I) Biomolculas

1) Mtodos y Origen de los seres vivos

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MTODOS DE ESTUDIO DE LA CLULA

CLASIFICACIN Clasificaremos los mtodos que se utilizan para el estudio de la clula en dos grandes grupos: I) Tcnicas para el estudio fisicoqumico: sirven para conocer la composicin y relacionar esta composicin con las estructuras celulares. Estos mtodos son: a) Centrifugacin ) Cromatografa c) Electroforesis d) Cultivos !in vitro! II) Tcnicas para el estudio morfolgico de la clula. "os permiten conocer cmo es su forma# su tama$o y su estructura. %on# fundamentalmente: a) &icroscopa ptica ) &icroscopa electrnica ') &icroscopio electrnico de Trasmisin (&ET) )) &icroscopio electrnico de arrido (&E*)

I) TCNICAS PARA EL ESTUDIO FISICOQUMICO DE LA CLULA Este tipo de mtodos se utilizan para el aislamiento# localizacin e identificacin de las sustancias que constituyen la materia viva. +resentan dos pro lemas principalmente: a) ,os componentes de un ser vivo se encuentran formando mezclas muy comple-as. ) ,a mayora de las sustancias que encontramos en los seres vivos son# a su vez# de una gran comple-idad. +ensemos#por e-emplo# que una sola de los varios miles de protenas que contiene una clula puede estar formada por m.s /000 amino.cidos. +asemos a continuacin al estudio de cada uno de estos mtodos.

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A) CENTRIFUGACIN Consiste en la separacin de los componentes de una mezcla en funcin de las diferencias entre las velocidades que presentan al someterlos a elevadas aceleraciones (g). Esto se consigue 2aciendo girar la mezcla en un rotor a un gran n4mero de vueltas por minuto. ,os aparatos empleados con este fin se denominan ultracentrfugas. Esta tcnica requiere los siguientes pasos: ') 567CCI8"7&IE"T8 9 :8&83E"EI;7CI<": El material iolgico# por e-emplo: un fragmento de te-ido del 2gado# es triturado para disgregarlo y romper las mem ranas celulares. ,a rotura de las mem ranas de-a en li ertad los org.nulos celulares y el contenido del 2ialoplasma. %i la 2omogeneizacin se realiza suavemente# los org.nulos permanecer.n intactos. 8 tendremos as una !papilla! que estar. compuesta de restos de mem ranas# org.nulos celulares# n4cleos# molculas li res y agua. )) CE"T6I5937CI<": ,as ultracentrfugas son m.quinas que consiguen velocidades de rotacin muy elevadas# 2asta /00.000 v=mn. En el interior de estos aparatos se alcanzan grandes aceleraciones que se miden en g ('g >?#@ m=s)). En una ultracentrfuga pueden alcanzarse 2asta '00.000 g. ,os materiales iolgicos sometidos a estas aceleraciones se desplazan 2acia el fondo de los recipientes que los contienen con velocidades que dependen de su masa# de su forma y volumen# y de la naturaleza del medio en el que se realice la centrifugacin. B) CROMATOGRAFA %e fundamenta en la separacin de los componentes de una mezcla por sus diferencias de a sorcin. Astas diferencias van a ser de idas a las fuerzas de Ban der Cals que se esta lecen entre los componentes de la mezcla y una sustancia que act4a de fase estacionaria. %eg4n la naturaleza de la fase estacionaria# tendremos los siguientes tipos de cromatografa: ') C68&7T83675D7 %8*6E +7+E,: %e emplea para la separacin de sustancias qumicas que presenten propiedades muy parecidas. %e opera de la siguiente manera. 9na
Fig. 3 Cromatografa de papel. Fig. 1 Homogeneizador.

Fig. 2 Centrfuga.

Fig. 4 Cromatografa de gases.

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peque$a cantidad de la mezcla a separar se deposita so re un fragmento de papel poroso en el que quedar. em e ida. 7 continuacin se introduce el orde del papel en una sustancia en la que sean solu les los componentes de la mezcla que queremos separar. El disolvente se desplazar. por capilaridad y los ir. arrastrando. ,os componentes de la mezcla via-ar.n m.s o menos r.pido seg4n esta lezcan fuerzas m.s o menos grandes con las molculas del papel. +ara o servar los componentes ya separados se emplean reacciones coloreadas especficas. )) C68&7T83675D7 EE 37%E%: El aparato consiste en un serpentn largo y delgado cuyas paredes est.n impregnadas de un lquido (fase estacionaria). ,a mezcla a separar se vaporiza y atraviesa el serpentn transportada por un gas. ,a fase estacionaria retiene m.s o menos los diferentes componentes de la mezcla. Astos se detectan cuando al atravesar una llama entran en com ustin# lo que aumenta la conductividad elctrica del detector. Este mtodo tiene la venta-a de necesitar peque$simas cantidades (0#0/ mg) y es capaz de separar sustancias muy parecidas qumicamenteF por e-emplo: .cidos grasos#az4cares u 2ormonas. C) ELECTROFORESIS En este mtodo# la mezcla a separar se deposita en una cu eta so re un soporte de tipo poroso (acetato de celulosa o tam in gel de almidn). 7 continuacin se esta lece una diferencia de potencial entre los eGtremos del soporte. ,as sustancias que componen la mezcla se desplazar.n en funcin de su carga elctrica. "aturalmente este mtodo se emplear. con sustancias que presenten cargas elctricas (protenas y .cidos nuclicos) D) CULTIVOS IN VITRO Estos mtodos nos van a permitir mantener lneas celulares en el eGterior de un organismo en condiciones favora les a su multiplicacin. ,a gran venta-a va a ser la facilidad para el tratamiento del material iolgico y su estandarizacin. ,as clulas eGtradas de en mantenerse para su cultivo en un medio con las condiciones fsicas y qumicas adecuadas y suministrarles aquellas sustancias que ellas no son capaces de sintetizar. En la actualidad se venden medios de cultivo concretos para cada tipo celular y que permiten mantener los cultivos durante largos perodos de tiempo.

Fig. 5 Cubeta para electroforesis.

Fig. 6 Cultivo de bacterias en cpsula de petri.

II) MTODOS MORFOLGICOS ,os mtodos morfolgicos nos van a permitir la o servacin directa de la estructura celular.

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El o-o 2umano puede distinguir a )/ cm dos o -etos separados entre s 0#) mm. Aste es el poder separador o poder de resolucin del o-o. ,as clulas de mamfero suelen tener unos 0#0' mm# por lo que no es posi le verlas a simple vista y muc2o menos o servar en ellas detalles estructurales. El microscopio va a permitir su o servacin al aumentar el poder de resolucin del o-o. CLASES DE MICROSCOPIOS A) MICROSCOPIO PTICO O FOTNICO ') 59"E7&E"T8: 5unciona de la siguiente manera: 9na fuente luminosa enva rayos de luz a una primera lente# llamada condensador# que concentra los rayos de luz so re el o -eto a o servar. Estos rayos atraviesan el o -eto y una lente denominada o -etivo da una imagen aumentada de ste. 9na segunda lente# el ocular# vuelve a aumentar la imagen dada por el o -etivo. Esta 4ltima imagen es la que ser. reci ida por el o servador. )) +6E+767CI<" EE, &7TE6I7,: En el microscopio ptico la luz atraviesa el o -eto a o servar. %i ste es muy grueso# la luz no lo atravesar. y el o -eto aparecer. demasiado oscuroF adem.s se superpondr.n los diferentes planos dando una imagen orrosa. %i el o -eto es demasiado delgado o muy transparente# no se o servar.n sus estructuras. En cualquier caso# de eremos realizar una preparacin. En general# una preparacin requiere las siguientes etapas 'H C86TE. ,os o -etos demasiado gruesos son cortados mediante aparatos denominados microtomos. Astos permiten realizar cortes de apenas unas micras de grosor# corrientemente entre I J y )0 J. El te-ido destinado al corte de e congelarse o incluirse en parafina para darle una mayor consistencia y que se pueda cortar con facilidad.
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ocular

revolver objetivo pinzas macromtrico micromtrico platina Fuente de iluminacin

Fig. 7 Partes del miccroscopio ptico.

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ocular

revolver objetivos platina diafragma lmpara

macromtrico micromtrico

Fig. 8 Partes del miccroscopio ptico.

)H 5I17CI<". %u fin es matar a las clulas con la menor alteracin de las estructuras posi le# para evitar las modificaciones que pudiesen producirse posteriormente por el meta olismo celular o por la descomposicin. Como fi-adores se emplean determinadas sustancias qumicas (por e-emplo: formalde2do y tetrGido de osmio). IH EE%:IE67T7CI<". ,a eGtraccin del agua del interior de las clulas permitir. tam in una me-or conservacin y la penetracin de los colorantes. +ara des2idratar el material a o servar se le sumerge en alco2oles de cada vez mayor graduacin que por dilucin ir.n eGtrayendo el agua.KH TI"CI<". Es la coloracin de las clulas o de partes de stas para que resalten y posi ilitar as su o servacin. 7lgunos colorantes son selectivos pues ti$en partes concretas de la clula.

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EGisten dos clases de colorantes: a) ,os colorantes vitales. Lue ti$en las estructuras celulares pero sin matar a las clulas (por e-emplo: el verde -ano# el ro-o neutro# el azul trip.n# el azul de metileno). ) ,os colorantes no vitales. Lue matan a las clulas (eosina# 2ematoGilina). /H &8"T71E. 9na vez realizadas las anteriores operaciones el material se coloca entre un portaHo -etos y un cu reHo -etos. +ara un monta-e no definitivo# se coloca entre !porta! y !cu re! una gota de glicerina. Este tipo de preparaciones tiene una duracin limitada y slo sirven para la o servacin moment.nea o a lo sumo de unos das. %i se desea una mayor duracin de e realizarse el monta-e en gelatinaHglicerina o en euparal. B) EL MICROSCOPIO ELECTRNICO EGisten dos clases de microscopios electrnicos: *') &icroscopio electrnico de trasmisin (&ET). *)) &icroscopio electrnico de arrido (&E*).

Fig. 9 Fundamento del microscopio ptico.

Fig. 10 Fundamento del microscopio electrnico de trasmisin (MET).

B1) EL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN (MET) ') 59"E7&E"T8: El microscopio electrnico fue puesto a punto en '?I' a partir de los tra a-os tericos de Ee *roglie. ,os electrones pueden comportarse como ondas o como partculas. Como ondas pueden llegar a tener una longitud '00.000 veces menor que la luz visi le. 7l ser partculas negativas pueden ser desviadas por campos elctricos que act4an como lentes.

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En esencia su funcionamiento es similar al del microscopio ptico. 9n c.todo emite un 2az de electrones que son acelerados por la aplicacin de una diferencia de potencial entre el c.todo y el .nodo. El flu-o de electrones es concentrado so re el o -eto por una primera lente magntica que 2ace las veces de condensador. ,os electrones atraviesan la muestra. 9na segunda lente magntica# el o -etivo# da una imagen aumentada del o -eto. 9na tercera lente# el ocular# aumenta de nuevo la imagen dada por la anterior. ,a imagen final es proyectada so re una pantalla o fotografiada. ,os microscopios electrnicos permiten aumentos 4tiles que van de )000 a '00.000 pudiendo llegar 2asta M00.000. ,os microscopios electrnicos son aparatos de 2asta ) m de alto y llegan a pesar /00 Ng. )) +6E+767CI<" del &7TE6I7, ,os electrones necesitan desplazarse en el vaco# esta es la razn por la que no es posi le la o servacin de clulas vivas al microscopio electrnico. )H') 5I17CI<". ,as clulas son fi-adas mediante fi-adores no coagulantes. ,os m.s corrientes son el tetrGido de osmio (8s8K )# el formalde2do (:C:8) y el permanganato pot.sico (&n8K O). ,os metales pesados que algunos contienen se fi-an selectivamente a las diferentes estructuras celulares. 7quellas que retengan m.s los metales aparecer.n m.s oscuras. Es por esto que la imagen depende muc2o del tipo de fi-ador utilizado. )H)) EE%:IE67T7CI<" e I"C,9%I<". ,a pieza es des2idratada e infiltrada mediante una resina o pl.stico para darle una mayor consistencia y facilitar su corte. )HI) C86TE. ,os cortes se realizan mediante ultramicrotomos de cuc2illa de vidrio o de diamante. ,os cortes m.s finos (0#0IJ) son depositados so re un tamiz y dispuestos para su o servacin al microscopio. B2) MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO (MEB) Este tipo de microscopio permite o tener im.genes tridimensionales del o -eto a estudiar. +rimero se efect4a un som reado met.lico de la superficie de la muestra# y la rplica o tenida es arrida por un 2az de electrones. ,os electrones secundarios que se forman son captados y convertidos en im.genes so re una pantalla de televisin. Estos microscopio son muy 4tiles para revelar estructuras anatmicas su microscpicas# sin em argo su aumento no suele pasar de )0.000.
&icroscopio ptico 5uente de iluminacin: ,a luz %e pueden ver seres vivos +oco aumento (P'000) %e o serva la estructura +reparaciones sencillas 7parato relativamente arato &icroscopio electrnico 5uente de iluminacin: electrones "o se pueden ver los seres vivos &uc2o aumento (PI00 000) %e o serva la ultraestructura +reparaciones comple-as Instrumento muy caro

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