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Artculos Originales Original Articles

Revista Colombiana de Investigacin en Odontologa 2009;1(1):97-105

EFECTO DEL LSER BLANDO DE He-Ne DE 2MW EN LA FORMACIN DE LA INTERFASE HUESO EFFECT OF THE APPLICATION OF THE LOWLEVEL (2MW HE-NE) LASER TREATMENT ON THE OSSEOUS INTERACTION IN THE INTERPHASE BONE-IMPLANTS
RESUMEN Objetivo Determinar el efecto del lser blando He-Ne 2 mw en la formacin de la interfase hueso-implante de titanio en tibia de conejos. Mtodos Estudio de tipo cuasi-experimental, la muestra fueron 8 conejos adultos sin previa manipulacin biolgica, de 12 semanas de edad, con 3-3.5Kg/peso, de raza Nueva Zelanda. Se excluyeron los conejos que estuvieran consumiendo algn tipo de medicamento y que padecieran alguna enfermedad de tipo sistmico. Este estudio fue hecho en un modelo animal a doble ciego, diseando un placebo control. Se utilizaron implantes de titanio de 5mm de dimetro por 3mm de longitud, marca IMETI, sembrados en la tibia de las patas traseras derecha e izquierda de conejos de raza Nueva Zelanda. Las patas traseras derechas se sembraron con implantes y se irradiaron con el lser blando de He-Ne 2mw por 180 seg y las patas izquierdas se dejaron como grupo control y se irradiaron con el lser apagado. El lser fue utilizado inmediatamente despus de la ciruga y aplicado consecutivamente por 10 das. Resultados La evaluacin histomorfomtrica sugiri que el grupo irradiado tena ms contacto hueso implante que el grupo control. Los porcentajes de calcio y fsforo, fueron ms altos en el grupo irradiado, cuando se compar con los controles (P=0.05 y P=0.05), respectivamente, sugiriendo que el proceso de maduracin sea fue ms rpido en el hueso irradiado. Conclusiones El lser blando de He-Ne de baja potencia debe tener un efecto favorable sobre la cicatrizacin y contacto intimo de los implantes de titanio. PALABRAS CLAVES: Oseointegracin, implante, lser blando He-Ne 2 mw. ABSTRACT Objetive demonstrate the effect of the application of the low-level (2mw He-Ne) laser treatment on the osseous interaction in the interphase bone-implants.

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Oscar Hernn Marin Escobar Catherine Daz Quiroz Jos Edison Arcila Moreno Alejandro Botero Botero Claudia Leonor Bastidas Ramrez

1 Residentes Especializacin en Periodoncia y Oseointegracin. Universidad Cooperativa de Colombia. 2 Ph. D. en Periodoncia. Docente de Pregrado de Odontologa Universidad Cooperativa de Colombia, Seccional Medelln 3 Especialista en Epidemiologa. Coordinadora de Investigacin Especializaciones en Odontologa. Universidad Cooperativa de Colombia, Sede Bogot. Correspondencia Carrera 13 A No 38-22. Especializaciones en Odontologa. Correo oscarmarinohne44@hotmail.com, Postgrados, universidad cooperativa de Colombia, sede Bogot

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Methods This study was completed using a double-blind-animal model, with a placebo control. 5 by 3mm titanium implants were used to seed in the tibias of the back-legs of New Zealand breed rabbits. The rabbits right-back-legs were seeded with the implant and were irradiated with the laser; while the rabbits back-left-legs were used as control group and were irradiated with the laser off. The laser treatment was applied after the surgery, consecutively for 10 days to seedtime. Results The mechanisms of union between the bone and the titanium implants were evaluated using the scanning electron microscope (SEM JSM-6490), by means of high and low resolution images. This evaluation permitted the topographic and morphologic characterization of the interphase bone - implants. Additionally, a semi-quantitative elementary chemical analysis was conducted using an energy dispersive X-ray detector (EDX) in nine random points of each cut. Results The histomorphometric evaluation suggested that the contact bone-implants was better developed in the irradiated group than the control group. Also, the percentage of calcium and phosphorus were higher in the irradiated group, compared with the controls group. This result suggests that the process of bone maturation was faster in the irradiated bone. Conclusions the low-level (2mw he-ne) laser treatment might have a favorable effect on the healing and contac intimate of the titanium implants. KEY WORDS: Oseointegracin, implants, soft laser, Have.

INTRODUCCIN En el ao 1952 el Dr., Branemark descubri por accidente la interaccin que se lograba entre un aditamento metlico de titanio y hueso vital, proceso que se defini posteriormente como Oseointegracin, que es la relacin intima de contacto a nivel macro y micro entre hueso e implante. Estudio el efecto de la aplicacin del lser blando de He-Ne en la interaccin sea en la interfase hueso implante, relacionado con los criterios de xito en implantes. (1) Davies (1998) describe que la oseointegracin se puede lograr por medio de la osteognesis a distancia que ocurre cuando el tejido seo nuevo se forma desde la superficie del hueso que rodea el implante, donde las superficies existentes de hueso proveen una poblacin de clulas osteognicas, las cuales secretan matriz nueva. En este tipo de osteognesis, la superficie del implante siempre estar separada del hueso por una matriz extracelular de tejido conectivo. Tambin describe la osteognesis de contacto, donde el hueso nuevo se forma inicialmente en la superficie del implante, y se extiende de sta hacia el hueso que previamente lo rode. Ello se logra mediante la colonizacin de la superficie del implante por una poblacin de clulas osteognicas antes de la iniciacin de la formacin de matriz sea. (2) En este proceso las plaquetas y la fibrina juegan un rol predominante, producindose la unin firme de sta ltima a la superficie del implante esencial. (3) Es importante que la fibrina se encuentre firmemente adherida, ya que la perdida de sta, concomitante con la retraccin de la herida durante la migracin celular, podra evitar que las clulas migrantes alcancen la superficie del implante que se desea integrar. (4, 5, 6) Despus de 14 das luego de posicionar un implante en boca, con estrategias de carga, ya se pueden observar fibras de colgeno y osteoblastos en contacto ntimo con el implante. (7) Con el crecimiento de los cristales de fosfato de calcio ocurre una insercin de fibras colgenas, con una mineralizacin posterior, tanto de las fibras como del espacio existente entre ellas.

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En 1998, Smith y Zarb propusieron seis criterios de xito en implantes, dos de los cuales tienen relacin directa con los conceptos histolgicos antes comentados. El primero de ellos dice que el implante debe estar inmvil clnicamente. Se sabe que para que se produzca movilidad se necesita que el implante se encuentre rodeado por una c psula de tejido conectivo. Esto es excluyente con el concepto de oseointegracin ya que segn los estudios anteriormente comentados y de acuerdo con la definicin del Glosario de Trminos Prostodnticos, no debe existir una interface de tejido conectivo entre el implante y el tejido seo. Otro criterio de xito en implantes es la ausencia de radiolucides peri-implante, el cual est relacionado con el punto antes comentado (1). Los antecedentes del lser, se hallan en el desarrollo de la Mecnica Cuntica en el presente siglo. El primero fue construido en 1960, las principales caractersticas del lser son: absorcin, transformacin de la energa de la luz en otra forma de energa; y dispersin, cambio en la direccin de la propagacin de la luz (8). El lser blando de baja potencia, tambin llamados ter aputicos, producen bioestimulacin celular. Se aplican para acelerar la regeneracin tisular, cicatrizacin de heridas, con propsitos analgsicos, antiinflamatorios, homeostticos y activador de los mecanismos naturales de defensa, Los ms usados son los de Helio-Nen (HeNe), Arseniuro de galio (GaAs) y Arseniuro de galio y aluminio (GAAlAs). En un estudio en animales, colocaron implantes de hidroxiapatita en la mandbula de conejos y aplicaron lser de He-Ne (6mw, en un rango de 1cm) 10 minutos por 4 das. La mandbula contralateral sirvi

como grupo control. Los animales fueron sacr ificados a los 21 das. Macroscpicamente, toda la hidroxiapatita estaba intacta en el momento de la reseccin en el grupo irradiado, en el grupo control hubo falla s en la unin al hueso. Micr oscpicament e, el gr upo contr ol presento un rea de granulacin, formacin de hueso nuevo a intervalos irregulares en el tejido de granulacin, con un alto grado de celularidad, consistente principalmente en fibroblastos y algunos osteoblastos. En el grupo irradiado se formo hueso nuevo y ms osteoblastos estaban presentes. Ello sugiere que el lser blando modifica la respuesta inflamatoria a los implantes de hidr oxia patita, r esultando una mejor Oseointegracin (9). Otro estudio investigo el efecto del lser GaAlAs (780 nm, 1 w, 300 J/cm2) sobre la Oseointegr acin de implantes de hidr oxiapatita usando anlisis histomorfometrico y microdureza. Despus de 3 y 6 semanas, el grupo irradiado comparado con el grupo control, tuvo un alto ndice de afinidad y diferencias significativas en la microdureza sea en la interface hueso hidroxiapatita (10). Recientemente se investig el efecto del lser blando sobre la concentracin de los componentes orgnicos e inorgnicos alrededor de implantes dentales insertados en las tibias de 14 conejos. Hubo diferencias significativas entre los grupos controles y experimentales, sugiriendo que el lser blando aumento la cicatrizacin sea alrededor de los implantes (11). El lser blando es todo aquel lser de baja energa, que no produce efecto trmico, emite espectro infrarrojo cercano o del rojo, con una potencia de 1 has ta 50 mw (miliwatts). Su actividad no obedece a

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efecto del calor, sino a la interaccin de esta radiacin con la clula. La energa es absor bida all donde hay mayor concentracin de fluidos y por tanto, es bien absorbida por los tejidos inflamados y edematosos. Realizaron en 1991 un anlisis radiogrfico despus de la extraccin para MATERIALES Y MTODOS Se usaron en este estudio ocho conejos machos. Cada animal recibi dos implantes de titanio 5mm de dimetro X 3mm de longitud marca IMETI. Uno en la tibia izquierda como control y otro en la tibia derecha el cual fue irradiado con el lser blando de He-Ne 2 mw luego de la ciruga y diariamente por 10 das consecutivos. La dosis aplicada fue de 0.2 julios/cm., con 2 mw, durante 180 segundos sesin, en el lado derecho y en el lado izquierdo se aplic el mismo tiempo pero con el lser apagado. Los conejos usados para el anlisis histolgico y ultraestructural, fueron los denominados con el cdigo 004, 006, 007 y 008. Los conejos 7 y 8 se sacrificaron a los 29 das posteriores a la ciruga y se procesaron las muestras. Cabe resaltar que el conejo numero 8 se fracturo la tibia izquierda donde no se aplico laser, no fue procesado pues presento una infeccin posiblemente osteomielitis donde el implante fue rodeado por tejido de granulacin. El conejo 4 y 6 se sacrificaron a los 36 das posteriores a la ciruga y se procesaron las RESULTADOS DESCRIPCION MACROSCOPICA Se pudo visualizar en los cortes macroscopicos donde se encontraba el implante de titanio, formacin de tejido oseo (trabecular y medular) alrededor del implante, sin embargo en los cortes realizados de las tibias que fueron tratadas con el lser, se

demostrar que el lser blando puede activar reparacin del tejido seo daado (12). El propsito del presente estudio fue investigar el efecto del lser blando de HeNe de 2 mw en la cicatrizacin y unin de los implantes de titanio en el hueso.

muestras. Se cortan las patas traseras y se ubica, las tibias donde estn los implantes. Se lavan con PBS y se sumergen en paraformaldehido al 4% durante 48 horas, se colocan en una nevera de icopor y se llevan al laboratorio para ser ledas en microscopio. Las muestras fueron procesadas realizando cortes transversales con un motortul, al cual se le acondicionan discos de diamante de 2 cms por 0.2 de mm de grosor. Se irriga profusamente con agua en el momento del corte para evitar recalentamiento, y evaporacin del tejido. Los cortes son de 0.2 a 0.3 mm en espesor del hueso. (Figura1), que fueron procesados por diferentes tcnicas para obtener la mayor informacin posible y realizar las lecturas con las tcnicas de anlisis para microscopia electrnica, con la tcnica de SEM JSM6490, espectroscopia de energa dispersiva de rayos X, microscopia de luz y en un microscopio avanzado de fluorescencia (microscopio Olympus IX-81). Es importante anotar que este sistema cuenta con un software (Image Pro Plus de MediaCybernetics).

observa un mayor contacto del tejido oseo alrededor de todo el implante de titanio, adems en los conejos 6 y 7 se observa mayor vascularizacin, lo cual podra estar indicando un proceso de neo formacin de vasos a partir de los existentes lo cual favorece la expansin sea y a su vez reparacin sea.

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Figura 1. Cortes de las Tibias de Conejos

MICROSCOPIA ELECTRNICA DE BARRIDO (SEM) Y EDX

superficie de contacto con el programa NIH-Imagen.

ANLISIS P OR FLUORESCENCIA MI CR OSCO PI A DE

Se escogieron los mejores cortes para realizar los estudios ultra estructurales con el microscopio electrnico de barrido (SEM JSM-6490) para hacer la caracterizacin topogrfica y morfolgica de la interfase hueso implante, mediante imgenes de alta y baja resolucin, adems se realizo un micr oanlisis qumico elementa l semicuantitativo por medio de un detector de energa dispersiva de rayos X (EDX) en 9 puntos aleatorios de cada corte con el fin de obtener la cantidad relativa de carbono (C), fosforo (P), calcio (Ca) y titanio (Ti). De las preparaciones obtenidas para la observacin en SEM se obtuvieron fotografas digitalizadas de diferentes areas alrededor del implante donde se calcul el porcentaje de contacto para cada impla nte mar ca ndo la s zonas de la

En el conejo 6 se cuantifica en 20 campos tomados con el objetivo de 10X, cada uno de los puntos azules que corresponden a los ncleos de las clulas marcados con Hoescht. Aunque hay diferencias en el nmero de clulas entre el control y las clulas tratadas que pueden corresponder a fibroblastos en divisin es necesario realizar marcajes especficos para determinar el tipo de clula en particular. En el conejo 7 cada uno de los cortes r ea liza dos par a es ta mu es tr a fu er on procesados del mismo modo que los cortes del conejo 6, sin embargo no hay una gran diferencia con respecto al nmero de clulas entre las clulas control y las clulas tratadas.

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Los detalles de microscopia de electrnica demuestran una diferencia ultra estructural, en cuanto a la topografa del tejido con respecto a las muestras irradiadas (A, B, C, D) y las no irradiadas (E, F) que pueden corresponder a fibroblastos sin diferenciar y de matriz extracelular como fibras de colgeno, a diferencia de las muestras irradiadas que evidencian la formacin de tejido seo compacto y de armaduras seas mineralizadas con seales de neoformacin indicando claramente que el efecto del lser He-Ne puede reducir el tiempo necesario para la oseointegracin.(13) -Ver Figura 2. Al realizar el anlisis de la espectroscopia de la energa dispersiva de rayos X llevado a cabo en el SEM, que permiti determinar la composicin qumica de las muestras en diferentes p untos y de esta manera comparar la cantidad relativa de carbono, fosforo, calcio y titanio y descartar la contaminacin con otros posibles metales.

Despus de realizar el anlisis de varianzas para determinar si existan diferencias en los niveles de carbono, fsforo, calcio y titanio entre las muestras irradiadas y no irradiadas para cada conejo, se encontr que no existen diferencias significativas entre las muestras irradiadas con el lser y no irradiadas en el porcentaje atmico de carbono y fosfatos, pero si se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de calcio y titanio. (Tabla 1) El calcio se encontr en un mayor porcentaje en las muestras que fueron sometidas al lser con un rango de variacin entre (2-13%) adems, aunque el titanio no debera cambiar se observo un mayor porcentaje en las muestras no tratadas esto se debi quizs a que las en areas donde se hizo la cuantificacin en muchos conejos no tratados, no se encontr neo formacin en la interfase.

Fgura 2. Microscopia Electrnica de Barrido (SEM Y EDX)

Tabla 1. Anlisis de Varianzas

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DISCUSIN El efecto del laser blando He-Ne 2 mw en la interaccin sea de un implante de titanio en tibia de conejo se demuestra en las observaciones macroscpicas de los cortes dado que se pudo visualizar en el contacto hueso implante de titanio, una mayor formacin de tejido oseo alrededor del implante, sin embargo en los cortes realizados de las tibias que fueron tratadas con el laser, se observa una mayor integracin titanio, adems en los conejos 6 y 7 se observa mayor vascularizacin, lo cual podra estar indicando un proceso de neoformacin de vasos a partir de los existentes favoreciendo la formacin sea y a su vez la oseointegracin, caso similar al reportado por Khadra M, Kasem N, Lynngstadaas Sp, Haanaes HR, Mustaf K. en 2004, en el articulo Estimulacin de la terapia laser de baja potencia en la interaccin hueso implante. (14) Al determinar histolgicamente la cantidad de clulas presentes en la interfase huesoimplante de titanio con la aplicacin de lser blando se observa en las imgenes de microscopia de fluorescencia con ms detalle la interfase hueso implante, evidenciando las diferencias en el nmero de clulas entre el control y las clulas tratadas que pueden corresponder a fibroblastos en divisin siendo estas clulas las precursoras de la oseointegracin; lo que muestra un mayor porcentaje de neoformacin de hueso en las tibias de conejos irradiados con el lser. Las muestras no irradiadas pueden corresponder a fibroblastos sin diferenciar y de matriz extracelular como fibras de colgeno, a diferencia de las muestras irradiadas que evidencian la formacin de tejido seo compacto y de armaduras seas mineralizadas con seales de neoformacin indicando que el efecto del lser He-Ne puede determinar la formacin sea en la interfase huesoimplante y puede reducir el tiempo necesario para la oseointegracin. A diferencia de los puntos de contacto donde se observa claramente la oseointegracin, por la presencia de tejido mineralizado a lo largo de una parte significativa de su permetro externo, los detalles de microscopia electrnica demuestran una diferencia ultra estructural, en cuanto a la topografa del tejido con respecto a las muestras irradiadas (A, B, C, D) y las no irradiadas (E, F) que pueden corresponder a fibroblastos sin diferenciar y de matriz extracelular como fibras de colgeno, a diferencia de las muestras irradiadas que evidencian la formacin de tejido seo compacto y de armaduras seas mineralizadas con seales de neoformacin y de reabsorcin indicando claramente el efecto del laser resultados similares a los presentados por K Khadra M, Kasem N, Lynngstadaas Sp, Haanaes HR, Mustaf K. (15) en 2005, en el articulo, terapia laser para aceleracion de unin inicial y subsecuente conducta de fibroblastos humanos cultivados en materiales de implantes de titanio con examen de microscopia electrnica y anlisis histomorfometrico, dirigido para investigar el efecto de la terapia del laser blando sobre la unin y proliferacin de fibroblastos gingivales humanos cultivados en material de implantes de titanio, concluyendo que el laser blando aumenta la unin y proliferacin de fibroblastos gingivales humanos en el material de implante de titanio. Despus de realizar el anlisis de varianzas para determinar si existan diferencias en los niveles de carbono, fsforo, calcio y titanio entre las muestras irradiadas y no irradiadas para cada conejo, se encontr que no existen diferencias significativas entre las muestras

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irradiadas con el lser y no irradiadas en el porcentaje atmico de carbono y fosfatos, pero si se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de calcio y titanio, resultado equiparable a los expuestos por k Khadra m. 2005, en el estudio del efecto de la irradiacin de lser blando de baja potencia en la interaccin tejido implante en estudios in vivo e in vitro, donde encontr que el efecto del lser blando puede acelerar el metabolismo y /0 mineralizacin durante la temprana cicatrizacin sea. (16) Caso similar al reportado por Khadra en 2004 con respecto al incremento de formacin sea en defectos de calota de rata usando terapia lser de baja potencia donde los resultados arrojaron que las muestras de tejido de los animales experimentales, contienen significativamente ms calcio, fsforo y protena que en el grupo control. (17) Similarmente los anlisis histolgicos, muestran angiognesis ms pronunciada y formacin de tejido conectivo, y mayor avance en la formacin sea en el grupo experimental que en el control. Se concluy que el lser blando de baja potencia puede REFERENCIAS
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aumentar la formacin sea en defectos de calota de rata. La formacin sea en la interfase huesoimplante en tibia de conejos muestra evidencia de la formacin de tejido seo compacto y de armaduras seas mineralizadas con seales de neo formacin y de reabsorcin, indicando claramente el efecto del lser en los cortes analizados por microscopia de barrido. Se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de calcio y titanio. En el calcio se encontr en un mayor porcentaje en las muestras que fueron sometidas al lser con un rango de variacin entre (2-13%). El efecto positivo que tiene el lser blando de He-Ne sobre la unin funcional del implante de titanio al hueso lo favorece como un tratamiento potencial para acelerar la cicatrizacin sea sobre el implante.
Agradecimientos. Medical Titanium Industry, (IMETI), Al Dr. Javier Bernal Botero, Subdirector Centro Nacional Agropecuario La Salada (SENA). Al Dr. Edison Holguin, Ospina, Medico Veterinario e Instructor Pecuario Centro Nacional Agropecuario La Salada (SENA).

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