidra o hidratada. La precisin del mtodo es de 0,15 g de lactosa anhidra por 100 g de producto. 6.2. Material y aparatos. 6.2.1. Balanza analtica. Sensibilidad 0,1 mg. 6.2.2. Estufa regulable a 103C 2C. 6.2.3. Mortero de porcelana de un contenido aproximado de 300 ml, de un dimetro interior de unos 110 nm, con una mano apropiada. 6.2.4. Vaso de precipitados de 400 ml 6.2.5. Crisol filtrante de porcelana de un contenido aproximado de 35 ml y de una porosidad media de 3-15 micras, cuyo peso no debe variar ms de 1,0 mg cuando se le aplica el mtodo operatorio descrito ms adelante, sin utilizar el queso. 6.2.6. Desecador provisto de un agente de desecacin eficaz, como el Gel de Slice con indicador QP. 6.2.7. Matraz aforado de 500 ml. 6.2.8. Matraz erlenmeyer de 500 ml. 6.2.9. Pipetas de 25 y 100 ml. 6.2.10. Probeta graduada de 20 o 25 ml. 6.2.11. Embudo de vidrio de unos 150 mm de dimetro. 6.2.12. Vidrio de reloj destinado a cubrir el vaso de precipitados de 400 ml. 6.2.13. Varilla de vidrio con proteccin de goma en la punta. 6.2.14. Dispositivo de aspiracin de una seccin media. 6.2.15. Matraz de vaco con portacrisol. 6.2.16. Filtro plegado o filtro plano de porosidad media, de dimensin correspondiente al embudo 6.2.11. 6.3. Reactivos. 131036 Acido Ntrico 60% PA-ISO 131074 Agua PA-ACS 131085 Etanol 96% v/v PA 131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO 211335 Gel de Slice 3-6 mm con indicador QP

98

Siendo: C = peso, en g., de cido ctrico obtenido al convertir la medida obtenida en el colormetro utilizando la curva patrn. W = peso, en g., de la muestra tomada para el anlisis.

M
211456 Piedra Pmez grnulos QP 131505 Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS 131729 Potasio Sodio Tartrato 4-hidrato PAACS-ISO 131687 Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO 131787 Zinc Sulfato 7-hidrato PA 6.3.1. Solucin de Zinc Sulfato. Disolver 30 g de Zinc Sulfato 7-hidrato PA en Agua PA-ACS, completando hasta 100 ml. 6.3.2. Solucin de Potasio Hexacianoferrato II. Disolver 15 g de Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS en Agua PA-ACS completando hasta 100 ml 6.3.3. Solucin de Cobre II Sulfato. Disolver 70 g de Cobre II Sulfato 5-hidrato PAACS-ISO en Agua PA-ACS, completando hasta 1.000 ml y filtrando si es necesario. 6.3.4. Solucin de Tartrato Alcalino. Disolver 350 g de Potasio Sodio Tartrato 4-hidrato PA-ACS-ISO en Agua PA-ACS, completando hasta 1.000 ml Dejar reposar dos das en un frasco tapado y filtrar. La solucin se deteriorar al cabo de un cierto tiempo, lo que puede falsear el ensayo en blanco (resultados ms elevados). 6.3.5. Acido Ntrico diluido: Acido Ntrico 60% PA-ISO diluyendo a 15-20% en peso. 6.3.6. Etanol 96% v/v PA. Puede ser desnaturalizado con un desnaturalizante apropiado que no deje residuos despus de la evaporacin. Los reactivos deben ser de calidad analtica. 6.4. Procedimiento. 6.4.1. Preparacin de la muestra para el ensayo. Antes del anlisis se quitar la corteza o capa superficial mohosa del queso, a fin de obtener una muestra representativa del queso tal como habitualmente se consume. La muestra ser triturada a continuacin en un triturador u otro aparato apropiado y mezclada ntimamente, evitando las prdidas por evaporacin. La muestra as preparada ser conservada en un recipiente cerrado hasta su anlisis, que deber efectuarse el mismo da. 6.4.2. Determinacin. Lavar el crisol filtrante con Acido Ntrico diluido, enjuagarlo perfectamente con Agua PA-ACS caliente y despus con 10 ml de Etanol 96% v/v PA. Secar el crisol a 103C. 2C durante treinta minutos, enfriar en un desecador y pesar. Colocar, aproximadamente, 10 g de la muestra, pesados exactamente, en un mortero de porcelana. Dispersar la muestra machacndola con la mano del mortero, aadiendo pequeas cantidades de Agua PA-ACS caliente (60 - 70C) Trasvasar el contenido del mortero a un matraz aforado de 500 ml Diluir en 400 ml, aproximadamente. Aadir 5 ml de la solucin de Zinc Sulfato, mezclando suavemente por rotacin del matraz alrededor de su eje, mantenindolo inclinado. Aadir del mismo modo 5 ml de la solucin de Potasio Hexacianoferrato II. Enfriar el contenido del matraz a 20C. y completar con Agua PA-ACS (a 20C.) hasta el aforo. Cerrar el matraz con un tapn seco y mezclar ntimamente su contenido mediante una agitacin enrgica. Filtrar con un papel de filtro seco, desechando los primeros ml filtrados. Tomar con una pipeta 25 ml de la solucin de Cobre II Sulfato (6.3.3.) y 25 ml de la solucin de Tartrato Alcalino (6.3.4.) y llevarlo a un vaso de precipitado de 400 ml Mezclar por movimiento de rotacin. Calentar la muestra hasta ebullicin. Aadir 100 ml del filtrado de la muestra con ayuda de una pipeta. Cubrir el vaso con un vidrio de reloj y calentar de nuevo. Detener el calentamiento exactamente seis minutos despus de alcanzar nuevamente el punto de ebullicin. Para asegurar una ebullicin ms regular y para evitar las proyecciones del lquido, se podrn aadir pequeos trozos de Piedra Pmez 4 a 8 mm QP tratados previamente de la misma manera que el crisol y pesados con ste ltimo. Enjuagar el vidrio de reloj con un poco de Agua PA-ACS caliente encima del vaso. Trasvasar todo el contenido del vaso a un crisol filtrante preparado previamente (segn se indica con anterioridad). Para efectuar este trasvase ayudarse de chorros de Agua PA-ACS caliente y de una varilla de vidrio con proteccin de goma en la punta. El filtrado debe ser de color azul. Si es incoloro, repetir el anlisis utilizando una cantidad ms pequea de filtrado diluida en 100 ml. Enjuagar cuidadosamente el crisol filtrante con Agua PA-ACS caliente y despus con 10 ml de Etanol 96% v/v PA. Secar el crisol durante treinta minutos a 103C 2C, enfriar en un desecador y pesar. 6.4.3. Ensayo en blanco. Efectuar un ensayo en blanco siguiendo el procedimiento descrito pero utilizando 10 ml de agua destilada en lugar de 10 g de queso. 6.5. Clculos. Corregir la masa de cobre I xido encontrada en el anlisis de la muestra restndole el resultado del ensayo en blanco. Buscar en las tablas la cantidad de lactosa anhidra o hidratada correspondiente a la masa corregida de cobre I xido. Calcular el contenido en lactosa anhidra o hidratada de la muestra con ayuda de la frmula siguiente:

99

Contenido en lactosa anhidra o hidratada (%) = 50.000 x A 500 x A = x 0,99 = 99 VxE VxE Siendo: A = masa, en g., de lactosa anhidra o hidratada encontrada en la tabla. E = masa, en g, de la muestra de ensayo. V = volumen, en ml, del filtrado utilizado. 0,99 = factor de correccin para compensar el error de volumen que resulta de la presencia de materia grasa y protenas en la muestra. 6.6. Referencia. 6.6.1. Federacin Internacional de Lechera. Norma FIL-IDF 43: 1967.

100

M
TABLA PARA DETERMINAR LA CANTIDAD DE LACTOSA (MONOHIDRATADA Y ANHIDRA) EN MILIGRAMOS, SEGUN LA CANTIDAD DE COBRE I OXIDO EN MILIGRAMOS Cobre I Oxido (Cu2O) en mg 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Lactosa 1-hidrato (C12H22O11.H2O) en mg 5,1 5,8 6,4 7,1 7,7 8,4 9,0 9,7 10,3 11,0 11,6 12,3 12,9 13,6 14,2 14,8 15,5 16,2 16,8 17,5 18,1 18,7 19,4 20,0 20,7 21,3 22,0 22,6 23,3 23,9 24,6 25,2 25,9 26,5 27,2 27,8 28,5 29,1 29,8 30,4 31,4 31,7 32,4 33,0 33,7 34,3 34,9 35,3 36,2 36,9 37,5 Lactosa anhidra (C12H22O11) en mg 4,8 5,5 6,1 6,7 7,3 8,0 8,6 9,2 9,8 10,5 11,0 11,7 12,3 12,9 13,5 14,1 14,7 15,4 16,0 16,6 17,2 17,8 18,4 19,0 19,7 20,2 20,9 21,5 22,1 22,7 23,4 23,9 24,6 25,2 25,8 26,4 27,1 27,6 28,3 28,9 29,5 30,1 30,8 31,4 32,0 32,6 33,2 33,8 34,4 35,1 35,6 Cobre I Oxido (Cu2O) en mg 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 Lactosa 1-hidrato (C12H22O11.H2O) en mg 38,2 38,8 39,4 40,1 40,8 41,4 42,0 42,7 43,3 44,0 44,6 45,3 45,9 46,6 47,2 47,9 48,5 49,2 49,8 50,4 51,1 51,8 52,4 53,1 53,7 54,4 55,0 55,7 56,3 57,0 57,6 58,2 58,9 59,5 60,2 60,8 61,4 62,1 62,8 63,4 64,0 64,6 65,3 66,0 66,6 67,2 67,9 68,6 69,2 69,9 70,5 Lactosa anhidra (C12H22O11) en mg 36,3 36,9 37,4 38,1 38,8 39,3 39,9 40,6 41,1 41,8 42,4 43,0 43,6 44,3 44,8 45,5 46,1 46,7 47,3 47,9 48,5 49,2 49,8 50,4 51,0 51,7 52,3 52,9 53,5 54,2 54,7 55,3 56,0 56,5 57,2 57,8 58,3 59,0 59,7 60,2 60,8 61,4 62,0 62,7 63,3 63,8 64,5 65,2 65,7 66,4 67,0

101

Cobre I Oxido (Cu2O) en mg 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164

Lactosa 1-hidrato (C12H22O11.H2O) en mg 71,2 71,9 72,5 73,2 73,8 74,5 75,1 75,8 76,5 77,1 77,7 78,4 79,1 79,8 80,4 81,0 81,7 82,3 83,0 83,7 84,4 85,0 85,6 86,3 87,0 87,7 88,3 89,0 89,6 90,3 91,0 91,6 92,2 92,9 93,6 94,3 94,9 95,6 96,2 96,9 97,6 98,2 98,8 99,5 100,2 100,8 101,5 102,2 102,8 103,5 104,2 104,9 105,6

Lactosa anhidra (C12H22O11) en mg 67,6 68,3 68,9 69,5 70,1 70,8 71,3 72,0 72,7 73,2 73,8 74,5 75,1 75,8 76,4 77,0 77,6 78,2 78,9 79,5 80,2 80,8 81,3 82,0 82,7 83,3 83,9 84,6 85,1 85,8 86,5 87,0 87,6 88,3 88,9 89,6 90,2 90,8 91,4 92,1 92,7 93,3 93,9 94,5 95,2 95,8 96,4 97,1 97,7 98,3 99,0 99,7 100,3

Cobre I Oxido (Cu2O) en mg 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217

Lactosa 1-hidrato (C12H22O11.H2O) en mg 106,2 106,9 107,6 108,2 108,9 109,6 110,2 110,9 111,6 112,3 113,0 113,6 114,3 115,0 115,6 116,3 117,0 117,6 118,3 119,0 119,7 120,3 121,0 121,7 122,4 123,0 123,7 124,3 125,0 125,6 126,3 127,0 127,7 128,4 129,1 129,7 130,4 131,1 131,8 132,4 133,1 133,8 134,5 135,2 135,8 136,5 137,2 137,9 138,6 139,3 140,0 140,6 141,3

Lactosa anhidra (C12H22O11) en mg 100,9 101,6 102,2 102,8 103,5 104,4 104,7 105,4 106,0 106,7 107,4 107,9 108,6 109,3 109,8 110,5 111,2 111,7 112,4 113,1 113,7 114,3 115,0 115,6 116,3 116,9 117,5 118,1 118,8 119,3 120,0 120,7 121,3 122,0 122,6 123,2 123,9 124,5 125,2 125,8 126,4 127,1 127,8 128,4 129,0 129,7 130,3 131,0 131,7 132,3 133,0 133,6 134,2

102

M
Cobre I Oxido (Cu2O) en mg 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 Lactosa 1-hidrato (C12H22O11.H2O) en mg 142,0 142,6 143,3 144,0 144,7 145,4 146,1 146,8 147,5 148,1 148,8 149,4 150,1 150,8 151,4 152,1 152,8 153,4 154,1 154,8 155,4 156,1 156,9 157,4 158,1 158,7 159,4 160,1 160,7 161,4 162,0 162,7 163,4 164,0 164,7 165,4 166,0 166,7 167,3 168,0 168,7 169,4 170,0 170,7 171,3 172,0 172,6 173,3 174,0 174,7 175,4 176,1 176,8 Lactosa anhidra (C12H22O11) en mg 134,9 135,5 136,1 136,8 137,5 138,1 138,7 139,5 140,1 140,7 141,4 141,9 142,6 143,3 143,8 144,5 145,2 145,7 146,4 147,1 147,6 148,3 149,1 149,5 150,2 150,8 151,4 152,1 152,7 153,3 153,9 154,6 155,2 155,8 156,5 157,4 157,7 158,4 158,9 159,6 160,3 160,9 161,5 162,2 162,7 163,4 164,0 164,6 165,3 166,0 166,6 167,3 168,0 Cobre I Oxido (Cu2O) en mg 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 Lactosa 1-hidrato (C12H22O11.H2O) en mg 177,5 178,2 178,8 179,5 180,2 180,9 181,6 182,3 183,0 183,6 184,3 185,0 185,7 186,4 187,1 187,8 188,5 189,1 189,8 190,5 191,2 191,9 192,6 193,3 194,0 194,7 195,4 196,0 196,7 197,4 198,1 198,8 199,5 200,2 200,9 201,6 202,3 203,0 203,7 204,4 205,2 205,9 206,6 207,3 208,0 208,7 209,5 210,2 210,9 211,6 212,3 213,0 213,7 Lactosa anhidra (C12H22O11) en mg 168,6 169,3 169,9 170,5 171,2 171,9 172,5 173,2 173,9 174,4 175,1 175,8 176,4 177,1 177,7 178,4 179,1 179,6 180,3 181,0 181,6 182,3 183,0 183,6 184,3 185,0 185,6 186,2 186,9 187,5 188,2 188,9 189,5 190,2 190,9 191,5 192,2 192,9 193,5 194,2 194,9 195,6 196,3 196,9 197,6 198,3 199,0 199,7 200,4 201,0 201,7 202,4 203,0

103

Cobre I Oxido (Cu2O) en mg 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377

Lactosa 1-hidrato (C12H22O11.H2O) en mg 214,4 215,2 215,9 216,6 217,3 218,0 218,8 219,5 220,2 220,9 221,6 222,4 223,1 223,8 224,5 225,2 225,9 226,6 227,2 227,9 228,6 229,3 230,0 230,7 231,4 232,1 232,8 233,5 234,2 234,9 235,6 236,2 237,0 237,7 238,4 239,1 239,8 240,5 241,2 241,8 242,5 243,2 243,9 244,6 245,2 245,9 246,6 247,3 248,0 248,7 249,4 250,1 250,8 251,6

Lactosa anhidra (C12H22O11) en mg 203,7 204,4 205,1 205,8 206,4 207,1 207,9 208,5 209,2 209,9 210,5 211,3 211,9 212,6 213,3 213,9 214,6 215,3 215,8 216,5 217,2 217,8 218,5 219,2 219,8 220,5 221,2 221,8 222,5 223,2 223,8 224,4 225,2 225,8 226,5 227,1 227,8 228,5 229,1 229,7 230,4 231,0 231,7 232,4 232,9 233,6 234,3 234,9 235,6 236,3 236,9 237,6 238,3 239,0

Cobre I Oxido (Cu2O) en mg 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431

Lactosa 1-hidrato (C12H22O11.H2O) en mg 252,3 253,0 253,7 254,4 255,1 255,8 256,6 257,3 258,0 258,7 259,5 260,2 260,9 261,6 262,3 263,1 263,8 264,5 265,2 265,9 266,7 267,4 268,1 268,8 269,6 270,3 271,0 271,8 272,5 273,2 274,0 274,7 275,5 276,2 276,9 277,7 278,4 279,1 279,9 280,6 281,4 282,2 283,0 283,7 284,5 285,2 286,0 286,8 287,6 288,3 289,1 289,9 290,7 291,4

Lactosa anhidra (C12H22O11) en mg 239,7 240,4 241,0 241,7 242,3 243,0 243,8 244,4 245,1 245,8 246,5 247,2 247,9 248,5 249,2 249,9 250,6 251,3 251,9 252,6 253,4 254,0 254,7 255,4 256,1 256,8 257,5 258,2 258,9 259,5 260,3 261,0 261,7 262,4 263,1 263,8 264,5 265,1 265,9 266,6 267,3 268,1 268,9 269,5 270,3 270,9 271,7 272,5 273,2 273,9 274,6 275,4 276,2 276,8

104

M
Cobre I Oxido (Cu2O) en mg 432 433 434 435 436 437 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 450 Lactosa 1-hidrato (C12H22O11.H2O) en mg 292,2 293,0 293,8 294,5 295,3 296,0 296,8 297,6 298,4 299,2 299,9 300,7 301,4 302,2 303,0 303,7 304,5 305,2 306,0 Lactosa anhidra (C12H22O11) en mg 277,6 278,4 279,1 279,8 280,5 281,2 282,0 282,7 283,5 284,2 284,9 285,7 286,3 287,1 287,9 288,5 289,3 289,9 290,7 131074 Agua PA-ACS 131129 Amonaco 25% (en NH3) PA Cadmio metal, grnulos ~ 0,3-0,8 mm 131270 Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO 132751 N-(1-Naftil) Etilendiamina Diclorhidrato PA 131505 Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS 131524 Potasio Nitrato PA-ISO 131703 Sodio Nitrito PA 132823 Sulfanilamida PA 131787 Zinc Sulfato 7-hidrato PA 7.3.1. Grnulos de cadmio de dimetro aproximado 0,3 a 0,8 mm. 7.3.2. Solucin de Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO: Disolver 20 g de Cobre II Sulfato 5hidrato PA-ACS-ISO en Agua PA-ACS y diluir a 1.000 ml 7.3.3. Solucin Tampn pH 9,6 a 9,7. Diluir 50 ml de Acido Clorhdrico 37% PA-ACS-ISO con 600 ml de Agua PA-ACS. Despus de mezclar aadir 140 ml de Amonaco 25% (en NH 3) PA. Diluir a 1.000 ml con Agua PA-ACS y mezclar. Ajustar el pH a 9,6-9,7, si es necesario. 7.3.4. Acido Clorhdrico 2 mol/l (2N) SV o diluir Dimensiones en milmetros

7. NITRATOS Y NITRITOS 7.1. Principio. Tratamiento de la muestra con agua caliente, precipitacin de la grasa y protena y filtracin. Reduccin en una porcin del filtrado del nitrato a nitrito, por medio de una columna de cadmio. Desarrollo de una reaccin coloreada en alcuotas del filtrado no reducida, por adicin de sulfanilamida y cloruro de N-1-Naftiletilendiamina. Medicin de la absorbancia de la solucin obtenida a 538 nm 7.2. Material y aparatos. 7.2.1. Aparato apropiado para triturar la muestra. 7.2.2. Mezclador-homogeneizador con recipiente de vidrio de 250 y 400 ml. 7.2.3. Papel de filtro de poro medio, de 15 cm de dimetro, exento de nitratos y nitritos. 7.2.4. Columna de reduccin similar a la de la figura (ver pgina siguiente). 7.2.5. Colormetro fotoelctrico o espectrofotmetro que permita lecturas a una longitud de onda de 538 nm. 7.3. Reactivos. 131020 Acido Clorhdrico 37% PA-ACS-ISO 182108 Acido Clorhdrico 2 mol/l (2N) SV 181023 Acido Clorhdrico 0,1 mol/l (0,1N) SV 131669 Acido Etilendiaminotetraactico Sal Disdica 2-hidrato PA-ACS-ISO Sal Disdica 2-hidrato

Pinza de Hoffman

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Conector lana de vidrio

Figura Columna de reduccin de nitrato

160 ml de Acido Clorhdrico 37% PA-ACS-ISO a 1.000 ml con Agua PA-ACS. 7.3.5. Acido Clorhdrico 0,1 mol/l (0,1N) SV o diluir 50 ml de la solucin 7.3.4. a 1.000 ml con Agua PA-ACS. 7.3.6. Solucin de Zinc Sulfato 7-hidrato PA: Disolver 53,5 g de Zinc Sulfato 7-hidrato PA con Agua PA-ACS y diluir a 100 ml. 7.3.7. Solucin de Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS: Disolver 17,2 g de Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS en Agua PA-ACS y diluir a 100 ml. 7.3.8. Solucin de Acido Etilendiaminotetraactico Sal Disdica 2-hidrato PA-ACS-ISO: Disolver 33,5 g de Acido Etilendiaminotetraactico Sal Disdica 2-hidrato PA-ACS-ISO (Na2C10H14N2O8 2H2O) en Agua PA-ACS y diluir a 1.000 ml. 7.3.9. Solucin de Acido Clorhdrico (Sol.I): Diluir 540 ml de Acido Clorhdrico 37% PA-ACSISO a 1.000 ml con Agua PA-ACS. 7.3.10. Solucin de Sulfanilamida (Sol. II): Disolver, calentando en bao de agua, 0,5 g de Sulfanilamida PA (NH2C6H4SO2NH2) en una mezcla de 75 ml de Agua PA-ACS y 5 ml de Acido Clorhdrico 37% PA-ACS-ISO. Enfriar a temperatura ambiente y diluir a 100 ml con Agua PA-ACS. Filtrar si es necesario. 7.3.11. Solucin de N-(1-Naftil) Etilendiamina PA (Sol. III): Disolver 0,1 g de N-1-(Naftil) Etilendiamina Diclorhidrato PA en Agua PA-ACS. Diluir a 100 ml con Agua PA-ACS. Filtrar si es necesario. Esta solucin se puede conservar hasta una semana en refrigerador en un recipiente oscuro bien cerrado. 7.3.12. Solucin patrn de Sodio Nitrito PA. Disolver en Agua PA-ACS 0,150 g de Sodio Nitrito PA desecado a peso constante a 110-120C, diluir a 1.000 ml con Agua PA-ACS y mezclar. En el momento de su empleo diluir 10 ml de esta solucin con 20 ml de solucin tampn (7.3.3.) y diluir a 1.000 ml con Agua PA-ACS. 1 ml de esta -. solucin final contiene 1,00 g de NO 2 7.3.13. Solucin patrn de Potasio Nitrato PAISO. Disolver en Agua PA-ACS 1,468 g de Potasio Nitrato PA-ISO desecado a peso constante a 110-120C y diluir a 1.000 ml con Agua PA-ACS. En el momento de su empleo diluir 5 ml de la solucin tampn (7.3.3.) y diluir a 1.000 ml con Agua PA-ACS. 1 ml de esta solucin final contiene 4,5 g -. de NO3

106

7.4. Procedimiento. 7.4.1. Preparacin de la columna de cadmio. 7.4.1.1. Llevar los grnulos de cadmio (aproximadamente 40-60 g para cada columna) a un erlenmeyer de 250 ml. Aadir suficiente solucin de Acido Clorhdrico 2 mol/l (2N) SV (7.3.4.) para cubrir el cadmio. Agitar durante unos minutos. Decantar la solucin y lavar el cadmio en el matraz

con Agua PA-ACS, hasta que est libre de cloruros. Aadir la solucin de Cobre II Sulfato 5-hidrato PA-ACS-ISO (aproximadamente 2,5 ml por g de cadmio) y agitar durante un minuto Decantar la solucin y lavar el cadmio cuprizado inmediatamente con Agua PA-ACS, teniendo cuidado de que el cadmio est cubierto con Agua PA-ACS, en todo momento. Terminar el lavado cuando el Agua PA-ACS est exenta de cobre precipitado. 7.4.1.2. Llenar la columna con Agua PA-ACS y llevar el cadmio cuprizado a la misma, con la mnima exposicin al aire. La altura del cadmio debe ser de 15 a 20 centmetros. Se debe evitar que queden atrapadas burbujas de aire entre los grnulos de cadmio y que el nivel del lquido quede por debajo de la parte superior del cadmio. 7.4.1.3. Acondicionar la columna haciendo pasar una mezcla de 750 ml de Agua PA-ACS, 225 ml de solucin patrn de Potasio Nitrato PAISO (7.3.1.2.), 20 ml de solucin tampn (7.3.3.) y 20 ml de solucin EDTA (7.3.8.) a un flujo no superior a 6 ml/min. Lavar la columna con 50 ml de Agua PA-ACS. 7.4.2. Comprobacin de la capacidad de reduccin de la columna. 7.4.2.1. Pipetear 20 ml de solucin patrn de Potasio Nitrato PA-ISO (7.3.1.2.) y llevarlos al depsito superior de la columna. Aadir inmediatamente 5 ml de solucin tampn (7.3.3.). Eluir a un flujo no superior a 6 ml/min. y recoger el eluido en un matraz aforado de 100 ml. Cuando el depsito se ha vaciado casi completamente, lavar las paredes del mismo con 15 ml de Agua PA-ACS y repetir esta operacin con otros 15 ml de Agua PA-ACS. Cuando esta segunda porcin de Agua ha pasado a la columna, llenar completamente el depsito con Agua PA-ACS y eluir con la mxima velocidad de flujo posible. Cuando se hayan recogido casi 100 ml retirar el matraz, completar hasta el aforo y mezclar bien. 7.4.2.2. Pipetear 10 ml del eluido a un matraz aforado de 100 ml. Aadir Agua PA-ACS hasta un volumen aproximado de 60 ml y proceder de la forma especificada en (7.4.8.). Si la concentracin de nitrito en el eluido determinada a partir de la curva de calibracin (7.4.9.) est por debajo de - por ml (95% del valor terico), se 0,63 g de NO2 debe regenerar la columna, 100% del rendimiento corresponde a 0,66 g de nitritos por ml. 7.4.3. Regeneracin de la columna: La columna se debe regenerar cada da despus de su empleo, o ms frecuentemente si se observa una prdida de eficacia, de la siguiente manera: Aadir 5 ml de la solucin EDTA (7.3.8.) y 2 ml de Acido Clorhdrico 0,1 mol/l (0,1N) SV (7.3.5.) a 100 ml de Agua PA-ACS. Pasar la mezcla a travs de la columna a un flujo aproximado de 10 ml/min. Cuando el depsito se ha vaciado, lavar la colum-

M
na con Agua PA-ACS, solucin de Acido Clorhdrico 0,1 mol/l (0,1N) SV y Agua PA-ACS sucesivamente. Si la columna no muestra todava una eficacia satisfactoria, repetir el procedimiento especificado en 7.4.1.3. 7.4.4. Preparacin de la muestra: Antes del anlisis quitar la corteza o la capa superficial, de modo que se obtenga una muestra representativa del queso tal y como se consume habitualmente. Triturar la muestra con un triturador u otro aparato apropiado y mezclar cuidadosamente, evitando las prdidas por evaporacin. La muestra as preparada se conservar en un recipiente cerrado hasta el momento del anlisis, que se realizar tan pronto como sea posible. Si el retraso es inevitable se deben tomar todas las precauciones para asegurar la conservacin de la muestra y para prevenir la condensacin de humedad en la superficie interior del recipiente. 7.4.5. Extraccin y desproteinizacin. Pesar con precisin de 1 mg, 10 g de muestra y llevarlos al recipiente de vidrio del mezcladorhomogeneizador. Aadir gradualmente 164 ml de Agua PA-ACS a 50-55C. Mezclar hasta que el queso est bien suspendido. Aadir en el siguiente orden: 6 ml de solucin de Zinc Sulfato 7-hidrato PA (7.3.6.), 6 ml de solucin de Potasio Hexacianoferrato II 3-hidrato PA-ACS (7.3.7.) y 20 ml de solucin tampn (7.3.3.) a la suspensin de queso, agitando cuidadosamente despus de cada adicin. Despus de tres minutos filtrar a travs del papel de filtro, recogiendo el filtrado en un Erlenmeyer de 250 ml. Es necesario obtener un filtrado transparente. Por esta razn, en algunos quesos puede ser necesario aadir una cantidad mayor de reactivos de precipitacin, disminuyendo en este caso la cantidad de Agua PA-ACS en la misma proporcin. 7.4.6. Reduccin de nitrato a nitrito. Pipetear 20 ml del filtrado obtenido en el apartado anterior y operar de la misma forma que en el apartado (7.4.2.1.) 7.4.7. Preparacin de la solucin para la determinacin de nitrito en la muestra. Pipetear 20 ml de filtrado del apartado 7.4.5. en un matraz aforado de 100 ml y completar con Agua PA-ACS. Mezclar bien. 7.4.8. Determinacin colorimtrica. Pipetear alcuotas iguales dependiendo del contenido probable en nitritos, de la solucin 7.4.7. y del eluido del apartado 7.4.6. en matraces aforados de 100 ml. Aadir Agua PA-ACS hasta un volumen aproximado de 60 ml. Aadir 5 ml de solucin I (7.4.9.) y 5 ml de solucin II (7.3.10.). Mezclar cuidadosamente y dejar reposar la solucin durante cinco minutos a temperatura ambiente protegindola de la luz solar directa. Aadir 2 ml de solucin III. Mezclar cuidadosamente y dejar reposar cinco minutos a temperatura ambiente al abrigo de la luz solar directa. Completar hasta 100 ml con Agua PA-ACS y mezclar bien. Medir en el plazo de quince minutos la absorbancia de la solucin frente al ensayo en blanco (7.4.10.) a una longitud de onda de 538 nm. 7.4.9. Curva de calibracin. Pipetear 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 y 20 ml de la solucin patrn de Sodio Nitrito PA (7.3.12.) en matraces aforados de 100 ml. Aadir Agua PAACS hasta un volumen aproximado de 60 ml. Llevar a cabo el procedimiento descrito en (7.4.8.). Representar las absorbancias obtenidas frente a las concentraciones de nitrito, en microgramos por mililitro. 7.4.10. Ensayo en blanco. Llevar a cabo un ensayo en blanco usando todos los reactivos, pero sustituyendo los 10 g de muestra por 4 ml de Agua PA-ACS. 7.5. Clculo. 7.5.1. Contenido en nitritos: 100.000 x c1 - (mg/kg) = Contenido en NO2 mxV Siendo: m = Peso en gramos de la muestra. c1 = Concentracin en microgramos de NO2 por ml, obtenidos a partir de la curva de calibracin, correspondiente a la absorbancia de la solucin obtenida usando el filtrado diluido (7.4.7.). V = Volumen en ml de la alcuota tomada en (7.4.8.) sobre el filtrado diluido (7.4.7.). 7.5.2. Contenido en nitrato: - (mg/kg) = Contenido en NO3 100.000 x c2 x r = 1,35 NO2 mxV

Siendo: m = Peso en gramos de la muestra. c2 = Concentracin en microgramos de NO2 por ml, obtenidos a partir de la curva de calibracin, correspondiente a la absorbancia de la solucin obtenida del eluido de la columna. V = Volumen en ml de la alcuota tomada del eluido. r = 100/rendimiento de la columna. 7.6. Referencias. 7.6.1. Norma Internacional L FIL-IDF 84 A: 1984.

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8. DETERMINACION DE LECHE DE VACA EN QUESO DE OVEJA O DE CABRA (Por electroforesis) 8.1. Principio. La fraccin srica de la muestra se extrae por adicin de solucin tampn a pH 4,6 y posterior centrifugacin. Las protenas de suero son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida a pH 8,3. Las lactoglobulinas de leche de vaca presentan una mayor movilidad electrofortica de las lactoalbminas y las lactoglobulinas de la leche de oveja y de la leche de cabra. El mtodo es aplicable a la leche cruda o pasterizada a una temperatura mxima de 90C durante treinta segundos, fresca o conservada mediante congelacin o adicin de dicromato potsico. 8.2. Material y aparatos. 8.2.1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 coinciden con los apartados 23(a)- 2.1., 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de los Mtodos de Anlisis de la Leche (ver pgina 43). 8.3. Reactivos. 8.3.1., 2 y 3, coinciden con los apartados 23(a)- 3.1., 2 y 3 de los Mtodos de Anlisis de la Leche (ver pgina 43). 8.4. Procedimiento. 8.4.1 Obtencin de la fraccin soluble a pH 4,6. Pesar 15 g de queso previamente triturado, aadir 5 ml de solucin de Acido Actico glacial PA-ACS al 10% (8.3.1.) y 5 ml de solucin de Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RE, homogeneizar y comprobar con pH metro que el pH de la mezcla es exactamente 4,6. Centrifugar a 3.000 r.p.m. durante diez minutos y filtrar el sobrenadante a travs de un papel de filtro de velocidad media. 8.4.2. Preparacin de la curva patrn. Dependiendo del tipo de muestra que se desea analizar, partir de patrones de quesos puros de oveja o de cabra y de vaca, as como patrones de quesos de mezcla de vaca en oveja o de vaca en cabra, en concentraciones del 5 por 100, 10 por 100 y 20 por 100. La leche utilizada para la fabricacin de estos quesos patrn podr ser cruda o pasterizada, en este ltimo caso la leche deber ser pasterizada a una temperatura mxima de 74C durante un tiempo mximo de treinta segundos. La fraccin soluble de los patrones se obtiene siguiendo el procedimiento descrito en 8.4.1. 8.4.3. Inmediatamente antes de su aplicacin en gel mezclar: -Un volumen de la fraccin soluble obtenida segn 8.4.1. -Un volumen de la solucin de Glicerina (USP, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX al 40% (8.3.2.7.).

-Medio volumen de la solucin de Azul de Bromofenol RE-ACS al 1/1000 (8.3.2.6.). 8.4.4 Preparacin del gel de poliacrilamida. Parar el gel laminar de espesor comprendido entre 0,5 mm y 1 mm. Para 50 ml de la solucin de Acrilamida-Bisacrilamida, aadir 0,5 ml de solucin de Amonio Peroxodisulfato PA al 10% (8.3.2.4.), desairear en un kitasato mediante vaco y aadir como agente polimerizante 50 ml de TEMED (8.3.2.5.). 8.4.5. Electroforesis. Colocar el gel en el aparato de electroforesis y llenar las cmaras de los electrodos con el tampn pH 8,3 (8.3.2.3.). Aplicar con microjeringa en cada uno de los pocillos del gel un volumen comprendido entre 10 l y 20 l de las soluciones obtenidas segn 8.4.3., tanto de la muestra como de los patrones. La electroforesis se realiza a 60 mA (220V) dejando correr el frente hasta que la lnea del azul de bromofenol est a 0,5 mm del extremo inferior del gel. La duracin es aproximadamente de tres horas. 8.4.6. Mtodos de tincin. 8.4.6.1. Tincin con Azul Coomassie R-250. Una vez completada la electroforesis, introducir el gel sucesivamente en: 1 La solucin fijadora (8.3.3.1.1.): Una hora. 2 La solucin decolorante (8.3.3.1.2.): Diez minutos. 3 La solucin de tincin (8.3.1.3.): Doce horas. 4 La solucin decolorante (8.3.3.1.2.), que se renovar con frecuencia, hasta eliminar el fondo. 8.4.6.2. Tincin con Azul de Coomassie G250. Una vez completada la electroforesis, introducir el gel sucesivamente en: 1 La solucin de fijacin/tincin (8.3.3.2.1.): Doce horas. 2 Agua PA-ACS, que se renovar con frecuencia: Una hora. 8.5. Interpretacin de los resultados. 8.5.1. Identificacin de las bandas. En el diagrama se observa el orden de las bandas de las protenas de menor a mayor movilidad electrofortica en cada una de las especies:

F E D C B 1 2 3 A

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Diagrama electrofortico de las protenas de suero de: 1) Leche de vaca, 2) Leche de cabra, 3) Leche de oveja.

M
A) Seroalbmina (BSA). B) Lactoglobulina de cabra. C) Lactoalbmina (cabra y oveja). D) Lactoalbmina de vaca y Lactoglobulina de oveja. E) Lactoglobulina B de vaca. F) Lactoglobulina A de vaca. 8.5.2. y 8.5.3. coinciden con los apartados 23(a)5.2. y 23(a)- 5.3. de los Mtodos de Anlisis de la Leche (ver pgina 45). 8.6. Expresin de los resultados. Expresar el contenido en leche de vaca segn los siguientes intervalos: -Menor del 5 por 100. -Entre el 5 y el 10 por 100. -Entre el 10 y el 20 por 100. -Mayor del 20 por 100. Siendo el lmite de deteccin prctico del 3 por 100 en leche de vaca, en queso de oveja o en queso de cabra. 8.7. Referencias. 8.7.1., 2, 3 y 4 coinciden con los apartados 23(a) 8.1., 2, 3 y 4 de los Mtodos de Anlisis de la Leche (ver pgina 45). 9. DETERMINACION DE LECHE DE CABRA EN QUESO DE OVEJA (Por electroforesis) 9.1. Principio. La fraccin srica de la muestra se extrae por adicin de solucin tampn a pH 4,6 y posterior centrifugacin. Las protenas de suero son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida a pH 8,3. La lactoglobulina de leche de cabra presenta una menor movilidad electrofortica que la lactoalbmina y la lactoglobulina de la leche de oveja. 9.2. Material y aparatos. 9.2.1., 2, 3, 4, 5, 6 y 7 coinciden con los apartados 23(a) 2.1., 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de los Mtodos de Anlisis de la Leche (ver pgina 43). 9.3. Reactivos. 9.3.1., 2 y 3, coinciden con los apartados 23(a)- 3.1., 2 y 3 de los Mtodos de Anlisis de la Leche (ver pgina 43). 9.4. Procedimiento. 9.4.1. como 8.4.1. 9.4.2. Preparacin de la curva patrn. Partir de patrones de quesos puros de oveja y de cabra, as como de patrones de quesos de mezcla de cabra en oveja, en concentraciones del 5%, 10% y 20%. La leche utilizada para la fabricacin de estos quesos patrn podr ser cruda o pasterizada, en este ltimo caso la leche deber ser pasterizada a una temperatura mxima de 74C durante un tiempo mximo de treinta segundos. La fraccin soluble de los patrones se obtiene siguiendo el procedimiento descrito en 9.4.1. 9.4.3., 4, 5 y 6 como 8.4.3., 4, 5 y 6. 9.5. Interpretacin de los resultados. 9.5.1. Identificacin de las bandas. En el diagrama se observa el orden de las bandas de las protenas de menor a mayor movilidad electrofortica en la leche de cabra y en la leche de oveja.

D C B A

Diagrama electrofortico de las protenas de suero. 1) Leche de cabra, 2) Leche de oveja. A) Seroalbmina (BSA). B) Lactoglobulina de cabra. C) Lactoalbmina (cabra y oveja). D) Lactoglobulina de oveja. 9.5.2. y 9.5.3. coinciden con los apartados 24(a) 5.2. y 24(a) 5.3. de los Mtodos de Anlisis de la Leche (pg. 47). 9.6. Expresin de los resultados. Expresar el contenido en leche de cabra segn los siguientes intervalos: -Menor del 5 por 100. -Entre el 5 y el 10 por 100. -Entre el 10 y el 20 por 100. -Mayor del 20 por 100. Siendo el lmite de deteccin prctico del 3 por 100 de leche de cabra en queso de oveja. 9.7. Referencias. 9.7.1., 2, 3 y 4 coinciden con los apartados 23(a) 8.1., 2, 3 y 4 de los Mtodos de Anlisis de la Leche (ver pgina 45).

109

Yogur

M
I ORDEN DE 1 DE JULIO DE 1987 POR LA QUE SE APRUEBA LA NORMA DE CALIDAD PARA EL YOGUR O YOGHOURT DESTINADO AL MERCADO INTERIOR. (B.O.E. 3-7-1987). De conformidad con lo establecido en el Decreto 1043/1973, de 17 de mayo, por el que se regula la normalizacin de productos ganaderos en el mercado interior, y teniendo en cuenta los Decretos de Presidencia del Gobierno 2484/1967, de 21 de septiembre, por el que se aprueba el texto del Cdigo Alimentario Espaol y el 2519/1974, de 9 de agosto, sobre su entrada en vigor, aplicacin y desarrollo, parece oportuno dictar la presente Norma de Calidad para yogur o yoghourt. En su virtud, previo informe de la Comisin Interministerial para la Ordenacin Alimentaria, de conformidad con los acuerdos del FORPPA y a propuesta de los Ministros de Economa y Hacienda, de Agricultura, Pesca y Alimentacin y de Sanidad y Consumo, Este Ministerio de Relaciones con las Cortes y de la Secretara del Gobierno dispone: Artculo nico.- Se aprueba la Norma de Calidad para el yogur o yoghurt destinado al mercado interior que se recoge en el anejo nico de esta Orden. DISPOSICIONES ADICIONALES Primera.- Las determinaciones analticas se realizarn de acuerdo con los mtodos oficiales vigentes. Cuando no existan mtodos oficiales para determinados anlisis y hasta tanto los mismos no sean propuestos por el rgano competente y previamente informados por la Comisin Interministerial para la Ordenacin Alimentaria, podrn ser utilizados los adoptados por los Organismos nacionales e internacionales de reconocida solvencia. Segunda.- Los Departamentos competentes velarn por el cumplimiento de lo dispuesto en la presente Orden a travs de sus rganos administrativos encargados, que coordinarn sus actuaciones, en todo caso, sin perjuicio de las competencias que correspondan a las Comunidades Autnomas y a las Corporaciones Locales. DISPOSICION FINAL La presente Orden entrar en vigor en todo el territorio espaol a los treinta das de su publicacin en el Boletn Oficial del Estado. DISPOSICION TRANSITORIA El apartado 11 - Etiquetado y Rotulacin del anejo nico no ser de obligado cumplimiento, hasta transcurridos seis meses a partir de la fecha de su publicacin en el Boletn Oficial del Estado, teniendo hasta entonces el carcter de recomendado, sin perjuicio de lo dispuesto en el Real Decreto 2058/1982, de 12 de agosto. Madrid, 1 de julio de 1987. ZAPATERO GMEZ Excmos. Sres. Ministros de Agricultura, Pesca y Alimentacin, de Economa y Hacienda y de Sanidad y Consumo. ANEJO UNICO Norma de Calidad para el yogur o yoghourt 1. NOMBRE DE LA NORMA Norma de Calidad para el yogur o yoghourt. 2. OBJETO DE LA NORMA La presente Norma tiene por objeto definir las caractersticas de calidad, envasado y presentacin que deben reunir los yogures para su adecuada comercializacin en el mercado interior. 3. AMBITO DE APLICACIN La presente Norma se aplicar a todos los yogures comercializados en todo el territorio espaol. 4. DEFINICIN Se entiende por yogur o yoghourt el producto de leche coagulada obtenida por fermentacin lctica mediante la accin de lactobacillus bulgaricus y streptococcus thermophilus a partir de leche pasterizada, leche concentrada pasterizada, leche total o parcialmente desnatada pasterizada, leche concentrada pasterizada total o parcialmente desnatada, con o sin adicin de nata pasterizada, leche en polvo entera, semidesnatada o desnatada, suero en polvo, protenas de leche y/u otros productos procedentes del fraccionamiento de la leche. Los microorganismos productores de la fermentacin lctica deben ser viables y estar presentes en el producto terminado en cantidad mnima de 1 por 107 colonias por gramo o mililitro.

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5. TIPOS DE YOGUR Segn los productos aadidos, antes o despus de la fermentacin, los yogures pueden clasificarse de la siguiente forma: 5.1. Yogur natural.- Es el definido en el punto 4. 5.2. Yogur azucarado.- Es el yogur definido en el punto 4 al que se han aadido azcar o azcares comestibles. 5.3. Yogur edulcorado.- Es el yogur definido en el punto 4 al que se han aadido los edulcorantes autorizados en esta Norma. 5.4. Yogur con fruta, zumos y/u otros productos naturales.- Es el yogur definido en el punto 4 al que se han aadido frutas, zumos y/u otros productos naturales. 5.5. Yogur aromatizado.- Es el yogur definido en el punto 4 al que se han aadido agentes aromticos autorizados. 6. FACTORES ESENCIALES DE COMPOSICION Y CALIDAD 6.1. pH.- Todos los yogures debern tener un pH igual o inferior a 4,6. 6.2. Materia grasa de leche.- Todos los yogures definidos en el punto 5, tendrn en su parte lctea, un contenido mnimo de materia grasa de leche de 2 por 100 m/m. Los yogures definidos en el punto 5 que tengan en su parte lctea un contenido mximo de materia grasa lctea de 0,5 por 100 m/m debern llevar adems la mencin desnatado. 6.3. Extracto seco magro de leche.- Todos los yogures definidos en el punto 5 tendrn en su parte lctea, un contenido mnimo de extracto seco magro de leche de 8,5 por 100 m/m. Asimismo, los yogures desnatados, cumplirn este requisito. 6.4. Contenido en yogur.- Para los yogures con frutas, zumos y/u otros productos naturales definidos en el punto 5.4., la cantidad mnima de yogur en el producto terminado sern del 70 por 100 m/m. Para los yogures aromatizados definidos en el punto 5.5., la cantidad mnima de yogur en el producto terminado ser del 80 por 100 m/m. 9. NORMA MICROBIOLOGICA Y CONTAMINANTES

ejemplares de la muestra. Cada unidad estar constituida por un envase original e ntegro. b) Excepcionalmente, en los supuestos en que no fuese posible tomar el nmero de muestras indicado en el apartado a), por falta de cantidad suficiente de un mismo lote, se tomar una unidad para cada ejemplar de la muestra. c) En ambos casos, en el acta de toma de muestras debern reflejarse las condiciones de conservacin, la temperatura de la muestra y la fecha de caducidad. El transporte de las muestras y su conservacin hasta el momento del anlisis, se realizar a temperatura inferior a 10C, para que la muestra mantenga, en todo momento, las caractersticas adecuadas al objeto de no desvirtuar la finalidad de aqul. El anlisis de los tres ejemplares deber estar iniciado antes de la fecha de caducidad. La porcin de la muestra que se tome para su anlisis, deber ser representativa del conjunto de su respectiva unidad. 9.1.2. Tolerancias microbiolgicas.- Las tolerancias sern las indicadas en el cuadro siguiente: Yogures definidos en: 5.1., 5.2., 5.3. y 5.5. n Enterobactericeae lactosa positivo colonias/g ................ E. coli colonias/g ....... Salmonella c m M

5 5

2 2

1.101 1.102 1 1.101

-Shigella/25 g............

5.4. n Enterobactericeae lactosa positivo colonias/g ................ E. coli colonias/g ....... Salmonella c m M

5 5

2 2

5.101 5.102 5 10 5.101

-Shigella/25 g............

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9.1. Norma microbiolgica para el yogur. 9.1.1. Toma, transporte y conservacin de muestras.- La toma de muestras para los yogures se har por triplicado segn la legislacin vigente y de acuerdo con los siguientes mtodos: a) Como norma general, se tomarn 5 unidades del mismo lote, para cada uno de los tres

n: Nmero de unidades de muestra de un lote que se analiza segn el programa de muestreo establecido. c: Nmero de muestras que pueden rebasar el lmite m, sin ser superior al lmite M. m: Lmite microbiolgico que nicamente c de las n muestras pueden sobrepasar.

M
Se admite para este nivel una variabilidad: 3 m para medio slido. 10 m para medio lquido. M: Nivel lmite de aceptabilidad. Los valores superiores a M no son satisfactorios. Los valores M se fijan en: M = 10 m para medios slidos. M = 30 m para medios lquidos. Para las muestras tomadas segn el procedimiento b) del apartado 9.1.1., las tolerancias sern las indicadas a continuacin: Yogures definidos en: 5.1., 5.2., 5.3. y 5.5. Enterobactericeae lactosa positivo colonias/g........... E. coli colonias/g .. Salmonella 5.4. II METODOS DE ANALISIS (B.O.E. 3-71987) EN TANTO NO SE ESTABLEZCAN NORMAS ESPAOLAS PARA LA DETERMINACION DE LAS ESPECIFICACIONES DE ESTA NORMA, SE UTILIZARAN LOS SIGUIENTES METODOS: 1. PREPARACION DE LA MUESTRA (Norma Chimie Ministerio de Agricultura francs XIV-1) 1.1. Principio. Esta operacin consiste en la preparacin de la muestra de forma homognea y a la temperatura conveniente. 1.2. Modo operatorio. Vaciar la muestra al mximo posible, dentro de un vaso o de un mortero seco. Homogeneizar el producto por batido y si es fluido por transvasamientos sucesivos. Llevar a temperatura prxima a 20C. Efectuar rpidamente las tomas de ensayo necesarias para las diferentes determinaciones, recogiendo el producto con la ayuda de una esptula antes de cada extraccin. Reducir al mximo la exposicin de la muestra a la atmsfera ambiental. Transvasar el resto de la muestra a un recipiente hermticamente cerrado. Conservar a alrededor de 4C en previsin de otro anlisis posterior. 1.3. Caso particular de los yogurs de frutas. Verter la muestra sobre un colador metlico (abertura de mallas alrededor de 0,5 mm) con el fin de retener las frutas. Proseguir las operaciones como se ha indicado arriba. 2. DETERMINACION DEL CONTENIDO EN MATERIA GRASA (Mtodo Acido-Butiromtrico, Norma Chimie Ministerio de Agricultura francs XIV-3) 2.1. Objeto. Este mtodo describe la tcnica de determinacin del contenido en materia grasa de las leches fermentadas. La muestra se diluir bajo las condiciones que permitan expresar los resultados en porcentaje ponderal. 2.2. Principio. Separacin de la materia grasa de la muestra diluida, por centrifugacin en un butirmetro, seguido de ataque con cido sulfrico de los elementos de la leche, excepto la materia grasa. La separacin de sta se facilita por la adicin de una pequea cantidad de alcohol iso-amlico.

1.102 1.101

5.102 5.101

-Shigella/25 g ......

Estos valores son vlidos para determinaciones en medios slidos. Debido a la variabilidad de los resultados en medios lquidos, las tolerancias sern tres veces superiores. 9.2. Contaminantes.- Las tolerancias en residuos de plaguicidas y otros contaminantes en todos los ingredientes y en los productos terminados, no debern sobrepasar los lmites contenidos en la legislacin vigente y, en su defecto, en las Normas Internacionales aceptadas por el Estado espaol, que velar por su cumplimiento como garante de las mismas, con la determinacin y exigencia de responsabilidades en este punto por el rgano del Estado correspondiente. Se admitir la presencia de cido benzoico de origen natural y sus sales siempre que no exceda la cantidad de 50 ppm. NOTA: Los apartados 7. Materias primas y adiciones esenciales y facultativas, 8. Higiene, 10. Envasado, 11. Etiquetado y rotulacin, 12. Prohibiciones y 13. Responsabilidades, publicados en este mismo B.O.E., no se han incluido en esta recopilacin por carecer de inters analtico.

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2.3. Reactivos. 171010 Acido Sulfrico 90-91% segn Gerber RE 131074 Agua PA-ACS 171865 Alcohol iso-Amlico segn Gerber mezcla de ismeros RE 2.3.1. Acido Sulfrico 90-91% segn Gerber RE. 2.3.2. Alcohol iso-Amlico segn Gerber mezcla de ismeros RE (exento de furfural d ~ 0,811). 2.4. Aparatos. Material corriente de laboratorio y especialmente: 2.4.1. Butirmetro para leche 0-4%, norma NF B 35521 provisto de tapn apropiado. 2.4.2. Pipeta para leche de 11 ml de descarga nica, norma NF B 35523. 2.4.3. Medidor de cido sulfrico (descarga 10 ml) o pipeta de seguridad de 10 ml. 2.4.4. Medidor de alcohol iso-amlico (descarga 1 ml) o pipeta de seguridad de 1 ml. 2.4.5. Bao de agua a 65-70C para butirmetros. 2.4.6. Centrfuga elctrica para butirmetros de leche. Esta centrfuga estando enteramente cargada, debe alcanzar en dos minutos una velocidad tal que produzca una aceleracin radial en el extremo exterior del tapn del butirmetro de 350 50 veces a la aceleracin debida a la gravedad. Una aceleracin as, es producida, por ejemplo, por una centrfuga de dimetro 52 1 cm (distancia entre las extremidades exteriores de los tapones de los butirmetros opuestos diametralmente) operando a 1.100 50 revoluciones por minuto. La frmula para calcular otras combinaciones entre el dimetro y la velocidad es la siguiente: a = 11,81 x n2 x R a es la aceleracin radial, expresada en g, es decir en mltiplos de la aceleracin debida a la gravedad. n es el nmero de revoluciones por minuto dividido por 1.000. R es el radio expresado en centmetros. 2.5. Modo operatorio. 2.5.1. Preparacin de la muestra. Dentro de un frasco aforado (2.4.7.), pesar con precisin aproximada de 2 mg, alrededor de 50 g de muestra preparada segn se indica en 10.1. Completar a 100 ml con Agua PA-ACS. Agitar y proceder a transvasamientos sucesivos para obtener la solucin lo ms homognea posible. 2.5.2. Determinacin. 2.5.2.1. Preparacin del butirmetro: Introducir dentro del butirmetro (2.4.1.) 10 ml de Acido Sulfrico 90-91% segn Gerber RE (2.3.1.) evitando mojar el cuello.

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Aadir con pipeta (2.4.2.) 11 ml de la solucin obtenida en (2.5.1.) colocando la punta de la pipeta en contacto con la base del cuello del butirmetro y evitando la mezcla prematura de la leche con el cido. Verter sobre la superficie de la leche 1 ml de Alcohol iso-Amlico segn Gerber mezcla de ismeros RE (2.3.2.) teniendo cuidado de no mezclar los lquidos ni de mojar el cuello del butirmetro. Tapar el butirmetro. 2.5.2.2. Agitacin: Proceder a la agitacin hasta que la casena, que coagula en el momento en que la leche se mezcla con el cido, est enteramente disuelta. Dejar el butirmetro en la posicin que ocupaba antes de la agitacin y esperar que la mezcla rellene completamente el terminal de la ampolla; seguidamente proceder a dar la vuelta y esperar a que el terminal de la ampolla est enteramente vaco; proceder dos veces ms a estos rellenados y vaciados alternativos de la ampolla. Despus de estos seis cambios sucesivos de posicin del butirmetro, la agitacin es suficiente y la mezcla homognea. El butirmetro debe calentarse a alrededor de 80C para facilitar la mezcla del cido con la leche. Es necesario vigilar que no se produzca enfriamiento importante a causa de la agitacin por lo cual debe efectuarse sta lo ms rpidamente posible. 2.5.2.3. Centrifugacin: Inmediatamente despus de la agitacin precedente y sin dejar enfriar el butirmetro, procdase a la centrifugacin. Si por cualquier circunstancia debe de aplazarse el centrifugado, antes de proseguir es imprescindible colocar el butirmetro, durante 5 minutos como mnimo, en el bao de agua (2.4.5.) y secarlo antes de su colocacin en la centrfuga (2.4.6.). Al introducir el butirmetro en la centrfuga, ajustar el tapn de modo que antes de centrifugar, la columna de grasa se halle dentro de la escala graduada. La duracin efectiva del centrifugado debe ser de 5 minutos. 2.5.2.4. Lectura: Una vez terminado el centrifugado, colocar el butirmetro verticalmente, con el tapn abajo, dentro del bao de agua (2.4.5.) y dejarlo 5 minutos antes de proceder a la lectura. El nivel del agua debe cubrir la ampolla terminal del butirmetro. En el momento de introducir el butirmetro en el bao de agua, la columna de grasa debe localizarse exactamente dentro de la escala graduada. Si es preciso modifquese el ajuste del tapn hasta lograrlo. Efectuar la lectura rpidamente (en menos de 10 segundos) y bajo las siguientes condiciones: a) Sacar el butirmetro del bao de agua, asindolo por su parte ancha, envolverlo con un trapo, y secando rpidamente el tubo graduado.

M
b) Estando el butirmetro en posicin vertical, mover el tapn de tal forma que al examinar el plano inferior de la columna grasa, este plano coincida con una divisin. En principio es preferible hacer descender la columna grasa que no hacerla subir. Asegurarse de que no se ha proyectado materia grasa dentro de la ampolla terminal, en el curso de esta manipulacin. c) Obtenida esta coincidencia, asegurar la inmobilidad de la columna de grasa al propio tiempo que la del tapn. d) Desplazar el butirmetro a la altura del ojo y leer el nivel por la parte ms inferior del menisco superior de la columna de grasa; e) Verificar inmediatamente el plano de separacin inferior de la columna grasa para asegurar que no se ha movido. Si se ha desplazado, corregir la posicin moviendo adecuadamente el tapn. f) Releer de la misma manera el nivel del menisco superior. Si el plano inferior no se ha desplazado, esta segunda lectura debe coincidir con la primera. Si este segundo valor difiere del primero, verificar nuevamente la posicin del plano horizontal inferior y proceder a una tercera lectura. Es del todo necesario llegar a este resultado: dos lecturas consecutivas del menisco superior deben dar el mismo valor. Esto prueba la constancia de posicin del plano horizontal inferior. g) Si el resultado no se obtiene en 10 segundos, sumergir el butirmetro en el bao de agua y rehacer la lectura al cabo de 2 o 3 minutos. 2.6. Expresion de resultados. 2.6.1. Modo de clculo. El contenido en materia grasa del producto examinado, expresado en porcentaje en masa se obtiene aplicando la frmula: 100 (n' - n) M donde: n' representa el valor alcanzado por el nivel superior de la columna grasa. n representa el valor alcanzado por el nivel inferior de la columna grasa. M la masa en g del producto pesado en la operacin (2.5.1.) 2.6.2. Precisin. La desviacin mxima entre los resultados obtenidos de determinaciones paralelas efectuadas por dos operadores debe ser de 0,05 g por 100 g de producto. 3. DETERMINACION DE LA MATERIA SECA (Mtodo por secado, Norma Chimie Ministerio de Agricultura francs XIV-2) 3.1. Objeto. Este mtodo describe la tcnica de determinacin de materia seca en las leches fermentadas. 3.2. Principio. Desecacin a 103 2C y pesado del residuo. 3.3. Reactivos. 131019 Acido Clorhdrico 35% PA-ISO 131074 Agua PA-ACS 211160 Arena de mar lavada, grano fino QP 211335 Gel de Slice 3-6 mm con indicador QP 3.3.1. Purificar la Arena de mar lavada, grano fino QP con Acido Clorhdrico diluido a 25%, lavado con Agua PA-ACS y calcinar a alrededor de 500C. La arena debe atravesar el tamiz AFNOR n. 28 y ser retenida por el tamiz AFNOR n. 23. NOTA: Tamiz AFNOR n. 28 equivale a 0,500 mm interior malla. Tamiz AFNOR n. 23 equivale a 0,160 mm interior malla. 3.4. Aparatos. 3.4.1. Balanza analtica. 3.4.2. Estufa provista de ventilacin y de sistema de regulacin termosttica que permita obtener una temperatura de 103 2C en todos los puntos de su interior. 3.4.3. Desecador provisto de deshidratante eficaz (Gel de Slice 3-6 mm con indicador QP). 3.4.4. Cpsulas cilndricas de metal inoxidable o de vidrio, de alrededor 25 mm de altura. 3.4.5. Varilla de vidrio con una extremidad aplastada, cuya longitud no debe sobrepasar en ms de 1 cm el dimetro de la cpsula. 3.5. Modo operatorio. 3.5.1. En la cpsula (3.4.4.) introducir 20 g de arena lavada y una varilla de vidrio. 3.5.2. Colocar en la estufa durante 1 hora. 3.5.3. Dejar enfriar en el desecador y pesar. 3.5.4. Introducir rpidamente dentro de la cpsula alrededor de 5 g, pesados con precisin de 1 mg, de muestra preparada segn (1.). 3.5.5. Mezclar cuidadosa e ntimamente la toma de ensayo y la arena con la ayuda de la varilla de vidrio. 3.5.6. Colocar la cpsula en la estufa durante 5 horas. 3.5.7. Dejar enfriar en el desecador y pesar. 3.5.8. Repetir este secado a periodos de 1 hora hasta peso constante (las desviaciones no deben sobrepasar los 2 mg).

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En caso de aumento de peso, tomar para el clculo el peso ms bajo obtenido. En la prctica, un solo secado de 15 horas en la estufa, proporciona los mismos resultados. 3.6. Expresin de resultados. 3.6.1. Modo de clculo. La materia seca expresada en porcentaje en peso, se obtiene por la frmula siguiente: 100 (M - m) E donde: M representa la masa en gramos de la cpsula y de su contenido despus de la operacin (3.5.8.). m representa la masa en gramos de la cpsula y de su contenido despus de la operacin (3.5.3.). E representa la masa en gramos de la muestra. 3.6.2. Precisin. La prdida mxima entre las determinaciones paralelas efectuadas por dos operadores distintos, debe ser de 0,3 g por 100 g de muestra. 4. IDENTIFICACION DE COLORANTES, EDULCORANTES, ESPESANTES Y CONSERVADORES Mtodos seleccionados y recomendados por el Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin. 5. ANALISIS MICROBIOLOGICO - Recuento de coliformes - Escherichia coli - Estafilococos aureus - Estreptococos D. de Lancefield - Grmenes sulfito-reductores (Cl. Perfringens) - Hongos - Examen al microscopio Mtodos seleccionados y recomendados por el Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin.

6.2. Material y aparatos. 6.2.1. Centrfuga que alcance 3.000 r.p.m. 6.2.2. Aparato de destilacin. 6.3. Reactivos. 131058 Acido Sulfrico 96% PA-ISO 131074 Agua PA-ACS 132770 Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS 131687 Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO 6.3.1. Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS. 6.3.2. Sodio Hidrxido solucin 1%. Disolver Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO en Agua PA-ACS y diluir hasta 1%. 6.3.3. Acido Sulfrico solucin 1%. Diluir Acido Sulfrico 96% PA-ISO con Agua PA-ACS hasta 5%. 6.4. Procedimiento. Pesar 50 g de la muestra, reducida a polvo, si es necesario, y llevar a un matraz erlenmeyer de 250 ml de capacidad. Aadir 50 ml de Eter Ditlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS. Agitar suavemente durante 3 a 5 minutos. Centrifugar la mezcla as obtenida a 1.5002.000 r.p.m. durante diez minutos. Recoger el lquido sobrenadante. Volver a emulsionar el sedimento con nueva aportacin de Eter Ditlico estabilizado con ~6 ppm de BHT PA-ACS, agitando durante dos-tres minutos. Centrifugar en las mismas condiciones y recoger el sobrenadante aadindolo a la centrifugacin anterior. Repetir esta operacin por tercera vez. Reunir todas las porciones de extracto etreo y destilar para eliminar el ter, tomando las precauciones habituales en este tipo de destilacin. Queda un residuo graso abundante. Aadir al residuo graso solucin acuosa de Sodio Hidrxido solucin 1%. Agitar suavemente durante 2-3 minutos. Si es necesario, calentando suavemente. Centrifugar la emulsin obtenida a 2.000-3.000 r.p.m. durante cinco minutos. Eliminar la capa superior grasa y tomar la fraccin acuosa inferior. Cuando el producto contenga Fenolftalena, la capa acuosa presenta una coloracin rojo-rosada que desaparece al acidificar con Acido Sulfrico solucin 5% y vuelve a reaparecer si se alcaliniza el medio.

6. FENOLFTALEINA (Mtodo cualitativo)

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6.1. Principio. Extraccin y concentracin de la fenolftalena presente en el alimento e identificacin por viraje a color rojo en medio alcalino que desaparece en medio cido. La separacin y concentracin de la fenolftalena se realiza por extraccin etrea y soluciones alcalinas.

Cuajada

ORDEN DE 14 DE JUNIO DE 1983 POR LA QUE SE APRUEBA LA NORMA DE CALIDAD PARA LA CUAJADA EN EL MERCADO INTERIOR. Excelentsimos seores: De acuerdo con lo dispuesto en el Decreto 1043/1973, de 17 de mayo, por el que se regula la normalizacin de productos ganaderos en el mercado interior, y teniendo en cuenta los Decretos 2484/1967, de 21 de septiembre, por el que se aprueba el texto del Cdigo Alimentario Espaol, y el 2519/1974, de 9 de agosto, sobre su entrada en vigor, aplicacin y desarrollo, parece oportuno dictar la presente norma de calidad, aprobada por la Comisin Especializada de Normalizacin de Productos Ganaderos, visto el informe de la Comisin Interministerial para la Ordenacin Alimentaria y de conformidad con los acuerdos del FORPPA. En su virtud, a propuesta de los Ministros de Agricultura, Pesca y Alimentacin, de Economa y Hacienda y de Sanidad y Consumo, esta Presidencia del Gobierno dispone: Primero.- Se aprueba la Norma de Calidad para la Cuajada en el mercado interior que figura en el anejo nico de esta Orden. Segundo.- La toma de muestras, as como las determinaciones analticas, se realizarn de acuerdo con los mtodos oficiales vigentes. Tercero.- La presente Orden entrar en vigor en todo el territorio nacional al ao de su publicacin en el "Boletn Oficial del Estado". Cuarto.- Los departamentos competentes velarn por el cumplimiento de lo dispuesto en la presente Orden a travs de sus rganos administrativos encargados, que coordinarn sus actuaciones, en todo caso, sin perjuicio de las competencias que correspondan a las Comunidades Autnomas y a las Corporaciones Locales. Lo que comunico a VV. EE. para su conocimiento y efectos. Dios guarde a VV. EE. muchos aos. Madrid, 14 de junio de 1983. MOSCOSO
DEL

2. OBJETO DE LA NORMA Esta Norma tiene por objeto definir las condiciones y caractersticas que debe reunir el producto cuajada para su adecuada comercializacin y consumo en el mercado interior. 3. AMBITO DE APLICACION La presente Norma se aplicar a la cuajada destinada a su comercializacin en el mercado interior. 4. DEFINICION Se entiende por cuajada el producto semislido obtenido de la leche sometida a tratamiento trmico adecuado para conseguir las caractersticas bacteriolgicas que se fijan posteriormente, entera o desnatada total o parcialmente, coagulada por la accin del cuajo u otros enzimas coagulantes autorizados, sin adicin de fermentos lcticos y sin proceso de desuerado. 5. DENOMINACIONES 5.1. En la denominacin, despus de la palabra "cuajada" debera figurar la indicacin de la especie o especies animales de las que proceda la leche empleada por orden descendente de proporciones, en caracteres perfectamente claros y legibles. 5.2. Segn el contenido en materia grasa, expresado en porcentaje en masa de la materia grasa sobre la masa del producto final, las cuajadas se denominarn: - Extragrasa: La que contenga ms del 5,5% de materia grasa. - Grasa: La que contenga ms del 3,5% y un mximo del 5,5% de materia grasa. - Magra: La que contenga ms del 1,5% y un mximo del 3,5% de materia grasa. - Desnatada: La que contenga un mximo del 1,5% de materia grasa. 6. FACTORES ESENCIALES DE COMPOSICION Y CALIDAD 6.1. Ingredientes esenciales: Uno.- Leche pasterizada o U.H.T. entera, semidesnatada o desnatada concentrada o no de oveja, cabra, vaca o sus mezclas. Dos.- Cuajo animal o coagulante vegetal. 6.2. Ingredientes facultativos: 6.2.1. Leche en polvo entera, semidesnatada o desnatada en cantidad que permita ajustar el extracto seco total.

PRADO

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Excmos. Sres. Ministros de Agricultura, Pesca y Alimentacin, de Economa y Hacienda y de Sanidad y Consumo. ANEJO UNICO Norma de Calidad para la Cuajada 1. NOMBRE DE LA NORMA Norma de Calidad para la Cuajada.

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6.2.2. Nata, para poder satisfacer los requisitos del contenido en materia grasa. 6.2.3. Gelatina, en dosis mxima de 7 g por kilogramo de cuajada. 6.3. Extracto seco total mnimo: 15% expresado en masa/masa sobre el producto terminado. 6.4 Indices. Las caractersticas fisicoqumicas de la grasa estarn comprendidas entre los siguientes valores: 6.4.1. Para la cuajada de vaca: Indice de refraccin a 40C: De 1,4540 a 1,4557. Indice de Reichert: De 26 a 32. Indice de Polenske: De 1 a 4. Indice de Kirchner: De 19 a 27. 6.4.2. Para la cuajada de cabra: Indice de refraccin a 40C: De 1,4520 a 1,4545. Indice de Reichert: De 21 a 28. Indice de Polenske: De 5 a 9. Indice de Kirchner: De 14 a 21. 6.4.3. Para la cuajada de oveja: Indice de refraccin a 40C: De 1,4530 a 1,4557. Indice de Reichert: De 26 a 32. Indice de Polenske: De 5 a 8. Indice de Kirchner: De 19 a 27. 8.2. Criterios aplicables a contaminantes y sustancias txicas. La tolerancia de productos contaminantes y sustancias txicas no debern sobrepasar los contenidos en la legislacin vigente y, en su defecto, los contenidos en las normas internacionales aceptadas por el Estado espaol. NOTA: Los apartados, 7. Aditivos autorizados, 9. Prohibiciones, 10. Higiene, 11. Envasado, 12. Etiquetado y rotulacin y 13. Responsabilidades, publicados en este mismo B.O.E., no se han incluido en esta recopilacin por carecer de inters analtico.

Para la cuajada de vaca, cabra y oveja el lmite mnimo de colesterol, dentro de los esteroles, ser de un 98%. 8. CONTAMINANTES Los siguientes niveles de contaminacin relativos a la higiene alimentaria de estos productos han sido sancionados por la Subsecretara para la Sanidad del Ministerio de Sanidad y Consumo. En virtud del artculo 14 del Real Decreto 3302/1978, de 22 de diciembre, dicha Subsecretara para la Sanidad podr modificar en cualquier momento la presente relacin de contaminantes mediante Resolucin. 8.1. Normas microbiolgicas aplicables a cuajadas. Recuento de colonias aerobias mesfilas (30 1C), mximo 1 x 105 col./g. Enterobacteriaceae, mximo: 1 x 10 2 col./g. Escherichia coli, mximo: 1 x 10 1 col./g. Salmonella-Shigella: Ausencia col./25 g. Staphylococcus aureus enterotoxignico, mximo: 1 x 102 col./g.

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Nata

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ORDEN DE 12 DE JULIO DE 1983 POR LA QUE SE APRUEBAN LAS NORMAS GENERALES DE CALIDAD PARA LA NATA Y NATA EN POLVO CON DESTINO AL MERCADO INTERIOR. Excelentsimos seores: De conformidad con lo dispuesto en el Decreto 1043/1973, de 17 de mayo, por el que se regula la normalizacin de productos ganaderos en el mercado exterior, y teniendo en cuenta los Decretos de Presidencia del Gobierno 2484/1967, de 21 de septiembre, por el que se aprueba el texto del Cdigo Alimentario Espaol, y el 2519/1974, de 9 de agosto, sobre su aplicacin, desarrollo y entrada en vigor, parece oportuno dictar las presentes normas de calidad, visto el informe de la Comisin Interministerial para la Ordenacin alimentaria y de conformidad con los acuerdos del FORPPA. En su virtud, a propuesta de los Ministros de Agricultura, Pesca y Alimentacin, de Economa y Hacienda y de Sanidad y Consumo, esta Presidencia del Gobierno dispone: Primero.- Se aprueban las Normas Generales de Calidad para la nata y nata en polvo con destino al mercado interior, recogidas, respectivamente, en los anejos 1 y 2 de esta Orden. Segundo.- La toma de muestras, as como las determinaciones analticas, se realizarn de acuerdo con los mtodos oficiales vigentes. Tercero.- Los departamentos competentes velarn por el cumplimiento de lo dispuesto en la presente Orden a travs de sus rganos administrativos encargados, que coordinarn sus actuaciones; en todo caso, sin perjuicio de las competencias que correspondan a las Comunidades Autnomas y a las Corporaciones Locales. Cuarto.- Las presentes Normas entrarn en vigor en todo el territorio del Estado espaol a los doce meses de su publicacin en el "Boletn Oficial del Estado", excepto lo dispuesto en los apartados 12. "Etiquetado y rotulacin" de las mismas, que lo harn en las fechas previstas para el ttulo IV del Real Decreto 2058/1982, de 12 de agosto, por el que se aprueba la Norma General de Etiquetado, Presentacin y Publicidad de los Productos Alimenticios Envasados. Quinto.- A la entrada en vigor de las presentes normas quedan derogadas cuantas disposiciones de igual o inferior rango se opongan a la presente Orden en los aspectos que regula. Lo que comunico a VV. EE. para su conocimiento y efectos. Dios guarde a VV. EE. muchos aos. Madrid, 12 de julio de 1983. MOSCOSO
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Excmos. Sres. Ministros de Agricultura, Pesca y Alimentacin, de Economa y Hacienda y de Sanidad y Consumo. ANEJO 1 Norma General de Calidad para la Nata 1. NOMBRE DE LA NORMA Norma General de Calidad para la Nata. 2. OBJETO DE LA NORMA La presente Norma tiene por objeto definir aquellas condiciones y caractersticas que debe reunir la nata para su comercializacin y consumo en el mercado interior. 3. AMBITO DE APLICACION La presente Norma General abarca a la nata destinada a su comercializacin en el mercado interior, con excepcin de la nata en polvo. 4. DEFINICION Se entiende por nata en general al producto lcteo rico en materia grasa separado de las leches de las especies animales a que luego se alude, que toma la forma de una emulsin del tipo grasa en agua. La nata se elaborar con leche procedente de animales que no padezcan procesos infecciosos peligrosos para la salud pblica y forzosamente habr de ser sometida a un tratamiento que asegure la destruccin de los grmenes patgenos. 5. DENOMINACIONES 5.1. Por su origen. 5.1.1. Nata o nata de vaca: cuando proceda exclusivamente de leche de vaca. 5.1.2. La nata que se fabrique con leche de oveja, leche de cabra o mezcla de ambas entre s y con la de vaca, deber incluir en su denominacin, despus de la palabra "nata", la indicacin de la especie o especies animales de las que proceda la leche empleada por orden descendente de proporciones en caracteres claros y legibles. 5.2. Por su composicin. Segn el contenido en materia grasa, expresado en porcentaje en masa de materia grasa sobre masa del producto final, las natas se denominarn:

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PRADO

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5.2.1. Doble nata: La que contenga un mnimo de materia grasa del 50%. 5.2.2. Nata: La que contenga un mnimo de materia grasa del 30% y menos del 50%. 5.2.3. Nata delgada o ligera: La que contenga un mnimo de materia grasa del 12% y menos del 30%. Cuando la nata contenga productos aadidos autorizados, la determinacin del porcentaje de materia grasa se efectuar sobre la parte lctea, descontando dichos aadidos. 5.3. Por su tratamiento higinico y conservacin. 5.3.1. Nata pasterizada: Se entiende por nata pasterizada la sometida a un tratamiento trmico en condiciones tales de temperatura y tiempo que aseguren la total destruccin de los grmenes patgenos y la casi totalidad de la flora banal sin modificacin sensible de su naturaleza fisicoqumica y cualidades nutritivas. El tratamiento trmico para la nata delgada o ligera se realizar a los mnimos de 75C durante quince segundos y mximo de 80C, y para los dems tipos, a los mnimos de 80C, durante quince segundos y mximo de 85C. No obstante, estas relaciones de temperatura y tiempo no excluyen otras que demuestren ser igualmente eficaces para el cumplimiento del apartado 8.1. de esta norma ni otros procesos de pasterizacin previamente autorizados por los Ministerios de Agricultura, Pesca y Alimentacin y de Sanidad y Consumo. 5.3.2. Nata esterilizada. Se entiende por nata esterilizada la sometida en el mismo envase en que se suministra al consumidor a tratamiento trmico que asegure la destruccin de los grmenes y la inactividad de sus formas de resistencia. El tratamiento trmico se realizar a los mnimos: 108C ................ 114C ................ 116C ................ 45 minutos 25 " 20 "

No obstante, esta relacin de temperatura y tiempo no excluye otras que demuestren ser igualmente eficaces para el cumplimiento del apartado 8.1. de esta norma ni otros procedimientos previamente autorizados por los Ministerios de Agricultura, Pesca y Alimentacin y de Sanidad y Consumo. 5.3.4. Nata pasterizada envasada bajo presin: Es la nata pasterizada envasada y acondicionada bajo presin de gases inertes para su venta en recipientes estancos. 5.3.5. Nata esterilizada envasada bajo presin: Es la nata esterilizada envasada y acondicionada bajo presin de gases inertes para su venta en recipientes estancos. 5.3.6. Nata UHT envasada bajo presin: Es la nata UHT envasada bajo presin de gases inertes para su venta en recipientes estancos. 5.3.7. Nata congelada: Es la nata pasterizada y envasada, azucarada o no, sometida a un proceso rpido de congelacin que permita alcanzar al menos -18C en el centro de su masa. Su almacenamiento y transporte deber hacerse a temperatura no superior a -15C. 5.4. Nata homogeneizada. Cualquiera de las natas anteriores sometidas a un proceso mecnico que subdivida los glbulos grasos y asegure una mejor emulsin. 5.5. Por distintas incorporaciones. Todos los tipos de nata que se relacionan a continuacin habrn de ser sometidos a algunos de los tratamientos contemplados en el apartado 5.3. de esta norma, sean o no homogeneizados. 5.5.1. Batida o montada: Con adicin de aire o gases inocuos. 5.5.2. Para batir o montar: La acondicionada para tal fin. 5.5.3. Azucarada: Con adicin de azcares. 5.5.4. Aromatizada: Con adicin de aromas. 5.5.5. Con frutas u otros alimentos naturales. 5.5.6. Acida o acidificada: la acidificada por adicin de fermentos lcticos. 6. FACTORES ESENCIALES DE COMPOSICION Y CALIDAD 6.1. Ingredientes esenciales. Leche de vaca, oveja o cabra o sus mezclas. 6.2. Ingredientes facultativos. 6.2.1. Sacarosa y/o glucosa en proporcin total no superior al 15% en masa con respecto al producto terminado, en las natas azucaradas. 6.2.2. Sustancias aromticas naturales o idnticas naturales en las natas aromatizadas. 6.2.3. Frutas y otros alimentos naturales.

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No obstante, estas relaciones de temperatura y tiempo no excluyen otras que demuestren ser igualmente eficaces para cumplir el apartado 8.1. de esta norma ni otros procedimientos de esterilizacin previamente autorizados por los Ministerios de Agricultura, Pesca y Alimentacin y de Sanidad y Consumo. 5.3.3. Nata UHT: Se entiende por nata UHT la sometida, en circulacin continua, a tratamiento trmico que asegure la destruccin de los grmenes y la inactivacin de sus formas de resistencia, siendo posteriormente envasada en condiciones aspticas. El tratamiento trmico se realizar a los mnimos de 132C durante dos segundos.

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6.3. Caractersticas fisicoqumicas. 6.3.1. Organolpticas: La nata dispuesta para su venta deber presentar las siguientes caractersticas: Consistencia lquida ms o menos viscosa, excepto la "nata batida" o "montada" que presentar consistencia semislida. Color blanco amarillento. Sabor u olor caractersticos. 6.3.2. Intrnsecas. Contenido mnimo en materia grasa de leche, 12%. La composicin del extracto seco de la fraccin no grasa de las distintas natas, descontando el correspondiente al de los ingredientes facultativos y aditivos aadidos, ser la misma que la del extracto seco magro de la leche natural de partida. Acidez, expresada en peso de cido lctico por 100 de nata en volumen de la parte no grasa, 0,25% como mximo, excepto para la nata acidificada, que podr ser del 0,65% como mximo. Impurezas macroscpicas, grado 0. Las caractersticas fisicoqumicas de la grasa estarn comprendidas entre los siguientes valores: a) Para la nata de vaca: Indice de refraccin a 40C: De 1,4540 a 1,4557. Indice de Reichert: De 26 a 32. Indice de Polenske: De 1 a 4. Indice de Kirchner: De 19 a 27. b) Para la nata de oveja: Indice de refraccin a 40C: De 1,4530 a 1,4557. Indice de Reichert: De 26 a 32. Indice de Polenske: De 5 a 8. Indice de Kirchner: De 19 a 27. c) Para la nata de cabra: Indice de refraccin a 40C: De 1,4520 a 1,4545. Indice de Reichert: De 21 a 28. Indice de Polenske: De 5 a 9. Indice de Kirchner: De 14 a 21. Tanto para la nata de vaca como para las de oveja y cabra el lmite mnimo de colesterol, dentro de los esteroles, ser del 98% de la fraccin esterlica del insaponificable, determinados por cromatografa gaseosa. 8. NORMA MICROBIOLOGICA Y CONTAMINANTES 8.1. Norma microbiolgica. Las siguientes normas microbiolgicas, relativas a la higiene alimentaria de estos productos, han sido aprobadas por la Subsecretara de Sanidad del Ministerio de Sanidad y Consumo. En virtud del artculo 14 del Real Decreto 3302/1978, de 22 de diciembre, dicha Subsecretara podr, atendiendo a motivaciones de salud pblica, modificar en cualquier momento la presente relacin, mediante la Resolucin correspondiente. a) Criterio microbiolgico para natas pasterizadas. Recuento de colonias aerobias: Mesfilas (311C): Mximo 1 x 10 5 colonias/g. Enterobacteriaceae totales: Mximo 1 x 10 1 colonias/g. Escherichia coli: Ausencia/g. Salmonella-Shigella: Ausencia/25 g. St. aureus enterotoxignico: Mximo 1 x 10 1/g. Otros grmenes patgenos: Ausencia. Prueba de la fosfatasa: Negativa. Adems, el producto deber estar exento de toxinas microbianas peligrosas. b) Criterio microbiolgico para natas esterilizadas. No debe haber ningn crecimiento microbiano despus de ser sometido el producto a pruebas de preincubacin a 311C y 55C durante setenta y dos horas. 8.2. Contaminantes. La tolerancia de productos contaminantes y sustancias txicas no deber sobrepasar los contenidos en la legislacin vigente, y en su defecto, los contenidos en las normas internacionales aceptadas por el Estado espaol. NOTA: Los apartados, 7. Aditivos autorizados, 9. Prohibiciones, 10. Higiene, 11. Envasado, 12. Etiquetado y Rotulacin, 13. Pas de origen y 14. Responsabilidades, publicados en este mismo B.O.E., no se han incluido en esta recopilacin por carecer de inters analtico. ANEJO 2 NORMA GENERAL DE CALIDAD DE LA NATA EN POLVO 1. NOMBRE DE LA NORMA Norma General de Calidad de la Nata en Polvo. 2. OBJETO DE LA NORMA La presente Norma tiene por objeto definir aquellas condiciones y caractersticas que debe reunir la nata en polvo para su comercializacin y consumo en el mercado interior.

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3. AMBITO DE APLICACION La presente Norma General abarca a la nata en polvo destinada a su comercializacin en el mercado interior. 4. DEFINICION Se entiende por nata en polvo el producto seco y pulverulento que se obtiene mediante la deshidratacin de la nata, pasterizada al estado lquido, antes o durante el proceso de fabricacin. 5. DENOMINACIONES 5.1. Por su origen. 5.1.1. Nata en polvo o nata en polvo de vaca: Cuando procede exclusivamente de leche de vaca. 5.1.2. La nata en polvo que se fabrique con leche de oveja, leche de cabra, o mezcla de ambas entre s y con la de vaca, deber incluir en su denominacin, despus de la palabra "nata", la indicacin de la especie o especies animales de las que procede la leche empleada por orden descendente de proporciones, en caracteres claros y legibles. 5.2. Por su composicin. Segn el contenido de materia grasa, expresado en porcentaje en masa de materia grasa sobre masa del producto final, las natas se denominarn: 5.2.1. Nata en polvo: La que contenga un mnimo de materia grasa de la leche del 65% y un mximo de agua del 5%. 5.2.2. Nata delgada o ligera en polvo: La que contenga un mnimo de materia grasa de la leche del 50% y menos del 65%, as como un contenido mximo de agua del 5%. 6. FACTORES ESENCIALES DE COMPOSICION Y CALIDAD 6.1. Ingredientes esenciales. Nata de vaca, oveja, cabra o sus mezclas. 6.2. Caractersticas fisicoqumicas: 6.2.1. Organolpticas: La nata en polvo dispuesta para su venta deber presentar las siguientes caractersticas: Consistencia pulverulenta. Color blanco amarillento. 6.2.2. Intrnsecas: Contenido mnimo de materia grasa de la leche, 50%. La naturaleza del extracto seco de la fraccin no grasa de la nata en polvo, descontando el

correspondiente al de los aditivos aadidos, ser idntica a la del extracto seco magro de la leche desnatada en polvo. La acidez mxima, expresada en gramos de cido lctico por 100 gramos, vendr dada por la frmula 1,874-0,0163 G, en la que G representa el porcentaje de grasa. Impurezas macroscpicas: Ausencia. Las caractersticas fisicoqumicas de la grasa estarn comprendidas entre los siguientes valores: a) Para la nata en polvo de vaca:

Indice de refraccin a 40C: De 1,4540 a 1,4557.

Indice de Reichert: De 26 a 32. Indice de Polenske: De 1 a 4. Indice de Kirchner: De 19 a 27. b) Para la nata en polvo de cabra: Indice de refraccin a 40C: De 1,4520 a 1,4545. Indice de Reichert: De 21 a 28. Indice de Polenske: De 5 a 9. Indice de Kirchner: De 14 a 21. c) Para la nata en polvo de oveja: Indice de refraccin a 40C: De 1,4530 a 1,4557. Indice de Reichert: De 26 a 32. Indice de Polenske: De 5 a 8. Indice de Kirchner: De 19 a 27. Tanto para la nata en polvo de vaca como para las de cabra y oveja el lmite mnimo de colesterol de los esteroles ser del 98% de la fraccin esterlica del insaponificable determinados por cromatografa gaseosa. 8. NORMA MICROBIOLOGICA Y CONTAMINANTES 8.1. Norma microbiolgica. Las siguientes norma microbiolgica, relativa a la higiene alimentaria de este productos, ha sido sancionada por la Subsecretara de Sanidad, del Ministerio de Sanidad y Consumo. En virtud del artculo 14 del Real Decreto 3302/78, de 22 de diciembre, dicha Subsecretara podr, atendiendo a motivaciones de salud pblica, modificar en cualquier momento la presente Norma mediante la Resolucin correspondiente. Norma microbiolgica aplicable a la nata en polvo: Recuento de colonias aerobias mesfilas 31 1C: Mximo 1.105 colonias/g. Enterobacteriaceae totales: Mximo 1.101 colonias/g. Eschericchia coli: Ausencia/g. St. aureus enterotoxignico: Mximo 1.10 1 colonias/g. Salmonella-Shigella: Ausencia/25 g.

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Otros grmenes patgenos: Ausencia. Prueba de la fosfatasa: Negativa. 8.2. Contaminantes. Las tolerancias de productos contaminantes y sustancias txicas no debern sobrepasar las contenidas en la legislacin vigente, y en su defecto, las contenidas en las normas internacionales aceptadas por el Estado espaol. NOTA: Los apartados, 7. Aditivos autorizados, 9. Prohibiciones, 10. Higiene, 11. Envasado, 12. Etiquetado y Rotulacin, 13. Pas de origen y 14. Responsabilidades, publicados en este mismo B.O.E., no se han incluido en esta recopilacin por carecer de inters analtico.

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Relacin de reactivos y productos auxiliares que se utilizan en los mtodos analticos, Leche y Productos Lcteos

NOTA: Algunos de los reactivos recomendados en los mtodos analticos previamente descritos han modificado su cdigo y mejorado su calidad. Adems se han producido nuevas incorporaciones. Por favor, consulte este anexo antes de efectuar su pedido. Es la versin actualizada de la oferta de productos suministrables en Mayo de 1999.

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REACTIVOS Y PRODUCTOS AUXILIARES QUE HAN CAMBIADO DE CDIGO ANTERIOR 172222 171010 253309 171865 171096 131129 171165 171168 251274 131086 131085 171327 132062 172430 132006 171498 131512 131509 131515 171617 171634 171674 131638 132823 131788 Acido Brico 4% RE Acido Slfurico 90-91% segn Gerber RE Acrilamida DC Alcohol iso-Amlico segn Gerber mezcla de ismeros RE Almidn soluble RE Amonaco 25% (en NH3) PA Azul de Bromofenol RE-ACS Azul de Bromotimol solucin 0,04% RE Colesterol DC Etanol absoluto PA Etanol 96% v/v PA Fenolftalena solucin 1% RE n-Heptano PA Indicador mixto (Rojo de Metilo-Azul de Metileno) RV n-Pentano PA Potasio Dicromato solucin 5% p/v RE di-Potasio Hidrgeno Fosfato anhidro PA Potasio di-Hidrgeno Fosfato PA Potasio Hidrxido 85% lentejas PA Rojo de Metilo (C.I. 13020) RE-ACS Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RE di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato RE Sodio Hidrgeno Carbonato PA Sulfanilamida PA Zinc Sulfato 1-hidrato PA ACTUAL 282222 Acido Brico solucin 4% RV 121010 Acido Slfurico 90-91% segn Gerber PA 373309 Acrilamida PB 121079 121096 121129 131165 281168 371274 121086 121085 281327 122062 282430 122006 281498 121512 121509 121515 131617 281634 121674 121638 122823 121788 3-Metil-1-Butanol segn Gerber PA Almidn de Patata soluble PA Amonaco 25% (en NH3) Azul de Bromofenol PA-ACS Azul de Bromotimol solucin 0,04% RV Colesterol PB Etanol absoluto PA Etanol 96% v/v PA Fenolftalena solucin 1% RV n-Heptano Indicador mixto (Rojo de Metilo-Azul de Metileno) RV n-Pentano PA Potasio Dicromato solucin 5% p/v RV di-Potasio Hidrgeno Fosfato anhidro PA Potasio di-Hidrgeno Fosfato PA Potasio Hidrxido 85% lentejas PA Rojo de Metilo (C.I. 13020) PA-ACS Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RV di-Sodio Fenilfosfato 2-hidrato PA Sodio Hidrgneo Carbonato PA Sulfanilamida PA Zinc Sulfato 1-hidrato PA

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131007 131881 131008 181009 131015 282222 131020 131019 181023 181021 182108 131669

131032 131036 132175 132838 131058 121010 181059 182105 131067 252373 373309 131074 212236 121079 121096 121129 131368 131134 131136

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131138 131147 211160 211161

ACETONA PA-ACS-ISO ACETONITRILO PA-ACS ACIDO ACETICO GLACIAL PA-ACS-ISO ACIDO ACETICO 1 mol/l (1N) SV ACIDO ACETICO 2 mol/l (2N) ACIDO BORICO PA-ACS-ISO ACIDO BORICO solucin 4% RV ACIDO CLORHIDRICO 37% PA-ACS-ISO ACIDO CLORHIDRICO 35% PA-ISO ACIDO CLORHIDRICO 0,1 mol/l (0,1N) SV ACIDO CLORHIDRICO 1 mol/l (1N) SV ACIDO CLORHIDRICO 2 mol/l (2N) SV ACIDO ETILENDIAMINOTETRAACETICO SAL DISODICA 2-hidrato PA-ACS ACIDO ORTO-FOSFORICO 85% PA-ACS-ISO ACIDO NITRICO 60% PA-ISO ACIDO PERCLORICO 70% PA-ACS-ISO ACIDO 5-SULFOSALICILICO 2-hidrato PA-ACS ACIDO SULFURICO 96% PA-ISO ACIDO SULFURICO 90-91% segn Gerber PA ACIDO SULFURICO 0,5 mol/l (1N) SV ACIDO SULFURICO 1 mol/l (2N) SV ACIDO TRICLOROACETICO PA-ACS ACIDO TRICLOROACETICO solucin 20% p/v DC ACRILAMIDA PB AGUA PA-ACS AGUA DESIONIZADA QP 3-METIL-1-BUTANOL segn Gerber PA ALMIDON DE PATATA SOLUBLE PA PA AMONIACO 25% (en NH3) AMONIO HIERRO (II) SULFATO 6-hidrato PA-ISO AMONIO MOLIBDATO 4-hidrato PA-ACS-ISO di-AMONIO OXALATO 1-hidrato PA-ACS AMONIO PEROXODISULFATO PA-ACS ANHIDRIDO ACETICO PA-ACS-ISO ARENA DE MAR lavada, grano fino QP ARENA DE MAR lavada, grano grueso QP

131165 281168 254932

251170 131188 131082 141206 141219 142400 142323 131270 371274 A17697 A12207 A16044 131785 121086 121085 132770 131315 134852 144852

131325 281327

141956 211335 141339 131340 122062 131350 141076 A10817

AZUL DE BROMOFENOL PA-ACS AZUL DE BROMOTIMOL solucin 0,04% RV AZUL BRILLANTE COOMASSIE R-250 (C.I. 42660) DC AZUL COOMASSIE G-250 AZUL DE METILENO (C.I. 52015) DC BARIO HIDROXIDO 8-hidrato PA-ACS-ISO 1-BUTANOL PA-ACS-ISO CADMIO METAL, lminas PRS CALCIO CLORURO ANHIDRO escoriforme PRS CALCIO HIDROXIDO, polvo (RFE, USP, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX CLORAMINA T 3-hidrato (RFE, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX COBRE (II) SULFATO 5-hidrato PA-ACS-ISO COLESTEROL PB CUAJO DE TITULO 1/10.000 2,4 - DIAMINOFENOL DICLORHIDRATO, 98% 2,6 - DIBROMOQUINONA4- CLORIMIDA, 98% DIGITONINA N,N-DIMETILFORMAMIDA PA-ACS-ISO ETANOL ABSOLUTO PA ETANOL 96% v/v PA ETER DIETILICO ESTABILIZADO con ~6 ppm de BHT PA-ACS-ISO ETER DE PETROLEO 40-60C PA-ISO FENOL CRISTALIZADO (cristales sueltos) PA-ACS FENOL CRISTALIZADO (critales sueltos) (RFE, USP, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX FENOLFTALEINA PA-ACS FENOLFTALEINA solucin 1% RV FITOSTEROL DE ACEITE DE COLZA FITOSTEROL DE ACEITE DE SOJA FORMAMIDA PRS GEL DE SILICE 3-6 mm con indicador QP GLICERINA (RFE, USP, BP, Ph. Eur.) PRS-CODEX GLICINA PA-ACS n-HEPTANO PA HIDRACINIO SULFATO PA-ACS HIDROGENO PEROXIDO 30% p/v (100 vol.) estabillizado PRS 4-HIDROXIBIFENILO, 98%

M
141358 282430 HIERRO (III) CLORURO 6-hidrato trozos PRS INDICADOR MIXTO (ROJO DE METILO-AZUL DE METILENO) RV LIQUIDO DE LUGOL DC ACIDO LACTICO, SAL DE LITIO, 99% MERCURIO (II) OXIDO rojo PRS METANOL PA-ACS-ISO METILENBISACRILAMIDA N-(1-NAFTIL) ETILENDIAMINA DICLORHIDRATO PA-ACS NEGRO AMIDO 10B (C.I. 20470) DC n-PENTANO PA PIEDRA POMEZ grnulos QP PIRIDINA PA-ACS PLATA NITRATO 0,1 mol/l (0,1N) SV PLATA SULFATO PRS POTASIO CROMATO solucin 5% p/v RV POTASIO HEXACIANOFERRATO (II) 3-hidrato PA-ACS-ISO POTASIO HEXACIANOFERRATO (III) PA-ACS di-POTASIO HIDROGENO FOSFATO anhidro PA POTASIO DI-HIDROGENO FOSFATO PA POTASIO HIDROGENO FTALATO PA-ISO POTASIO HIDROXIDO 85% lentejas PA POTASIO HIDROXIDO 0,1 mol/l (0,1N) etanlica SV POTASIO NITRATO PA-ISO POTASIO PERMANGANATO 0,01 mol/l (0,05N) SV POTASIO SODIO TARTRATO 4-hidrato PA-ACS-ISO POTASIO SULFATO PA-ACS-ISO POTASIO YODURO PA-ACS-ISO ROJO DE METILO (C.I. 13020) PA-ACS ROSANILINA ACETATO SODIO ACETATO 1 mol/l (1M) RV SODIO META-BORATO TETRAHIDRATO, 98% 131644 131648 131655 131659 131698 121674 121638 131687 181694 183154 di-SODIO -tetra -BORATO 10-hidrato PA-ACS-ISO SODIO CARBONATO anhidro PA-ACS-ISO tri-SODIO CITRATO 2-hidrato PA-ACS SODIO CLORURO PA-ACS-ISO SODIO DISULFITO PA-ACS di-SODIO FENILFOSFATO 2-hidrato PA SODIO HIDROGENO CARBONATO PA SODIO HIDROXIDO lentejas PA-ACS-ISO SODIO HIDROXIDO 0,1 mol/l (0,1N) SV SODIO HIDROXIDO 0,111 mol/l (0,111N) segn Dornic SV SODIO HIDROXIDO 1 mol/l (1N) indicador: FENOLFTALEINA SV SODIO HIDROXIDO 1 mol/l (1N) indicador: AZUL DE BROMOFENOL SV SODIO HIDROXIDO 2 mol/l (2N) SV SODIO HIDROXIDO sol. 5% SODIO MOLIBDATO 2-hidrato PA-ACS SODIO NITRITO PA-ACS SODIO NITROFENILFOSFATO SODIO SULFATO anhidro PA-ACS-ISO SODIO SULFURO x-hidrato QP SODIO TIOSULFATO 0,05 mol/l (0,05N) SV SODIO TUNGSTATO 2-hidrato PA-ACS SUERO SALINO Fisiolgico SULFANILAMIDA PA N, N, N', N' - TETRAMETILETILENDIAMINA, 99% TRIS (HIDROXIMETIL) AMINOMETANO PA-ACS UREA PA-ACS YODO 0,05 mol/l (0,1N) SV ZINC ACETATO 2-hidrato PA-ACS ZINC SULFATO 1-hidrato PA ZINC SULFATO 7-hidrato PA-ACS

251774 A11818 141427 131091 132751 252036 122006 211835 131457 181464 141801 281498 131505 131503 121512 121509 131481 121515 182146 131524 182114 131729 131532 131542 131617

182415

181691

182158

131701 131703 131716 211682 182160 131724

122823 A12536 131940 131754 181772 131775 121788 131787

281634 A11803

129

Aditio Aditivos y coadyuvantes tecnolgicos para uso alimentario industrial

PANREAC QUIMICA, S.A., fabrica adems de los reactivos para anlisis PANREAC, una lnea de aditivos y coadyuvantes tecnolgicos para uso alimentario industrial, que cumplen las especificaciones de pureza prescritas por The Food Chemicals Codex 3 ed., complementadas con las exigencias especficas fijadas por la legislacin espaola y comunitaria de la CEE. En la relacin que sigue se indica denominacin del producto, frmula y nmero de identificacin. Para mayor informacin, solicite nuestro catlogo ADITIO 1995.

130

M
Cdigo Producto 201007 ACETONA 201008 ACIDO ACETICO GLACIAL 202342 ACIDO ADIPICO 201013 ACIDO L(+)-ASCORBICO 201014 ACIDO BENZOICO 201808 ACIDO CITRICO anhidro 201018 ACIDO CITRICO 1-hidrato 201020 ACIDO CLORHIDRICO 37% 201019 ACIDO CLORHIDRICO 35% 201512 ACIDO ESTEARICO (Mezcla de cidos grasos) 201669 ACIDO ETILENDIAMINOTETRAACETICO SAL di-SODICA 2-hidrato 201030 ACIDO FORMICO 98% 201029 ACIDO FORMICO 85% 201032 ACIDO orto-FOSFORICO 85% 202344 ACIDO FUMARICO 201034 ACIDO L(+)-LACTICO 202051 ACIDO DL-MALICO 202591 ACIDO MIRISTICO 201810 ACIDO PROPIONICO 201055 ACIDO SORBICO 201883 ACIDO SUCCINICO 201058 ACIDO SULFURICO 95-98% 201065 ACIDO TANICO 201066 ACIDO L(+)-TARTARICO 201792 AGAR 201081 ALCOHOL BENCILICO 201103 ALUMINIO POTASIO SULFATO 12-hidrato 201130 AMONIACO 30% (en NH3) 201129 AMONIACO 25% (en NH3) 201119 AMONIO CARBONATO 201121 AMONIO CLORURO 201116 AMONIO HIDROGENO CARBONATO (Amonio Bicarbonato) 201127 di-AMONIO HIDROGENO FOSFATO 201126 AMONIO di-HIDROGENO FOSFATO 201140 AMONIO SULFATO 203464 L-ARGININA 204109 L-ASPARAGINA anhidra 204233 2-ter-BUTIL-4-METOXIFENOL (BHA, Butildroxianisol) 201211 CALCIO ACETATO x-hidrato 201212 CALCIO CARBONATO precipitado 201213 tri-CALCIO di-CITRATO 4-hidrato 201219 CALCIO CLORURO anhidro escoriforme CaCl2 E-509 AIK(SO4)2.12H2O NH4OH NH4OH NH4CI NH4HCO3 (NH4)2HPO4 NH4H2PO4 (NH4)2SO4 C6H4N4O2 C4H8N2O3 C11H16O2 Ca(CH3COO)2.xH2O CaCO3 Ca3(C6H5O7)2.4H2O E-320 E-263 E-170i E-333iii E-522 E-527 E-527 E-510 E-503ii
E-342ii E-342i E-517

Sinnimos

Frmula CH3COCH3 CH3COOH (CH2CH2COOH)2 C6H8O6 C6H5COOH C6H8O7 C6H8O7.H2O HCl HCI C18H36O2

N. de identificacin

E-260 E-355 E-300 E-210 E-330 E-330 E-507 E-507

Na2H2C10H12N2O8.2H2O HCOOH HCOOH H3PO4 HOOCCHCHCOOH CH3CHOHCOOH C4H6O5 CH3(CH2)12COOH CH3CH2COOH C6H8O2 HOOCCH2CH2COOH H2SO4 (CHOH)2(COOH)2 C6H5CH2OH E-280 E-200 E-363 E-513 E-334 E-406 E-236 E-236 E-338 E-297 E-270 E-296

~(NH4)3(CO3)2H+NH2COONH4 E-503i

131

Cdigo Producto 201221 CALCIO CLORURO anhidro polvo 201215 CALCIO CLORURO 2-hidrato escoriforme 201232 CALCIO CLORURO 2-hidrato polvo 201214 CALCIO CLORURO 6-hidrato 202824 CALCIO CLORURO solucin 45% p/p (en CaCl2.2H2O) 201818 CALCIO ESTEARATO 201228 tri-CALCIO FOSFATO 201227 CALCIO HIDROGENO FOSFATO anhidro 201226 CALCIO HIDROGENO FOSFATO 2-hidrato 201225 CALCIO bis (di-HIDROGENO FOSFATO) 1-hidrato 202400 CALCIO HIDROXIDO polvo 201230 CALCIO LACTATO 5-hidrato 201235 CALCIO SULFATO 2-hidrato 201237 CARBON ACTIVO polvo 202416 CARBOXIMETILCELULOSA SAL SODICA (baja viscosidad) 203645 L-CISTINA

Sinnimos

Frmula CaCl2 CaCl2.2H2O CaCl2.2H2O CaCl2.6H2O

N. de identificacin E-509 E-509 E-509 E-509 E-509

~Ca(C18H35O2)2 ~Ca3(PO4)2 CaHPO4 CaHPO4.2H2O (Calcio Difosfato) CaH4(PO4)2.H2O Ca(OH)2 Ca(CH3CHOHCOO)2.5H2O CaSO4.2H2O

E-470a E-341iii E-341ii E-341ii E-341i E-526 E-327 E-516

E-466 C6H12N2O4S2 C15H24O ClCH2ClCH2 Cl2CH2 SnCl2.2H2O CH3CH2OH CH3CH2OH CH3CH2OH CH3COOC2H5 C5H10O3 C6H12O6 (Glicerol) (Glicerol) C3H8O3 C3H8O3 C9H14O6 H2NCH2COOH C6H12O6 C6H12O6.H2O E-414 H2O2 FeSO4.7H2O MgCl2.6H2O ~Mg(C18H35O2)2 (Magnesio orto-fosfato) Mg3(PO4)2.5H2O E-511 E-470b E-422 E-422 E-1518 E-640 E-512 E-921 E-321

202825 2,6-Di-ter-BUTIL-4-METILFENOL (BHT, Butilhidroxitoluol) 201286 1,2 DICLOROETANO 201254 DICLOROMETANO estabilizado con amileno 201303 ESTAO (II) CLORURO 2-hidrato 201086 ETANOL absoluto 201085 ETANOL 96% v/v 202695 ETANOL 70% v/v 201318 ETILO ACETATO 201319 ETILO S(-)-LACTATO 202728 D(-)-FRUCTOSA 201339 GLICERINA 202329 GLICERINA 87% 201922 GLICERINA tri-ACETATO 201340 GLICINA 201341 D(+)-GLUCOSA 203140 D(+)-GLUCOSA 1-hidrato 202061 GOMA ARABIGA polvo 201076 HIDROGENO PEROXIDO 30% p/v

132

(100 vol.) estabilizado 201362 HIERRO (II) SULFATO 7-hidrato 201396 MAGNESIO CLORURO 6-hidrato 202029 MAGNESIO ESTEARATO 201399 tri-MAGNESIO di-FOSFATO 5-hidrato

M
Cdigo Producto 201927 MAGNESIO HIDROGENO FOSFATO 3-hidrato 201395 MAGNESIO HIDROXI CARBONATO 5-hidrato 201404 MAGNESIO SULFATO 7-hidrato 201413 MANGANESO (II) SULFATO 1-hidrato 202067 D(-)-MANITA 201091 METANOL 203332 METILO 4-HIDROXIBENZOATO 201479 POTASIO ACETATO 201487 POTASIO BROMATO 201490 POTASIO CARBONATO 201492 tri-POTASIO CITRATO 1-hidrato 201494 POTASIO CLORURO 201522 POTASIO DISULFITO 201513 tri-POTASIO FOSFATO 1,5-hidrato 201505 POTASIO HEXACIANOFERRATO (II) 3-hidrato 201480 POTASIO HIDROGENO CARBONATO 201512 di-POTASIO HIDROGENO FOSFATO anhidro 202333 di-POTASIO HIDROGENO FOSFATO 3-hidrato 201509 POTASIO di-HIDROGENO FOSFATO 201486 POTASIO HIDROGENO TARTRATO 201515 POTASIO HIDROXIDO 85% lentejas 201524 POTASIO NITRATO 201855 POTASIO NITRITO 201729 POTASIO SODIO TARTRATO 4-hidrato 201531 POTASIO SORBATO 201533 POTASIO SULFITO 201537 POTASIO TARTRATO 1/2-hidrato 201542 POTASIO YODURO 201545 1,2-PROPANODIOL 201090 2-PROPANOL 201633 SODIO ACETATO anhidro 201632 SODIO ACETATO 3-hidrato 203865 SODIO L(+)-ASCORBATO 201637 SODIO BENZOATO 201648 SODIO CARBONATO anhidro 202032 SODIO CARBONATO 1-hidrato 201647 SODIO CARBONATO 10-hidrato 201655 tri-SODIO CITRATO 2-hidrato NaK(COO)2(CHOH)2.4H2O CH3(CHCH)2COOK K2SO3 K2(COO)2(CHOH)2.1/2H2O KI CH2OHCHOHCH3 CH3CH2CH2OH CH3COONa CH3COONa.3H2O C6H7NaO6 C6H5COONa Na2CO3 Na2CO3.H2O Na2CO3.10H2O Na3C6H5O7.2H2O E-262i E-262i E-301 E-211 E-500i E-500i E-500i E-331iii E-336ii E-337 E-202 (mono-Potasio orto-Fosfato) KH2PO4 (COO)2KH(CHOH)2 KOH KNO3 KNO2 E-340i E-336i E-525 E-252 E-249 K2HPO4.3H2O E-340ii (di-Potasio ortoFosfato) K2HPO4 E-340ii (Potasio Ferrocianuro) K4Fe(CN)6.3H2O (Potasio Bicarbonato) KHCO3 E-536 E-501ii (Manitol) (Magnesio Carbonato) MgSO4.7H2O MnSO4.H2O C6H14O6 CH3OH C8H8O3 CH3COOK KBrO3 K2CO3 K3C6H5O7.H2O KCl K2S2O5 K3PO4. 11/2H2O E-228 E-261 E-924 E-501i E-332ii E-508 E-224 E-340iii E-421 E-504ii E-518 MgHPO4.3H2O E-343ii Sinnimos Frmula N. de identificacin

133

Cdigo Producto 201656 tri-SODIO CITRATO 51/2-hidrato 201659 SODIO CLORURO 201698 SODIO DISULFITO

Sinnimos

Frmula Na3C6H5O7.51/2H2O NaCl Na2S2O5 C12H25NaO4S Na3PO4.H2O Na3PO4.12H2O (NaPO3)6

N. de identificacin E-331iii E-223 E-339iii E-339iii E-452i E-262ii E-500ii E-339ii E-339ii E-339i E-339i E-524 E-524 E-251 E-250 E-450iii E-450iii

202363 SODIO DODECILO SULFATO (Lauril Sulfato Sdico) 201681 tri-SODIO FOSFATO 1-hidrato 201680 tri-SODIO FOSFATO 12-hidrato 201684 SODIO POLIFOSFATO 201665 SODIO HIDROGENO di-ACETATO 201638 SODIO HIDROGENO CARBONATO 201679 di-SODIO HIDROGENO FOSFATO anhidro 201678 di-SODIO HIDROGENO FOSFATO 12-hidrato 201965 SODIO di-HIDROGENO FOSFATO 1-hidrato 201677 SODIO di-HIDROGENO FOSFATO 2-hidrato 201687 SODIO HIDROXIDO lentejas 201686 SODIO HIDROXIDO escamas 201702 SODIO NITRATO 201703 SODIO NITRITO 201711 tetra-SODIO PIROFOSFATO anhidro 201710 tetra-SODIO PIROFOSFATO 10-hidrato 201684 SODIO POLIFOSFATO 201716 SODIO SULFATO anhidro 201715 SODIO SULFATO 10-hidrato 201717 SODIO SULFITO anhidro 201720 SODIO TARTRATO anhidro 201719 SODIO TARTRATO 2-hidrato 201721 SODIO TIOSULFATO 5-hidrato 203064 D(-)-SORBITA 201733 TALCO lavado 202101 TITANIO (IV) OXIDO 201786 ZINC OXIDO 201788 ZINC SULFATO 1-hidrato 201787 ZINC SULFATO 7-hidrato (Sorbitol) (tetra-Sodio Difosfato) (tetra-Sodio Difosfato) (mono-Sodio orto-Fosfato) (Sodio Diacetato) (Sodio Bicarbonato) (di-Sodio orto-Fosfato)

CH3COONaCH3COOH NaHCO3 Na2HPO4 Na2HPO4.12H2O NaH2PO4.H2O NaH2PO4.2H2O NaOH NaOH NaNO3 NaNO2 Na4P2O7 Na4P2O7.10H2O

(NaPO3)n Na2SO4 Na2SO4.10H2O Na2SO3 Na2(COO)2(CHOH)2 Na(COO)2(CHOH)2.2H2O Na2S2O3.5H2O C6H14O6 TiO2 ZnO ZnSO4.H2O ZnSO4.7H2O

E-452i E-514i E-514i E-221 E-335ii E-335ii E-420i E-553b E-171

134

M
NOTAS

Editado por: PANREAC QUIMICA, S.A. 044 -15 - 500 - 7/99 Diseo: Pere Duran Impresin: Centre Telemtic Editorial, Dep. Legal: B-36.720-99

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