1 4skyriai

EUROPOS SJUNGA Europos socialinis fondas
KURKIME ATEIT DRAUGE!
PROJEKTAS MAGISTRANTROS IR DOKTORANTROS STUDIJ MODULI KRIMAS IR PROGRAM ATNAUJINIMAS STRATEGINSE BIOMOKSL SRITYSE
Vytautas Ranelis
AUGAL GENETIKA
UDK ....
Apsvarst ir rekomendavo Vilniaus Universiteto Gamtos moksl fakulteto taryba (2008 m. kovo 5 d., protokolas Nr. 4). Auktj mokykl bendrj vadovli leidybos komisijos rekomenduota 2008 m. kovo 28 d. Nr. 08-392
Recenzavo: doc. dr. Juozas Prosceviius doc. dr. Donatas vingila dr. Violeta Kleizait
Leidin finansuoja Europos Sjungos struktrini fond paramos 2.5 priemons projektas Magistrantros ir doktorantros studij moduli krimas ir program atnaujinimas strateginse modernij biomoksl srityse. Sutarties Nr. ESF/2004.2.5.0-03-430/BPD199/ParS-12500-602, SFMIS Nr. BPD2004-ESF-2.5.0-03-05/0095. Projekt remia Lietuvos Respublika. Projekt i dalies finansuoja Europos Sjunga.
Vadovlis skirtas Vilniaus universiteto magistrantros studij programos Genetika (62101B105) studentams.
LEIDINYS PLATINAMAS NEMOKAMAI
ISBN 978-9955-25-
V. Ranelis, 2008 Vilniaus universitetas, 2008
TURINYS
Turinys
I DALIS 1. Augal poymi paveldjimo dsningumai .....................................................9 Pagrindins svokos odynlis.......................................................................9 1.1. Nuo Mendelio dsni iki visiko augalo genomo DNR sek nustatymo ..........11 1.2. Objektas augal genetikoje ........................................................................................19 1.3. Genetiniai simboliai/augal gen pavadinimai ......................................................24 1.4. Genai chromosomose. Paprasiausi augal poymi paveldjimo dsningumai .................................................................................................................27 1.5. Dihibridinis kryminimas dvi paveldjimo alternatyvos ...................................32 1.6. Nealelini gen sveikos pasireikimas hibrid kartose........................................38 1.7. Alelini gen sveika ..................................................................................................44 1.8. Aplinkos veiksniai ir alelini gen sveika. Geno penetrantikumas ir ekspresyvumas .............................................................................................................50 1.9. Komplementacijos (trans) testas ir poymio genetika............................................55 1.10. Komplementacijos testas ir funkcinis geno dalomumas.......................................58 1.10.1. Krosingoveris geno viduje. Tarpalelin komplementacija......................58 1.10.2. Funkcinis geno dalomumas. Polifunkciniai baltymai ..............................61 1.10.3. Duplikacijos geno viduje. Netolygus krosingoveris geno viduje ir permutacijos...................................................................................................63 Savarankikam darbui...........................................................................................................66 II DALIS 2. Gametofit raida pozicin determinacija. Vyrikasis sterilumas ir heteroz. Apvaisinimas ir nesuderinamumo genetika ....................................67 Pagrindins svokos odynlis.....................................................................67 2.1. Augal dauginimosi ypatumai ir tipai (bendra apvalga) ......................................71 2.2. Sporofitas ir gametofitas kart kaita ....................................................................72 2.3. Magnolijn sklapradio ir gametofit raida. Vyrikasis sterilumas, gen ininerija ir heteroz ...................................................................................................80 2.3.1. Ssaja su gyvn raida. Sklapradis ............................................................80 2.3.2. Moterikasis gametofitas. Pozicin determinacija....................................86 2.3.3. iedadulk vyrikasis gametofitas...........................................................90 2.3.4. Citoplazminis vyrikasis sterilumas. Nauji chimeriniai mitochondrij genai ................................................................................................................96 2.3.5. Vyrikasis sterilumas, heteroz ir gen ininerija...................................102 2.4. Apdulkinimas, apvaisinimas ir nesuderinamumo genetika. Apoptoz augaluose ...................................................................................................................108 2.4.1. Apdulkinimas ir apvaisinimas....................................................................108 2.4.2. Nesuderinamumo genetika. Sudtingi S-lokusai ir haplotipai..............115
AUGAL GENETIKA
|3
2.4.2.1. Heteromorfinis nesuderinamumas. Struktriniai ir fiziologiniai savidulkos barjerai. Selektyvusis apvaisinimas ................................................................................116 2.4.2.2. Homomorfinis nesuderinamumas. S-genai ir S-haplotipai ..121 2.4.3. S-nesuderinamumo genetika. Baltym skaidymas, apoptoz ir S-nesuderinamumas....................................................................................127 2.4.3.1. Numatyt baltym suskaidymas ir S-nesuderinamumas......127 2.4.3.2. S-nesuderinamumas ir apoptoz. Papaver tipas ......................131 Savarankikam darbui.........................................................................................................135 3. Skla: gemalas ir endospermas. Juvenylin augalo raida ir bendras raidos planas. Somatin embriogenez ir apomiks ................................................ 137 Pagrindins svokos odynlis................................................................... 137 3.1. Sklos sandara ir raida (bendras apibdinimas)....................................................139 3.2. Sklos gemalas. Embriogenez ...............................................................................145 3.2.1. Gemalo raidos stadijos. Dviskili, vienaskili ir pun palyginimas...................................................................................................145 3.2.2. Ypatingas reguliacinis auksino vaidmuo gemalo raidai.........................149 3.2.3. Gemalo raidos genai...................................................................................152 3.3. Netipika gemalo raida .............................................................................................155 3.3.1. Klonavimas. Somakloninis kintamumas .................................................155 3.3.2. Somatin embriogenez .............................................................................158 3.3.3. Androgenez. Gemalo raida i iedadulks ............................................161 3.4. Endospermas .............................................................................................................165 3.4.1. Bendri endospermo raidos vykiai............................................................165 3.4.2. Miglini endospermas ................................................................................166 3.4.3. Vairenio endospermas................................................................................170 3.4.4. Trumpai apie dygim. Dviguba aleurono reguliacija. Giberelin vaidmuo........................................................................................................171 3.5. Motininis ir gen dozs efektai. Genomo,, imprintingas ir sklos raida ........173 3.5.1. Motininiai ir zigotos genai. Gen doz endosperme. Motininis efektas ...........................................................................................................173 3.5.2. Vieno kelio genomo ,,imprintingas endosperme. Epigenetinis endospermo raidos reguliavimas ..............................................................176 3.6. Apomiks unikalus augal genomo klonavimo ir heterozigotikumo isaugojimo bdas .....................................................................................................183 3.6.1. Apomiks tobuliausias gamtos irastas klonavimo bdas.............183 3.6.2. Sporofitin ir gametofitin apomiks ......................................................185 3.6.3. Apomikss genetika keli genai lemia apomiks?.................................191 Savarankikam darbui.........................................................................................................194 4. Atsargini baltym sintezs genetika ir gen evoliucija............................... 197 Pagrindins svokos odynlis................................................................... 197 4.1. Bendrieji principai ir veika .......................................................................................197
4|
TURINYS
4.2. Atsarginiai baltymai...................................................................................................199 4.2.1. Atsargini baltym grups ir j paveldjimas.........................................199 4.2.2. Skl atsargini baltym sandara ir gen evoliucija...............................203 4.2.3. Skl atsargini baltym kaupimo ir saugojimo bdai: svarba augalui ir gen ininerijai ...........................................................................212 Savarankikam darbui.........................................................................................................222 III DALIS 5. Funkcin genomo sandara ir gen raikos valdymas. Transkripcijos kodas ............................................................................................................. 223 Pagrindins svokos odynlis .................................................................. 223 5.1. Genai erdvje ir laike ................................................................................................226 5.2. Funkcins gen grups. Struktriniai ir valdymo genai. Valdymo sekos .........228 5.2.1. Operonas. Branduollio organizatorius ir rrn operonai, nuo kuri nuraomas didiausias RNR skaiius augalo lstelje ...........................228 5.2.2. Funkcin geno sandara ir gen raikos valdymas ..................................234 5.3. Promotoriai : cis elementai .......................................................................................235 5.3.1. Pagrindinis promotorius ............................................................................236 5.3.2. Savita promotoriaus dalis ir saviti cis elementai. Cis elementai intronuose ....................................................................................................238 5.3.3. Saviti promotoriai ir gen promotori konstravimas............................242 5.3.4. Elementai, enhanceriai ar moduliai? Promotori duomen bazs ....246 5.4. Transkripcijos veiksniai ir augalo evoliucija..........................................................250 5.4.1. Bendras apibdinimas ir transkripcijos veiksni eimos.......................250 5.4.3. Transkripcijos veiksniai ir augalo evoliucija. Dirbtiniai transkripcijos veiksniai ...............................................................................259 5.5. Gen raikos reguliavimas po transkripcijos. Splaisingas ir jo mutacijos.........263 5.5.1. Branduolio ir citoplazmos RNR...............................................................263 5.5.2. Splaisingas augaluose. Intronins-egzonins geno sandaros privalumai. SR baltymai..............................................................................267 5.5.2.1. Splaisingo privalumai .................................................................267 5.5.2.2. Intronai ir egzonai. Splaisingo mechanizmas.........................269 5.5.2.3. Intron ir splaisingo mutacijos.................................................275 5.5.3. Alternatyvusis splaisingas augaluose. Autonominis ydjimo meto kontrols kelias ir alternatyvusis splaisingas ...........................................280 5.5.3.1. Alternatyvusis splaisingas augaluose........................................280 5.5.3.2. Alternatyvusis splaisingas ir autonominis ydjimo pradios kelias. Alternatyvusis poliadenilinimas ir autoreguliavimas .........................................................................284 5.6. Signal pernaa ir signalo molekuls. Meristemos. Cirkadiniai reikiniai. Florigenas. Sisteminiai atsakai ir imuniteto pagrindai..........................................293 5.6.1. Plazmodezmos ir reguliaciniai ryiai tarp lsteli. Simplastas ..............293
AUGAL GENETIKA
|5
glio meristemos raida ir ryiai tarp lsteli. Polipeptidai kaip signalo molekuls ........................................................................................297 5.6.2.1. Meristemos ir augimo reguliavimas. Virns vyravimas.....297 5.6.2.2. CLAVATA ir glio virns meristema (SAM). CLE genai..............................................................................................299 5.6.2.3. Kiti polipeptidai, kurie palaiko ryius tarp lsteli ir kontroliuoja gen raik ...........................................................302 5.6.3. Transkripcijos veiksni ir kit gen raik reguliuojani molekuli pernaa floema. Florigenas. Sisteminiai atsakai......................................304 5.6.3.1. Transkripcijos veiksni ir mRNR, mi/si RNR pernaa dideliais atstumais.......................................................................304 5.6.3.2. Florigenas. Cirkadiniai reikiniai ir signal pernaa i lap glio meristem ................................................................308 5.6.3.2.1. viesos jutikliai (fitochromai, kriptochromai, fototropinai).............................................................309 5.6.3.2.2. Cirkadinis laikrodis ir florigenas ...........................313 5.6.3.3. Itin ma molekuli pernaa ind sistema. Sisteminiai atsakai............320 5.6.3.3.1. Sisteminis gytas atsparumas ir hiperjautrus atsakas. Atsakai biotinius stresus........................322 5.7. Transkripcijos kodas. Transkripcijos veiksni kompleksai. iedo ABC. Suderinta gen raika................................................................................................330 5.7.1. Baltym kompleksai kaip transkripcijos veiksniai..................................332 5.7.1.1. Homodimeriniai ir heterodimeriniai transkripcijos veiksniai........................................................................................332 5.7.1.2. CONSTANS HAP komplekso dalis....................................334 5.7.2. Multimeriniai MADS ir kit augal iedo raid kontroliuojani transkripcijos veiksni kompleksai. iedo ABC....................................335 5.7.3. Suderinta gen raika..................................................................................340 5.7.3.1. Gvaizdns (Zinnia L.) lapo mezofilo lsteli transdiferenciacija trachjinius elementus ............................340 5.7.3.2. Suderinta grdo brendimo, atsargini baltym sintezs ir panaudojimo gen raika...........................................................344 Savarankikam darbui.........................................................................................................348 Pagrindin literatra............................................................................................................349
5.6.2.
6|
VADAS
vadas
Kiekvienas autorius, msis rayti vadovl lietuvi kalba, nort bti pirmasis. Deja, nors esu pirmj bendrosios genetikos vadovli autorius (V. Ranelis. Bendroji genetika. Vilnius: Mokslas, 1986; V. Ranelis. Genetika. Vilnius: Lietuvos moksl akademijos leidykla, 2000), negaliu pretenduoti pirmj lietuvik Augal genetikos vadovl. Tokiu pavadinimu dar 1939 metais pasirod diplomuotos agronoms Elenos Gimbutiens Augal genetika. (Kaunas: Spaudos fondas). Nors per t laikotarp augal genetika toli paengusi, ir dabartiniai gimnazij moksleiviai apie genetik imano daugiau, negu parayta E. Gimbutiens knygoje, iki iol niekas nesiryo rayti Augal genetikos vadovlio lietuvi kalba. Taip pat ir kitomis kalbomis yra tik viena knyga, kuri gali pretenduoti platesns apimties apskritai augal biologijos vadovl. Tai didels apimties B. B. Buchanono, W. Gruissemo, R. L. Joneso Biochemistry and Molecular Biology of Plants. Tokia padtis susidar dl labai sparios augal genetikos pltros vairiomis kryptimis per pastaruosius 1015 met. Augalai dl j gebjimo regeneruoti i vienos lstels, atsargini mediag talpykl ir kt. tampa nepamainoma baze biotechnologijai, gen ininerijai ir nauj genetikos reikini tyrimui, tarp j vienai sudtingiausi genetikos problem transkripcijos kodui, kuris gana plaiai nagrinjamas ioje knygoje. Didels augal biotechnologijos perspektyvos Lietuvoje yra paskata lietuvikai literatrai ir vadovliams ioje srityje. Pirmj sprag upildo A. Sliesaraviiaus ir V. Stanio ,,ems augal biotechnologija. Tikiuosi, kad i knyga prisids prie fundamentali ini apie augal egzistavim, funkcionavim ir galimybi gytas inias pritaikyti praktiniais tikslais. Vadovlis skiriamas studentams, kurie specializuojasi augal biologijos, agronomijos, mikininkysts srityse ir turi bendr ini apie genetik. Taiau tiems, kurie imasi studijuoti augal genetik savarankikai, knygoje prie kiekvien skyri yra vadiniai odynliai, o gale papildomos pagrindins svokos savarankikam darbui ir kaip prasminiai odiai darbui internete. odynlis prie kiekvien skyri turi ir papildom tiksl. Paprastai odynliai dedami knygos pabaigoje ir neturi didels reikms paiam mokymuisi. Skyriaus pradioje pateiktas odynlis yra kaip vadas tuos klausimus, kurie bus nagrinjami atitinkamame vadovlio skyriuje. Kita vertus, patartina prie odynlio grti dar kart, kai bus istudijuotas visas skyrius. Tai turt tapti kaip ir gyt ini apibendrinimas. Sunkesns problemos ar svarbs augal genetikos ir apskritai biologijos klausimai pateikiami Intarpuose arba petitu. Tai turt bti irgi atitinkamas vadas nagrinjam klausim arba papildomos inios, kuri sisavinimas gali ir nebti sudtin adaptuotos konkreiai studij krypiai programos dalis. Tarp studij program, kuriose studijuojami augal biologijos klausimai, yra dideli skirtum. Naudodamasis galimybe, dkoju monms, padjusiems rengti i knyg: recenzentams doc. dr. J. Prosceviiui, dr. V. Kleizaitei, doc. dr D. vingilai u vertingus patarimus ir pastabas, padjusias gerokai pagerinti knygos kokyb, ir ypa dkingas J. Patamsytei, G. Vengalienei, V. Ranelienei, be kuri pagalbos ios knygos tekstai ir paveikslai nebt parengti. Vadovlis skirtas magistrantams ir doktorantams, kurie studijuoja augal biologijos ir jai artimas problemas, taip pat visiems, kurie tiria augalus (agronomams, mikininkams, mokslo darbuotojams).
AUGAL GENETIKA
|7
1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI
I DALIS 1. Augal poymi paveldjimo dsningumai

PAGRINDINS SVOKOS odynlis Genetika mokslas apie paveldimum ir kintamum. Eukariotai visi organizmai (iskyrus bakterijas) ir virusus, kuri lstelse yra membranomis apribotas branduolys ir kitos lstels struktros (mitochondrijos, plastids ir kt.). Lstels dalijasi mitozs ir mejozs bdu. Prokariotai (bakterijos) neturi membranomis apribot lstels struktr (organoid). J DNR sudaro kompaktik nukleoid. Skirtumai tarp prokariot ir eukariot labai dideli, neapsiriboja vien tik lstels suskirstymu atskirus skyrius (kompartmentus). Dalijasi persismaugimo bdu. Deoksiribonukleorgtis (DNR) pagrindin genetin mediaga, biopolimeras sudarytas i deoksiribonukleotid (purino ar pirimidino baz + deoksiriboz + fosfato liekana; bazs: purinai-adeninas (A), guaninas (G); pirimidinai-timinas (T), citozinas (C)), saugo genetin informacij, koduojam nukleotid sekose. Ji nusako aminorgi sek baltyme. Vien aminorgt koduoja 3- nukleotid derinys kodonas. Chromosomos silikas lstels branduolio nukleoproteid (DNR + baltymai) kompleksas, kurio paskirtis yra genetins informacijos (gen) saugojimas, padvigubinimas ir taisyklingas paskirstymas tarp dukterini branduoli (lsteli), pirminis genetins informacijos realizavimas (RNR sintez, transkripcija). Geriausiai matomos optiniu mikroskopu mitozs metafazje ir mejozs pachitenoje. Yra vairios - bdingos riai sandaros, skaiiaus ir dydio. i poymi visuma vadinama kariotipu. Santykinai chromosomomis vadinama ir bakterij, mitochondrij, chloroplast DNR. Homologins chromosomos poruojasi mejozje, yra tapaios arba artimos genetins struktros, turi tokius paius genus arba j struktrines atmainas alelius ir kitas tapaias DNR sekas. Genas pagrindinis fizinis ir funkcinis paveldimumo vienetas, DNR (reiau RNR) dalis, kurioje ukoduota RNR nukleotid ir baltymo aminorgi seka. Skiriami genai, koduojantys tik RNR arba RNR ir baltymus, yra reguliaciniai genai, kurie reguliuoja kit gen (vadinam. struktriniais) veikl. Visi genai sudaryti i reguliacins ir koduojanios dalies. Genas gali kisti vairias formas, vadinamas aleliais. Alelis bet kuri geno struktrin forma, pakanka, kad skirtsi viena nukleotid pora.
AUGAL GENETIKA
|9
Diploidas organizmas (arba lstel) su dviem (daniausiai homologini) chromosom rinkiniais. Diplofaz gyvenimo ciklo dalis, kurioje organizmo lstels turi diploidin chromosom skaii. Toks organizmas arba jo dalis vadinama diplontu. Haploidas organizmas (arba lstel), turintis vien chromosom rinkin. Haplofaz gyvenimo ciklo dalis, kurioje visos organizmo lstels arba j dalis turi haploidin chromosom skaii. Toks organizmas arba jo dalis vadinama haplontu. Atitinkamai yra diploidiniai/haploidiniai branduoliai ir lstels. Poliploidas organizmas, kurio branduoliai (lstels) turi daugiau kaip du chromosom rinkinius. Reikinys vadinamas poliploidija, o organizmai (lstels, branduoliai) triploidai, tetraploidai, pentaploidai, heksaploidai) pagal chromosom rinkini skaii, atitinkamai 3n, 4n, 5n, 6n ir t. t. Aneuploidas (sin. heteroploidas) organizmas, kurio lstelse (branduoliuose) pakits pavieni chromosom (ne kartotinis) skaiius. Reikinys aneuploidija. Pagal pakitusi homologini chromosom skaii skiriami nulisomikai (2n2), monosomikai (2n1), disomikai (abi chromosomos to paties tvo ar motinos), trisomikai (2n + 1), tetrasomikai (2n+2). Galimi vairs mirs variantai. Genomas gen visuma haploidiniame chromosom rinkinyje arba gen visuma konkreioje lstels struktroje, kuriai bdinga savarankika genetin funkcija (branduolio, mitochondrij, chloroplast, plazmidi, virus). Genotipas genetini organizmo ypatybi visuma, siauresne prasme gen/aleli derinys, lemiantis mus dominant konkret poym (fenotip). Fenotipas organizmo (lstels) poymi visuma arba konkretus poymis, genotipo ir aplinkos veiksni sveikos rezultatas. Homozigota organizmas (lstel), kuris turi tok pat geno alel visose (poliploido) arba abiejose diploido homologinse chromosomose. Heterozigota organizmas (lstel), kurio homologinse chromosomose yra skirtingi to paties geno aleliai. Mutacijos genomo, chromosom, gen ir kit nukleotid sek pokyiai ir pats j atsiradimo procesas. Procesas dar vadinamas mutageneze. Mutantas organizmas (lstel), kuriame vykusi mutacija. Mutagenas veiksnys, kuris sukelia mutacijas.
10 |
1.1. Nuo Mendelio dsni iki visiko augalo genomo DNR sek nustatymo (trumpa augal genetikos istorijos apvalga)
XIX a. baigsi sensacija, i esms pakeitusia viso biologijos mokslo raid. 1900 m., paskutiniai XIX a. metai, laikomi naujo mokslo apie paveldimum ir kintamum pradia. 1906 m. is mokslas angl mokslininko Beitsono (W. Bateson) buvo pasilytas vadinti genetika. Pakartotinis Mendelio dsni atradimas. Augal genetikos pradia. T simintin 1900 m. pradioje trys mokslininkai beveik vienu metu ir skirtingose alyse, de Fryzas (H. de Vries) Olandijoje, Korensas (C. Correns) Vokietijoje ir ermakas (E. Tschermak) Austrijoje paskelb darbus apie poymi paveldjim augal hibriduose. Deja, jie tik pakartojo ek vienuolio Mendelio (J. G. Mendel, 18221884) tyrimus ir ivadas, paskelbtas prie 35 metus 1865 m. Vis tik 1900 m. visikai teistai laikomi genetikos mokslo atsiradimo data. Mendelio darbas mokslui nebuvo inomas ir tik dl laimingo atsitiktinumo jis buvo prisimintas ne tiek dl to, kad trys mokslininkai ne visikai pasidalino atradimo garbe, o todl, kad Mendelio darbas savo ivadomis gerokai lenk trijuls darbus. Jame labai logikai buvo pagrstas paveldimumo vienet, 1909 m. (dar vliau negu genetika) dan botaniko Johanseno (W. L. Johannsen) pavadint genais, realus buvimas. Tad visa mokslo apie paveldimum genetikos skaiiuot tikrai prasidjo tik nuo 1900 m. 1900 m. yra ir augal genetikos mokslo atsiradimo data, nes visi minti darbai buvo atlikti su augalais: Mendelio su irniais ir pupelmis, vliau vanage, de Fryzo su vairi augal agurk, nakvios, durnaropi labai artimomis rimis, o dar daniau poriais, varietetais. Korenso darbas pagal objektus jau artimesnis Mendelio darbui, nes Korensas krymino ne augal ris, o kukurz, irni, leukonij veisles. Panaiausi Mendelio buvo ermako, kuris krymino irni rases ir pirmasis (1899 m.) susidr su io tyrintojo-mgjo darbu, tyrimai. Toks ilgas augal sraas tik sustiprino mint, kad Mendelio dsniai ne atsitiktiniai, galioja vairiems augalams. Abejons buvo atsiradusios ne be pagrindo. Mendelis band su savo tyrim rezultatais ir j ivadomis supaindinti ym to meto vokiei botanik Negel (K.W. Ngeli), o tas tik mandagiai jam patar sukryminti tarpusavyje vairias vanags (Hieracium) ris, kad sitikint, jog bna ir kitaip. Taip ir buvo. Nepasireik Mendelio stebta su irniais palikuoni vairov antrojoje hibrid kartoje (darbas paskelbtas 1869 m.). Taiau po pakartotino Mendelio dsni atradimo pasipyl tkstaniai darb, analogik jo bandymams su irniais, ne tik su augalais, bet ir su gyvnais, ir sitikinta, kad Mendelio nustatyti paveldjimo dsniai galioja, vis t eukariot, kuriems bdingas tipikas lytinis procesas,hibridams. Mendelio neskmei, augalas vanag kaip tik yra iimtis i tipiko lytinio dauginimosi. Jai bdinga apomiks (r. 3.6 sk.). Hibrid analizs metodas. Mokslas prasideda nuo dsni ir metodo. Mendelis pasil ne tik dsnius, bet ir pirmj metod paveldimumui tirti. Tai kuo artimesni form, rasi, veisli kryminimai (hibridizacija). Kryminimais tiriamas vieno arba riboto skaiiaus poymi paveldjimas. Daniausiai tiriama viena prieing (alternatyvi) poymi pora, pvz., geltona arba alia skl spalva, lygi arba rauklta j forma, violetiniai arba
AUGAL GENETIKA
| 11
balti iedai (1.1 pav., r. taip pat 1.2 lentel). Mendelis i viso tyr 8 tokias poymi poras. Nuo Morgano laik (r. toliau) kryminimams pradti naudoti mutantai. Mutanto poymis lyginamas poroje su normalaus organizmo poymiu.
P F1 P
F2 F3 F4
1.1 pav. Monohibridinio kryminimo rezultatai 4-iose hibrid kartose:

P tvins formos; F1, F2, F3, F4 hibrid kartos
iuolaikins genetikos metodai yra labai sudtingi, taiau i esms kryminimai nepraranda aktualumo ir yra vienas i veiksmingiausi lyginamosios genetikos metod. Juo nustatoma gen, genomo, jo dali tapatumas, giminingumas (homologija). Tik su genetikos raida is metodas patiria vairias naujas modifikacijas, pritaikomas naujiems tyrimo lygmenims (pvz., DNR hibridizacija). Netgi Mendelis naudojo du io metodo variantus reciprokinius (abipusius) kryminimus, kai tas pats augalas bna vien kart motina, o kit tvas, ir analitinius kryminimus, kuriais galima tirti lytini lsteli genetines ypatybes (genotip). Lstels atradimas eksperimentins biologijos pradi pradia.Tai, kad organizmai pasiymi paveldimumo savybe, mons pastebjo seniai, augindami gyvulius ir augalus, ir i savo pai gyvenimo patirties. Taiau moksliniam paveldimumo aikinimui, genetikai, atsirasti turjo bti reikiamos mokslins prielaidos, pagrindas (1.1 intarpas). Pirmiausia rasta lstel. domus sutapimas. Lstel augaluose atrado 1665 m. angl mokslininkas Hukas (R. Hooke) lygiai 200 m. prie Mendelio darb. Atjo eil lytinms lstelms ir lytiniam procesui, bet augaluose jis atrastas Kiolroiterio (J. G. Klreuter) tik po madaug imto met. Taiau kuo toliau, tuo spariau kaupsi inios apie lstel, ir XIX a. bt galima pavadinti citologijos amiumi. Aptiktas branduolys ir kitos matomos optiniu mikroskopu lstels struktros, bet lstels dalijimosi bdai mitoz ir mejoz atrasti jau po Mendelio. Atjo laikas rimtai pradti svarstyti, kas yra paveldimumas, ar kinta ir kodl kinta gyvieji organizmai. Tai buvo susij su evoliucijos idjomis. Pradi padar Lamarkas (J. B. Lamarck), kuriam genetika iki iol dkinga u vadinamj gytj poymi problem. Lamarkui dideli pretenzij genetikai neturt reikti. Jis buvo pirmasis, kuris tyr organizm kintamum, todl suprantama, kad nesugebjo atskirti paveldim pokyi
12 |
nuo nepaveldim, vadinam modifikacijomis, ir man, kad visi pokyiai, kuriuos organizmas gyja savo raidoje (ontogenezje), yra paveldimi. Treniruojamas, naudojamas organas ibujoja, o nenaudojamas nyksta (atrofuojasi). Manyti galima vairiai, tik ne per jg primetant kitiems savo nuomon, kaip tai dar po daugybs met T. Lysenka SSSR. Taiau reikia ir rodyti. iuo metu grietai laikomasi taisykls: modifikacija yra nepaveldimas pokytis. Genetins struktros, veikiamos aplinkos, kryptingai nesikeiia, o jeigu ir keiiasi, tai tik somatinse lstelse, ir tie pokyiai: paprastai nepersiduoda organizm kartoms ir tai nra modifikacija; neatmetama ir rodyta, kad kai kurie prisitaikomojo pobdio arba uprogramuoti kitimai, atsirad tvins kartos somatinse arba generatyvinse lstelse, gali persiduoti palikuonims. Tai taip pat ne modifikacijos, o nauji (epi)genetiniai reikiniai (genomo imprintingas, genotrofai, paramutacijos ie reikiniai bus nagrinjami atskirai);. gali pasireikti tariamas poymio paveldjimas, jeigu modifikacij sukeliantys faktoriai pastovs tam tikroje aplinkoje, taip, pvz., atsiranda skirtumai tarp tos paios ries kalnuose ir emumose augani augal (1.2 pav.).
1.2 pav. Paprastasis saulenis (Helianthemum nummularium) emumose (a) ir kalnuose (b).
Paveldimumo vienet hipotezs. Mintis apie paveldimumo vienetus kilo evoliucijos teorijos krjo Darvino (Ch. Darwin) galvoje. Jis tiesiog buvo priverstas kaip nors paaikinti, kas yra paveldimumas, nes jo evoliucijos teorijos pamatus sudaro paveldim pokyi atranka. Darvinas tiesiog fantazavo be jokio eksperimentinio pagrindo, kad yra specials paveldimumo vienetai. Mintis patiko kitiems mokslininkams. Atsirado daug nauj paveldimumo hipotezi. Kai kurios i j buvo labai arti tiesos, pvz., jau minto Mendelio dsni atradjo de Fryzo, pasak kurio, paveldimumo vienetai yra lstels branduolyje. Ten jie padvigubja ir taisyklingai paskirstomi tarp dukterini branduoli ir lsteli. Austr mokslininkas VeismaAUGAL GENETIKA
| 13
nas (A. Weismann) atkreip dmes somatini ir generatyvini (lytini) lsteli skirtumus ir kaip jie gali atsirasti. Tai problema, kuri iki iol nagrinja genetikai. Augalai ir iame genetikos prieauryje nebuvo nustumti antrj plan. Atvirkiai, dl teikiam patogum eksperimentuoti daug atradim buvo padaryta su augalais, pradedant nuo Huko atrast lsteli. Augalus tyr Braunas, istiakovas, Strasburgeris, leidenas, Negelis. Netgi ymusis Darvinas, kuris savo evoliucijos teorij grind daugiau stebjimais i natralios gamtos ir selekcinink veiklos, atliko bandymus su augalais, atrado heteroz (r. 2.3.4 sk.) reikin, kuriuo oficialioji genetika susidomjo tik madaug 19081914 metais ir kuris dav daug naudos monijai pagausinant augal, ypa kukurz, produkcij. Augal genetikos monopolis. Kaip minta, paveldjimo dsniai, kuriuos nustat Mendelis galioja ne tik augalams, bet ir visiems kitiems eukariotams, turintiems bent trumpai du chromosom rinkinius, o paveldimumo vienetai genai bdingi visoms genetinms struktroms, kurios turi genetin mediag DNR arba daugumos augal virus, gana didels dalies induoli virus, kai kuri kit genetini struktr RNR. Tad po pakartotinio Mendelio dsni atradimo susidomta ir kitomis organizm grupmis, ne tik augalais. Vis tik nors ir trumpai, apie deimtmet, iki Morgano (T. H. Morgan, 18661945) chromosomins paveldimumo teorijos (19111918 m.), kai augalus antrj plan nustm vaisin musel (Drosophila melanogaster), kaip tyrim objektas vyravo augalai. Tai trumpas, bet labai audringas genetikos vystymosi laikotarpis. Visikai teisintas genas, nustatyti vairs gen ir j sveikos tipai, susiformavo pagrindins genetikos svokos: genotipas-fenotipas, homozigota-heterozigota, aleliniai ir nealeliniai, dominuojantieji ir recesyvieji genai, dominavimas ir epistaz, komplementacija, atrasta daug nauj reikini, bendr visiems eukariotams ar net prokariotams, kaip antai heteroz (pakartotinai); gen sankiba (nors nemokta jos paaikinti); populiacijos ir grynosios linijos, tuo paiu sukurti pagrindai populiacij genetikai; kiekybini poymi paveldjimas polimerija ir poligenai; nebranduolinis paveldjimas. Tiesa, pastarasis rodytas lstels struktrai, kuri turi tik augalai. Tai plastids (chloroplastai).
1.1 intarpas. Svarbiausios augal genetikos datos ir atradimai Genetikos prieauris 16651667 Augalins) lstels atradimas (R. Hooke) 17351762 Linjaus augal sistema ir paveldimumo aikinimas (C. Linnaeus-Linne) 17591761 Augal lytinio proceso atradimas (J. G. Klreuter) ir pirmieji augal hibridai 17991849 Augal hibrid savybs (chronologine tvarka T. A. Knight, C. F. von Grtner, 1862 Ch. Naudin) 1809 Lamarko Zoologijos filosofija ir pirmoji kintamumo samprata (J. B. Lamarck) 1831 Aptiktas lstels branduolys (R. Brown) 18381839 Lstelin teorija (M. J. Schleiden, T. Schwann) 1865 Mendelio darbas su augal hibridais (J. G. Mendel) 1859 Darvino Ri kilm (Ch. Darwin) 1868 Darvino pangenez/paveldimumo vienet hipotez ir augal heterozs tyrimai (Ch. Darwin) 18741875 Atrasta mitoz (I. D. istiakov, E. Strasburger) 18751876 Iaikintas spermio prasiskverbimas kiauialst (E. Strasburger) 18821889 Atrasta mejoz (E. van Beneden, Th. Boveri ir kt.)
14 |
18751889 1898
Paveldimumo hipotezs (F. Galton, 1875; A. Weismann, 1882; K. W. Ngeli, 1884; H. de Vries, 1889 ir kt.) Dvigubas iedini augal apsivaisinimas (S. G. Navain)
Genetika XX a. mokslas augal genetikos raida 1900 Genetikos gimimas/pakartotinis Mendelio dsni atradimas (H. de Vries, Olandija; E. Tschermak, Austrija; C. E. Correns, Vokietija) 19011903 Mutacin teorija, nakvi (Oenothera) tyrimai (H. de Vries) 1903 Populiacijos ir grynosios linijos (W. L. Johannsen) 1906 Gen sankiba (ir krosingoveris) (W. Bateson, R. C. Punnett) 1908 Nebranduolinis (chloroplast) paveldimumas (E. Bauer, C. E. Correns) 19081914 Heteroz ir vaisa (teorija ir praktinis panaudojimas (G. H. Shull, E. M. East) 19081910 Polimerija, poligenai/kiekybini poymi paveldjimas (N. H. Nilsson-Ehle, E. M. East) 1916 ir 1936 Natrali (H. Winkler) ir dirbtin (A. F. Blakeslee) poliploidija 1919 ir 1931 Augal chimeros/somatini lsteli genotipo skirtumai (H. Winkler, T. Asiejeva) 1927 Tolimieji hibridai/Raphanobrassica (G. D. Karpeenko) 1930 Geno konversijos hipotez (H. Winkler) 1931 Citologinis krosingoverio rodymas kukurzuose (B. Mc Clintock) 1931 ir Vyrikas citoplazminis sterilumas (M. R. Rhoades, M. I. Chadinov) toliau 1932 Ri resintez (A. Mntzing, V. Rybin) 1935 Chromosom eliminacija tolimuosiuose hibriduose (G. D. Karpeenko, S. avinskaja) 19401950 Judrieji (kukurz) genomo elementai (B. Mc Clintock) 1954 Genotrofai (A. Durrant) 1956 Paramutacijos/epigenetiniai reikiniai (R. A. Brink) 1958 Augal regenerantai i vienos lstels (F. Steward ir kt.) 1964 Haploidai i iedadulki (S. Gusha, S. L. Maheshwari) 19711973 Ti ir Ri plazmid/natrali ir dirbtin gen ininerija (R. H. Hamilton, M. Z. Fall ir kt.) 19802005 Didysis augal genetikos uolis 2000 Pirmasis sekvenuotas augalo/vairenio (Arabidopsis thaliana) genomas 2001 ir Pogenomin (augal) era toliau
Stambiausias darbas tuoj po pakartotino Mendelio dasni atradimo buvo 19011903 m. de Fryzo paskelbtas dviej tom veikalas Mutacin teorija. Stebdamas augalo nakvios (Oenothera lamarciana) palikuonis jis nustat pagrindines mutacij ypatybes. Paveldimi pokyiai, kuriuos dabar vadiname mutacijomis, buvo inomi seniai. Jie aprayti ir Darvino veikaluose, panaudoti naujoms vaismedi, dekoratyvij ir kit augal veislms kurti, taiau mokslinis mutacij tyrimas prasidjo tik nuo de Fryzo teorijos paskelbimo. Drozofilos ir bakterij genetika pagrindas naujam augal genetikos suklestjimui. Nuo XX a. antrojo deimtmeio pradios prasidjo vaisins musels (Drosophila melanogaster) laikmetis genetikoje. i musel turi tiek daug visoki privalum, kad iki iol yra vienas svarbiausi genetikos objekt. Kap minta, drosofil genetiniams tyrimams pirmasis pasirinko, ir labai skmingai, Morganas. Po Antrojo pasaulinio karo kur laik drozofilai teko uleisti pirmaujanio genetinio objekto pozicijas bakterijoms ir kitiems mikroorganizmams (virusams, mikroskopiniams grybams). i genomas yra paprastesns sandaros, lengviau tirti molekulins genetikos
AUGAL GENETIKA
| 15
metodais gen veikl ir jos reguliacij, taiau tirti daugialsi organizm raid jie netiko, ir vl pradjo ,,pirmauti drozofila, taiau alia jos atsirado nematodas Caenorhabditis elegans ir smulkus augallis vairenis (Arabidopsis thaliana (L.)Heynh.), kuris subrandina sklas per mnes ar pusantro nuo pasjimo. Augal privalumai (r. 1.2 sk.) lm tai, kad ir iuo laikotarpiu (1.1 intarpas) daug i principo nauj genetikai reikini pirm kart aptikta augaluose. Tai vis tip vadinamosios genomo mutacijos aneuploidija ir poliploidija, kai pakinta pavieni chromosom skaiius ar itisas j haploidinis rinkinys, tolimoji hibridizacija ir jos dsningumai, tarp j chromosom eliminacijos reikinys, judrieji genomo elementai. Nors somatini lsteli genetikoje daugiausia dmesio, finans ir tyrim skiriama induoli lstelms dl galimo patologinio i lsteli dalijimosi ir vio, vis tik genetinis somatini lsteli polimorfizmas pirm kart rodytas augaluose. Visi ie reikiniai, iuolaikinis j tyrimo lygis, j svarba bus smulkiau nagrinjami atitinkamuose knygos skyriuose. Augal gen klonavimas ir ininerija naujas augal genetikos etapas. Augal gen klonavimas ir ininerija prasidjo iek tiek vliau negu mikroorganizm, bet i principo nauju atradimu. Atrasta natrali gen ininerija, kuri vykdo augalus parazituojanios bakterijos Agrobacterium tumefaciens ir A. rhizogenes. Jos sukelia augal v, vadinamuosius galus. Abi bakterijos turi genetines struktras (plazmides), i kuri dalis DNR pereina i bakterijos plazmids augalo genom. Apie gen klonavim (1.2 intarpas) ir ininerij kalbame praleisdami daug itin svarbi vyki, atradim genetikoje. Vien ko verti DNR struktros ir funkcijos/genetinio kodo iaikinimas arba DNR sekoskaita, kuri prasidjo 20 met prie pogenomin er ir daugeliui organizm, tarp j ir augal (ryi, sojos ir kt.) tik sibgja. Vienas i esmini visiems organizmams atradim tiesiogiai susijs su augal gen ininerija. Tai vadinamj transgen, perkelt i kito organizmo gen, nutildymas (slopinimas). Augalini RNR virus tyrimais nustatyta, kad gen nutildymas kur kas platesnis ir vairesnis reikinys, negu manyta, ir galioja visiems organizmams, yra vienas i bd reguliuoti gen veikl. Tai vienas didesni pastarojo meto atradim. Buvo prisiminta, nauj reikm gijo daug nepripaint, nesuprast ar tiesiog pamirt reikini, pvz., Brinko (R. A. Brink) atrastos kukurz paramutacijos. Tai paveldimi pokyiai, kuriuos sukelia hibriduose kai kuri kukurz gen aleliai kitiems to paties geno aleliams. Reikinys buvo visikai rodytas puikiais gerai apgalvotais genetiniais bandymais, todl nekl abejoni, bet taip ir nesuprastas. Raktas jam minti surastas tik po beveik 40 met: visi Brinko darbai apie kukurz paramutacijas buvo itisai pakartotinai perspausdinti vienoje i garsios pasaulyje Cold Spring Harbor (JAV) laboratorijos leidiam monografij, paskirtoje epigenetiniams reikiniams (paveldimiems pokyiams, kai nekinta DNR nukleotid sekos).
1.2 intarpas. Trumpai apie gen klonavim Gen klonavimas susideda i keli etap: gen iskyrimo arba sintezs, DNR fragmento statymo vadinamj vektori, o io vedimo lstel ir klonuoto geno pagausinimo iai dalijantis. Gen sintez vyksta naudojantis specialiais fermentais. Iskirtas arba susintetintas DNR fragmentas gali bti pagausinamas atliekant polimerazin grandinin reakcij. DNR fragment karpymas ir prijungimas prie vektoriaus atliekamas naudojant savitas endonukleazes vadinamas. restriktazmis. Jos atpasta trumpas nukleotid sekas (restrikcijos vietas/saitus) ir kerpa DNR molekul. vairios restriktazs atpasta ir kerpa skirtingas sekas. Kirpimo vietos tai paiai
16 |
restriktazei vis organizm DNR vienodos. Kirpimo vietoje susidar fragmentai turi lipnius galus, kuriais lengvai jungiasi. Tad lengvai gali susijungti, pvz., drozofilos ir vairenio DNR fragmentai, jeigu jie karpyti ta paia restriktaze. Taip gaunamos hibridins DNR molekuls, ir DNR fragmentai statomi speciali genetin struktr vektori. Tai priemon, kuri klonuojamas reikiamas genas, t. y. svetima DNR, kad bt galima j perneti reikalingas lsteles, terpti j genom ir pagausinti ioms lstelms dalijantis. Daniausiai klonuoti genai saugomi bakterij plazmidse. Augal iam tikslui daniausiai naudojamas tabakas, i kurio vienos izoliuotos lstels nesunkiai galima iauginti (regeneruoti) vis augal. Gen klonavimas leidia palyginti vairi organizm genomus, j dalis arba pavienius genus, nustatyti j tapatumus (homologij) arba skirtumus. Klonuoti genai ir kitos DNR sekos naudojami kaip molekuliniai zondai aptikti homologinius genus ir DNR sekas kit organizm genomuose. Keliant temperatr dvigrands DNR grandins dl silpn vandenilini ryi atsiskiria viena nuo kitos, o laipsnikai mainant temperatr DNR grandins vl susijungia. Prie svetimos vienagrands DNR zondas prisijungia tik tose vietose, kur yra homologin DNR (DNR grandin komplementari zondui). Naudojami vairs patobulinti metodai homologinms (komplementarioms) DNR sekoms aptikti (DNR hibridizacija ant citologini preparat, Sauterno blotingas ir kt.). Taip atsirado lyginamoji genetika, ir nustatyta, kad daug augal gen yra tapats mogaus, drozofilos, mieli, netgi bakterij genams. Pasitaiko, kai genai i pradi atrandami ir itiriami augaluose, o vliau jie aptinkami ir induoli genome.
Panai ir tolimj hibrid istorija. Maa to, kad augalai uima beveik monopolin padt tiriant iuos hibridus, kad tiriant augalus iaikinta tolimj hibrid (alopoliploid) savybs ir chromosom skaiiaus kitimai, gana danai buvo stebimi ir chromosom formos pokyiai iuose hibriduose. io reikinio prieasi niekas paaikinti negaljo, todl jis buvo jeigu ir ne ignoruojamas, tai pamirtas. Bent naujosios genetik kartos. iuo metu daugelis i chromosom kitim jau iaikinta, ir alopoliploidija tapo labai veiksmingas reikinys genomo evoliucijai tirti. Gauti augal tyrim rezultatai pritaikomi suprasti netgi mogaus genomo evoliucij. mogaus genomas, pasirodo, yra paleo(poli)ploidas. Pogenomin era. XX a. baigsi ne maiau sensacingai, kaip ir XIX a. 2000 m. sensacija buvo mogaus genomo sekoskaita (visos DNR nukleotid sek nustatymas), bet tais paiais metais, po 100 met nuo pakartotino Mendelio dsni atradimo, DNR sekos nustatytos ir pirmo augalo vairenio (Arabidopsis thaliana). i vyki visi lauk, nes vairenio, kaip ir mogaus, genomas turjo didiausi dirb: daug gen ir kit nukleotid sek jau buvo klonuotos ir nuskaityta j seka. Visa, kas vyksta po 2000 m. datos pradta vadinti pogenomine era. Bet oficialus paskelbimas apie kurio nors konkretaus organizmo ir apskritai genomo sekoskait, yra tik virnls. Kada pradjo dygti aknels, ne taip lengva nustatyti. Gali bti daug svarbi dat ir vyki: gal pradia buvo tada, kai 1944 m. trys amerikiei mokslininkai Eiveris (O. A. Avery), Makliaudas (C. M. MacLeod) ir Makartis (M. Mc Carthy) nustat, kad angl bakteriologo Grifitso (F. Griffith) aptikt pneumokok transformacijos reikin sukelia DNR tai buvo pirmas rodymas, kad DNR yra genetin mediaga; o gal dar anksiau, 1941 m., kai Bydlis (G. W. Beadle) ir Teitumas (E. L. Tatum) suformulavo gerai inom tez vienas genas vienas baltymas (polipeptidas) be jos neinotume, k genas lemia;
AUGAL GENETIKA
| 17
poskio taku visoje biologijoje daug kas teisingai laiko 1953 m., kai Vatsonas (J. D. Watson) ir Krikas (F. C. Crick) paskelb DNR sandaros model, pagal kur DNR gali sintetintis ypatingu kopijavimosi bdu replikacija tai btina genetins mediagos savyb; kai 1954 m. vl trys mokslininkai (is skaiius genetikoje, matyt, magikas) Gamovas (G. Gamov), Martynas Yas ir Rias (A. Rich) - paskelb genetinio kodo hipotez, o 1961 m. Nirenbergas (M. W. Nirenberg) ir Matjus (A. Mattaei) surado bd, kaip iaikinti kod; 1969 m., kai Korana (H. G. Khorana) cheminmis priemonmis ir metodais susintetino, o Bekvitas (J. R. Beckwith), apira (J. Shapiro) ir j bendradarbiai iskyr pirmj gen, tiksliau gen grup lac operon i baktrijos Escherichia coli; DNR sintezs metodai nuolat tobulinami iki automat su i anksto numatyta sintezs programa, bet be 1970 m. Temino (H. M. Temin) ir Baltimoro (D. Baltimor) atrasto fermento atvirktins transkriptazs, kuri sintetina DNR nuo RNR matricos, ir ypa 1988 m. Miulio (K. Mullis) sukurto metodo neribotai pagausinti DNR polimerazins grandinins reakcijos (PGR), pasinaudojant archibakterijos Thermus aquaticus DNR polimeraze, dirbtins DNR sintezs galimybs bt labai ribotos; 1972 m. laikomi gen ininerijos pradia, nes Polio Bergo laboratorijoje gauta pirmoji rekombinantin DNR molekul, dirbtinai DNR fragmentams prijungus lipnius galus (D. A. Jackson, R. A. Symonds, P. Berg), ir nors restriktazs buvo atrastos dar 1962 m. Arbero (W. Arber) ir Diuzo (D. Dussoix), tik nuo 1973 m. jos pradtos naudoti DNR fragmentams su lipniais galais gauti (1.2 intarpas); ioje vyki ir atradim grandinje svarbiausias vykis atsitiko 1977 m., kai i karto pasilyti du metodai nustatyti DNR sekas: amerikieiai Maksamas (A. Maxam) ir Gilbertas (W. Gilbert) sukr chemin metod, o angl mokslininkas Sengeris (F. Sanger) fermentin metod, panaudojant nukleotid analogus dideoksinukleotidtrifosfatus. Pastarasis metodas prieinamesnis ir populiaresnis. Jis naudojamas ir automatiniuose sekvenatoriuose. Pamatas jiems atsirasti buvo 1986 m. Hudo (L. E. Hood) ir jo bendradarbi pasilytas Sengerio metodo patobulinimas prie nukleotid prijungti fluorescuojanius daus ir tyrim rezultatus analizuoti kompiuteriais. Po met sukurtas pirmasis DNR sekvenatorius, o kompiuteriai tapo nepamainomais rankiais genomui tirti. Toliau DNR sekoskaitos ir kompiuterins analizs metodai ir programos labai spariai tobuljo. Tikslas - apimti kuo didesn genomo dal. Taip pat atsirado ratinio autuvo, chromosom iskyrimo, dideli DNR fragment/puls elektroforezs metodai. Paanga matoma ir pagal visikai sekvenuot genom dydius: 1976 m. vienagrandio fago X174 tik 5387 b 1982 m. bakteriofago 49 kbp 1995 m. bakterij Haemophilus influenzae 1,8 Mbp 1996 m. mieli Saccharomyces cerevisiae 14-20 Mbp 1997 m. bakterij Escherichia coli 4,2-4,7 Mbp 1998 m. nematodo Caenorhabditis elegans 80-100 Mbp 1999 m. 2-osios ir 4-osios vairenio chromosom atitinkamai 19,6 ir 17,5 Mbp
18 |
2000 m. didysis uolis: mogaus (Homo sapiens) ~ 3150 i 3300 Mbp drozofilos (Drosophila melanogaster) 140-170 Mbp vairenio (Arabidopsis thaliana) 115 Mbp i 125 Mbp Tai vis vykiai, be kuri vis organizm, tarp j ir augal, genom ir gen tyrimo istorija bt nepilna, sunkiai suvokiama. Mokslas pogenominje eroje nestovi vietoje. Prasidjo funkcins ir lyginamosios genomikos amius.
Funkcin genomika tiria viso genomo suderint gen funkcionavim, apibdina transkriptom transkribuojam RNR visum (tiria transkriptomika) ir proteom genomo koduojam baltym visum (tiria proteomika). Ir vl viena visam mokslui svarbi data: 1999 m. pradtos naudoti mikrogardels, kuriomis galima vienu metu tirti daugelio gen raik. Tai labai veiksminga funkcins genomikos priemon, efektyviai taikoma tirti augal genomo atsakus vairius aplinkos veiksnius.
1.2. Objektas augal genetikoje

irniai savidulkis augalas. Tai privalumas. Visikai pagrstai manoma, kad viena i pagrindini Mendelio skms prieasi yra labai vykusiai tyrimams pasirinktas augalas irniai, taiau tai ne atsitiktin skm, kuri danai lydjo Mendel, o labai apgalvotas pasirinkimas. irniai yra savidulkis augalas, todl negresia pavojus, kad tiriami augalai gali atsitiktinai susikryminti su alia auganiais augalais. Savidulki augal kryminimas yra visikai tyrjo rankose. Hibridai gaunami tik motininiam augalui dirbtinai paalinus kuokelius ir apvaisinus tok kastruot augal kito augalo iedadulkmis. irni pasirinkim lm ir kiti j privalumai. Mendelis i dviej savidulki augal pupeli ir irni, jau grynai vertins savo patirtimi pastarj auginimo privalumus (pvz., kad irni augal galima daugiau auginti maesniame plote, jie auktesni, todl patogiau juos dirbtinai sukryminti), pirmenyb skyr irniams. Tik vliau, jau atlikus genetin hibrid analiz, paaikjo ir kiti, genetiniai, savidulki augal privalumai. Savidulkiai augalai negali ilgai ilikti heterozigotiniai. Gana greitai hibrid kartose jie tampa homozigotiniais, genetikai grynais. Dl ios prieasties lengviau pasirinkti reikiam tv genotip homozigotas arba heterozigotas, lengviau sprsti ir apie lytini lsteli genetines ypatybes (smulkiau apie tai r. 1.4 sk.). Krymadulki augal homozigotinms, genetikai grynoms linijoms gauti reikia naudoti ilgalaik vais ir specialiais metodais tikrinti augal genotipus, ar jie nra heterozigotiniai pagal tiriamus genus. Veiksniai, nulemiantys objekto pasirinkim. I istorins apvalgos (1.1 sk.) galjome sitikinti, kad genetikoje vyraujantis objektas keit objekt, ir genetikos istorij galima skirstyti epochas ir pagal tyrimo objektus: augalus keit drozofila, i mikroorganizmai, o juos vl pakeit sudtingesns genomo sandaros eukariotai, tarp j vl augalai. Prieasi pasirinkti tyrimo objekt yra kelios. Augalo ekonomin svarba yra pirmaeilis dalykas, todl suprantamas dmesys kviei, kukurz, miei, ryi, sojos ir kit ems kio augal genomams. ia daug reikia istorins-nacionalins tradicijos. Atsiranda regioniniai, nacionaliniai prioritetai, tarkim, AmeAUGAL GENETIKA
| 19
rikoje kukurzai, soja: Kinijoje soja ir ryiai, Japonijoje ryiai. i augal ekonomin svarba stimuliavo atitinkam genomo projekt atsiradim (2.2 sk.). Lyginamasis/evoliucinis aspektas skatina tirti ir lyginti vairias augal grupes, tiek pagal vis genom, tiek pagal atskirus genus. Tai evoliucins ir lyginamosios genetikos sritis. Sukaupt apie augalo genom duomen visuma (baz). Lengviau ir netgi patikimiau tyrimus atlikti su gerai itirtais augalais, apie kuri genom turima kuo daugiau ini. Taip istorikai irykja pagrindiniai objektai. Daniausiai pradin susidomjim tokiu objektu lm biologiniai privalumai, o iuo metu ir gerai itobulinti tyrimo metodai, sukauptos ir toliau labai gausjanios inios apie j genom, pagaliau gausios mutant kolekcijos. Dl i prieasi iuo metu augal genetikos pagrindinis objektas yra ne kukurzai, ne kvieiai ar ryiai, o lauk piktol, smulkus augallis vairenis (Arabidopsis thaliana). Jo pasirinkim irgi lm biologiniai privalumai (1.3 intarpas).
1.3 intarpas. Vairenis (Arabidopsis thaliana) pagrindinis modelinis augal genetikos objektas Baltaiedis vairenis (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) bastutini (Brassicaceae) eimos augalas yra pagrindinis augal fiziologijos, genetikos ir molekulins genetikos objektas. Sukauptos inios apie vairenio genom ir genus taikomos kitiems augalams. Vairenio genome nustatyt DNR sek iekoma kit augal, tarp j ems kio, genomuose. Be to, vairenio DNR sekos/genai lyginami su kit organizm mogaus, pels, drozofilos, nematodo Caenorhabditis elegans genomais, kaip tai buvo padaryta paskelbiant apie mogaus genomo sekvenavim (r. Science, 2001, vol. 291, nuo 1304 p.). Gan daug vairenio gen mutacij atitinka mogaus paveldimas ligas (pvz., Menks/ Wilsono ligas) ir naudojamos kaip modeliniai objektai tirti i lig gen pasireikimui. Vaireniu genetikai susidomjo dl smulkumo ir greito brendimo. Tai 730 cm aukio augalas su lap skrotele pamate ir negausiai lapuotu stiebu (1.3 pav. sp.). Dl smulkumo vairenis, kaip ir drozofila, tinka auginti mgintuvliuose arba laboratoriniuose induose. Stiebas labai itsta,
1.3 pav. Baltaiedis vairenis (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.):

1 bendras augalo vaizdas; 2 iedynas; 3 lap skrotel; 4a anktarl; 4b atsidariusi anktarl su sklomis.
20 |
kai brsta vaisiai, todl auginant aseptinmis slygomis kamiai, kuriais iki tol buvo ukimti laboratoriniai indai, atkemami.Taip gaunama daugiau skl arba galima tirti embriono letales (vien i mutacij ri). Vairenis labai lengvai regeneruoja i meristemini kultr. i savyb yra labai svarbi gen ininerijoje, klonuojant genus. Taiau svarbiausia vairenio botanin ypatyb, dl kurios vokiei genetikas Laibachas (F. Laibach) 1943 m. pasil vairen naudoti genetiniams tyrimams, tai efemerinis, labai greitai brstantis augalas. Natraliai Lietuvoje auga pietryi rajonuose lengvose nederlingose dirvose, ant lait, dirvonuose, kitur retas, bet ydi anksti balandio-gegus mn. ir greitai brandina sklas. Tad kaip piktol, j nelabai kreipiama dmesio. Ilgadienis augalas, kuriam, be to, reikalinga vernalizacija (temperatros okas). Jis vystosi ir be i slyg, bet labai ilgai iki 150 dien, todl laboratorijoje jam sudaromos reikiamos slygos. Tada jis subrsta per madaug 1 mn. Bdinga savidulka. Tai svarbu ne tik dl aseptini slyg, kur kiekvienas augalas daniausiai auginamas atskirame mgintuvlyje, bet ir genetins analizs rezultat patikimumo. Nepaisant savidulkos, lengva gauti hibridus. Sklos labai smulkios (0,5 mm), bet nuo vieno augalo j daug. Tai irgi svarbus privalumas.
1.4 pav. ioveinio (Antirrhinum majus) ir vairenio (Arabidopsis thaliana) ortologai mutantai
(ioveinis pagal E. Coen. http://www.jic.ac.uk/staff/enrico-coen/index.htm; vairenis pagal F. Wellmer et al. Plant Cell. 2004, Vol. 16, P. 13141326; J. Alvarez et al. Plant Journal. 1992, Vol. 2, P. 103116).
Laibachas sukr pirmj genetin vairenio kolekcij, rinko vairenio rasi/ekotip kolekcij po vis Europ. Vertingiausi ekotipai buvo tie, kurie buvo lengviausiai auginami aseptinmis slygomis. Po ilgos atrankos jais tapo du etaloniniai ekotipai Columbia ir Landsberg erecta. Pastarasis turi mutacij erecta, dl kurios augalai yra smulks, neigulantys. Juokaujama, kad plote, atitinkaniame A4 formato popieriaus lap, galima auginti iki 1000 toki augal. Columbia ekotipas (kils i JAV Kolumbijos valstijos, ekotip pavadinimai yra pagal vietov, i kur jie kil) yra labai nereiklus aplinkos slygoms. Landsberg erecta ir Columbia ekotipai yra baziniai tirti vairenio genom. Kitas vokiei genetikas Riobelenas (G. Rbbelen) sukr pirmj mutant kolekcij ir 1961 m. pradjo leisti informacin biuleten Arabidopsis Information Servis. Pirmuosius biocheminius vaireAUGAL GENETIKA
| 21
nio mutantus, nesintetinanius vairi mediag (pirmieji mutantai vitamin), Australijoje gavo Lengridas (J. Langridge), taiau didiausiu i mutant gamintoju ir tyrju tapo vengr kilms amerikietis Redjis (Redei). Taip vairenis persikraust u Atlanto. Nuo biochemini mutant prasidjo vairenio ir apskritai augal biochemin ir molekulin genetika. Su biocheminiais vairenio mutantais netgi patogiau dirbti negu su analogikais bakterij mutantais. Tuo sitikino ir i eilui autorius. iuo metu stambiausi vairenio tyrimo centrai yra ne tik JAV Kalifornijoje, ikagoje, alia Niujorko, bet ir kitose alyse Pranczijoje, Anglijoje, Japonijoje. Lietuvoje vairenis genetiniuose tyrimuose naudojamas labai ribotai, genetiniams tikslams pradtas auginti nuo 1965 m. Vilniaus universiteto Biochemijos, biofizikos ir genetikos katedroje. Gauti pirimidin sintezs mutantai i Lengrido ir Redjo. Kiek vliau vairenis pradtas auginti Botanikos institute Augal fiziologijos laboratorijoje, grups, kuri tiria augalo augim nesvarumo slygomis,nes vairenis yra nepamainomas kosmonautas, skraidintas daugelyje ilgalaiki kelioni kosmos. 1986 m. klonuoti pirmieji vairenio genai, prasidjo intensyvs ir masyvs vairenio genomo, gen struktros ir funkcijos tyrimai, o 2000 m. Nature urnale (480 tomas, gruodio mn. numeris) paskelbta apie beveik viso genomo sek nustatym. is projektas pradtas mokslini centr konsorciumo mintose alyse. 1991 m. sukurta centrin vairenio duomen baz. Jos internetinis adresas www. arabidopsis.org
Objektai vienam reikiniui. Paprastai nauj genetikos reikini atradimas susijs su vienu kuriuo objektu (augalu). Daniausiai tas augalas, tas reikinys yra prieinamiausias tyrimams, guli paviriuje. Duomenys vis kaupiasi ir kaupiasi, ir objektas tampa pagrindiniu tirti atrast reikin, su juo sukaupiama didiausia duomen baz apie reikin. Suprantama, kad ir toliau tyrimams patikimiau naudoti augal. Keletas toki objekt pavyzdi: tabak lengva klonuoti, regeneruoti augal i vienos lstels tai nepamainomas objektas augal klonuotiems genams tirti; pupos (Vicia faba Moenh.) dl stambi chromosom, o kreisv (Crepis capillaris (L) Wallr.) ir Haplopappus dl mao chromosom skaiiaus yra puiks objektai augal citogenetiniams tyrimams; rgtyns (Rumex acetosa L.) turi tokias pat lytines (X, Y) chromosomas kaip ir mogus ar drozofila ir yra bazinis objektas io tipo lyties paveldjimui tirti, ir tokie objektai keiiasi anksiau vyraujantis buvo kitas augalas - akinys (Melandrium album Garce); kukurzai yra bazinis augalas mobiliesiems (judriesiems) genomo elementams tirti, nes jie buvo atrasti ir detaliai itirti kukurzuose kukurz grd spalva ir isidstymas burbuolje labai patogs poymiai tirti ne tik mobiliuosius genomo elementus, bet ir gen sankib, krosingover ; daugiausia ini apie papildomas B chromosomas sukaupta tiriant augalus, ir vienas i klasikini objekt joms tirti yra rugiai (Secale cereale L.); naujas genetikos reikinys permutacijos, kai genas sudarytas i daugybs segment ir ie vairiuose augaluose derinasi skirtingais deriniais tai lemia atsparum patogenams, aptikta ir tiriama Solanaceae eimos augaluose ir t. t. Istorins aplinkybs irgi labai daug reikia. Vienu pagrindini augal raidos objekt, be vairenio, yra ioveinis (Antirrhinum majus L.), bet tai atsitiko todl, kad tikriausiai, dl subjektyvi prieasi ioveinis buvo labai populiarus genetinis objektas XX a. pra22 |
dioje tarp vokiei genetik. Sukauptos didiuls io augalo mutant (tarp j ir raidos) kolekcijos. Laimei, jos buvo rpestingai saugomos ir labai pravert, kai buvo surasti metodai augal raidai ir raidos genams tirti. Turtingos genetins kolekcijos ikl iovein pirm plan tirti iuos raidos genus. Daugeliu atvej pagrindin objekto pasirinkimo prieastis yra augalo biologins ypatybs. Tuo jau buvo galima sitikinti. Kai kurie augal privalumai inotini, nes yra bendro pobdio. Augalo lstel turi unikali genetin struktr plastides (chloroplastus). Procesas, kuris vyksta chloroplastuose, irgi unikalus ir reikmingas visam gyvajam pasauliui. Tai fotosintez. Be to, chloroplastuose, kaip ir mitochondrijose, vyksta adenozintrifosfato (ATP) sintez, plastids diferencijuojasi ne tik chloroplastus, bet ir leukoplastus ir chromoplastus. Nepaisant to, kad fotosintez vykdo ir cianobakterijos bei kai kurie pirmuonys, vis tik fotosintezs genetika yra augal monopolis. Dauginimosi form ir sistem vairov. Ji kur kas didesn negu gryb. Augal dauginimosi sistemos yra sudtingos, bet nagrinjamos kaip variacija trij sistem: krymadulkos (autbrydingo), savidulkos (vaisos, inbrydingo) ir labai isipltojusio nelytinio dauginimosi kaip bdo isaugoti heterozigotikum ir jo teikiamus privalumus. Lyties raidos vairov nuo vienanami arba dvinami augal iki dvilyi arba vienalyi. Prisiminkime, kad vienanamis augalas turi moterikus ir vyrikus lytinius organus, o dvinamis augalas tik vienos kurios lyties organus. Jo apsivaisinimui btini prieingos lyties augalai. Haplofazs/diplofazs santykio vairov. Augaluose, be lytini lsteli, susidaro ir sporos. Augal gyvenimo ciklas pagal homologini chromosom rinkini skaii dalijasi dvi fazes: haplofaz ir diplofaz Gyvn haplontas labai redukuotas, apsiriboja vien generatyvinmis lstelmis po pirmojo mejozs dalijimosi, kai netgi iedini augal haplontas yra i keli lsteli. Vyrikasis gametofitas (haplontas) yra iedadulk (subrendusi yra sudaryta i 3- lsteli: 2- spermi ir 1-os vegetatyvins), o moterikasis gametofitas gemalo maielis (magnolijn subrends i 7-ni lsteli: kiauialsts 2- sinergidi, 3- antipodi ir 1-os stambios antrins lstels su diploidiniu branduoliu). Btent pasinaudojus vyrikojo gametofito raidos ypatumais gaunami haploidai i iedadulki labai svarbi priemon biotechnologijoje, (augal) genetikoje ir selekcijoje. Palyginti lengva, su nedidelmis finansinmis snaudomis tirti palikuoni kartas. I kitos puss, sudarius reikiamas slygas (labai intensyvus apvietimas ir optimali temperatra), ne tik vairenio, bet ir toki augal, kaip kvieiai, mieiai, per metus galima iauginti iki 11 augal kart, paprastesniuose iltnamiuose 2-3 kartas. Augal genetines kolekcijas lengviau kaupti, tirti ir isaugoti sivaizduokime, kiek kainuoja namini gyvuli kolekcij kaupimas ir tyrimai, kad ir emaituk arkli. Ilaikyti galima ualdyt gyvn sperm, bet kiek kainuoja vietins gyvuli veisls atkrimas ir tyrimai. Kaupiama ir tiriama ne tik natrali ekonomikai svarbi augal vairov ries viduje, bet ir j laukiniai giAUGAL GENETIKA
| 23
minaiiai (kurie danai bna svarbi gen donorai), mutantai, nepanaudoti tolimieji hibridai ir gen ininerijos produktai, iuo metu praradusios ekonomin vert praeities augal veisls - visa tai gali praversti ateityje, kaip jau minti ioveinio raidos mutantai, pradti tirti 8090 met nuo j aptikimo. Danai daug mint veiksni ir privalum persipina viename augale. Pvz., kukurz, kaip objekto, pasirinkim pirmiausia lm istorins-ekonomins slygos: tradicija Amerikoje valgyti kukurz duon ir labai stipri JAV augal genetik mokykla. Taiau nieko nra geresnio u kukurzus tirti heteroz ir dirbtins vaisos pasekmes. Tai susij su dauginimosi sistem ir lyties raidos (vienalyiai iedynai) ypatumais. Hibridins sklos gamyba sklininkysts firmose savo ruotu atvr neipasakytas galimybes diegti genetikai modifikuotus augalus. Pagal i ypatyb kukurzai yra pirmoje vietoje. Tirant kukurzus atrasti judrieji genomo elementai, paramutacijos, neocentrin 10-oji chromosoma ir kt. pavert kukurzus baziniu objektu iems reikiniams tirti. Suprantama, kad duomen baz apie kukurz genom dl vis i prieasi yra labai didel. Ries viduje paprastai pasirenkamas ne vienas, o bent du-trys baziniai genomai populiacijos, ekotipai, veisls ir panaiai. Pvz., vairenio baziniais yra du ekotipai (1.3 intarpas) Columbia (Col) ir Landsberg erecta ekotipai. Ryi yra tiriami du poriai: Oryza sativa subsp. japonica, atstovaujamas veisli Nipponbare ir Zhonghua 11; ir O. sativa subsp. indica veisli 93-11 ir IR36. Kukurz sukurtos 3 genomo bibliotekos naudojantis BAC (nuo angl. bacterial artificial chromosome dirbtin bakterij chromosoma), be to kaip bazinis genomas naudojama kukurz vaisos (inbred) linija B73 ir pan.
1.3. Genetiniai simboliai/augal gen pavadinimai

Mendelis ir raidinis poymi (gen) ymjimas. Tarp naujadar, kuriuos ved Mendelis ir kurie gal daugiau skms atne ne tiek paiam Mendeliui, kiek visai genetikai, buvo raidinis poymi ymjimas. Neabejotinai jis palengvino, supaprastino ir paties Mendelio gaut tyrimo rezultat analiz, taiau kur kas jis buvo reikalingesnis genetikams vliau, kai susikaup daugiau ini apie genus. Poymi/gen ymjimas raidmis leidia hibrid analiz sprsti abstrakiai, kaip matematin udavin. Ypa tai svarbu populiacij genetikai, taiau labai palengvina suvokti ir paprast, kontroliuojam kryminim rezultatus. Mendelis nustat ir poymi ymjimo tvark. Pagal j vyraujantieji (dominuojantieji) poymiai ymimi didiosiomis raidmis, o recesyvieji maosiomis raidmis. Skirtingi poymiai (genai) uraomi skirtingomis raidmis. Tarkim, gelton irni skl spalv tekt ymti A, o ali spalv a, tuo tarpu vyraujani lygi skl form - B, o rauklt skl form atitnkamai b. Nors ir kaip stengiamasi ios tvarkos laikytis, vis tik gerokai nuo jos nutolta. Pasisavinta tik pati mintis vesti genetinius simbolius, gen pavadinimus. Morganas ir mutacij pavadinimai. Jis pirmasis genetinei analizei pradjo naudoti mutantus ir genus vadinti mutacij pavadinimais kok poymio pokyt sukelia mutacija. Antai viena pirmj drozofilos itirt mutacij buvo baltomis akimis angl. white. Taip ir pradtas vadinti genas lemiantis drozofilos aki spalv. Tai recesyvusis genas. Dominuojantysis jo alelis, lemiantis normali rusvai raudon spalv, buvo paymtas taip White (pirmoji raid didioji, pagal Mendel). Taiau patogiau naudoti ne vis pavadinim, o tik santrump. Recesyviojo geno ji yra w, o dominuojaniojo W, taiau pastarojo geno simbolis gali bti ir kitoks w+. Taip su + (plius) enklu genetikoje ymimas vadinamasis laukinis tipas (angl. Wild Type) normal poym lemiantis genas (alelis). Tai
24 |
visikai nebtinai dominuojantysis genas, kaip iuo White atveju. Pasitaiko gana daug ir dominuojanij mutacij. Tada normalj poym lemiantis genas yra recesyvusis, bet pagal priimt tvark j reikia ymti su + enklu. Augal genetikoje, kad nesusipainiotiume tarp plius, normalusis tipas daniausiai ymimas santrumpa WT arba wt (1.1 lentel).
1.1 lentel. Vairenio (Arabidopsis) ir ioveinio (Antirrhinum) iedyno/iedo raidos homologiniai genai (ortologai)1 Koduojama funkcija
iedyno/iedo meristema, ydjimo laikas iedyno/iedo meristema, ydjimo laikas Sveika tarp iedyno ir iedo meristem /reguliacija iedo organai A klas3 B klas B klas
Vairenis
LEAFY (LFY)
ioveinis
FLORICAULA (FLO)
Mutanto fenotipas
iedynai virt gliais, iedas i taurlapi ir piesteles panai organ Determinantinis2 iedynas, sumajs ied skaiius Skirtingai pasireikia4 Be vainiklapi ir taurlapi Be vainiklapi ir kuokeli
TERMINAL CENTRORADIALIS FLOWER 1 (TFL 1) (CEN) UNUSUAL FLORAL ORGANS FIMBRIATA (FIM) (UFO) APETALA 1 (AP 1) SQUAMOSA (SQUA) APETALA 3 (AP 3) DEFICIENS (DEF) PISTILLATA (PI) GLOBOSA (GLO)
Be kuokeli ir piesteli PLENA (PLE) AGAMOUS (AG) C klas 2 - r. taip pat 1.4 pav.; - Indeterminantinis iedynas neriboto augimo, tokie yra normals vairenio ir ioveinio iedynai; determinantinis riboto augimo iedynas, paprastai baigiasi virniniu iedu; 3 - Normalus vairenio arba ioveinio iedas yra sudarytas i keturi menturi: 1 taurlapiai, 2 vainiklapiai, 3 kuokeliai, 4 piestels. Taurlapius lemia A klass genai, vainiklapius A ir B klass genai, kuokelius B ir C klass genai, piesteles tik C klass genai; 4 - ioveinio yra determinantinis iedynas su labai daug ied; vairenio sutrikusi iedo raida, danai vietoj kuokeli ir vainiklapi yra silai (filamentai).
1
Augal gen ymjimas. Morgano pasilyta tvarka vadinti genus pagal mutacij pavadinimus naudojama ir augal genetikoje. Taiau, kaip ir kit organizm, gen pavadinimai yra atsirad ne vien nuo mutacij. Labai danai tai ir yra pavadinimas poymio, savybs, mediagos, fermento, kur lemia genas. Pvz., augal pigment fitochrom genai ymimi PHY arba phy, cirkadinius (paros bgio) ritmus reguliuojantis vairenio genas CIRKADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1 (CCA 1) arba kitas genas EARLY FLOWERING 4 (ELF 4). Pasitaiko ir subjektyvi, geno atradjo pasilyt pavadinim, kaip pvz., vienas i ioveinio raidos gen PHANTASTICA (PHAN). Blogiau, kai tas pats genas vadinamas keliais pavadinimais, turi sinonimus. Tai susiklosto dl istorini aplinkybi, daniausiai dl to, kad skirtingos mokslinink grups tiria skirtingas to paties geno koduojamas ypatybes, o kartais ir dl to, kad ios mokslinink grups dirbo skirtingose alyse. Tarkim, miei mutacija Hooded (angl. su gobtuvu, nes varpos akuotas virts papildomu invertuotu iedu, primenaniu gobtuv), vadinama ir Kap (vok. Kapuze). Rusai iuos mieius vadina dar kitaip pagal varieteto pavadinim furkatiniais (var. trifurcatum). is pavyzdys pakankamai rodo, kad turi bti (ir yra) tarptautiniai centrai, kurie tvarko, standartizuoja konkretaus augalo gen pavadinimus ir kaupia
AUGAL GENETIKA
| 25
apie juos vis informacij, leidia gen katalogus, informacinius biuletenius ar net urnalus (r. 1.3 intarp), pvz., Barley Genetics Newsletter (skirtas vien tik mieiams). Gen pavadinim tvarka. Atidesnis skaitytojas galjo pastebti, kad visus gen pavadinimus ir j santrumpas rame kursyvu. Tai pirmoji bendra vis organizm visiems genams taisykl. Ji leidia atskirti, kur yra genas, o kur jo koduojamas poymis, geno produktas. Pvz., dna reikia, kad genas koduoja baltym, kuris dalyvauja DNR sintezje. Vienas i DNR reparacijos gen yra uvrA, o jo produktas baltymas UvrA. Kursyvu raomi ir mutacij pavadinimai. Antroji taisykl, atsiradusi nuo Morgano laik, genus ir mutacijas vadinti anglikai. Tai, inoma, palengvina atskirti gen simbolius nuo taksonomini vienet pavadinim ries viduje, kurie, kaip inia, turi lotynikus pavadinimus (tarp kitko, irgi raomus kursyvu). Taiau kaip ir kiekviena taisykl, ir i turi daug iimi. Nevengiama ir mutacij pavadinim, kilusi i lotyn kalbos, pvz., chlorofilini (augalo pigmentacijos) mutacij pavadinimai albina, xantha, viridis, maculata ir kt. (r. taip pat 1.1 lentel). Pasitaiko pavadinim ir i kit kalb kai genai vadinami atradjo kalba, bet tai jo teis. Tai atsitik ne tik dl istorini prieasi (kur ir kada atrastas genas), bet ir dl subjektyvi, netgi patriotini aplinkybi. Rykiausiai tai matyti drozofilos genetikoje. Gen pavadinimuose amintos itisos ymiosios kilmingosios dinastijos kaip valois, vasa, tudor. genetik plsteljo ne tik vokiki, bet netgi japoniki gen pavadinimai fushi tarazu, shibire (pastarasis reikia rstus, matyt, i ia kilo ir Sibiro pavadinimas). Tik, inoma, pavadinimai raomi ne hieroglifais, o lotyniku riftu. Augal genetikoje kit kalb (ne angliki arba lotyniki) pavadinimai retesni, bet irgi pasitaiko, ypa vokiki, kaip antai augal raidos genas WUSCHEL (WUS), daigo raidos mutacijos gurke (gk), doppel (dp). Vienas judrusis genomo elementas pavadintas netgi kelt kalba crwydryn (klajnas). Treioji taisykl yra sutarta gen raymo tvarka kiekvienam atskiram augalui. Jeigu pastebjote, iki iol visus vairenio ar ioveinio genus itisai rame tik didiosiomis raidmis. Tas pat daroma ir 1.1 lentelje. Tai yra nustatyta tvarka iems augalams, netgi kai geno pavadinimas i keli odi. Vairenio ir ioveinio mutacijos, atvirkiai, raomos tik maosiomis, arba tik pirmoji raid didioji, jeigu mutacija yra dominuojanti. Genai-ortologai. Gen klonavimo ir sekoskaitos technologijos leidia palyginti genus, nustatyti j homologij ne tik ries viduje, bet ir palyginti genus vairi organizm genome. Paaikjo, kad daug gen yra giminingi netgi labai nutolusiuose organizmuose. Istorikai jie bendros kilms, kil i bendro protvio. Tokie genai vadinami ortologais. inoma, kuo augalai artimesni, tuo daugiau jie turi ortolog. Pvz., kukurz ir ryi genai ortologai sudaro 72 %. Abu augalai priklauso tai paiai Poaceae eimai. iuo metu stengiamasi ortologus vadinti tuo paiu pavadinimu, tik prie geno pavadinimo (tiksliau, jo santrumpos) priekyje pridedamos dvi (o kartais viena) raids. Jos yra genties ir ries pavadinim pirmosios raids: vairenio (Arabidopsis thaliana) At, kukurz (Zea mays) Zm, miei (Hordeum vulgare) Hv ir pan. Taiau ilik ir skirtingi ortolog pavadinimai vairiuose augaluose (1.1 lentel ir 1.4 pav. sp.). i gen pavadinimai atsirado dar prie klonavimo-sekoskaitos technologij atsiradim, ir gen homologija rodyta vliau, taiau ankstesni gen pavadinimai iliko nepakeisti, todl ortologai gali bti vadinami ir skirtingais pavadinimais. Poligen ymjimas. Poligenai lemia kiekybinius poymius, j poveikis sumuojasi, todl visi t pat kiekybin poym lemiantys genai danai ymimi tais paiais simboliais,
26 |
tik pridedami papildomi indeksai R1, R2, R3 ir t. t. (angl. red raudona ied spalva) arba C1, C2, C3 ir t.t. (angl. colour spalva) ir pan. Danai taip pat vadinamos ir mutacijos, nulemianios tok pat fenotip. Pvz., visi be vako apnao ant lap ir stiebo augalai vadinami eceriferum, nors gen, kurie Poaceae eimoje lemia tok fenotip, aptikta apie 100. Gen santrumpos. Vis geno pavadinim gana danai i keli odi ir dar didiosiomis raidmis nepatogu rayti, todl vartojamos gen santrumpos i 1-3, o kartais net 4-6 raidi. Svarbu, kad skirting gen jos nesutapt, todl kartais ir prireikia didesnio raidi skaiiaus. Santrumpos irgi yra registruojamos gen kataloguose. Santrump i kairs puss prailgina jau mintos nuorodos augal gent ir r At, Zm, Hv... ir i deins papildomi skaiiai arba raids pagal gen, lemiani bendr proces ar poym, raikos arba atradimo eil. Pvz., visi fitochrom genai ymimi i eils raidmis PHYA, PHYB, PHYC..., o iedo organ raidos genai APETALA (r. 1.1 lentel) skaiiais AP1, AP2, AP3.
1.4. Genai chromosomose. Paprasiausi augal poymi paveldjimo dsningumai

Mendelio atrasti poymi paveldjimo dsniai. Mendeliui i ties seksi, bet ne todl, kad jis pasirinko grietai, privalomai (obligatiniai) savidulk augal irnius ir tyr tik riboto poymi skaiiaus paveldjim, be to, pereidamas nuo paprasiausio monohibridinio kryminimo, kur tvai skiriasi tik vienu alternatyviuoju poymiu, prie sudtingesni dihibridinio, trihibridinio kryminim, kur analizuojamos dvi arba trys poymi poros. Visa tai jis dar smoningai, apgalvotai, pagal i anksto numatyt plan. Mendeliui i ties pasisek, kad jis tyr pat paprasiausi poymi paveldjim, kai vienas genas aleli poroje yra visikai dominuojantysis, o kitas recesyvusis, todl pirmojoje hibrid kartoje (ymimoje F1) visi palikuonys vienodi (1.1 pav ir 1.5 pav.); kitose kartose aptinkami tik dviej fenotip (poymi) augalai, kaip buvo j tvai; tyr nepriklausomai paveldimus poymius (genus), nesusidr su gen sankiba, kuri tiek pat prasta kaip ir nepriklausomas poymi paveldjimas; nesusidr su sveika tarp nealelini gen dihibridiniuose kryminimuose, dl kurios F2 santykis bt ne 9:3:3:1, o koks nors kitoks, pvz., 9:7, 13:3, 9:6:1 ir pan. ne visos ios gen sveikos ir iuo metu iaikintos; nors irniai yra savidulkis augalas, jiems bdingas tipikas lytinis procesas: susilieja dvi lytins lstels su haploidiniais chromosom rinkiniais, o galjo pradti nuo vanags (Hieracium ), kuriai bdinga apomiks. Tada tikrai neturtume Mendelio dsni, kurie yra trys: pirmosios hibrid kartos (F1) vienodumo/dominavimo; skilimo pradedant antrja hibrid karta (F2) palikuonys susiskaido grupes tam tikrais santykiais: grupi skaiius ir santykiai priklauso nuo tirt poymi skaiiaus ir nuo gen sveikos pobdio; nepriklausomo poymi paveldjimo. Prie Mendelio dsni priskirtina ir gamet (lytini lsteli) genetinio grynumo taisykl. ios taisykls esm tai, kad lytinse lstelse yra tik po vien gen i kiekvienos alelini
AUGAL GENETIKA
| 27
gen poros. Tai btina slyga pasireikti Mendelio dsniams.iuo atveju Mendeliui tikrai seksi, nes galjo pasitaikyti poliploidins augal rys arba veisls, ir i taisykl negaliot. Genetin gamet grynum nulemia ypatingas lstels dalijimosi bdas mejoz, kuri buvo atrasta gerokai vliau po Mendelio darbo (1.1 intarpas), o dukterini chromosom paskirstymo dsningum reikm paveldjimui dar vliau, bet Mendelis ne tik suvok, kaip svarbios gamet genetins ypatybs paveldjimui, bet ir sugalvojo metod tirti lytini lsteli genotipus analitin, arba tiriamj, kryminim. Tai tik parykina Mendelio genealum. Chromosomos ir Mendelio dsniai. Pirmasis chromosomas, kaip paveldimumo vienet talpykl, dmes atkreip Veismanas (A. Weismann), taiau kur kas labiau prie tiesos priartjo de Fryzas. Jis man, kad paveldimumo vienetai, esantys chromosomose, padvigubja ioms dalijantis iilgai pusiau ir paskui taisyklingai paskirstomi dukteriniams branduoliams ir lstelms. Pakartotinai atradus Mendelio dsnius, Boveris (Th. Boveri) ir Satonas (W. Sutton) grynai teorikai velg, kad Mendelio dsnius lengva paaikinti homologini chromosom pasiskirstymo dsningumais mejozje. Viskas bt labai gerai, jeigu kiekvienoje chromosomoje bt tik po vien gen. Pvz., vairenis haploidiniame rinkinyje turi 5 chromosomas, o gen apie 29000.
1.4 intarpas. Monohibridinis kryminimas. irniai lygiomis x raukltomis sklomis ar viskas taip paprasta? irniai lygiomisraukltomis sklomis yra daniausiai svarstomas poymis, kur tyr Mendelis. Vadovliuose jis konkuruoja tik su irniais geltonomis ir aliomis sklomis, bet turima omenyje ne skl luobels spalva, kuri tiesiogiai stebima, o sklaskili spalva, todl ios poymi poros analizei reikia papildomo darbo. Taiau ne tai nulm ger skl formos itirtum: dauguma daro irni veisli yra raukltomis sklomis, o tai susij su krakmolo sinteze. Rauklt skl form lemia SBE1 geno mutacija. Genas (WT alelis) lemia ferment amilo (14), (16) transglikozilaz, kuri skelia krakmolo molekulje (14) jungt ir sukelia krakmolo grandins akojimsi. Fermentas turi dvi izoformas I ir II. Viena j vykdo amilazs, o kita amilopektino grandins isiakojim. Mendelio tirti irniai raukltomis sekomis yra atsirad dl mutacijos (transpozono siterpimo), vykusios gene, koduojaniame II izoform. Sumaja krakmolo, pakinta krakmolo grdeli forma, bet padidja cukraus. Skl raukltumas tiesiogiai susijs su padidjusiu cukraus kiekiu. Dl jo didja osmozinis slgis, todl sklas patenka daugiau vandens. Tai padidina sklos tr ir jos ali mas. Kai sklos brsta, jos praranda vanden, ir tos sklos, kurios santykinai turjo daugiau vandens,didamos labiau raukljasi. Kai kryminami homozigotiniai irniai lygiomis ir raukltomis sklomis, poymi paveldjimas vyksta visikai pagal Mendel. F1 hibridai yra visi vienodi, lygiomis sklomis. Vadinasi, lygi skl forma yra dominuojantysis poymis, nes i poymi pasireikimo F1 ir sprendiame apie alelini gen sveikos pobd. Jis gali bti vairus. iuo atveju yra visikas dominavimas. Tuo galime sitikinti i F2F3 rezultat (r. 1.1 pav.). F2 hibridai susiskaido dvi grupes: 3 lygiomis sklomis ir 1 raukltomis sklomis. Tai papil4 4 domas rodymas, kad rauklt skl form lemiantis alelis yra recesyvusis. Treiosios hibrid kartos (F3) analiz mus tikina, kad recesyvusis poymis gali pasireikti tik tada, kai j lemiantis genas yra homozigotins bsenos (aa). Visi tie F3 hibridai, kurie yra augal raukltomis sklomis palikuonys, yra raukltomis sklomis. Tai yra stebima ir tolimesnse hibrid kartose (F4 ir t. t.), nepriklausomai, kiek j bt tiriama. Visai kitaip yra su irniais, kurie F2 buvo lygiomis sklomis. F3 analiz parodo, kad apie toki augal genotip be speciali tyrim arba kitos kartos analizs sprsti negalima. F2 heterozigoti28 |
niai (Aa) augalai visikai nesiskiria nuo homozigotini (AA) lygiomis sklomis augal. O F3F4 galime sitikinti, kad F2 lygiomis sklomis augal buvo dvejop genotip. F3 vienas tredalis buvusi lygiomis sklomis augal taip ir ilieka lygiomis sklomis, kiek toliau i augal kart bt tiriama ( 1.1 pav.,palyginkite F3 su F4). Jie yra homozigotiniai (AA). Didesn dalis (du tredaliai) F2 buvusi lygiomis sklomis augal F3 vl skaidosi grupes 3:1 santykiu kaip ir F2, o tai rodo, kad jie F2 buvo heterozigotiniai (Aa). Jeigu toki augal analiz pratstume toliau (F4), vaizdas kartotsi: i rauklt skl (aa) iaugt augalai tik raukltomis sklomis. Tas pat atsitikt su tredaliu lygi skl. J genotipas AA, o i likusij 2 lygi skl 3 vl iaugt dviej fenotip augalai santykiu 3:1 (j genotipas F3 buvo Aa). Atidiau pastudijavus 1.1 pav., galima sitikinti, kaip staigiai maja heterozigotini augal dalis hibrid kartose: F1 visi augalai buvo heterozigotiniai (Aa, matematikoje visuma = 1,0) Aa; F2 toki augal jau tik pus (2/4=1/2) 1/4AA : 2/4AA : 1/4aa; F3 j sumaja dar pusiau lieka tik ketvirtadalis (1/4); F4 j jau tik atuntadalis (1/8) ir taip toliau, kol vl susidarys dvi homozigot (AA ir aa) grups, nuo ko ir pradjome. Kiekvienoje tolesnje hibrid kartoje heterozigot sumaja pusiau (1/2n, kur n kart skaiius). Tuo naudojamasi tiriant vais, nustatant vaisos koeficient. Taiau istorija su raukltomis sklomis tuo nesibaigia. Nors formaliai nustatomas visikas A alelio dominavimas, ityrus hetrozigotini (Aa) augal krakmolo grdelius, galima sitikinti, kad jie skiriasi nuo abiej homozigotini (AA ir aa) tv krakmolo grdeli sklose. Tokiu bdu galima atpainti heterozigotinius augalus lygiomis sklomis ir be kart analizs. is bdas heterozigotoms nustatyti labiau naudojamas mogaus genetikoje, kur reikia sprsti, ar asmuo neturi recesyviojo geno, lemianio koki nors paveldim lig. Augal genetikoje, kur nekyla problem dl augal kart analizs, jis naudojamas reiau, bet gali bti taikomas gen ininerijoje atpainti heterozigotoms pagal transgenus. Keletas bendro pobdio moral: ir paprasti nereikmingi poymiai gali turti ekonomin vert, ir paprastus poymius giliau ityrus, paaikja j sudtingumas, kaip ir paprast gen sveik . Tad nereikia menkinti kuri nors poymi, kuriuos augalas turi. Isamesni tyrimai gali atskleisti daug naujo apie j reikm ir prigimt (r. V. Ranelis. Genetika. 2000. Vilnius, LMA).
Chromosomin paveldimumo teorija. Jos krjas yra amerikiei genetikas Morganas (T. H. Morgan, 1866-1945) ir jo bendradarbiai Bridesas (C. B. Bridges), Startevantas (A. H. Sturtevant), Maleris (H. J. Muller). Nesvarbu, kad jie tyr vaisin musel. Principai, kuriuos nustat Morganas vienodai tinka visiems eukariotams ir gyvnams, ir augalams. Be to, jis buvo pirmasis, kuris ne tik i tikrj iaikino Mendelio dsni esm, bet ir puikiai suvok, vertino ir panaudojo tiriamuosius kryminimus tirti chromosom genetin struktr. Chromosomin paveldimumo teorija trumpai apibdinama 6 principais. 1. Skilimo principas paaikina, kodl F1 (pirmoji hibrid karta) visa vienoda ir kodl F2 palikuonys skaidosi grupes tam tikru santykiu. 2. Nepriklausomo poymi paveldjimo principas nustato ribas, kada poymiai paveldimi nepriklausomai: a. kai juos nulemiantys genai yra nehomologinse chromosomose;
AUGAL GENETIKA
| 29
b. kai genai yra toje paioje chromosomoje, o atstumas tarp j toks didelis, kad krosingoveris yra danas, susidaro spdis, kad genai paveldimi nepriklausomai. 3. Gen sankibos principas tikina, kad toje paioje chromosomoje yra daug gen, ir (iskyrus 2. b. atvej) genai, esantys toje paioje chromosomoje, paveldimi kartu, sukib. Gen skaiius chromosomoje nra vienodas. Jis priklauso ne tik nuo chromosomos dydio, bet ir nuo chromosomos struktros ypatum kartotini sek, koki dal chromosomoje sudaro heterochromatinas. Gen sankiba riboja nepriklausom poymi paveldjim. 4. Sankibos grupi principas numato, kad poymiai paveldimi grupmis. Grup sudaro genai, esantys toje paioje chromosomoje, nepriklausomai nuo krosingoverio. vairiuose organizmuose sankibos grupi yra nevienodai. Tai priklauso nuo chromosom skaiiaus haploidiniame j rinkinyje. Vairenis turi n=5, tad ir jo gen sankibos grupi yra penkios, o kukurz n=10, tad sankibos grupi yra deimt. Mitochondrijos ar plastids turi tik po 1- DNR molekul, kuri galima vertinti kaip atskir chromosom, tad i organoid DNR koduojamos savybs paveldimos viena grupe. 5. Krosingoverio principas rodo, kad vis dlto gaunami nauji sukibusi gen deriniai gen sankiba nra absoliuti. Tai atsitinka dl reikinio, kur Morganas pavadino krosingoveriu (angl. crossing, susikryiavimas, susikirtimas, over-per). Konjugav chromosomos gali apsikeisti segmentais. Anksiau manyta, kad tai vyksta tik mejozje. iuo metu sitikinta, kad krosingoveris vyksta ir mitozje. Krosingoveris vyksta labai sudtingai, bet mejozje jis yra privalomas reikinys. Tarp homologini chromosom keiiamasi ir visikai tapaiais segmentais. Kitaip homologins chromosomos netaisyklingai paskirstomos tarp dukterini branduoli. Labai padaugja aneuploid (organizm su pakitusiu pavieni chromosom skaiiumi). 6. Linijinio gen isidstymo principas tikina, kad kiekvienas genas chromosomoje turi savo viet. Vieno ar gen grups vieta yra vadinama lokusu. Homologinse chromosomose toje paioje vietoje (lokuse) yra visikai tapats arba aleliniai genai. Taiau gen chromosomoje yra daug, ir jie isidst vienas paskui kit eksperimentikai nustatoma linijine tvarka. Principu nusakoma, kad toje paioje vietoje negali bti dviej (ar daugiau) nealelini gen, bet tam ir taisykls, kad bt iimtys. Pasitaiko sanklotini gen, kai viename gene telpa dar vienas genas arba du genai i dalies persikloja. Gali pasitaikyti netgi toki lokus, kur viena DNR grandin koduoja vien RNR ir baltym, o kita visai kit RNR ir baltym. Sanklotiniai genai danesni genetinse struktrose, kurioms tenka taupyti genetin mediag. Taip pasitaiko, pvz., mitochondrij DNR. Daniausiai sanklotiniai genai aptinkami virus genetinje mediagoje, tarp j ir augalini RNR virus. Didels apimties ir talpos augal branduolio genomuose sanklotiniai genai nereikalingi, bet irgi pasitaiko. Tai nulemia i gen valdymo ypatumus. Chromosomos ir poymi paveldjimas. Tai daugiau apibendrinimas to, kas jau inoma ir anksiau nagrinta. Galima iskirti tokius su chromosom padvigubjimu ir paskirstymu susijusius gen paveldjimo momentus: chromosomoms (DNR) padvigubjant, dvigubja ir visi chromosomoje esantys genai; mitoz taisyklingai padalija kiekvienos chromosomos (tuo paiu geno) kopijas dukterinms lstelms;
30 |
visos lstels, atsirad mitozs bdu, turt bti vienodos genetins informacijos, taiau jos gali skirtis, ir tai viena i sudtingiausi genetikos problem; taiau poymi/gen paveldjimui palikuoni kartose svarbiausia, kas vyksta mejozje: homologins chromosomos konjuguoja ir taip tiksliai, kad iki iol nesuprantamas toks tikslumas; homologini chromosom konjugacija palengvina galimyb ioms apsikeisti segmentais krosingoveriui, ir jis vyksta tose mejozs stadijose, kuriose homologins chromosomos yra konjugav (zigotenoje ir pachitenoje); krosingoveris yra pirmasis vykis, sukuriantis palikuoni vairov, jo dan tarp atskir gen galima nustatyti, bet jo mast visam genomui, deja, sunku prognozuoti; mejozje prieingus polius keliauja ne tos paios chromosomos kopijos, kaip tai yra mitozje, o homologins chromosomos (1.5 pav.) dl ios prieasties lytins lstels (gametos) turi dvigubai maesn, haploidin (n) chromosom skaii; chromosom skaiius vl tampa diploidinis (2n), kai susilieja dvi lytins (haploidins) lstels, ir tai trunka tol, kol vl vyks mejoz, ir kitoje kartoje viskas kartosis i naujo. Dukterins lstels paveldi vis chromosom su visais joje esaniais genais ir tai vyksta nepriklausomai, ar prie tai vyko ar nevyko krosingoveris (r. 1.5). Tik todl, kad gen chromosomoje daug, ir jie nutol vienas nuo kito (atstumus tarp gen dar labiau padidina vairios kartotins sekos), susidaro iliuzija, kad genai paveldimi nepriklausomai, kas sau. Taip nra derinasi tarpusavyje ne genai, o chromosomos. Kuo j daugiau haploidiniame chromosom rinkinyje, tuo didesn gali bti lytini lsteli genetin vairov. Tai specifinis, tik eukariotams bdingas bdas atsirasti lytini lsteli ir palikuoni vairovei. Organizmo, kuris turi tik vien chromosom por (21), galimybs tokio tipo lytini lsteli vairovei labai menkos ir primena savidulkio augalo monohibridin kryminim: buvo du, atsirado treias, o paskui galutinai vl liko du genotipai (1.4 intarpas). Vairenio n=5, tad galimybs vairovei didesns 25, o kukurz n=10, tai 210 ir pan. Taiau ios vairovs nebt, jeigu homologinse chromosomose genai nesiskirt. Skirtumus tarp alelini gen daniausiai sukuria gen mutacijos. Vl kyla problem prognozuoti vairovs mast, nes reikia inoti, pagal kiek gen yra heterozigotin bkl. Vienai-dviem gen poroms heterozigotikum galima nustatyti, bet visam genomui tai padaryti nelengva, o tiksliau (beveik) nemanoma. Kaip bebt, bet vl tenka grti prie Mendelio: palikuoni genotipus lemia ne tik lytini lsteli vairov, bet ir tai, kokiais deriniais lytins lstels atsitiktinai susilieja.Tiktin zigot genotip skaii galima suinoti, jeigu sudauginti tvinio ir motininio augalo lytini lsteli derini tikimybes: 2n 2n
AUGAL GENETIKA
| 31
Tai daugiau abstraktus skaiiavimas, taiau btina inoti, kas sukuria palikuoni vairov: aleliniai gen skirtumai/heterozigotikumas; krosingoveris; chromosom derini skaiius, kur lemia chromosom skaiius haploidiniame rinkinyje; ie reikiniai/ypatybs lemia lytini lsteli vairov, o atsitiktinis lytini lsteli susiliejimas palikuoni vairov.
1.5. Dihibridinis kryminimas dvi paveldjimo alternatyvos

I chromosomins paveldimumo teorijos princip aiku, kad yra dvi alternatyvos gen/poymi paveldjimui: nepriklausomas gen/poymi paveldjimas; gen sankiba. Skirtumas irykja tik antrojoje hibrid kartoje (F2) ir tik dihibridini kryminim. Ir tai visikai suprantama, nes tik kada tiriama du ar daugiau gen, galima sitikinti, ar jie yra sukib, ar paveldimi nepriklausomai. Nepriklausomas gen/poymi paveldjimas. J aptiko ir ityr Mendelis, nors nieko neinojo nei apie chromosomas, nei apie jose esanius genus. Pakako sugalvoti, kaip tirti lytini lsteli genotipus. Geriausia nagrinti tai, kas labiausiai inoma. Tai kryminimai irni geltonomis lygiomis sklomis su irniais aliomis raukltomis sklomis (1.5 pav.). Pirmieji du poymiai yra dominuojantieji, o kiti du yra recesyvieji. Kryminimo rezultatai yra tokie: F1 visi palikuonys heterozigotiniai (AaBb) geltonomis lygiomis sklomis kaip ir pridera, pasireikia dominuojantieji genai; F2 palikuonys susiskaido keturias fenotip grupes: 9 geltonomis lygiomis (AB), 16 3 geltonomis raukltomis (Abb), 16 3 aliomis lygioms (aaB), 16 1 aliomis raukltomis (aabb) sklomis. 16 A B Svarbiausias momentas suvokti, kodl dihibridas sudaro lygiu santykiu 4 a b genotip lytines lsteles: 1AB:1Ab:1aB:1ab Tai nulemia dvi lygiaverts situacijos kaip chromosomos isidsto mejozs I metafazje, lstels vidurio ploktumoje (1.5 pav.). Abiej i padi tikimyb vienoda 1:1, todl ir dihibrido lytins lstels yra keturi genotip ir vienodu santykiu.
32 |
AB AB
Geltonos lygios
ab ab
alios raukltos
Genotipai
Fenotipai
F1
Gametos
AB AB ab
ab
Visi augalai vienodi
Geltonos lygios
A B a b
arba
A b a B
A b,
Mejozs I metafaz a B,
F2
Gametos
A B , a b,
AB
Ab Ab AB
aB aB AB
ab a b AB
AB
Geltonos lygios
AB AB
Geltonos lygios
Geltonos lygios
Geltonos lygios
Ab
Geltonos lygios
AB Ab
Ab Ab
Geltonos raukltos
Geltonos lygios
aB Ab
Geltonos raukltos
ab Ab
aB
Geltonos lygios
AB aB
Geltonos lygios
Ab aB
alios lygios
aB aB
alios lygios
ab aB
a b
Geltonos lygios
AB ab
Geltonos raukltos
Ab ab
alios lygios
aB ab
alios raukltos
ab ab
1.5 pav. Dihibridinis kryminimas. irni skl spalvos paveldjimas

1.5 intarpas. Kaip Penetas palengvino gyvenim visiems studijuojantiems genetik I genetikos mokslo jaunysts ms laikus yra pasieks labai patogus F2 uraymo bdas, pavadintas j sugalvojusio angl mokslininko Peneto (R. C. Punnett) vardu Peneto gardel, arba Peneto lentel. is bdas ypa praveria nagrinjant sudtingesnes gen sveikas. Taiau jis tinkamas tik monohibridiniam arba dihibridiniam kryminimams. Sudtingesnius (trihibridinius, tetrahibridinius ir t. t.) kryminimus taip pavaizduoti nepatogu. Peneto gardels sudarymo bdas visiems inomas dar i mokyklos suolo, bet pravartu j prisiminti. Peneto gardel sudaroma taip: a) i vieno tako nubriamos dvi linijos: viena vertikaliai
AUGAL GENETIKA
| 33
emyn, kita statmenai pirmajai dein pus; b) ant vertikaliosios linijos suraomi motinos lytini lsteli genotipai ir j santykin dalis, o ant horizontaliosios tvo lytini lsteli genotipai ir j santykin dalis; c) kiek yra motinos ir tvo lytini lsteli genotip, tiek nubriama horizontali ir vertikali linij. J susikirtime susidars langelis yra atskira zigota, kurios genotipas priklauso nuo to, i ko pavedtas alelis - motinos ar tvo. Taiau nepriklausomai paveldim poymi analizei reikia laikytis keli slyg: tvai turi bti homozigotiniai monohibridinio kryminimo (AA ir aa), o norint gauti antrj hibrid kart (F2), F1 heterozigotinius (Aa) augalus kryminti tarpusavyje. irniams to daryti nereikia, nes jie yra savidulkiai augalai, ir apsivaisina patys savo iedadulkmis; mokti parayti tv ir F1F2 hibrid genotipus kiekvienm genui/poymiui atstovauja du aleliai pvz., AA, Aa ar aa. Patirtis rodo, kad augalo genotip raymas daniausiai pasitaikanti klaida; suvokti, kaip susidaro, koki genotip ir kokiais santykiais augalo lytins lstels (homozigotinio augalo visos lytins lstels vienodo genotipo, bet priklauso nuo tiriam gen skaiiaus A ir a, AB ir ab; heterozigotini augal nuo to, keli genai yra heterozigotins bkls: monohibrido vienas (Aa) ir lytini lsteli yra du tipai A arba a; dihibrido yra du heterozigotiniai genai (Aa Bb), o lytini lsteli yra keturi tipai AB, Ab, aB, ab). irni dihibridinio kryminimo, kuris pavaizduotas 1.5 pav., F1 hibridai abiejose gen porose yra heterozigotiniai, todl j lytins lstels yra keturi tip lygiu santykiu: vertikali ir horizontali linij po keturias, langeli 16. Tiek yra genotip derini F2, atsivelgiant ir tai, i ko tvo ar motinos yra paveldtas genas. Tik alia lytini lsteli genotip nenurodyti j daniai, nes vis tip lytini lsteli yra po lygiai. Kai reikia skaiiuoti galim genotip danius, ypa kai lytini lsteli daniai skirtingi, alia lytini lsteli genotip btina nurodyti j danius. Konkretaus genotipo zigot danis yra lygus dani sandaugai t lytini lsteli, kurioms susiliejus atsirado toks genotipas. Taip apskaiiuojama tikimyb atsirasti konkrei genotip palikuonims. Pvz., F1 tikimyb motinos lytinms lstelms AB = 0,25 ir tvo tokio pat genotipo lytinms lstelms AB = 0,25. Sudaugin ias tikimybes ir suinosime, kokiu daniu gali bti palikuoni, kuri genotipas AA BB: 0,25 0,25 = 0,0625, arba
1 . 16
Toks io genotipo zigot danis surandamas ir irni F2 hibrid Peneto gardelje (1.5 pav.). Kokius rezultatus fenotip santykius duoda vairios nealelini gen sveikos, yra labai patogu nustatyti ir kitokiu bdu, pagal sumin F2 palikuoni pagal fenotip skilimo formul. I Peneto gardels dihibridiniam kryminimui (1.5 pav.) akivaizdu, kad kai yra visikas dominavimas, konkreioje gen poroje pakanka vieno dominuojaniojo alelio, kad fenotipe pasireikt dominuojantysis poymis. Fenotipas bus tas pats, ar bt, pvz., homozigota AA, ar heterozigota Aa. Todl labai patogu dihibridinio kryminimo fenotip santyk F2 urayti itaip: 9A B : 3A bb : 3aa B : 1aa bb. ia ir kitur brknys () reikia antrj gen poros alel, kuris nelemia fenotipo. i formul parodo, i koki genotip susidaro fenotip grups.
Sukibusi gen paveldjimas. Alternatyva nepriklausomam poymi paveldjimui gen sankiba atrasta dar 1906 m. Beitsono (W. Bateson), Saunderso (E. R. Saunders) ir Peneto (R. C.Punnett). Jie nustat, kad pelirnio (Lathyrus odoratus) du poymiai ilgos iedadulks ir purpuriniai iedai arba, kaip alternatyva, apvalios iedadulks ir
34 |
raudoni iedai paveldimi kartu. Tik nedidel dalis augal (11,2 %) F2 turjo kitok poymi derin, negu j tvai: ilgas iedadulkes, bet raudonus iedus; apvalias iedadulkes, bet purpurinius iedus. Paaikinti gaut rezultat Beitsonas ir jo kolegos ne tik nepajg, bet ir man, kad tai reta iimtis i Mendelio dsni. Morganas ne tik pakartotinai atrado reikin, bet ir j paaikino. Gen sankiba stebima tarp nealelini gen, kurie yra toje paioje chromosomoje. iuo atveju jau seksi Morganui, nes drozofilos patinli lstelse krosingoveris nevyksta ir galima tirti visik sankib. Krosingoveris rezultat analizei netrukdo. mogaus ir t augal, kurie kaip drozofila turi lytines chromosomas (X ir Y), krosingoverio danis vyrikos lyties organizmuose, kad ir reiau kaip moterikos lyties organizmuose, bet vis tik vyksta. Pelirnis augal grupei, kuri turi lytines chromosomas, nepriklauso, tad visik sankib jo chromosomose galime sivaizduoti tik teorikai. Pirmoji hibrid karta (F1) niekuo nesiskiria nuo t augal, kuri poymiai paveldimi nepriklausomai: visi augalai vienodi, ir F1 pasireikia dominuojantieji poymiai ilgos iedadulks ir purpuriniai iedai, o F2 palikuonys isiskaido grupes monohibridinio kryminimo santykiu 3:1. io reikinio prieastis yra, kad kai yra visika sankiba, F1 hibrid susidaro tik 2- genotip lstels. Teorikai su A ir B atrodyt taip:
P ABab AB ab AB ab AB tik! ab Po krosingoverio j lytins lstels irgi yra lygiu santykiu (tarpusavyje): 1 Ab ir 1 aB Tie 11,2 % augal, kurie atsiranda sukryminus pelirnius, yra krosingoverio pasekm: AB ab ab A a b B Ab aB
Gametos
F1 Gametos
AB A B ab ab AB ab
Peneto gardel: AB AB AB AB ab ab AB
ab AB ab ab ab
AUGAL GENETIKA
| 35
Analitiniai (tiriamieji) kryminimai irgi dvi alternatyvos. Mint, kaip galima tirti lytini lsteli genetines ypatybes, matyt, pakio grtamieji monohibrid kryminimai. Grtamieji kryminimai (nevartotini bekrosai) yra hibrido (heterozigotos) kryminimai su vienu kuriuo tv. Aiku, kad kai kryminami homozigotiniai augalai, pirmosios kartos (F1) hibridai yra visi heterozigotiniai (jeigu nevyksta krosingoveris). Tuo ir pasinaudota. Tarkime, kryminami irniai lygiomis ir raukltomis sklomis:
LL P (tvai) arba AA Lygios
F1 Ll arba Aa Ll Aa Lygios Grtamieji kryminimai: LL arba AA 50 % LL arba AA Visi lygiomis sklomis 50 % Ll arba Aa Lygios 1:1 Ll arba Aa Ll arba Aa 50 % 50 % ll arba aa Raukltos ll arba aa Ll Aa
ll arba aa Raukltos
F2 25% LL arba AA Lygios 50% Ll arba Aa 3:1 Santykis F2 25% ll arba aa Raukltos
36 |
Grtamj kryminim rezultatas priklauso nuo augalo, su kuriuo yra kryminamas monohibridas Aa. Gal atkreipte dmes t grtamojo kryminimo derin, kai heterozigota Aa buvo kryminama su augalu (nebtinai tai vienas tv), kurio tiriamasis poymis yra recesyvusis. Jo genotipas yra aikus, nes recesyvusis alelis pasireikia tik homozigotins bkls. Tai homozigota aa. io derinio palikuonys isiskaido dvi grupes lygiu santykiu 1:1. Tokiu santykiu susidaro ir jo lytins lstels 1 A : 1 a. i aplinkyb numat Mendelis ir j pritaik rodyti, kad lytins lstels yra genetikai grynos, lygiai kaip ir dihibrido AaBb, kuris pagal Mendel turjo sudaryti lygiu santykiu 4 tip lytines lsteles: 1 AB : 1 Ab : 1 ab : 1 ab. Tiek pat ir tokiu paiu santykiu jis gavo ir irni palikuoni. Vliau tokie kryminimai, kai tiriamasis augalas (individas), kurio fenotipe yra dominuojantysis poymis ar poymiai, yra kryminamas su augalu, kurio atitinkami poymiai yra recesyvs, buvo pavadinti analitiniais, arba tiriamaisiais (1.6 intarpas). J labai didel geb genetinei analizei tinkamai vertino tik Morganas, ir tai jam seksi, nes drozofilos patinli lstelse nevyksta krosingoveris, ir galima tirti visik gen sankib. Netrukdo krosingoveris, dl kurio atsiranda papildom genotip lytins lstels. Suvokti io analitinio (tiriamojo) kryminimo gali galima tik sugretinus dvi prieingas genetines situacijas: poymiai yra paveldimi nepriklausomai (1.5 pav.); poymiai yra paveldimi sukib. Kai genai yra nesukib, nehomologinse chromosomose, susidaro, kaip minta, aukiau, lygiu santykiu 4 lytini lsteli tipai, ir kai atliekamas tiriamasis kryminimas, gaunamos lygiu santykiu 4-ios palikuoni grups: 1 AaBb : 1 Aabb : 1 aaBb : 1 aabb. Kaip alternatyva, kai yra visika sankiba, lygiu santykiu susidaro tik du lytini lsteli tipai (pasirinktame pavyzdyje AB ir ab), todl ir palikuoni yra tik dvi grups: 1 AB ab :1 ab ab
Dl krosingoverio susidaro papildomi lytini lsteli deriniai. Tarpusavyje jie irgi yra lygiu santykiu 1:1. Tai nulemia mejoz. Kai genai yra toje paioje chromomoje, bet nutol, paveldjimas ir tiriamojo kryminimo rezultatas atitinka nepriklausom poymi paveldjim, taiau nepaisant to, kok rezultat rodyt krosingoveris, genai vis tiek yra toje paioje chromosomoje, tik formaliai lyg ir paveldimi nepriklausomai. Augal, kuriuose galima stebti visik sankib, iki iol neaptikta. Kandidatai tokius augalus galt bti tie, kurie kaip drozofila turi lytines chromosomas, bet iki iol tirt augal vyrikos lyties augaluose krosingoveris vyksta, nors ir maesniu daniu kaip moterikos lyties augaluose. Tai labai panau mogaus ir kit induoli lsteles. J vyrikos lyties individuose krosingoveris vyksta, bet maesniu daniu.
AUGAL GENETIKA
| 37
1.6 intarpas. Kas tiriama tiriamaisiais kryminimais Diploido lytinse lstelse yra tik po vien alel i kiekvienos gen poros, ir paprastai vis tip gamet yra po lygiai. Tiriamasis kryminimas (angl. test cross) yra tada, kai tiriamasis augalas (individas, galima neinoti jo genotipo), daniausiai heterozigota, kryminamas su recesyviuosius poymius turinia homozigota, kad ir aa arba aabb. Analitiniais kryminimais genotip tyrimo tikslais, savaime suprantama, tiriami augalai tik su dominuojaniuoju poymiu ar poymiais. Tik toki augal genotipas yra neaikus ar tai homozigota, ar heterozigota. Augalo su recesyviuoju poymiu taip tirti nra jokios prasms. Jo genotipas paprastai yra aikus tai homozigota.Tiriamaisiais kryminimais nustatomi tiriamojo individo lytini lstel genotipai kokybikai ir kiekybikai: koki genotip susidaro lytini lsteli, tiek bna palikuoni grupi pagal fenotip; fenotip santykis parodo lytini lsteli genotip santyk; i kryminimo rezultat sprendiama, ar genai paveldimi nepriklausomai, ar yra sukib; nustatomas krosingoverio danis tarp dviej sukibusi gen, o i krosingoverio danio sprendiama apie atstumus tarp gen: jis yra tiesiai proporcingas krosingoverio daniui (tai taisykl su iimtimis): kuo genai artimesni, tuo krosingoverio danis maesnis, ir atvirkiai, kol pasiekiamas toks krosingoverio danis, kad atrodo lyg genai bt nesukib, paveldimi nepriklausomai; tiriamaisiais kryminimais pagal krosingoverio dan tarp trij gen nustatomas atstumas tarp i gen. Tai yra genetinis metodas sudaryti chromosom genolapius. Chromosom genolapiai tai grafikai pavaizduota chromosomos genetin sandara genai, j sekos ir atstumai.
1.6. Nealelini gen sveikos pasireikimas hibrid kartose

Kodl kartais nepasireikia aa? (r. taip pat 1.7 intarp). Taisykl yra tokia: recesyvusis genas gali pasireikti tik aa genotipo homozigotose. Tad i recesyvij poymi, kuriuos turi augalas, i karto galime sprsti pagal kelis recesyviuosius genus jis yra homozigotinis. Tai labai patogi ypatyb, kuria genetikai labai danai naudojasi, ypa tirdami gen paveldjim populiacijose, genetin populiacij struktr. Taiau ia taisykle galima pasikliauti tik tada, kai gerai itirta poymio genetika ir inomos j lemiani gen sveikos su kitais genais ir kiek poymis priklauso nuo vairi iorins ir vidins aplinkos veiksni. Nra taisykls be iimi ir kart. Genotipas gali bti aa, o fenotipas atitinkantis dominuojantj, daniausiai WT, poym. Prieastys, kodl taip atsitinka, yra vairios, bet pagrindins yra dvi: sveika su nealelinias genais (1.7 intarpas); aplinkos ir vidini veiksni poveikis. Nealelini gen sveikos yra labai vairios: polimerija, komplementari, genmodifikatori, epistaz. Pastarieji trys nealelini gen sveikos tipai gali pakeisti aa genotipo pasireikim. Epistaze, genais-modifikatoriais yra reguliuojama gen veikla, todl i sveik mechanizmai aptariami kitur, o polimerija (adityvi gen sveika) bdinga kiekybiniams poymiams. Tik labai trumpai apibdinsime 3 nealelini gen sveikos tipus ir kaip jie gali takoti fenotipus F1 ir F2.
38 |
Komplementari nealelini gen sveika pasireikia labai vairiai, bet jai bdingas nauj fenotip atsiradimas hibriduose. Pasireikia jau pirmojoje hibrid kartoje (F1). Antrosios hibrid kartos (F2) fenotipai ir j santykiai priklauso nuo to, ar gali ie genai savarankikai takoti poymio raid. Santykiai vairs, nuo formaliai tipiko dihibridiniam kryminimui santykio 9:3:3:1 (kai abu genai pasireikia ir savarankikai, bet atsiranda ir nauj fenotip palikuonys) iki vairiai modifikuot dihibridinio kryminimo santyki: 9:7; 9:3:4; 9:6:1. Daniausia ir genetikams svarbiausia yra komplementari nealelini gen sveika, dl kurios pasireikia komplementacija. Nuo jos labiausiai nukenia ir homozigotos su recesyviaisiais genais (aa tipo). Komplementacij stebime sukrymin du daniausiai niekuo nesiskirianius vien nuo kito nul mutantus gauname normalaus, WT (laukinio), tipo hibridus. Sukryminus dvi pelirni (Lathyrus odorata) veisles baltais iedais, F1 visi hibridai buvo purpuriniais iedais, o F2 palikuonys isiskaid dvi gupes: 9 dalys purpuriniais iedais, o 7 dalys baltais iedais. Tok pat rezultat gavo ir prof. M. Natkeviait-Ivanauskien, sukryminusi du gamtinius tbs (Verbascum) mutantus (gelsvai) baltais iedais. F1 visi augalai buvo geltonais iedais, o F2 9 dalys geltonais, o 7 dalys baltais (9:7) iedais. Komplementacijos reikinio prieastis yra labai paprasta, bet svarbi: daugel poymi lemia vienas paskui kit pasireikiantys genai. vairios mediagos, poymiai isivysto per tarpines grandis. Pvz., pigmento antocianino, nudaanio pelirnio iedus purpurine spalva, sintez prasideda nuo nespalvot jungini. Pats labiausiai nutols ioje antocianino sintezs grandinje junginys, i kurio sintetinami flavonoidai, danai yra aminorgtis fenilalaninas. Iki galutinio spalvoto junginio, antocianino vyksta daug tarpini reakcij, kuriose susidar junginiai dar yra nespalvoti. Kukurz nustatyti bent 9 genai, kontroliuojantys ias tarpines reakcijas. Tiek galima nustatyti ir komplementacijos grupi (r. 1.9 sk.), jeigu bt kryminami tarpusavyje vairis kukrz nul mutantai, nesintetinantys antocianino. Bet kurios i reakcij genetinis blokas (nul mutacija) sustabdo vis tolesn reakcij grandin, ir galutinis poymis nepasireikia. Ireikime i situacij labiau apibendrintai, kur atskirus poymio raidos etapus pavaizduokime raidmis: A B C D E Poymis (pigmentas) Tarkime, kad vis vyki grandin nutraukia nul mutacija tarp B ir C (nesigamina fermentas reikalingas B virsti C): A B nul Kito mutanto vyki eiga yra truput toliau pasislinkusi: A B C nul
AUGAL GENETIKA
| 39
1.7 intarpas. Nul mutacijos. Kaip homozigotai aa pasireikia dominuojantysis poymis Recesyvusis alelis, kaip ir kitos struktrins geno formos, atsiranda dl mutacij. Jos vairiai paveikia geno veikl, taiau tarp recesyvij mutacij gana danos tokios, dl kuri genas apskritai tampa neveiklus. Tokios mutacijos turi vairius pavadinimus (amorfins, funkcijos praradimo angl. loss-of-function, nokaut mutacijos angl. knock-out). ie pavadinimai ne tik mados dalykas, bet ir nusako, kokiu bdu mutacija yra gaunama (tai bus dstoma vairiuose knygos skyriuose). Labiausiai apibendrinantis ir daniausiai vartojamas i mutacij pavadinimas yra nul mutacijos, nes i tikrj geno veikla lygi nuliui. Genas visikai nepasireikia. Nul mutacija gali atsirasti dl nukleotid pokyi DNR molekulje vieno geno ribose. ie pokyiai irgi vairs. Kai yra pakaitos, vienas nukleotidas arba j seka yra pakeista kita. Netgi vieno nukleotido pakeitimas kitu gali pasireikti kaip nul mutacija: dl pakaitos gene jo koduojamame baltyme viena aminorgtis pakeiiama kita. Tai missense mutacijos. Jos bus nul mutacijomis, jeigu aminorgties pakaita vyks aktyviajame baltymo centre gal net danesns tarp nul mutacij yra nonsense mutacijos, kai pakeitus vien nukleotid kodone, trij nukleotid derinyje, koduojaniame kuri nors konkrei aminorgt, susidaro vienas kuris nors i vadinamj beprasmi kodon UAA, UAG, UGA. Jie nekoduoja aminorgi. Jais baigiasi baltymo sintez, todl visi ne vietoje atsirad beprasmiai kodonai pasireikia kaip nul mutacijos, nes baltymo sintez nutrksta ties pirmu pasitaikiusiu beprasmiu kodonu. Tik nul fenotipo bna (skaitymo) rmelio poslinkio mutacijos, kurios atsiranda, kai gene ikrenta arba siterpia nukleotid pora. Visikai suprantama, kodl tokios mutacijos neivengiamai yra nul. Joms vykus, sutrinka viso geno koduojanti funkcija: vis kodon (triplet) skaitymas kode pasislenka. I ia kils ir toks i mutacij pavadinimas. Tiek daug dmesio nul mutacijoms skyrme ne atsitiktinai. Vienas pirmj dominavimo aikinim skelb: geno buvimas vyrauja prie geno nebuvim. Daniausiai nul mutacijos yra recesyviosios, bet ne visos. Jas galima prilyginti geno nebuvimui (delecijoms). Heterozigot lstelse pasireikia aktyvusis alelis, kuris arba visikai vyrauja, arba heterozigot (Aa) fenotipas yra tarpinis tarp tvini augal: AA = Aa > aa arba AA > Aa >aa. Tai priklauso nuo WT alelio aktyvumo. Nepriklausomai nuo nul mutacijos atsiradimo prieasi, aptikti nealeliniai genai, kurie slopina tokias mutacijas. Vietoje mutantinio fenotipo (nul) genas normaliai veikia, t.y. vietoj recesyviojo (aa) pasireikia dominuojantysis poymis. Daniausiai mutantinio recesyviojo (aa) alelio veikl itaiso vadinamieji supresoriai. Paradoksalu, bet danai jie patys yra mutantiniai. Ypa danai supresoriai atsiranda dl mutacij,kurios vyksta pernaos (transportini) RNR genuose. Pernaos RNR tenka svarbus vaidmuo baltymo sintezje. Prie j prijungiama aktyvinta konkreti aminorgtis, ir tRNR j pernea ribosomas. Ten ji atsistoja reikiam viet (ir tuo paiu pastato aminorgt). kuri viet atsistoti tRNR, priklauso nuo sveikos tarp mRNR ir tRNR: mRNR kodono pvz., UGG koduoja Trp (triptofan); tRNR antikodono ACC (iuo atveju) Kaip matyti, antikodono seka komplementari kodono sekai. Jeigu UGG kodone pirmasis G bt pakeistas A, vietoj UGG atsirast nonsense mutacija beprasmis kodonas UAG. Mutacijos vyksta bet kuriame gene ir bet kurioje jo vietoje. Tai irgi taisykl, kuri galioja visiems genams, tarp j ir koduojantiems tRNR. Mutacija gali vykti antikodono sekoje tokiu bdu, kad ios tRNR antikodonas tampa komplementariu, tarkim, ne triptofano kodonui
40 |
UGG, o beprasmiam kodonui UAG. iam kodonui komplementari seka tRNR molekulje turi bti AUC. Tad mutacija pasirinktos aminorgties triptofano Trp tRNR gene atrodyt taip: Trp tRNR antikodonas ACC pakaita U Mutantin Trp tRNR antikodonas AUC Mutantinis antikodonas AUC Trp tRNR molekulje atpasta mRNR molekulje nonsense kodon UAG ir i viet pastato triptofan ar kuri nors kit aminorgt su tokiu paiu mutantiniu antikodonu. Svarbu tik, kad ios mutantins tRNR antikodonas bt komplementarus nonsensui: mRNR UAG kodonas tRNR AUC antikodonas Pasirinkto pavyzdio rezultatas bt toks: mutantinje mRNR molekulje ties UAG turjo nutrkti baltymo sintez (nul fenotipas), taiau dl supresoriaus Trp tRNR molekuls mutantinio antikodono AUC beprasmio kodono viet pastatomas triptofanas. Taip fenotipas tampa normaliu netgi kai genotipas aa. Tokiu bdu supresoriai gali itaisyti ir nul fenotipo missense mutacijas, kurios atsiranda dl pokyi aktyviajame polipeptido centre, tai todl genetikai saugo supresori (Sup, sup) kolekcijas kaip didiausi turt. Taiau nul fenotip lemiani aleli itaisymas ia netikras. Itaisomas tik fenotipas. Genas lieka toks pat, koks buvs, ir jo paveldjimas lieka nepakits. Jis vyksta pagal visus Mendelio dsnius. Jeigu augalas pagal abu genus homozigotinis aa SupSup ir jeigu genai nesukib, jo visi palikuonys turs itaisyt fenotip, nes netgi heterozigotos Supsup mutantin tRNR itaisys mRNR geno mutacij. Heterozigot aa Supsup ne visi palikuonys bus normals. Priklausys, kok supresoriaus alel jie pavelds Sup ar sup. Bendra taisykl: itaisomas fenotipas, bet ne genotipas, todl genas paveldimas pagal iam genui galiojanius paveldjimo dsnius.
Jeigu pataikytume sukryminti du tokius nul mutantus, hibrido lstelse, kuriose sintetinamas antocianinas, vyki (reakcij) eiga visikai atsinaujint, o pataikius sukryminti du mutantus, kuriuose vyki eiga nutrkusi tame paiame etape, gautume mutantin fenotip. Taip ir grupuojami mutantai komplementacijos grupes. Kiek yra toki grupi, tiek ir gen grandinje, lemianioje poym. I kitos puss, tai tikra rykt tiems, kurie augina veisli kolekcijas, usiima veislininkyste. Vis laik gresia genetinis veisli usiterimas dl spontanins hibridizacijos. Pvz., auginant kelias saldij lubin veisles, realiai jos usiteria augalais, kuriuose vyksta alkaloido sintez. Tai atsitinka skirting veisli augalams spontanikai susikryminus. Epistaz (gr. epistasis vyravimas) yra labai panai dominavim nealelini gen sveika. Abiem atvejais slopinama geno veikla, tik dominavimas yra sveika tarp alelini gen, o epistaz tarp nealelini gen. Genai, kurie slopina, vadinami epistaziniais, o kurie yra slopinami hipostaziniais. Epistaziniai genai turi ir kitoki pavadinim: inhibitoriai (ymimi I, i), supresoriai (Sup, sup). 1.7 intarpe aptarti supresoriai, tRNR antikodono nukleotid sekos mutacijos, priklauso iai grupei. Epistazs sutapimas su dominavimu yra tik formalus, pagal pasireikim slopinim, vieno geno vyravim prie kit. Kuo jie skiriasi? Epistaziniai genai vienu metu gali slopinti ne vien, o kelis, kelias deimtis ar net imtus nealelini gen, pvz., augal Polycomb-like genas, kuris valdo daugiau kaip 100 gen veikl.
AUGAL GENETIKA
| 41
Slopinti gali ne tik dominuojantysis, bet ir recesyvusis epistazinio geno alelis. Tai sukuria didel F2 kartos santyki vairov: 12:3:1 (arba 13:3 kai yra dominuojanioji epistaz; 9:3:4 kai yra recesyvioji epistaz). Pasitaiko, atrodyt, paradoksali padtis, kai nealeliniai genai slopina vienas kit. Vl atsiranda nauji epistazs variantai: dviguba dominuojanioji (F2 15:1) arba dviguba recesyvioji (9:7) epistaz, kai vienas genas slopina kit, skirtumas tik tai, kurie jo aleliai dominuojantieji ar recesyvieji. Dar yra ir miri epistaz (F2 13:3) vieno geno epistazinis yra recesyvusis, o kito dominuojantysis aleliai. Skiriasi slopinimo mechanizmais. J ia nenagrinsime. Tarp epistazini gen labai dani reguliaciniai genai, kuri paskirtis, kaip minta, yra reguliuoti kit gen veikl (r. 5 sk.). Jie irgi labai vairs. Genai-modifikatoriai pagal pasireikim taip pat yra labai vairs. Tradicikai iai sveik grupei priskiriami ir genai-aktyvikliai. Tai prieingo epistaziniams genams veikimo reguliaciniai genai. Jie reguliuojamus genus jungia, suaktyvina. Gen-modifikatori tyrimai tikino, kad reikia skirti: pagrindinius genus, genus-modifikatorius, arba papildomuosius genus. Pagrindiniai genai yra tokie, be kuri poymis apskritai neisivysto. Pagrindiniai yra visi genai, lemiantys pigmento antocianino sintezs tarpines grandis (1.8 intarpas). Kaip minta, bet kurio j mutacija nutraukia vis antocianino sintezs grandin, pasireikia kaip minus, nul mutacijos. O genai, nuo kuri priklauso lstels pH ir tuo paiu pigmento spalva (raudona, mlyna ar violetin), antocianino sintezs atvilgiu yra genai-modifikatoriai. Jei nra antocianino, tai koks bebt pH, spalva neatsiras. Lygiai taip pat modifikatoriais yra genai, lemiantys vakuols (ypa j membran) ypatybes, nes pigmentas yra udarytas vakuolje. Pagaliau, pigmentas nevienodai pasiskirsto vairiuose augalo organuose ar net gi tame paiame organe . Pvz., iedai gali bti margi, ir tai yra paveldimas poymis.
1.8 intarpas. Kaip pasigamina ir nudao iedus antocianinas Antocianinai priklauso didelei flavonoid grupei. iuo metu itirta daugiau kaip 4500 flavonoid. J paskirtis augaluose labai vairi: apsauga nuo oldi, patogen ir UV spinduli, ied ir vaisi spalva prisivilioti ied apdulkintojus, skl platintojus ir kt. Aptinkami daugelyje augalo organ, lstelje daniausiai vakuolse. Antocianinai augalo iedo vainiklapiams suteikia labai vairi spalv: vairius raudonos, mlynos ir violetins spalv atspalvius. Spalva priklauso nuo antocianin savybs keisti spalv priklausomai nuo pH: rgioje aplinkoje ji bna raudona, neutralioje violetin, o silpnai arminje mlyna. Dl ios prieasties to paties augalo ied splava gali kisti. Vienokia ji bna jaunuose ieduose, kitokia ydjimo pabaigoje. Dl vidini ir iorins aplinkos poveiki keiiasi ne tik ied, bet ir viso augalo spalva, pvz., danai augalai pamlynuoja kai alta. Vis antocianin sintez vyksta susidarant vadinamajam. C15-tarpininkui chalkonui. Vienas nuo kito antocianinai daniausiai skiriasi OH radikal skaiiumi ir prijungimo vieta. Iki antocianin sintezs junginiai iedui mlynos, violetins ar raudonos spalv nesuteikia, todl vykus mutacijai iki io sintezs etapo iedai bus balti. Fermento chalkonsintazs genas labai danai naudojamas kaip gen ininerijos teorini tyrim objektas. Btent su iuo genu, perkeltu petunijas, pirm kart buvo nustatytas transgen nutildymas. Kamferolis i sojos yra vienas efektyviausi flavonoid prie UVB. Flavonoidai yra veiksmingos prievins mediagos, laisvj radikal gaudykls.
42 |
Genai-modifikatoriai suteikia pagrindini gen koduojamiems poymiams papildom ypatybi. Jie keiia vairias pagrindini gen ypatybes: pagrindini gen raik (j sustiprina, arba atvirkiai, susilpnina); sveik su aleliniais genais (dominavim); bding pagrindiniam genui mutacij dan (mutabilum); pagrindinio geno penetrantikum ir ekspresyvum (r. 1.8 sk.). Paprastai genai-modifiaktoriai pasireikia jau F1, o F2 santykiai bna labai vairs (pvz., 9:3:4). Poymis priklauso nuo geno-modifikatoriaus savybi ir netgi nuo gen modifikatori skaiiaus, nes pagrindinius genus augaluose gali veikti skirtingas genmodifikatori skaiius, ir j poveikiai susisumuoja. Komplikuotos nealelini gen sveikos. Netgi grynai formali nealelini gen sveikos analiz F1 ir ypa F2 hibrid kartose atskleidia sudting gen sveikos pobd. Antocianin sintezs grandinse spalvotas junginys, nudaantis iedo vainiklapius, gali susidaryti anksiau, nei pasiekiamas galutinis produktas. Taip, pvz., atsitinka kolinsijos (Collinsia parviflora) vainiklapiuose. Sukryminus baltaiedius jos augalus su augalais, kuri iedai yra fuksino/anilino da spalvos (angl. is atspalvis vadinamas magenta), F1 visi augalai buvo mlynos spalvos iedais, o F2 palikuonys isiskaid 3 fenotip grupes santykiu 9:3:4 (9 dalys mlynais : 3 dalys anilino spalvos : 4 dalys baltais iedais). Formaliai galima tarti geno-modifikatoriaus buvim baltaiediuose augaluose (atitikt formul ccMM, ia c spalv lemiantis genas, o M modifikatorius). Taiau i tikrj iki galutins mlynos spalvos susidaro dar vienas spalvotas antocianinas, kuris ir nudao iedus fuksino/anilino da spalva. vyki grandin bt tokia: 1-asis fermentas W balta 2-asis fermentas M mlyna
w anilino m (white) (magenta) Blokuojanios mutacijos Gautj F2 santyk 9:3:4 galima pavaizduoti taip: 9 W M mlyna ied spalva: 16 W M
mlyna
3 Wmm anilino (magenta) spalva: 16
W anilino
AUGAL GENETIKA
| 43
4 3 1 ( wwM + wwmm) balta ied spalva 16 16 16
balta Jeigu atidiau palyginote vairius hibrid pasiskirstymo F2 santykius, jau galjote sitikinti, kad mintasis kolinsijos hibrid santykis 9:3:4 galt bti dl vis iki iol nagrint nealelini gen sveik: komplementarios, skaitant ir komplementacijos reikin, recesyviosios epistazs, gen-modifikatori. Tad neverta stebtis, kad gana danai t pai kryminim rezultatai yra vairiai aikinami. Ir ne be pagrindo. Lygiai tokius paius kolinsijos hibrid fenotipus F1 ir F2 gautume, jeigu paprasiausiai nealelinis genas-modifikatorius sustiprint W geno veikim taip, kad vietoje anilino saplvos gautsi mlynos spalvos iedai. Galutin sprendim turtume padaryti isiaikin konkrei gen sveikos mechanizmus. Taiau ir jie kartais neduoda galutinio atsakymo, nes tas pats genas gali pasiymti daugybiniu veikimu (pleiotropija) arba veikti ir kaip aktyviklis (genas-modifikatorius), ir kaip inhibitorius (epistazinis genas). Tai priklauso nuo papildom veiksni, vadinamj koaktyvikli arba kosupresori (r. 5 sk. ir 1.7 pav.). Taiau viena bendra taisykl galioja visoms nagrintoms nealelini gen sveikoms: Jeigu F2 gavome skilimo santyk, atitinkant dihibridinio kryminimo sumin rezultat 16 (pvz., 9+3+3+1; 9+7; 9+3+4), be abejons poym lemia ne vienas, o du nealeliniai genai, nesvarbu kaip atrodo pats santykis. Klasikinio santykio 9:3:3:1 modifikacijos turt bti paskata isiaikinti santykio pokyio prieastis.
1.7. Alelini gen sveika

Aleliniai genai sveikauja keliais bdais. Nuo sveikos pobdio priklauso: heterozigot fenotipas F1 ir kitose hibrid kartose, ir jau i F1 hibrid fenotipo danai galima sprsti apie alelini gen sveikos pobd; skilimo santykis pagal fenotip F2. Genotip santykis, kai kryminamos heterozigotos (Aa), iskyrus kodominavim (r. toliau), visada ilieka tas pat:
1 2 1 AA : Aa : aa 4 4 4 Fenotip santykis F2 priklauso nuo alelini gen sveikos pobdio. Kaip ir sveikaujant nealeliniams genams, jis ne visada atskleidia sveikos pobd ir prieastis. Santykis 1:2:1 bdingas tiek nevisikam dominavimui, tiek ir superdominavimui, kuri prieastys yra i esms skirtingos. Visikas dominavimas (vyravimas) yra tas alelini gen sveikos tipas, kur tyr Mendelis (1.1 pav.). Heterozigot (Aa) fenotipas visikai nesiskiria nuo homozigot (AA) fenotipo, todl F1 visi hibridai yra vienodi, pasireikia visikai vyraujantis genas;
44 |
F2 hibridai susiskaido 2 fenotip grupes santykiu miu:

1 su recesyviuoju poymiu: 4
3 su dominuojaniu poy4
3:1 Apie ias dvi gen savybes dominavim ir recesyvum kaip tik sprendiame i F1 ir F2 rezultat. Taiau gana danai, atidiau ityrus dominuojaniojo geno pasireikim, aptinkami nedideli fenotipo skirtumai tarp homozigot (AA) ir heterozigot (Aa). Prisiminkime kad ir irnius lygiomis ir raukltomis sklomis (r. 1.4 intarp ir 1.1 pav.). Formaliai AA ir Aa genotip augalai pagal skl form nesiskyr, taiau vis trij genotip (AA, Aa, aa) krakmolo grdeli forma buvo skirtinga. Heterozigotini (Aa) augal sklose krakmolo grdeliai buvo tarpiniai tarp abiej tv (1.6 pav.). Pagal i savyb alelini gen sveik tarp A ir a aleli reikt priskirti kitam nevisiko dominavimo tipui. Nevisikas dominavimas danai tapatinamas su hibrido, kaip kako tarpinio tarp tv, svoka. Taiau hibridais reikia laikyti visus dirbtinai sukrymint genetini linij, veisli, ri palikuonis F1, F2, F3 ir kt. kartose, ir ne tik heterozigotinius. Dl kryminim, kaip tai turjome progos sitikinti (r.1.5 sk.), palikuonys gyja naujus gen derinius, pvz., AAbb arba aaBB, kai tvai, tarkim, buvo AABB ir aabb. Taip i ties ir turi bti. Galimyb atsirasti naujiems gen deriniams ir heterozigotikumas sudaro lytinio proceso esm, yra pagrindiniai lytinio dauginimosi privalumai ir tikslai. Nevisikas dominavimas yra labai dana alelini gen sveika, nes pasireikia tarp poligen, nulemiani vairius kiekybinius poymius. Poligen skaiius genome yra ypa didelis. Jie priklauso duplikuotj gen grupei, kuri veikimas sumuojasi. Kai yra nevisikas dominavimas, heterozigotiniai augalai (individai) yra tarpinio fenotipo tarp abiej homozigotini tv, todl heterozigotos yra lengvai nustatomos pagal fenotip. ia savybe naudojamasi vairiais tikslais, kai reikia patikimai skirti heterozigotas nuo homozigot. Selekcijoje yra tiesiogiai panaudojami tarpiniai fenotipai. Heterozigotiniai augalai turi nauj fenotipo ypatybi, taiau heterozigotikumas yra laikinas reikinys (1.4 intarpas), todl kai norima j isaugoti, naudojamos vairios specialios priemons, daniausiai augalai dauginami vegetatyviniu bdu. domu, kad t pat proces lemiantys genai vienose augal ryse yra visikai dominuojantys, o kitose pasireikia nevisikas dominavimas. irni ied purpurin spalv, kaip ir ioveinio (Antirrhinum) raudon spalv nulemia antocianinai. Mendelio bandymuose purpurin ied spalva buvo visikai dominuojantysis poymis. Sukrymin iovein raudonais iedais su augalais, kuri iedai yra balti, galime sitikinti, kad j raudona ied spalva yra nevisikai dominuojantysis poymis: ioveinio F1 hibridai (Aa) bna tarpinio atspalvio, roiniais iedais, todl ir F2 palikuonys susiskaido 3 fenotip grupes:
AUGAL GENETIKA
| 45
1 2 1 AA : Aa : aa 4 4 4
raudoni
roiniai
balti
iedai
Skirtumai tarp alelini gen sveikos gali atsirasti ne tik skirting ri augaluose, bet netgi tos paios ries viduje, tarp skirting veisli, genetini linij. iuos skirtumus nulemia ne tik vairs genai-modifikatoriai, vadinamoji genetin aplinka, bet ir individualios gen ypatybs. Jie dl vairi struktros ypatum yra nevienodo aktyvumo, nors gali lemti t pat baltym/ferment, todl konkreiuose tyrimuose, netgi Mendelio, tik yra priartjama prie teorinio santykio, pvz., 3:1 (1.2 lentel).
1.2 lentel. Kai kuri irni poymi hibridologins analizs duomenys G. Mendelio bandymuose F2 (antroji hibrid karta) Augal skaiius su Santykis Poymis pagal F1 Poymis poymiu I ,,domiviso nuojantysis/ dominuodominuo- recesyrecesyvusis jantysis janiuoju viuoju recesyvusis Vainiklapi spalva Violetin Balta 705 224 929 3,15:1 ied isidstymas Paastyse Virnje 651 207 858 3.14:1 Stiebas Ilgas Trumpas 787 277 1064 2,84:1 Anki forma Isiptusi Su gaubi882 299 1181 2,95:1 mais Neprinokusi alia Geltona 428 152 580 2,82:1 anki spalva Skl forma* Apvali Rauklta 5474 1850 7324 2,96:1 Sklaskili spalva* Geltona alia 6022 2001 8023 3,01:1 Skl luobels Pilkai ruda Balta 705 224 929 3,15:1 spalva
Pastaba * nurodomas ne augal, o skl skaiius.
P (tvai) poymis
Daugybinis alelizmas ir nevienodas vairi aleli aktyvumas. Pastaroji ypatyb i esms ir nulemia, ar alelis bus visikai, ar nevisikai dominuojantis. Daniausiai tarpin heterozigot fenotip nulemia suminiai alelini gen santykiai. Du genai homozigotos genotipe daugiau negu vienas genas, o neaktyvus alelis yra lygus nuliui. Taigi nevisik dominavim danai nulemia alelini gen fenotipini aktyvum suma (r. taip pat 1.7 intarp): Du aktyvs aleliai (AA) Vienas aktyvus alelis (Aa) Nra aktyvaus alelio (aa) Stipriai ireiktas fenotipas arba Silpnesnis fenotipas Recesyvusis fenotipas = poymis neisivyst
AA > Aa > aa = 0
46 |
i taisykl negalioja, kai heterozigotos lstelse pasigaminusio geno produkto (paprastai baltymo) pakanka tenkinti lstels reikmms. iuo atveju pasireikia visikas dominavimas, nes tolesnis geno produkto priedas prie optimalaus jo kiekio io produkto atliekamos funkcijos nepadidina. Visikai dominuojantis genas yra toks, kuris vienoje dozje yra tiek aktyvus, kad patenkina lstels poreikius jo produktui. Tarp maesnio aktyvumo gen (daniausiai mutantini) pasireikia nevisikas dominavimas. iuos teiginius patvirtina daugybinio alelizmo (sin. polialelizmo) tyrimai. Daugybiniai aleliai yra to paties geno struktrins atmainos, tik j yra daugiau kaip dvi. Labai danai jie skiriasi poymio raikos stiprumu: nuo WT (normalaus, arba kitaip laukinio tipo) iki visiko poymio nepasireikimo (nul fenotipo). Sumin alelini gen sveik patvirtina du reikiniai, nustatyti ityrus daugybinius alelius: heterozigotose tarp tarpins raikos aleli stebimas nevisikas dominavimas; didinant tarpins pagal stiprum raikos alelio doz galima pasiekti WT fenotip. Kartais utenka 2- mutantini gen dozs, kad bt pasiektas WT fenotipas. Tokie mutantiniai aleliai labai nedaug skiriasi nuo t, kurie lemia normal fenotip (WT). Jie vadinami izoaleliais (gr. isos lygus). Jiems aptikti reikia atlikti specialius tyrimus. Daugybini aleli santykiai heterozigotose detaliau itirti induoli ir drozofilos, bet galioja ir augalams. Daugybini aleli tyrimais aptikta ir alelini gen sveika, kuri pavadinta kodominavimu. Kodominavimas lengviausiai ir tikinamiausiai rodomas tiriant mutantinius baltymus. Heterozigotose randami abiej alelini gen produktai koduojami baltymai daniausiai nustatomi elektroforezs bdu. Kodominavimas tai alelini gen sveika, kai abu aleliniai genai pasireikia fenotipe. Heterozigotiniame organizme yra abiej kodominuojani gen veiklos produkt. Klasikiausias kodominavimo pavyzdys yra kraujo grups A ir B. I jas lemiani gen tyrim, matyt, kilo ir pats sveikos pavadinimas (lot. co su, kartu). Mat kraujo A ir B antigenus lemiantys genai IA ir IB vienas kito neveikia. Heterozigot IAIB kraujo grup yra AB, t.y. pasireikia abu aleliai. Taiau ie abu genai stelbia i, o homozigot ii kraujo grup yra 0. Vadinasi, abu aleliai, IA ir IB, vyrauja prie i, kuris j atvilgiu yra recesyvusis. Tai visikai nra vieno kurio nors geno monopolis, kaip kas galt sprsti i kraujo grupi genetikos. Tokia sveika tarp aleli yra visada, kai be aleli, lemiani normal (WT) ir mutantin baltymus, dar yra nul tipo alelinis genas, kuris yra visikai neaktyvus. Jo atvilgiu kiti aleliai ir bus kodominuojantys. Vadinasi, kodominavim galima atsekti, kai yra daugybinis alelizmas, arba kitaip polimorfizmas (vairov) pagal geno koduojamus baltymus, nebtinai mutantinius. Priklauso nuo polimorfizmo pobdio. Netgi fermento amilo (14)(16) transglikozilazs, kuri sukelia krakmolo grandins akojimsi, mutantinio alelio (rauklt irni skl, r. 1.1 pav. ir 1.4 intarp) pasireikim reikia vertinti kaip kodominavim, nes brstani skl lstelse elektroforezs metodu aptinkami abu normalusis (WT) ir mutantinis baltymai.
AUGAL GENETIKA
| 47
Tai tik dar kart rodo, koks santykinis yra gen skirstymas pagal j sveikos pobd heterozigotose, ir kaip samprata apie gen sveik priklauso nuo poymio itirtumo. T pat gen SBE1, dl kurio sklos yra lygios, galima vertinti kaip visikai dominuojant (poroje lygios-raukltos sklos), nevisikai dominuojant (pagal krakmolo grdelius, r. 1.6 pav.) ir kodominuojant (pagal baltym frakcijas heterozigotose).
1.6 pav. irni skl krakmolo grdeliai:
a apvali skl, b rauklt, c F1 hibrido, kurio sklos iorikai apvalios, visikas dominavimas.
Kai abu tvai yra heterozigotiniai pagal skirtingus kodominuojanius genus, gali bti iskirtinis palikuoni santykis 1:1:1:1, formaliai daugiau menantis dihibrido analitin kryminim, taiau vis tik tai yra monohibridinio kryminimo santykis. Jis atsiranda tokiu bdu: P (F1) Gametos Palikuonys (F2) A' A'a a A'A'' A'a aA'' aa A'' A''a a abiej gen (A' ir A'') produktai A' geno produktas A'' geno produktas nul fenotipas
Superdominavimas (lot. super vir + dominatio viepatavimas) sunkiau nustatoma ir paaikinama, bet realiai egzistuojanti, netgi praktikai panaudojama alelini gen sveika. Tokiu bdu gaunama monogenin (vieno geno) heteroz, pvz., pomidor. Superdominavim galima urayti taip:
AA < Aa > aa
Tad heterozigotiniai augalai skiriasi nuo homozigotini, todl F2 palikuonys skaidosi 3 fenotip grupes, panaiu kaip esant nevisikam dominavimui santykiu 1:2:1, t. y.
1 2 1 AA : Aa : aa 4 4 4
Taiau tai tik iorinis panaumas.

48 |
Superdominavimas alelini gen sveika, kai heterozigotiniai (Aa) augalai (individai) lenkia homozigotinius tvus (AA ir aa), net jei tai bt kodominuojantys aleliai (A' ir A'' r. aukiau). Kaip ir nevisikas dominavimas, superdominavimas yra laikinas reikinys, todl norint j isaugoti augal kartose, augalai dauginami vegetatyviniu bdu. Gamtin atranka irgi gali bti palanki superdominavimui, todl susikr ir natrali bd heterozigotikumui isaugoti, kaip ir labai paplits tarp augal nelytinis dauginimasis. Augal populiacijose J. Miriuta atrado ilgalaik vidulokusin heterozigotikum. Dl netolygaus krosingoverio (apsikeitimo nevienodo dydio segmentais tarp homologini chromosom) F1 hibriduose (Aa) abu aleliai atsiduria vienoje chromosomoje: A a A a A a (duplikacija) (delecija)
Toje chromosomoje lokusas yra padvigubjs (duplikacija). is pokytis yra paveldimas vis palikuoni, kurie gav chromosom su padvigubjusiu lokusu Aa vienoje chromosomoje. Po keli kart, palaikant atrankai, visi augalai populiacijoje gyja tok duplikuot heterozigotin lokus Aa.
Laukinis tipas/ normalus baltymas. Abu genai WT tipo
E1+ E1+
1-asis polipeptidas
E2+ E2+
2-asis polipeptidas
(E1+E2)
Aktyvus dimerinis baltymas Nul mutacija 1-ojo polipeptido gene
nul
E1nul
E2 + E2+
E1nul
E1+E2 kompleksas nesusidaro

Nul mutacija 2-ojo polipeptido gene
E1+
E2nul
nul
E2nul E1+ E1+E2 kompleksas nesusidaro

Dvigubas mutantas arba hibridas tarp dviej nul mutacij
nul
E1nul
E2nul
nul
E1nul (E1nul+E2nul)
E2nul
papildomas veiksnys
Aktyvus (dimerinis) baltymas
1.7 pav. Aktyvus dimerinis baltymas dviej gen produktas ir dviej nul mutacij kosupresija: dl papildomj veiksni atsikuria normali dimerinio baltymo erdvin ir funkcin sandara.
AUGAL GENETIKA
| 49
Praktikoje panaudojama monogenin heteroz, todl superdominavim paaikinti labai svarbu. Deja, kaip ir heterozei, vieno bendro paaikinimo superdominavimui nra. Jo prieastys vairios, konkreios atskiriems genams. Daniausiai vienas kit aleliai vienaip ar kitaip papildo, ypa kai aleliai koduoja nevienodas funkcijas arba skirtingus produktus. Tokiu atveju heterozigotiniai augalai turi abiej gen produkt ir tai yra naudinga organizmui. Pvz., lin to paties geno aleliai lemia atsparum skirtingoms rdi rasms: genotipas M1M1 atsparum 1-ajai rasei, o M2M2 2-ajai rasei. Heterozigota M1M2 yra atspari abiems rdi rasms (1-ajai ir 2-ajai). Alelini, kaip ir vis gen, veikla labai priklauso nuo aplinkos veiksni. Gana danai yra geno aleli, kuri veikla priklauso, pvz., nuo temperatros. Tokie aleliai turi netgi savo pavadinim ts (angl. temperature sensitive, r. 1.8 intarp ir 1.8 pav.). Heterozigot Ts'Ts'' adaptacins galimybs yra gerokai platesns negu homozigot Ts'Ts' arba Ts''Ts''. Dar gali bti taip, kad vienas alelis, tarkim, B1, lemia mediagos stok, o kitas, tarkim, B2, pertekli. Heterozigotose B1B2 me1.8 pav. Normalus pomidor augalas (kairdiagos kiekis gali bti optimalus. je) ir mutantas Jaundiced1 (deinje): Labiausiai iuo metu yra domimasi auginti emos temperatros (15-19 C) slygomis. hibridinmis molekulmis (1.7 ir 1.12 pav). Heterozigota produkuoja hibridines molekules, kurios susikomponuoja i subvienet, kuriuos nulemia aleliniai genai. i sveika bdinga funkciniu atvilgiu dalomiems genams, koduojantiems i domen sudarytus baltymus. Hibridins baltymo molekuls gali bti didesnio aktyvumo.
1.8. Aplinkos veiksniai ir alelini gen sveika. Geno penetrantikumas ir ekspresyvumas

Ir dar kart aa. Aplinkos veiksni poveikis. Sk. 1.6 nurodytos dvi prieastys, kodl genotipas gali bti vienok poym lemiantis, o fenotipas, pats poymis, kitoks. Tarkime, genotipas homozigota (aa) su abiem recesyviaisiais genais, o fenotipas normalus (daniausiai atitinkantis WT). Tos prieastys yra sveikos su nealeliniais genais, daniausiai modifikatoriais jas jau nagrinjome (1.6 sk.); aplinkos ir vidini veiksni poveikis, kuris ilg laik buvo tui ir nevaising gin objektas. Aplinkos poveikis genotipui arba buvo pervertinamas, arba vertinamas nepakankamai (ypa tai buvo SSSR lysenkizmo klestjimo laikais). Lysenkistai buvo naiviai tikj, kad pakanka rodyti, kad pirmoji hibrid karta (F1) yra nevienoda pagal fenotip, ir jau grius visa genetika. Mendelio dominavimo dsnis, kaip jis dabar suprantamas, skelbia, kad
50 |
homozigotini tv visi pirmosios (F1) kartos hibridai yra vienodo genotipo, heterozigotiniai (atitinka Aa). Taiau geno veikla priklauso ne tik nuo gen modifikatori, bet ir nuo vidins ir iorins aplinkos veiksni. iuo metu nustatyta, kad netgi genetinio kodo skaitymas priklauso nuo aplinkos veiksni. Pirmasis tai nustat Gorinis (L. Gorini) dar 1961 m., kai dar tik buvo pradtas iaikinti pats genetinis kodas. Pasirodo, kad nonsense mutacijas, kad ir UAG, gali slopinti ne tik supresoriai tRNR gen mutacijos, bet ir antibiotikas streptomicinas. Gorinis nustat, kad streptomicinas slopina UAG nonsense mutacij viename i bakterijos Escherichia coli arginino sintezs gen. Dl ios mutacijos buvo nutrkusi arginino sintez (nul fenotipas). Po poveikio E. coli nemirtinomis streptomicino dozmis arginino sintez nonsense mutante atsinaujino. Nustatyta, kad is antibiotikas ribosomose sutrikdo kodo skaitym nuo mRNR. Aplinkos veiksni sukeliamas mutantinio alelio slopinimas buvo pavadintas fenotipine supresija. Fenotipins supresijos prieasi yra daug, vien j jau inome tai genetinio kodo skaitymo pokyiai. Taiau reikia pabrti, kad skaitymo, o ne paties genetinio kodo, kuris lieka toks pat. Genetinio kodo skaitym, o tuo paiu geno pasireikim, keiia ne tik streptomicinas, kai kurie kiti antibiotikai, bet ir purino-pirimidino bazi analogai (pvz., fluoruracilas), senjimas, Mg2+ jon koncentracija, poliaminai, aminorgi badas, temperatros pokyiai ir kt. Aplinkos veiksni, kurie gali pakeisti genetinio kodo skaitym, sraas gana spdingas ir nuolat didja. Visi ie veiksniai keiia ir eukariot gen raik, tuo paiu ir alelini gen sveik heterozigotose.
1.9 intarpas. vairiais reimais veikiantys genai. ts mutantai Vienokia ar kitokia to paties geno aleli reakcija aplinkos veiksnius gldi paioje geno sandaroje, tose nukleotid sekose, kurios skirtos reguliuoti geno raik, daniausiai promotoriuje arba alia jo. Promotorius (lot. promotio pasistmjimas priek) yra nukleotid seka, su kuria tiesiogiai ar netiesiogiai jungiasi RNR polimeraz. Tai seka, inicijuojanti RNR sintez ant geno kaip matricos. Genai, kuri veikla priklauso nuo aplinkos veiksni, turi specialias nukleotid sekas. Genai, nuo kuri priklauso iedo pigment antocianin sintez, tarp j chalkonsintazs genas (r. 1.8 intarp), turi vadinamj G-element (G-sek). Jis reaguoja vairius aplinkos veiksnius viesos pokyius, ultravioletinius spindulius ir kt. aplinkos veiksnius. Kuriam veiksniui bus teikiama pirmenyb, priklauso nuo augalo ir genus reguliuojani gen-modifikatori ir reguliatori (transkripcijos veiksni, 5 sk.). Pvz., petraols chalkonsintazs genas, kuris reaguoja UV, turi tokias sekas: 12 bp 169 /\ 120 TC CACGTG GC GTCCCTCCAACCTAACC G-seka Papildoma seka Pup chalkonsintazs gene, kuris reaguoja kumaro rgt, papildomos sekos, sek isidstymas ir atstumai tarp j jau kitokie:
AUGAL GENETIKA
| 51
72 bp 150 CCTAC Papildoma seka TG CACGTG G-seka
56 bp /\ 55 AT CCTACC Papildoma seka
Visi genai, kurie reaguoja t pat aplinkos veiksn, turi tokias paias arba labai artimas nukleotid sekas, sudaro bendr reguliuojam gen grup, vadinamj regulon. J raika (ekspresija) tai atsakas aplinkos veiksn. Atsakai yra vairs: iluminio oko, metal pertekliaus, oksidacinio oko ir kt., ir genai, kurie paprastai nereaguoja kur nors aplinkos veiksn, gali dl mutacijos pasidaryti jautrs vienam ar kitam aplinkos veiksniui. Slygos, kurias reaguoja tokio tipo mutantai, gali bti vairios: pH, osmozinis slgis, temperatra. Kaip minta, temperatrai jautrs mutantai ypa danai ir veiksmingai naudojami genetiniams ir molekulins biologijos tyrimams. ie ts-mutantai pasidaro jautrs kuriam nors temperatr diapazonui. Pvz., pomidor dominuojantis chlorofilinis mutantas Jaundiced 1, iskirtas i lietuvikos veisls 'Ryiai', gali bti 3- fenotip, priklausomai nuo temperatros: emesnje( 10-15C ) margais lapais (r. 1.8 pav.); vidutinje (apie 25C) augalo virn yra gelsvai alios spalvos, o apatiniai lapai normaliai ali (tokio pobdio chlorofiliniai mutantai apibdinami kaip virescens) auktoje (28-30C ir daugiau) visas augalas yra normaliai aliais lapais. iuose mutantuose Jaundiced 1 chlorofilo sintez priklauso nuo temperatros. Ji sutrinka, kai temperatra yra ema, ir sunormalja, kai temperatra yra aukta. Genetiniams tyrimams ypating svarb turi vadinamieji santykinai mirtini (letals) ts-mutantai t gen, kuri nul fenotipo negali bti, nes organizmas t. Tai genai, kurie lemia labai svarbius poymius, procesus: DNR sintez, lstels kvpavim, lstels dalijimsi ir pan. Jeigu nebt santykinai letali mutacij, i proces genetikos itirti bt nemanoma. Santykinai letali ts mutant nul fenotipas pasireikia tam tikr temperatr slygomis (jos vadinamos nepermisinmis), taiau yra temperatra, vadinama permisine (angl. permissive leidis), kai genas veikia visikai normaliai.. Taigi galima turti dvi btinas tyrimams poymio alternatyvas veiklus ir neveiklus (nul) genai, iaikinti geno reikm koduojam proces grandinje. Temperatrai jautrs (ts-mutantai) gali nevienodai pasireikti ir heterozigotose. Tai pirmasis nustat rus mokslininkas N. Timofiejevas-Resovskis.
Dominavimo priklausomyb nuo aplinkos. Viena i pagrindini augalo ekologijos ypatybi yra tai, kad jis negali kaip gyvnas pabgti nuo nepalanki slyg. Jam tenka gyventi tarp besikaitaliojani aplinkos veiksni (ypa temperatros, drgms, apvietimo), todl augalams aleli pasireikimo kitimai heterozigotose turi svarbi prisitaikomj (adaptacin) reikm. Priklausomai nuo aplinkos slyg genas i visikai dominuojaniojo gali pasidaryti nevisikai dominuojantysis arba netgi recesyvusis. Pvz., durnarops (Datura), auganios vasar natraliomis slygomis, purpurin spalva paprastai visikai nustelbia ali spalv, taiau iltnamyje heterozigotiniai augalai aikiai skiriasi nuo homozigotini purpurini, kad ir iek tiek blykesne augal spalva. Kokios tai gali turti takos F1 fenotipams ir skilimo santykiui F2, labai gerai iliustruoja ioveinio (Antirrhinum majus) augal raudonais iedais kryminimas su augalais dramblio kaulo spalvos iedais. Kai augalai auginami optimalaus apvietimo ir emos temperatros slygomis, heterozigotiniai augalai (F1 hibridai) bna raudonais iedais; kai ilta, bet prieblanda dramblio kaulo spalvos iedais, o tarpinmis slygomis pasireikia
52 |
nevisikas dominavimas iedai yra tarpins spalvos. Atitinkamai keiiasi ir hibrid santykiai F2 pagal ied spalv: 3 1 alta, optimalus apvietimas raudoni : dramblio kaulo 4 4 1 3 ilta, prieblanda raudoni : dramblio kaulo 4 4 1 2 1 tarpins slygos raudoni : tarpiniai : dramblio kaulo 4 4 4 Taigi, priklausomai nuo aplinkos slyg, ypa temperatros, keiiasi dominavimo kryptis: dominuojantysis alelis (raudoni iedai) virsta recesyviuoju aleliu, o buvs recesyvusis alelis (dramblio kaulo spalvos iedai) virsta dominuojaniuoju. Kaip galjome sitikinti, keiiasi skilimo santykiai F2 3:1, 1:3 arba 1:2:1. Visi jie yra tik vienokia ar kitokia bendro F2 genotip santykio
1 2 1 AA : Aa : aa 4 4 4
modifikacija. Aplinkos veiksniai keiia tik alelinio geno pasireikim. Genotipas dl to nesikeiia. Pateikti pavyzdiai parodo, kad aplinkos veiksniai nevienodai veikia skirtingus to paties geno alelius ir kad reakcija aplinkos slygas uprogramuota paiuose genuose. i genetin program, kaip ir kitas savybes, gali pakeisti mutacijos. Pvz., dl mutacijos gali atsirasti ypatingas jautrumas temperatrai ir ne apskritai, o kuriam nors temperatr diapazonui. Taip atsitinka ts-mutantams (1.9 intarpas), kuri mutantin pobd, ypa jautrum konkreiam aplinkos veiksniui, gana danai pavyksta nustatyti atsitiktinai, kai mutantas paklina nepermisines slygas. Taip buvo iaikinti primuli antocianin sintezs ts-mutantai. Padjo tai nustatyti hibrid analiz F1 ir F2 kartose. Paprastai primuli roin ir balta ied spalva hibriduose paveldima pagal tipikus Mendelo dsnius: vyrauja roin spalva, todl F1 visi hibridai yra roins spalvos iedais, o F2 palikuonys isi3 1 skaido dvi grupes: roiniais : baltais iedais. Taip bna, kai primuls ydi pavasar, 4 4 kai temperatra retai pakyla daugiau nei 15-25C. Taiau iltnamyje, kai temperatra buvo 30-35C, visi augalai buvo baltais iedais, abiejose hibrid kartose F1 ir F2. Aukta temperatra visikai slopino primuli veisls roiniais iedais antocianin sintez. Jeigu ne neprastai aukta temperatra, niekas nebt tars, kad tai ts-mutantas. Reakcijos norma. Fenotipins mozaikos. Gana danai genas lemia ne grietai apibrt fenotip, o ribas, kuriose gali varijuoti geno lemiamas poymis reakcijos norm. Tai turi prisitaikomj reikm. Geno produktas geriau atitinka besikaitaliojanius aplinkos veiksnius. Kai kuriais avejais reakcijos norma pasireikia dviem alternatyviais fenotipais, arba-arba, kaip vandeninio vdryno (Ranunculus aquatilis L.) arba papliaukos (Sagittaria sagittifolia L.) lapai vandenyje ir vir vandens. Alternatyvs fenotipai yra tam tikr gen ypatyb.
| 53
AUGAL GENETIKA
Kaip tokie genai veikia ir kaip valdoma j veikla, sprendiama konkreiai. Daugeliu atvej tai dar ateities klausimas. vairs dominavim ir geno raik keiiantys veiksniai gali pasireikti ne vienu metu ir vairiose augalo raidos stadijose. Tai labai bdinga augalams, kuri tapaios dalys, organai isivysto ne vienu metu, kaip, pvz., pomidor vaisiai ar jav stiebai su varpomis. ie ne vienu metu isivyst organai/augalo dalys danai paklina skirtingas aplinkos slygas, ir jeigu i augal genotipe yra gen, kuri aleli veikla priklauso nuo aplinkos veiksnio besikeiianioje aplinkoje gali atsirasti fenotipins mozaikos. Paaikjo, kad ir kai kuri miei veisli varpos akuotumas gali bti poymis, kurio raika priklauso nuo aplinkos veiksni. Pvz., auginant mieius tikrai neprastomis slygomis, u Poliarinio rato, ant to paties augalo vienos varpos buvo be akuot (dominuojantysis poymis), kitos varpos buvo su akuotais (recesyvusis poymis). Ilgos dienos slygomis kviei hibriduose vyrauja normali varpa, o trumpos dienos slygomis akota varpa. Auginant kviei hibridus i pradi ilgos, o paskui trumpos dienos slygomis, ant to paties augalo vienos varpos buvo normalios, kitos akotos. Ne kas kita kaip fenotipins mozaikos yra ir vandeninio vdryno ar papliaukos augalai, kuri lapai vandenyje vienoki, o ant vandens kitoki. Taiau ir iuo atveju galioja taisykl: nepaisant fenotipo skirtum, fenotipins mozaikos visos augalo dalys yra vienodo genotipo. Geno penetrantikumas ir ekspresyvumas. Kaip buvo galima sitikinti i mint ir 1.6-1.7 sk. pateikt ini, fenotipas ne visada atspindi genotip taip, kaip turt bti. Homozigotos su recesyviaisiais genais (tarkim, aa) gali bti WT fenotipo, kuris dominuojantis, o aikiai dominuojantysis genas gali nepasireikti fenotipe. Vietoje jo pasireikia fenotipas, bdingas recesyviajam aleliui. Taip pat galjome sitikinti, kad visa tai apibdina geno santyk su kitais genais (genetine aplinka) ir su iorins bei vidins aplinkos veiksniais. Tokias ivadas dar 1925 m. padar rus mokslininkas N. Timofejevas-Resovskis, kuris tyr varijuojant gen pasireikim drozofilos populiacijose. Jis pastebjo, kad drozofilos white (baltos akys) geno pasireikimas labai priklauso nuo temperatros. Kai yra kariau, atsiranda daugiau vairiu laipsniu pakitusio fenotipo museli. White geno aleliai ne tik keiia museli aki spalv, bet jos yra ir atsparesns auktai temperatrai, todl heterozigotose padidja mutantini aleli raika. i tyrim pagrindu N. Timofejevas-Resovskis pasil dvi svokas, apibdinanias geno pasireikim. Tai geno penetrantikumas ir ekspresyvumas. Geno penetrantikumas (lot. penetro siskverbimas) tai procentais ireikiamas danis, kuriuo genas pasireikia fenotipe, kai genotipas yra lemiantis poymio isivystym. Geno ekspresyvumas geno, genotipo lemiamo poymio vairov, skirtinga poymio iraika, nors vis augal (individ) genotipas yra tas pats (1.9 pav.). Suprantama, kad vienoks ar kitoks geno penetrantikumas ir ekspresyvumas yra fiksuotas paio geno struktroje ar genas priklausys nuo aplinkos veiksni ir kit gen, ar ne. Tai, kas nustatoma procentais vertinant geno penetrantikum, yra suminis aplinkos veiksni
54 |
ir gen-modifikatori poveikio genui rezultatas. imtaprocentinis geno penetrantikumas parodo, kad genas nuo i veiksni nepriklauso. Koks genotipas, toks ir fenotipas. Geno ekspresyvum irgi stengiamasi ireikti skaiiais, kiek koki fenotip yra, bet tai sunkiau padaryti. Pastaruoju metu paaikjo, kad geno ekspresyvum vertinti reikia labai atsargiai. Jei anksiau manyta, kad skirtingai pasireikia tas pats geno alelis, tai nustaius nukleotid sek, paaikjo, kad tai gali bti mutacijos skirtingose to paties geno vietose (saituose), t. y. i esms skirtingi aleliniai genai. Tad nenuostabu, kad jie skirtingai ir pasireikia.
Visikas penetrantikumas Nevisikas penetrantikumas Visikas ekspresyvumas Nevisikas ekspresyvumas Nevisikas penetrantikumas ir ekspresyvumas 100% 60%
1.9 pav. Schema, vaizduojanti geno penetrantikum ir ekspresyvum:

WT fenotipas; alternatyvusis fenotipas; skirtinga poymio raika atskiruose augaluose;
100 %, 60 % penetrantikumas, ireiktas procentais.
Dl ios prieasties geno penetrantikumo ir ekspresyvumo tyrimai turi bti atliekami labai apgalvotai, tik mutantinje linijoje vieno atskiro mutantinio augalo palikuoni. Tik toki augal mutacija tiktinai yra toje paioje geno vietoje (saite), bet ir tokio mutanto palikuoni vairov gali atsirasti dl mutanto genetinio nestabilumo, o ne dl geno penetrantikumo ar ekspresyvumo.
1.9. Komplementacijos (trans) testas ir poymio genetika

Komplementacija. Tarp kit nealelini gen sveik aptarme (1.6 sk.) ir komplementacijos reikin. Komplementacija tai normalaus (laukinio) arba jam artimo fenotipo atsistatymas hibriduose sukryminus du recesyviuosius skirtingo arba tapatingo fenotipo mutantus (1.10 pav.). Daniausiai i sveika parodo, kad genai yra nealeliniai, ypa kai j mutacijos lemia t pat fenotip. Komplementacijos tarp vienodo arba artimo fenotipo mutant prieastys aptartos 1.6 sk. i sveika bdinga recesyviesiems mutantams gen, kurie daniausiai yra susij bendru poveikiu fenotip, nulemia susijusius ir vienas paskui kit vykstanius procesus, tarpines reakcijas. Bet kurio i i vyki blokavimas (nul mutacija) sustabdo vis vyki grandin, ir galutinis poymis nepasireikia. Kai pataikoma sukryminti du mutantus, kuri lstelse vyki eiga nutrkusi skirtinguose etapuose, tada heterozigotose vl yra aktyvs abiej komplementari gen aleliai, tarkim,
AUGAL GENETIKA
| 55
P F1
aaBB
x AAbb AaBb
poymis neisivysto; hibridas normalaus fenotipo, pasireikia komplementacija.
Komplementacija parodo, kad nepriklausomi (nealeliniai) genai koduoja difuzinius produktus, kurie sveikauja nulemdami normal (laukin) fenotip. I esms sveikauja normal fenotip lemiani nealelini gen produktai.
x
arba
lax
tw
twN18
tw
tw1
F1
F1
Komplementacija Normalus fenotipas
Nra komplementacijos
B Mutantinis fenotipas
1.10 pav. vairi miei mutant tyrimai komplementacijos testu:

lax (laxatum) ir tw (tweaky spike) yra nealeliniai mutantai, t patvirtina ir F2 tyrimai (skilimo santykis yra madaug 9:3:3:1); tw ir tw1 aleliniai mutantai F1 ir F2 visi mutantinio fenotipo; twN18 gali bti tarpalelin komplementacija, nes F2 skilimo santykis 2,7:1, t. y. atitinka monohibridinio kryminimo (r. 2.2 lentel; pagal V. Ranelis, V. Vaitknien. Biologija. 2007, Vol. 53, P. 1118).
Taigi komplementacijos reikinys mums praveria duris kur kas sudtingesn, svarbesn, bet anaiptol nepakankamai itirt problem koordinuot gen veikl: kokia eile genams ir j produktams veikti. Be to, ne maiau svarbu ir kaip gen produktai pristatomi savo veiklos viet, koordinuotai irikiuojami pagal veiklos eil, ar pagal eil perdirba substratus (jeigu tai fermentai) iki galutinio produkto. Tai jau proteomikos, ne vien gen veiklos reguliacijos problema.
56 |
Proteomika tiria gen koduojam baltym visum proteom, j erdvin integracij (isidstym), funkcinius ir evoliucinius ryius grupuoja baltymus pagal struktr ir kilm eimas. Komplementacijos grups ir poymio genetika. Nors komplementacijos reikinys buvo aptiktas dar XX a. pradioje, io reikinio, kaip metodo, poymio genetikai tirti vert suvokta tik daug vliau, po daugelio met, ir prie to labai prisidjo geno funkcinio dalomumo tyrimai. Augal indlis i problem nra enklus. I pradi visi tyrimai ribojosi drozofila, vliau juos papild gauss bakterij ir virus tyrimai. Taiau daugelio augal poymi genetika prasideda nuo mutacij ir j analizs komplementacijos, arba trans-testu. is testas yra labai veiksmingas, kai norima isiaikinti, keli genai nulemia poym. Reikia gauti daug tokio pat fenotipo atskir mutant. Pagal itirt komplementacijos testu atskir mutant skaii rekordininke tikriausiai yra ved mokslinink Uda Lundkvist. Vien tik miei eceriferum tipo atskir mutant komplementacijos testu ji ityr 1347. Visa genetin poymio analiz prasideda nuo mutant, nepriklausomai nuo to, kokiu bdu mutacijos gene yra gaunamos, ar naudojant cheminius mutagenus (daniausiai alkilinanias mediagas metilmetansulfonat ir kt.), ar panaudojant transpozonus, ar sait-specifins mutagenezs bdu specialiai konstruojant mutantin gen su pakitusiu nukleotidu ar nukleotid seka. Svarbu, kad ie mutantai bt atskiri. Panagrinkime, kaip gaunami atskiri miei eceriferum tipo mutantai. Daugelis tokio tipo mutantus, nebtinai miei, yra mat. Tai augalai be vako apnao, kuris dengia stieb, lapus. Paveikus miei sklas mutagenu, kiekvieno augalo palikuonys sudaro eim (linij). Joje gali pasitaikyti ne vienas, o keli augalai mutantai be vako apnao, taiau tikriausiai jie kil i vienos pakitusios lstels, t. y. tapats. Atskirais mutantais j laikyti negalima. Kas kita mutantai i skirting eim. Jeigu mutacija ir vyko tame paiame gene, labai menka tikimyb, kad jame pakito tas pats nukleotidas (ar nukleotidai) ir visikai tapaiai. Sukuriama reikiam tyrimams atskir mutant kolekcija, ir ie mutantai ibandomi trans-testu, mutantus kryminant vien su kitu ir grupuojant komplementacijos grupes. Grups viduje yra tie mutantai, kuri F1 hibridai yra mutantinio fenotipo, nes tiek vienoje, tiek kitoje homologinse chromosomos genai yra paeisti mutacijos:
a1 a2
Kitaip atsitinka, kai nealelini gen mutacijos yra skirtingose nehomologinse chromosomose ar tos paios chromosomos skirtinguose lokusuose (vietose). Norint lengviau suprasti susidariusi padt, tarkime, kad genai yra toje paioje chromosomoje:
+ (A) (a) (b) +(B)
AUGAL GENETIKA
| 57
J hibridai yra normalaus fenotipo, nes pasireikia komplementacija: mutantin alel (a) stelbia normal fenotip lemiantis tame paiame lokuse tik kitoje homologinje chromosomoje esantis alelis (A). Panaiai ir kit mutantin gen (b) stelbia jo dominuojantis, normalj fenotip lemiantis, jo alelinis genas (B). 1-oji ivada. Trans-padt gauti nesudtinga: reikia sukryminti du mutantus, ir j F1 hibridai atitinka i padt. Kai dvi mutacijos yra skirting gen, trans-padtyje F1 hibridai bna normalaus fenotipo, o kai dvi mutacijos yra to paties geno mutantinio fenotipo. 2-oji ivada. Kiek trans-testu nustatoma komplementacijos grupi, tiek yra ir nealelini gen, kurie nulemia tiriamj poym. Lundkvist miei eceriferum mutantus sugrupavo 66 koplementacijos grupes, tad tiek jai pavyko aptikti ir gen, lemiani vako apna, dengiant augal. Pirma, tai nereikia, kad kitiems tyrintojams negali pavykti nustatyti naujas komplementacijos grupes, tuo paiu papildyti gen sra, kurie koduoja poym (taip atsitiko ir eceriferum vako apna koduojantiems genams). Antra, mutant suskirstymas komplementacijos grupes palengvina nauj mutant analiz. Reikia tik nustatyti grup, su kurios mutantu nra komplementacijos, ir jau aiku, kad is naujas mutantas yra to paties geno.
Treia, komplementacija yra stebima netgi tada, kai abiej nealelini gen mutacijos yra toje paioje homologinje chromosomoje, t. y. vadinamojoje cis-padtyje (1.10 pav.).
1.10. Komplementacijos testas ir funkcinis geno dalomumas
Nors pirmiausia nustatytas drozofilos gen funkcinis dalomumas, galioja ir augalams. Krosingoveris geno viduje yra viena i pagrindini augal polimorfizmo prieasi. 1.10.1. Krosingoveris geno viduje. Tarpalelin komplementacija
Tyrimai prasidjo kaip atsvara Morgano nuomonei, kad genas yra maiausias genetinis vienetas. Smulkesni u gen vienet nra, ir krosingoveris vyksta tik tarp gen. Kitaip tariant, pagal Morgan, maesni u gen chromosomos (tuo paiu ir DNR) dali, kurios lemt koki nors, kad ir labai ma savyb, nra. Krosingoveris geno viduje buvo vienas svariausi ir pirmj argument, kad genas yra dalomas. Tam reikms turjo btent komplementacijos tyrimai. Kai pataikoma sukryminti du mutantus (1.9 sk.), kurie yra dl to paties geno mutacij, F1 hibrid fenotipas turt bti mutantinis. Taiau tarp daugybs itirt drozofilos F1 palikuoni buvo aptikta, kad ir nedaug, bet normali individ. Galima buvo tai ir ranka numoti, bet ityrus toki individ palikuonis, nustatyta, kad tie normals individai buvo heterozigotiniai. Vienas j alelis buvo visikai normalus, o kitame atsirado abi mutacijos. Kad tai tiesa, patvirtino ir vlesni bakteriofago T4 ir bakterij tyrimai. Tokie normals individai su vienu normaliu, be paaid genu atsiranda dl krosingoverio geno viduje:
58 |
a1 +
+ a2
a1 + chiazmas
a2 +
a1 +
a2 +
trans-padtis mutantinis poymis
cis-padtis (po krosingoverio normalus poymis)
Trans-padt jau aptarme (1.9 sk. ir 1.11 pav.). Geno dali padtis, pavaizduota po krosingoverio, vadinama cis-padtimi.
Mutacijos Alelins (vieno geno) Normalus Mutantinis Cis-padtis / hibrido fenotipas Trans-padtis / hibrido fenotipas
Nealelins (skirting gen) Normalus Normalus
1.11 pav. Apibendrinti cis- trans-testo rezultatai:

geno ribos; x mutacijos vieta gene.
Geno dalys (vienodai normalios, ar mutantins), kurios yra toje paioje chromosomoje, apibdinamos kaip esanios cis-padtyje, o genai, geno dalys, nukleotid sekos, esanios kitoje chromosomoje (lyginamosios atvilgiu), yra trans- padtyje. i taisykl galioja bet kuriai DNR sekai, chromosomos segmentui, ne tik geno dalims. J isidstymas toje paioje chromosomoje apibdinamas kaip cis-padtis, o skirtingose chromosomose trans-padtis. Tarpalelin komplementacija buvo vienas netiktum, kurie lauk genetik, pradjusi naudoti komplementacijos test genetinei analizei. Komplementacija kartais pasireikia ir tarp to paties geno aleli (to paties geno mutacij). Rimtai iuo reikiniu susidomta tik tada, kai buvo surasti kiti tikinantys metodai nustatyti mutacij viet gene, ir nekilo abejoni, kad tikrai kai kuriuose genuose stebima tarpalelin komplementacija. Suprantama, kad lyderio pozicija iam klausimui tirti teko mikroorganizmams. Kokios yra tarpalelins komplementacijos prieastys, pirmasis iaikino 1959 m. Vudvardas (D. Woodward). Jam priskiriama tarpalelins komplementacijos atradimo garb. Vudvardas tyr grybo Neurospora crassa mutantus, kurie nesugeba sintetinti fermento adenilsukcinazs. Sujungus vienoje kolbutje ekstraktus i dviej mutant, kuriems bdinga tarpalelin komplementacija, kolbutje aptiktas aktyvus fermentas. Atskirai ibandytuose mutantini lsteli ekstraktuose aktyvaus fermento neaptikta. Vliau panaudojus radioaktyvi ym, rodyta, kad susijungia du fermento subvienetai.
AUGAL GENETIKA
| 59
Tarpalelin komplementacija vyksta tarp geno produkt. Polipeptidai sveikauja tarpusavyje sudarydami hibridines baltymo molekules (1.7 pav. ir 1.12 pav.).
A. Tarpalelin komplementacija koduojanti geno dalis + a2 a1 + neveiklus alelis a1 neveiklus alelis a2
Kompaundas (heterozigota a1, a2)
Transkripcija transliacija a1 a2 DNR (aleliniai genai) mRNR a1 a2 Polipeptidai (neveikls)
Veiklus baltymas (tarpalelin komplementacija) B. Baltymas su naujomis savyb mis/abu aleliai funkcionals a4 a3
Kompaundas a3a4 mRNR (transkripcija) baltymas i 2-j domen
d1a
A3
d2a
d1b
A4
d2b
d1 ir d2 Hibridinis baltymas
d1a
d2b A (naujas)
1.12 pav. Tarpalelin komplementacija ir hibridini baltymo molekuli susidarymas.
Daniausiai hibridins molekuls gali tik maiau ar daugiau prilygti pradiniam fermento aktyvumui, ir tai i dalies paaikina nevisik dominavim. Taiau pasitaiko, kad hibridins molekuls aktyvumu pranoksta pradinio fermento (atitinkanio WT) aktyvum. Tai vertinama kaip superdominavimas (r. 1.7 sk.). Pastebta, kad netgi mutantini aleli produkuojami baltymo fragmentai jungiasi neatsitiktinai: mutantiniai baltymo subvienetai sunkiai jungiasi;
60 |
normals, aktyvs subvienetai, atvirkiai, lengvai komponuojasi vienas su kitu. i savyb priklauso nuo konformacini baltymo ypatybi ir palaikoma speciali kokybs kontrols baltym; danai susijung dviej aleli koduojami produktai turi nauj ypatybi, gali turti selekcins verts, todl specialiai tiriami ir hibridai tarp skirting recesyvij alelini gen. Hibridas/heterozigota tarp dviej aleli vadinamas kompaundu (1.12 pav.). Vykdoma praktikai nauding kompaund paieka ir atranka. 1.10.2. Funkcinis geno dalomumas. Polifunkciniai baltymai Homoaleliai ir heteroaleliai. Ne tarp vis alelini gen vyksta tarpalelin komplementacija. Pagal tai genai skirstomi homoalelius, kuriems ie reikiniai nebdingi, ir heteroalelius, tarp kuri gali bti rekombinacija geno viduje ir tarpalelin komplementacija. Rekombinacija geno viduje daugiau priklauso nuo alelinius skirtumus nulemiani nukleotid vietos gene. Ji gali vykti ir netranskribuojamose ar netransliuojamose geno dalyse. Kitaip yra su tarpaleline komplementacija. Kaip galjome sitikinti (1.10.1 sk.), ji stebima tarp geno koduojam polipeptid fragment. Taigi vyksta net ne tarp visos transkribuojamosios geno dalies, o tik tos, kuri perraoma transliacijos metu polipeptidin grandin. Papildomais tyrimais nustatyta, kad tarpalelin komplementacija vyksta tik t gen, kurie transliuojamoje geno dalyje yra funkciniai dalomi. ie genai koduoja sudtingos sandaros ir funkcijos baltymus. Monofunkciniai ir polifunkciniai baltymai. Danai baltymai vykdo ne vien (bt monofunkcinis) funkcij, o dvi ir daugiau. Labai gerai polifunkcini, sudtingesns sandaros baltym savybes iliustruoja labai vairs pagal ias ypatybes augal R-baltymai, kurie lemia specifin augal atsparum patogeno rasms (1.10 intarpas). Tarp R-baltym yra ir monofunkcini, sudaryt i vieno domeno, pvz., Ptobaltymas, bet dauguma j yra polifunkciniai. Tarpalelinei kmplementacijai pasireikti daugiau reikms turi baltym domenin sandara. Ji ne visada tiesiogiai siejama su funkcija (bent funkciniai skirtumai gali bti neryks), o daugiau su tretine baltymo sandara. Domenai tai baltymo dalys, kurioms bdingos tam tikros konkreios funkcijos, sandaros ir erdvin autonomija. Suprantama, kad kai polifunkcin, sudaryt i dviej ir daugiau domen, baltym koduoja tik vienas genas, galima tiktis tarpalelins komplementacijos, jeigu mutacijos vyk geno dalyse, koduojaniose skirtingus domenus/funkcines dalis. Taip buvo ir Vudvardo bandymuose. Taiau, kai atskirus to paties baltymo domenus koduoja skirtingi genai, tarp gen pasireikia sveikos, bdingos nealeliniams genams (1.6 sk.). Komplementacijos testas ir poymio genetika. Dl tarpalelins komplementacijos kyla klausimas: ar apskritai priimtinas komplementacijos testas gen alelizmui nustatyti?
AUGAL GENETIKA
| 61
Kaip alelizmo testas, komplementacija visikai vienareikmio atsakymo, ar mutacijos yra alelins, ar nealelins nepateikia. Reikia komplementacijos tyrimus derinti su kitais genetins analizs metodais. Papildomas kriterijus mutacij/gen alelizmui nustatyti gali bti F2 hibrid analiz. Kai F2 hibrid santyki bendra suma sudaro 16 (pvz., 9:3:3:1; 9:7; 9:3:4 ir pan.) arba yra dar didesn 64, 256 ir t. t., mutacijos yra ne tik nealelins, bet labai didel tikimyb, kad jos yra gen, esani nehomologinse chromosomose. Komplementacija parodo, kad poym lemia keli genai, arba kad genas yra funkcikai dalomas. Sudtingiau, kai gen grup yra paveldima ir veikia kaip vienas vienetas operonas. Taiau pastaroji aplinkyb augal genetinei analizei didels reikms neturi, nes operono tipo gen sankaup augal genome yra nedaug.
1.10 intarpas. R-baltymai/erdvin ir funkcin j vairov R-baltymai lemia augalo atsparum konkreiai patogeno rasei pagal princip genas prie gen arba avr-R, t. y. R-baltymas reaguoja savit patogeno sintetinam jungin, daniausiai baltym (avr nuo angl. avirulence). Jeigu augalas turi patogeno rasei antagonistin R-baltym, jis atsparus iai rasei. Tas pats patogenas gamina kelis avr produktus, kaip ir augalas gali turti daug R-baltym (r. 5.6.3.3.1 sk.). Tipikas R-baltymas viena savo dalimi LLR (angl. leucine rich repeats) atpasta patogeno sintetinam baltym. Jai talkina ir kita R-baltymo dalis, kuri vairiuose R-baltymuose skiriasi. Tai parodo netgi jos pavadinimai LZ (angl. leucine zipper leucino utrauktukas), TIR (pavadinimas kils i dviej skirting baltym Toll ir Interleukino 1), CC (angl. coiled coil susivijusi spiral). Dar viena dalimi R-baltymai prijungia ir skaido ATP (arba GTP), atlieka ATPazs funkcij. i dalis pavadinta NB (angl. nucleotide binding nukleotid jungianti). Kai kurie R-baltymai dar turi baltymo dal, kuri veikia kaip proteinkinaz. Visos proteinkinazs fosforilina baltymus, t. y. prijungia fosfato liekan. ia dalimi R-baltymai perduoda signal apie augal itikus pavoj gilyn citoplazm ir branduol, kad bt aktyvinti kiti genai, kuri koduojami baltymai saugo augal nuo patogeno. Visas ias atskiras R-baltymo dalis LLR, NB, TIR, CC, LZ vadiname domenais. Antra vertus, R-baltymai labai vairs pagal savo viet lstelje. Vieni yra citoplazmoje, kiti persmeigia lstels membran, ilsdami u jos rib. Tai transmembraniniai baltymai, kuri domenai skirstomi ir pagal j erdvin padt: ekstramembraniniai domenai(-as); transmembraninis(iai) domenas(-ai); citoplazminis(iai) domenas(-ai). Kiekvienoje i erdvi gali bti ne vienas, ir, be to, skirting funkcij domenai. Kadaise prie R-baltym priskiriamas miei Mlo baltymas, kuris lemia atsparum visoms miltligs rasms (patogenas yra grybas Blumeria graminis, arba kitaip Erysiphe graminis f.sp. hordei), kerta membran net 7 kartus. Pats paprasiausias i R-baltym yra Pto-baltymas (pavadinimas nuo patogeno bakterijos Pseudomonas ir pomidoro tomato). Tai yra pavyzdys monofunkcinio ir tik i vieno domeno sudaryto baltymo proteinkinazs. Tai paskatino itirti, kaip toks R-baltymas veikia. Daugybin funkcij is baltymas atlieka kartu su kitu baltymu (Prf), kuris turi visus trkstamus domenus. Tai nra iimtis. Daugelis baltym veikia ne pavieniai, o sudarydami kompleksus. Pvz.,, SCF kompleksas (kurio net pavadinimas yra i trij baltym pavadinim pirmj raidi) sudarytas i dar didesnio, be to, kintanio priklausomai nuo funkcijos, baltym skaiiaus. Kai reikia
62 |
baltym arba baltym kompleks pritaikyti naujai specializuotai paskiriai, paprasiausias bdas tai atlikti pakeisti vien jo dal kita. Kai kompleks sudaro du vienodi arba daugiau polipeptid, yra homodimeriniai, arba homopolimeriniai, baltymai ir j kompleksai. Atitinkamai, i skirting polipeptid susidaro heterodimeriniai, arba heteropolimeriniai, baltymai arba j kompleksai. Be i struktrini/funkcini baltym ypatybi aptarimo sveika tarp nealelini ir alelini gen, komplementacijos reikiniai likt neaiks.
1.10.3. Duplikacijos geno viduje. Netolygus krosingoveris geno viduje ir permutacijos Daug geno sandaros ypatum atsirad ir atsiranda dl krosingoverio geno viduje, ypa dl netolygaus krosingoverio. Taip gene ir apskritai genome atsiranda tandemins duplikacijos kartotini DNR sek sankaupos, kai pasikartojantys DNR segmentai seka vienas paskui kit. Kita vertus, kartotini DNR sek sankaupos yra netolygaus krosingoverio karti takai, todl kartotini sek sankaupos yra tuose genuose ir j dalyse, kurioms btinas didelis kintamumas, polimorfizmas. Toki gen pavyzdys yra bulvi II tipo proteinazs inhibitoriaus genas Pin2. Pin2 geno ypatybs. II tipo proteinazs inhibitori eimos baltymai aptinkami sklose, lapuose ir kituose augalo organuose. J paskirtis yra slopinti fermentus proteinazes, kurios skaido baltymus. Tai atliekama vairiais tikslais, bet geriausiai itirti Pin2 baltymai augalo aizdose. J paskirtis - apsaugoti augal nuo per aizdas lengvai augal prasiskverbiani patogen. Patogeno siskverbimas (invazija) augal danai prasideda nuo to, kad jis sintetina ir iskiria aplink proteolitinius baltymus. Jie skaido augalo-eimininko baltymus, ypa pavirinius. Pin2 baltymas slopina proteolinius fermentus ir tuo paiu patogeno invazij augal. Paaikjo, kad Solanaceae eimos augalai turi unikali Pin2 baltym konduojanio geno sandar. Transkribuojamojoje geno dalyje yra du egzonai (1.13 pav.). Ypatinga yra 2-ojo egzono sandara. Pirmasis egzonas ir nedidel dalis 2-ojo egzono koduoja vadinamj signalin polipeptid. io polipeptido nelieka subrendusiuose baltymuose. Signalinis polipeptidas yra btinas baltymo sekrecijai pro membran arba jo sistatymui membran. Vliau jis paalinamas. Likusioji, pagrindin, Pin2 antrojo egzono dalis koduoja Pin2 baltym. i dalis ypatinga tuo, kad sudaryta i vairaus skaiiaus (kol kas nustatyta iki 8) kartotini sek (R), koduojani kartotin polipeptid (IP). Solanaceae . IP yra labai vairs. Iki iol aptikta bent 77 skirtingos kartotins sekos. Kiti augalai genome irgi turi Pin2 gen, bet duplikacijos geno viduje yra bdingos tik Solanaceae eimos augalams. Kol kas inoma tik viena iimtis. Tarp kit eim augal tik dekoratyviojo augalo kriktolins pluotagls (Mesembryanthemum crystallinum) Pin2 baltyme irgi yra aptiktos kartotins sekos. Kit augal II tipo proteinazs inhibitorius turi tik vien IP sek. Didiausia staigmena buvo ne tiek duplikacijos koduojanioje Pin2 geno dalyje, o tai, kad to paties augalo vairiose lstelse ir netgi toje paioje lstelje sintetinami skirtingi Pin2 baltymai, su skirtingu IP sek skaiiumi ir deriniu. Mat, paios IP sekos gali daugiau ar maiau skirtis. Sintetinamas tikras Pin2 proteinkinazi inhibitori kokteilis.
AUGAL GENETIKA
| 63
C
A bulvi IP gen vairov, pasireikianti pagal domen, koduojani proteinkinazes, skaii: 1-as domenas = 1-a aktyvaus baltymo molekul; B bulvi IP gen vairovs pagal kartotini domen skaii ir isidstym prieastis netolygus krosingoveris; R (repeat) kartotiniai segmentai; C kitas vairovs atsiradimo mechanizmas: ciklin sandara ir ciklo kirpimas vairiose vietose tabako (Nicotiana alata) NaProPI gene (pagal: A N. Antcheva et al. Protein Science. 2001, Vol. 10, P. 22802290; B E. Barta et al. Trends in Genetics. 2002, Vol. 18, P. 600603; C M. J. Scanlon et al. Structure. 1999, Vol. 7, P. 793802).
64 |
1.13 pav. Permutacijos Solanaceae eimos augal proteinkinazs inhibitori genuose:
Tai labai svarus ginklas kovoti su patogenais/ parazitais, kur naudoja ne tik augalai, bet ir kiti organizmai, tarp j induoliai (pvz., sintetindami kelis interferonus). Artim pagal funkcij baltym, izoferment sintez gana dana augaloeimininko strategijos prie patogen/parazit forma. Taiau skirtingai nuo Pin2 baltymo, daniausiai geno produkt/baltym vairov nulemia ne duplikacijos geno viduje, o duplikuoti genai. Yra ir kit bd sukurti geno produkt baltym vairov, pvz., alternatyvusis splaisingas. Kaip sukuriama geno produkt vairov du krosingoverio tipai geno viduje. Pin2 baltymo kokteilyje aptinkami trij tip baltymai. Vienuose aptinkamas vairus tos paios IP sekos segment skaiius, kiti nesiskiria IP sek skaiiumi, bet skiriasi j sudtimi (aminorgi sekomis), treti skiriasi abiem ypatybmis ir sek skaiiumi, ir sek sudtimi. Visa tai priklauso nuo krosingoverio pobdio Pin2 geno viduje. Pirmuoju ir treiuoju atvejais vyko netolygus krosingoveris (1.11 intarpas). Antruoju atveju apsikeista tolygiais segmentais tarp dviej homologini chromosom. O kaip susidaro Pin2 baltym kokteilis toje paioje lstelje? Daugelio augal somatins lstels gali bti poliploidins. Ypa tai bdinga Solanaceae . augalams. Prisiminkime, kad pirmuosius augal poliploidus Vinkleris gavo priversdamas pomidoro glius susidaryti i gilesni, nemeristemini lsteli. Poliploidinse lstelse yra daugiau kaip dvi homologins chromosomos, todl ir derini somatinse lstelse dl krosingoverio Pin2 geno viduje susidaro labai daug. Permutacijos. Akivaizdu, kad pertvarka Pin2 gene yra i anksto numatyta paios geno sandaros duplikacij geno viduje (1.13 pav.). Kartotins sekos skatina netolyg krosingover (1.11 intarpas). iuo metu i anksto numatyta genomo ir geno dali pertvarka yra vadinama permutacija. Lotynika odio prasm geriausiai paaikina reikinio esm (lot. permutatio element sukeitimas arba pertvarkymas).
1.11 intarpas. Cikliniai genomo kitimai permutacijos ir krosingoveris Ko gero, permutacijos ciklinis genomo dali sukeitimas, pertvarka pirmiausia aptikta virus genome. Dar 1960 m. trezingeris (G. Stresinger) man, kad i iedins, bazins bakteriofago T4 DNR susidaro linijins chromosomos, kuriose tie patys genai gali bti vairioje linijins chromosomos vietoje pradioje, ties viduriu, pabaigoje. Taip gali atsitikti, jeigu iedas bt kerpamas vairiose vietose, tarkime:
.
ia 1, 2, 3, 4 kirpimo vietos; A, B, C, D genetiniai ymenys. Visikai panaiai atsiranda kai kuri augal mitochondrij DNR permutacijos. J bazin DNR irgi yra iedin, o susidaro vairios linijins DNR molekuls. Savotikai permutacijos vyksta gripo viruso, kurio genetin mediaga yra RNR. io viruso genomas yra segmentuotas ir keiiamasi segmentais tarp dviej ir daugiau virus, ukrtusi t pat asmen. Kuo didesniu
AUGAL GENETIKA
| 65
skaiiumi segment keiiasi virusai, tuo didesn j vairov ir tuo sunkiau organizmoeimininko imuninei sistemai prisitaikyti prie danai besikeiiani viruso serotip. Tai bdinga ir augalams. Permutacijos yra bdingos tik konkretiems genomams ir j segmentams arba netgi konkretiems genams. Daniausiai jos vyksta dl genetins rekombinacijos-krosingoverio tam tikrose nukleotid sekose, kurias atpasta rekombinacij vykdantys fermentai. Daniau krosingoveris vyksta ir kartotini DNR sek sankaupose. iose vietose padidja tikimyb btent netolygiam krosingoveriui. Daniausiai homologins chromosomos keiiasi vienodo dydio segmentais. Kartotini sek sankaupose homologins chromosomos gali konjuguoti netiksliai, pasislinkusios:
1 2 3
1 2 1
2
3
1 2
1 2 3
ia 1, 2, 3 kartotins nukleotid sekos. Po netolygaus krosingoverio vienoje DNR molekulje segmentas padvigubja, o kitoje DNR molekulje vyksta delecija segmentas ikrenta.
Kol kas permutacij reikinio paplitimas augaluose menkai itirtas, taiau aptinkami vis nauji ir nauji genai, kurie koduoja duplikuotus to paties baltymo domenus ir patiria ciklin pertvark permutacijas. Tai bdinga agliutinacij sukeliantiems lstels baltymams baltymui favinui i pup (Vicia faba L.), konkavalinui A i Canavalia ensiformis ir kitiems lektinams, augal aspartilproteinazms. Tai vis baltymai, susij su atsparumu patogenams, stresams arba oldiams gyvnams. SAVARANKIKAM DARBUI Pagrindins svokos Alelis Aplinkos poveikis Augal genomas Domenas Genotipins mozaikos Genas Genomas Geno dalomumas Geno ekspresyvumas Geno penetrantikumas Gen sankaba Gen svoka Heterozigota Hibridas Hibridins baltymo molekuls
66 |
Homozigota Komplementacija Kryminimai Krosingoveris Modifikacijos Mutacijos Nealeliniai genai Objektai Paveldimumo teorija Permutacijos Pogenomin era Polifunkciniai baltymai Poliploidas Sekoskaita Supresija
Tarpalelin komplementacija Tyrimo metodai Vairenis
2. GAMETOFIT RAIDA POZICIN DETERMINACIJA. VYRIKASIS STERILUMAS IR HETEROZ. APVAISINIMAS IR NESUDERINAMUMO GENETIKA
II DALIS 2. Gametofit raida pozicin determinacija. Vyrikasis sterilumas ir heteroz. Apvaisinimas ir nesuderinamumo genetika
PAGRINDINS SVOKOS odynlis Kart kaita haplonto/gametofito ir diplonto/sporofito kaita gyvenimo cikle. Gametofitas augalo karta, kuri turi haploidin chromosom rinkin ir sudaro gametas. Samann vyraujanti gyvenimo ciklo dalis. Gameta (sin. lytin lstel) speciali haploidin lstel, kuri susiliejusi su kita gameta sudaro diploidin lstel zigot. Taip prasideda sporofitas. Augal isivysto mitozs bdu. Gametogenez gamet (lytini lsteli) susidarymas, magnolijn tai vyksta iedadulkje arba gemalo maielyje. Sporofitas daugialst diploidin karta arba augalo dalis, kuri susidaro tada, kai susilieja haploidins gametos. Po mejozs subrandina haploidines sporas, i kuri iauga gametofitas. Pataisn, asikln, ertvn, pun ir magnolijn vyraujanti gyvenimo ciklo dalis. Sporang augal reprodukcijos struktra, kuri gamina sporas. Magnolijn dulkins sudarytos i keturi sporangi. Sporogenez spor susidarymas i sporocito (mikro- arba megasporocito): atitinkamai mikrosporogenez ir megasporogenez. Spora haploidin lstel, kuri gali vystytis vis organizm arba jo dal nesusiliedama su kita lstele. Taip prasideda gametofitas. Mikrospora vyrikojo gametofito pirmoji lstel. Po mejozs i mikrosporocito susidaro keturios mikrosporos. iedadulk vyrikasis gametofitas, daniausiai sudarytas i 3- lsteli: vegetatyvins ir dviej generatyvini, kurios diferencijuojasi spermius vyriksias lytines lsteles. Megaspora (pirminis gemalinis maielis) moterikojo gametofito pirmoji lstel, pun ir magnolijn tik viena i 4-i haploidini lsteli, susidariusi po mejozs; 3 i j sunyksta. Gemalo maielis sklini augal moterikasis gametofitas; antrinis gemalo maielis daniausiai i septyni lsteli: kiauialsts, 2- sinergidi; 3- antipodi ir centrins gemalo maielio lstels su dviem haploidiniais arba vienu diploidniu branduoliu, i jos po dvigubo apvaisinimo vystosi triploidinis endospermas, o i kiauialsts diploidinis gemalas.
AUGAL GENETIKA
| 67
Heterosporija dviej skirting tip spor (mikrosporos ir megasporos) susidarymas ant to paties arba skirting tos paios ries augal (kai augalai dvinamiai, r. toliau). Homosporija bdinga kriptogaminiams augalams, vienalsiams, kai sporos yra vienodos formos, nors i j gali vystytis skirtingi gametofitai. Heterospermija skirtumai, kurie yra tarp spermi, vienas j apvaisina gemalo maielio kiauialst, o kitas susilieja su centrine gemalo maielio lstele. I pirmosios vystosi gemalas, o i antrosios endospermas. Nulemia spermi padtis vyrikajame gemalo vienete. Vyrikasis gemalo vienetas (pavadinimas kol kas nenusistovjs) kompleksas, kur sudaro spermiai ir iedadulks vegetatyvins lstels branduoliai. Spermiai tiesiog mirksta vegetatyvinje lstelje, bet ne atsitiktinai, sudaro kompleks su vegetatyvins lstels branduoliu. Sinergids yra gemalo maielio lstels, kurios labai svarbios dulkiadaigiui teisinga kryptimi patekti sklaprad ir teisingam apvaisinimui (dulkiadaigis siskverbia sinergid). Plikieji spermiai bna labai trumpai, kai suyra sinergid su j siskverbusiu dulkiadaigiu. Ateities klausimas: kaip paskui jie atpasta ir prasiskverbia kiauialst ir antrin gemalo maielio lstel. Sklapradis struktra, kurioje yra megaspora (gemalo maielis), o po apvaisinimo i jo vystosi skla. Sklapradio pagrind sudaro branduolas (nucelis), jo virutinje dalyje yra mikropil, pro kuri patenka iedadulks dulkiadaigis su spermiais, emiau jos yra gemalo maielis; bazalinis galas vadinamas chalaza, jo paskirtis mitybin; branduol dengia vienas arba du apdangalai (integumentai), i j susidaro sklos apvalkallis. Ap(si)vaisinimas dviej lytini lsteli susiliejimas; paskui seka branduoli susiliejimas kariogamija. Dvigubas ap(si)vaisinimas bdingas tik magnolijnams: dulkiadaigis prasiskverbia iki gemalo maielio, ir vienas spermis susilieja su kiauialste, o antrasis su centrine gemalo maielio lstele. Pun susidaro du spermiai, bet apvaisinama tik kiauialst; antrasis spermis nunyksta; j apdulkinimas ir apsivaisinimas atskirtas laiko tarpo. Asortyvusis (sin. selektyvusis) apvaisinimas kai vyrikojo individo poravimasis su moterikuoju arba vyrikj ir moterikj lytini lsteli susiliejimas yra neatsitiktinis. Lytinis dauginimasis kai susilieja dvi paprastai haploidins gametos. Augal skiriama krymadulka ir savidulka ir pagal tai augalai skirstomi krymadulkius ir savidulkius: krymadulka (sin. autbrydingas) kai apsivaisinama kito augalo iedadulkmis;
68 |
savidulka (sin. vaisa, inbrydingas) kai augalas pats save apvaisina; gali bti krymadulki augal priverstin vaisa. Hermafroditizmas vyrikos ir moterikos lyties poymi buvimas tame paiame augale, bdingas daugumai magnolijn. Hermafroditas organizmas, kuris turi vyrikus ir moterikus lytinius organus. Pagal lytinius organus augalai skirstomi dvi grupes: vienanamius tas pat augalas turi vyrikuosius ir moterikuosius iedus (iedynus), atskirai arba tame paiame iede yra vyrikieji ir moterikieji organai; iedai pagal tai skirstomi vienalyius ir dvilyius; dvinamius patys augalai yra skirting lyi, vieni turi moterikuosius, kiti vyrikuosius lytinio dauginimosi organus. Poravimosi (lytiniai) tipai yra bdingi organizmams, kuri (arba j gamet) negalima skirstyti moterikj ir vyrikj lyt; kriptogaminiai augalai priklauso iai grupei, nes ant to paties augalo isivysto vienodos formos, bet skirting poravimosi tip gametos. Genetinis krvis yra bdingas krymadulkiams augalams. Tai letali gen skaiius vienam augalui. ie genai paveldimi nepasireikdami fenotipe dl j recesyvumo. Heterozigotins bkls ie genai gali bti netgi naudingi. Genetinis krvis irykja, kai krymadulkiai augalai priverstinai veisiami savidulkos bdu. Taip veisiant krymadulkius augalus pasireikia: vaisos depresija sumajs augal gyvybingumas ir prastesnis igyvenimas; genai, lemiantys alingus, danai mirtinus (letalius) poymius. vaisos linijos gaunamos i vieno krymadulkio augalo palikuoni keliose kartose juos veisiant priverstins savidulkos bdu. Heteroz (sin. hibridin galia) yra prieingas vaisos depresijai reikinys, padidjs hibrid gyvybingumas (augimas, igyvenimas, vaisingumas) lyginant juos su homozigotiniais tvais; labai stipriai pasireikia tarp kai kuri vaisos linij tai pritaikoma praktikai. Nelytinis dauginimasis yra seniausias dauginimosi bdas, dauginamasi be lytinio proceso. Vienalsi daugiau/maiau pasidalijant lstelei pusiau. Taip dalijasi (dauginasi) ir iuolaikini eukariot/augal plastids ir mitochondrijos. Daugialsi labai vairs bdai. Augal skiriama: vegetatyvinis dauginimasis (sin. klonavimas) augalo dalimis (aknimis, stiebais, lapais, j dalimis ir pan.). Palikuonys yra tokio paties genotipo kaip motininis augalas. Augal bdas isaugoti heterozigotikum (heteroz) ir ivengti apsunkint slyg lytiniam dauginimuisi, todl tarp augal labai paplits. Daug speciali struktr ir dauginimosi bd (svognai, gumbai, atlankos, palaipos, stolonai ir kt.), tarp j:
AUGAL GENETIKA
| 69
pumpuravimosi bdas, kai vienalsi motinins lstels dalis (paprastai maesn), atsiskiria nuo likusios lstels; stuomenini augal susidaro speciali struktra pumpuras, neisivysts glys lap paastyse arba pakraiuose; gemuls (gemaliniai kneliai) samann vegetatyvinio dauginimosi organai i vienos, dviej ar daug lsteli, susidaro dubenlio pavidalo gemaliniuose krepeliuose; dirbtinis vegetatyvinis dauginimas mogaus sukurti vairs bdai( meristemins kultros, skiepijimas, kero dalijimas, gli aknydinimas, atlankos ) isaugoti hibrid heterozigotikum ir ypatybes, kurios atsirad hibriduose dl alelini gen sveikos ir palanki derini, ne visiems augalams vienodai skmingas. Sterilumas nesugebjimas produkuoti lytines lsteles, lemia: 1. gametofit ir su j raida susijusi sporofito struktr (pvz., sklapradio) raid ir funkcionavim koduojani gen mutacijos, 2. fiziologins prieastys ir netinkamos augimui slygos moterikasis sterilumas dl sutrikusios moterikj lytini organ, sklapradio, megasporos, gemalo maielio arba jame esani lsteli (kiauialsts, centrins, sinergidi) raidos arba funkcijos vyrikasis sterilumas (vs) dl t pai, tik vyrikj organ mikrogametofito, spermi ypatum, panaudojamas heterozei ir genetikai modifikuot (GM) augal plitimui reguliuoti, todl vs genetika geriau itirta. Skiriamas sterilumas pagal tai, kuriose genetinse struktrose yra j lemiantys genai. is skirtumas itin svarbus tiems, kurie kuria arba naudoja GM augalus: branduolinis dl branduolio gen (pvz., barnazs) citoplazminis (cvs) dl gen, esani nebranduolinse struktrose: mitochondrij labai danai naudojamas heterozei, atsiranda dl gen, esani mitochondrij DNR, viena i prieasi nauj chimerini gen susidarymas reikinys, kol kas nustatytas tik mitochondrij genomui; plastidi natralus (galbt dl letalumo) neaptinkamas, sukurtas dirbtinai RF (angl. Restortier Fertility) genai btini atkurti VS vaisingum t augal, kuri produkcija yra sklos/grdai. Paprastai tai yra dominuojantieji genai. Jie slopina VS sukelianius genus. Nesuderinamumas (apvaisinimo metu) neleidia hermafroditui augalui (turiniam vyrikus ir moterikus lytinius organus) apsivaisinti savo paties iedadulkmis, ivengiama vaisos. Nebdingas savidulkiams augalams. Skiriamas dviej tip: heteromorfinis dl sandaros ir fiziologini ypatum (pvz., heterostilijos, skirtingo ydjimo laiko ir pan.); homomorfinis, kai yra akivaizdios vidins prieastys, nes augalo struktros, fiziologini skirtum nra, morfologikai nesiskiria ir iedadulks. Lemia speciali motininio ir tvinio augalo S-gen sveika

70 |
skiriami moterikasis ir vyrikasis S-determinantai (sveikos veiksniai). Pagal juos ir sveikos pobd skiriami keli (Brassica, Solanaceae, Papaver) S-nesuderinamumo tipai S-genai, kurie lemia S-nesuderinamum. J koduojami S-determinantai yra subtiliai suderinti tarp motininio ir tvinio augal. Pagal tai skiriami: sporofitinis S-nesuderinamumas: turi atitinkamu bdu derintis motinos ir tvo sporofit genotipai, vadinasi, po du genus i tvo ir motinos pusi, nes sporofitai yra diploidai; gametofitinis S-nesuderinamumas nulemiamas konkreios iedadulks (haploido) atitikimo/neatitikimo atitinkam S-geno koduojamo moterikojo determinanto alel turint motinin augal.
S-lokusas moterikieji ir vyrikieji S-genai yra viename lokuse, sudaro vadinamj. supergen. Tai palengvina suderint tvini augal moterikojo ir vyrikojo S-determinant sveik.
2.1. Augal dauginimosi ypatumai ir tipai (bendra apvalga)

Mendelio neskm Hieracium hibridai. Mendelio darbai su augal hibridais nutrko dl paios netikiausios prieasties. Pats Mendelis sitikino, kad jo nustatyti poymi paveldjimo dsniai negalioja tarpriniams vanags (Hieracium) hibridams. Kaip minta (r. 1.1 sk.), viskuo kaltas ymus to meto botanikas Negelis (K. W. Ngeli), kurio patarimu Mendelis msi vanags kryminim. Rezultatai i esms skyrsi nuo t, kuriuos Mendelis gavo krymindamas irnius ar pupeles. Netgi pirmosios hibrid kartos (F1) vienodumas pasireik tik kai kuriuose Hieracium ri deriniuose, bet svarbiausia, kad tolesnse kartose hibridai buvo stabils, pastoviai isaugojo F1 turtas savybes. Vadinasi, F2-F3 nepasireik skilimas, bdingas irni, pupeli F2 hibridams. Biologams teko gerokai papluti, kol paaikjo tikroji vanags tarprini hibrid nukrypimo nuo Mendelio dsni prieastis apomiks, kuri tik imituoja tipik lytin dauginimsi: sklos vystosi be apvaisinimo. Antra vertus, vanags hibrid ypatybs vaizdiai parod, kad poymi paveldjimas labai priklauso nuo dauginimosi bdo. Pagrindiniai dauginimosi tipai yra du: lytinis dauginimasis, kai susilieja dvi lytins lstels, taiau jos gali bti skirting augal motininio ir tvinio, tai krymadulka, prieinga jai yra savidulka (vaisa), kai augalas apsivaisina savo paties vyrikosiomis lytinmis lstelmis (gametomis) nelytinis dauginimasis augal labai paplits ir pasireikia visose stambiose augal taksonominse grupse, o tarp stuburini gyvn is dauginimosi tipas inyko. Nelytinis dauginimasis bdas isaugoti heterozigotikum ir palankius gen derinius heterozigotose, nes palikuonys atsiranda i vieno motininio augalo. Isaugomas motininio augalo genotipas ir jis pagausinamas. Ivengiama lytini lsteli susiliejimo, po kurio palikuoni genotipas gali skirtis nuo motininio augalo genotipo (tai nagrinjome 1 sk.).
AUGAL GENETIKA
| 71
Pastaroji ypatyb augal genetikoje itin svarbi. Dauguma iedini augal yra hermafroditai. Ant to paties augalo yra ir vyriki, moteriki lytiniai organai, ir todl labai svarbus klausimas, kaip tokie augalai ivengia savidulkos (vaisos). Yra ir kitos augal dauginimosi ypatybs, dl kuri kyla savitos augal genetikos problemos, susijusios su augal dauginimosi ypatumais. Tai enklus gametofito vaidmuo netgi sudtingiausios sandaros iedini augal gyvenime, sporofito ir gametofito kart kaita, dvigubas magnolijn apvaisinimas ir sklini augal naujov skla. Dl pastarosios atsirado naujas unikalus, tik tarp sklini augal pasitaikantis nelytinio dauginimosi bdas apomiks. Apomiks tai nelytinio dauginimosi bdas sklomis. Skla vystosi be apvaisinimo i diploidins somatins sklapradio lstels arba i neredukuoto diploidinio gametofito. Isaugomas pradinis motininio augalo genotipas. Dl apomikss skiriami du augal nelytinio dauginimosi tipai: apomiks (kuri tik k aptarme ir r. 3 sk.); vegetatyvinis dauginimasis augalo dalimis, kurio bdai yra labai vairs ir natrals, bdingi konkreiam augalui, dirbtiniai, mogaus sukurti, tarp j ir i atskir lsteli, mikrospor (iedadulki).
2.2. Sporofitas ir gametofitas kart kaita

Sporogenez ir gametogenez. Sporofitas ir gametofitas. Skirtingai nuo gyvn, augal po mejozs susidaro sporos. Jos yra haploidins. Sporos geba dalintis mitozs bdu ir i j iauga gametofitas. Tai daugialstis haploidinis organizmas arba jo dalis. Kokiu mastu pasireikia gametofitas, yra stambi taksonomini augal grupi ypatyb. Gametofitas i haploidini lsteli subrandina haploidines lytines lsteles gametas, ir tai vyksta mitozs bdu, skirtingai nuo gyvn, kuri lytins lstels susidaro tiesiogiai po mejozs. Kai susilieja lytins lstels, zigota turi diploidin chromosom skaii, ir jeigu i jos vystosi organizmas arba bent jo dalis (kaip samann), jis yra diploidinis sporofitas: turi isidiferencijuoti jo specialios lstels sporocitai, kurie dalijasi mejozs bdu ir susidaro haploidins sporos. Haploidinis gametofitas iaugina haploidines gametas, o diploidinis sporofitas haploidines sporas. Kart kaita (2.1 pav., A). Gametofito ir sporofito ratai sukasi ir sukasi. Tai ir sudaro gyvenimo ciklo kart kait. Cikle kaitaliojasi haplofaz (organizmas vadinamas haplontu) ir diplofaz (atitinkamai, diplontu). Tarp daugialsi dumbli, kuriems bdinga labai didel kart kaitos vairov, gali pasitaikyti, kad sporofitas arba gametofitas turi ne vien, o dvi fazes (r. toliau).
72 |
a) Vyrauja haplontas
Susiliejimas
Haploidin populiacija
Haplofaz
Mejoz
Ne mutantas A Mutacija
Mutantas aa
b) Vyrauja diplontas
Susiliejimas Atranka
Diplofaz
Mejoz
Diploidin populiacija Ne mutantas Aa AA Mutacija

Mutantas aa
c) Izomorfinis haploidinis-diploidinis ciklas

Susiliejimas
Haplofaz
Mejoz
Diplofaz
Atranka
2.1 pav. Kart kaita (A) ir letalaus recesyviojo mutantinio alelio likimas, kai veikia atranka (B):
A kart kaitos vairov: a vyrauja haplontas: gametos susilieja ir i karto vyksta mejoz, vl atsiranda haploidins lstels, kurios dauginasi mitozs bdu iki kito lytinio ciklo (pvz., aliadumblis Ulothrix); b vyrauja diplontas: gametos susilieja ir mitozs bdu dalijasi diploidins lstels, haplofaz trunka tarp mejozs ir gamet susiliejimo (daugelio augal); c izomorfinis ciklas, kai haplofaz ir diplofaz pagal trukm i esms nesiskiria, gali bti, kad ir haplontas nuo diplonto maai skiriasi, kaip aliadumblio lins (Ulva); B haplonte mutacija greitai pasireikia fenotipe ir paalinama atrankos, o diplonte recesyvioji mutacija pasireikia ir paalinama atrankos tik kai yra homozigota, abejose homologinse chromosomose (pagal B. K. Mable, S. P. Otto. BioEssays. 1998. Vol. 20, P. 453462).
Sporofito ir gametofito kaita nebdinga gyvnams, kuri haplofaz apsiriboja lytinmis lstelmis tik tiek, kiek tai btina reguliuoti pastov chromosom skaii. Iimt sudaro tie gyvnai (vabzdiai), kuri kaitaliojasi lytins (dipoidins) ir partenogenetins (haploidins, be apvaisinimo) kartos arba viena i lyi yra partenogenetin (pvz., bii tran). Bestuburi gyvn gali reguliariai kaitaliotis lytins ir nelytins kartos. Sporofito (diplonto) dominavimas ir gametofito (haplonto) redukavimas irgi labai ryki augal evoliucijos tendencija. Taiau netgi didiausio sudtingumo pasiekusi magnolijn (gaubtaskli) haplontas yra ne pavien lstel, o daugialst struktra. Subrendusioje j iedadulkje/vyrikajame gametofite yra 3 lstels, o moterikajame gametofite gemaliniame maielyje tipiku atveju yra septynios lstels (2.2 pav.).
AUGAL GENETIKA
| 73
Antrinis gemalo maielis
2.2 pav. Magnolijn (gaubtaskli) augal sporogenez ir gametogenez.
Mejoz ir dl jos atsirandantis haploidinis chromosom skaiius gametofito ir lytinse lstelse yra btina lytinio dauginimosi slyga: isaugomas pastovus chromosom skaiius, kuris antraip didt po kiekvieno lsteli susiliejimo; tolygiai, dsningai paskirstomos chromosomos organizm, kuri genomas fragmentuotas chromosomas, o tai neivengiama btinyb didjant genom dydiui; netgi kai genomas ne toks jau didelis, chromosom gausa padidina tvo-motinos chromosom derini skaii (tai irgi jau aptarme); suartjus homologinms chromosomoms padidja tikimyb apsikeisti fragmentais tarp homologini chromosom krosingoveriui. Visikai taip pat dsninga, kad diplontas istm haplont. Privalumai, kuriuos teikia augalui diploidikumas ir lytinis dauginimasis, aptarti 1-ajame skyriuje, taiau pravartu juos prisiminti:
74 |
padidja organizm vairov (polimorfizmas), dl to lengviau igyventi, kai keiiasi aplinkos slygos, uimti platesn gyvenimo erdv (areal). Tai pasiekiama dl trij prieasi: genomo fragmentacijos chromosomas, o i atsitiktinio derinimosi; krosingoverio; gen sveikos diploido lstelse (ias sveikas jau irgi aptarme 1-jame skyriuje); diploiduose greiiau gali atsirasti naujos funkcijos, nes organizmas turi po dvi chromosom kopijas, todl vienoje j gali bti normal (tipik augalui, WT) fenotip lemiantis alelis, kai kitoje chromosomoje mutantinis alelis, galbt, kaip tik koduojantis nauj funkcij. Haploide tokie aleliai i karto bt alinami atrankos, nes visi haploido genai kaip ant delno, pasireikia fenotipe. iuo metu labiau rpi ne kodl vyrauja sporofitas, o kodl iliko gametofitas. Be to, kai kuri augal grupse, pvz., samann gametofitas yra klestinti gyvenimo ciklo dalis. Samanos (Bryophyta) yra tarp t augal, kuri suklestjo gametofitas. Be to, samanos turi dvi gametofito fazes: protonem, iaugani tiesiogiai i sporos, vienasluoksn ir silik besiakojani form, primenani silinius dumblius; lapik gametofit, kuris isivysto i pumpurli, ant protonemos isiakojim. Tai sudtingi organizmai, kurie kaip ir dera gametofitams, iaugina gametas. Samann gametofitas ivyst kelet naujovi, kurios buvo pasigautos ir kit augal, kuri gyvenimo cikle jau vyrauja sporofitas. Pirmiausia tai stiebas ir ypa lapai, kaip tobulas organas vykdyti fotosintez. O samann sporofitas tik apgailtinas parazitas, sitvirtins gametofito audiniuose ir imantis i j reikiamas maisto mediagas. Taiau samannams reikia daug drgms, o vyrikoms lytinms lstelms judti tiesiogiai reikalingas vanduo. Todl manoma, kad augal sporofito sigaljim lm ijimas sausum, o tai reik apskritai nauj gyvybs epoch emje. Gyvn i karto sigaljo diplontas, bet jie gali judti, keisti aplink. Dumbliai perspektyva kart kaitos genetikai. Kart kaita yra paveldimas taksonominis poymis, taiau jos genetika engia pirmuosius ingsnius. Daugiausia vili teikia dumbliai, kurie apskritai yra aukso kasykla genetikams, nes tarp dumbli daugeliui esmini biologini reikini galima surasti uuomazgines pereinamsias formas: nuo vienalsio per kolonijinius dumblius daugialsius linijinius ir gniuulinius organizmus, lytinio dauginimosi, heterosporijos uuomazgas ir sigaljim. Patraukia dmes ir labai didel haplonto/diplonto santykio vairov netgi toje paioje dumbli taksonominje grupje. Tai pasireikia netgi tarp vienalsi dumbli. Antai populiaraus genetini tyrim objekto vienalsio aliadumblio Acetabularia lstels yra diploidins, vyrauja diplofaz. iam dumbliui bdinga sudtinga sandara ir raida i palyginti paprastos pradins lstels. Palaipsniui lstel tampa vis sudtingesn, kol gal gale primena kepurtuosius grybus. Susidaro ir rizoid panai dumblio dalis, kurios viename gale taip ir lieka lstels branduolys, todl j lengva paalinti arba pakeisti kitu, ir itirti, kaip tai atsilieps lstels raidai kepurl. Dl mint ypatybi Acetabularia yra puikus objektas tirti tokiems
AUGAL GENETIKA
| 75
sudtingiems reikiniams kaip morfogenez, lsteli diferenciacija, branduoliocitoplazmos sveika, ilgalaikms mRNR. Kitas vienalstis aliadumblis Chlamydomonas, ypa jo ris Ch. reinhardii yra ne maiau, o gal ir daugiau populiarus genetini tyrim objektas nei Acetabularia. rodymas yra ir tai, kad io dumblio genomas yra visikai sekvenuotas, t. y. nustatyta nukleotid seka. Taiau Ch. reinhardii, prieingai Acetabularia, vyrauja haplofaz. io dumblio tyrimai labai daug prisidjo iaikinti nebranduolin poymi paveldjim per chloroplastus. Uuomazgins formos yra ir jo kolonijin bsena. Kai blogos slygos, Chlamydomonas praranda iuelius, gebjim judti, bet dauginasi ir buriasi gleivtus lsteli sambrius (palmelin bkl). Lyties genetika irgi nra sudtinga. iam dumbliui netinka skirstymas vyrikj ir moterikj lyt. Kaip ir mieli Saccharomyces cerevisiae, aliadumblio Chlamydomonas skiriami poravimosi tipai. Susilieja dviej poravimosi tip lstels. Chlamydomonas poravimosi tipai paveldimi paiu paprasiausiu bdu. Juos lemia vieno branduolyje esanio geno aleliai mt+ ir mt . Atitinkamai skirstomi ir poravimosi tipai. Taiau pagal tai, kaip susidaro skirting poravimosi tip gametos, skiriami heterotaliniai ir homotaliniai organizmai. Homotalins ir heterotalins rys. Heterotaliniams organizmams bdinga tai, kad skirting potencial lstels isivysto skirtingiems individams ir poruojasi lytins lstels, kil i skirting individ. Homotalini organizm skirting poravimosi tip lstels yra kil i to paties individo (lstels). Taip atsitinka todl, kad tos paios lstels genome yra genai, lemiantys vien ir kit poravimosi tip. Vienose lstelse veikia vienas genas, kitose kit poravimosi tip lemiantis genas. Geriausiai tai itirta ne dumbli, o mieli Saccharomyces cerevisiae. Chlamydomonas gentyje yra ir heterotalins, ir homotalins rys. Vadinasi, galima surasti uuomazg dauginimosi sistem krymadulkos (heterotalin ris) arba savidulkos (vaisos, homotalin ris). Homosporija ir heterosporija. Chlamydomonas gentyje galima irti pradi pradi ir kitam reikiniui, sitvirtinusiam kitose augal taksonominse grupse tai heterosporija, kuriai kaip alternatyva yra homosporija. iedini augal nesunku atskirti, kuri lytin lstel vyrika (spermis), o kuri moterika (kiauialst). Skiriasi ir skirting lytini potencij sporos tiek dydiu, tiek forma: mikrosporos smulkesns ir i j vystosi vyrikasis gametofitas, o megasporos yra stambesns ir i j vystosi moterikasis gametofitas. Heterosporijos sigaljimas prasideda nuo sporini induoi, nes homosporija pasitaiko psilotainiams, pataisnams, asiklnams, daugumai ertvn. J sporos yra vienodo dydio, taiau gametofitai gali bti dvinamiai (vyriki ir moteriki) arba taip vadinamj kriptogamini augal (pasitaiko tarp dumbli, samann, ertvn) gametofitas vienanamis. Vystosi ir vyrikos, ir moterikos gametos, kurios savo forma nesiskiria. Chlamydomonas gentyje pasitaiko visko, visi trys galimi atvejai: izogamins, anizogamins ir oogamins rys. Izogamini ri lytins lstels nesiskiria dydiu ir forma, galima bt lyginti su homosporija. Chlamydomonas jos turi iuelius, todl yra vienodai judrios. Kitose ryse gametos skiriasi dydiu, bet yra iueliuotos, todl judrios. Toks apsivaisinimo bdas vadinamas anizogamija. Bene domiausios yra oogamins Chlamydomonas rys. Vienos j gametos stambesns, bet nejudrios, neturi iueli, o kitos smulkesns, iueliuotos ir
76 |
judrios. Preliudija vienai i rykesni evoliucijos tendencij heterosporij, nejudri megaspor ir dulkiadaigiu judanius spermius.
Daugialsi dumbli kart kaitos vairov dar didesn. Vien dumbli, pvz., aliadumblio Ulothrix, vyrauja haplofaz. Diplontas tik viena lstel, zigota. Joje i karto vyksta mejoz ir susidaro haploidins sporos, o i j iauga daugialstis organizmas. Kit dumbli, pvz., rudadumblio guveinio (Fucus), haploidins yra tik gametos. Rudadumbli (Phaeophyta) gyvenimo cikle yra ne dvi, o trys fazs, tik skirtingai nei samann, dvi fazs yra diploidins: haploidinis gametofitas; diploidinis karposporofitas (arba cistokarpis); kita diploidin faz tetrasporofitas. Karposporofitas iaugina karposporas, kurios susidaro karposporangs viduje, ieina aplink ir virsta savarankikais tetrasporofitais. Juose dar kart susidaro sporas iauginantis organas tetrasporangs. Tetrasporangse kart, kaip prasta, vyksta mejoz ir susidaro haploidins sporos. Daugumos rudadumbli (Phaeophyta) susidaro dviej tip sporos diploidins (karposporos) ir haploidins (tetrasporos).
Izomorfiniai ir heteromorfiniai dumbliai. Gyvenimo cikl kaitos atvilgiu domiausi yra dumbliai, kuri gyvenimo cikle haplofaz ir diplofaz yra lygiaverts. Sporofitas ir gametofitas morfologikai nesiskiria (arba skiriasi nedaug). Pavyzdiu gali bti aliadumblis lin (Ulva). Tokius dumblius (ir apskritai organizmus) apibdiname kaip izomorfinius (2.1 pav., A). Jiems prieingyb heteromorfiniai organizmai, kuri haplofaz ir diplofaz rykiai skiriasi. Gan danos, izomorfins rys tarp rudadumbli. Izomorfins rys yra didiausias galvos skausmas genetikams. Dl j kyla daugiausia klausim. Pirmiausia, kodl gyvenimo cikle egzistuoja dvi madaug lygiaverts to paties augalo fazs. Kol kas eksperimentais pagrsto atsakymo klausim nra. Manoma, kad gametofitas ir sporofitas uima skirtingas ekologines nias, geriau inaudoja maisto ir energijos iteklius. Keliamas ir platesnio pobdio klausimas: kodl net tarp tos paios grups organizm egzistuoja tokie, kuriuose vyrauja sporofitas ar, atvirkiai, gametofitas, haplofaz arba diplofaz. Kaip pagrindin prieastis nurodoma atranka. Haplonte atranka lengviau paalina alingus genus, neleidia susidaryti genetiniam krviui (2.1 pav., B). Be to, manoma, kad haplonto ilikim lemia ir ekologiniai veiksniai. Haploidiniai augalai yra smulkesni, todl sunaudoja maiau maisto atsarg. Visa tai tik samprotavimai, taiau gana pagrstai manoma, kad dumbliai yra raktas kart kaitos genetik. Reali tikimyb tarp dumbli rasti paprasiausius, uuomazgos pavidalo kart kaitos atvejus, kuriuos yra lengviau tirti. Stuomeninius ( tarp j ir sporinius induoius) augalus vienija suklestjusi sistema gabenti maisto mediagas rtiniais (floema) ir medienos (ksilema) indais, taiau, gal netgi svarbiau tai, kad vyrauja sporofitas ir labai ryki stuomenini augal (induoi) evoliucijos tendencija mati gametofitui pagal dyd ir sudtingum. Taiau daugumos lygiaspori (izosporini) pataisn, asikln ir ertvn gametofitas yra savarankikas. Heterosporini stuomenini augal gametofitas yra sporofito ilaikytinis: i jo gametofitas gauna maisto mediagas. Vis tik pataisn, asikln ir ertvn apsivaisinimui reikalingas vanduo. Punai ir magnolijnai to ivengia, nes j vyrikosios lytins lstels spermiai pasiekia kiauialst (gemalin maiel) dulkiadaigiu.
AUGAL GENETIKA
| 77
Pun ir magnolijn palyginimas. Pagal kart kait didels takoskyros tarp pun ir magnolijn nra. Rykesni morfologiniai skirtumai. Punai neturi ied, o j lapai virt spygliais. Pun iek tiek maiau redukuoti gametofitai, taiau ir ie skirtumai ne tokie dideli. Vienintelis rykus skirtumas, kad punai kaip ir kiti stuomeniniai augalai turi archegones, kuri neturi tik magnolijnai. Tai lytinis organas, morfologikai daug kuo menantis sklaprad (r. 2.3.1 sk.), tik sklapradis yra sporofito darinys. Archegon tai moterikas lytinis organas, kuriame isivysto kiauialst. Magnolijn skiriamieji poymiai yra iedas ir vaisius, kuris supa skl arba sklas, dl ko jie vadinami gaubtaskliais. Taiau kankoris atlieka t pai apsaugin funkcij skloms, kuri atlieka ir vaisius: apsaugoti nuo nepalanki slyg. Tik skl iplitimui kankorio vaidmuo yra palyginti menkas. Taiau pasitaiko gana daug magnolijn, kuri ibarstomos plikos sklos, pvz., aguon. Punus ir magnolijnus vienija dvi labai svarbios ypatybs: skla, dl ko jie vadinami skliniais auglais; moterikasis gametofitas yra neatskiriama augalo dalis. Skla apskritai laikoma didiausiu augal evoliucijos pasiekimu. Kaip ir induoli gemalas, kur ipuoselja, iaugina motina. Augalo gemalas sklos viduje irgi iauginamas ant motininio augalo. Taip gemalas apsaugomas nuo nepalanki aplinkos veiksni, maksimaliai reguliuojama jo raida. Tik morfologin augalo raida (skirtingai nuo induoli gemalo) sklos gemale nepasibaigia. Ji tsiasi vis augalo gyvenim. Taiau motina pasirpina ir tolesniu daigo augimu (esant juvenylinei augalo raidos stadijai), kol jis nesustiprjs. iam tikslui endosperme arba sklaskiltse yra sukauptas pakankamas kiekis maisto mediag. Gemalo raida sklapradyje netgi neprasideda, kol nesivysto endospermas. Magnolijnai irado bd, kaip suderintai kontroliuoti gemalo-endospermo raid. Tai tariamasis genomo imprintingas. Kartu paaikjo, kad sklos raida be apvaisinimo gali bti kai kuri augal labai patogus rafinuotas nelytinio dauginimosi bdas. Itisos augal gentys geba iauginti skl be apvaisinimo. Tai apomiks. Gametofit raida pun ir magnolijn irgi daug kuo panai. Pirmiausia, vyrikasis gametofitas yra iedadulk. Tiesa, abiejose augal grupse jo raida iek tiek skiriasi. I pateikto 2.3 pav. (A) palyginimo labai esmini skirtum tarp pun ir magnolijn mikrogametofito (iedadulks) raidos nematyti. Skirtumas tik iek tiek didesnis lsteli skaiius, daugiau mitozs dalijimsi, ypa t lsteli, i kuri vystosi spermiai. Didiausias skirtumas dvigubas apvaisinimas. Net atrodo paradoksaliai, kad ir pun susidaro du spermiai, nors apvaisinimui reikalingas tik vienas. iek tiek daugiau skiriasi pun moterikojo gametofito raida. Tai susij su i augal apvaisinimo skirtumais. Puies apdulkinimas ir apvaisinimas atskirti didelio 15 mnesi laikotarpio, o magnolijn apvaisinimas daniausiai vyksta i karto po to, kai iedadulks patenka ant purkos ir pradeda dygti (iimtis, pvz., orchidjos, r. 2.3 pav., B).
78 |
2.3 pav. Pun ir magnolijn vyrikj gametofit raidos ir apvaisinimo palyginimas (A); orchidj sklapradio ir gemalo maielio raida, prasidedanti tik po apdulkinimo (B):
B raidos pokyiai: 1 sklapradio raidos pradia; 2 sklapradio raida; 3 megasporocito raida; 4 mejoz; 5 gemalo maielio raida.
Pun megagametofito raida. Pun viskas vyksta kaip labai sultintame filme. Megagametofitas vystosi tik po apdulkinimo. Pirmiausia prajus madaug mnesiui po apdulkinimo vyksta mejoz, susidaro 4 haploidins lstels, i j 3 va, o viena vystosi megagametofit. Iki io momento pun ir magnolijn gametofito raida nesiskiria. Toliau megagametofit raida i esms skiriasi. Magnolijn, kaip gerai inoma, susidaro gemalo maielis su 7-iomis lstelmis, taiau ir ia sutapimas: i pradi dalijasi branduoliai, o tik paskui vyksta citokinez (susidaro lstels apvalkallis). Pun megagametofite branduoliai mitozs bdu dalijasi labai daug kart. Susidaro daugiabranduol lstel. Madaug po 13 mnesi nuo apdulkinimo joje bna apie 2000 branduoli. Tik po
AUGAL GENETIKA
| 79
15 mnesi nuo apdulkinimo pagaliau susiformuoja megagametofitas. Jame bna kelios archegons. Puies gametofite isivysto 2-3 archegons. iedadulks galutin raida irgi suderinta su megagametofito raida. Tik praslinkus metams po apdulkinimo, prasideda antrasis mitozini dalijimsi ciklas ir subrsta 2 spermiai. Pagaliau madaug po 15 mn. dulkiadaigis pasiekia archegons kiauialst. Daniausiai nepaisant to, kad buvo apvaisintos vis archegoni kiauialsts, skloje vystosi tik vienas gemalas.
2.3. Magnolijn sklapradio ir gametofit raida.Vyrikasis sterilumas, gen ininerija ir heteroz

2.3.1. Ssaja su gyvn raida. Sklapradis Magnolijn paralels su induoliais. Nors apibdinimas ,,auktesnieji augalai nra vyks, taiau vis tiek reikia pripainti, kad magnolijnai yra paioje augal evoliucijos medio virnje ir, kas labiausiai stebina, tai bendra evoliucijos tendencija su toki pat padt tarp gyvn uimaniais induoliais: haplofaz yra labai redukuota (induoli iki minimumo vienos lytins lstels, augal iek tiek maiau); moterikasis gametofitas yra neatskiriama augalo dalis; gemalas susiformuoja motininiame organizme. Tarp gyvn tai bdinga tik induoliams, o augal ne tik magnolijnams, bet ir punams. Nereikia net rodinti, kad induoli ir magnolijn evoliucija tiesiogiai nesusijusi, nors abiems organizm grupms mintos naujovs leido sigalti emje. Evoliucijos logika. Paraleli tarp evoliucijos medio nesusiet organizm yra ne viena. Pvz., magnolijn ir pun megaspora (kaip nusako ir jos pavadinimas gr. megas didelis) yra stambi, kaip ir induoli moterikosios lytins lstels. Svarbiausia, kad is stambumas pasiekiamas lygiai tokiais paiais bdais: netolygiai asimetrikai pasidalija citoplazma tarp dukterini lsteli, kai vyksta mejoz; i keturi po mejozs susidariusi haploidini lsteli ilieka tik viena stambi, kitos trys lstels va, o j turin sunaudoja ilikusi lstel nuo to ji dar stambesn; paioje augal megasporoje, kaip ir induoli ovocituose, vyksta intensyvi mediag sintez, be to, ias lsteles intensyviai aprpina maisto mediagomis kaimynins motinos lstels. Tokias tiesiogiai nesusiet evoliucijos medio organizm raidos ir gyvenimo strategijos paraleles, sutapimus 2000 m. Mejeroviius (E. M. Meyerowitz) pavadino evoliucijos logika. Daniausiai augalai lyginami su gyvnais, o iekant bendr itak su vienalsiais grybais (mielmis ir kt.), dumbliais ar net bakterijomis. Reprodukcin raida vegetatyvins raidos tsa. Prisiminkime, kad sklini augal sporofitas ir gametofitas yra vieno augalo dalys, ir iki sklapradio, spor ir gamet susidarymo yra itisa grandin vyki, tarp kuri svarbiausias yra vegetatyvinio augimo perjimas reprodukcin magnolijn: iedyno ir iedo organ susidarym. Mikrospor ir megaspor susidarymas yra tiesiogin iedo lytini organ raidos tsa. Mutacijos arba fiziologiniai poveikiai, kurie stelbia i organ raid, stabdo spor ir gametofit susida80 |
rym. Tuo nesunku sitikinti i sklapradio raidos. Jis isivysto moterikame lytiniame organe piestelje, toje jos dalyje, kuri vadinama mezgine, ant placentos. Piestels susidaro i vieno ar daugiau tarpusavyje suaugusi vaislapli. Suaugimo vietose yra ikilos briaunos arba skiauters, nukreiptos mezgins vid. Tai yra placenta. Sklapradio raida. Ant placentos atsiranda spariai besidalijani lsteli grups. Jos sudaro kauburlius (2.4 pav.). Taip susidaro cilindrika, panai rankos pirt struktra sklapradio pradmuo ( 2.4 pav., B). Pagal sklapradio raid jis dalijamas 3 zonas (r. 2.4 pav., A ir C): distalin (labiausiai nutolusi nuo placentos): tai branduolo (nucelijaus), o jame megasporogenezs ir gemalinio maielio raidos vieta; centrin, i jos vystosi chalaza ir sklapradio apdangalai (integumentai); proksimalin, kuri labai itsta ir virsta sklasaiiu (funikulu). Susidaro dviej ryki poli distalin-proksimalin ais. Galutinai i ais labai ilinksta dl nesimetiko augimo kita kryptimi (2.4 pav., A ir C). Raidos genetikoje poliams ir aims skiriamas ypatingas dmesys. Aies kryptimi netolygiai pasiskirsto raid koduojani gen produktai, o tai nulemia tolesn lsteli diferenciacij, specializacij. Tenka tirti ne tik tai, kas sukuria organo ar jo audinio tapatyb (identitet), bet ir pai a. Svarbu taip pat isiaikinti, ar tapatybs gen produktai susidaro vietoje paioje lstelje, ar atgabenami i kaimynini lsteli ar net kit organ, k gametofito lstels pasigamina paios, o k gauna i sporofito motininio augalo. Sklapradyje iskiriamos bent dvi rykios ays. Pimj jau aptarme, tai distalinproksimalin ais. Antrosios pavadinimas dl sklapradio struktros ypatum kol kas galutinai nenusistovjs. onus sklapradio pradmuo (kaip pirtas ar boktas) yra radialins simetrijos. sivaizduokime, kad per tokio cilindro vidur eina ais (lot. axis), todl kryptys ios aies atvilgiu vadinamos abaksialia (ab) nuo aies ir adaksialia (ad) link aies. Abaksiali ir adaksiali gali reikti ir, atitinkamai, virutin/apatin, pvz., lapo pus, jeigu vl sivaizduojama per organo vidur einanti ais, pvz., lapo gysla. Apdangalai iauga i centrins skalpradio dalies chalazos, ir iorinio apdangalo pradia chalazoje yra pirmasis morfologinis enklas, kad yra sukurtas adaksialus-abaksialus polikumas ir kad radialin simetrij sklapradyje keiia dvipus (bilateralin) raida. Tipikas sklapradis (2.4 pav., B deinje) sudarytas i branduolo (nucelijaus), kuris uima didiausi sklapradio dal, vieno-dviej apdangal (integument). Su placenta sklaprad jungia sklasaitis (funikulus). Pro j sklaprad eina ind klelis. Jis pasiekia bazalin sklapradio dal, vadinam chalaza. Jos padtis yra labai svarbi atsirasti archesporio lstelei (megasporocitui) ir tolesnei gemalo maielio raidai. iedadulks dulkiadaigis prasiskverbia pro sklapradio mikropil, esani prieingame chalazai gale. Mikropilschalazos padtis sukuria a tolesnei gemalo maielio ir netgi gemalo raidai (2.5 pav.). Branduolas vliau sunyksta, o apdangalai virsta sklos luobele. Dl nevienodo skirting sklasaiio ir iorinio apdangalo lsteli augimo sklapradis gyja S raids form. Sklapradio raidos genetika. Sklapradis, kaip pats pavadinimas sako, yra pradmuo sklai, todl jo raidai skiriama labai daug dmesio, taiau sklapradio ir gametofito raida gerai itirta anatomikai, bet dar nepakankamai genetikai, nes j lemiantys genai pasireikia savitai tik tam tikrose lstelse ir labai trump laik, o paios lstels yra sunAUGAL GENETIKA
| 81
kiai prieinamoje vietoje. Netgi anatominiams vyki tyrimams teko pasiekoti tinkam objekt. Parankiausios, pasirodo, yra orchidjos. J apdulkinimas ir apvaisinimas primena pun (2.3 pav., B) irgi vyksta taip sultintai. Orchidj sklapradis pradeda vystytis tik tada, kai iedai apdulkinami, o pats apsivaisinimas nukeliamas tik po 11 savaii. Sklapradio specifini gen raika aptinkama anksiau, negu pradeda formuotis pats sklapradis 5,5 savaits nuo apdulkinimo.
Distalin nu ch f
ays
Promiksalin
Gemalo maielis
Chalaza
B
2 mej. d. va ia mml br 1 mej. d. f .l. Mikropil Kiauialst
Netolygus lsteli dalijimasis
Augimo reguliavimas
2.4 pav. Sklapradio ir gemalo maielio raida:

A raidos ays; B kairje ,,boktelis, deinje - subrends sklapradis; C scheminis sklapradio ir gemalo maielio raidos pavaizdavimas nuo ,, boktelio iki sklapradio su subrendusiu gemalo maieliu atkreipkite dmes netolyg chalazos/apdangal lsteli dalijimsi ir mikropil-chalaza aies padties pasikeitim; D gen, kurie valdo sklapradio augim, raikos vieta; nu nucelijus (branduolas); ch chalaza; f funikulas (sklasait); ia iorinis apdangalas; br branduolas; mml motinin megasporos lstel; ia iorinis apdangalas; va vidinis apdangalas; 1 mej. d. pirmasis mejozs dalijimasis; 2 mej. d. antrasis mejozs dalijimasis; . l. uv lstels; mi mikropil; (pagal D. J. Skinner et al. Plant Cell. 2004, Vol. 16, Sup. 3245; L. Reiser, R. L. Fischer. Plant Cell. 1993, Vol. 5, P. 12911301).
82 |
SKLAPRADIS
CHALAZA
Diferenciacija
branduolas
MIKROPIL
Archesporio lstel (megasporocitas) Mejoz asimetrika Keturios haploidins lstels megaspora va va va

Mitoz be citokinezs (3 kartus)
Daugiabranduolis gemalo maielis (8 haploidiniai branduoliai) Branduoli migracija/galutin j padtis: Trys branduoliai Du branduoliai Trys branduoliai Citokinez (dalin) Antrinis subrends gemalo maielis Sinergid (n) Kiauialst (n) Centrin lstel diploidin!! 2n Sinergid (n)
3 antipods (n)
Spermiai (n) susiliejimas Dvigubas apvaisinimas
2.5 pav. Megasporos ir moterikojo gametofito raida. Chalazos/mikropils ais: rodyklmis ir rmeliais parodyta vykio vieta ir ribos.
Pagal gen raikos pobd skiriamos kelios gen grups: lemiantys paties sklapradio ir jo dali tapatyb; lemiantys bendr konkreios struktros vaizd (angl. pattern genai); jau mintas ais ir polikum link ai; spart ir netolyg lsteli dalijimsi (kaip jau mint iorinio apdangalo ir sklasaiio); reguliuojani kit gen jungimo/ijungimo viet ir laik;
AUGAL GENETIKA
| 83
pagaliau, perjungiani sporofito raid gametofito raid.

Gen, kurie vienaip ar kitaip veikia sklapradio raid, atrasta jau daug ir atrandami vis nauji genai. Kaip minta, sklapradis vystosi i lstels, vadinamos sklapradio pradmeniu. i lstel labai spariai dalijasi ir tai nulemia ANT (AINTEGUMENTA) genas. Jis priklauso AP2 transkripcijos veiksni eimai ir kontroliuoja lsteli dalijimsi ir augim, todl jo pagrindiniu sklapradio genu vadinti negalima. is genas specifikai reikiasi augalo raidoje daug kart meristeminse, spariai besidalijaniose lstelse. Jo raika nustatyta ir iedo organ lstelse, todl perteklini (angl. gain-of-function) mutant yra stambesns visos augalo dalys, pradedant vairenio lapais bei iedais ir baigiant sklomis ir jose esaniu gemalu. Tai paskatino sukonstruoti tok ANT gen, kurio raika sklapradio lstelse labai sustiprjusi. Ir syk, kaip paprastai, pasinaudota iedinio kopsto mozaikos viruso labai stipriu promotoriumi, ymimu 35S. Kaip ir tiktasi, 35S::ANT padidjo visi augalo organai, o sklapradyje branduolas ir sklasaitis, vliau vaisiai ir sklos (2.6 pav.,C). iose buvo stambesnis gemalas. Manoma, kad surastas bdas padidinti augal produktyvum. Taiau viskam yra ribos. Dar labiau sustiprinus ANT geno raik (35SS::ANT), augalai tapo moterikai sterils. Dl nenormaliai suvejusi branduolo ir chalazos lsteli nesusidar gemalo maielis. Panaudojus kDNR i petunijos (Petunia hybrida Vilm.) piesteli, pavyko aptikti du genus fbp7 ir fbp11 (floral binding protein 7 ir 11). ie genai savitai pasireikia vaislapyno centre, kur formuojasi kauburliai, o vliau sklapradyje. Kai fbp11 genas transgeninje petunijoje, perkeltas gen ininerijos metodais pasireik ektopikai ne toje vietoje, kur jam normaliai priklausyt pasireikti, sklapradiai atsirado ant virutins taurlapi ir apatins vainiklapi dalies (2.6 pav., B). Petunijos fbp7 ir fbp11 gen ortologai (tapats genai), taip pat aptikti vairenio ir kit augal, tarp j puies, atstovaujanios punus, genome. Vairenio toks genas vadinamas SEEDSTICK (STK). Dar neseniai jis vadintas AGL11 (AGAMOUS-LIKE11). is vairenio genas yra netgi geriau itirtas negu petunijos fbp7 ar fbp11 genai. STK genas pripastamas kaip pagrindinis (angl. master) sklapradio genas, kurio raika inicijuoja sklapradio raid ir reguliuoja jos eig. Jis koduoja transkripcijos veiksn, kuris priklauso MADS eimai pagal baltymo domen, kuriuo is sveikauja su savitomis valdom gen sekomis. Pagal organo, kurio tapatyb lemia STK genas, jis priskiriamas vadinamajai. D grupei (r. 5.7 sk.). Pun genome yra genas DAL2, kuris yra STK geno ortologas. Vairenio aptikta daug kit gen mutacij, keiiani sklapradio arba jo dali raid. vykus mutacijai bell1 (bel1), stebimas lyg ir raidos grimas atgal. Vietoje sklapradi atsiranda vaislaplius panai struktr. Nustatyta, kad BELL1 genas reikiasi sklapradio pradmens lstelje. Mutant aintegumenta (ant) ir short integument (sin1) slopinama sklapradio apdangal (integument) ir gametofito raida. Mintas BELL1 genas svarbus sklapradio apdangal tapatybei ir bazalinei/proksimalinei aiai. BELL1 genas yra dar vienos transkripcijos veiksni eimos, sveikaujanios su DNR vadinamuoju homeodomenu, atstovas. Polius sukuria YABBY eimos genai. Jiems bdinga abaksialin raika. Jie koduoja transkripcijos veiksnius, kurie turi du domenus, kuriais jie sveikauja su makromolekulmis: cinko pirteli motyv ir pana HMG (nuo angl. high mobility group-like). Pastarja dalimi ie baltymai jungiasi su DNR. Sklapradyje veikia keletas ios transkripcijos veiksni eimos gen, i kuri geriausiai itirtas genas INNER NO OUTER (INO). Dl io geno mutacijos ino nesivysto iorinis apdangalas, ir sutrinka ab-ad ais.
84 |
WT
AtGEX1::eGFP
AtGEX2::eGFP
AtVEX1::eGFP
35S::ANT
WT
nzz-2
2.6 pav. Transgenini augal panaudojimas sklapradio ir gametofit gen raikai tirti:
A aliosios iedadulks. Prie iedadulkms savit promotori AtGEX1, AtGEX2, AtVEX1 prijungta geno reporterio GFP dalis, koduojanti aliai florescuojant baltym,. Viruje gen raikos skirtumai, apaioje akivaizdu, kad spermiai sujungti vien vienet vegetatyvins lstels citoplazmos uodegomis (pagal M. L. Engel et al. Plant Physiology. 2005, Vol. 138, P. 21242133); B petunijos transgeno 35S::FBP11 ektopin (ne vietoje) raika ant iedo taurlapi; SR - sklapradis (pagal L. Colombo et al. Plant Cell. 1995, Vol. 7, P. 18591868); C vairenio AINTEGUMENTA (ANT) geno perteklin mutacija, gauta prie 35S CaMV promotoriaus prijungus ANT geno koduojanij dal ied ir sklapradi palyginimas. Kairje WT, deinje 35S::ANT (pagal Y. Mizukami, R. L. Fischer. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2000, Vol. 97, P. 942947); D vairenio normalaus (WT) ir nozzle2 (nzz2) mutanto ied ir sklapradi palyginimas: nu nucelijus (branduolas); ia iorinis apdangalas; va vidinis apdangalas; ch chalaza; fu- funikulas; dg distalinis galas (pagal P. Sieber et al. Plant Physiology. 2004, Vol. 135, P. 21722185).
Bazalinei-proksimalinei aiai susikurti sklapradyje yra svarbus ir dar vienas, iuo metu labai intensyviai tiriamas genas dvigubu pavadinimu NOZZLE (NZZ, angl. snapas)/SPOROCYTELESS (SPL; 2.6 pav., D ). Pats dvigubas pavadinimas rodo, kad jis svarbus ir sklapradio, ir iedadulks raidai. Jo koduojamas baltymas yra MADS transkripcijos veiksnys. Jis yra abiej tip sporogenezs pradininkas, reguliuoja kit transkripcijos veiksni INO ir ANT genus. Mutant nzz/spl nesusidaro megasporocitas.
AUGAL GENETIKA
| 85
2.3.2. Moterikasis gametofitas. Pozicin determinacija Megasporogenezs tipai. Haploidin megaspora ir megagametofitas, kitaip gemalo maielis, isivysto sklapradyje. Magnolijn megaspor susidarymas megasporogenez vyksta vairiai (2.7 pav.). Skiriami 3 pagrindiniai jos tipai: monosporin, bisporin ir tetrasporin.
MEGASPOROGENEZ MEGAGAMETOGENEZ
Mitoz 1 Mitoz 2 Mitoz 3 Gemalo maielis
A
Monosporin (Polygonum)
MML
Mejoz 1
Mejoz Megaspora 2
Bisporin (Alisma)
Tetrasporin (Drusa)
C
A trys pagrindiniai tipai: monosporinis (daniausiai pasitaikantis), bisporinis ir tetrasporinis (pavadinimai nuo padties po mejozs); B 1 Acalypha indica gemalo maielis su 16 branduoli; 8 i j laisvi centre ir po dvi lsteles periferijoje; B 2 Plumbagella nra sinergidi, antipods lstel triploidin, o centrin lstel yra tetraploidin; c Torenia fournieri (Scrophulariaceae): a iedas; b - ilinds gemalo maielis (parodytas rodykle) puikus gametofit sveikos tyrimo objektas (pagal: A R. Yadegari, G. N. Drews. Plant Cell. 2004, Vol. 16, Supl. 133141; B V. Brukhin et al. Current Science. 2005, Vol. 89, P. 18441852; C T. Higashiyama et al. Plant Physiology. 2006, Vol. 142, P. 481491).
2.7 pav. Gemalo maieli raidos vairov:
iuos tipus nulemia tai, kaip mejozje pasidalina lstels. Daniausia yra monosporin megasporogenez, kai po kiekvieno branduolio pasidalijimo mejozs metu vyksta ir citokinez, susidaro lstels apvalkallis. Daugumai augal bdingas Polygonum (rgties) tipas. Jis pasireikia daugiau nei 70 % iedini augal, tarp j ir vaireniui, Poaceae, Fabaceae, Solanaceae eim augalams. Po mejozs susidaro 4 lstels, i kuri 3 va. Lieka viena megaspora, o subrends gemalo maielis yra i 7 haploidini lsteli. Kai yra bisporin megasporogenez, mejozje branduoliai dalijasi du kartus, kaip tai prasta tipikai mejozei, bet citokinez vyksta tik vien kart, todl susidaro dvi dvibranduols sporos, i kuri viena va. Tetrasporinei megasporogenezei bdinga, kad branduoliai dalijasi mejozs bdu, bet citokinez nevyksta ir susidaro viena megaspora su keturiais haploidiniais branduoliais. Tad po antrojo mejozs dalijimosi visais atvejais susidaro po vien megaspor, tik su vienu, dviem arba keturiais haploidiniais branduoliais. Megasporos raida (Polygonum tipas) (2.7 pav. ir r. 2.2 pav.). Viena i branduolo lsteli, esani arti chalazos, virsta archesporio lstele (megasporocitu). Ji stambesn,
86 |
itsusi viena kryptimi nuo chalazinio galo link mikropils. i lstel dalijasi mejozs bdu, bet citoplazma tarp dukterini lsteli paskirstoma netolygiai (asimetrikai). Ta lstel, kuri ariau chalazinio galo, gauna daug citoplazmos,o kita maai. Antroji lstel smulki. Antr kart dalijantis kartojasi vl tas pat: viena lstel tampa dar stambesne, o kita lieka smulki. Kaip minta, visos trys smulkiosios lstels sunyksta, o stambioji ir yra megaspora. Joje per pus sumajs chromosom skaiius (n). Tai labai panau induoli moterikosios lytins lstels raid. induoli po mejozs irgi ilieka tik viena i keturi stambi lstel, o kitos trys smulkiosios (poliniai kneliai) va. Du veiksniai nulemia megasporos stambum: asimetrinis (netolygus) citoplazmos paskirstymas dukterinms lstelms; lstels padtis arti chalazos. chalaz eina ind klelis, todl arti jo esanti lstel gerai aprpinama maisto mediagomis. Be to, ind kleliu atkeliauja hormonai, kurie padeda sukurti polikum a mikropil-chalaza. i ais kartu pamus su asimetriniu lsteli turinio ir netolygiu transkripcijos veiksni padalijimu nulemia sporos ir netgi gemalo raid (2.5 pav.). Moterikojo gametofito raida bent i dalies nulemiama ios mikropil-chalaza aies, ir dl kaimynini sporofito audini veiklos gemalo maielio raida poliarizuojama. alia mikropils susiformuoja kiauialst, sinergids ir vakuol, o chalaziniame gale antipods. Sporos ir gametofito raida pastebimai priklauso nuo sporofito (motinos), taiau motinos genai, kurie nulemia gametofito raid, kol kas menkai itirti. Labai akivaizdiai pasireikia pozicin determinacija. Determinacija yra procesas, kurio metu nediferencijuotos (arba ne iki galo determinuotos/diferencijuotos) lstels arba branduoliai gyja program diferencijuotis konkreius organus, audinius, lsteles. Kai determinacija priklauso nuo lsteli ar branduoli padties tai vadinama pozicine determinacija. Rykesn gyvn raidos pozicin determinacija, taiau ir augal ji gana akivaizdi: tam tikra vieta sklapradio raidai; megaspora yra tik ta lstel i keturi haploidini lsteli, kuri arti chalazinio galo; tolimesn gemalo maielio raida, ypa tikslinga haploidini branduoli migracija daugiabranduoliame gametofite. Sporocito ir gemalo maielio polikumas. Pozicin determinacija. Gal ir morfogenai? Polikumas, kur nulemia ais mikropil-chalaza pasireikia dar megasporocite. Jame netolygiai pasiskirsto lstelje esantys organoidai. Plastids, mitochondrijos ir kiti organoidai kaupiasi chalaziniame sporocito gale. Taip jie ir paveldimi po pirmojo ir antrojo mejozs dalijimsi. Ne tik citoplazmos, bet ir lstels organoid netolygus pasiskirstymas lemia, kuriai lstelei tapti megaspora. Branduoli migracija gemalo maielyje. Kai yra Polygonum tipas, haploidinis megasporos (pirminio gemalo maielio) branduolys dalijasi 3 kartus mitozs bdu, ir po 4 branduolius atsiduria prieinguose gemalo maielio poliuose. Kiekvien branduol supa mikrovamzdeli debeslis. Jis ir prie mikrovamzdeli prisitvirtin motoriniai (gebantys
| 87
AUGAL GENETIKA
susitraukinti) baltymai, matyt, ir lemia branduoli migracij pradioje polius, vliau i kiekvieno poliaus po branduol, taip ir vadinamus poliniais gemalo maielio centr.
Kokia tvarka vyksta branduoli migracija polius, priklauso nuo augal ries. Pagal vien versij, jau po pirmojo mitozinio dalijimosi dukteriniai branduoliai keliauja polius, o smulkiosios vakuols susilieja stambi centrin vakuol. Manoma, kad jos padtis svarbi nustatyti branduoli padt po kit mitozs dalijimsi. Vairenio gemalo maielyje branduoli migracija vyksta iek tiek kitaip. Pirm kart pasidalij haploidiniai branduoliai lieka centre. Jie dalijasi ir polius keliauja po du branduolius. Ten jie dar kart dalijasi. Paskui poliuose yra po 4-is branduolius, i kuri po vien, polin branduol, migruoja lstels centr. Kukurz spjamu mitozinio branduoli dalijimosi reguliatoriumi gemalo maielyje yra genas Indeterminate gametophyte 1 (Ig1). Mutant ig1 gemalo maieliuose sutrik branduoli dalijimasis ir migracija. Mikropils gale ir gemalo maielio centre daugja branduoli, dl ko danai stebima poliembrionija. Be to, paprastai branduoli dalijimasis chalaziniame ir mikropls galuose ir polini branduoli migracija yra suderinti procesai. Mutanto ig1 gemalo maielyje centr migruoja tik vienas polinis branduolys i chalazinio gemalo maielio poliaus. is branduolys dalijasi dar du kartus, ir centre atsiranda ne du, o keturi haploidiniai branduoliai. Chalaziniame ir mikropils galuose irgi vyksta papildomas (ketvirtasis) mitozs dalijimasis.
Vienokiu ar kitokiu bdu susidaro daugiabranduolis megagametofitas, ir tada vienu metu apie uprogramuotai isidsiusius branduolius vyksta citokinez. Tik vienas skirtumas. Gemalo maielio lsteles skiria apvalkallis. Augalams bdinga lstels sienel nesusidaro. Tolesn i lsteli likim, kaip ir branduoliuose esani gen raik, nulemia j padtis (pozicija) gemalo maielyje. Vl tenka lyginti su gyvnais, tik syk ne su induoliais, o su drozofila, be to, su apvaisintos moterikosios lytins lstels (vadinasi, diploidins) raida. Drozofilos zigotoje panaiai kaip augal gemalo maielyje i pradi susidaro daugiabranduol lstel. Branduoliai kaupiasi lstels centre, paskui migruoja periferij. Ten beveik vienu metu vyksta citokinez, ir tolesn susidariusi lsteli likim nulemia vieta citoplazmoje, kuri pakliva branduoliai. Drozofilos dar ovocito citoplazma jau yra erdvikai determinuota, ir j pakliuv branduoliai gyja skirting raidos program. Reikiasi skirtingi branduolio genai. Drozofilai ir kitiems gyvnams nustatyta, kad toki erdvin determinacij lemia specials baltymai, dar XIX a. pradioje pavadinti morfogenais. Morfogenai tai baltymai/transkripcijos veiksniai, kurie lemia organizmo organ, audini raid netolygiai pasiskirstydami lstels viduje arba tarp lsteli. gyvn generatyvines lsteles dalis morfogen atkeliauja i motinos lsteli, todl juos lemiantys genai vadinami motininiais. Ar augalai turi morfogenus, kol kas yra atviras klausimas. Motinos (sporofito) gen reikm megagametofito raidai nekelia abejoni. Aptikti ir transkripcijos veiksniai, kurie gali bti perneami i vien lsteli kitas. Patys branduoliai irgi migruoja pagal i anksto uprogramuot plan. Polikumas, kur nulemia mikropil-chalaza ais, pasireikia ne tik gemalo maielyje, bet ir paioje kiauialstje bei ankstyvosiose gemalo raidos stadijose. Mikropils gale kiauialstje yra vakuol, o branduolys, dauguma organoid yra chalaziniame gale. is polikumas ilieka ir zigotoje, todl po pirmojo zigotos dalijimosi zigotos turinys vl netolygiai paskirstomas tarp dviej lsteli. Moterikojo gametofito/gemalo maielio polimorfizmas. Netgi tarp Polygonum tipo augal yra gana didel gemalo maielio sandaros ir tolesns raidos vairov. Pvz., poliniai branduoliai gali susilieti dar prie apvaisinim arba tik po to, kai centrin lstel
88 |
paklina spermio barnduolys. Labai dani skirtumai pagal antipodes. Augal vairov daniausiai pasireikia pagal branduoli skaii arba chromosom sandar chalaziniame gemalo maielio gale. Kukurz chalaziniame gale branduoliai dalijasi daug kart, ir j skaiius siekia iki poros tkstani. Kviei genom skaiius padidja kitokiu bdu: susidaro politenins chromosomos. Jose DNR padvigubjusi imtus ar net tkstanius kart, o DNR kopijos po kiekvieno DNR sintezs vykio neisiskiria. Lieka paraleliai isidst toje paioje chromosomoje. Dl ios prieasties politenin chromosoma yra labai stambi. Australijoje tarp Fabaceae eimos augal aptiktos gentys (Burtonia, Indigofera ir kt.), kuri gemalo maielyje yra trys, bet itin stambios antipods. J branduoliai irgi labai stambs. Endosperme ir sklaskiltse intensyviai kaupiamos maisto mediagos bsimam daigui. Btinas didelis gen aktyvumas, ir geriausias bdas padidinti j skaii yra poliploidija arba politenija. Be to, toki lsteli, kurios vliau va, nepalikdamos savo dukterini lsteli susiformavusioje skloje. Vadinasi, skloje ie pokyiai nepaveldimi. Endospermas iam tikslui netinka, nes jame esantys genai apskritai reguliuoja sklos raid. Gemalo maielio lsteli tolesnis likimas labai nevienodas. I apvaisintos kiauialsts vystosi sklos gemalas, o i triploidins centrins lstels endospermas, kuris gali sunykti, ir tada maisto mediagos perneamos sklaskiltes. Pagal sinergidi ir antipodi likim vl pasireikia augal polimorfizmas. Pirmiausia, kai kuri augal (ypa citrusini) jos gali bti apvaisintos, ir i j vystosi gemalas. Tokiems augalams bdinga poliembrionija (keli gemalai vienoje skloje). Sinergids yra labai svarbios. Jos sudaro silo pavidalo struktr (filiform), kurioje specifikai orientuotai isidsto mikrovamzdeliai. Tokiu bdu sukuriamas polikumas gemalo maielio viduje ir reguliuojamas metabolit srautas i branduolo (sporofito) lsteli gemalo maiel ir paties gemalo maielio viduje. Dar viena sinergidi funkcija irykja apvaisinimo metu. iedadulks dulkiadaigis pirmiausia praardo vienos i sinergidi apvalkall ir jos vid suleidia vis iedadulks turin. Tik paskui spermiai susilieja su kiauialste ir centrine gemalo maielio lstele. Sinergids va. Pirmoji va toji sinergid, kuri siterpia iedadulks dulkiadaigis. Kai kuriose augal ryse sinergids va dar iki patenkant dulkiadaigiui gemalo maiel, ir tai enklina megagametofito raidos pabaig. Daugelio augal antipods irgi yra pasmerktos programuotai numatytai iai. Kai kuri augal tai vyksta labai anksti. Pvz., Passiflora edulis Sim. subrends gemalo maielis apvaisinimo metu yra tik i keturi lsteli. Antipods jau sunykusios. Gemalo maielio genai ir j mutacijos. Per pastaruosius kelerius metus aptikta apie 200 gen mutacij, kurios turi takos gemalo maielio (gametofito) raidai. Btina inoti vien gametofito gen pasireikimo ypatyb. Gametofito branduoliai yra haploidiniai, todl visi genai yra hemizigotins bkls, t. y. pasireikia fenotipe, nepriklausomai nuo to, ar genas dominuojantysis ar recesyvusis, todl lengvai eliminuojasi visi letals (mirtini) arba gemalo maielio gyvybingum mainantys genai. Tai savotikas sietas atmesti, eliminuoti nenaudingus augalui genus, taiau kelia papildom problem genetikams, kurie tiria gametofito raid. i gen mutacijas aptikti palengvina tai, kad dauguma gametofito mutant yra moterikai sterils. Tokie mutantai dauginami heterozigotins bkls. Moterikai sterilaus mutanto sporofitai yra klonuojami ir tiriamos sterilumo prieastys.
AUGAL GENETIKA
| 89
Visi inomi mutantai grupuojami 7-ias grupes pagal pasireikimo laik ir pobd ir pasireikia kaip vairi proces defektai: centrins vakuols susidarymo, branduoli dalijimosi ir migracijos, polini branduoli susiliejimo, numatytos lsteli ties, apsivaisinimo ir raidos gemal ar endosperm. Vairenio mutant fem1-4 yra sutriks mitozinis haploidini branduoli dalijimasis. Mutanto fem2 gemalo maielyje branduolys visikai nesidalija. Taip ir lieka vienabranduolis gemalo maielis. Jis yra pasmerktas, ir pasireikia moterikasis sterilumas. GFA1-7 (GAMETOPHYTIC FACTOR 17) genai irgi vairiai veikia gametofito raid. Mutanto gfa2 nesusilieja poliniai branduoliai. GFA2 yra mitochondrij genas. Jis koduoja aperon, kuris pasireikia mitochondrijos matrikse ir btinas sinergidi numatytai iai. Antipodse veikia kiti numatytos ties genai. GFA2 genas veikia tik sinergidse.
Apvaisinimo/dulkiadaigio atrakcijos genai. Dulkiadaigio augimas vyksta kryptingai, alia sklasaiio link mikropils. Tai daugiapakopis procesas, reguliuojamas ne vieno geno, ir dulkiadaigio augimas yra subtiliai suderintas su megagametofito raida. vykus anksti pasireikianioms (priskiriamoms 13 grupei) moterikojo gametofito mutacijoms, iedadulks dulkiadaigis nustoja augti. Megagametofite maa (magatama) genas pasireikia vliau. Tai pastebima ir pagal dulkiadaigio augim. Jis auga normaliai, lygiagreiai sklasaiiui (funikului), tik neprasiskverbia pro mikropil. Vl pasireikia moterikasis sterilumas, nes tai megagametofito mutacija prisivilioti dygstani iedadulk, t. y. reguliuoti apvaisinim. Taip pat btini SIRENE (SRN), FERONIA (FER) (tai rodo ir pavadinimai) gen produktai. Vilionms svarbios sinergids, nes ie genai ir GFA2 reguliuoja ir sinergidi raid bei funkcij. Dygstanios iedadulks krypt megagametofite reguliuoja ir Ca2+ jonai, bet ne visuose augaluose jie vienodai svarbs. 2.3.3. iedadulk vyrikasis gametofitas Subrendusi iedadulk pagal sandar ir funkcij yra maas, iki trij lsteli redukuotas, bet tikras atskiras organizmas. Jos raida vyksta dulkins dulkializdyje, kuris i vidaus iklotas tapeto ir kur laik upildytas matrikso. Skiriamos dvi raidos fazs mikrosporogenez ir mikrogametogenez (2.2 pav.). Mikrosporos raida prasideda i archesporio lstels, i kurios netiesiogiai isivysto diploidin iedadulks motinin lstel (kitaip mikrosporocitas). Vairenio dulkializdyje toki lsteli yra apie 30. Po mejozs susidaro keturi lygiaveri haploidini mikrospor darinys tetrada. Vairenio po pirmojo mejozs dalijimosi citokinez nevyksta. Lstel kur laik turi 4-is haploidinius branduolius, tik paskui pasidalija citoplazma. Mutanto tes/std (tetraspore/stud) keturi haploidiniai branduoliai taip ir lieka vienoje citoplazmoje. Citokinez nevyksta todl, kad TES/STD genas koduoja motorin baltym kinezin. Jis reikalingas paskirstyti mikrovamzdelius. Panaiai kaip apie gemalo maielio branduolius, normaliai apie kiekvien tetrados branduol yra mikrovamzdeli debeslis. TES/STD genas reikiasi dar prie mejoz. Vadinasi, mejoz kontroliuojama sporofito. Kaip ir megagametofitui, taip mikrogametofitui mejozs pradia reikia, kad sporofito raida perjungiama gametofito raid. Labai svarbu nustatyti perjungim atliekanius genus. Deja, iki iol tai galutinai nepadaryta, nors aptikti iedadulks raidos genus yra lengviau negu moterikojo gametofito. iedadulki raidos gen mutacijos pasireikia vyrikuoju sterilumu, kur lengviau pastebti. Kai kurie genai vienodai svarbs abiej tip gametofitams. Toks yra jau mintas genas SPOROCYTELESS (SPL)/NOZZLE), kuris koduoja MADS klass transkripcijos veiksn (r. 2.6 pav., D). Jis vienodai reikalingas pradti vyrikj ir moterikj sporoge90 |
nez. Mutanto msca1 (male sterile converted anther 1) susidaro archesporio lstels, bet jos nesidiferencijuoja toliau pirmines sporogenines lsteles. Dar du genai tiesiogiai perjungia sporofito raid gametofito raid. Tai SWITCH/DYAD ir AMEIOTIC1. Mutanto switch/dyad isivysto mikrosporocitai, bet nevyksta mejoz ir nesusidaro haploidins sporos, o mutanto ameiotic1 mejoz apskritai pakeiiama mitoze. Mikrosporocitus supa apvalkallis, daugiausia sudarytas i kalozs (-1,3-glukano), kur koduoja specifinis tik iedadulkms kalozs genas CAL S5. io geno mutantai cal s5 yra vyrikai sterils. Kalozs funkcija iedadulkje daugiaplan. Ji yra lyg filtras, skiriantis sporogenines lsteles nuo kit sporofito lsteli. Kaloz sudaro kamius dygstaniame dulkiadaigyje. Pagaliau kaloz tetradoje jungia mikrosporas, kad jos isiskirt, kaloz turi bti suskaidoma. Taiau mikrosporos gali likti neisiskyr tetradoje, kai vyksta mutacija qrt (quartet). Ilieka nesuskaidyta kita mikrosporas jungianti mediaga pektinas, kalozs sintez iuose mutantuose yra normali. Kas vieniems augalams mutacija, kitiems augalams yra normali bsena. Vikrini (Juncaceae), erikini (Ericaceae) ir nakviini (Oenotheraceae) eim augal iedadulks taip ir ilieka neisiskyr, tetradomis, o orchidj sudaro dar sudtingesnius agregatus polinijas. iedadulks apvalkallis tai unikalus tik augalams bdingas darinys, sudarytas i ne maiau unikalaus, vien tik augal iedadulkms bdingos mediagos sporopolenino. Jis yra polimeras, fenilpropanoid ir riebal rgi darinys, bet jo tiksli sudtis iki iol neinoma. Sporopolenino unikalumas yra tas, kad jis atsparus dljimui cheminiam, fiziniam, biologiniam poveikiui. Jo neveikia bakterijos ir grybai, todl iedadulks gerai isilaiko ikasenose ar eer nuosdose ir yra didelis diaugsmas paleobotanikams, nes kiekvieno augalo iedadulks turi savit ivaizd, pagal kuri galima nustatyti augalo gent ar net r(r. 2.12 pav., B) . Konkretaus augalo iedadulkei bding ivaizd suteikia iorinis sluoksnis egzina, kuri daugiausia ir yra sudaryta i sporopolenino. Vidiniame sluoksnyje intinoje kaupiamos iedadulkei reikalingos biologikai aktyvios mediagos baltymai, lipidai, flavonoidai, karotinoidai ir kt. Minti antioksidantai apsaugo dygstani iedadulk nuo genotoksini veiksni, tarp j sauls ultravioletini spinduli. Apvalkallio paskirtis ne tik apsaugin. vairios egzinos iaugos, sparneliai ir kt. padeda iedadulkms iplisti. Apvalkallio raida yra subtilios sveikos tarp sporofito ir gametofito pavyzdys. Apvalkallio sintez inicijuojama gametofito, bet daugiausia tai dulkins kiliminio audinio tapeto produktas. ia gaminasi sporopolenino granuls (dar vadinamos Ubio grdeliais). Ne visi augalai turi ias granules, pvz., j neturi Brasicaceae . augalai, tarp j vairenis. Egzinos pirmtakas yra primaksinas, lipnus sluoksnis, kuris supa mikrosporos plazmin membran. Genas DEX1 koduoja baltym, kuris reguliuoja primaksino, o vliau ir sporopolenino erdvin isidstym. is baltymas jungia Ca2+ jonus ir taip pat yra labai svarbus dygstaniai iedadulkei. Mutant dex1 (defective exine formation1) sporopoleninas isidsto netvarkingai ir iedadulks degraduoja. Tarp ios grups mutant bene domiausias yra nef1 (no exine formation1). Sporopoleninas yra sintetinamas, bet gabenamas ne viet, o dulkializdio lsteli sieneles. NEF1 genas, kaip ir keleto kit iedadulks sienels mutant ms2 (male sterility2), flp1 (faceless pollen visikai nesusidaro egzina) normals aleliai susij su lipid apykaita. Vis j mutantai yra visikai sterils. Be to, mutant ms2 ir flp1 egzina tampa jautri acetolizei (acto rgties poveikiui), kuri normalios iedadulks nereaguoja.
AUGAL GENETIKA
| 91
Tapetas yra tiek pat svarbus iedadulks raidai, kiek sklapradio audiniai megagametofitui. Kai dl mutacij (tpd1, exs/ems1) neisivysto tapetas, irgi pasireikia vyrikasis sterilumas, nes mikrosporocitai, kuriuose normaliai turt vykti I mejozs dalijimasis, degeneruoja. Tapeto lstels labai aktyvios, todl jose vyksta endoreduplikacija. Danai susidaro dvi- arba daugiabranduols lstels. Mikrosporai brstant tapeto lstels pasmerktos programuotai iai. Dulkializdyje atsiranda ertm, o degeneruojanio tapeto likuiai panaudojami susidaryti papildomiems iedadulki apvalkallio sluoksniams. iedadulks egzina nra itisin. Joje yra poros, arba kitaip diegaviets, nes pro vien i j ilenda dygstanios iedadulks dulkiadaigis. Por raida yra sudtinga ir kontroliuojama sporofito. vairi augal jos skiriasi skaiiumi, forma ir dydiu. Vidutinikai jos 0,008 m dydio ir daniausiai iedadulk turi 34 poras, taiau yra augal, kuri iedadulkse por yra kelios deimtys ar net vir 100. iedadulks, kurios turi daugiau por, dygsta greiiau. Pro jas palaikomi ryiai su sporofitu, siurbiamas vanduo ir maisto mediagos, vyksta sudtingi iedadulk-purka atpainimo (S-nesuderinamumo) reikiniai (r. 2.4.2 sk.) ir pagaliau jomis prisitvirtinama prie purkos. Vyrikojo gametofito raida. Mikrosporoje vyksta du mitozs dalijimaisi. Pirmasis j asimetrinis (2.2 pav.). Citoplazma tarp dukterini lsteli paskirstoma netolygiai. Stambesnioji lstel yra vegetatyvin. Kartais ji vadinama dulkiadaigio lstele, nes btent ji virsta dulkiadaigiu. Smulkesnioji lstel yra generatyvin. I jos po antrojo mitozs dalijimosi susidaro du spermiai. Taiau ir iuo atvilgiu augalai yra vairs. Daugumos magnolijn iedadulkje, kuri atsiskiria nuo motininio augalo, yra tik dvi haploidins lstels. i augal antroji mitoz vyksta jau dygstanioje iedadulkje. Taiau yra ir daug augal, kuri atsiskirianioje nuo motininio augalo iedadulkje jau yra po tris lsteles (tarp j kukurzo ir vairenio). Du spermiai btini dvigubam apvaisinimui: vienas susilieja su gemalo maielio kiauialste, o kitas su centrine lstele. Abu mitozs dalijimaisi ir lsteli diferenciacija gali sutrikti dl mutacij. Pvz., mutanto gemini pollen abi lstels yra virt vegetatyvinmis, nes j branduoliuose yra nekondensuotas chromatinas. Vegetatyvins ir generatyvins lstels branduoliai stebtinai skiriasi chromatino sandara. Aptiktas netgi specifinis iedadulkms histonas H3. Kodl taip staigiai atsiranda chromatino sandaros skirtumai i karto po pirmosios mitozs, dar teks iaikinti. Pats genas GEMINI POLLEN koduoja baltym, kuris jungiasi su mikrovamzdeliais. Nuo j priklauso ir branduoli/spermi migracija mikrogametofite (r. toliau). Kit dviej nealelini mutant duo1,2 (duo pollen 1,2) sutriks antrasis mitozs dalijimasis ir vietoje dviej yra tik viena generatyvin diploidin lstel. Vadinasi, DNR sintez vyksta normaliai, tik neisiskiria dukterins chromosomos. Dar keistesnis yra vairenio mutantas sidecar pollen (angl. sidecar motociklo, mainos priekaba). Susidaro papildoma lstel, siterpusi egzin. Tai fenotipikai nestabilus mutantas, ir danai iedadulkje po pirmojo mejozs dalijimosi abi dukterins lstels yra lygiaverts, taiau keisiausia, kad viena j dalijasi ir isivysto du spermius. Augalai visais atvilgiais vairs. Polimorfizmas pagal mikrogametofito raid pasireikia keliais bdais: pagal pirmosios mitozs pobd (lelij yra stambesn generatyvin lstel), spermi raidos pabaig (antrj mitoz) ir tolesnius vykius. Skiriami bent 5 vyri-
92 |
kojo gametofito raidos tipai, taiau nepriklausomai nuo tipo subrendusioje iedadulkje yra du spermiai. Yra dar viena iskirtin ypatyb, bdinga tik iedadulkms. Spermiai (tai lstels) yra tiesiog panir vegetatyvins lstels citoplazmoje. Netikta ir tai, kad vyksta sudtinga spermi migracija, kuriai sutrikus irgi gali pasireikti vyrikasis sterilumas. Pvz., vairenio mutanto ingressus (lot. engimas, savo vietos, pareig umimas) generatyvin lstel dalijasi normaliai, bet spermiai negali migruoti vegetatyvins lstels centr, lieka alia vegetatyvins lstels apvalkallio. Kito mutanto gum (gem unit malformation), atvirkiai, du spermiai asocijuojasi ir juda vegetatyvins lstels centr, o vegetatyvins lstels branduolys, kuris paprastai bna asociavsis kartu su spermiais, lieka vegetatyvins lstels pakratyje. Kaip ir gemalinio maielio branduoli migracij, taip ir spermi/vegetatyvins lstels branduolio migracij lemia mikrovamzdeliai ir motoriniai baltymai. Vis j mutacijos pasireikia kaip vyrikasis sterilumas arba bent labai maina iedadulki gyvybingum. iedadulks dehidratacija (vandens praradimas) enklina iedadulks raidos pabaig. Tai irgi apsaugin reikm turintis vykis. Taip iedadulk prisitaiko savarankikai gyventi atvirame ore. Ne vis augal iedadulks praranda vanden. Kukurz iedadulks netenka iki 50 % vandens, o drebuls tik 6 %, agurk visai jo nepraranda. Pagal dehidratacij skiriamos dviej tip iedadulks: maai prarad vandens (iki 20 %), jos bna labai trumpai gyvybingos dvi-tris valandas; stipriai dehidratuotos (iki 60 %). Jos ilieka gyvybingos kelias dienas, kai kuri augal ir mnesius, o priklausomai nuo aplinkybi kartais ir metus.
2.1 intarpas. iedadulki alergenai vieniems nauda, kitiems ala... Seniai inoma, kad augal iedadulks jautriems monms sukelia alergij astm, slog, taiau kokia tikroji iedadulki alergen (alergij sukeliani veiksni) chemin ir biologin prigimtis, paaikjo tik prie du-tris deimtmeius, ir tyrimai tsiasi iki iol. Atrandami vis nauji iedadulki alergenai. iuo metu skiriama bent 15 iedadulki alergen klasi, taiau netgi tai paiai klasei priklausantys alergenai skiriasi. Augalams bdingas polimorfizmas ir pagal alergenus. Gal todl iedadulki alergijos gana paplitusios. Teigiama, kad apie ketvirtadalis alergik moni jautrs vieno ar kito augalo iedadulkms. Be to, to paties augalo iedadulkse gali bti ne vienas alergenas. Tai atspindi ir alergen nomenklatra. Alergenai daniausiai apibdinami lotyniko augalo pavadinimo santrumpomis, o papildomi skaiiai parodo iame augale aptikto alergeno eils numer: Phl p1 Phleum pratense (paarinis motiejukas), Lol p1 Lolium perenne (daugiamet svidr), Zea m1 Zea mays (paprastasis kukurzas), Phl p13 vl Phleum pratense, Bet v1 Betula verrucosa (karpuotasis beras), Mal d1 Malus domestica (namin obelis), Api g1 Apium graveolens (valgomasis salieras), LaPR-10 Lupinus albus (baltaiedis lubinas). Nomenklatra keiiasi priklausomai nuo itirt alergen chemins-biologins sandaros ir paskirties. Tai atspindi ir pastarasis i lubin alergenas LaPR-10. PR ymimi baltymai, kurie lemia augal atsparum vairiems patogenams (PR nuo angl. pathogen(esis) related). Jie lemia ne tik
AUGAL GENETIKA
| 93
atsparum patogenams, bet ir vairiems stresams: aliui, sausrai, netgi ultravioletiniams spinduliams ir kt. Tai labai svarbu dygstaniai, menkai nuo aplinkos izoliuotai iedadulkei. Kai kurie PR-baltymai tiesiogiai keiia lstels sienels/apvalkallio struktr. Tai chitinazs, -1,3glukanazs, pektinazs, osmotinas, sisteminas, proteinazs ir j inhibitoriai. Jie btini dygstaniai iedadulkei, auganiam dulkiadaigiui. iedadulki dygimui labai svarbs baltymai, kurie jungiasi su Ca2+. Jie yra alyvmedio (Olea europea) Ole e6 ir bero (Betula verrucosa) Bet v3 alergenai. Bero alergenas Bet v1, kuriam yra jautrs apie 20 % asmen, alergik iedadulkms, yra profilinas. Tai maos molekulins mass (1417 kDa) baltymai, bdingi ne tik ber, bet ir kit augal, ypa medi (lazdyno, alksnio, skroblo) iedadulkms. Profilinai jungiasi su motoriniu baltymu aktinu, kuris be kit funkcij, dalyvauja paskirstant dukterines/homologines chromosomas mitozje ir mejozje. Nuo profilin priklauso iedadulki nesuderinamumas. Tarp iedadulki alergen bene geriausiai itirti ekspansinai. Tai nulm j svarba augalui. Ekspansinai yra btini tstamajam augimui, tarp kit augalo dali ir iedadulks dulkiadaigiui. Jie silpnina ryius tarp lstels sienels/apvalkallio biopolimer. Patys ekspansinai yra panas katepsin B, kuris yra papain (C1) eimos proteinaz. Ekspansinai priklauso 1-ajai iedadulki alergen klasei. Gana skmingai vykdomos gen ininerijos programos, kuri tikslas sumainti alergen kiek augal iedadulkse taip, kad tai nepakenkt paiam augalui. Skelbiama, kad tokie yra gauti svidrs (Lolium) augalai.
Prie iedadulki ilikimo atvirame ore prisideda vairs osmoprotektantai (angliavandeniai, lipidai, prolinas), kuri gausu iedadulkse. Vegetatyvinje lstelje kaupiamos ir atsargins mediagos, reikalingos augti dulkiadaigiui. Dar kart galima sitikinti, kaip subtiliai suderinti gametofito ir sporofito veiksmai. Vos tik iedadulk praranda vanden (pasiruoia laisvam gyvavimui), atsiveria dulkin ir iedadulks vairias bdais pasklinda erdvje. Jautriems monms nuo to atsiranda alergija (2.1 intarpas). Gen pasireikimo iedadulkse ypatumai. iedadulki transkriptomika. iedadulks yra genetikai visaverts (totipotencins). Tuo sitikinta prie kelis deimtmeius, kai pavyko i iedadulki iauginti haploidinius augalus. Taiau kuri dalis iedadulks genome esani gen pasireikia paioje iedadulkje, paaikjo tik 20032004 m., kai buvo pritaikytas mikrogardeli metodas. Juo galima tirti iedadulks transkriptom, transkribuojamas mRNR. Transkriptomas yra transkript, kuriuos per vis savo egzistavim sintetina konkretus organizmas, visuma, o mokslo sritis, kuri tai tiria, vadinama transkriptomika. Skirtingai nuo gyvn spermatozoid, kuriuose gen raika nuslopinta, iedadulks yra genetikai aktyvios lstels. Tiesa, brstaniose iedadulkse ekspresuojam gen labai sumaja. Tai nustat D. Honysas ir D. Twellas pasitelk ATH1 mikrogardel, atstovaujani 22591 genui i madaug 28000 gen, koduojani vairenio mRNR ir baltymus. Didiausias genomo aktyvumas nustatytas mikrosporocituose (11565 mRNR) ir dvilsiuose gametofituose po pirmojo mitozs dalijimosi (11909 mRNR). Paskui jis maja: po II mitozs 8788 mRNR; subrendusiose iedadulkse 7235 mRNR.
94 |
Tarp subrendusiose iedadulkse aptinkam mRNR yra atsargini. Nuo j bus sintetinami baltymai tik dulkiadaigyje. Kiek yra toki mRNR, kol kas nenustatyta. Dauguma iedadulkse pasireikiani gen yra bdingi ir sporofito lstelms. Be to, tai vadinamieji nam kio/apyvokos genai, btini lstels gyvybinms funkcijoms. Svarbiau iaikinti tik iedadulkms savitus genus (2.2 intarpas). J dalis mikrogardeli metodu sudaro apie 10 %, tarp j didiausia dalis (45 %) tenka lstels apvalkallio ir citoskeleto (mikrovamzdeli isidstymo) genams. Tai patvirtina i struktr reikm iedadulks raidai. Tarp 22591 tirt gen iedadulkse reikiasi 608 genai, koduojantys transkripcijos veiksnius. Tai genai, kuri koduojami baltymai, kaip ne kart minta, jungiasi su DNR. Spjama, kad vairenio genome i viso yra 1594 tokie genai. Kaip ir megagametofito, ir haploidini iedadulks lsteli visi genai yra hemizigotiniai, neturi sau homologo, todl pasireikia fenotipikai. Dl ios prieasties augalus, kuri vyrikj sterilum lemia branduolio recesyvieji genai, galima aptikti tik tada, jeigu jie yra homozigotiniai (vs vs). Heterozigotini augal (+vs) visos iedadulks bna gyvybingos, nes iedadulks, paveldj vs gen, va. Lieka iedadulks tik su WT (+) genu. Tai, be viso kito, viena i nukrypim nuo Mendelio dsni prieasi. Tipiku atveju, pagal Mendel, vis tip gamet turt bti po lygiai. I ties iedadulks, kuri lstelse pasireikia letals, trikdantys iedadulks raid genai, va. iedadulks poligonas natraliai atrankai. Kaip galjome sitikinti, hemizigotin gen bsena sudaro ypatingas, tiesiog idealias slygas natraliai atrankai. Tai, matyt, ir viena i prieasi, kodl iedadulkse reikiasi tiek daug ir sporofitui reikaling gen. Atranka pasireikia ir vliau apdulkinimo-apvaisinimo etapuose. Dulkiadaigiui tenka veikti didel keli, kol pasiekia gemalo maielio mikropil. Ant purkos dygsta daug iedadulki ir tik paios energingiausiosios pasiekia galutin tiksl. Vyrikasis gametofitas/iedadulk yra parankiausia sistema gamtinei atrankai. Tai kas, kad us milijonai iedadulki, augalo ris nuostoli nepatirs. Kitaip bt, jeigu t sporofitai. Manoma, kad i mikrospor atrank perj genai garantuoja privalumus ir sporofitui.
2.2 intarpas. Kaip nustatoma gen raikos vieta. aliosios iedadulks Savitai reikiasi ne tik transkripcijos veiksnius koduojantys genai, nulemiantys lstels tip ir funkcijas, bet ir kit tik konkreiai lstelei bding mediag sintez, pvz., sporopolenin genai. Jie yra saviti tik tapeto lstelms ir mikrosporoms. Kur ir kada pasireikti genui, nulemia jo promotorius. Jame yra ne tik nukleotid sekos, kurias atpasta pagrindiniai transkripcijos veiksniai. Be j sveikos su genu nebt transkribuojamas bet kuris genas. Promotoriuje gali bti ir itin savitos nukleotid sekos, kurias atpasta saviti transkripcijos veiksniai. Tokie genai pasireikia tik tam tikrose lstelse, tam tikru j raidos momentu arba kaip atsakas aplinkos veiksn ar veiksnius. Reguliacin geno dalis Koduojanti geno dalis
Saviti Transkripcijos veiksniai Promotorius
Bendrieji
RNR sintez Reporterio koduojanti dalis
AUGAL GENETIKA
| 95
Geno promotori sujungus su reporteriu genu, galima vizualiai stebti, kuriose lstelse veikia genas. Augal genetikoje daniausiai naudojami du reporteriai genai: gliukuronidazs genas (sutr. GUS) kai vyksta io geno raika, susidaro spalvotas produktas; aliai fluorescuojanio baltymo genas (GFP). Savitas promotorius sujungiamas su vieno kurio nors reporterio geno koduojania dalimi. Kuriose lstelse pasireikia toks chimerinis genas, tose lstelse natraliai reikiasi genas, kurio promotorius panaudotas ioje konstrukcijoje. Kai kuriems promotoriams nustatyti reikia dideli pastang. Pvz., didelis laimjimas yra promotoriai gen, kurie pasireikia tik spermiuose. Kandidatais tokius genus buvo trys vairenio genai: AtGEX1, AtGEX2 (GAMETE EXPRESSED 1, 2) ir AtVEX (VEGETATIVE CELL EXPRESSED 1). Sujungus kurio nors i i trij gen promotori su GFP geno koduojania dalimi, lstels, kuriose pasireik chimerinis genas, vytjo aliai: AtGEX1 : : GFP aktyvus spermyje, bet ne jo pirmtake generatyvinje lstelje arba vegetatyvinje lstelje, io geno raika taip pat nustatyta sklapradyje, aknyse ir lapo ioteli lstelse; AtGEX2 : : GFP aktyvus tik spermyje, bet ne vegetatyvinje lstelje; AtVEX1 : : GFP aktyvus tik vegetatyvinje lstelje, spermyje jis nepasireikia. Vadinasi, tai genas, kuris savitai pareikia tik vegetatyvinje lstelje. Nra bdingas spermiui genas. Kita vertus, akivaizdu, kad AtGEX1 ir 2 yra aktyvs skirtingose spermio raidos stadijose ir AtGEX2 genas pasireikia anksiau, dar generatyvinje lstelje iki II mitozs, o AtGEX1 vliau, tik paiame spermyje (2.6 pav., A sp.). (Pagal M. L. Engel, R. Holmes-Davis, S. McCormick. Plant Physiology: 2005.Vol. 138, P.21242133).
2.3.4. Citoplazminis vyrikasis sterilumas. Nauji chimeriniai mitochondrij genai Vyrikai sterils mutantai, kurie aprayti 2.3.3 skyrelyje, yra dl branduolio DNR gen mutacij. Dar 1921 m. angl mokslininkas Beitsonas (W. Bateson) pastebjo, kad vyrikasis lin sterilumas paveldimas tik i motinos puss. Tai reikt, kad is poymis paveldimas ne per branduol, o per citoplazm. Gaila, tai buvo laikmetis, kai nebranduolinis paveldimumas apskritai oficialiosios genetikos nebuvo pripastamas, todl is atradimas ypatingo susidomjimo nekl. Nauj impuls tirti vyrikj citoplazmin sterilum dav kukurz heteroz (2.8 pav.). Kukurzai tiesiog sukurti panaudoti heteroz, kuri pasireikia didesniu hibrid (heterozigot) produktyvumu. Vyriki j iedynai yra luotels, o moteriki burbuols (varpos, nors varpomis jas laikyti daug kas nelinks) auga atskirai. Kad augalas apsivaisint gretimos linijos iedadulkmis, reikia paalinti luotel, paprasiausiai j nukirpti. Taip ir buvo daroma. Atrodyt, viskas paprasta, taiau reikia gauti sklos milijonams hektar. Net naudojant specialius renginius, tai sunku, o svarbiausia neapsimoka. Tada ir atkreiptas dmesys kukurz augalus, kuri vyrikieji iedynai sterils, o moterikieji to paties augalo iedynai normaliai vaisingi, ir i savyb paveldima tik i motinos puss. Tai nustatoma abipusiais kryminimais: VS N N VS VS N F1
96 |
ia VS sterilios luotels; N normalios vaisingos luotels; abipusis kryminimas manomas todl, kad VS augal dulkinse bta iek tiek gyvybing iedadulki.
Vaisinga (tvirtintoja) VCS vaisos linijos VCS Vaisinga (krja)
Viengubieji (paprastieji) linijiniai hibridai
(C x D) Vaisingas Dvigubojo linijinio hibrido burbuol [(A x B) x (C x D)] Vaisingas (A x B) VCS
2.8 pav. Dvigubj linijini kukurz hibrid gavimas panaudojant vyrikj citoplazmin sterilum:
A, B, C, D vaisos linijos; B ir C VCS; A linija, tvirtinanti VCS; D linija, atkurianti vaisingum, jos hibridai su VCS yra vaisingi.
Citoplazmin VS prigimtis. Heterozei gauti is reikinys pradtas naudoti netgi anksiau, negu Roudsas (M. M. Rhoades) rod, kad poymis paveldimas per citoplazm. Abejones dl io poymio citoplazmins prigimties kl tai, kad hibridas (VSN) pus chromosom paveldi i motinos, o kit pus i tvo. Vyrikasis sterilumas galjo isivystyti dl tvo ir motinos chromosom neatitikimo arba tvo chromosom neatitikimo motinos citoplazmai. Toks sterilumas nustatytas tolimiesiems hibridams. Kad nekilt abejoni, Roudsas i tvo puss panaudojo ypating kukurz linij, kurios visos 10 haploidinio rinkinio chromosom yra citologikai ymtos, t. y. kokia nors struktros ypatybe skiriasi nuo normalaus kariotipo chromosom. Po pirmojo kryminimo, kaip ir priva| 97
AUGAL GENETIKA
ljo bti, pus hibrido chromosom buvo normalios struktros (i motinos), o kita pus citologikai ymt (i tvo). Genetikai disponuoja paprastu, tik daug laiko ir darbo reikalaujaniu metodu, kaip pakeisti vieno organizmo chromosomas kito organizmo chromosomomis. Tai grtamieji kryminimai: hibridas yra kryminamas su vienu i tv. Nagrinjamu atveju, hibridas (VSN) kryminamas su tvine linija (N), kurios visos chromosomos buvo citologikai ymtos. Po kiekvieno pakartotinio grtamojo kryminimo motinos (normali) chromosom sumadavo pusiau: iki 0,25; 0,125; 0,0625 ir t. t. Grtamieji kryminimai i kartos kart kartoti tol, kol visos normaliosios chromosomos, i pradi i motinins VC linijos, buvo pakeistos citologikai ymtomis tvins vaisingos linijos chromosomomis. Nepaisant to, iliko hibrido (VSN) vyrikasis sterilumas. Neliko joki abejoni, kad j lemia citoplazmoje esanios genetins struktros. Nuo to laiko vyrikasis sterilumas, kuris paveldimas i motinos puss, pradtas vadinti CVS, arba citoplazminiu vyrikuoju sterilumu. Tikroji io sterilumo prigimtis paaikjo negreitai, pirma jis pritaikytas heterozei. iuo metu CVS naudojama gauti hibridus ir heteroz ne tik kukurz, bet ir daugelio kit augal (svogn, cukrini runkeli, sorgo, pomidor ir kt.). Tradicikai teigiama, kad CVS yra nustatyta daugiau nei 150 magnolijn ri, bet praktikai CVS gen ininerijos metodais galima sukurti bet kuriai augal riai (2.3 intarpas). Sunkiau yra kita surasti linijas, genus, kurie atkuria vaisingum. Tai btina, jeigu augalo produkcija yra sklos ar grdai (2.8 pav.). CVS ir mitochondrijos. Skiriami vairs CVS tipai daniausiai pagal CVS pasireikimo pobd. Kukurz, kuri CVS detaliai pradta tirti pirmiausia pagal pasireikimo pobd, skiriami du CVS tipai: T-tipas (nuo Teksaso, kur tas tipas pirm kart aptiktas) ir S-tipas (jam pavadinim dav JAV ems kio departamentas). Abu jie atsirad natraliai, bet dl skirting prieasi, nors juos abu lemia pokyiai mitochondrij genome. CVS-T augal nesivysto netgi dulkins. CVS-S augal dulkins atrodo normaliai. Abortyvus yra tik gametofitas: nesusidaro iedadulks. J raidos nukrypimai prasideda tik tetradose. Kiek yra itirta CVS, visais atvejais sterilumas atsirado dl mitochondrij gen pokyi: ATP sintezs subvienet atpA, atp4, atp6, atp8, atp9; citrochromo oksidazs subvienet coxI, coxII, cob ir kt. Iki 2004 m. pabaigos buvo inomi 25 mitochondrij genai, dl kuri atsiranda CVS, todl tolesnis CVS skirstymas tipus neteko prasms, taiau iliko istoriniai tip pavadinimai. Kodl mitochondrijos? is klausimas kyla todl, kad augal citoplazmoje yra dvi organels, kurios turi DNR ir vykdo savarankik genetin funkcij. Tai plastids ir mitochondrijos, taiau, kaip minta, visais iki iol inomais atvejais CVS atsiradusi dl pokyi mitochondrij genome. Tik gen ininerijos metodais CVS sukurta plastidse (2.3 intarpas). Prieastis, matyt, yra plastidi ir mitochondrij pasireikimo vietos ir laiko skirtumai. Plastidi pagrindin funkcija yra fotosintez. Ji vyksta tik aliose augalo dalyse, lapuose. Mitochondrijos funkcionuoja visose lstelse, bet iedadulki raidai reikia itin daug energijos, todl paios iedadulks ir jas imaitinanio audinio tapeto lstels yra ypa jautrios energijos stokai. Kita vertus, augalas sukuria kompensacijos mechanizmus. Tuo sitikinsime toliau isiaikin Rf gen funkcij. Sporofito lstelse energijos nepritekli gali kompensuoti netgi chloroplastai. Juose irgi vyksta ATP sintez ir toks kompensa98 |
vimo bdas nustatytas eksperimentais. Gali bti, kad per labai trump iedadulki raidos trukm kompensacijos mechanizmai, kuriuos koduoja branduolio genai, nespja ar nestengia susiformuoti. Nutrksta koordinuoti ryiai tarp branduolio ir mitochondrij genom ir pasireikia genom konfliktas. Nauji chimeriniai genai. Genom konfliktas. Tai nustatyta tolimuosiuose lytiniuose ir somatini lsteli hibriduose. Juose vyrikasis sterilumas danai atsiranda dl branduolio gen neatitikimo citoplazmai arba vieno augalo citoplazmos nesuderinamumo su kito augalo citoplazma. Toks augal sterilumas yra inomas seniai, nuo pat tolimj hibrid tyrimo pradios, taiau tikrosios io reikinio prieastys nustatytos palyginti neseniai, pasitelkus iuolaikinius genomo tyrimo metodus. Tada ir paaikjo sudtingi ryiai tarp branduolio ir mitochondrij genom. CVS yra puikus branduolio ir mitochondrij genom konflikto pavyzdys atsiranda nauji chimeriniai genai, su kuriais nutrksta branduolio gen ryys. Dl genom konflikto greita genom reorganizacija vyksta ne tik tolimj hibrid branduolyje, bet ir mitochondrijose: gali susilieti du trys mitochondrij genai vien bendr chimerin darin. Vliau dar papildomai vyksta daugkartin rekombinacija, ir jeigu naujai atsirads genas turi normaliai veikiant promotori, o jo koduojanti dalis atitinka atvirojo skaitymo rmelio sandar, susidaro naujas chimerinis genas. Atviruoju skaitymo rmeliu yra vadinama nukleotid seka, galinti nepertraukiamai koduoti polipeptid (aminorgtis vien paskui kit). Jo ribas ymi pradios (AUG) ir pabaigos (UAG, UAA arba UGA vienas kuris i j) kodonai. Sutrumpintai ymimas ORF (orf) (i angl. open reading frame). Nauj chimerini gen atsiradim mitochondrij genome palengvina jo sandara. Mitochondrijos atsirad dl eukariot lstels simbiozs su bakterijos lstele, todl mitochondrij genome isaugota kai kurios bakterij genomo ypatybs: viena iedin chromosoma, dl ko visi genai yra sukib; genai jungiasi gen grupes operonus. Daug mitochondrij gen turi kelis promotorius arba keliems genams yra bendras promotorius. Prisiminkime, kad tai seka, be kurios nebt veiklus n vienas genas. Promotoriumi genas arba gen grup sveikauja su transkripcijos veiksniais. Naujas chimerinis genas be promotoriaus irgi bt nefunkcionalus. Nauj chimerini gen atsiradim btent mitochondrij genome skatina ir tai, kad mitochondrij genomui bdingos permutacijos (r. 1.11 intarp): iedin DNR karpoma ir atsirad jos fragmentai sujungiami vairiais deriniais. Tad yra padidintos galimybs rekombinacijai. Tolimj hibrid CVS daniausiai gaunama, kai suliejamos dviej augal ri ar net geni somatins lstels. iuo atveju sujungiami ne tik du branduolio genomai, bet ir citoplazma su joje esaniomis organelmis. Susidaro idealios slygos mitochondrij genom konfliktui ir jo isprendimui genom pertvarkai.
AUGAL GENETIKA
| 99
Taip gautas ir petunijos CVS tipas pavadintas pcf. Chimerinis Pcf lokusas atsirado dl sudtingos somatini lsteli hibridizacijos. Buvo sulietos somatins Petunia hybrida ir P. parodii lstels. Petunijos Pcf lokusas, dl kurio atsiranda CVS, i esms, yra nedidelis operonas, nes j, be Pcf geno, eina dar kiti genai. I viso keturi ORF (atvirieji skaitymo rmeliai): chimerinis genas sudarytas i susiliejusi trij gen: atp9 geno fragmento; cox2 pseudogeno, kuris yra be intron ir jam trksta vieno kodono, btent ATG; neidentifikuoto (nenustatyta jo koduojamo polipeptido funkcija) ORF pavadinto urf-s; antras ir treias ORF yra normalios, be pokyi nad3 ir rps12 gen kopijos; tarp Pcf ir nad siterps tik 9 kodonus turintis neidentifikuotas, bet bdingas ir normaliai vaisingai linijai orf 143 (2.9 pav.).
orf355 orf77 atp9 3 to atp9 atp4 (orf 221) rrn26 cp tPNAwT orf143 urfS atp8 nod3 rps12
Kukurzas
atp6 urf13-T 3 to rrn26
Kukurzas
atp9 atp9 trnfM
115 codon
Pcf (orf402) cox2 orf138 orf125
Petunija
118 codon 125 codonai
Brassica Ogura Ridikas Kosena Brassica tour

trnfM
158 codon
atp6
atp8
orf263
nad5a atp6 atp6 orf 79 cox1 orf107 atp9 cox1
Ryiai
337 codonai
Sorgas
2.9 pav. Kai kurie nauji chimeriniai mitochondrij genai, kurie lemia citoplazmin vyrikj sterilum
(pagal M. R. Hanson, S. Bentolila. Plant Cell. 2004, Vol. 16, Supl., P. 154169).
Daugelis iuo metu itirt CVS gen irgi yra chimerins prigimties, tarp j ir abiej kukurz tip CVS-S ir CVS-T. Pvz., CVS-T tipas atsirads dl chimerinio geno urf13, kuris sudarytas i susiliejusi ribosomini RNR gen, kurie nekoduoja baltymo, fragment, bet, paradoksalu, susidaro ORF i 115 kodon, ir jis koduoja 13 kDa baltym.
100 |
CVS radikaliausias kelias atsikratyti chimerinio geno. mogus, iekodamas bd, kaip gauti hibridus ir heteroz, tiesiog isaugo tokius CVS augalus. Natralioje aplinkoje jie inykt arba bt panaudoti kaip tiesiausias kelias lytin dimorfizm dvinamikum, o kartu ir bd 100 % utikrinant krymadulk. Kad toks kelias realus, rodo Rf genai. Rf genai (nuo angl. restorter of fertility). Kaip sinonimas, vartojama kita j santrumpa Fr (fertility restorter). Tai branduolio genai, kurie atkuria CVS augal vaisingum. Surasti tokius genus vert praktins aplinkybs, nors j veikimo mechanizmai yra ne maiau svarbs ir doms. Visos sklos, kurios usimezga ant CVS augal, yra hibridins. Augal, kurie dauginami vegetatyviniu bdu, produkcijai CVS neturi reikms. Taiau augalams, kuri produkcija yra sklos ar vaisiai, btina atkurti vaisingum. Grynai i praktini paskat pirmieji vaisingum atkuriantys genai buvo surasti ir panaudoti kukurzams. J CVS-T vaisingumui atkurti btini du dominuojantys branduolio genai Rf1 ir Rf2 (2.1 lentel). Rf1 geno produktas slopina urf 13 geno raik, todl labai sumaja URF13 baltymo kiekis, bet augalai, kurie yra Rf1Rf1 rf2rf2 genotipo, ilieka sterils. Reikia, kad bt suskaidomi toksiki aldehidai, kurie pasigamina netgi esant maiems URF13 baltymo kiekiams. Rf2 genas kaip tik koduoja aldehido dehidrogenaz, kuri skaido toksin, bet suprantama, jo vieno vaisingumui atkurti nepakanka: rf1rf1 Rf2Rf2 genotipo augalai yra sterils. Tik tada, kai yra genotipas Rf1Rf1 Rf2Rf2, augal vaisingumas visikai atkuriamas.
2.1. lentel. Vaisingumo atkurimo gen Rf1 ir Rf2 raika kukurz CVS-T tipo augaluose Augalo fenotipas
CVS CVS CVS Vaisingas
urf13 transkripto/URF13 baltymo kiekis

Daug Maai Daug Nra
Branduolio genotipas
rf1rf1 rf2rf2 Rf1Rf1 rf2rf2 rf1rf1 Rf2Rf2 Rf1Rf1 Rf2Rf2
Genotip fenotipinis pasireikimas

URF13 baltymas Mainamas URF13 baltymo kiekis Aldehido dehidrogenaz Visikai atkuriamas vaisingumas (nra URF13 baltymo ir toksin)
Vis tik daniausiai pakanka vieno Rf geno, bet jis atkuria tik vieno tipo CVS, ir tai suprantama, nes kiekvienu atveju po mitochondrij genomo reorganizacijos susidars naujas genas yra unikalus. Taiau aptikti ir tokie Rf genai, kurie atkuria 2-3 tip CVS augal vaisingum. Dar didesn Rf gen raikos vairov yra pagal tai, kokiu bdu jie atkuria vaisingum. Tik retais atvejais Rf genai veikia CVS lokuso struktr (pvz., per nesuporuot nukleotid reparacij). Daugeliu atvej Rf genai slopina arba gen transkripcij, arba keiia potranskripcinius vykius: transkripto brendim (be to, vairiais bdais); paties CVS baltymo sintez (transliacij); potransliacin baltymo brendim; pagaliau Rf geno produktas gali sveikauti su CVS baltymu. Taip atkuriamas Brassica napus vadinamojo Ogura tipo VCS augal vaisingumas. Rfo baltymas tiesiogiai sveikauja su ORF138 baltymu, dl kurio vystosi Ogura CVS. Utenka vieno geno atkurti petunijos CVS, kuris atsiranda dl sudtingo chimerinio Pcf lokuso. Genas, kurio produktai labai sumaina PCF baltymo kiek, buvo pavadintas Rf-PPR592, nes jis koduoja domios sandaros baltym. PPR 592 baltymas (pavadinimas
AUGAL GENETIKA
| 101
nuo pentatricopeptide repeat) turi 14 pentatrikopeptido kartotini sek, kurios sudaro 87 % viso baltymo i 592 aminorgi. io atradimo svarba yra ta, kad PPR baltym koduojanius motyvus turi ir kai kurie Rf genai kit augal genomuose, kad ir mintas Brassicca napus Rho genas arba Rfk1 genas, kuris atkuria Raphanus CVS, taiau augal genomuose aptinkama daug PPR gen. Tik kai kurie i j veikia kaip Rf atkurdami CVS augal vaisingum. Vairenio genome PPR baltymus koduojani gen yra apie 200. J koduojamuose baltymuose kartotins aminorgi sekos konsensusas yra: (1) TYNALINAYAK . G . . EEA . . LY . .M . . . G . (2) ITYT VI GLC G LD A LF M GI AL LF EM G (3) VTY TLI G CK GR G (4) TYN LI GLCK GR EA LF M ia (1) vairenio (Arabidopsis thaliana) konsensusas i vis tirt PPR baltym; takais paymtos praleistos aminorgtys; (2) petunijos (Petunia) PCf baltymo kiek mainantis Rf-PPR592; (3) ryi (Oryzias sativa) Boro tipo CVS atkuriantis baltymas; (4) ridiko (Raphanus sativus) Kosena CVS atkurianio Rfk1 geno koduojamas PPR baltymas ( pagal M. R. Hanson, S. Bentolila, 2004). Konsensusas (lot. consensus susitarimas) sutartin idealizuota nukleotid arba aminorgi seka, pagrsta apibendrinaniais tyrimais. Kiekvienoje padtyje nurodomi atitinkamai nukleotidai arba aminorgtys, kas ioje padtyje daniausiai pasitaiko. Kartais tai nurodoma procentais: 100 % reikia, kad ioje padtyje nukleotidas ar aminorgtis yra visuose tirtuose biopolimeruose; maiau kaip 100 % maesn ar didesn vairov. I pateikt (1 4) PPR baltym kartotins sekos aminorgi palyginimo matyti dsningas aminorgi sekos pokytis t baltym, kurie yra koduojami Rf gen ir maina CVS sukeliani baltym kiek. Palyginimas atliktas su PPR baltym koncensusu i normalaus vaisingo vairenio (A. thaliana) genomo. Btent, yra tokie skirtumai G (glicinas) vietoje A (alanino), C (cisteinas) vietoje A (alanino) ir F (fenilalaninas) vietoje Y (tirozino).
Toliau tiriant Rf genus dl j ir CVS vairovs turt paaikti dar daug domi, svarbi augal ir galbt apskritai genetikai, molekulinei biologijai biomolekuli sveik ir reikini. Pvz., esnako CVS ymimam CMS1 aptikti net trys skirtingi branduolio genai, atkuriantys vaisingum: X stabiliai atkuriantis vaisingum; T aikiai temperatros reguliuojamas (TS) genas: iedadulks susidaro, kai t dien/nakt yra 24 C ir lieka steriliu augalu, kai t dien 20 C, o nakt yra 12 C; treias genas atkuria iedadulki raid po poveikio tetraciklinu. esnako CMS1 sterilumas pasireikia irgi savotikai: labai ivejs tapetas, o iedadulks visikai be protoplazmos, bet yra normalus apvalkallis.
2.3.5. Vyrikasis sterilumas, heteroz ir gen ininerija Heteroz vertinama kaip vienas didiausi XX a. agrotechnikos laimjim. Teigiama, kad j diegus JAV kukurz derlius padidjo 3 kartus. Genetin sistema, pagal kuri CVS taikoma daugelio augal heterozei, buvo sukurta dar 1943 m. Donso (H. A. Jones)
102 |
ir Klarko (A .E. Clarck) svognui (Allium cepa L.), kuris iki iol greta kukurz (2.8 pav.) naudojamas kaip modelinis objektas tirti heteroz. Sistemos ypatumas yra vaisos (inbred) linijos, kurios sukuriamos krymadulkius augalus priverstinai apvaisinant savo pai iedadulkmis, t. y. vaisos (priverstins savidulkos) bdu. vaisos linijos pasirinktos dl j genetinio grynumo (homozigotikumo). Jas sukryminus, F1 hibriduose heteroz pasireikia vienodai. vaisos linijos parenkamos specialiai, kad F1 heteroz bt kuo didesn (2.8 pav.). Sistema sudaryta i dviej vaisos linij, kuri viena turi CVS, o kita Rf genus. Taiau naudojant tik vien CVS altin, kyla vieno geno iplitimo pavojus. Klasikinis pavyzdys tie patys kukurzai. JAV praktikai pritaikytas tik vienas CVS-T tipas. 1970 m. pietinse JAV valstijose, kuriose ir auginami kukurzai, kilo epidemija. J sukl grybas Bipolaris (Cochliobolus) maydis. Paaikjo antrinis pleiotropinis CVS-T poveikis, kuris pasireik tik tada, kai aplinkoje aukta temperatra. Tokiomis slygomis mitochondrij genas, kuris lemia CVS, sukelia por susidarym membranose ir atveria kelius patogenui. Tai buvo skaudi pamoka, po kurios parenkant VS altin atsivelgiama galim pleiotropin poveik, kuris neprastomis slygomis gali sukelti pavoj: paiam augalui, o dar blogiau mogui. Kita vertus, negalima pasitenkinti tik vienu VS altiniu. VS genetinius iteklius papild transgeniniai augalai. Barnazs Barstar sistema. Lengviau svetimus genus vesti branduolio genom, todl iki iol dauguma VS sukeliani transgen yra branduolio genome. Toks yra ir barnazs genas, kuris yra i bakterijos Bacillus amyloliquefaciens ir koduoja toksik baltym ribonukleaz, vadinam barnaze. Barnaz toksika ir augalo lstelms. Siekiant, kad t tik tapeto lstels ir atsirast VS, Barnase genas buvo sujungtas su specifiniu promotoriumi TA29, kuris aktyvus tik tapeto lstelse (2.10 pav.). Konstrukcija atrod taip: TA29::Barnase. Surasti iam transgenui Rf palengvino tai, kad natraliai B.amyloliquefaciens gamina prienuod barnazs inhibitori, kuris buvo pavadintas barstar. is baltymas lstels viduje inaktyvina barnaz ir taip bakterija apsisaugo nuo savo paios gaminamo nuodo. Tad kaip Rf buvo sukonstruotas transgenas TA29::Barstar: kai branduolio genome yra tik TA29 :: Barnase transgenas, pasireikia VS; o kai TA29:: Barnase + TA29::Barstar, augalas yra vaisingas. Heterozei gauti kryminami augalai, kuri vienas turi TA2:: Barnase, o kitas TA29:: Barstar transgen.
Nors sistema po kai kuri modifikacij (2.3 intarpas) buvo pritaikyta aliejiniam rapsui (kanolai), kai kurie sistemos trkumai akivaizds: abu genai yra i tos paios bakterijos; abi linijos, kurias vedami transgenai, jau i anksto turi bti atrinkti dl j hibrid heterozs. Bent vienas i tv turt bti laisvai parenkamas selekcininko pagal heterozs pasireikim. Pagaliau bendras VS, kur lemia branduolio genai, trkumas:
gresia heterozigotikumas ir susiskaidymas vaisingus ir sterilius augalus.
AUGAL GENETIKA
| 103
Barnazs sistema buvo vairiai tobulinama. Vienas i patobulinim yra toks: barnaz yra i dviej polipeptid (domen); abu skirting augal genome, ir tik jeigu abu sukryminti, pasireik VS. Tai kartu vienas i bd, kaip ivengti horizontalaus transgeno plitimo.
A
P L D K M T K M T P L
Skirtingi CVS tipai
2.10 pav. Savit promotori ir toksino barnazs panaudojimas kukurz CVS indukcijai ir heterozei:
dulkins raidos stadijos (A), kuriose pasireikia saviti promotoriai (C), prie vieno j (TA29) prijungta koduojanti barnazs geno dalis arba barnazs slopiklis Barstar; B pavaizduoti du skirtingi vairenio vyrikojo sterilumo tipai: kairje neisivyst dulkins, deinje dulkins atsidaro udelstai (pagal R. B. Goldberg et al. Plant Cell. 1993. Vol. 5, P. 12171229).
Barnase+Barstar sistema turi ir svarb privalum. Abu genai yra dominuojantys, todl genotipai i tvo puss su TA29::Barnase bna sterils. Taip neleidiama transgenui nekontroliuojamai plisti.
Kitos transgenins VS sistemos sukurtos panaiu bdu kaip ir Barnase-Barstar. Panaudoti saviti promotoriai, prie kuri prijungti genai pasireikia tapeto lstelse. Lstels, kuriose reikiasi transgenas, va, pasireikia VS. Pvz., argE genas i bakterijos Escherichia coli koduoja deacetilaz, kuri netoksik Naacetilfosfinotricin paveria toksiku herbicidu fosfinotricinu (dar kitaip vadinamu glufozinatu). Panaiems tikslams naudojami transgenai, koduojantys citochromus P-450. ie fermentai dalyvauja skaidant ksenobiotikus (organizmui svetimas mediagas). VS atsirasti utenka panaudoti transgenus, kurie
104 |
slopina flavonoid arba citokinin (lsteli dalijimosi hormon) sintez. Pastarojo tipo VS augal vaisingumas atkuriamas ne speciali Rf gen, o kinetino. VS gali sukelti ne tik tapeto lsteli tis, bet didelis suvejimas. Tokio tipo VS sukurta kaip transgen panaudojus augal augimo hormono indolilacto rgties sintezs gen rol B bakterij Agrobacterium rhizogenes. io hormono pertekliumi bakterija sukelia patologin infekuotos augalo dalies augim. Dar vienos gen grups transgenas panaudotas sukurti drebuls (Populus tremula P. alba) tarprinio hibrido VS. Tai homeozinis genas LEAFY, kuris reguliuoja perjim i vegetatyvinio augimo fazs ydjimo faz. Ne vietoje ir perdta LEAFY geno raika sukelia VS.
Deja, visi minti transgenai buvo vedami branduolio genom. Parankiau naudoti CVS (citoplazmin vyrikj sterilum), bet, kaip minta (2.3.4), CVS lemia mitochondrij genai, kuriems gen ininerijos metod kol kas nepavyksta pritaikyti. Plastidi CVS. 2005 m. Ruizas (O. Ruiz) ir Danijelis (H. Daniell) sukr CVS, kuri atsiranda dl transgeno plastidse. Tai buvo viena i 2005 m. sensacij. Pasinaudota patirtimi, kaip gaunami transgenai plastidi genome, kurie koduoja plastmass polihidroksialkanoato (PHA) sintez. J koduoja bakterijos Actinobacter Pha operonas (keli gen kompleksas), taiau transgeniniai augalai buvo skurduiai ir VS. aling Pha operono raikos pasekmi ivengta paiam augalui plastidi genom vedus ne vis Pha operon, o tik vien PhaA gen, kuris koduoja -ketolaz (2.11 pav.).
a. Normalus augalas (WT) vaisingas Acetil-CoA Acetil-CoA karboksilaz Malonil-CoA
b. phaA plastid sterilus Acetil-CoA -ketolaz Acetoacetil CoA Acetil-CoA karboksilaz Malonil-CoA
c. phaA plastid + pastovus (ilgalaikis) apvietimas vaisingas Acetil-CoA -ketolaz Acetoacetil CoA Acetil-CoA karboksilaz Malonil-CoA
2.11 pav. Citoplazminio vyrikojo sterilumo (CVS) atsiradimas dl phaA transgeno plastidse (b) ir vaisingumo atkrimas nepertraukiama viesa (c):
nuotraukose iedadulks: kairje normalaus augalo (WT), deinje CVS (i O. N. Ruiz, H. Daniell. Plant Physiology. 2005. Vol. 138, P. 12321246).
AUGAL GENETIKA
| 105
Po tabako plastidi transformacijos gautas CVS, bet be joki kit pleiotropini (daugybini) pasekmi augalui. Sterilumas atsiranda dl sutrikusios riebal rgi sintezs i acetil-CoA. Sutrikus riebal rgi sintezei, pasireikia VS. Tai puikiausias bdas ivengti nekontroliuojamo transgen plitimo (2.3 intarpas). Ir io tipo CVS augal vaisingum atkuria ne Rf genas, o nepertraukiama viesa.
2.3 intarpas. Kaip apsisaugoti nuo transgen plitimo ar vagysts? Citoplazminis vyrikasis sterilumas (CVS), ypa transgen terpimas plastidi genom, yra rimta klitis transgenams nekontroliuojamai plisti. Daugelio augal plastids, kaip ir mitochondrijos, yra paveldimos tik i motinos:
T Meristemos lstel su transgenu (T) plastidse iedadulks be T transgeno
Taiau, nors ir menka, bet egzistuoja galimyb (vairi augal ji skirtinga daniausiai madaug 0,02 %), kad plastids bus paveldtos ir i tvinio augalo. To pakanka atsirasti vadinamosioms. superpiktolms, t. y. transgeno horizontaliam plitimui tarp gimining augal, ypa piktoli. Dl ios prieasties kuriami vairs nauji bdai, kaip ivengti nekontroliuojamo transgeno plitimo. J paiekas skatina ir anaiptol ne tokios kilnios prieastys: gen ininerijos metodais sukurto transgeno autorysts apsauga; sklininkysts ki noras isaugoti sklins mediagos gamyb savo rankose. Tiktina, kad didiausia paanga bus pasiekta, kai pavyks nustatyti genus, kurie lemia apomiks, ir juos perkelti pageidaujamus genomus. Bt isprsta ir ilgalaiks heterozs problema, nes kol kas heterozei naudojami tik F1 hibridai. Toliau heterozigotikumas kaskart maja pusiau. Kol kas tenkinamasi dirbtinai sukurta kleistogamija. Tai apsivaisinimas iki iedo isiskleidimo,. udaras ydjimas. J pavyko sukurti kaip transgenus panaudojus du augal raidos genus LEAFY ir APETALA. Labai svarbu ivengti, kad transgeniniai ems kio augalai nesusikrymint su giminingais augalais piktolmis. Kartais praveria inios apie augal genomus. Daug kultivuojam augal yra poliploidai ir nesikryminimo barjeru tampa j genom nesutapimas su laukini giminaii genomais. Pora pavyzdi: paprastasis kvietys (Triticum aestivum) turi tris genomus A, B, D; kietasis kvietys (T. durum) tik A ir B genomus; Aegilops cylindrica (giminaitis) turi D genom jis nesikrymina su T. durum, kuris D genomo neturi. Dar svarbiau Brassica gentis, nes rapsas (kanola) yra tarp pagrindini GMO augal: Brassica junceae (vikrinis bastutis) turi B genom ir kryminasi su daugeliu Brassica ri, tik ne su Brassica napus (grieiu, rapsu), kuris turi A ir C genomus. Konstruojami ir transgenai, kuriais bt galima paveikti ir paius laukinius augalus, piktoles. Tai labai perspektyvi tyrim kryptis, nes galima bt ivengti besaikio herbicid vartojimo. Yra bent du bdai: transgen mitigacijos (lot. mitis velnus) transgeno pavojus suvelninamas transgen artimai sukabinus su mitigacijos genu, kuris koduoja poym, aling laukiniams augalams;
106 |
galima slopinti piktoli vadinamj antrin dygim. Piktoli (daugumos laukini augal) ypatyb: itstas daugel met dygimas. Taip ivengiama nepalanki met. Jeigu pavykt pasiekti, kad visos piktoli sklos sudygt pirmaisiais metais, visas jas bt galima sunaikinti paprastomis agrotechnikos priemonmis. Bdas ivengti antrinio dygimo iplatinti mutantin abscizo rgties gen. GMO augalai gali plisti grynai mechanikai, pvz., per isibarsiusias sklas. Tai itin aktualu tokiems augalams kaip rapsas (kanola), kurio anktaroms atsivrus, sklos lengvai ibarstomos. Panaudojus vairenio gen SHATTERPROOF, gaunami augalai su neatsiverianiomis arba sunkiai atsiverianiomis anktaromis. Laukas, kuriame buvo prie tai auginami GMO augalai, bna stebimas ir visi atsirad augalai (pvz., bulvs) sunaikinami. Labai svarbi yra transgen ekscizijos (ipjovimo) technologija. Jai apibdinti vartojama santrumpa GURT (nuo genetic use restriction technologies). Ji yra ne tik apsaugin priemon nuo GMO nekontroliuojamo plitimo, bet, svarbiausia, buvo pritaikyta paalinti abejotinus selektyviuosius ymenis, pagal kuriuos sprendiama apie transgeno jungim augalo genom. Paprastai tai bna genai, koduojantys atsparum antibiotikams. Transgen ekscizijai pritaikyta sait-specifin rekombinacija. Tai rekombinacijos bdas, kur vartoja virusai, judrieji genomo elementai, plazmids, kad pakeist buvimo viet. Atpastamos savitos nukleotid sekos, jos kerpamos specifini endonukleazi ir kirpimo vietoje siterpia kuri nors i mint struktr. Pvz., sukurta Cre/lox sistema, ikerpanti transgen prie ydjim arba skloje. Cre/loxP yra i bakteriofago P1. Cre (Causes recombination) tai genas, koduojantis baltym, atliekant sait-specifin rekombinacij; loxP (specifin nukleotid seka, kuri kerpa Cre baltymas; nuo locus of crossing over, X, P1). Transgenas konstruojamas taip, kad bt tarp loxP1 sait: lox Transgenas lox
Cre genas yra sujungiamas su savitu, pvz., sklose aktyviu promotoriumi: Cre Ph3 PhP Kai ateina laikas (pvz., brstanioje skloje, kur PhP fazeolino promotorius), aktyvuojamas Cre, ir jo koduojamas baltymas ikerpa transgen (pagal J. T. Odell et al., 1994). ios technologijos pagrindu sukurti ir vadinamieji terminatoriai. Tai grup technologij, paprastai labai slepiam gen ininerijos kompanij ir sulaukiani oficialaus pasmerkimo, kaip gauti sterilias sklas. Sklos bus tol negyvybingos, kol nebus paveiktos kokiu nors tik firmai inomu veiksniu (cheminiu ar aplinkos), kuris aktyvina gen represori, o is inaktyvina terminatori: Terminatorius slopinamas Signalas Genas represorius aktyvus Signalo nra Represorius neaktyvus Gyvybingos sklos Terminatorius aktyvus Negyvybingos sklos
AUGAL GENETIKA
| 107
Vienas tokios sistemos pavyzdi: barnase genas yra sujungtas su tik sklos dygimui savito cisteinproteinazs (SA-EP) geno promotoriumi; barstar genas sujungtas su iluminio oko atsako geno (HSP) promotoriumi. Neutraliomis slygomis hibridins sklos yra sterilios, nes Barstar inhibitorius nesigamina. Reikia paveikti iluminiu oku, norint suaktyvinti barstar. Jo produkuojamas Barstar inhibitorius slopina barnaz, ir sklos bus gyvybingos. Norint atkurti sklos gyvybingum, reikia inoti, k daryti, bet viskas kompanijos, sukrusios GMO produkt, paslaptis, todl reikalaujama vieumo. Terminatoriaus technologija bent kol kas draudiama.
2.4. Apdulkinimas, apvaisinimas ir nesuderinamumo genetika. Apoptoz augaluose

2.4.1. Apdulkinimas ir apvaisinimas iedadulks perneimas nuo atsivrusios dulkins ant piestels purkos yra vadinamas apdulkinimu. Pavadinimas kils i lotyn kalbos (lot. pollen smulks milteliai, dulks). Apdulkinimas ir apvaisinimas (moterikosios ir vyrikosios gamet susiliejimas) yra atskiri reikiniai, nors vienas seka paskui kit. Tuo galjome sitikinti i pun ir orchidj vyrikojo ir moterikojo gametofit raidos ypatum. Abu ie augal procesai yra labai raikiai atskirti laiko ir raidos vyki. Udelstas apvaisinimas bdingas ne tik orchidjoms, bet ir Fagales eils net 8 eim, tarp j Betulaceae, Fagaceae, Juglandaceae augalams. J piestels apdulkinimo metu bna dar nesubrend, ir tik po 2- savaii ar net po 15 mnesi vyksta apvaisinimas. ie augalai pasiymi dar viena ypatybe. Paprastai dulkiadaigis sklaprad prasiskverbia pro mikropil, o i augal pro chalaz. iedadulks patekimas ant purkos dar negarantuoja, kad btent ji apvaisins gemalo maiel (r. taip pat 2.4.2). Btina, kad iedadulks genotipas subtiliai atitikt moterikojo augalo atitinkamus genus, kurie pasireikia purkos ir piestels liemenlio ir netgi gemalo maielio lstelse (sinergidse), taip realizuojasi vadinamasis S-nesuderinamumas; patekusi ant purkos iedadulk prisitraukt vandens, kurio ji neteko brsdama; iedadulk ileist dulkiadaig, o is piestels liemenliu pasiekt gemalo maiel ir suleist iedadulks turin vien i sinergidi; magnolijn vykt dvigubas apvaisinimas: vienas spermis susiliet su kiauialste, o antrasis su centrine gemalo maielio lstele. Visi ie etapai yra kontroliuojami iedadulks ir moterikojo sporofito gen ir gali nutrkti dl atitinkam gen mutacij. Kai apvaisinimo neskm yra dl sporofito ir megagametofito gen, tai apibdinama kaip moterikasis sterilumas, o kai dl iedadulks gen vyrikasis sterilumas. Tais atvejais, kai ir iedadulks, ir gemalo maielio lstels yra normaliai gyvybingos, bet apvaisinimas nevyksta dl gen ir j produkt neatitikimo, pasireikia S-nesuderinamumas. Neatitinka kirvis koto vyrikojo gametofito genai ir j produktai moterikojo sporofito arba gametofito.
108 |
Dygstanti iedadulk modelinis tyrim objektas. Tirti iedadulks-purkos sveik formaliai atrodo nesudtinga. Reikia iedadulkes pamerkti ant objektinio stiklelio la, kuriame yra purkos iskyr arba net paios purkos ar liemenlio gaballi, dar geriau susmulkint (homogenizuot) i piestels dali. Pagaliau tirpal gali bti pridedama vairi konkrei mediag (cukraus, vitamin, hormon ir pan.). Taip nustatoma, kurios mediagos skatina, o kurios slopina iedadulks dygim. Sudtingiau, bet svarbiau tirti dulkiadaigio ir spermi sveik su moterikuoju sporofitu ir gametofitu in vivo. Skm labai priklauso nuo objekto. Kaip paparastai biologijoje, pirmiausia iekoma modelini augal ir mutant. Sunkiausia yra stebti dulkiadaigio/vegetatyvins lstels ir spermi sveik su gemalo maielio lstelmis, kurios yra sunkiai prienamoje vietoje. Tad iai sveikai tirti modeliniu augalu tapo Torenia fournieri (Scrophulariaceae .). Dalis jo gemalo maielio ilenda pro mikropil (2.7 pav.,C), todl galima atlikti vairias manipuliacijas su sinergidmis, kiauialste ir net centrine gemalo maielio lstele: izoliuoti gemalo maiel, panaudoti lsteli ablacij ultravioletiniu lazeriu (r. toliau). Ablacija (lot. ablatio atmimas, nuneimas) biologijoje lsteli arba j dali tikslinis sunaikinimas, daniausiai lazeriu. Sukurtas ir taip pat naudojamas genetins ablacijos metodas (2.4 intarpas).
2.4 intarpas. Genetin ablacija Genetin ablacija tai lsteli sunaikinimas panaudojant citotoksinius produktus koduojanius genus, sujungtus su savitais, tik konkreiose lstelse ar audiniuose pasireikianiais genais. is tyrimo metodas sukurtas Goldbergo (R. B. Goldberg) laboratorijoje ir konkreiai pritaikytas tirti vyrikojo gametofito raid. Btina turti savitus tik konkreiose lstelse pasireikianius promotorius (r. 2.10 pav.). Kaip minta, tai geno dalis, kuri atpasta ir su ja jungiasi reguliacini gen koduojami transkripcijos veiksniai. Gen ininerijos metodais prie tokio promotoriaus prijungiamas genas (jo baltym koduojanti dalis), kurio produktas yra citotoksinas. Daniausiai naudojami patogenini mikroorganizm citotoksinus koduojantys genai: difterijos toksino A grandins genas; bakteriofago T1 ribonukleazs genas; barnazs genas. Pastarasis itin populiarus, nes taikomas gauti vyrikj sterilum. Kaip minta, tai citotoksikas baltymas, ribonukleaz, vadinama barnaze, kuri produkuoja bakterija Bacillus amyloliquefaciens u lstels rib, kad apsisaugot nuo kit mikroorganizm. Lstels viduje B. amyloliquefaciens produkuoja barnazs inhibitori, kuris pavadintas barstar baltymu. Svarbiausia surasti savitus promotorius. Pvz., vairenio AtGEX1 promotorius yra aktyvus spermiuose, bet ne jo pirmtake generatyvinje lstelje, bet taip pat aktyvus sklapradyje, aknyse ir lapo ioteli lstelse; AtGEX2 promotorius yra aktyvus tik spermiuose; AtVEX1 promotorius aktyvus tik vegetatyvinje lstelje vlyvoje iedadulks raidos stadijoje ir pan. Metodas patogus tuo, kad galima sunaikinti lsteles lazeriu sunkiai prieinamose vietose, nepaeidiant kaimynini lsteli. Jis skmingai pritaikytas tirti tapeto lsteli reikm mikrogametofito raidai. Jas sunaikinus, pasireikia vyrikasis sterilumas. Metodo trkumas: juo negalima nustatyti gen, kurie nulemia sunaikintos lstels funkcij. iam tikslui naudojami gen ijungimo metodai (antiprasmin RNR, miRNR, vadinamosios. knock out mutacijos).
AUGAL GENETIKA
| 109
Kai kurie augalai vertinami dl ilgo piestels liemenlio (Nicotiana tabacum L.) arba heterospermijos (Plumbago zeylanica, N. tabacum). Pats iedadulks dygimas ir dulkiadaigio augimas yra unikali modelin sistema sprsti esmines ne tik augal, bet ir apskritai gyv organizm lstels biologijos problemas, tarp j sveik lstel-lstel; lsteli atpainimo procesus, kurie iedadulkse pasireikia kaip S-nesuderinamumas arba, atvirkiai, suderinamumas; sveik augalas-vabzdys; lstels sienels sintez ir degradavim; lstels organeli ir pai lsteli krypting migracij; veiksnius, kurie skatina arba slopina lstels augim, tarp j ir genotoksinius; numatyt lsteli t (sinergidi ir paties dulkiadaigio/vegetatyvins lstels); augimo krypties reguliacij. Tai dar viena unikali iedadulki ypatyb, kuri galima lyginti tik su kai kuri vienalsi gryb hifo augimu. Dulkiadaigis tai viena itsusi lstel. Daug kas yra mats i tabako (Nicotiana tabacum L.) iedo ilindus piestels liemenl. Jis siekia net 4 cm, ir tok keli turi veikti dulkiadaigiu virtusi vegetatyvin lstel. Dulkiadaigiu tartum vamzdiu link gemalo maielio pasyviai teka generatyvin lstel arba du spermiai (priklausomai nuo augalo ries dvilstis ar trilstis vyrikasis gametofitas, r. 2.3.3 sk.). Tad dulkiadaigio lstels augimas yra rykiai poliarizuotas, vienakryptis. iedadulki hidratacija ir sveika purka-iedadulk. Skiriami du purkos tipai sausa ir lapia. Pastaroji iskiria daug vairi mediag (hormon, vitamin, cukr, lipid ir kt.), kurios skatina iedadulki dygim. Miinio sudtis priklauso nuo augalo ries. Taiau sveika tarp purkos ir iedadulks ne tokia paprasta, kaip sivaizduota. Purkos paviriuje yra pirto pavidalo lstels papils (2.12 pav., A ir C). Jos paviriniais baltymais atpasta sau tinkamas ar netinkamas iedadulkes. Nepriklausomai nuo purkos tipo, vyksta du procesai: iedadulk prisitvirtina prie purkos; prisisiurbia vandens. Lelij (Lilium longiflorum Thunb.), kurios irgi yra modelinis augalas tirti apsivaisinimo procesus, iedadulkes pritvirtina pektinai ir specialus daug cisteino turintis maos (madaug 9 kDa) molekulins mass baltymas adhezinas. ios mediagos ir toliau yra orientyras dulkiadaigio augimo krypiai piestels liemenliu. Lelij purkoje aptiktas ir chemotropinis (augal augimo krypt reguliuojantis) baltymas (9,9 kDa), pavadintas chemocianinu dl mlynos spalvos. Jo aktyvum sustiprina adhezinas. Vegetatyvins lstels membranoje susidaro vandeniui pralaids kanalliai. Juos sukuria akvaporinai. Labai svarbs l1yra fermentai, kurie skaido iedadulks lipidus. Tarp j bent eios lipazs ir daug Gly turintys lipidus prisijungiantys saviti baltymai oleozinai. Mintus fermentus koduojani gen mutacijos sukelia vyrikj sterilum. Labai savotikai pasireikia vairenio mutantas fiddlehead (angl. uriestas burlaivio priekis; taip uraitytas ir lapo laktas). iedadulks gali dygti ir ne vietoje, ant io mutanto lap. Taip atsitinka todl, kad iedadulks prisisiurbia vandens ant lapo dl pakitusios lap lsteli sienels sandaros. Tai atsitik dl sutrikusios lipid apykaitos: nesintetinama -ketoacil-CoA sintaz. Purkos savybs lapia ar sausa nulemia tai, kaip iedadulks dulkiadaigis prasiskverbia piestels liemenl. Kai purka yra sauso tipo, dygstanti iedadulk elgiasi ag110 |
resyviai: dulkiadaigis tiesiog siskverbia papils lstel, o pro j patenka piestels liemenlio vid. lapi purk dengia lstels, kurios suirdamos ilaisvina lipnias iskyras. Jose yra baltym, lipid, polisacharid, flavonoid ir kt. mediag. iedadulk tiesiog prilimpa prie tokios purkos. Tarp kit baltym, kuriuos koduojantys genai aktyvinami purkos ir liemenlio lstelse, yra ir PR (nuo angl. pathogen(esis) related) baltymai. Jie saugo augal nuo vairi patogen, taip pat nuo stresus sukeliani veiksni. J reikm iedadulkms matoma pagal tai, kad iuos baltymus koduojani gen mutacijos maina iedadulki gyvybingum.
B
H+ ClK+
C
ET mikrofilamentai mikrovamzdeliai mitochondrijos H+ K+ 2+ Ca H+ ClPslels su lstels spermis RET Goldio sienels pradmenimis vegetatyvinis kompleksas branduolys
D1
kalozs kamtis
vakuol
D2
E F H 2.12 pav. Nuo papils lsteli (A ir C) sveikos su iedadulke (B), iedadulks dygimo ir dulkiadaigio judjimo piestels liemenliu (D) iki prasiskverbimo pro mikropil (F), susiliejimo su sinergide ir plik spermi (G ir H):
d iedadulk; p papils lstel; ET endoplazminis tinklas; RET raukltasis ET; mi mikropil; E in vitro sklapradio gaballis vilioja dygstanias iedadulkes; F viruje WT, o apaioje magatama mutantas: dulkiadaigis nepataiko mikropil; G spermi prasiskverbimas sinergid (1), sinergids tis (2) ir pliki spermiai (2, 3); H dalis vyrikojo gemalo vieneto, kur sudaro spermiai su vegetatyvins lstels branduoliu ir citoplazmos gijomis (i vieno galo ilga citoplazmos gija, o i kito galo dalis antrojo spermio) (A ir B pagal A. F. Edlund et al. Plant Cell. 2004, Vol. 16, Sup. 8497; C A. Kachroo et al. Plant Cell 2002. Vol. 14, Sup. 227238; D L. C. Boavida et al. International Journal of Development Biology. 2005, Vol. 49, P. 615632; E T. Higashiyama et al. Science. 2001, Vol. 293, P. 14801483; F K. Weterings, S. D. Russel. Plant Cell. 2004, Vol. 16, Sup. 107118; G ir H pagal S. D. Russel. Boletin de la Sociedad Argentina de Botanica. 2003, Vol. 38, P. 349356).
AUGAL GENETIKA
| 111
dygstanios iedadulks dulkiadaig, paskui jo virnin gal pereina visas vegetatyvins lstels turinys su plduriuojaniais jame spermiais (2.12 pav, D). Dulkiadaigis vis tsta ir tsta, kol pasiekia gemalo maiel. Jis imtus-tkstanius kart virija iedadulks diametr. Kalozs kamiai kaskart atskiria citoplazm nuo itutjusio vamzdio (2.12 pav., D). Kaip minta (2.3.3 sk.), kalozs sintezs ferment -1,3-glukansintaz koduoja tik iedadulkei savitas genas CAL S5. Dulkiadaigyje veikia du skirtingi -glukano genai: -1,3-glukankalozs ir -1,4-glukanceliuliozs. Dulkiadaigis auga labai greitai. Kukurz 1 cm/val., visam tabako piestels liemenliui veikti reikia 26 30 val. Dulkiadaigio augimo krypties valdymas piestels liemenlyje. Sporofito vaidmuo. Dulkiadaigis kryptingai auga link gemalo maielio tarplsteline mediaga (matriksu), kuri upildo piestels liemenlio vamzdio vidin ertm. Joje daug polisacharid, glikolipid ir glikoprotein. Sveikai sporofitas-dulkiadaigis ir dulkiadaigio augimo krypiai reguliuoti ypa reikmingi glikoproteinai, kurie yra signalo molekuls, gidai nustatyti dulkiadaigio augimo krypt. ie baltymai ir juos sintetinanios lstels pavadintos TTS (angl. transmitting tract signal). Tokia savybe pasiymi du tabako arabinogalaktanai TTS1 ir TTS2. Nustatyta, kad lelij dulkiadaigio augimo krypt nurodo pektinas ir 9 kDa LTP (angl. lipid transfer protein) baltymas. TTS baltymai yra liemenlio vidinio epitelio lsteli paviriuje ir paioje tarplstelinje mediagoje. Tiesiog avi subtiliai suderinta pagal laik sporofito (piestels/liemenlio) gen, kurie reguliuoja dulkiadaigio augimo krypt, raika. Kuo gilyn skverbiasi dulkiadaigis, tuo vis naujesni vidinio epitelio lsteli paviriuje aktyvuojami TTS baltymai. Pagal TTS baltym glikozilinim (angliavandenio, daniausiai galaktozs, prijungim) liemenlio epitelio lstelse susidaro gradientas gemalo maielio kryptimi. Juo ir yra nustatoma dulkiadaigio augimo kryptis. Jeigu TTS baltymas yra deglikozilinamas, jis nustoja bti atraktantu dulkiadaigio virnlei. Serija gen, kuri produktai valdo dulkiadaigio augimo krypt, pavadinti POP (angl. pollen-pistil 1, 2, 3). Vienas i j koduoja POP2 transaminaz, kuri reguliuoja (skaido) vienos i signalini molekuli GABA kiek sporofito TTS lstelse ir terplstelinje mediagoje. Mutanto pop2 iedadulks dulkiadaigis auga, raitosi sklapradyje, bet negali patekti pro mikropil. GABA yra gana plaiai paplitusi 4- anglies atom ir neeinanti baltym sudt aminorgtis, pirmiausia itirta kaip neurotransmiteris (irgi signal neiklis). Palyginti maa molekulin mas ir tai, kad i aminorgtis neeina baltym sudt, labai tenkina signalo molekuls funkcij. Atrandamos vis naujos signalins molekuls. TTS lstels, pasirodo, produkuoja ir kit universali signalo molekul NO (azoto monoksid). GABA, NO yra dulkiadaigio navigacijos sistemos, besitsianio gradiento iki pat sklapradio ir gemalo maielio, dalis. Kai kurie signalai yra saviti riai. Tuo sitikinta, kai buvo kryminami vairi Arabidopsis ar Torenia ri augalai. Dygstanios kai kuri Arabidopsis ri iedadulks sugeba prasiskverbti A.thaliana audinius, bet neveikia megagametofito. Dulkiadaigio augimo krypties valdymas. Megagametofito vaidmuo. Pasieks sklaprad dulkiadaigis auga tolyn sklasaiiu (funikulu), tiesiog liauia juo, kol pasiekia mikropil, prasiskverbia gemalo maiel ir suleidia savo turin su spermiais vien i sinergidi. Mutanto magatama dulkiadaigis auga normaliai, taiau praauna pro al kit pus nuo mikropils (2.12 pav., F). Taip buvo nustatyta, kad sklapradyje veikia dviej tip signalai dulkiadaigiui:
112 |
siuniami sklasaiio (tai vis dar sporofito lstels); siuniami mikropils-gemalo maielio. Pastaraisiais sitikinta, kai normalus (WT) tipas buvo palygintas su pop2 mutantu. Normalios (WT) iedadulks puikiausiai pataiko pop2 mutanto gemalo maiel, o kaip minta, pop2 mutanto iedadulks niekaip nesugeba to padaryti. Taip nustatoma POP2 geno raikos vieta. Jis reikiasi dulkiadaigyje, o jo koduojamas fermentas skaido GABA, kuri sintetina sporofito TTS lstels. Antra vertus, akivaizdu, kad signalus siunia btent gemalo maielio lstels (2.12 pav., E). Mutanto pop2 dulkiadaigio virnl i signal priimti nesugeba. Kokios gemalo maielio lstels (j i viso septynios) ir kokius signalus siunia, bent i dalies nustat japon mokslininkai (E.T. Higashiyama et al., 2001), pritaik ablacijos metod Torenia fournieri gemalo maielio lstelms. Signalus siunia sinergids. Kai lazeriu sunaikinamos abi sinergids, signalas dingsta, bet palikus nesunaikint vien sinergid, to pakanka generuoti dulkiadaigio atrakcijos signal. Sinergidi tis, kuri pasireikia normaliame gemalo maielyje, apsaugo nuo polispermijos. Daugiau dulkiadaigi gemalo maiel prasiskverbti negali. mutanto fer (feronia nuo etrusk vaisingumo deivs Feronijos) gemalo maiel gali patekti daug dulkiadaigi, o sinergids ilieka gyvybingos. Fagales . augal dulkiadaigi skaiiaus reguliacija vyksta kitaip: per ilg laiko tarpsn tarp apdulkinimo ir apvaisinimo degraduojami visi piestels liemenl patek dulkiadaigiai. Ilieka tik vienas.
Mutant srn (sirene) ir gametophytic factor 2 sinergids irgi neva kaip ir feronia. Taiau ie genai koduoja skirtingas funkcijas. Mutant feronia ir sirene genai susij su sinergidi siuniamais signalais; sirene mutanto sinergids nepraranda galios patraukti iedadulkes. GAMETOPHYTIC FACTOR 2 genas koduoja DnaJ aperon, kuris yra lokalizuojamas mitochondrijose ir susijs su numatyta sinergidi timi. Kokius signalus siunia sinergids ir kokie receptoriai juos priima labai svarbus klausimas. Signal primimas siejamas su maosiomis Rho GTPazmis ir receptorinmis proteinkinazmis, o taip pat nedidels mass daug cisteino turiniais baltymais, kurie veikia ir kaip antimikrobiniai baltymai, todl vadinami AMP. iai grupei baltym priklauso ir defensinai, S-nesuderinamumo baltymas SCR/SP11. Kol kas geriausiai ie riai specifinius signalus siuniantys gemalo maielio baltymai itirti kukurz. J nustatyta keletas: ZmES1-4 (nuo Zea mays EMBRIO SAC1-4), ZmEA1 (nuo Zm EGG APPARATUS). ie baltymai sintetinami sinergidse ir gabenami link mikropils. Po apvaisinimo daugiau ie baltymai neaptinkami. Keletas gen koduoja proteazes, kurios kaip ir minti baltymai padeda ivengti polispermijos.
Dulkiadaigio augimo krypties valdymas. Mikrogametofito vaidmuo. Signal perdavimas ir primimas visada yra dvipusis reikinys. Apie 8 % gen, kurie pasireikia spermiuose, koduoja transmembraninius arba sekretuojamus baltymus, todl gali bti naudojami ryiams ir signalams tarp lsteli. Prasiskverbusi gemalo maiel dulkiadaigio lstel irgi va. Sinergidi ir vegetatyvins lstels (dulkiadaigio) DNR suskaidoma nukleazi. Iki pat dulkiadaigio suirimo spermiai pasyviai juda link sklapradio, bet iam suirus jie lieka nuogi(2.12 pav., G). Spermio branduolys nukreipiamas kiauialst ar centrin gemalo maielio lstel. Prie tai vyksta labai svarbus augalo paveldimumui, bet dar nepakankamai giliai itirtas, reikinys. Sinergidje suskaidoma visa spermio citoplazma kartu su visomis lstels citoplazmos struktromis, kurios turi DNR. tai kodl galioja taisykl: palikuonis branduol paveldi i tvo ir motinos, o citoplazmos paveldimumo struktras tik i motinos.
AUGAL GENETIKA
| 113
Bet ir augalams i taisykl galioja su labai didelmis ilygomis. Priklauso nuo augalo ries. Kartais, kaip nukrypimas, o daug augal ri ir numatytai, branduolys perneamas su visa citoplazma arba jos dalimi, o kai kuri augal, atvirkiai, paalinamos kiauialsts citoplazmos genetins struktros.
Spermiai pasyviai nukeliauja didel keli, bet vis laik bna, kas juos lydi. Tai Ca2+ jon gradientas ir citoskeletas/motoriniai baltymai. Netgi sinergidje, kai spermiai yra nuogi, susidaro dvi motorinio baltymo aktino karnos, kuriomis vienas spermis palydimas iki kiauialsts, o kitas ligi centrins lstels.
Citoskeleto reikm yra daugiapus: jis nulemia gametofito lsteli polikum, virnin (apikalin) dulkiadaigio augim, lstel-lstel atpainim ir signal perna, pagaliau organeli, tarp j ir lstels branduolio, judesius ir tarpusavio ryius. Citoskelet sudaro: motorini baltym (dulkiadaigyje pirmaeiliai tai aktino) plaueliai danai susijung ilgok virv, sugebdami susitraukti-isitiesti jie suteikia lstels struktroms judes, o virv judjimo krypt; mikrovamzdeliai sudaryti i baltym tubulin. Jie yra ne tik atramos, bet jais kaip bgiais keliauja motoriniai ir signal pernaos baltymai. Mikrovamzdeli depolimerizacija inhibitoriais (kolchicinu, oryzalinu) nesustabdo dulkiadaigio augimo. Jis nutrksta tik kai panaudojami aktino inhibitoriai (citochalazinas D, latrunkulinas B). Bent magnolijn spermiai yra fizikai sujungti vienas su kitu ir su vegetatyvins lstels branduoliu sudarydami vadinamj vyrikj gemalin vienet. jungin ir spermi form lemia mikrovamzdeliai ir motoriniai baltymai (r. 2.6 pav. ir 2.12 pav., H).
[Ca2+] jon gradientai. Vienu i citoskelet stabilizuojani veiksni dulkiadaigyje/vegetatyvinje lstelje yra Ca2+ jonai. Kai kurie kiti citoskeleto sandar keiiantys veiksniai (kalmodulinas, profilinas, vilinas) irgi veikia citoskeleto struktr reguliuodami Ca2+ jon koncentracij. iedadulks dygimui ir dulkiadaigio augimui Ca2+ jon reikm daugiaplan, bet viena yra bendra. [Ca2+] gradientas sukuria poliarizuot augim ir reguliuoja vienakrypt jo pobd t ypatyb, kuri yra iskirtin dulkiadaigiui: didel Ca2+ koncentracija vis laik yra dulkiadaigio virnlje apikaliniame gale, nukreiptame gemalo maiel. Tuo sitikinta ir gyvose lstelse, kai buvo panaudotas specialus naujos kartos fluorescuojantis daas geltonasis kameleonas. Tai savitas tik Ca2+ indikatorius, chimerins sandaros, sudarytas i aliojo fluorescuojaniojo baltymo (angl. santrumpa GFP) ir Ca2+ surianiojo baltymo kalmodulino; Ca2+ jon antpldis pasireikia ir spermio susiliejimo su kiauialste metu; kai Ca2+ kanalai slopinami Gd3+, spermio branduolys vis dar gali susilieti, bet kiauialst nepatenka spermio citoplazma; kai kuri augal Ca2+ koncentracija purkos lstelse lemia S-nesuderinamum.
Heterospermija. iedadulkje susidaro ne vienas, o du spermiai. Be to, ir j paskirtis skirtinga: vienas apvaisina kiauialst, o kitas susilieja su centrine gemalo maielio lstele. Tad visikai suprantamas klausimas, ar ie du spermiai yra lygiaveriai. Morfologini skirtum tarp j kaip ir nepastebta, todl manyta, kad jie tapats. Ar taip yra i ties, nra lengva nustatyti, ir vl pasinaudota augal vairove. Dar 1948 m. buvo atkreiptas dmesys papildomj B chromosom. Ji yra viena i ankstyvosios heterospermijos prieasi, nes skirtumai tarp spermi atsiranda, kai tik iedadulkje vyksta antroji mitoz ir susidaro dvi generatyvins lstels. B chromosomos paskirstomos dukterinms lstelms netolygiai: viena lstel paveldi B chromosom, o kita jos negauna. Taiau B chromosomos paskirstymas yra nereguliarus reikinys, todl skirtumais tarp spermi heterospermija rimtai susidomta tik tada, kai Raselui (S. D. Russell)
114 |
1989 m. pavyko nustatyti, kad heterospermija yra bdinga plumbagiui (Plumbago zeylanica), ir ilgai manyta, kad is augalas yra iuo atvilgiu unikalus. iuo metu sraas augal, kuriems nustatoma heterospermija, pastoviai didja: tai paprastasis kukurzas (Zea mays L.), bastutis (Brassica rapa L.) ir rapsas (B. napus L.), dailioji gerbera (Gerbera jasmonii Bolus ex Hook.), kardelis (Gladiolus gandavensis), darelin petunija (Petunia hybrida Vilm.), darinis pinatas (Spinacia oleracea L.), paprastasis tabakas (Nicotiana tabacum L.). ie augalai danai paklina augal genetik ir lstels biolog rankas. Daugelis augal iki iol iuo atvilgiu netyrinti. Kyla klausimas ir dl pun, kuri iedadulkje irgi isivysto du spermiai, bet tik vienas i j apvaisina kiauialst. Kuris ir kokiomis savybmis jis pasiymi? Plumbagio heterospermija atsiranda vlai, jau mintame vyrikajame gemalo vienete (r. 2.6 pav., A). Vienas spermis jungiasi su vegetatyvins lstels branduoliu, o kitas ne. Jis jungiasi su kitu spermiu. iuos spermius pavyko atskirti elektroforezs bdu arba mikromanipuliatoriumi, ir tada paaikjo, kad jie i esms skiriasi. Tas spermis, kuris palaiko ry su vegetatyvins lstels branduoliu, turi daug mitochondrij, bet maai plastidi. Jis susilieja su kiauialste. Antrasis spermis, atvirkiai, turi maai mitochondrij, bet daug plastidi ir susilieja su centrine lstele. Tad heterospermija nulemia skirtingas spermi funkcijas. Labai doms tyrimai atlikti su tabaku (N. tabacum). Kaip jau minta, io augalo piestel turi labai ilg liemenl, kuris buvo padalintas dalis tada, kai iedadulk pradjo dygti ir dulkiadaigis judti gilyn liemenliu. Paaikjo, kad i pradi spermiai nesiskiria. J heterospermija atsiranda prie pat apvaisinimo pradi. Be to, tabako spermiai skyrsi ir parametrais. Tas tabako spermis, kuris jungsi su vegetatyvins lstels branduoliu, buvo smulkesnis. Ar neatsiranda ir kit augal heterospermija prie dulkiadiagio raidos pabaig, dar teks isiaikinti. 2.4.2. Nesuderinamumo genetika. Sudtingi S- lokusai ir haplotipai Jau daug deimtmei genetikams tenka sprsti problem, kuri atsirado dl dviej viena kitai lyg ir prietaraujani augal ypatybi: dauguma sausumos augal yra hermafroditai. Ant to paties augalo susidaro arba atskirai vyriki ir moteriki iedynai/iedai, pvz., kukurz, kuri virnje yra vyrikasis iedynas luotel, o apaioje, lap pamaktse, moterikieji iedynai, arba kur kas daniau tame paiame iede yra ir vyrikieji, ir moterikieji lytiniai organai. antra vertus, madaug tik apie 20 % augal ri yra privalomai (obligatiniai) savidulks. J dauginimosi sistema yra vaisa (inbrydingas). Augal i dauginimosi sistema vadinama savidulka. Apie 33 % augal ri yra tarpins tarp savidulkos ir prieingos jai dauginimosi sistemos krymadulkos (arba kitaip autbrydingo). Krymadulki augal fakultatyvi savidulka daniausiai atsiranda dl nepalanki ydjimo slyg ir paprastai pasireikia tik ydjimo pabaigoje, lyg bt pasiteisinimas, kad kitaip nieko neieina. Kaip hermafroditams augalams pavyksta ivengti savidulkos, sudaro nesuderinamumo genetikos esm.
AUGAL GENETIKA
| 115
Jos tyrimai atskleid sudting lokuso genetin sandar, haplotipus, j sveik. Skiriami du pagrindiniai nesuderinamumo tipai: heteromorfinis, lemiamas iedo ir iedadulki morfologini bei fiziologini ypatum; homomorfinis, kai iedadulks pagal savo morfologines-fiziologines savybes nesiskiria, o iedadulki suderinamum ar nesuderinamum lemia specifini S-lokuso koduojam baltym sveika. 2.4.2.1. Heteromorfinis nesuderinamumas. Struktriniai ir fiziologiniai savidulkos barjerai. Selektyvusis apvaisinimas Struktriniai ir fiziologiniai barjerai. Yra daug prieasi, dl kuri hermafroditai augalai negali apsivaisinti savo pai iedadulkmis. ios prieastys, nors i esms nulemiamos genetini veiksni, taiau nereikalauja ypatingos gen ir j produkt sveikos, kaip tai yra dl S-lokuso lemiamo augal nesuderinamumo (r. toliau). J esmei suvokti pakanka fiziologini-morfologini augalo tyrim. Tai iedo sruktros ir ydjimo ypatumai, kurie tampa klitimi savidulkai. Galima iskirti du pagrindinius struktrinius-fiziologinius barjerus savidulkai: dichogamij, kai to paties iedo kuokeliai ir piestels subrsta skirtingu laiku, ir pagal tai, kas pirmiau subrsta, skiriama: protandrija (gr. protos pirmas + aner vyras), kai dulkins subrsta anksiau nei piestels, bdinga katilliams, okaroms, alavijams, kiauliapienms ir kt.; protogonija (gr. protos + gyne moteris, pav.), kai atvirkiai, pirmiau subrsta piestels, o kuokeliai vluoja; tok iedyn turi gyslotis (Plantago media L.); heterostilij lemia iedo struktros skirtumai. Kuokeliai ir piestels liemenlis bna skirtingo ilgio. Aptikta 30-yje augal eim, pvz., bdinga grikiams, raudoklei (Lythrum), raktaolei (Primula vulgaris Huds.). Toje paioje populiacijoje pasitaiko augal su trumpais ir su ilgais piestels liemenliais, kaip ir su ilgais arba trumpais kuokeliais. Raudokls populiacijose pasitaiko net 3- tip augal: ilgais, vidutiniais (lygiais kuokeliams) ir trumpais piestels liemenliais. Neabejotinai skirtumus lemia genetiniai veiksniai: trumpas piestels liemenlis yra dominuojantysis poymis. Heteromorfinio nesuderinamumo genetika dar, matyt, pateiks daug netiktum. Netikta buvo tai, kad genai, kurie lemia heteromorfin nesuderinamum, panaiai kaip Snesuderinamumo genai (r. toliau), sutelkti vien viet, sudaro vadinamj supergen. Toks supergenas yra nustatytas ir griki heterostilijai. Supergeno lokuse yra net 5-ri genai: G lemia liemenlio ilg; IS liemenlio nesuderinamum; IP iedadulks nesuderinamum; P iedadulks dyd; A kuokelio ilg. Augal, kuri piestels liemenlis trumpas, bet ilgi kuokeliai (vad. thrum), genotipas yra toks: -GISIPPA/giSiPpa heterozigotinis ir dominuojantysis, o augal ilgais piestels liemenliais, bet, atvirkiai, trumpais kuokeliais (vad. pin) genotipas recesyvusis homozigotinis:
-giSiPpa/giSiPpa.
116 |
Pasitaiko ir dichogamijos arba heterostilijos paeidim. Krymadulkis augalas apsivaisina savo iedadulkmis. Toki paeidim prieastys vairios, gali bti ir genetins, nulemtos mutacij, bet kur kas daniau fiziologins dl aplinkos slyg pokyi. Heterostilija pagal apsivaisinimo pobd netgi skirstoma legitimin (teist, t. y. krymadulk) ir ilegitimin (neteist), t. y. savidulk. Griki, kaip ir kit tirt augal, krymadulk ir nesuderinamum gali pakeisti tolimoji hibridizacija. Pvz., dviej griki ri (Fagophyrum esculentum x F. homotropicum) hibridas yra savidulkis. Jo kuokeliai ir piestels yra madaug vienodo ilgio (2.13 pav.,A ir C) ir dl gen rekombinacijos lokuso viduje atsiranda naujas supergenas, pavadintas Sh. Pakits ir dominavimo pobdis: S > Sh > S.
A morfotipai: a) pin trumpi kuokeliai/ilgos piestels; b) thrum ilgi kuokeliai/trumpos piestels; c) vienodai ilgi kuokeliai ir piestels (F. esculentum F. homotropicum hibridas); B morfotip thrum ir pin, o taip pat hibrido genotipai bei suderinamumo /nesuderinamumo pasireikimas (r. tekst; pagal K. Matsui et al. New Phytologist. 2003, Vol. 159, P. 701708).
2.13 pav. Heteromorfinis nesuderinamumas. Griki (Fagopyrum esculentum Moendr.) heterostilija:
domiausia tai, kad paveldimai savidulkiai augalai aptikti tarp abiej grupi (thrum ir pin) augal. Tai IS/iS ir IP/iP gen mutacijos. Mutacijos yra antroji prieastis, kuri gali keisti savidulkos-krymadulkos pobd. Griki S supergenas nra vienintelis itirtas. Panaiai paveldima heterostilija ir Primula vulgaris. S-lokusas yra paveldimas kaip vienas vienetas, nors jame yra maiausiai 7 genai.
AUGAL GENETIKA
| 117
Toje paioje gentyje, pvz., Narcissus, gali bti vairios rys: heteromorfins, homomorfins ir netgi savidulks. Tai irgi mutacij rezultatas. Netgi toje paioje Narcissus ryje gali bti vairios populiacijos ar netgi augalai pagal nesuderinamumo pasireikim. Labai domus objektas heteromorfiniam nesuderinamumui tirti gali bti Piet Afrikos augalai Pentanisia angustifolia Hochst ir P. prunelloides Eckl. et Zeyh. (Rubiaceae). Abiejose io augalo ryse pasireikia vairov ne tik pagal piestels liemenlio ilg: ilgais (L long) arba trumpais (S short), bet ir pagal iedadulki spalv (atitinkamai, geltonos arba mlynos) ir egzinos form. Atrandami vis nauji heteromorfinio nesuderinamumo tipai (2.5 intarpas). Bdai iplatinti iedadulkes labai vairs. Prie struktrini prisitaikym krymadulkai priskiriama ir vairi, kartais labai mantri iedo forma, iskyros, kvapai privilioti gyvnus (zoofilija). Pagal tai, kokie gyvnai platina iedadulkes, is platinimo bdas turi konkreius pavadinimus: ornitofilija (paukiai) ir pan., bet daniausiai iedadulkes platina vabzdiai (entomofilija). iedadulks, ypa iorinis j apvalkallis egzina, turi daug visoki prisitaikym platinti iedadulkes, ypa vjui (anemofilija). iedadulkes gali platinti ir vanduo (hidrofilija). Prisitaikymas paskleisti iedadulkes yra labai vairus. Vien tik apsidulkinimo padedant vjui arba vabzdiams yra didel vairov. Pavyzdiui, liucernos (Medicago sativa) ir dobil iedadulks negali patekti ant purkos, kol vabzdys neatidarys iedo dalies laivelio. Be to, ant liucernos purkos paviriaus susidaro apsauginis sluoksnis, dl kurio to paties iedo iedadulks negali dygti. is sluoksnis yra suardomas vabzdi, atneani svetimas iedadulkes. Koks yra iedadulki paskleidimo bdas augalo ypatyb, kaip ir dichogamija arba heterostilija. Tai yra paveldimos ypatybs, bet ios savybs nesulaukia ypatingo genetik dmesio. Visikai pagrstai labai intensyviai ir produktyviai tiriama sveika tarp piestels purkos ir ant jos patekusios iedadulks. Tai, kad ant purkos pateko iedadulk, dar negarantuoja, kad vyks apsivaisinimas. iedadulks dygim pasirinktinai gali skatinti arba slopinti purkos iskiriamos mediagos, purkos ir piestels liemenlio lsteli sveika su iedadulke ir jos dulkiadaigiu. i sveika tiesiogiai vyksta tarp iedadulks purkos gen produkt. Selektyvusis apvaisinimas. Labai seniai, dar XX a. pradioje, o gal dar ir anksiau, buvo pastebta, kad augal apsivaisinimas nra visikai atsitiktinis, kaip tai turt bti pagal Mendel, o pirmenyb gali bti teikiama vieno ar kito genotip iedadulkms. io reikinio praktine svarba sitikinta dar apie 1900 m. Paaikjo, kad veisiant pramoninius vienos veisls sodus, mediai pasidaro maai vaisingi, nors sudaromos visos slygos apsivaisinti kaimynini augal iedadulkmis. Kad sodas gerai dert, reikia pasodinti kit veisli (specialiai parinkt apdulkintoj) medi. Vadinasi, pirmenyb teikiama tam tikr genotip (tik ne savo) iedadulkms. Vliau is reikinys buvo pavadintas selektyviuoju apvaisinimu, o dar vliau nustatyta, kad jis bdingas ir gyvnams, tik realizuojamas skirtingu bdu. mogaus, gyvn apsivaisinimo metu dalyvauja deimtys milijon spermatozoid, tarp kuri vyksta nirtinga konkurencija (atranka), ir tik pats greiiausias, energingiausias, veiks skaidrij zon ir moterikosios lytins lstels apvalkall, j apvaisins. Kai kuri augal, ypa orchidj, apvaisinimas bent i dalies panaus gyvn. Ant i augal purkos patenka ne paviens iedadulks, o polinijai visas dulkializdis su sulipusi iedadulki mase. Visos iedadulks dygsta vienu metu, ir tarp j vyksta tokia
118 |
pat konkurencija kaip ir tarp gyvn spermatozoid. vendr, viri ir kai kuri kit augal ant purkos patenka tetrados 4-i iedadulki darinys, atsirads po mejozs.
2.5 intarpas. Nauji heteromorfinio nesuderinamumo tipai inversiostilija, enantiostilija, fleksistilija. Kas dar? iuo metu heterostilija (gr. heteros skirtingas + stylos stulpas, kolona) yra geriausiai genetikai itirtas heteromorfinio nesuderinamumo tipas. Tai, kad u sivaizduojamo ir hibridologine analize patvirtinamo paprasto monogeninio heterostilijos paveldjimo slypi sudtingas supergenas, paskatino genetikus tirti heteromorfin nesuderinamum apskritai. Atrasti nauji io nesuderinamumo tipai. Visi jie siejami su piestels liemenlio (style) ypatybmis. Enantiostilijai (gr. enantios prieingas) bdingas veidrodinis piestels liemenlio nukrypimas kair (L-tipas) arba dein (R-tipas, nuo angl. left, right). Bdinga labai didel augal ri ir netgi pavieni augal vairov. Ji gali pasireikti skirtingu L ir R ied isidstymu iedyne (be to, atsitiktiniu A1 arba neatsitiktiniu A2), tarp iedyn (B), ar net tapti dimorfiniu, tarp augal (C):
A1 Solanum rostratum
A2
B Monochoria australasica
C Cyanella alba Wachendorfia paniculata
Isamesni enantiostilijos genetini tyrim kol kas nra. Kaip ir heterostilijos atveju, hibridologin analiz rodo tik paprast monogenin paveldjim. Labai domus klausimas apie L ir R augal santyk, kai augal riai bdinga dimorfin (vieni augalai L, o kiti R) enantiostilija. Piet Afrikos augalo Wachendorfia (Haemodoraceae) is santykis priklauso nuo augal ries. Krymadulks ries W. paniculata L ir R augal yra lygiai (1:1). Kit ri, kaip W. trysiflora (kuri dauginasi klonavimo bdu) arba savidulks ries W. parviflora, visi augalai yra tik vieno kurio tipo. Fleksistilij (lot. flexio sulinkimas) atrado kin mokslininkai tropikinio imbiero Alpinia (Zingiberaceae) gentyje. Populiacijose madaug lygiu santykiu pasitaiko dviej tip augalai. Vien augal iedai ryte fukcionuoja kaip vyriki, o po piet kaip moteriki. J piestels ryte nulinkusios, o vakare, atvirkiai, isitiesia, ikyla vir kuokeli ir yra apvaisinamos. Kit augal viskas vyksta atvirkiai: ryte piestels isitiesusios ir apvaisinamos iedadulkmis, atnetomis nuo kit augal. Inversiostilija (lot. inversio apvertimas, perstatymas) aptikta Piet Afrikoje vienameio augalo Hemimeris racemosa (Scrophulariaceae) ieduose. Dauguma io augalo populiacij yra dimorfins pagal piestels liemenlio padt, tik skirtingai nuo enantiostilijos, vieni liemenliai nukreipti vir, kiti apai. Visi to paties augalo iedai turi tos paios krypties liemenlius. Dl aliejaus iedus lankantys vabalai isitepa iedadulkmis apatin arba virutin kno
AUGAL GENETIKA
| 119
dal. iek tiek vyrauja iedai su apatins padties liemenliais, ir toki augal gausja, kai maiau apdulkintoj. H. racemosa homostilinse populiacijose, kaip ir homostilins ries H. sabulosa, vis augal ieduose liemenlis yra apatinje padtyje. Pagal S. C. H. Barrett. Nature Reviews. Genetics. 2002. Vol 3, P. 274-284; A. Pauw. American Journal of Botany. 2005. Vol. 92, P. 18781886.
Selektyvusis apvaisinimas gali priklausyti ir nuo iedadulks iors. Daugeliui augal bdingas iedadulki heteromorfizmas (form vairov). Heteromorfizmas gali pasireikti ir dl diegaviei formos ir skaiiaus. Kaip minta, egzinoje yra vairus skaiius nesustorjusi viet, diegaviei, pro vien i kuri dygsta iedadulk. Diegaviets yra vairaus dydio (0,0080,2 m) ir formos. iedadulks, kurios turi daugiau ir stambesni diegaviei, dygsta greiiau. Manoma, kad be konkurencijos, tai padeda augalui dar ir apsidrausti nuo neprognozuojam, besikeiiani apvaisinimo slyg augal ydjimo metu. Pvz., nalaits (Viola diversifolia) pirmiausia dygsta iedadulks su daugiau diegaviei, bet iedadulks, kurios turi maiau diegaviei, ilgiau ilieka potencialiai vaisingos ir gali apvaisinti augal vliau, jeigu atsiranda palankesns slygos. Paprastai vis genotip iedadulks turt bti vienodai gyvybingos. Tai viena i slyg pasireikti Mendelio dsniams, taiau gali bti du atvejai, kai taip nra: kai kuri augal yra dvejopos dulkins skirtos apvaisinimui ir maitinaniosios; pasireikia letals genai. iedadulkse ir spermiuose, skirtingai nuo gyvn spermatozoid, pasireikia daug gen. Gametofitas yra haploidinis, todl visi genai jo chromosomose yra hemizigotiniai, nra heterozigot. Dl iedadulki haploidikumo jose pasireikia ir kartu pasialina visi ankstyvieji letals genai. Visos iedadulks, kuri genotipe yra tokie genai, va. Taiau tai nra tikrasis selektyvusis apvaisinimas, kai vyksta konkurencija tarp iedadulki, todl reikinys pavadintas paraselektyvumu (gr. para alia). Kai kuriose kukurz veislse ir linijose pastebtas dar vienas reikinys, dl kurio i apvaisinimo gali bti paalintas tam tikras genotipas. vairios veisls ir linijos gali lemti nevienodo ilgio dulkiadaigius, ir iedadulks trumpais dulkiadaigiais gali paprasiausiai nepasiekti mikropils, pro kuri gemalo maiel prasiskverbia spermiai. Jeigu ilgio skirtumai tarp dulkiadaigio ir piestels liemenlio bt to paties iedo, tai jau bt barjeras savidulkai. Gyvn spermatozoid heteromorfizm lemia ir lytins chromosomos, pagal kurias jie bna dviej tip arba su X, arba su Y chromosoma. Spermatozoidai su Y chromosoma, lemiania vyrikj lyt, yra gerokai judresni ir daniau apvaisina moteriksias mogaus ir gyvn lytines lsteles. Dl io selektyviojo apvaisinimo pasireikimo daugiau gimsta vyrikosios lyties individ, nors teorikai lyi santykis turt bti lygus 1:1. Lytini chromosom dimorfizmas yra bdingas ir kai kuriems dvinamiams augalams. Ar selektyvusis apvaisinimas gali paveikti lyi santyk, iki iol nra aiku.Visais atvejais (ir paraselektyvumo) selektyvusis (neatsitiktinis) apvaisinimas lemia nukrypim nuo Mendelio poymi paveldjimo dsni.
120 |
2.4.2.2. Homomorfinis nesuderinamumas. S-genai ir S-haplotipai Savitu selektyviojo apvaisinimo tipu formaliai bt galima laikyti ir S-(ne)suderinamum, taiau jo tikslai kiti: neleisti hermafroditui augalui apsivaisinti savo paties iedadulkmis. Vadinasi, slopinamas sav iedadulki dygimas, todl reikinys ymimas tarptautiniu simboliu S-(angl. self savi-). Uuomazg iai nesuderinamumo sistemai galima rasti tarp vienalsi organizm. Morfologikai tapataus, bet skirting poravimosi tip (mt+ ir mt-) dumblio Chlamydomonas gametos atpasta viena kit paviriniais baltymais glikoproteinais. Magnolijn (gaubtaskli) lsteli pavirini kontakt sistemos itobuljusios, taiau S-nesudrinamumo sistema verta ypatingo dmesio. Manoma, kad jos atsiradimas yra viena i magnolijn iplitimo ir suklestjimo prieasi. i augal yra apie 235000 ri daugiau negu bet koki kit augal. S-nesuderinamumo sistema atvr duris genetinei rekombinacijai ir polimorfizmui. O kur vairov ten ir platesns galimybs igyventi, surasti savo ekologin ni po saule. S-nesuderinamumo sistema ir S-lokusas. iedadulkei pakliuvus ant purkos galimi bent trys atvejai: jeigu augalas be klii ir nepriverstinai apsivaisina savo paties iedadulkmis yra savidulka ir S-suderinamumas (angl. self-compatibility) savo paties iedadulkms; kai kito augalo iedadulks be klii dygsta ant purkos irgi yra S-suderinamumas (angl. compatibility); jeigu augalo iedadulks ant purkos nedygsta yra S-nesuderinamumas (angl. self-incompatibility). Taiau pastarasis yra dviej tip: sporofitinis, gametofitinis (2.2 lentel).
2.2 lentel. Augal S-nesuderinamumo (SN) tipai ir mechanizmai Augal eimos
Solanaceae, Rosaceae, Scrophulariaceae Brassica Papaver
SN1 tipas
GSN SSN GSN
Pagrindinis lokusas
S S S
Determinantai2 Moteri- Vyrikakasis sis

S-RNAse SRK S-genas SLF/SFB SCR/SP11
Veikimo bdas
S-RNRazs inicijuojamas dulkiadaigio RNR degradavimas
Receptorins proteinkinazs inicijuota vyki grandin purkoje S-baltymo inicijuota signal perNeinomas davimo grandin iedadulkje
1 SN S-nesuderinamumas: GSN gametofitinis; SSN sporofitinis; 2 S-RNAse S-Rnazs genas; SRK S-receptorins proteinkinazs genas; SLF/SFB genas, koduoajntis S-lokuso F domen turint baltym; SCR/SP11 genas, koduojantis turting cisteino liekan baltym.
Kuris i nesuderinamumo tip pasireik, priklauso nuo to, kieno genotipas sporofito ar gametofito lemia S-nesuderinamum. Kai yra sporofitinis nesuderinamumas (2.14 pav.), visos konkretaus augalo iedadulks irgi nedygsta ant konkretaus augalo (tarkim, S1S3) purkos, nes tvinis augalas (sporofitas) yra diploidinis (tarkim, S1S2). Tvinio augalo S1 sutampa su purkos/liemenlio S1, todl visos io augalo iedadulks neAUGAL GENETIKA
| 121
dygsta. Pasireikia sporofitinis S-nesuderinamumas. Suderinamos iedadulks bus tik tada, jeigu tvinio augalo genotipai visikai nesutapt su motininio augalo genotipais; tarkim, kai motininis augalas yra S3S4, o tvinio augalo genotipas S1S2.
Kuokeli haplotipai S2 S3 S2 S1 S1 S4 Purka Liemenlis S2 S3 S2 S3 S2 S3 Dygstanios iedadulks S1 S2 S1 S3 S3 S4 S1 S2 S1 S2 S1 S2
A. Gametofitinis S-nesuderinamumas
Piesteli haplotipai
B. Sporofitinis S-nesuderinamumas
2.14 pav. Du homomorfinio S-nesuderinamumo tipai: (A) gametofitinis ir (B) sporofitinis:

Kairje S-nesuderinamo augalo iedadulks nedygsta, deineje dygstanios S-suderinamo augalo iedadulks (pagal J. B. Nasrallah. Trends in Immunology. 2005, Vol. 26, P. 412418).
Gametofitinis S-nesuderinamumas priklauso nuo haploidins iedadulks ir diploidini purkos-liemenlio lsteli sveikos, bet to paties augalo vienos iedadulks (tarkim, S1) gali dygti, o kitos (tarkim, S2) nedygti, yra nesuderinamos su purkos S2S3 genotipu. Tai daniausias S-nesuderinamumo tipas. Gametofitin S-nesuderinamum lemia paios iedadulks genotipas, o sporofitin S-nesuderinamum augalo, kuris produkuoja iedadulkes, genotipas. S-nesuderinamum lemia ne pavieniai genai, o j deriniai, vadinami haplotipais. S1, S2 ir t. t. yra haplotip skiriamieji simboliai. Haplotipas yra unikalus aleli derinys lokuse, paveldimas kaip vienas vienetas (2.6 intarpas). iedadulk atmetama, kai jos haplotipas sutampa su vienu kuriuo i dviej diploidins piestels haplotip, pvz., iedadulks S2, o piestels S2S3. Taip yra gametofitinio S-nesuderinamumo. Kur kas sunkiau susiderinti tvinio ir motininio augal haplotipams, kai pasireikia sporofitinis S-nesuderinamumas. iedadulk nedygsta, jeigu bent vienas i vyrikojo sporofito haplotip sutampa su kuriuo nors piestels haplotipu, pvz., kaip jau mintu atveju, kai vyrikojo sporofito haplotipai S1S2, o piestels S1S3 (2.16 pav.). Tik tada, kai abu haplotipai nesutampa (pvz., S1S2 ir S3S4), iedadulk dygsta, jos dulkiadaigis pasiekia mikropil ir vyksta dvigubas apvaisinimas: vienas spermis susilieja su kiauialste, o kitas su centrine gemalo maielio lstele.
2.6 intarpas. Kas yra tas haplotipas? Haplotip reikia apibdinti pagal dvi jo ypatybes paveldjim ir polimorfizm. Dauguma organizmo poymi nulemiami ne vieno geno, o yra sudting sveik rezultatas. Ne nauja ir tai, kad vien poym, savyb, proces koduojantys genai gali bti sutelkti sankaupas viename bendrame lokuse. Nuo tokio lokuso, kuris sudaro operon, gali bti transkribuojama netgi tik viena bendra RNR. Tai, kad haplotipas paveldimas kaip vienas bendras lokusas, sudarytas i keletos, keli deimi, o paties kol kas didiausio inomo induoli pagrindinio audini suderinamumo komplekso (angl. MHC major compatibility complex) i netgi per 100 gen, dar nepaaikina,
122 |
kas yra haplotipas. iame bendrame lokuse genai turi bti labai polimorfiki, ir haplotipe ypating reikm gyja sveika tarp daniausiai dviej lokuse esani gen aleli ar tie aleliai reikiamu bdu sutampa, ar ne. Genai, kuri aleliai nulemia sveikos pobd, vadinami determinantais. Iskirtin j ypatyb, labai padedanti nustatyti, kuris genas koduoja determinant, savita i gen raika. Jie pasireikia tik arba savitose lstelse, arba tik tam tikromis savitomis slygomis. Konkreiai, nors ir vyrikojo ir moterikojo determinant genai yra S-lokuse, vyrikasis determinantas pasireikia tik iedadulkse, o moterikasis tik purkos/liemenlio lstelse. Haplotipas yra unikalus derinys, kuriame kaskart vis kitaip derinasi vis lokus sudarani gen aleliai. Dl io unikalumo haplotipas dar apibdinamas kaip miniatirinis nedidels genomo dalies genotipas. Kiek gali susidaryti vieno bendro lokuso haplotip, priklauso nuo to, kiek gen yra lokuse ir kiek kiekvienas j turi aleli, ypa determinantai. Haplotipai nulemia sveik tarp atskir individ arba j lsteli. Ar bus suderinami audiniai, ar bus suderintos-nesuderintos iedadulks su piestels lstelmis ir pan. Haploidins lstels, tarp j ir iedadulki, turi tik vien haplotip. Sporofitui, diploidinms lstelms, bdingi du haplotipai po vien homologinse chromosomose, taiau, jeigu lokusui bdinga vadinamoji. monoalelin raika, pasireikia tik vienas haplotipas, nors paveldimi yra du haplotipai. Vienas j slopinamas. Sporofito S-lokuse reikiasi abu haplotipai, bet iedadulk turi tik vien haplotip, o purkos-liemenlio lstels turi du haplotipus. Jie irgi ymimi sutartiniais simboliais. S-lokuso jie ymimi ta paia S- raide ir atskiriami vienas nuo kito papildomais skaitmenimis: S1, S2 ... S31 ... Sn
Trys skirtingi S-lokusai. Pagal S-lokuso genetin sandar (genus) ir j pasireikim skiriami trij tip S-lokusai ir S-nesuderinamumas (2.2 lentel): Brassica(ceae) tipas (Brassicaceae . augaluose); Solanaceae tipas (itirti augalai Solanum, Lycopersicon, Nicotiana, Petunia), taip pat Rosaceae (Malus, Prunus, Pyrus), Scrophulariaceae (Antirrhinum); Papaver(aceae) tipas itirtas aguonos (Papaver rhoes) augaluose. J lemia signal perdavimo kaskada, kuri siejama su Ca2+ jon gradientu, fosfoinozitidais, proteinkinazmis ir fosfatazmis. S-lokuso struktra kol kas neaiki. Akivaizdu, kad kol kas itirtas labai menkas augal skaiius ir nra garantijos, kad yra tik i trij tip S-lokusai. Brassica S-lokusas yra daugiaalelinis, labai polimorfikas. Jame yra 3 itin polimorfiki genai, nulemiantys iedadulks/purkos S-nesuderinamum (2.15 pav.): SLG (S-locus glycoprotein) koduoja glikoprotein, kuris sekretuojamas purkos (papiliarini) lsteli sienel; SP11/SCR (turi du pavadinimus, kartais raomas tik kuris vienas: SP11 S-locus protein 11 arba SCR S-Cys rich) koduoja ma sekretuojam labai turting cisteino liekanomis (8- iomis) baltym ir yra pripaintas kaip vyrikasis iedadulks determinantas: SCR baltymas sintetinamas ne iedadulkje, o dulkins (t. y. sporofito) tapeto lstelse tai gali paaikinti ir sporofitin S-nesuderinamum; SRK (S-locus receptor kinase) koduoja transmembranin proteinkinaz piestels lsteli determinant. Sveikauja su iedadulks SCR baltymu. Transmembraninis SRK baltymo domenas labai panaus SLG glikoprotein. SRK proteinki-
AUGAL GENETIKA
| 123
naz perduoda signal gilyn citoplazm ir iedadulks dygimas yra slopinamas. Galiausiai nesuderinama iedadulk pasmerkiama numatytai iai apoptozei.
C 2.15 pav. Brassica tipo S-nesuderinamumas:
A S-lokusas: HV1-3 hipervariabils SRK rajonai; B ir D atmetimo reakcijos mechanizmas (r. tekst); D SRK S-receptorins proteinkinazs kompleksas; C pagrindini iedadulks atmetimo reakcijoje dalyvaujani baltym sandaros palyginimas: SP signalinis polipeptidas; TM transmembraninis domenas; brkneliais paymtos Cys liekanos (pagal N. F. Silva, D. R. Goring. Cellular and Molecular Life Sciences. 2001. Vol. 58, P. 19882007; S. L. Stone et al. Plant Cell. 2003, Vol. 15, P. 885898; Y. Z. Haffani et al. Canadian Journal of Botany. 2004, Vol. 82, P. 115).
Solanaceae S-lokusas jame yra itirti du irgi itin polimorfiki genai iedadulks ir purkos determinantai:
124 |
S-RNase S-ribonukleazs genas piestels determinantas, S-ribonukleaz

yra ne tik fermentas, skaidantis RNR, bet S-specifinis citotoksinas. Baltymui bdinga labai didel vairov. Tarp labiausiai nutolusi pagal aminorgi sudt S-ribonukleazi nustatytas tik 38 % panaumas. Baltym koduojani aleli vairov sukuriama vidugenins rekombinacijos, panaiai kaip Solanaceae proteinazs inhibitorius PI2 gene. S-RNazs molekulje yra 5 konservatyvs (C1-C5) ir 2 hipervariabils (HVa ir HVb) rajonai. ie ir sukuria baltymo S-specifin vairov. Tai panau induoli imunoglobulinus, kurie irgi turi konstantikus (C) ir hipervariabilius (V) domenus. Kai sutampa dulkiadaigio ir purkos/piestels liemenlio haplotipai, S-ribonukleaz suskaido dulkiadaigio RNR, ir tokia iedadulk pasmerkiama apoptozei (2.16 pav.). SLF (S-locus F-box)/SFB (S-haplotype specific F-box) genas yra labai artimai sukibs su S-RNase genu, taiau prieingai S-RNase genui, yra iedadulks determinantas. Jis koduoja baltym, kuris, kaip manoma, yra S-ribonukleazs inhibitorius. S-suderinamose iedadulkse (dulkiadaigyje) jis slopina S-ribonukleaz. Kaip F-domen turintis baltymas, jis pristato S-ribonukleaz proteolitini baltym kompleksui proteosomai, kur S-ribonukleaz yra suskaidoma.
Suderinama
Piestels = SaSb
x x
iedadulk = Sx
PP
Baltym sintez
Vak. ELM Nesuderinama

Ankstyva stadija Piestel = SaSb
a a
Vlyva stadija
RNR stabili Stabilus kompartmentas HT-B suskaidymas
iedadulk = Sa
PP
Vak. ELM
Ankstyva stadija S-RNaza S-RNazb
a x
Vlyva stadija SLFa SLFx

PP
RNR suskaidymas Nestabilus kompartmentas HT-B stabilus Destabilizuojantis Baltymas HT-B
HT-B 120K
2.16 pav. S-nesuderinamumo S-determinantas S-RNaz:
Solanaceae
tipas.
tis,
kuri
lemia
moterikasis
ELM ekstralstelinis matriksas, i jo dulkiadaig paklina HT-B, S-RNaz, 120K baltymas; Vak. vakuol (pagal A. Goldraij et al. Nature. 2006, Vol. 439, P. 805810).
AUGAL GENETIKA
| 125
Bendri S-nesuderinamumo pasireikimo principai. Nepaisant to, kad Brassica ir Solanaceae S-tipus lemia visikai skirtingi genai, jiems bdingi bendri veikimo principai: vairov sukuria lokuse esani gen polimorfizmas, dl jo susidaro skirtingi tarpgeniniai aleli deriniai haplotipai; abiems tipams bdinga, kad S-nesuderinamum lemia haplotip sveika (sutapimas); S-lokuse esani gen reikm nevienoda, nustatomi genai iedadulks ir purkos determinantai; galutinis S-nesuderinamumo pasireikimo bdas sutampa: inicijuojami baltym degradavimas ir nesuderinam iedadulki tis apoptoz, i proces detals kol kas nepaaikintos; ne tik S-lokuse esantys genai lemia iedadulks-purkos sveikos pobd, daugelis j koduoja baltymus kaskadini vyki dalyvius, bet kai kurie j reguliuoja ir gali pakeisti S-sveikos pobd, pvz., M (angl. modifier modifikatorius), kuris koduoja citoplazmin receptorin proteinkinaz ( S atsako reguliatori). kai kuri augal itirtuose S-lokusuose aptinkami ir kiti genai, kuri svarba S-nesuderinamumui irgi tiriama. S-polimorfizmo atsiradimo prieastys. Nra retenyb, kad toje paioje gentyje ar net ryje yra krymadulkiai ir savidulkiai augalai ar net dauginasi nelytiniu (apomikss) bdu. Modelinis genetini tyrim objektas vairenis Arabidopsis thaliana yra savidulkis augalas, o jam labai artima ris A. lyrata yra krymadulk ir jai bdingas Brassica tipo S-nesuderinamumas. Kokios prieastys sukuria taip pasireikiant augal polimorfizm? Vien io reikinio prieasi jau nagrinjome (2.4.2.1). Tai tolimoji hibridizacija, kuri griki heterostilij paveria homostilija ir savidulka. Lytinio dauginimosi tip gali pakeisti ir poliploidija. Pastaruoju metu susidomta nukleotid sekomis, kurios yra u S-lokuso rib. iose sekose aptinkama siterpusi judrij genomo element. Jie dauginimosi tipo gal ir nepakeiia, bet padidina augal polimorfizm pagal S-haplotipus. Pagrindin augal polimorfizmo pagal dauginimosi tipus ir S-nesuderinamum prieastis yra mutacijos. Gali pasireikti stambesns chromosom mutacijos ir chromosomos segmentai ikristi (delecijos) arba, atvirkiai, padvigubti. S-lokuse aptinkama duplikuot gen, kurie pagal savo genetin sandar atitinka alelio svok, t. y. daugiau ar maiau skiriasi. Prisiminkime, kad ie genai gali labai skirtis vienas nuo kito (tik iki 38 % homologijos). Mutacijos pavert ir A. tahaliana savidulkiu augalu. S-lokuse abu genai S-determinantai (SRK ir SP11/SCR, raide ymimi pseudogenai) yra pseudogenai (2.17 pav.), t. y. neaktyvios, bet homologikos gen kopijos. Jos gali atsirasti dl judrij genomo element, retrotranspozon, arba dl takini mutacij, translokacij (vietos pakeitimo) ir inversij (apsivertimo 180 %). Tai nustatyta A. lyrata S-lokuse, dl to susidar skirtingi S-haplotipai (2.17 pav.). Gen ininerija realiai leidia valdyti lytinio dauginimosi tip, pasirinkti tarp savidulkos ir krymadulkos. Kai norima isaugoti augal genetin ir fenotipin vienodum, naudingesn yra savidulka, bet jeigu norima sukurti labiau adaptyvius augalus arba pasi126 |
naudoti heteroze, neisiversti be krymadulkos. Savidulkiams A. thaliana augalams buvo perkelti funkcionals A. lyrata S-nesuderinamum koduojantys genai. Transgeniniai A. thaliana augalai tapo krymadulkiais.
A. lyrata haplotipas b haplotipas a A. thaliana
B160 B120 SRK B80 B70 SCR(3) 9 4 50 SRK 40 SCR (SP11) 35 4
apytiksl. kb
2.17 pav. Vairenio SRK-SCR(SP11) sistema. Krymadulks (Arabidopsis lyrata) ir savidulks (A. thaliana) ri palyginimas:
yminimi pseudogenai, kurie yra neaktyvs; linijomis parodytos nukleotid sekos, kurios tarp A. lyrata ir A. thaliana yra homologins (pagal D. Charlesworth et al. New Phytologist. 2005, Vol. 168, P. 6169).
2.4.3. S-nesuderinamumo genetika. Baltym skaidymas, apoptoz ir S-nesuderinamumas iuo metu nekyla abejoni, kad S-nesuderinamumas pasireikia numatytai suskaidant specifinius baltymus ir degraduojant paias S-nesuderinam iedadulki lsteles. Pasireikia apoptoz. Nors S-nesuderinamumo mechanizmai nra visikai iaikinti, jau dabar galima teigti, kad sporofitiniam S-nesuderinamumui (Brassica tipui) esmin yra sveika baltymas-baltymas, po kurios suderinamo augalo iedadulks gali dygti, arba, atvirkiai, j dygimas yra slopinamas. Gametofitinio S-nesuderinamumo esminiu momentu irgi yra atpainimas, kurios iedadulks suderinamos, o kurios nesuderinamos. Pastarosios yra atmetamos: nedygsta, o jeigu dygsta, sunaikinamos. 2.4.3.1. Numatyt baltym suskaidymas ir S-nesuderinamumas Baltymai numatytai suskaidomi ne tik tada, kai atmetamos S-nesuderinamos iedadulks. Tai kur kas platesnis reikinys: atrastas kaip naujai susintetint baltym kokybs kontrols (taip kur laik ir vadinta) reikinys. Tai atlieka specials baltymai aperonai. Jie patikrina naujai susintetint baltym, ir jeigu is neteisingos sandaros, pirma pabando j pataisyti, o jei tai nemanoma, toks baltymas gabenamas proteosom, kuri j suskaido; suskaidomi visi lstelei nereikalingi, atidirb baltymai, taip ,,paremontuojamos arba atsinaujina lstels struktros; valdoma gen veikla. Reguliaciniai (valdymo) genai koduoja arba baltymusaktyviklius arba slopiklius (represorius). ie baltymai atpasta ir jungiasi su geno
AUGAL GENETIKA
| 127
reguliacinmis sekomis j valdomuose genuose, reguliuodami gen transkripcij, todl jie vadinami transkripcijos veiksniais. Kai suskaidomas aktyviklis, procesas nutrksta arba bent susilpnja. Atvirkiai, suskaidius gen veikl slopinanius veiksnius, pasireikia anksiau nuslopinti genai. Pvz., vadinamieji DELLA baltymai slopina augalo augim. Kai jie suskaidomi, augalas pradeda augti. Numatytas konkrei baltym skaidymas yra ne tik sudtingas, bet ir labai atsakingas procesas, todl prie pristatant baltym 26S proteosom, kur baltymas yra suskaidomas, jis turi bti kruopiai patikrintas, ar tikrai btent tas baltymas turi bti suskaidytas. Tai atlieka baltym kompleksas, bet baltym, skirt suskaidyti, atpasta ir prijungia prie io komplekso E3 ubikvitinligazs (2.7 intarpas). Jos pristato baltym dar vienam baltymui ubikvitinui (vyksta ubikvitininimas baltymo ubikvitino prijungimas), tik vliau baltymas pristatomas i proteazi sudarytai 26S proteosomai ir ten suskaidomas.
Yra kelios vairenio E3 ubikvitinligazi klass, bent dvi yra tiesiogiai susij su S-nesuderinamumu. Viena j SCF kompleksas (nuo pirmj trij baltym raidi, kurie sudaro kompleks SKp1, Cullin, F-box ir RBx1). Konkretaus baltymo prisijungim lemia vienas baltymas arba baltym kompleksas, kuriame vienas i baltym turi bding tik E3 ubikvitinligazms domen HECT, RING, U-box, F-box (2.7 intarpas). Daniausiai pasitaiko baltymai su F-box domenu. Vairenio genome yra 621 genas, koduojantis F-box baltymus ir 468 genai, kurie koduoja RING baltymus. ie domenai yra numatyto baltym skaidymo proteosomoje ymenys.
Tai, kad Solanaceae tipo S-nesuderinamumo iedadulks determinantu yra SLF (S-locus F-box), i karto galima sprsti, kad iam S-nesuderinamumo tipui pasireikti btinai suskaidomas kakuris konkretus baltymas. Brassica tipas irgi neapsieina be baltymo pristatymo proteosomai, taiau tai atlieka ne iedadulks ir purkos/liemenlio determinantai, o giliau citopalzmoje esantis baltymas ARC1 (ARM repeat containing1; ARM kartotin seka yra 42 aminorgi motyvas, kurio pavadinimas kils i induoli geno armadillo; 6 ARM kartotins sekos sudaro domen, kuriuo sveikaujama su kitais baltymais). ARC1 turi ir U-box domen. Tai irgi E3 ubikvitinligazs ymuo, homologinis RING, tik nejungia Zn2+ (2.7 intarpas). is baltymas purkos papils lstelje yra audykl tarp SRK, citozolio proteosom ir branduolio (2.15 pav.). Determinant sveika vyksta purkos papils lsteli paviriuje. Tinkama (S-suderinama) ar netinkama (S-nesuderinama) iedadulk, nustato purkos determinantas transmembraninis baltymas SRK. Tai receptorin proteinkinaz. Proteinkinazs yra fermentai, kurie fosforilina (prijungia fosfato liekan) baltymus. Receptorin proteinkinaz priima signal ir j perduoda kitoms molekulms, pvz., ARC1. Gali bti itisa proteinkinazi kaskada. Fosforilinimas yra vienas i pagrindini bd greitai perduoti signal nuo vieno baltymo kitam. Citoplazmoje esanios signalus perduodanios proteinkinazs, kaip ARC1, yra vadinamos citoplazminmis receptorinmis kinazmis. Kai iedadulks yra S-suderinamos, nra atmetamos, SRK proteinkinaz yra neaktyvi. Jos aktyvum slopina specials baltymai THL1 ir THL2 (nuo thioredoxin-like). Jie sveikauja su Cys-liekana transmembraniniame (kuris eina skersai membranos) domene. Tai iskirtin ios SRK kinazs ypatyb.
128 |
SRK tyli, ir iedadulk sau ramiai dygsta. Visikai kitaip, kai i tvo (sporofito) puss yra S-nesuderinami haplotipai (r. 2.15 pav.). Tada iedadulks determinantas SCR jungiasi su SRK kinaze. Pasialina inhibitoriai THL baltymai, SRK proteinkinaz pati save fosforilina ir paskui fosforilina ARC1. is baltymas yra E3 ubikvitinligaz, nes turi U-box domen. Jis prisijungia ir pristato suskaidymui tok baltym, be kurio iedadulk negali dygti. Deja, iki iol neinoma, kuris i baltym yra suskaidomas, be kurio iedadulk negali dygti. Tai vienas i t baltym, kuriuos nagrinjome 2.3.3 sk. Jis gali slopinti iedadulks hidratacij, dygim ar dulkiadaigio augim.
Dar vienas opus klausimas. Kodl visos nesuderinamo augalo iedadulks yra atmetamos. Kai yra sporofitinis S-nesuderinamumas, diploidinis augalas turi du S-lokusus. Heterozigotinio augalo, pvz., S1S3, pus iedadulki turt bti S1 haplotipo, o kita pus S3 haplotipo. Gal bt ne vis augal, bet sporofitiniam S-nesuderinamumui bdinga monoalelin raika. Pasireikia tik vienas S-lokusas. Monoalelin raik lemia epigenetiniai mechanizmai DNR metilinimas.
Gametofitinis Solanaceae tipo S-nesuderinamumas. Sveika tarp determinant pasireikia ne iedadulks ir piestels lsteli paviriuje, kaip tai yra sporofitinio S-nesuderinamumo, o dygstanios iedadulks dulkiadaigio viduje ir baigiasi iedadulks lsteli apoptoze. Kita Solanaceae tipo ypatyb, kad abu determinantai yra tiesiogiai biopolimer skaidymo dalyviai. Piestels lsteli determinantas yra S-ribonukleaz. Ji skaido S-nesuderinamos iedadulks lsteli RNR. Taip pasireikia jos citotoksinis poveikis. iedadulks determinantas yra baltymas, kuris turi F-box domen, ir tose iedadulkse, kurios yra S-suderinamos, E3 ubikvitinligazs pristato S-ribonukleaz proteosom, kad j ten suskaidyt. Ir iuo atvilgiu gali pasireikti augal vairov. Tarp Petunia hybrida augal aptikti ir tokie, kuri iedadulks determinante yra ne F-box, o RING domenas. Jis taip pat yra E3 ligazs ymuo (2.7 intarpas).
Su S-RNaze sveikauja daug baltym, kurie gali pakeisti S-nesuderinamumo pobd. Apie j reikm S-nesuderinamumui sprendiama pagal i gen mutacijas. Jos krymadulk augal gali paversti savidulkiu, arba atvirkiai. Tai HT-B, 4936-veiksnys, 120 kDa baltymas. J funkcija nra visikai itirta, bet kai su miRNR yra blokuojama 120 kDa baltymo raika, iedadulks, kurios turt bti atmetamos, pripastamos kaip S-suderinamos, o savidulkis Solanaceae augalas pomidoras (Lycopersicum esculentum) neturi HT-B baltym koduojanio geno.
Augal piestels lsteli gaminami baltymai, tarp j ir S-RNazs, iskiriami piestels liemenlio vidin ertm, o i ten jie endocitozs bdu patenka iedadulks dulkiadaig. Diploidinse piesteli lstelse gaminasi dviej haplotip S-RNazs. Abi jos patenka dulkiadaig, o tolesnis rezultatas priklauso nuo to, ar S-RNazs yra S-suderinamos, ar S-nesuderinamos su dulkiadaigiu (2.16 pav.). ia pasireikia iedadulks determinanto SFB/SLF baltymo funkcija. Jis yra S-RNazs inhibitorius, bet slopina S-RNaz, jeigu piestels lstels ir dulkiadaigis S-suderinami. Kai iedadulk yra nesuderinama, S-RNaz veikia kaip citotoksinas ir iedadulk va. Manoma, kad S-nesuderinamose iedadulkse suyra vakuols tonoplastas (taip vadinama jos membrana) ir vakuolje esantys fermentai (r. 2.4.3.2) isilaisvina ir skaido iedadulks lsteli turin.
AUGAL GENETIKA
| 129
2.7 intarpas. Baltym pristatymas proteosomai. Augal E3 ubikvitinligazs Numatyt baltym skaidymas yra daugiaetapis ir sudtingas vykis, kur iaikino Herko (A. Hershko) ir Ciehanoveris (A. Ciechanover) 1998 m. Baltymo pristatym ubikvitinui atlieka trys fermentai: E1 aktyvina 76 aminorgi baltym ubikvitin, btinas ATP; E2 prijungia ubikvitin; tioesterifikuotas ubikvitinas perneamas ant E2-UBC (nuo angl. UBiquitin-Conjugating) baltymo Cys-liekanos; paskui ubikvitinas nuo E2 tarpininko perneamas ant lizino liekanos substrate; E3 ubikvitinligaz kartu su E2 prisijungia suskaidymui skirt baltym:
Substratas Substratas
Substratas
Anaiptol ne visada baltymas, prie kurio prijungiamas ubikvitinas, yra gabenamas 26S proteosom. Tai gali bti ir vienas i baltymo modifikacijos bd. Jis nustatytas vairiems reikiniams ir baltymams (signaliniams, endocitozei). Labai svarbus chromatino veiklai yra ubikvitino prijungimas prie histon. Gali bti prijungiami ir kiti ubikvitin panas baltymai: SUMO (nuo Small Ubiquitin-related MOdifier), jo homologija ubikvitinui yra 20 %; RUB/Nedd8 ir kt. Vairenio genome yra apie 1400 gen, koduojani baltymus (apie 5 % proteomo), susijusius su baltym skaidymu, kur atlieka 26S proteosoma. Apie 90 % i gen koduoja E3 ubikvitinligazes, todl, kad btent jos atpasta suskaidymui skirt baltym. E3 ubikvitinligazs atpastamos pagal savitus tik iems baltymams domenus: HECT (nuo Homolog to EG-APC Terminus geno, kuris eina APC anafaz skatinanio komplekso sudt, vieno i mitozs ir mejozs reguliatori); RING (nuo Really Interesting New Gene) tai cinko pirteli polipeptidas, toks polipeptidas jungia Zn2+ jonus ir yra sveikos baltymas-baltymas dalyvis; U-box giminingos (homologins) sandaros RING domenui, tik nejungia Zn2+ jon; F-box 40-50 aminorgi seka paprastai sujungta su kita seka, pagal tai skiriamos trys F-box klass: FBXL F-box + LRR (Leu Rich Repeat turinti daug Leu liekan); FBXW F-box + WD (40 aminorgi motyvas, kuris baigiasi TrpAsp, arba kitaip WD; domene toki sek bna 416 ir jos reikalingos sveikai baltymas-baltymas), FBXO F-box + vairs papildomi motyvai Leu utrauktuko, RING pirteli, daug Pro turinio ir kt. Tai padidina galimyb atpainti ir sveikauti su vairiais baltymais.
130 |
E3 gali bti monomerinis baltymas. Tai ypa bdinga E3 ubikvitinligazms, kurios turi HECT domen. Bet kur kas danesni yra baltym kompleksai. Tai dar labiau prapleia E3 ubikvitinligazi galimyb sveikauti su tik tam tikru konkreiu baltymu/substratu. Augal SCF kompleksas yra sudarytas i 3 5 subvienet/baltym: SKP1 (S phase Kinase-associated Protein 1; vairenio (Arabidopsis) ir kit augal genome yra SKP1-like genas, todl is baltymas vadinamas ASK); kulino CUL; baltymo, kuris turi F-box domen FBX; gali turti baltym su RING domenu tada jis ymimas RBX. Prie io komplekso jungiasi substratas ir per E2 ubikvitinas. SCF kompleksas reguliuoja daug labai svarbi augalo proces: substratas hormon (auksino/indolilacto rgties, etileno, giberelin, abscizo ir jazmin rgties) veikim; FBP E2 cirkadinius reikinius; ASK fotomorfogenez ir ydjimo laik; RBX1 (SKP) iedo raid; CDC53 arba CUL1 lap senjim; signal perna ir kt. (pagal J. Moon et al. Plant Cell. 2004, Vol. 16, P. 31813195) ubikvitinas Todl, kaip minta, vairenio genome i viso yra 468 genai, kurie turi RING domen ir dar daugiau 621 genas, kurie turi F-box domen. Kit gen yra maiau: U-box 5, HECT 7 genai. Skirtingus ASK/SKP baltymus koduoja 21, o kulinus 9 vairenio genai. Be to, tik konkreiam procesui ir gen grupei bdingas sveikas nulemia papildomi SCF kompleks einantys baltymai: iedo raidai UFO (UNUSUAL FLOWER ORGAN) ir SCF ymimas SCFUFO, giberelinui SLY1 (nuo SLEEPY1) atitinkamai SCFSLY1; jazmin rgiai COI1 (COronatine Insensitive) SCFCOI1 ir kt.
2.4.3.2. S-nesuderinamumas ir apoptoz. Papaver tipas Papaver S-nesuderinamumo pasireikimas. Aguonoje birulje (Papaver rhoeas L.) aptiktas gametofitinio S-nesuderinamumo tipas, kuris i esms skiriasi nuo Solanaceae S-Rnase gametofitinio S-nesuderinamumo: S-determinant sveika pasireikia ant purkos. Papaver tipas skiriasi ir nuo Brassica tipo ne tik tuo, kad tai gametofitinis S-nesuderinamumas. Abiej i tip S-determinant sveika vyksta ant lsteli paviri, bet Papaver signal priima ne purka, o iedadulk. Jos S-determinantas yra lstels pavirinis receptorius. iedadulks determinantas apskritai kol kas nenustatytas, o purkos S-determinanto genas yra netgi klonuotas. Jis koduoja smulk 15 kDa baltym, kur iskiria purka. Baltymui bdinga labai didel vairov pagal aminorgtis. Homologijos sutapimas siekia tik 51,363,7 %. Baltymas turi 4 Cys liekanas, kurias prarads netenka S-funkcijos. Paradoksalu, bet io baltymo funkcija iki galo neiaikinta. Manoma, kad jis jungiasi su iedadulks specifiniu S-receptoriumi. is prims signal, kad iedadulk yra S-nesuderinama, signal siunia gilyn dviems vienas su kitu susijusiais signalais: [Ca2+]i gradiento pokyiu ir per signalines IP3 (inozit(1,4,5)trifosfato) molekules. Jos kaip tik skatina Ca2+ bang, kuri pasireikia per 1 min. nuo signalo pradios.
AUGAL GENETIKA
| 131
Tolesn signalo pernaa susijusi su baltym fosforilinimu. Fosforilinami bent du baltymai p26 ir p68. Manoma, kad dl p26 fosforilinimo slopinamas iedadulks dygimas, degraduoja jos citoskeletas, i aktin sudarytas ,,silas. Antrajam etapui ,,diriguoja p68 baltymo fosforilinimas. Tai kelias apoptoz iedadulks t. iedadulks lsteli/dulkiadaigio apoptoz. Suprantama, kad iedadulks atmetimas visais S-nesuderinamumo atvejais turt baigtis apoptoze, taiau tai eksperimentais rodyta tik Papver S-nesuderinamumo tipui. Apoptozs ymenys yra dviej tip. -morfologiniai/citologiniai: citoplazmos ir branduolio kondensacija; membran pokyiai; DNR degradavimas, kopi susidarymas; apoptozs knai; pagaliau, suprantama, pati lsteli tis; atsikartojanti tam tikroje raidos stadijoje ar situacijoje. -biocheminiai: citochromo c ijimas i mitochondrijos citozol; kaspaz 3 citozolyje; fermento poli(ADPribozs)polimerazs skaidymas, kur vykdo kaspaz 3 (2.8 intarpas).
Apoptozei Papaver S-nesuderinamose iedadulkse rodyti buvo panaudoti biocheminiai ymenys. Kaip ir tiktasi, buvo slopinamas S-nesuderinam iedadulki dulkiadaigio augimas. Kartu citozolyje atsirado citochromas c (2.18 pav.). Didesnis kas-
Citozolio citochromas c (kiekis mm-2 x 104)
S1 SX Piestels liemenlio signalin s molekul s S iedadulks S-receptorius Ca2+ gradiento praradimas
JP
S1 S1
Ca2+
[Ca ]
2+
p26 CDPK PK p68
[Ca ]
2+
[Ca2+]
[Ca ]
2+
Aktinas
NL
[Ca ]
2+
p52 MAPK S1 iedadulks
Laikas (min)
Kalcio gradiento pokyiai
dulkiadaigis
2.18 pav. Papaver rhoeas S-nesuderinamumo tipas. Ca2+ gradiento pokyiai ir iedadulks apoptoz: A molekulinis apoptozs ymuo citochromo c ijimas citozol S-nesuderinamame haplotipe; B spjamas S-nesuderinamumo mechanizmas: NL numatyta lsteli tis, PK ir CDPK proteinkinazs, kurios fosforilina p26 ir p68 baltymus; 52pMAPK su mikrovamzdeliais susieta proteinkinaz; JP proteinglikanai, su kuriais jungiasi iedadulks baltymai (r. tekst; pagal S. G. Thomas, V. E. Franklin - Tong. Nature. 2004, Vol. 429, p. 305308; J. J. Rudd, V. E. Franklin - Tong. Journal of Experimental Botany. 2003, Vol. 54, P. 141148).
132 |
pazs 3 tipo ferment aktyvumas S-nesuderinam iedadulki lsteli citozolyje rodytas netiesiogiai. Panaudotas tetrapeptidas DEVD (D-Asp; E-Glu; V-Val; D-Asp), kuris yra savitas kaspazs 3 inhibitorius. Kaspazs yra bdingos apoptozei cisteinproteazs, kurios kerpa baltym po aspartato liekanos (i ia j pavadinimo pradia c-asp-). Veikia j kaskada. induoli lstelse bent 14. Augal kol kas j buvimas neaikus, yra kaspazes panas baltymai (angl. caspase-like), kurie veikia vairiuose augal procesuose. Kaspazs 3 klasikiniu substratu yra poli(ADP-ribozs)polimeraz(PARP). Kai yra aktyvs kaspazs 3 tipo fermentai (2.8 intarpas), PARP yra skaidoma ir atsiranda 24 kDa io baltymo fragmentai. Pagal tai ir nustatomas kaspazs3 tipo ferment aktyvumas. Tai ir nustatyta S-nesuderinamose iedadulkse. DEVD slopino ne tik PARP skaidym, bet ir skatino S-nesuderinam iedadulki dulkiadaigio augim. Tad Papaver rhoeas S-nesuderinam iedadulki apoptoz nekelia abejoni.
2.8 intarpas. Apoptoz augaluose Apoptoz i anksto numatyta, programuota konkrei lsteli tis nra retas reikinys augalo gyvenime, pasireikia vairiais raidos momentais. Netgi paio reikinio pavadinimo kilm botanin: gr. apoptosis vainiklapi ir lap kritimas. I ties abu jie yra reikiniai, kur i anksto numatytai pasireikia lsteli tis ir augalo organas atsiskiria nuo viso augalo. Taiau mokslinis susidomjimas reikiniu prasidjo nuo kirmlaits nematodo Caenorhabditis elegans, kurio raidoje numatytai va 121 lstel, kad atsirast vietos kitoms lstelms. iose vaniose lstelse aptikti ir pirmieji lstels mirties genai CED (CEll Death). J ortologai aptikti ir augal genomuose. Programuotai va ne tik S-nesuderinamos iedadulks. iame skyriuje tokia lsteli tis minta jau ne kart, pradedant megaspora (ilieka tik viena i 4-i lsteli), branduolo ir chalazos, sinergidi ir antipodi, iedadulks vegetatyvins lstels/dulkiadaigio likimai paymti apoptozs. Dulkinje va tapeto ir dulkializdio vidins mass lstels. Daniausiai augalo lstels numatytai va, kai jos tampa nereikalingomis, kaip dulkiadaigio, tapeto lstels, arba kai reikia susidaryti tutumoms, erdvms (rtiniai indai, aerenchima) ar dengiamiesiems audiniams (iev, spygliai ir plaukeliai, akn almelio lstels). Kai kuriais atvejais apoptozs raikos bdas yra unikalus. Poaceae . augal endosperme vyksta mumifikacija: endospermo lsteli sienels degraduoja, bet visas turinys ilieka su branduoliu ir kitais organoidais, kol grdas nepradeda dygti. Kaip atsakas stres sukelianius veiksnius, ypa patogenus, pasireikia hiperjautrus atsakas. Dalis lsteli va, ir taip ribojamas patogeno plitimas. Apoptozs genus galima skirstyti dvi grupes: tuos, kuri produktai yra signalas iai, reguliatorius; baltymus, kurie yra vanios lstels turinio utilizatoriai. vanios lstels baltymai, nukleorgtys, lipidai skaidomi ir naudojami kitose lstelse. Suprantama, kad ios grups genai yra itirti geriausiai, ypa tie, kurie skaido baltymus. Baltym skaidymas yra ir signalas, kad apoptoz tampa negrtama. Apie tai sprendiama pagal vieno i proteolitini ferment kaspazs 3 aktyvum. Augalo genome koduojami imtai proteazi. Vairenio j yra per 550. Tipikos proteazs turi autoinhibitoriaus prodomen. ios formos jos vadinamos zimogenais. Prodomenas paalinamas, kai fermentas yra aktyvinamas. Klasifikuojamos pagal savo katalitinius aktyvumus Ser, Cys, asparto, metalo. Pati didiausia klas yra Ser proteazs vairenio j apie 200. Kaspazi substratas yra Val-Glu-Ile-Asp. Hidrolizina asparto liekan i C-galins puss (i liekana vadiAUGAL GENETIKA
| 133
nama. P1). Dl augal kaspazi vis dar vyksta ginai. Matyt, jie tikr kaspazi neturi, taiau dvi grups proteazi atlieka kaspazi funkcij. Vakuoli VPE (nuo Vacuolar Processing Enzymes). ios proteazs pasireikia, kai suardoma vakuols membrana, vadinama. tonoplastu. Vakuols suirimas yra bdingas augal apoptozs poymis. Jis nustatytas ir Solanaceae tipo S-nesuderinamumui. Metakaspazs yra iek tiek homologikos kaspazms. Vairenio genome koduojamos 9 metakaspazs. Jos skirstomos dvi klases pagal jas sudaranius domenus: H C Apskritai dauguma metakaspazi yra citozolyje, ir VPE ten gali bti suskaidomos I tipo metakaspaz du atskirus 20 kDa (P20) ir 10 kDA (P10) polipeptidus; II tipo metakaspaz 100 ar H-C-His-Cis katalitin diada.
Signalinis peptidas N-galo domenas Aktyvus domenas Karboksiinhibitoriaus domenas C2C2 ZIP motyvas P/Q prodomenas P20 subvienetas P10 subvienetas
Aviose, kurias infekuoja grybas Cochliobolus victoriae, gaminantis toksin viktorin, aptiktos dar vieno tipo gynybins proteazs, pavadintos saspazmis (nuo Ser asp protease). Nukleorgtis skaido vairios nukleazs. Augal genomai koduoja keturi klasi nukleazes pagal tai, kokius metal jonus prisijungia: Zn2+ Ca2+ Mg2+ Ca2+/Mg2+ DNR skaidoma palaipsniui: 50 200 kb fragmentus, kurie atitinka chromatino kilp dyd; apie 180 bp kopias (taip atrodo sukarpyti fragmentai) nukleosom jungtuk vietose; visikai suskaidoma iki nukleotid. DNR fragmentacija yra vienas i apoptozs ymen. Augaluose Cys-proteazs ir nukleazs veikia koordinuotai. Branduolio degradavimas prasideda nuo branduolio membran. vanioje lstelje skaidomi ne tik baltymai ir nukleorgtys, bet ir kitos mediagos. Tai atlieka kit gen koduojami fermentai: gliukanazs, ksilanazs ir kt. fermentai skaido lstels sienels polisacharidus; amilazs krakmol;, lipazs lipidus. Skiriami trys programuotos lsteli ties tipai, todl pastaruoju metu siloma apoptoze vadinti tik t tip, kuriame dalyvauja kaspazs arba joms panaios proteazs. Apoptozs reguliacija augaluose itirta nepakankamai. Be to, kiekvienam numatytos lsteli ties pasireikimui yra savi reguliavimo genai. Geriausiai itirti du reikiniai: lapo mezofilo lsteli tis joms virstant negyva gretimo indo lstele ir hiperjautrus atsakas patogen. Dl pastarojo patogenas lokalizuojamas vienoje vietoje, negali plisti po vis augal. Hiperjautr atsak reguliuoja keletas gen. I j LSD1 (Lesion Simulating Disease1) koduoja mir baltym, kuris turi du skirtingus domenus: cinko pirteli transkripcijos veiksnio ir I tipo metakaspazs. is baltymas neleidia ties signalui plisti po vis augal. Kiti reguliaciniai genai LOL1, LOL2 (LSD-One-Like), atvirkiai, yra pozityvs lsteli ties reguliatoriai. Taiau pradinis impulsas lsteli iai daniausiai kyla i maos molekulins mass jungini polipeptid, netgi laisvj radikal, lipid, ceramid.
134 |
Ceramid (gr. keras ragas) yra daug sukietjusiuose dengiamuosiuose audiniuose, mogaus odos paviriniame lsteli sluoksnyje. Ceramidai yra minoriniai lstels membran komponentai. Augaluose pasigamina dvejopai: arba i paprastesni jungini, arba i sfingolipid (fosfolipid): O || + R.CHOH.CH.CH2 O P O CH2CH2N(CH3)3 | |_ NHOC.R O sfingomielinaz R.CHOH.CH.CH2OH , arba kitaip | NHOC.R Ceramidas Apoptozs sutrikimai dl gen mutacij arba fiziologini poveiki yra pratingi augalui, bet ne maiau pavojingas augalui ir neribotas apoptozs signal plitimas.
sfingomielinas OH OH NH O
OH
SAVARANKIKAM DARBUI (r. papildomai odynl) Antipods Apdangalai (integumentai) Apoptoz augaluose Asimetrin mitoz Barnaz Branduolas (nucelijus) Centrin lstel Chalaza ays Ceramidai Heterostilija Morfogenas Heterospermija Dichogamija Dygimas ( iedadulks) E3 ubikvitinligazs signalai Gametofit raida moterikojo vyrikojo Generatyvin lstel Kiauialst Heterospermija iedadulki atranka iedadulks dehidratacija Kiauialst Metakaspazs Moterikasis sterilumas Papils (lstels) Paraselektyvumas Polygonum tipas Pozicin determinacija Proteosoma Raidos ays sklapradio Rf-genai Savitas promotorius S-nesuderinamumas Brassica tipas Papaver tipas Solanaceae tipas Dulkiadaigis Sinergids signalai Spermis Sporopoleninas Supergenas Terminatorius (GMO) Genetin ablacija Haplotipas Kaspazs iedadulki alergenai iedadulks dygimas iedadulks transkriptomas
AUGAL GENETIKA
| 135
3. SKLA: GEMALAS IR ENDOSPERMAS. JUVENYLIN AUGALO RAIDA IR BENDRAS RAIDOS PLANAS. SOMATIN EMBRIOGENEZ IR APOMIKS
3. Skla: gemalas ir endospermas. Juvenylin augalo raida ir bendras raidos planas. Somatin embriogenez ir apomiks
PAGRINDINS SVOKOS odynlis Skla sklini augal (pun ir magnolijn) dauginimosi organas, kuris vystosi i apvaisinto gemalo maielio ir sklapradio, magnolijn sudaryta i gemalo, endospermo arba sklaskili ir dalies motininio augalo lsteli luobels; netipika sklos raida yra apomiks: gemalas vystosi i zigotos (apvaisintos kiauialsts) ir yra jaunas augalas, juvenylin raidos stadija, kuri vyksta ant motininio augalo, paprastai jo lstels yra diploidins (2n); endospermas (tik magnolijn) vystosi i diploidins centrins gemalo maielio lstels, iai susiliejus su vienu i spermi, todl jis triploidinis (3n), jo paskirtis mitybin, praktikai svarbu, kokios atsargins mediagos vyrauja endosperme (krakmolas, aliejus, baltymai); skiriami augalai, kuri subrendusi skla turi endosperm (dauguma vienaskili, dalis dviskili) ir kuri skla neturi endospermo (dalis dviskili augal), j yra pakeit sklaskilts; luobel sklos apdangalai, isivyst i sklapradio apdangal (integument), pagrindin j funkcija apsaugin, danai turi prisitaikym iplatinimui. Vaisius struktra, isivysiusi i mezgins, skirta skl iplatinimui ir apsaugai. Embriogenez gemalo raida. Somatin embriogenez gemalo raida i somatins lstels, pagal eig labai panai gemalo raid i apvaisintos kiauialsts; Androgenez gemalo raida i vyrikojo gemetofito (iedadulki); Ginogenez gemalo raida i moterikojo gametofito (gemalo maielio). Apomiks sklos vystymasis be apvaisinimo, skiriama kelet tip pagal kilm ir pobd. Apomiktas augalas, kils apomikss bdu. Motininiai genai gemalo raid lemia ne tik genai, kurie yra zigotoje, bet ir motininio augalo gen produktai (mRNR ir baltymai). Pagal j susidarymo viet skiriama: sporofito motininiai genai susidaro sporofito audiniuose (pvz., sklapradyje); gametofito motininiai genai susidaro gametofite dar iki apvaisinimo.
AUGAL GENETIKA
| 137
Dihaploidas augalas, kils i haploido, kuris danai yra iaugintas i vyrikojo ar moterikojo gametofit; haploidui padvigubinama chromosom skaiius iki 2n. Tai homozigotinis (genetikai grynas) augalas pagal visus genus ir kartu gyvybingas, nes haploidai yra maiau gyvybingi. Somakloninis kintamumas augal vairov, kuri atsiranda, kai augalai iauginami i somatini lsteli. Jis yra dl dviej prieasi: genetini skirtum tarp somatini lsteli ir j kintamumo - mutacij, atsirandani dl streso, kur patiria izoliuotos lstels. Biotechnologiniais tikslais stengiamasi jo ivengti, kuriami specials metodai. Totipotencija somatini lsteli genetinis visavertikumas, prilygstantis generatyvinms lstelms: neprarastas gebjimas regeneruoti visavert augal (organizm), isaugota visa genetin informacija. Kalius kamienins lstels, iaugintos i somatini lsteli,joms dediferencijuojantis arba i aktyviai besidalijani lsteli Meristemos lstels isaugoj gebjim dalintis. Dl j augalas auga. Meristem specializacija (akn, glio, iedyno, iedo) priklauso nuo speciali gen. Embrioletals letals (negyvybingi) mutantai, kurie va embriogenezs metu, padeda iaikinti gemalo raidos genus. Dauginami ir saugomi genetinse kolekcijose heterozigotins bkls (Aa). Determinacija raidos plano gijimas vystytis konkreius audinius, organus. Diferenciacija determinacijos realizavimas: transdeterminacija, ir atitinkamai, transdiferenciacija determinacijos arba diferenciacijos program pakeitimas; pozicin determinacija raidos priklausomyb nuo lsteli, lstels dali ir gen produkt vietos. Bdingas morfogen gradientas (netolygus, majantis pasiskirstymas) arba skirtinga j vieta lstelje. Dozs efektas gen raikos priklausomyb nuo j skaiiaus genome/genotipe. Bdinga endospermui, kuriame daniausiai turi bti isaugotas dozs santykis 2:1 tarp gen, paveldt i motininio ir tvinio augal. Kai paeidiamas is santykis, skla visai nesivysto arba vystosi su vairiais paeidimais. Endospermas yra atsargini mediag talpykl, laikina sklos dalis, kuri dviskili augal danai sunyksta anksti, vietoje jo vystosi sklaskilts, vienaskili kai grdas dygsta. Skiriami keli jo sluoksniai tarp j: aleuronas gyvybingos lstels, kuriose sintetinamos hidrolazs, btinos skaidyti atsargines mediagas, esanias vadinamajame. krakmolingajame endosperme. Likusios endospermo lstels numatytai na (pasireikia savita apoptoz).
138 |
endospermui priskiriamas vienos krypties genomo imprintingas, tiksliau endospermas epigenetiniu bdu valdo sklos raid: kol nevyko spermio suliejimas su antrine gemalo maielio lstele, i kurios vystosi endospermas, atitinkami gemalo genai yra neaktyvs, ir sklos raida slopinama.
3.1. Sklos sandara ir raida (bendras apibdinimas)

Skla yra vienas didiausi augal evoliucijos laimjim. Dl jo skliniai augalai, ypa magnolijnai, subujojo emje. Po apvaisinimo i magnolijn mezgins (ir kit audini) vystosi vaisius, o i sklapradio skla. Vaisius supa skl arba sklas, todl ie augalai dar vadinami gaubtaskliais. Pun sklos plikos, todl jie dar vadinami plikaskliais. J sklos atvirai iauga makrosporofil pamatinse dalyse. Tipiku atveju skla dalijama 3 dalis: sklos luobel, gemal ir atsargini mediag talpykl sandlin audin. Pastarasis vairi augal labai skirtingas ir pagal kilm, ir pagal sandar. I apvaisintos centrins gemalo maielio lstels vystosi endospermas. Kai kuri augal endospermas ilieka ir subrendusioje skloje. Tai bdinga miglini, lelijini, bulvini, salierini, karpaolini eim augalams. Svarbiausia, kad i augal grup paklina migliniai (Poaceae), kuri atstovai kvieiai, ryiai, kukurzai ir kiti grdiniai augalai yra pamatinis maisto altinis mogui. Dl ios prieasties endospermo raidai ir atsargini mediag sintezei augal genetikai skiria daug dmesio. Tai yra viena i centrini gen ininerijos problem. Kit augal endospermas nors ir susidaro, bet labai greitai nunyksta, o atsargins maisto mediagos i endospermo perneamos sklaskiltes. Pasitaiko augal, kuri skloje is reikinys vyksta ne iki galo, ir skloje alia sklaskili ilieka reliktinis endospermas. Per j papildomai maitinamos dygstanios sklos sklaskilts. Kai kuri augal atsargins maisto mediagos sandliuojamos perisperme. Jis kils i branduolo (nucelijaus) lsteli. Pasitaiko tarp gvazdikini, lgnini, pipirini eim augal. Yra ir augal, kuri skloje yra ir endospermas, ir perispermas. Dar didesn augal vairov pagal sklaskili isivystymo laipsn. Pagal sklaskili skaii augalai skirstomi vienaskilius (paklina migliniai) ir dviskilius (ia paklina ir vairenis). Miglini viena sklaskilt virtusi skydeliu (skutelijumu), kuriuo gemalas siurbia i endospermo atsargines mediagas. Antroji sklaskilt grdui sudygus apgaubia stieb ir yra panaaus linijinio gyslotumo kaip ir tikrieji lapai. Dygstanio grdo glio meristem fizikai saugo diegamakt (koleoptil). Lietuvikoje literatroje sudygusio daigo sklaskilts vadinamos skilialapiais. Sklos luobel supa gemal ir endosperm i vis pusi ir yra kilusi i sklapradio apdangal. jos sudt gali eiti ir sklapradio branduolo likuiai. Luobels paskirtis daugybin, pirmiausia apsaugin nuo nepalanki aplinkos veiksni, tarp j ir biotini. Luobels sudtyje yra antimikrobini mediag, o tvirta luobel trukdo patogenams prasiskverbti sklos vid, todl sveikos, nepaeista luobele sklos yra atsparesns patogenams. Luobel saugo skl nuo maisto mediag isiplovimo, o jos pokyiai stratifikavimo metu, atvirkiai, yra vienas i signal sklai dygti. vairs fiziniai luobels paviriaus
| 139
AUGAL GENETIKA
elementai padeda skloms isiplatinti. Medviln yra ne kas kita, kaip ilgi sklos luobels plaukeliai - trichomos.
C A D
E B
3.1 pav. Kai kurie augal sklos ir gemalo raidos mutantai:

A vairenio normalus tipas WT; mutantai monopteros (mp), bodenlos (bdl); B kukurz viviparous15 ne laiku sudyg grdai; C vairenio amp1 (twin1) poliembrionija, i pakabos lstels iaugo papildomas gemalas; D vairenio embrioletal emb2761 dauginama kaip heterozigota, tad vyksta skilimas: baltos sklos yra embriono letals; E kairje lec1 daigelis su ne vietoje plaukeliais (trichomomis) ant skilialapi deinje WT; F vairenio WT ir tt12 mutanto sklos (A pagal T. Berleth, S. Chatfield. Arabidopsis Book, 2002, P. 122; B M. Suzuki et al. Plant Journal. 2006. Vol. 45, P. 264274; C D. M. Vernon et al. American Journal of Botany. 2001. Vol. 88. P. 570582; D M. Berg et al. Plant Journal. 2005. Vol. 44, P. 866878; E West et al. Plant Cell 1994, Vol. 6, P. 17311745; F I. Debeaujon et al. Plant Cell. 2001, Vol. 13, P. 853872).
Daugelis luobels savybi, netgi tai, kaip ilgai sklos ilieka gyvybingos, priklauso nuo luobelse esani flavonoid, tanin. Btent ios mediagos sudaro sklos luobel. Tai patvirtina mutant tyrimai. Vien grup luobels raidos mutant sudaro btent flavonoid ir tanin sintez koduojani gen mutacijos, btent tt (transparent testa) arba ttg (transparent testa glabra). Be to, mutantai ttg sklos paviriuje yra prarad plaukelius ir luobel supanias gleives. domu, kad mutant ttg yra pakit ir akn plaukeliai.
Sklos luobel sudaryta i dviej sluoksni. Iorinis luobels sluoksnis yra kils i iorinio sklapradio apdangalo. Mediagos, reikalingos luobels raidai, yra sintetinamos i vidinio sklapradio apdangalo susidariusiame endotelyje, kurio lstels yra aktyvios. Endotelio raid nulemia TT16 ir TT1 genai, o luobels
140 |
iorinio sluoksnio genas AP2 (APETALA2), kuris svarbus ir iedo raidai. Skl luobels spalva priklauso nuo mediag, kurios sintetinamos endotelyje ir kaupiamos ioriniame apdangale. Vairenio genome yra bent 22 tokie genai, dauguma j ymimi TT(TT1-19), ei i j koduoja proantocianinus, kondensuotus taninus. Jie yra bespalviai flavonoid polimerai, randami tik sklos luobelje. Po oksidacijos jie gyja rud spalv (3.1 pav., F).
3.1 intarpas. Ir i plaukeli (trichom) gali bti daug naudos Vis dar gajus skirstymas vertingus ir nevertingus organizmui ir ypa mogui poymius. Tarp toki neverting augalo poymi paklina ir plaukeliai (trichomos gr. trix, kilm. trichos plaukas). Kas abejoja plaukeli svarba augalui, gali patyrinti vien kur nors i trij vairenio arba kit augal mutant gl1, gl3 arba ttg1. Tai plaukeli tapatumo gen GLABRA1 (GL1), GL3 (angl. glabrous lygi, be plauk oda) ir TRANSPARENT TESTA GLABRA (TTG1) mutacijos. Bet kurio i gen mutantams plaukeliai visikai nesusidaro. Tokius augalus tenka itin rpestingai globoti: saugoti nuo perkaitimo, vandens stokos ir kit abiotini stres, kuriems ie mutantai itin jautrs. Mutantus pult vairs patogenai, o skl daigumas bt menkas. Plaukeliai padeda taupyti vanden ir fizikai saugo nuo UV spainduli, vairi patogen, netgi aktyviai nuo oldi, pvz., dilgls plaukeliai. Kai kuri augal plaukeli pamate sukauptos nuodingosios mediagos, kai kuri patys toksikiausieji sunkieji metalai. Plaukeliai sukuria augalui mikroklimat, o skl plaukeliai padeda joms iplisti. tikinam ekonomin vert turi medviln. Tai beveik i grynos celiuliozs ilgais silais virt vilnamedio (Gossypium ssp.) genties augal skl plaukeliai. Ilgus plaukelius turi ir gluosni (Salix ssp.) genties augal sklos. Medvilns raid koduoja genai, homologiniai kit augal trichom genams, tik Gossypium genties augal genome j yra daugiau: aptikti keturi GhTTG genai. J homologija vairenio TTG1 genui tokia didel, kad kai vairenio ttg1 mutantui gen ininerijos metodais buvo perkeltas G. hirstum GhTTG genas, is transgenas gelbjo vairenio fenotip ir vaireniui iaugo normals plaukeliai. Plaukeliai dengia beveik vis augal. Iimtis yra hipokotiliui ir sklaskiltms, todl kai ant i augalo dali atsiranda plaukeliai, akivaizdu, kad genai, kurie lemia plaukeli raid, pasireikia ne vietoje, ektopikai, arba kad vyko mutacijos gen, kurie slopina plaukeli atsiradim. Taip iaikinti io tipo genai CPC(CAPRISE) ir TRY(TRIPTYCHON). Pastarasis koduoja MYB transkripcijos veiksn (TV). Labai patogus modelis tirti plaukeli genetik yra ir akniaplaukiai. Juos koduoja tie patys GL13, TTG1 genai kaip ir sklos paviriaus plaukelius. ie genai koduoja TV, bet skirtingus: GL2 homeo TV; GL1 R2-R3 MYB TV; GL3 bHLH TV, o TTG1 koduoja baltym, kuris turi vadinamj WD 40 kartotin sek ir sveikauja su kitais baltymais. akniaplaukiai tyrimams yra tuo patogs, kad jie iauga ne i vis epidermio lsteli, ioms labai itstant ior. Be to, reikinys priklauso nuo ekologini veiksni. Kai trksta kurios nors maisto mediagos, pvz., geleies, akniaplauki skaiius labai padidja. Galima stebti ir atvirki reikin. Tai prapleia galimybes tirti, kokie genai reguliuoja atsak aplinkos veiksnius. Epidermio lstelse, i kuri iauga plaukeliai, vyksta intensyvi mediag apykaita, todl j branduoliuose labai dana endoreduplikacija, net iki 32C. Kai kurios trichomos akotos, nevienodo ilgio, tad skiriami keli plaukeli raidos etapai: bendro plano (identiteto) sukrimas; branduoli endoreduplikacija; akojimasis ir tstamasis augimas. Kiekvien i etap valdo skirtingos gen grups. Plaukeli raidai taip pat yra svarbs genai, kurie koduoja mediag, sudarani lstels sienel, sintez, tarp j ir ekspansin, kurie gali sukelti alergij.
Svarbi grup sudaro MUCILAGE MODIFIED genai, koduojantys gleivi, kurios pasimato, kai skla kontaktuoja su vandeniu, sintez. Gleivs sudarytos i pektin.
AUGAL GENETIKA
| 141
Dar vien gen grup, nustatyt irgi pagal skl luobels pokyius, sudaro genai, kuri mutantams bdinga pakitusi fizin luobels sandara ir forma. Pvz., vairenio mutanto aberrant testa shape sklos yra irdels formos. Tai atsitik dl sklapradio apdangal sandaros pokyi, maesnio lsteli sluoksni skaiiaus sklapradio apdangaluose. Daugelio sklos luobels mutant sutriks ramybs laikotapis, padidjs luobels pralaidumas nepageidautinoms mediagoms. Taiau visiems luobels genams ,,diriguoja endospermo genai TITAN1, FIS (FERTILIZATION INDEPENDENT SEED).Tai visikai nenuostabu: jie siunia signalus prasidti ir gemalo raidai. Taip suderinama vis trij pagrindini sklos dali raida. Galutinai sklos luobels lstels numatytai va, taiau ne visos, bent ne vis augal. Pvz., tabako sklos luobelje ilieka gyvybingas vidins parenchimos lsteli sluoksnis. Kaip minta, luobel yra kilusi i motinos. Tai skiriamasis i lsteli poymis, labai svarbus genetikai, nes motinos somatini lsteli ir sklos endospermo bei gemalo lsteli branduoliai genetikai skiriasi: gemalo lstelse pus chromosom, o endospermo lstelse tik tredalis chromosom yra i tvo. Tad teko specialiai rodyti, kad ios sklose ilik gyvybingos lstels tikrai yra kil i motinos audini. Pasitelktas genetins ablacijos metodas (r. 2.3 intarp) ir panaudotas difterijos toksin koduojantis genas.
Dviej genom konfliktas. Genetini program perjungimas. Skirtumai tarp motinos ir gemalo bei endospermo lsteli genom i ties gali bti dideli. Tai labai akivaizdu tolimuosiuose hibriduose. Motinos ir gemalo genom konfliktas tolimuosiuose hibriduose gali bti tokio masto, kad hibridin augal pavyksta iauginti tik tada, jeigu gemalas izoliuojamas nuo motininio augalo ir auginamasi dirbtinje terpje. Po apvaisinimo vyksta pats stambiausias genetini program perjungimas i motinos genomo zigotos genom. Netgi esant nekonfliktinei padiai susidaro tarpsnis tarp i dviej genom perjungimo. I pradi veikia tik motinos genomas. Zigotos/gemalo genomas veikia ne i karto. io tarpsnio trukm yra savita kiekvienam organizmui, ir augaluose is tarpsnis itirtas nepakankamai. Nematodo Caenorhabditis elegans jis trunka iki 28 lsteli gemalo stadijos, varls Xenopus laevis iki blastuls vidurio, o pels, galima teigti, visai neegzistuoja, nes baigiasi esant dviej lsteli stadijai, po pirmojo zigotos dalijimosi. Sklos raida prasideda po apvaisinimo ir skirstoma 3 arba 4 stadijas, jeigu ketvirtja stadija laikomas sklos dygimas. Skiriamos morfogenezs, brendimo ir desikacijos (vandens praradimo) stadijos, bet po j dar galt kaip atskira stadija bti iskirtas ramybs laikotarpis. Paprastai stadijos nustatomos pagal gemalo raidos poymius (r. toliau sk. 3.2.1 sk.) ir pagal par skaii nuo apvaisinimo (angl. santrumpa DAP days after pollination arba DAF days after fertilization). Sklos raidos pabaig ymi du reikiniai: vandens praradimas desikacija ir didesnis ar maesnis ramybs laikotarpis. Desikacija. Vis sklos dali (gemalo, endospermo, sklos luobels) raida vyksta suderintai, bet j tolesnis likimas pasiekus brandos stadij yra skirtingas. T augal, kurie isaugo endosperm subrendusioje skloje, endospermo lstels numatytai va. Miglini tai atsitinka ypatingu, mumifikacijos bdu. Lstels turinys nesunyksta, kaip tai atsitinka, kai yra tipika apoptoz (r. 2.8 intarp), o ilieka visi lstels komponentai. Jie suyra tik grdui pradjus dygti. Gemalo ir endospermo dalies aleurono lstels ilieka gyvybingos, todl jos priverstos tapti tolerantikomis vandens praradimui. Jose kaupiami osmoprotektantai (cukrs, baltymai), aktyvinami iam etapui bdingi genai Lea (Late embriogenesis abundant) ir Em. Sklos brendim ir desikacij reguliuoja hormonas abscizo rgtis (3.2 intarpas). Galutinai vandens kiekis sklose ir grduose sumaja iki natraliai minimalaus kiekio (10-15 % nuo skl mass). Tai padeda skloms plisti ir itverti nepalankias slygas. Visai panaiai kaip augalo vyrikajam gametofitui iedadulkms.
142 |
Genetini itekli saugyklose (dar vadinamose gen bankais) sklos laikomos aldikliuose. Toks Augal gen bankas nuo 2004 m. kurtas ir Lietuvoje. Jis turi dvi bazines skl saugyklas Dotnuvoje (Lietuvos emdirbysts institute) ir Girionyse (Lietuvos mik instituto bazje). Siekiant, kad sklos neprarast daigumo, vandens kiekis jose specialia ranga sumainamas iki 28 %. Taip vadinamosios bazins skl kolekcijos gali bti laikomos neprarasdamos daigumo deimtmeius, o galbt ir imtmeius. Toks genetini itekli saugojimo bdas yra nesenas, todl sukaupta nepakankamai patirties apie individual vairi augal pakantum tokioms skl laikymo slygoms. Jau iuo metu aiku, kad vairios augal rys, netgi mutantai, yra nevienodo jautrumo ir gali bti taip saugomi nepersjant skirting laikotarp.
3.2 intarpas. Viskas savo laiku. ABR brendimo-ramybs stadij reguliatorius Sklos brendimas ir dygimas yra dvi fazs, kurias skiria ramybs laikotarpis. Abscizo rgtis yra pagrindinis skl brendimo ir perjimo ramybs laikotarp reguliatorius. Abscizo rgties (ABR) pavadinimas yra kils ne i kokio nors junginio (kaip danai manoma), o i subrendusi vaisi atsiskyrimo nuo motininio augalo (lot. abscissus atpltas, atskirtas), nes pirm kart ABR buvo iskirta i vilnamedio vaisi. Taiau i ties vaisi atsiskyrimas priklauso nuo kito fitohormono etileno. ABR reguliuoja skl brendim, desikacij ir ramyb, lapo ioteli varstym, pumpur ir bulvi stiebagumb ramyb, augalo atsak vairius abiotinius stresus (druskos pertekliaus, sausros, alio ir kt.). ABR yra maos molekulins mass liofilinis junginys. Jis sintetinamas i karotinoid. ABR sintez, veikimo mechanizmus, genus, kuriuos ABR valdo augaluose, tirti naudojami du tyrimo modeliai: lapo ioteli varstymas ir augal, daniausiai kukurz, mutacijos, kurios pavadintos viviparous (vp) (lot. viviparus gyvavedys). Dalis kukurz grd sudygsta ne laiku, per anksti, dar ant burbuols. O COOH Mutantai tiriami komplementacijos testu, paskui stengiamasi nuABR statyti kiekvieno naujo lokuso reikm. Daugelyje kukurz vp (3.1 pav., B) mutant (vp2, vp5, vp7, vp9, w3, y3, y9 ir kt.) blokuota ABR pirmtak karotinoid sintez. Tai gali pasireikti ir kaip augalo spalvos pokyiai (i ia w white; y yellow). Kitos vp mutacijos (vp10/vp13,vp14) blokuoja paios ABR sintez ar jos reguliacini signal perdavim (vp1). Gen, kuri raik valdo ABR, promotoriuje (cis-padtyje) yra G-box elementas. Konkreiai ABR valdomiems genams jis vadinamas ABRE (angl. ABscisic acid-Responsive Element). Tok element turi ir ABI1, ABI2 genai, kurie koduoja LEA baltymus. Tai nukleotid seka 5-CCACGTGG-3. Kviei grdo brendimo-desikacijos genas Em turi kiek kitoki, suprastint nukleotid sek 5-CACGTG-3. Savita (kuriuo metu arba kokiuose audiniuose) geno raika priklauso nuo papildomo elemento, pavadinto CE (angl. Coupling Element): Transkripcijos veiksniai CE ABRE Koduojanti geno dalis
AUGAL GENETIKA
| 143
Su ABRE elementu sveikauja dviej grupi transkripcijos veiksniai MYC/MYB ir bZIP. Kai kurie genai (ypa atsak abiotinius stresus) turi ne vien ABRE element, todl jie yra labai aktyvs. Pvz.,vairenio rd29B genas turi dvi ABRE kopijas, todl labai greitai aktyvinamas ABR, kai tik yra sausra, altis ar didelis NaCl kiekis aplinkoje. Ne visi CACGTG sek turintys genai reaguoja ABR, kaip ir ne visus su desikacija vandens stoka siejamus genus reguliuoja is fitohormonas. Kaip antagonistai ABR yra kiti fitohormonai giberelinai. Jie skatina sklos dygim, ir j gen ektopin (ne vietoje) raika irgi gali bti skl viviparijos prieastis.
Sklos brendimo-ramybs genai. Genetikai, kurie tiria sklos raidos pabaig-dygimo pradi susiduria su domiu reikiniu, savotika dviguba buhalterija. Viena vertus, slopinami gemalo raidos genai, kad jie nepasireikt dygstanioje skloje. Vairenio genome tai atlieka geno PICKLE (PKL) koduojamas baltymas. Jis yra vienas i chromatino remodeliavimo baltym. Tad epigenetiniai reikiniai svarbs ir sklos brendimo-dygimo fazms. Tarp gen, kuri raik slopina PKL geno koduojamas baltymas, yra ir PHERES1, tiesiogiai susijs su genomo reguliacija ankstyvosiose endospermo raidos stadijose (r. 3.5 sk.). Antra vertus, slopinami ir genai, kurie reikiasi vlesnse vegetatyvins raidos stadijose, pvz., lapuose. vykus mutacijai leafy cotyledon1 (lec1), ant dygstanios sklos skilialapi atsiranda plaukeliai (trichomos). Taip neturt bti. Plaukeliai (3.1 intarpas) yra ne skilialapio, o tikrojo lapo poymis. Kita vertus, vykus lec1 mutacijai, sklos gemalas tampa netolerantikas (jautrus) desikacijai, sutrinka atsargini mediag sintez endosperme ir sklaskiltse (3.1 pav.,E). Esant sklos brendimo-perjimo ramybs bsen fazei, veikia dvi gen grups. Vienai j diriguoja ABR. Jos valdomi genai promotoriuje turi ABRE element (r. 3.2 intarp), tarp j ir LEA baltymus koduojantys genai. ABR eimininkaujaesant ankstyvajai ir viduriniajai brendimo fazei. I pradi ji sintetinama motinos audiniuose ir tik vliau gemalo ir endospermo lstelse. Esant vlyvajai brendimo fazei ABR kiekis sumaja ir prasideda LEA sintez. Kita gen grup yra nepriklausoma nuo ABR. Tai jau minti LEC genai, kuri yra keletas (LEC1, LEC2) ir FUSCA3 (FUS3). FUS3 geno svarba sklos raidai nustatyta ne i karto. I pradi atkreiptas dmesys, kad fus3 (angl. fuscous tamsus, tamsios spalvos) mutantuose padidjusi antocianin sintez. Tik vliau nustatyta, kad i mutant sklose sutrikusi baltym kneli sintez, gemalas tapo netolerantikas desikacijai, o skilialapi lapo gysl sandara bna tarpin tarp skilialapio ir tikrojo lapo. ios gen grups reikm sklos raidai yra daugybin: Morfogenezs pabaiga Lapo poymi slopinimas sklaskiltse/skilialapiuose Dygimo laiko reguliacija Vlyvosios raidos programos FUS3 LEC2 LEC1 PKL
144 |
Jau mintas genas PICKLE valdo LEC1,2 ir FUS3 genus ir neleidia ektopikai, ne vietoje i somatini lsteli susidaryti gemalui. io geno mutantui pkl ilikusi, usikonservavusi (angl. pickle marinatas, srimas) geba somatinei embriogenezei i akn somatini lsteli. Mutantinis pkl genas nesugeba slopinti embriogenezs, todl augalas turi abiej gemalo ir vegetatyvins fazs augalo poymi.
Subrendusios sklos transkriptomas. Sklos brendimas usibaigia ramybs stadija, ir tik sklos luobels pokyiai, poreikis stratifikacijai rodo, kad is laikotarpis irgi nra toks ramus. Kita vertus, sausose subrendusiose sklose aptinkama daug atsargini mRNR. Vairenio priskaiiuojama iki 12470 vairi atsargini mRNR. J paskirtis kol kas neaiki. Manoma, kad jos reikalingos labai greitai baltym sintezei, kai slygos sklai dygti tampa palankios.
3.2. Sklos gemalas. Embriogenez

3.2.1. Gemalo raidos stadijos. Dviskili, vienaskili ir pun palyginimas Gemalo raida dalijama dvi fazes: morfogenezs; brendimo-desikacijos. Kita vertus, morfogenezs faz skirstoma dvi smulkesnes fazes: ankstyvosios embriogenezs, kai susikuria bendras gemalo planas su apikalinebazaline ir radialine aimis; morfologins embriogenezs, kai isivysto palyginti nesudtingos daigo organ uuomazgos. Dviskili augal tai epikotilis su glio virnine meristema, sklaskilts, hipokotilis ir gemalo aknis. Esant gemalo brendimo fazei papildom morfologini struktr nesusidaro. Pagrindinis vykis desikacija ir gemalo lsteli prisitaikymas prie jos. Dl to labai esminiai keiiasi gen raika. ie vykiai jau aptarti 3.1 sk. Esant iai fazei, labai subujoja daugumos dviskili sklaskilts ir sunyksta endospermas. I jo maisto mediagos perneamos sklaskiltes. Taim irgi reikia savit gen raikos. Gemalas juvenylin augalo/sporofito forma. Sklos gemalas ir daigas tik truput panas suaugus augal. Pagrindin augalo raida vyksta tada, kai skla sudygsta: isivysto oniniai (lateraliniai) organai (lapai, akos), iedini augal iedynai, iedai, sklos ir vaisiai. Dl ios prieasties skiriama: gemalo raida, jos metu susidaro virns (glio, apikalin) ir apaios (akn, bazalin) meristemos; pogemalin raida, kai i glio ir akn meristem susidaro dauguma suaugusio augalo struktr ir audini. Pogemalin raida savo eile dalijama dvi fazes: vegetatyvinio augimo; reprodukcijos. Pastarosios pradi ymi ydjimo laiko kontrols genai. Tie raidos vykiai, kurie vyksta embriogenezje yra svarbs visai tolimesnei augalo raidai: susikuria glio ir akn meristemos,. Tuo paiu bendras augalo planas, augimo ays ir poliai.
| 145
AUGAL GENETIKA
Gemalo padtis skloje yra labai vairi, priklauso nuo augal ries ir bendros sklos sandaros. Vien augal (pvz., aguonos Papaver) gemal i vis pusi supa endospermas, o kit (kaip raugs Agrostema) perispermas, o dar kit augal (kaip miglini eimos.augal) gemalas ir endospermas yra erdvikai atskirti. Tai paveldimos savybs ir yra speciali genetini tyrim klausimas. Labai dideli skirtumai yra tarp vienaskili ir dviskili augal pagal gemalo raid (3.2 pav.). Deja, dauguma gemalo genetini raidos tyrim atlikta tik su vienu dviskiliu augalu vaireniu. Praktin miglini eimos augal reikm, atvirkiai, skatina endospermo, kaip pagrindins atsargini mediag talpykls, tyrimus. Dviskili endospermas tik laikina (efemerin) struktra. Ankstyvas j endospermo sunykimas vertinamas kaip teigiamas reikinys, nes daigui sisavinti maisto mediagas i sklaskilts/skilialapio yra greiiau, efektyviau ir netgi patikimiau, o sklai sudygus daugelio augal skilialapiai aktyviai papildo atsargas vykdydami fotosintez, kaip ir tikrieji lapai.
Dviskili skl gemalo raida. Prisiminkime, kad bet kurios morfologins struktros raidai svarbs du momentai: polikumo ir raidos ai atsiradimas; bendrojo raidos plano atsiradimas. Pastarj sukuria bendrojo vaizdo ir organo/audinio tapatumo (master) genai. Gemalo polikumas sukuriamas labai anksti. Dar nepradjusi dalintis vairenio zigota jau padalinta polius. Jie atsirad dar anksiau neapvaisintoje kiauialstje. Jos polius sukuria branduolio ir vakuols padtis. Kiauialsts ir zigotos apatinje dalyje yra stambi vakuol, o branduolys yra virutinje dalyje. Poliams atsirasti yra svarbus ir netolygus indolilacto rgties (auksino) pasiskirstymas (3.2.2 sk.). Poliai yra ypa akivaizds po pirmojo zigotos dalijimosi. Prie tai zigota itsta ir dalijasi skersai, bet asimetrikai, nevienodo dydio ir citoplazmos tankio lsteles. Kiekviena j jau turi skirting raidos plan. Labai svarbi ir vlesn lsteli dalijimosi kryptis. Nuo jos priklauso kaip pasiskirsto gemalo raid koduojani gen produktai (r.3.4 pav.). I smulkesns, bet didesnio citoplazmos tankio lstels vystosi gemalas. Jo lsteli dalijimosi kryptis kaitaliojasi. Gemalas pereina kelet stadij, gyja vis sudtingesn sandar. Dviskili augal stambesnioji, mikropils pusje esanti lstel ir i jos kil dukterins lstels dalijasi skersai, viena grandinle (3.2 pav., A). ios lstels sudaro pailg stiebel pakab (arba suspensori). Tai laikina struktra. Jos lstels pasmerktos programuotai iai, iskyrus vien lstel hipofizio, kuri su gemalo pradmens lstelmis sudaro mir audin aknies virns meristem. Pakabos lstels genetikai neprarad gebjimo diferencijuotis gemal. Kritiniu atveju, kai sunyksta gemalo pradmuo, pakaba gelbsti skl. Tuo sitikinta, kai buvo panaudotas genetins ablacijos metodas. Gemalo pradmuo sunaikinamas, prie savito gemalui geno promotoriaus (r. 2.3 intarp) prijungiant difterijos toksino DTA gen. Tada isivysto antrinis gemalas i pakabos lstels. Retsykiais pasitaiko skl su dviem gemalais. Tokios sklos labai danos vairenio mutanto twin (dvynys;3.1 pav.,C). Jose, be pagrindinio (tikrojo) gemalo, i pakabos lstels isivysto papildomas gemalas. Gemalo raidos stadijos. Dviskilio augalo gemalas. Po pirmj smulkesniosios lstels dalijimsi isivysto progemalis (3.2 pav., A). Konkreiau jis apibdinams pagal lsteli skaii: 1-os (po pirmojo zigotos dalijimosi), 2-, 4-i, 8- ir 16-os lsteli. Kaip minta, vis laik tam tikra tvarka keiiasi lsteli dalijimosi kryptis. Tai esminis reikinys, nes tokiu bdu netolygiai tarp dukterini lsteli paskirstomi gen, nuo kuri priklauso gemalo raida, produktai. Atsiranda slygos lstelms diferencijuotis.Toliau vis labiau irykja lsteli sluoksniai .Juose lstels dalijasi sluoksniui bdinga tvarka.
146 |
4-i lsteli
Progemaliai 8-i lsteli
Ankstyvoji globul (vlyvoji globul)
Pereinamoji (trikampio)
irdies
Torpedos
Lazdos
C
Skuteliumas Koleoptil M Lapas
M 11 PPA M 1 10 2 12 3 14 4 16 5 45 Stadijos PPA
B
A 4-i ir 8-i lsteli progemaliai (skaiiuojamos lstels be pakabos); B PPA par po apdulkinimo; M glio ir virnls meristema (SAM); M aknies virnls meristema; C vaizdas i priekio (A pagal T. Berleth, S. Chatfield. Arabidopsis Book, 2002; B E. Vollbrecht et al. Development. 2000, Vol. 127, P. 3161-3172; C M. M. S. Evans, J. L. Kermicle. Genetics. 2001, Vol. 159. P. 303315).
3.2 pav. Dviskilio (A) ir vienaskilio (B) augal gemalo raidos palyginimas
AUGAL GENETIKA
| 147
Gemalas dalijamas 3 sritis domenus. Vairenio jie jau irimi esant 8-i lsteli progemalio stadijai: virninis (apikalinis), vairenio i keturi pai virutini progemalio lsteli, i jo toliau susidaro glio meristema ir didioji sklaskili dalis; vidurinysis (centrinis), kuriam tenka 4-ios likusios progemalio lstels, jo naas yra sklaskiltes, hipokotil ir akn meristem; apatinis (bazalinis) apsiriboja tik viena lstele, ir ta ne progemalio, o pakabos. Tai hipofizis, i kurio kaip minta, vystosi didioji aknies meristemos dalis. Toks gemalo suskirstymas sritis yra pagrstas daigo mutacij tyrimais (3.3 pav.): gurke daigas be virutins dalies (apikalins meristemos ir skilialapi); fackel nra viduriniosios dalies, tik skilialapiai ir menkut aknis; monopteros nra aknies ir vieno skilialapio; gnom/emb30 ilikusi tik vidurinioji sritis. is gemalo suskirstymas sritis ilieka ir vlesnse jo raidos stadijose iki pat daigo. Skirtingose srityse pasireikia skirtingi organ tapatumo genai (r. toliau). Progemalis gauna galvuts, arba kitaip globuls, pavidal. i stadija papildomai dalijama ankstyvj ir vlyvj. Globuls stadij keiia pereinamoji (tranzicijos) stadija. Ji yra skiriamoji riba tarp dviskili ir vienaskili gemalo raidos, nes kitoje dviskilts sklos gemalo stadijoje irdies morfologikai irykja sklaskili pradmenys (3.2 pav., A). Vl skiriamos ankstyvoji ir vlyvoji irdies stadijos. Tai palengvina nustatyti gen raikos pokyius. Torpedos stadijoje sklaskilts dar rykesns. Ir pagaliau - pasiekiama subrendusio gemalo, arba kitaip (pasiramsiavimo) lazdos stadija (3.2 pav., A). Brendimo stadijoje daugumos lsteli dalijimasis yra pasibaigs, bet gemalas gali padidti daugiau kaip 100 kart. Tai atsitinka dl atsargini mediag kaupimosi ir gemalo, ypa sklaskili, lsteli padidjimo. Kita vertus, ioje stadijoje prarandamas vanduo, sintetinama grup baltym dehidrin prisitaikoma prie desikacijos. ios stadijos bdingos ne tik mejoziniam gemalui, atsiradusiam po apvaisinimo. Jas visas ar i dalies pereina ir gemalai, kil i somatini lsteli (r. 3.3.2 sk.) ar dl apomikss (r.3.6 sk.). Kita vertus, yra didel augal vairov pagal gemalo raid. Vien tik pagal pirmj zigotos dalijimsi, apikalins ir bazalins lsteli reikm skiriami ei embriogenezs tipai. Vienaskili skl gemalo raida. Kaip minta, i esms skiriasi nuo dviskilio gemalo raidos. Nesutariama, kada ie skirtumai atsiranda, ar nuo pereinamosios ( tranzicijos) stadijos, ar anksiau, nes ir progemalio forma yra kitokia.I pradi jis ovalinis, o kiek vliau vzdo pavidalo (3.2 pav., B). Apatinioji vzdo dalis yra pakaba, o virutinioji gemalo uuomazga. Pereinamojoje stadijoje gemalas gyja led indelio pavidal. ios stadijos pabaigoje atsiranda kupolo pavidalo virnin meristema, kuri matoma irint progemal i priekio, ne i ono. Progemalio viduje atsiranda akn meristema. Vliau skirtumai tarp vairenio ir miglini eimos augal tampa labai ryks, netgi nesulyginami. Koleoptils stadijoje (3.2 pav., B) ir vliau vaizdas btinai pateikiamas i priekio ir i ono. Antraip sunku bt sivaizduoti raidos pokyius. Iplatja virn ir susidaro skydelis (skuteliumas). Juo gemalas siurbia maisto mediagas i endospermo. Tai ir yra vienaskilts sklos sklaskilt. Gemal supa diegamakt (koleoptil). Tai
148 |
struktros, kuri raida pasibaigia jau grdui sudygus. Diegamakt gaubia ir saugo nuo paeidim virnin meristem, o akniamakt (koleoriza) aknies meristem. Vlesns vienaskilts sklos gemalo raidos stadijos turi gana keistokus pavadinimus 1-oji 2-oji 6-oji stadijos, lyg iki tol kit stadij nebta. Bet taip yra priimta, ir i stadij pavadinimai kil nuo lapeli pradmen skaiiaus ir atsiradimo eils. Pirmojoje stadijoje pirmojo lapelio pradmuo, o etojoje stadijoje atsiranda etojo lapelio pradmuo. Tuo ir baigiasi gemalo raida. Pun sklos gemalo raida, suprantama, irgi labai skiriasi nuo vairenio gemalo raidos. Prisiminkime, kad po apdulkinimo praeina 15 mnesi, kol pagaliau dulkiadaigis pasiekia kiauialst archegonje ir suleidia j daug citoplazmos su abiem spermiais. Vieno i spermi branduolys (lieka isiaikinti, kurio arba kokio) susilieja su kiauialsts branduoliu, o kitas suyra. Paprastai apvaisinamos ir pradeda vystytis gemalai i vis archegons kiauialsi, taiau daniausiai iki pabaigos vystosi tik vienas gemalas. Ankstyvojoje embriogenezje arti apatinio archegons galo susidaro keturi lsteli sluoksniai, kiekvienas i 4-ri lsteli. I kiekvienos paties virutinio (labiausiai nuo mikropils nutolusio) sluoksnio lstels vystosi po gemal. Tuo paiu metu keturios kitos sluoksnio lstels labai itsta ir stumia keturis gemalus gilyn moterikj gametofit. Tad dar kart pasireikia poliembrionija, taiau vl iki galo vystosi tik vienas i keturi gemal. Subrends gemalas turi hipokotil su virnine (glio) ir akn meristemomis, o taip pat kelias (paprastai atuonias) sklaskiltes. I vienintelio integumento (apdangalo) isivysto sklos luobel sporofilas. Apdangalas yra i 3- sluoksni. Kieta sklos luobele virsta vidurinysis sluoksnis. Atsargini mediag talpykl yra ne endospermas ar sklaskilts, o gametofitas. Pun embriogenez yra skirstoma 3 stadijas: 1) progemalio nuo pirmojo zigotos dalijimosi iki pakabos tsimo pabaigos; 2) ankstyvojo gemalo lydimo labai spartaus gemalo augimo; 3)vlyvosios embriogenezs, kai baigia formuotis gemalas su virnine ir akn meristemomis. 3.2.2. Ypatingas reguliacinis auksino vaidmuo gemalo raidai Auksinas augal ankstyvosios raidos morfogenas. Indolilacto rgiai (IAR, auksinui) pripastamas morfogeno vaidmuo, nes progemalio lstelms bdingas IAR gradientas. Tai lemia gemalo lsteli polikum, pozicin informacij. Morfogenai yra veiksniai (baltymai, baltym-RNR kompleksai; iuo atveju netgi nedidels molekulins mass hormonas IAR), kurie valdo raid, determinuoja gen veiklos pobd per morfogeno koncentracijos gradient lstelje arba lsteli grupje. Svarbu nustatyti, kuriose vietose ir kaip sukuriamas gradientaas, taip pat kokius konkreius genus ir morfogenezs-embriogenezs reikinius valdo morfogenai. Apie IAR svarb gemalo raidai sprendiama dl keli prieasi: is augimo hormonas danai yra btinas indukuoti somatin embriogenez gemalo raid i somatini lsteli; IAR netolygiai paskirstoma ir susikaupia konkreiose gemalo lstelse;
AUGAL GENETIKA
| 149
pagal gen, kurie koduoja IAR pernaos baltymus, kitaip transporterius (neiklius), mutacij pasireikim; i IAR neiklius koduojani gen raikos vietos ir pai IAR neiklli sankaup vietos gemalo lstelse. Pirmasis IAR maksimumas pasiekiamas btent smulkesniojoje lstelje, kuri susidaro po pirmojo zigotos dalijimosi. Prisiminkime, kad i ios lstels vystosi sklos gemalas. Antrasis IAR maksimumas aptinkamas globuls stadijoje irgi labai svarbioje gemalo raidai hipofizio lstelje. Ji yra pradmuo gemalo aknelei. Kita vertus, gemalo lsteli viduje IAR pasiskirsto labai netolygiai. Lengviausia tai nustatyti pagal IAR neikli susitelkimo viet (3.4 pav., A). Taip sukuriamas lsteli polikumas ir IAR gradientas. Auksino (IAR) neikliai ir j pasiskirstymas gemalo lstelse. Kai kuri gen, susijusi su IAR sintezs reguliavimu ir paskirstymu, koduojamus baltymus irgi bt galima priskirti prie morfogen. Tai genai GNOM (GN), MONOPTEROS (MP) (r. 3.3 pav.), BODENLOS (BDL, irgi neisivysto vidurinis gemalo domenas). Pastarieji du genai, MP ir BDL, pasireikia smulkesniojoje lstelje, po pirmojo zigotos dalijimosi. i lstel mp ir bdl mutantuose keiia dalijimosi krypt. Vietoje to, kad dalintsi statmenai, ji dalijasi paraleliai pirmajam zigotos dalijimuisi. Suprantama, kad dl to kitaip erdvikai pasiskirsto gemalo raid reguliuojantys veiksniai, tarp j IAR.
Gen GN, MP, BDL ssaja su IAR yra rodyta tiesiogiai. Pvz., nors GN geno koduojamas guanino apykaitos veiksnys pasireikia vairiose augalo lstelse, taiau gemalo lstelse jis reguliuoja IAR perna vien lstels pus, nes susijs su G-baltymais ir reguliuoja, kaip susidaro pernaos priemons pslels (vezikuls). MP ir BDL sudaro gen duet, kuris sudtingu bdu valdo IAR atsako genus, t. y. tuos genus, kuriuos aktyvina IAR.
skilialapiai 1 2 monopteros aknys gnom/ emb30 WT gurke fackel 3
3.3 pav. Trys gemalo sritys (domenai ), nustatomos pagal daigo mutacijas:
(r. tekst; pagal R. B. Goldberg et al. Science. 1994, Vol. 266; P. 605614).
Ar stipriai IAR pernaos pokyiai gali paveikti gemalo raid, galima sitikinti pagal mutacijos laterne pasireikim. Mutanto laterne daigas visikai neturi skilialapi, nors hipokotilis ir aknys yra normalios. Pasirodo, laterne yra dvigubas mutantas. Jis atsirads dl mutacij i karto dviejuose genuose PINOID (PIN) ir ENHANCER of PINOID (ENP). ie du genai reguliuoja PIN1 baltymo pasiskirstym lstelje.
150 |
Apikalin dalis Hipofizis
GNOM
Bazalin dalis
Vienos lstels
8-i lsteli
Globuls
B 3.4 pav. Auksino svarba vairenio gemalo raidos bendrajam planui (A) ir svarbi gemalo raidai gen raikos skirtumai (B)
Kiekvienas genas, kuris sukuria bendrj gemalo/augalo plan, pasireikia savitai. Gemalo pradmuo yra tik viena, po I zigotos pasidalijimo maesnioji, lstel, tik joje pasireikia keturi parodyti paveiksle genai MP (MONOPTEROS), MERISTEMLESS1 (AtML1), BODENLOS (BDL) ir WOX2 (B), bet WOX8 ir WOX2 yra gametofito motininiai genai, j produktai yra zigotoje ir prie tai neapvaisintoje kiauialstje. Vliau WOX2 ir WOX8 keliai isiskiria. WOX8 pasireikia tik pakabos (suspensoriaus) lstelse. Atkreipkite dmes PIN 4 gen. Jis savitai pasireikia tik tose lstelse, i kuri susidarys aknies virns meristema, o REVOLUTA (REV) genas pasireikia gemalo lstelse, bet tik tada, kai jau yra pakaba. Auksinai pasiskirsto neatsitiktinai (A) prie konkrei lsteli membranos ir tik i vienos puss. Tai atlieka auksino neikliai (pagal D. Weijers, G. Jrgens. Current Opinion in Plant Biology. 2005. Vol. 8, P. 3237).
AUGAL GENETIKA
| 151
PIN (PIN-FORMED) gen koduojami baltymai sukuria IAR polikum gemalo lstelse. Vairenio genome yra atuoni PIN genai, i j keturi (PIN1, PIN3, PIN4 ir PIN7) pasireikia gemalo lstelse. Jie koduoja IAR transporterius (neiklius). Svarbiausia, kad i gen produktai aptinkami tik tam tikrose lstelse ir tik tam tikrose j vietose, ant lsteli membran. Antai tik k minti PIN1 ir MONOPTEROS bei BODENLOS genai pasireikia tik pradedant smulkesnija lstele po pirmojo zigotos dalijimosi. Be to, PIN1 baltymas ir toliau pasiskirsto labai savitai (r. 3.4 pav., A ir B). Kitas PIN7 genas, atvirkiai, pasireikia tik pakabos lstelse. Jo koduojamas baltymas kaupiasi labai bdingai, tik toje membranos dalyje, kuri yra nukreipta tikrj gemal (r. 3.4 pav.).
3.2.3. Gemalo raidos genai Daniausiai genai, kurie valdo gemalo raid, pirmiausia nustatomi pagal mutacijas, vliau atliekami isamesni i gen raikos tyrimai. Mutacijos gali bti dviej tip: gemalo/daigo raidos, daniausiai pagal daigo pokyius, tarp j jau mintos mutacijos gurke, fackel, monopteros, gnom/emb30; embrioletals (r. 3.1 pav., D) gemalas anksiau ar vliau va. Svarbu nustatyti ir kada tai atsitinka. Manoma, kad vairenio genome yra 5001000 gen, kuri mutacijos pasireikia kaip embrioletals, bet vairenio duomen bazje toki mutant yra apie 300. Taiau dauguma embrioletali yra ne raidos, o nam kio/apyvokos gen mutacijos. Normaliai gemalo raidai svarbus aprpinimas energija ir maisto mediagomis, reikalingomis lsteli augimui. Ankstyvosiose raidos stadijose embrioletales sunku aptikti. Dar sunkiau jas isaugoti genetinse kolekcijose. Tenka dauginti heterozigotas ir kryminti heterozigotinius augalus vien su kitu. HD transkripcijos veiksniai ir gemalo raida. Transkripcijos veiksni (TV), kurie sveikauja su DNR homeodomenu (HD), svarba pirmiausia yra meristem raidai. Pvz., iai TV grupei priklausanio vairenio geno SHOOT MERISTEMLESS (STM) mutantuose stm gemalo glio meristema visikai nesusidaro, todl mutacija pasireikia kaip embrioletal. Gemalo meristem raidai svarbus ir kitas HD koduojantis genas WUSCHEL (WUS). Jo raika aptinkama 16 lsteli progemalyje ir yra enklas, kad pradjo formuotis virnin glio meristema. Tik tada pasireikia ir kiti augimo kgeliui bdingi genai (STM, CLV3 ir kt.). Tolimesnei augimo kgelio diferenciacijai lsteli sluoksnius (jie trys, ymimi L1, L2, L3) yra svarbus HD-Zip tipo TV koduojantis genas ATML1 (Arabidopsis Thaliana Meristem L1 Layer). io geno koduojamas TV su DNR sveikauja dviem domenais HD ir leucino utrauktuko ZIP (angl. zipper utrauktukas). Paprastai ATML1 genas pasireikia tik ioriniame (L1) meristemini lsteli sluoksnyje, taiau gemalo raidoje ATML1 mRNR jau yra aptinkama smulkesniojoje lstelje, kuri atsiranda po pirmojo zigotos dalijimosi (3.4 pav., B). Tai tik parodo, kaip anksti augalo raidoje isiskiria kamienini lsteli linija. Tokios btent yra meristemins lstels. Tolesn ATML1 geno raika gemalo lstelse irgi yra domi ir neatsitiktin (3.4 pav., B). Ji nutrksta torpedos stadijoje, kai susidaro sklaskili pradmenys, ir vl aptinkama augimo kgelio L1 sluoksnyje. Toliau iose lstelse ATML1 genas pasireik per vis augalo vegetatyvins raidos faz.
152 |
HD koduojantys genai yra vairs (3.3 intarpas). Kaip galjome sitikinti, pvz., k ATML1 geno koduojamo TV savit pasirekim nulemia papildomas domenas ZIP. Danai ie papildomi domenai yra svarbs sveikai su kitais baltymais, pvz., MYB domen koduojaniais TV. Kai kurie HD genai, labai panaiai drozofilos, gali bti priskirti motinini gen grupei, t.y. pasireikia motinos/sporofito lstelse, nulemdami sklos/gemalo raid, pvz., jau ne kart mintas genas BELL1. Be jo nesusidaryt sklapradio apdangalai, o tuo paiu sklos luobel. Bet sklos luobel tiesiogiai yra sporofito lsteli darinys.
Bendrj gemalo raidos plan sukuria netolygiai paskirstomas auksinas per jo valdomus (auksino atsako) genus ir grup homeodomen koduojani gen, kurie dl panaumo WUSCHEL pavadinti WOX (WUSCHEL RELATED HOMEOBOX). Ypa sidmtini du WOX genai WOX2 ir WOX8. Jie irgi yra motininiai, tik gametofito genai, nes j koduojam mRNR miinys aptinkamas ne tik zigotoje, bet ir dar neapvaisintoje kiauialstje.
3.3 intarpas. Homeodomenus (HD) turintys transkripcijos veiksniai J tyrimai vertinti 1995 m. Nobelio premija, kuri gavo Niuslein-Folard (C. Nsslein-Volhard), Vieschauzas (E. Wieschaus) ir Liujis (E. B. Lewis). Pavadinimas kils nuo homeozini drozofilos mutacij, kurias tiriant pirm kart aptikti genai, koduojantys homeodomen. Kaip minta, homeozins yra mutacijos, kai vietoje vieno organo isivysto kitas. Homeodomenu transkripcijos veiksnys (TV) atpasta savit DNR nukleotid sek. Prisijungdamas prie ios sekos jis valdo atitinkamus genus. Labai skmingas buvo bandymas iekoti homeo gen induoli, tarp j mogaus, genome. Tai paskatino panai sek turini gen paiekoti ir tarp augal, ypa iedo, raidos mutant. Tik paaikjo, kad iedo organ raidai svarbi kita grup MADS domen koduojani gen. Pirmasis HD koduojantis augal genas atrastas tiriant ne itin reikming kukurz knotted mutacij. Ant mutanto lap atsiranda mazgeliai. Tai ne vietoje (ektopiniai) susidariusi meristema. HD TV reguliuoja daug meristem gen. Stebina labai didelis homeodomeno konservatyvumas. vairi organizm is polipeptidas labai didelio panaumo. Tai madaug 60 aminorgi polipeptidas (atitinkamai DNR 180 bp). Kaip minta, homeodomenu TV sveikauja su valdom gen promotoriais. Pagal sveikos su DNR pobd tai HTH (angl. helixturn-helix = spiral-poskis-spiral) TV. Pagal homeodomeno sek arba ypa kitas papildomas, u homeodomeno rib, sekas skiriamos kelios HD eimos ir klass. Skiriamos dvi klass. I klass genai, tarp j kukurz Kn1, rough sheath, vairenio STM-1, miei Hvknox3 labai stipriai pasireikia meristeminiuose audiniuose. Vairenio mutant stm (shoot meristemless) visikai nesusidaro glio meristema. STM geno ortologai nulemia glio meristem ir kituose augaluose. ios klass genai dar vadinami TALE (angl. Three Amino acid Loop Extension; ios trys aminorgtys yra prolinas-tirozinas-prolinas). II klass HD genai pasireikia daugelyje tirt audini. Atrodo, kad dar bus surasta treioji klas. Jos atstovas ryi genas OSM3 pasireikia tik gemalo ir iedyno meristemose. Homeodomeno-utrauktuko (HD-ZIP) eimos TV papildomai turi vadinamj leucino utrauktuk. Tai dar vienas polipeptidas, kuriuo savitai sveikaujama su atitinkamomis DNR sekomis valdom gen promotoriuose. J koduoja visa serija gen OCL 1-5, kurie aptikti kukurz genome ir pasireikia vairiose gemalo protodermos vietose. ios klass genas ATML1 (ARABIDOPSIS THALIANA MERISTEM LAYER1 yra labai svarbus meristemos lsteli L1 sluoksnio raidai. Jis pasireikia jau po pirmojo zigotos dalijimosi, savitai koduodamas virns meristem, tuo paiu gemalo pradmen, o vliau iorin (L1) augimo kgelio lsteli sluoksn. Augal HD pirto (PHD finger) eimos genai koduojaTV, kuriems bdingas cisteinu turtingas motyvas ir tik vienas Zn-pirtelis. io tipo domenai bdingi kai kuriems PR (Phatogenesis Related) baltymams. PR genai lemia atsparum patogenams. Jau esame minj sklapradio raidos gen BELL1 (BEL1), kuris pasireikia vidurinje sklaAUGAL GENETIKA
| 153
pradio raidos stadijoje. Jis yra vienas i gen, lemiani sklapradio apdangal raid. domu, kad iai homeo gen eimai priklauso ir kai kurie fotomorfogenezs genai COP1, DET1 (be to, j koduojami baltymai yra signaliniai). Kol kas labai negausu ini apie ELK-HD (pagal tris aminorgtis ELK: E Glu, L- Leu, K- Lys). ELK tai madaug 24 aminorgi papildomas domenas. HD-GL2 genai yra tarp t, kurie sukuria gemalo bendrj plan. Pavadinimas yra kils nuo GLABRA-LIKE2 geno. GLABRA genas koduoja ereli raid, yra svarbus akn meristemos raidai. HD-GL2 klass genai ne vieninteliai, kurie lemia bendrj augalo plan. Vegetatyvins augalo raidos bendrasis planas, matyt, kur kas daugiau priklauso nuo jau minto geno STM, o taip pat kito homeo sek koduojanio geno, WUS (vok. WUSCHEL suiautas, sutarytas). eiolikos lsteli progemalyje WUS geno raika yra pirmasis enklas, kad pradjo formuotis glio meristema, o WOX1-9 (WUSCHEL RELATED HOMEOBOX) eimos genai praktikai nulemia vis gemalo bendrj plan. WUS ausys kyo netgi tada, kai susidaro iedo meristema. Kartu su kitais genais (LFY, UFO) jis aktyvina iedo organ tapatumo genus AP3 (APETALA3) ir AG (AGAMOUS) (r. 5 sk.).
domiausia tai, kad po pirmojo zigotos dalijimosi i dviej gen raikos keliai isiskiria. I esms tai nulemia i dviej lsteli, susidarius po pirmojo zigotos dalijimosi, tolimesn likim: WOX2 baltymas aptinkamas tik maesniojoje lstelje, i kurios vystosi gemalas, o WOX8 baltymas tik stambesniojoje lstelje, kuri yra pradmuo hipofiziui ir pakabai (3.4 pav., B). Radialinis gemalo vaizdas. Kaip jis susikuria, nra galutinai nustatyta. Svarbi lsteli padtis progemalyje. Po keli dalijimsi 8 lsteli stadijoje vienos lstels atsiduria iorje, kitos viduje. Panaiai kaip induoli, iorins ir vidins lstels gyja skirtingas raidos programas. Tai pozicin determinacija, iuo atveju raidos priklausomyb nuo lsteli padties. Radialin raida siejama su dviem HD genais, jau mintu ARABIDOPSIS THALIANA MERISTEM LAYER1 (ATML1) ir PROTODERMAL FACTOR2 (PDF2). Abu genai pasireikia anksti gemalo raidoje ir j koduojami baltymai yra ioriniame lsteli sluoksnyje. Dvigubi i gen mutantai atml1pdf2 neturi epidermio ne tik gemalo augimo kgelyje, bet daiguose. Abu ie TV turi papildom domen START, su kuriuo sveikauja lipidai/sterolai. Subrendusio gemalo radialin vaizd apibdina trys pirminiai audiniai: epidermis, pamatinis audinys ir ind kleliai. is vaizdas, kuris pradeda susidaryti globuls stadijoje, ilieka daige ir esant augalo vegetatyvinio augimo fazei. inoma, jis toliau tobulja, ypa ind sistema, epidermyje atsiranda plaukeliai ir iotels. onini (lateralini) organ raida. Pagrindinis oninis organas yra lapas, o sklos gemale sklaskilts, kuri skaiius priklauso nuo taksono. Kaip minta, kukurz ir kit vienaskili gemale susidaro vairus lapo pradmen skaiius. Vl pasireikia pozicin determinacija. Sklaskili raida prasideda nuo dviej pradmen, kurie atsiranda augimo kgelio onuose. Jiems susidaryti centre neleidia CUP-SHAPED COTYLEDON 1-3 (CUC1-3) genai. Vieno kurio i gen mutacija labai silpnai pakeiia daigo ivaizd, bet dvigub mutant cuc1cuc2 skilialapiai yra suaug, sudarydami lyg puodel. I ia ir gen pavadinimas. CUC1-2 genams pasireikti btini MP1 ir PIN2 genai, kurie reguliuoja indolilacto rgties paskirstym. Kita vertus, nustatyta keletas gen (ROUGH SHEATH 2, NARROW SHEATH, LEAF BLADES, SEMAPHORE), kurie neleidia STM ortologui miglini genome KNOTTED1 (Kn1) pasireikti oniniuose organuose.
154 |
3.3. Netipika gemalo raida

3.3.1. Klonavimas. Somakloninis kintamumas Nelytinis/vegetatyvinis dauginimasis yra viena iskirtini augal ypatybi. iuo atvilgiu augalai yra labai vairs, kaip ir nelytinio dauginimosi bdai. Daug augal dauginasi vegetatyvinmis dalimis, bet kai kuri augal, pvz., orchidjos Malaxis paludosa gemalas atsiranda ant lapo paviriaus. Gyvavedio augalo Bryophyllum vaikuiai iauga lapo pakraiuose ir numetami ant ems, kad leist aknis kaip atskiri augalai. Nelytinio dauginimosi paplitimo prieastys pirmiausia yra genetins. Augalai, kurie yra kil i diploidini somatini lsteli, atitinka motininio augalo genotip. Isaugomas heterozigotikumas, heteroz ir naudingi augalui poymiai, atsirad dl gen sveikos ir palanki gen derini. Kai augalas dauginasi lytiniu bdu, ie kartais tiesiog unikals gen rinkiniai inyksta. Susikuria nauji, gal maiau vetingi arba reti bendroje augal masje deriniai. Visi augalai, kil i vieno nelytiniu bdu pasidauginusio arba dirbtinai dauginamo augalo, yra to paties genotipo ir sudaro klon (gr. klon akel, glis, atala). Lsteli klon sudaro lstels, kilusios i vienos motinins lstels, kuri daug kart dalijosi mitozs bdu. Vis lsteli genotipai irgi turt bti vienodi. Pats dauginimo bdas vadinamas klonavimu( 3.5 pav., A ir B).
3.5 pav. Augalo regeneracija i vienos somatins lstels:

(A) totipotencins lstels i morkos: augalo klonavimas i vienos somatins lstels, iauga visavertis augalas; (B) protoplastai i tabako lapo mezofilo lsteli; (C) somakloninis kintamumas: skirtingi augalai i to paties augalo lsteli (pagal J. J. Gleba, K. M. Sytnik. Augal lsteli ininerija, 1984, rus k.).
AUGAL GENETIKA
| 155
Augal dauginimosi bdai, kaip ir tikslai bei galutinis rezultatas, yra vairs:
Redukuota iedadulk n M Redukuotas gemalo maielis n A Androgenez n Zigotin embriogenez 2n Ginogenez (partenogenez) n Motinin apomiks 2n Tvin apomiks 2n DH, gemalas, augalas Gemalas, skla, augalas Gemalas, skla, augalas DH Gemalas, skla, augalas, IG Gemalas, augalas, IG Gemalas, augalas, IG
Sporofitas 2n
Neredukuotas gemalo maielis 2n Neredukuota iedadulk 2n
Somatin embriogenez 2n Nelytinis/ vegetatyvinis dauginimas(is) 2n
Augalas, IG
ia M mejoz; n chromosom rinkini skaiius; A apvaisinimas; DH bdas gauti dvigubus haploidus; IG isaugomas sporofito (diploidins motinos arba diploidinio tvo) genotipas. Netipika gemalo raida yra dl keli prieasi androgenezs, ginogenezs, apomikss, somatins embriogenezs. Tipika laikoma gemalo raida i apvaisintos kiauialsts. Androgenez (gr. aner vyras) dauginimasis i vyrikojo gametofito (redukuot iedadulki) lsteli ir ginogenez (gr. gyne moteris) tik i motinos (gemalo maielio) redukuot lsteli. Abi yra naudojamos gauti haploidus. ie augalai turi tik vien chromosom rinkin (n). I j padvigubinus chromosom skaii gaunami dihaploidai (DH). Tai visikai homozigotiniai pagal visus genus augalai.
156 |
Apomiks (gr. apo + mixis be susimaiymo), kaip minta, yra gemalo ir sklos raida i somatini (2n) sklapradio lsteli. Kaip ir nelytinis/vegetatyvinis dauginimasis, tai natralus bdas isaugoti palankius diploidinio augalo gen derinius, heterozigotikum. Lygiai tais paiais tikslais siekiama gauti dirbtin apomiks. Sporofito genotipas isaugomas tik tada, kai gemalas vystosi i neredukuotos diploidins lstels. Nelytiniu/vegetatyviniu bdu dauginam augal genotip vienodumas yra tik taisykl. Ji turi daug iimi, kuri prieastis btina isiaikinti ir inoti. Klonavimas yra ko gero vienintelis bdas isaugoti unikalius genotipus, todl iekoma vis nauj bd, kaip klonuoti ypa tokius augalus, kuriems natraliai nelytinis/vegetatyvinis dauginimas nebdingas. Tai labai aktualu tiems sumedjusiems augalams (puiai, eglei ir pan.), kurie iaip jau vegetatyviniu bdu nesidaugina. Taip stengiamasi isaugoti unikalius vadinamj pliusini medi genotipus. Somakloninis kintamumas (3.5 pav., C). Pagrindin klonuojam augal genetins vairovs prieastis yra pai somatini lsteli kintamumas. Jose gali vykti vis tip mutacijos ir daniausiai endomitoz. Jos pasekm gali bti arba politenins chromosomos, arba poliploidija. Netgi pirmieji poliploidai, kuriuos gavo Vinkleris (H. Winkler, 1919) buvo atsirad i somatini lsteli. Jie gauti pomidorams daug kart alinant oninius glius. Taip elgiantis, gliai susidar ne i meristemini, o i gilumini somatini lsteli. Tarp j pasitaik poliploid. Dar raikiau somatini lsteli genetin vairov pademonstravo 1931 m. T. Asiejeva. Ji privert susidaryti bulvi pridtinius (adventyvinius) pumpurus daug kart alindama bulvi gumb akutes. I adventyvini pumpur iaug bulvi gliai ir i j gumbai buvo stebtinai vairs pagal daugel tirt poymi (gumb spalv, form ir kt.). Atsirad skirtumai buvo paveldimi. Reikinys buvo pavadintas ichimerinimu, nes somatins lstels buvo skirting genotip, sudar chimer, arba kitaip somatini lsteli populiacij (lot. populus liaudis, minia). Somakloninis kintamumas gali bti naudojamas kaip priemon sukurti augal vairov. Kita vertus, tai neatitinka klonavimo tiksl iauginti vienodus to paties genotipo augalus. Tad iekoma bd, kaip io kintamumo ivengti arba bent j sumainti. Somatinse lstelse, be endomitozs, yra daugiau prieasi j vairovei atsirasti. Viena j - somatini lsteli genomo pertvarka, netgi endomitoz yra bdas iai pertvarkai. Prisideda ir epigenetiniai genomo pokyiai epimutacijos. Kita vertus, pati klonavimo procedra gali sukelti papildom kintamum. Somatini lsteli kultrose gali bti suadinta judrij genomo element transpozicija vietos pakeitimas, o su ja atsiranda genetinis nestabilumas. Jis pasireikia nauj mutacij gausa. Dl somatini lsteli kintamumo, ypa dl genetikai numatytos negrtamos genomo pertvarkos, somatins lstels gali prarasti totipotencikum. Totipotencinmis (lot. totali visikas, pilnutinis + potentia galimyb, pajgumas) laikomos lstels, kurios genetiniu atvilgiu yra lygiaverts zigotai, atitinka t genotip, kuris buvo zigotoje.
AUGAL GENETIKA
| 157
3.3.2. Somatin embriogenez Somatin embriogenez yra veikiau dirbtinis bdas gauti gemalus, taiau gemal susidarym i somatini lsteli skatina ir kai kurios mutacijos. Sukaupta patirtis rodo, kad danai tokios mutacijos gali bti vienos ar kitos augal ries iskirtinis poymis. Somatin embriogenez yra gemalo susidarymas i somatini lsteli. Somatin embriogenez pavyko gauti tik 1958 m., kai buvo sukurti metodai i somatini augal lsteli iauginti kali ir regenerantus. Daniausiai tai atliekama i suspenzini lsteli kultr. Klasikinis objektas somatinei embriogenezei yra morka (Daucus carota L.; 3.5 pav.,A). Pastebta, kad gemalas vystosi ne i vienos somatins lstels, o i j agregato, taiau gemalas iauginamas ir i vienos somatins lstels. Somatins embriogenezs stadijos. Somatins embriogenezs panaumas zigotin embriogenz labiausiai nustebino genetikus ir augal fiziologus. Somatinis gemalas nuo globuls stadijos pereina tas paias globuls, irdies, torpedos, sklaskili (lazdos) stadijas kaip ir zigotinis gemalas. Tik nesusidaro endospermas ir skla. Gemalas i karto pereina vegetatyvin faz. Jis i karto gyja glio ir aknies ais, nors nra nei mikropils, nei chalazinio gal, kurie sukuria zigotinio gemalo raidos ais. Kas inicijuoja ai atsiradim, yra vienas dar neiaikint klausim. Nesusidaro pakaba. Jeigu tai atsitikt zigotiniam gemalui, jis t. Somatiniam gemalui tai neturi takos. Maisto mediagomis ir hormonais jis aprpinamas i mitybins terps. Pakaba galbt ir susidaryt, bet lstel, i kurios ji turt vystytis, numatytai va. Tai nustatyta netgi morkoms. io augalo somatin lstel, i kurios pradeda vystytis gemalas, dalijasi asimetrikai. I turtingos citoplazma lstels susidaro gemalas, o lstel, kurioje lieka vakuol, va. Ankstyva pakabos lstels tis bdinga ir egls (Picea abies (L.) Karst.) somatiniams gemalams. Somatins embriogenezs indukcija. Kompetentinis ir nekompetentinis kalius. Somatin embriogenez ko gero leidia klonuoti visus augalus,tik reikia kartais gerokai papluti parenkant mitybines terpes, hormonus ir j derinius. Augal biotechnologai tuo ir apsiriboja. Genetikus ir augal fiziologus domina pats somatins embriogenezs mechanizmas: i vienos ar keli somatini lsteli iauga gemalas; ar tikrai gemalas gali iaugti i bet kurios somatins lstels, tik reikia parinkti tinkam mitybin terp ir hormonus; tuo paiu, ar visos somatins lstels yra genetikai lygiaverts totipotencins; kaip somatin lstel dediferencijuojasi (raida grta atgal), o paskui gyja nauj raidos program (determinuojama). Kaip minta, netgi morkos somatinis gemalas (3.5 pav., A) lsteli suspensijoje vystosi i sulipusi lsteli gumullio. Kokia ios lsteli grups reikm, kol kas nenustatyta. Tik nekelia abejoni, kad gemalas gali iaugti ir i vienos lstels. Tai rodyta auginant protoplastus lsteles, kurioms paalinta lstels sienel (3.5 pav., B). Augalo regeneracija i protoplasto labai svarbi gen ininerijai, nes protoplastus lengviau vesti genus. Kita vertus, sitikinta, kad somatin embriogenez priklauso nuo daugelio aplinkybi: augalo ries ir veisls (genotipo), netgi individuali augalo ypatum, nors naudojamos grynosios linijos. Dar lengviau negu i morkos gemalas iauga i Nicotiana L. genties
158 |
augal. J protoplastai yra modelinis objektas tirti transgen raik. Taiau net tabako pastebti skirtumai tarp atskir augal pagal gebjim regeneruoti i protoplasto.Tenka specialiai tirti ir iuos klausimus. Miglini eimos augal somatinius gemalus lengviausia gauti i nesubrendusio gemalo, dar konkreiau, i skydelio (skuteliumo) lsteli. Paaikjo ir tai, kad ne i kiekvieno kaliaus regeneruoja gemalas. Ne visos lstels pagal gebjim regeneruoti yra vienodos. Vienos lstels lengvai diferencijuojasi ir gyja nauj raidos plan. Kitose vyk, matyt, negrtami pokyiai, ir j dediferenciacija nevyksta. Lengviausiai tai rodoma kaliaus kultrose. Skiriamos kompetentins (embriogenins) ir nekompetentins (neembriogenins) lstels ir kaliai. Miglini embriogeniniai ir neembriogeniniai kaliai yra lengvai atpastami pagal ivaizd ir netgi spalv (r. 3.6 pav.). Kompetentins lstels sudaro tik nedidel dal netgi tarp mork somatini lsteli. Tad nekelia abejoni, kad somatins lstels sudaro skirtingu laipsniu determinuot lsteli populiacij: vien lsteli determinacija yra negrtama; kit lsteli lengviau ar sunkiau, bet vyksta dediferenciacija ir po indukcijos hormonais prasideda somatin embriogenez.
II
P K
3.6 pav. Miei regeneracija i mikrosporos androgenez:

I. A, B dar neiplaukusi varpa (apie 910 cm ilgio), i kurios imamos dulkins; C ipreparuota varpa: k kuokeliai; p piestel; D izoliuotos mikrosporos po 4 par poveikio manitoliu; embriogenins (g) ir neembriogenins (b) mikrosporos skiriasi dydiu; E pradjusi dalintis mikrospora; F daugialst mas i vienos mikrosporos; G jauno augalo raidos pradia; H jaunas regeneravs augalas (pagal M. Wang et al. Plant Physiology. 2000. Vol. 124, P. 523530) II. vaigds susidarymas: a) padidjusi mikrospora po pirmojo mitozs dalijimosi: generatyvin lstel (gl) tiesiog mirksta vegetatyvins lstels viduje; b) vaigd, kurios centre vegetatyvins lstels branduolys (vb), o onus nuts citoplazmos gijos (c); ls lstels sienel (pagal S. F. Maraschin et al. Journal of Experimental Botany. 2005. Vol 56, P. 17111726).
I
AUGAL GENETIKA
| 159
Kuo skiriasi kompetentins (embriogenins) lstels nuo nekompetentini (neembriogenini) lsteli, dar teks iaikinti. Somatins embriogenezs genetika. I somatins embriogenezs labai daug tiktasi. Manyta, kad ji palengvins aptikti genus, nuo kuri raikos prasideda gemalo raida. Deja, rezultatai nepateisino lkesi. Naujais genais sraas maai pasipild. Kriterijai, pagal kuriuos sprendiama apie geno svarb somatinei embriogenezei, yra: dl geno arba jo mutacijos gemalo raida gali vykti be hormon; geno mutacija arba ektopinis jo pasireikimas skatina somatin embriogenez. Be hormon indukcijos, somatin embriogenez skatina jau mintas genas BABY BOOM (BBM). Jis koduoja AP2 eimos transkripcijos veiksn. Kitas, taip pat jau mintas genas, PICKLE koduoja chromatino remodeliavimo veiksn ir, matyt, slopina gemalo raid i kit, ne zigotos, lsteli, nes pkl mutante somatiniai gemalai susidaro i somatini akn lsteli, be to, minimalioje mitybinje terpje be hormon. Programos pasikeitim i vegetatyvins gemalo skatina WUSCHEL (WUS) ir LEAFY COTYLEDON2 (LEC2) genai. Dar vienas genas, kuris skatina somatin embriogenez, priklauso stambiai MADS transkripcijos veiksni grupei. Tai AGAMOUS LIKE15
kai nera net gi iorinio induktoriaus. Tuo galima sitikinti, kai ie genai pasireikia ne vietoje ektopikai. Paprastai tai padaroma prijungiant i gen koduojani dal prie atitinkam promotori, kurie yra bdingi tam tikroms lstelms (r. 2.2 intarp). Signalai somatinei embriogenezei prasidti. Labai daug pastang skiriama isiaikinti, kokie ir i kur siuniami signalai somatinei embriogenezei pradti, kas juos priima, kaip jie toliau perneami gilyn branduol. Nustatyta, kad kompetentins lstels signalus gauna ne tik i hormon, bet ir i kaimynini nekompetentini lsteli, kurios sintetina baltymus arabinogalaktanus. io tipo baltymus jau irgi minjome. Jie reguliuoja ir dulkiadaigio augimo krypt piestels liemenlyje. Manoma, kad pavirinis baltymas, priimantis signal somatinei embriogenezei, koduojamas geno SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE (SERK). Tai receptorin LRR (angl. Leucine Rich Repeat) serino-treonino proteinkinaz. ios grups baltymai turi kartotines aminorgi sekas, kuriose daug Leu liekan. SERK proteinkinaz yra tokios sandaros: ia P signalinis polipeptidas, reikalingas sijungti membran; LZ leucino utrauk140 SERK 496 tukas (Leu Zipper); LRR kartotins LRR sekos, SP rajonas, kuriame daug prolino; T transmembraninis domenas; K kinazs domenas.
CLAVATA1 ir 2, be kuri nesusidaryt glio meristema. iai grupei priklauso ir gal ne maiau
(AGL15). BBM, PKL, LEC2, WUS, AGL15 koduojami baltymai skatina somatin embriogenez
P LZ
LRR
SP T
io baltymo struktra sidmtina ir todl, kad LRR turi ir kiti signaliniai baltymai. Tai
svarbs R baltymai. Jie lemia augal imunitet patogeniniams grybams ir bakterijoms. Vairenio genome yra penki, o kukurz trys SERK genai.
160 |
SERK kinazs priima signal lstels paviriuje ir siunia j proteinkinazi kaskada gilyn iki branduolio gen:
Hormonai
TV ir kiti baltymai (arabinogalaktanai) SERK Lstels membrana
Proteinkinazi kaskada
Branduolys Genai
Transkripcija Transliacija Diferenciacija Nauja raidos programa Gemalas

SERK genas irgi nra bdingas tik somatinei embriogenezei. Jo raika labai svarbi dulkini tapeto lsteli ir mikrospor raidai.
3.3.3. Androgenez. Gemalo raida i iedadulks Augal androgenez suprantama kitaip negu gyvn. Gyvn ji yra iimtinis atvejis, kai va kiauialsts branduolys ir gemalas vystosi turdamas tik tvo spermatozoido branduol. Tad branduolys yra paveldtas tik i tvo. Augal androgenez beveik iimtinai dirbtinis bdas. Gemalo ir augalo raida vyksta i mikrosporos. Gyvn androgenez irgi galima gauti dirbtinai, jeigu sunaikintume kiauinlio branduol, pvz., didele jonizuojamj spinduli doze. Pirm kart toks bdas gauti androgeninius augalus buvo pritaikytas aliajai kreisvei (Crepis capillaris (L.) Wallr.). Augaluose bd visikai istm i pradi augal regeneravimas i nesubrendusi dulkini, o vliau, tobuljant metodui, tiesiogiai i iedadulki. Metod atrado Indijos mokslininkai Gua (S. Gusha) ir Magevaris (S. L. Magheshwari) 1964 m.
AUGAL GENETIKA
| 161
Iaug i skirting to paties augalo mikrospor augalai yra skirting genotip. Jie skiriasi tiek, kiek skiriasi vieno augalo gametos dl vykusio skilimo (r. 1.4 sk.). Tas pat atsitinka, kai gemalas ir augalas iauginamas i gemalo maielio. Skirtingi to paties augalo gemalo maieliai irgi yra skirting genotip. Augal iauginimas i gemalo maielio vadinamas ginogeneze. Augalai, kil i iedadulks arba i gemalo maielio, pasiymi svarbia ypatybe: jie yra kil i haploidins lstels, todl yra haploidai ir pagal visus genus yra hemizigotiniai, genetikai gryni. Augal genetikoje vartojamas ir kitas bdas gauti genetikai grynus krymadulkius augalus. Tai priverstin i krymadulki augal savidulka (vaisa) daugelyje kart, kol augalas pagal visus genus tampa homozigotinis, panaiai kaip savidulkiai augalai. Ilgai praktikuojant krymadulki augal savidulk sukuriamos genetikai grynos, vaisos (inbrydingo) linijos. Jos, ypa kukurz, labai skmingai panaudotos gauti heteroz. Taiau tai ilgas kelias. Gemalo ir augalo auginimas i iedadulki yra kur kas greitesnis bdas gauti homozigotinius genetikai grynus augalus. Androgenezs indukcija. Kaip minta, augal androgenez beveik iimtinai dirbtin. Vis tik pasitaiko augal, kuriems bdinga vadinamoji tvin apomiks. Pvz., kipariso (Cupressus dupreziana) gemalai iauga i neredukuot iedadulki. Tokiu atveju iauga diploidinis tvinio genotipo augalas. Androgenezs indukcijai btinas poveikis stres sukelianiais veiksniais (aliu, osmoziniu arba iluminiu oku, badavimu ir kt.) arba hormonais. Visi ie veiksniai yra specialiai parenkami konkreiam augalui, kai norima gauti kuo didesn skaii androgenini augal, t. y. augal po androgenezs. Miei androgenezei indukuoti danai naudojamas manitolis, kuris sukelia osmozin ok (3.6 pav.). Danai derinami du poveikiai. Pvz., kvieiams geriausias yra bado (maisto mediag stoka) ir iluminio ok derinys. Labai svarbu pataikyti tinkam moment androgenezs indukcijai. Vyksta sudtingas procesas: raidos programos perjungimas, ir daniausiai skm lydi, jeigu poveikis induktoriais pataikomas momentu apie pirmj asimetrin haploidins mikrosporos dalijimsi. Po poveikio stresu dalis mikrospor tampa embriogeninmis. Jos gerokai stambesns (3.6 pav.). Likusioji dalis arba vystosi tipikas iedadulkes, arba va. Embriogenines mikrosporas danai galima atpainti ir pagal spalv. Taiau ir pakeitusi raidos program mikrospor vysymosi rezultatas gali bti dvejopas: tiesiogiai isivysto gemalas; susidaro kalius. Kalius nra pageidautinas. Juo pasinaudojama tik tada, kai tiesiogiai i iedadulks iauginti gemal nepavyksta. I kaliaus kilusiems gemalams bdingas didelis kintamumas, polisomija (chromosom paskirstymo nestabilumas). Dl ios prieasties kiekvienam ekonomikai svarbiam augalui iekoma bd, kaip iauginti gemal tiesiogiai i iedadulks. Skm lemia labai subtilios slygos: met laikotarpis, individuals augal skirtumai ir augalo genotipas. Pvz., miei genotipo igri pavyksta gauti iki 50 % ali augal. Labai didelis kliuvinys yra i mikrosporos iaugusi augal albinizmas. Pasireikia augal iedadulkms bdingas reikinys:pasialina nebranduolins genetins struktros, tarp j plastids. Atsiranda albinosai, kurie yra prarad plastides arba bent dal plastidi genomo. Vl tenka iekoti bd, kaip ivengti arba bent sumainti albinos skaii.
162 |
I mikrosporos gemalas gali isivystyti dviem bdais: vienabranduolje mikrosporoje branduolys toliau dalijasi daug kart, susidaro daugiabranduol lstel, tik tada vyksta citokinez; vienabranduol lstel dalijasi ne asimetrikai (kaip prasta), bet simetrikai, o toliau dukterins lstels dalijasi tipiku mitozs bdu. Dihaploid atsiradimas. Diploidinis organizmas, kuris atsiranda padvigubinus haploidins lstels chromosom skaii, vadinamas dihaploidu. Chromosom skaiius padvigubja arba natraliai, arba po poveikio kolchicinu, kuris, kaip inoma, slopina achromatins verpsts susidarym ir sukelia poliploidij. Natraliai chromosom skaiius padvigubja dl endomitozs arba dl branduoli susiliejimo. Androgenezs i iedadulki tikslas gauti dihaploidus. Raidos program kaita ir androgenezs genetika. Kai gemalas vystosi i mikrosporos, vyksta bent trys pagrindiniai vykiai: indukcija, kuri kaip minta, sukelia vairs stresai; dediferenciacija ir po jos prasidedantis mitozinis branduolio arba visos lstels dalijimasis; perjungimas gemalo raidos program. Pasireikia kiekvienam iam vykiui bdingi genai. Po streso, kuris indukuoja androgenez, pirmiausia suaktyvinami atitinkamo streso atsako genai. Taiau yra ir bendr vairiems atsakams gen, pvz., PR-baltymus koduojani, oksidacinio oko, tarp j ir abscizo rgties sintezs. Aktyvinami taip pat genai, susij su proteolize, lstels apsauga (pvz., glutation-S-transferazi), cukr/krakmolo metabolizmu, lstels ciklo reguliavimu. Iskirti tokioje aktyvinam gen gausoje kuriuos nors tik androgenezs indukcijai bdingus genus yra sunkus darbas, taiau rodyta, kad nuo vis sumint gen priklauso kiekybiniai androgenezs indukcijos skirtumai, todl ji nagrinjama ir kaip kiekybinis poymis. Labai svarbus vaidmuo tenka ir genams, kurie lemia programuot lsteli t. Kaip minta, didel dalis mikrospor apskritai va. Kita vertus, kai pasiekiama daugialstelin androgenezs stadija , numatytai va ir visos i generatyvins lstels kilusios dukterins lstels (3.7 pav.). Tai domus reikinys, btini isamesni jo tyrimai. Dediferenciacija, programos perjungimas yra lydimi labai dideli pokyi mikrosporos lstelse: aktyvinamas ubikvitino - 26S proteosomos kelias (r. 2.7 intarp) ir suskaidomi tipikai iedadulks raidai reikalingi transkripcijos veiksniai ir kiti baltymai, vl raida pradedama nuo nulio, aktyvinama kit gen raika; vyksta vidini lstels struktr pertvarka, ypa citoskeleto/mikrovamzdeli. Aktyviai pasireikia autofagija: stambi centrin vakuol suskaidoma dalis, o branduolys i periferijos atsiduria lstels centre. Susidaro vaigd (3.6 pav., B). Jai bdinga beveik radialin simetrija. vaigdikos lstels atsiradimas vertinamas kaip lstels dediferenciacijos ymuo, tam tikras atskaitos takas. Tai ir yra prieastis sidmti i lstels bsen.
| 163
AUGAL GENETIKA
Gemalo tapatumo gen, kurie bt bdingi tik i mikrosporos isivystaniam gemalui bent kol kas nerasta. Taiau skirting bd (zigotinio, somatins embriogenezs, androgenezs) gemalui atsirasti palyginimas dar labiau sureikmina kai kuri gen svarb gemalo raidai, jo tapatumui. Kai tik prasideda mikrosporos dediferenciacija, pasireikia jau mums gerai inomas genas BABY BOOM (BBM). Genas valdo lsteli dalijimsi. Jo raika tsiasi tol, kol formuojasi gemalas (3.7 pav.). Lygiai taip pat vis tip embriogenezei bdinga MADS transkripcijos veiksnius koduojani gen grupei priklausanio geno AGAMOUS LIKE15 (AGL15) raika. is genas androgenezje pasireikia netgi anksiau u BBM gen nuo pat indukcijos pradios, bet raika trunka trumpiau u BBM geno, kol pasiekiama daugialsts struktros stadija (3.7 pav.). Nors io geno reikm nra galutinai nustatyta, manoma, kad jis, kaip ir kiti MADS TV koduojantys genai, lemia organo tapatum. Tiek pat laiko kaip AGL15 pasireikia ir dar vienas jau mintas genas SERK. Prisiminkime, kad jis koduoja receptorin proteinkinaz, kuri bdama transmembraniniu baltymu priima signalus i alies.
b
3.7 pav. Androgenezs/gemalo raidos ir mikrosporos citologiniai pokyiai (a) ir genetin reguliacija (b):
a trys pagrindiniai tarpsniai; M mikrospora: B branduolys; V vakuol; PM padidjusi mikrospora; M mikrospora ,,vaigd; DLS daugialst struktra; NL numatytai va generatyvins lstels (GL), kurios tam tikr irgi dalijosi; G gemal panai struktra; SAM stiebo (glio) apikalin meristema; SK skydelis (skateliumas); M akn meristema; b aktyvi gen grups: dediferenciacijos metu pasireikia streso baltymai (pvz., HSP iluminio oko atsako), baltymus ir cukrus skaidanius fermentus koduojantys genai; kiti genai reguliaciniai: lsteli dalijimosi etape lsteli cikl/dalijimsi kontroliuojantys genai, tarp j svarbus reguliacinis genas BBM. Akivaizdi vien gen grupi raikos kaita kit gen grupi raik. Baby Boom (BBM) genas aktyvus nuo dediferenciacijos pabaigos (pagal G. F. Maraschin et al. Journal of Experimental Botany. 2005. Vol. 56, P. 17111720).
Daugialstje struktroje svarbi dar viena grup gen, kurie reguliuoja ryius tarp lsteli. Kai susidaro epidermis, kai kuri augal androgeninis gemalas gauna tipik irdies ir torpedos stadijoms form.
164 |
3.4. Endospermas
3.4.1. Bendri endospermo raidos vykiai Endospermas yra laikina (efemerin) struktra, kai kuri tyrintoj vertinamas kaip treiasis neapibrtos lyties organizmas. Taiau tai daugiau samprotavimai dl vaizdumo, nes endospermas vystosi i apvaisintos centrins gemalo maielio lstels. Prisiminkime, kad ios lstels branduolys daniausiai yra diploidinis, susidars susiliejus dviems poliniams branduoliams, todl endospermo lstels yra triploidins. Nepriklausomai nuo jo ypatingo atsiradimo bdo, endospermas yra tik sklos dalis. Tik klausimas, ar ilgai ji egzistuoja. Miglini eimos augal jis ilieka, kol skla dygsta. Daugelio dviskili jis sunyksta kur kas anksiau. Spariai augantis gemalas sunaudoja endospermo turin sklaskili raidai. Taiau kaip pagal bet kuriuos poymius ir sandaros ypatumus, taip ir pagal endosperm augalai yra labai vairs. Kai kuri augal, kaip pomidor, salot, ilieka iek tiek endospermo lsteli gyvybing. Jos kaupia baltymus, ypa lipidus. Kita vertus, nors miglini endospermas ilieka, bet dauguma lsteli va ypatingu bdu mumifikuojasi. i augal endosperme gyvybingos ilieka aleurono lstels, kuriose grdui dygstant sintetinami atsargini mediag hidrolizs fermentai. Deja, dar daug ko apie endosperm neinome. Pvz., netgi dviskilio augalo vairenio ilieka gyvybingos endospermo epidermio lstels, bet j paskirtis kol kas neinoma. Endospermo raidos tipai.Pagal tai,kaip prasideda endospermo raida, skiriami trys tipai: branduolinis susidaro daugiabranduol lstel, tik paskui vyksta citokinez; lstelinis citokinez vyksta po kiekvieno branduolio pasidalijimo; helobinis (gr.heles pelk) lstels dalijasi, bet toliau jos virsta daugiabranduolmis. Tai tarpinis tipas. Geriausiai itirtas branduolinis endospermas (3.8 pav.). Jo raidos pradioje susidaro daugiabranduol lstel sincitis, dar kitaip vadinamas koenocitu. iam tipui priklauso ne tik migliniai augalai, mieiai, kukurzai, kvieiai, ryiai, bet ir dviskiltis augalas vairenis. Nepaisant dideli endospermo tolesnio likimo skirtum, vairenio ir mint miglini augal ankstyvoji endospermo raida bendrais bruoais gerokai sutampa, ir veikia genai ortologai. Pati centrin lstel dar prie apvaisinim yra poliarizuota. Tai persiduoda ir endospermui. Poliams atsirasti yra svarbi ais mikropil-chalaza (r. 2.5 pav.). Labai domu tai, kad centrin lstel yra praradusi totipotencij. I izoliuotos ir in vitro apvaisintos kiauialsts pavyksta iauginti gemal, o i centrins lstels ne. Sincitinis endospermas. Po centrins lstels apvaisinimo triploidinis branduolys daug kart dalijasi mitozs bdu, bet citokinez nevyksta, tad lstel tampa daugiabranduole sinciiu (koenocitu). Centrin lstel pasiskirsto sritis (domenus). Vienaskili ir dviskili jos skirtingos. Be to, augalai labai vairs. Pvz., paprastosios vitapiens (Gagea lutea Ker.-Gawl.) chalazinje srityje chromosomos stipriai kondensuojasi ir virsta heterochromatinu. Savaime perasi palyginimas su drozofilos sincitine blastoderma i pradi branduoliai daug kart dalijasi. Vliau jie migruoja periferij, ten dar kelet kart dalijasi, paskui vyksta citokinez. Nuo branduoli vietos priklauso tolesn lsteli raida.
AUGAL GENETIKA
| 165
A. a keturi branduoli endospermas (e); b ankstyvasis periferinis e; c vidurinioji sincitinio e stadija; d - vlyvasis sincitinis e; e celiuliarizacija, kai gemalas irdies stadijos; f torpedos stadijos gemalas; g brendimo stadijos (lazdos) gemalas; MS mikropils sritis, CHS chalazos sritis, CS centrin (vidurin) sritis (pagal B. Stangeland et al. Journal of Experimental Botany. 2003, Vol. 54, P. 279290). B. a triploidins centrins lstels branduolys po dvigubo apvaisinimo: cv centrin vakuol; b, c, d branduoli dalijimasis ir sincitinio endospermo (koenocito) susidarymas; e sincitinio endospermo pabaiga; f celiuliarizacija ir susidariusi vidin ertm (alveol); g pakartotini dalijimaisi, upildant ertmes; h visikai upildyta ertm (pagal O-A. Olsen. Plant Cell. 2004. Vol. 16, Sup. 214227).
3.8 pav. Dviskilio augalo vairenio (A) ir vienaskilio miglini eimos augalo (B) endospermo raidos palyginimas:
Panaiai ir augal sincitiniame endosperme i pradi branduoliai dalijasi vienoje vietoje, paskui migruoja periferij, ir nuo vietos, kur jie atsiduria, priklauso lsteli diferenciacija. Tai pozicin determinacija. Celiuliarizacija taip pavadintas endospermo raidos etapas, kai apie branduolius su juos supania citoplazma vyksta citokinez. Nuo io momento prasideda endospermo brendimo stadija: kaupiamos atsargins mediagos. Celiuliarizacija bendras vienaskiliams ir dviskiliams reikinys. 3.4.2. Miglini endospermas i augal endospermo genetika yra daugiausia paengusi, ypa miei ir kukurz. Tai visikai suprantama, migliniai augalai yra svarbiausias maisto, paaro ir maisto pramons aliavos altinis. Be to, j endosperme vyksta unikali augalo raidai reikini: saviti lsteli ciklo pokyiai ir ne maiau savita programuota lsteli tis, genomo imprintingas. Branduoli padtis ir achromatins verpsts kryptis yra svarbi nuo pat pirmojo triploidinio centrins lstels branduolio dalijimosi. Po pirmojo dalijimosi branduoliai
166 |
isidsto ne bet kaip, o lateraliai (onin padtis). Tai nulemia kairij ir deinij endospermo puses, kurios yra skirtingos (r. 3.8 pav., B). Endospermo skirstymas skyrius (domenus) priklauso nuo tolimesns branduoli padties ir sicitinio endospermo citokinezs. Vl pasireikia pozicin determinacija. Miglini endosperme branduoliai dalijasi sinchronikai vienu metu. Kai kukurz sincityje branduoli skaiius pasiekia atuonis, jie migruoja periferij. Ten toliau dalijasi, kol j skaiius pasiekia 256 512. Tik tada vyksta citoplazmos dalijimasis, susidaro lsteli sienels vyksta citokinez, celiuliarizacija. Po jos dalis periferini lsteli ir toliau dalijasi, o vidins lstels labai stambja. Jose ne tik kaupiamos atsargins mediagos, bet ir vyksta endoreduplikacija. Anksiau manyta, kad ji btina tik didinti i lsteli aktyvum, nes daug kart vyksta DNR sintez, susidaro daug DNR molekuli (tuo paiu ir gen) kopij. iuo metu manoma, kad endoreduplikacija vyksta ir dl kitos prieasties: dygstaniam grdui reikalingos nukleotid atsargos. Pagrindins endospermo A B dalys yra keturios (3.9 pav.): p krakmolinis endospermas ji didiausia endospermo dalis, jame a kaupiasi krakmolas ir atsarginiai sa baltymai; ke aleuronas tai endospermo C epidermis, vienintelis endospermo sluoksnis, kuris ilieka gyvybingas grde; pernaos lsteli sluoksnis (dar yp vadinamas modifikuotu aleuronu) D yra prie grdo pagrindo; gemal supantis rajonas yra nedidelis, alia bazalins gemalo g dalies ir pakabos, svarbus gemalo krakmolinis gemalas BETL1 mitybai ir ryiams su gemalu. Kartu endospermas perikarpis laidumo zona tai yra rajonas, skiriantis gemal BETL1/C aleuronas gsr nuo endospermo. iam sluoksniui subaleuronas bdingos smulkios lstels su tankia 3.9 pav. Miglini (vienaskili) endospermo citoplazma sandara: Pernaos lsteles nesunku A bendra schema: gsr gemal supantis rajonas; BETL1 io geno pasireikimo sritis; g gemalas; atpainti pagal joms bding ivaizB pjvis per endosperm, parodyti sluoksniai: p pe- d. Jos pailgos, o j sienels yra su rikarpis, a aleuronas, sa subaleuronas, ke krakmo- daugybe aug ir raukli. Taip palinis endospermas; C pernaos lsteli sluoksnis: yp didinamas i lsteli pavirius. ypatinga lsteli sieneli sandara; D in situ hibridizaciKukur z pernaos lsteli jis pajos rezultatai parodantys BETL1 geno raikos viet pernaos lsteli sluoksnyje (r. taip pat tekst) (pagal P. didja iki 20 kart (3.9 pav.). DiW. Becraft. Seminars in Cell and Developmental Biolo- desniu paviriumi siurbiama daugy. 2001, Vol. 12, P. 387394). giau mediag i motininio augalo ir perneama gilesnius endospermo sluoksnius.
AUGAL GENETIKA
| 167
Pernaos lstels yra pozicikai determinuotos dar sincityje. Toje dalyje, kuri diferencijuosis pernaos lsteles, kaupiasi miei geno ENDOSPERM1 (END1) koduojamas TV. Kukurz genome tai geno ZmMRP1 (Zea mays MYB Related Protein) koduojamas TV. Jis priklauso MYB TV supereimai (3.4 intarpas). ZmMRP1 genas pasireikia i karto po apvaisinimo, bet jo koduojamas baltymas kaupiasi tik toje sinciio dalyje, kuri patenka branduoliai ir po citokinezs lstels diferencijuojasi pernaos lsteles. Bazalinje sinciio dalyje susikuria io MYB TV gradientas. Tai tipika morfogenams. Vadinasi, ZmMRP1 geno koduojamas baltymas yra pernaos lsteli morfogenas. Labai svarbs ne tik pernaos sluoksnio, bet ir viso endospermo raidos reguliatoriai yra cukrs. Tuo sitikinta pagal kukurz mutanto mn1 (miniature1) pasireikim. iame mutante slopinama ne tik endospermo raida, bet ir degraduoja motinos placentos lstels. Normal fenotip lemiantis genas pavadintas kitaip INCW1 (INvertase of Cell Walls). Jis koduoja tik invertaz, kuri paveria disacharidus monosacharidais. Paiose pernaos lstelse aptinkama baltym, kuri nra kitose lstelse. Tai maos molekulins mass, bet daug Cys liekan turintys polipeptidai, kuriuos koduoja BETL1-4 (Basal Endosperm Transfer Layer 1-4) genai. ie polipeptidai yra labai panas Brassica tipo S-nesuderinamumo vyrikj detrminant SCR ir apsauginius antigrybinius polipeptidus defensinus. Manoma, kad BETL1-4 paskirtis dvejopa. Jie yra signalins molekuls kaip ir SCR polipeptidai. Kita vertus, tai apsaugins molekuls. Grdui irgi btinas imunitetas. BETL2 antigrybin paskirtis yra rodyta. Panai paskirtis yra ir kit iame sluoksnyje esani baltym BAP1-3 (Basal layer-type Antifungal Protein1-3). BETL1 ir BETL2 genus suaktyvina ZmMRP1 geno koduojamas TV. Gemal supani lsteli sluoksnis supa ne vis gemal, o tik jo apai ir pakab. Tai palyginti nedidel endospermo dalis, bet lstels isiskiria bdinga ivaizda ir vidine sandara. Tai smulkios lstels su labai tankia citoplazma ir labai suvejusiu raukltuoju endoplazminiu tinklu. Vadinasi, jos intensyviai sintetina baltymus, nes ant raukltojo endoplazminio tinklo yra baltym sintezs struktros ribosomos. Manoma, kad ios lstels papildomai perduoda raidos signalus i endospermo gemal, nes gemalo ir viso grdo/sklos raid valdo FIS/MEA genai. Jie pasireikia endosperme, bet valdo ir gemalo raid.
3.4 intarpas. MYB viena gausiausi augal transkripcijos veiksni klasi Tai transkripcijos veiksniai (TV), kurie turi bding 51 52 aminorgi ilgio MYB domen. Pirmiausia i aminorgi seka nustatyta pauki mieloblastozs viruso onkogene v-myb. I ia kilo ios TV klass pavadinimas. Daugialsi gyvn TV is domenas pakartotas 3 kartus. Kartotins sekos yra ymimos R ( angl. repeat) ir nurodomos prie atitinkam TV, pvz., R1-R2R3 MYB arba R2-R3 MYB, nes daugelyje augal MYB TV yra tik dvi kartotins R sekos. Tai iskirtin augal ypatyb, bet augaluose pasitaiko MYB TV ir su 3-is kartotinmis sekomis. Atskir grup sudaro genai, kurie koduoja MYB tik su viena R seka. Jie vadinami susijusiais su MYB (angl. MYB-related)genais. MYB domenu TV jungiasi su valdom gen promotori cis sekomis. Sveikos pobd nulemia kartotins sekos erdvin sandara. Ji apibdinama kaip spiral-spiral-poskis-spiral (angl. helix-helix-turn-helix), todl tokio tipo TV pagal sveikos su DNR pobd apibdinami kaip HHTH. Sveikos pobdis priklauso nuo R skaiiaus ir papildom domen TV sandaroje. Tai ir lemia MYB TV sveik su konkreiais genais arba gen grupmis. R-MYB su DNR jungiasi kitaip negu tie TV, kurie turi 2 ar 3 R. i R-MYB sveika daugiau panai homeodomen tu168 |
rini TV sveik su DNR (HTH). ie TV gali sudaryti heterodimerus arba homodimerus, padidindami TV vairov ir sveik su DNR specifikum. Atskir eim su MYB susijusi TV baltym sudaro tokie, kurie kartotinje sekoje turi aminorgi sek SHAQK(Y/F)F. Nustatyta, kad jie gali bti dvejopos paskirties: vieni yra TV ir sveikauja su DNR promotori cis sekomis (pvz., MYB ST1), o kiti yra transkripcijos reguliatoriai (pvz., Le MYB1). iai grupei priklauso ir pagrindiniai cirkadinio laikrodio baltymai LHY ir CCA1. Vienas ios eimos SHAQKYF MYB genas ZmMRP1 koduoja TV, nulemiant endospermo pernaos lsteli diferenciacij. Gyvn, gryb genomuose MYB TV koduojani gen yra nedaug, todl nustebino didelis MYB baltymus koduojani gen skaiius augal genomuose. Vairenio ir kukurz genomuose vien tik R2R3MYB eimos yra apie 120 gen. Augal MYB genai koduoja baltymus, daniausiai TV, kurie nulemia lsteli form ir tip, atsak hormonus (pvz., GAMYB GA), reguliuoja antrin metabolizm (ios paskirties genai irgi pasireikia endosperme), atsak stresus, virus infekcij ir kt.
Aleuronas ir jo transdeterminacija. Aleuronas supa beveik vis krakmolin endosperm, iskyrus pernaos lsteles. Prisiminkime, kad btent is lsteli sluoksnis endosperme ilieka gyvybingas, nors ir yra prarads daug vandens. Tokios bsenos aleuronas bna, kol grdas nepradeda dygti. Tada jo lstelse gaminasi hidrolizs fermentai. io sluoksnio lstels va, kai grdas sudygsta ir sunyksta krakmolinis endospermas; isibaigia jame buv atsargins maisto mediagos. Skirtumas tarp aleurono ir kit endospermo lsteli atsiranda sincitinio endospermo celiuliarizacijos metu. ios epidermio lstels dalijasi statmenai likusioms endospermo lstelms (3.8 ir 3.9 pav.), bet ne tai nulemia i lsteli diferenciacij. Pasireikia pozicin determinacija: i kit endospermo dali patek i periferin padt lstels virsta tipikomis aleurono lstelmis. Raidos programos pakeitimas vadinamas transdeterminacija. Ji vyksta dl gen veiklos pokyi (ne dl mutacij) ir vietoje vieno audinio ar organo isivysto kitas. Transdeterminacija rodo, kad lsteli, audini, organ determinacija yra grtamojo pobdio. Taip atsitinka ir su lstelmis, kurios nors ir turi savo raidos program, patek aleurono sluoksn, j keiia virsdamos aleurono lstelmis. Nustatytas ir prieingas reikinys: aleurono lstels gali virsti krakmolinio endospermo lstelmis.Taiau panaus aleurono lsteli virsmas krakmolinio endospermo lstelmis vyksta ir dl mutacij dek1 (defective kernel1) ir cr4 (crinkly 4 raukltas). Bna rauklti grdai. Tas pat raidos (fenotipo) pokytis gali vykti dl dviej prieasi: mutacij, kurios danai (jeigu jos ne somatini lsteli) yra paveldimos palikuoni kartose; gen veiklos pokyi, kurie yra dl vairi prieasi.
CR4 genas koduoja receptorin proteinkinaz, kuri svarbi perduoti signalus. DEK1 ir CR4 yra aleurono tapatumo genai. J veikl valdo SAL1 (Supernumerary Aleurone Layer1). io geno mutantas sal1 turi padidint aleurono lsteli sluoksni skaii.
Krakmolinis endospermas, kaip minta, yra pati didiausia endospermo dalis, btent jame kaupiasi krakmolas ir atsarginiai baltymai. is sluoksnis dvejopos kilms.
AUGAL GENETIKA
| 169
Didij dal sudaro lstels, kurios upildo endosperm celiuliarizacijos pabaig, lstelms dalijantis endospermo centre netvarkingai, vairiomis kryptimis. Kita dalis lsteli atsiranda i aleurono lsteli, todl vadinamos subaleuronu. Tai aktyviai besidalijani lsteli zona. Krakmoliniame endosperme iskiriama dar viena laidumo (kondukcijos) zona. Jos lstels siskverbia gilyn endosperm nuo pernaos lsteli (3.9 pav.). Krakmolinis endospermas ir numatyta lsteli tis. Kaip minta, ji vyksta netipiniu mumifikacijos bdu: nevyksta uvusij lsteli irimas, kol grdas nepradeda dygti (r. 2.8 intarp). Tik DNR skaidymo pradia yra labai tipika i anksto numatytai lsteli iai: susidaro DNR fragment kopios, bet tuo, atrodo, DNR skaidymas baigiasi iki grdo dygimo. Lsteli t reguliuoja hormonai abscizo rgtis ir etilenas. ie hormonai apskritai valdo grdo/sklos brendim. 3.4.3. Vairenio endospermas Endospermo sandara. Dviskilio augalo endospermas neturi taip aikiai apibrt dali kaip miei ar kukurz endospermas. Vis tik jis dalijamas 3 skyrius/domenus (3.8 pav.): mikropils (priekin), centrin (periferin), chalazin (upakalin). Kaip buvo galima sitikinti, skyrius skirstoma pagal mikropils-chalazos padt. Endospermo raida irgi prasideda nuo sinciio, daugiabranduols lstels, bet branduoli dalijimasis vyksta asinchronikai. Be to, kiekvienoje zonoje yra savas branduoli dalijimosi laikas. Dl asinchroniko branduoli dalijimosi sincitiniame endosperme i viso yra tik 200 branduoli (palyg. su 256512 kukurz). Labai svarbus branduoli isidstymo ir migracijos pobdis. Jis daug priklauso nuo mikrovamzdeli. Branduoli dalijimosi pobd, endospermo diferenciacij reguliuoja TITAN gen grup. Vairenio genome j bent devyni. Mutant titan endospermo branduoliai labai padidja. ie genai valdo bent dvi vyki grandis. Vieni reguliuoja chromosom chromatino sandar per vadinamuosius chromosom pastoli baltymus kohesinus (SCM1 ir SCM3) ir kondensinus. TTV3 baltymas tiesiogiai identifikuotas kaip SCM2 kondensinas. Kaip pats pavadinimas rodo, tai yra baltymas, nuo kurio priklauso chromosomos kondensacija. Kiti (TTN1 ir TTN5) baltymai svarbs mikrovamzdeli kompleksui. Susiskirstymas zonas vyksta jau po pirmj keturi branduoli dalijimsi (3.8 pav.). Nuo 16 branduoli stadijos atsiranda skirtumai pagal branduoli form, mikrovamzdeli isidstym, citoplazmos savybes. Celiuliarizacija prasideda, kai gemalas bna irdies ir torpedos stadij, o endospermas atuntajame mitozs cikle ir pasiekia 200 branduoli rib. Celiuliarizacija irgi asinchronika. Pirmiausia ji vyksta priekiniame, mikropils skyriuje, aplink gemal, paskui centriniame (periferiniame) skyriuje. Chalaziniame skyriuje celiuliarizacija nevyksta. Daugiabranduol citoplazmos mas ioje endospermo dalyje vadinama cista. Dalis ios daugiabranduols citoplazmos labiau kondensuota ir vadinama mazgeliais (nodulmis). Cistos ir noduli paskirtis kol kas neaiki, bet ios struktros gemalui augant kaip ir didioji likusio endospermo dalis sunyksta. I vairenio endospermo ilieka tik epidermio
170 |
sluoksnis. Pagal padt ir gyvybingum, tik ne pagal paskirt, kuri iki iol neinoma, is sluoksnis panaus miglini aleuron. Tad subrendusioje vairenio skloje yra iek tiek gyvybing endospermo lsteli. Dauguma gen, kurie valdo vairenio endospermo raid, yra ortologai miglini endospermo raidos genams. 3.4.4. Trumpai apie dygim. Dviguba aleurono reguliacija. Giberelin vaidmuo Vis augal sklos turi sudygti laiku. io reikinio reguliacija sudtinga ir bdinga konkreiai ne tik taksonominei, bet ir fiziologinei-biologinei augal grupei ar veislei: kokios trukms ramybs laikotarpis, kaip lengvai veikiama sklos luobel ir kt. Antai vairenio skloms reikalingas ramybs laikotarpis, kurio galima ivengti alio oku ir viesa. Ji aktyvina fitochromus. DAG1 (Dof Affecting Germination) geno mutantai dag1 dygsta tamsoje be ramybs laikotarpio. DAG1 genas koduoja cinko ,,pirteli TV. Genas pasireikia motininio augalo audiniuose, todl sklos yra mutantinio fenotipo, netgi jeigu kiauialst apvaisino spermis su laukinio tipo dominuojaniu genu. Geriausiai itirtas miglini grdo dygimas. Brstaniame grde, be gen, kurie koduoja dehidratacij ir atsargini mediag sintez, veikia genai, kurie koduoja vadinamuosius gynybinius baltymus, tarp j ir giberelin (GA) atsako slopiklius, hidrolizs ferment inhibitorius. Pvz., genas Lti1 koduoja tripsino inhibitori, kuris reikalingas slopinti proteolitinius fermentus. Atsargini baltym ir proteazi inhibitoriaus genai veikia suderintai. J promotoriuose yra tokios pat cis sekos (r. 3.6 intarp). Jie yra kartu aktyvinami ir slopinami. Gynybini baltym paskirtis yra neleisti sklai/grdui nelaiku sudygti. Abscizo rgties/GA santykis. Kaip jau minta (r. 3.1 sk.), brstaniose sklose ar grduose ypatingas vaidmuo tenka abscizo rgiai (ABR), o tiksliau ABR/GA (giberelin) santykiui. Nedygstanioje skloje vyrauja ABR. ABR slopina genus, kurie pasireikia dygstanioje skloje arba grde. Kai skla dygsta, nusveria GA. Suprantama, kad yra genai ir fiziologiniai signalai, kurie santyk reguliuoja. iuo atvilgiu dideli skirtum tarp vienaskili ir dviskili, matyt, nra. Vairenio genome aptiktas genas slopiklis SPINDLY (SPY), kuris slopina sklos dygim. Miglini, konkreiai miei, genome aptiktas jo ortologas HvSPY. Dygstanti skla/grdas. Vienu i fiziologini veiksni, reguliuojani gen veikl, yra vanduo dehidratacija/hidratacija. Kai grdas prisisiurbia vandens, miglini grdo skydelyje (skuteliume) gaminasi giberelinai (GA, r. 3.5 intarp). Jie ,,diriguoja dygimo pradiai. GA patenka aleurono lsteles ir ten suaktyvina GA atsako genus, pirmiausia GAMYB gen, o io koduojamas TV aktyvina hidrolizs ferment ( -amilazs, proteazi) genus. ie fermentai aleurone neusibna. Jie gabenami (sekretuojami) krakmolin endosperm, ten skaido krakmol ir atsarginius baltymus. Taip grdas pereina dygimo faz. Suskaidyti cukrs tampa ir gemalo gen reguliatoriais. Pasireikia tik augalams bdingas metabolizmo kelias, vadinamasis glioksilato ciklas: atsargini lipid riebal rgtys paveriamos gliukoze ir sacharoze. Gyvnai riebal rgi paversti gliukoze nesugeba.
AUGAL GENETIKA
| 171
3.5 intarpas. Giberelinai augal hormonai, kurie reguliuoja ne tik skl dygim. Pavadinimas kils i parazitinio grybo Gibberella fujikuroi, kuris iskiria giberelino rgt (GA3) ir ja skatina ryi stieb augim. Giberelinai yra augal hormon grup, kuri sudaro vairs diterpenoidai, ir j pavadinimai daniausiai pateikiami kaip standartin santrumpa nuo angliko pavadinimo (GA Gibberellic Acid): GA3, GA1, GA5 ir pan. ia santrumpa danai prasideda ir giberelin atsako gen pavadinimai, pvz., GAMYB. Ja prasideda ir cis seO kos pavadinimas giberelin atsako gen promotoriuose. Tai GARE (angl. HO CO OH GA Responsive Element): TAACAAAA Giberelinai reguliuoja ne tik sklos CH3 dygim, bet ir daug kit augalo proceHOOC CH2 s,: ioteli varstym, augim, GA3 ydjim (vadinamj giberelino keli). Proceso, kur reguliuoja GA, savitum nulemia papildomos cis sekos gen promotoriuose. Miei ir kukurz gen, kurie pasireikia endosperme ir dygstaniame grde, promotoriuose ios sekos jungiasi GA atsako kompleks GARC (GA Response Complex). Jame papildomai yra. pirimidin elementas CCTTTT ir kita seka TATCCAC. Ji reikalinga visikam GA atsakui dygstaniame grde. Atsakas pasireikia aleurono lstelse. GA aktyvina mint GAMYB gen, o jo koduojamas TV indukuoja -amilazi, proteazi, B-glukanazs ferment, kurie skaido atsargines mediagas endosperme, sintez. GAMYB TV yra abscizo rgties antagonistas. Brstaniame ir subrendusiame, bet nedygstaniame grde, atvirkiai, GA signalai yra slopinami, ir mintus fermentus koduojantys genai aleurone yra neveikls. Svarbi pusiausvyra tarp dviej hormon: abscizo rgties, kuri dygim slopina; giberelin, kurie dygim skatina. Kai grdas ibrinksta, santykis persveriamas GA naudai, nes skydelyje (skuteliume) sintetinami GA ir perneami aleuron. Labai skmingai GA atsako mutantai Rht-A1a ir Rht-D1a buvo panaudoti sukurti emages kviei veisles. Tokie kvieiai neigula drkinamose ir intensyviai triamose dirvose, todl ios veisls paplito tose alyse (Indija, Pakistanas, Filipinai, Meksika, ri Lanka), kur yra drkinamoji emdirbyst. Indijoje ir Pakistane kviei derlius dl i veisli padidjo beveik dvigubai, iki 20 ton i ha. Tai buvo pavadinta alija revoliucija. Vienam i i veisli krj Borlagui (N. Borlaug) 1970 m. teikta Nobelio taikos premija. Kviei Rht-A1a ir Rht-D1a mutant normals (WT) aleliai per DELLA (r. 2.4.3.1 sk.) domen slopina augim. Slopinim normaliai paalina GA. Minti mutantai GA nereaguoja, ir augal augimas yra pastoviai slopinamas.
172 |
3.5. Motininis ir gen dozs efektai. Genomo ,,imprintingas ir sklos raida

3.5.1. Motininiai ir zigotos genai. Gen doz endosperme. Motininis efektas Pradinius gemalo ir apskritai sklos raidos etapus nulemia motininiai augalo genai. Taip pasireikia vadinamasis motininis efektas. Palyginkime turimas inias apie svarbi sklos raidai gen raikos viet ir laik. Pagal tai genus galima suskirstyti keturias grupes: motininius sporofito (pvz., BELL1), motininius gametofito (WOX2, WOX8), zigotos (MONOPTEROS, BODENLOS ir kt.), endospermo (ENDOSPERM1, BETL1-4 ir kt.). Motinin efekt nulemia dvi pirmosios gen grups: motininiai sporofito ir gametofito genai. Motinos poveikis sklos raidai pasireikia ir per mityb, aprpinim maisto mediagomis, energijos itekliais. Tiesiogiai sporofito genai nulemia sklos luobels raid, nes sklos luobel yra ne gametofito, o sporofito dalis. Ji isivysto i sklapradio apdangal (integument). Sklos luobel padeda sporofitui dar vienu bdu reguliuoti sklos raid, nes nuo sklos luobels priklauso sklos dydis ir forma. Motininiai gametofito genai. Suprantama, kad visi mutantai, kurie stipriau ar silpniau paeidia gemalo maielio (megagametofito) raid, turi takos ir sklos raidai. Taiau yra ir bendrojo plano (master) genai, kuri raika prasideda dar gemalo maielyje, bet ie genai valdo gemalo arba endospermo raid, arba abiej, kaip FIS grups genai (FIE, MEA, FIS2 ir kt.), arba gemalo ir pakabos raid kaip, atitinkamai, WOX2 ir WOX8 (r. 3.4 pav.). FIS grups genai pasireikia dar centrinje gemalo maielio lstelje. Motininiai gametofito yra ir du genai CAPULET1 ir 2, kurie pasireikia gametofito lstelse, o j mutacijos cap1 ir cap2 slopina gemalo ir endospermo raid. Motinini gametofito gen grupei priklauso ir tie genai, kurie koduoja atsargines mRNR. Jos saugomos gemalo maielio kiauialsts arba centrins lstels citoplazmoje, o i gen koduojami baltymai sintetinami jau po apvaisinimo, zigotoje arba endosperme. Taip pasireikia vairenio genas PRL (PROLIFERA). Patikrinti, ar motininis genas yra sporofito, ar gametofito, galima genetikai. Pasinaudojama embrioletalmis. Tarkime, kad alelis lemia embrioletal. Heterozigotinis augalas (sporofitas) Aa yra normalus, nes A alelis slopina letalj recesyvj gen a. Svarbiausia, kad tokio augalo ir visi gametofitai yra normals, gyvybingi. siterpia atranka, ir visi gametofitai (jie haploidiniai), kurie yra paveldj a, va. Ilieka tik A alel paveldj gametofitai. Taiau dl dalies gametofit ties gali sumati skl/grd derlius. Letalieji genai, kurie pasireikia gametofite, turt eliminuotis dl gametofito haploidikumo: haploidins lstels, kuriose pasireikia letalusis genas, va. Kai letalusis alelis a yra motininis gametofito genas ir sporofitas yra homozigota aa, visi gametofitai va. Pasireikia moterikasis sterilumas. Sporofitui aa nepakenkia, jeigu nepasireikia jo lstelse.
AUGAL GENETIKA
| 173
Zigotiniai genai. Vyrikojo genomo inaktyvinimas. Zigotoje yra du genomai i motinos ir i tvo, taiau tiek augal, tiek ir gyvn pirmosios gemalo raidos stadijos vyksta vienodai: nedalyvauja i tvo paveldtas genomas. Gyvn spermatozoido branduolys visikai inaktyvintas, nes jo chromatinas yra labai kondensuotas. Vietoje histon jame yra didesnio armingumo baltymai protaminai. Tik po kurio laiko po apvaisinimo spermatozoido chromosomose protaminus keiia histonai. Tada pradeda veikti ir genai, paveldti i tvo. Inaktyvinimo trukm yra gyvnui bdinga ypatyb. Pvz., pels tvinio genomo perjungimas vyksta dviej lsteli stadijoje, nematodo Caenorhabditis elegans tik 28 lsteli stadijoje, o varls Xenopus dar vliau, blastuls stadijos viduryje. Augal spermi branduoliuose chromatinas, panaiai kaip gyvn, irgi yra stipriai kondensuotas dl savit spermiui histon, todl i spermio paveldti genai kur laik irgi yra neaktyvs. Pvz., kukurz buvo itirta 16 tik ankstyvajai sklos raidai bding gen. Tik i motinos paveldti i gen aleliai pasireik pirmsias tris dienas. Deja, perjimo trukm ir io proceso genetin reguliacija augaluose itirti nepakankamai. Centrins gemalo maielio lstels/endospermo vaidmuo. Genom santykis endosperme. Sklos raidai ,,diriguoja genai, veikiantys endosperme. Tai jie atlieka dviem bdais: per motinos (m) ir tvo (t) genom santyk: 2 m:1 t; per genomo imprinting. Pastarasis reikinys apskritai aptiktas tik augal endosperme, bet tai nra tikrasis genomo imprintingas, kuris bdingas gyvnams. J genome genai ymimi abipusiai:vienas i motinos, kitas i tvo. Kodl centrinis gemalo maielio branduolys turi bti diploidinis (jis atsiranda, kai susilieja du poliniai visikai tapai genotip haploidiniai branduoliai), klausim kol kas atsakymo kaip ir nra. Greiiausiai tai galima sieti su reguliaciniu endospermo vaidmeniu sklos raidai. Santykis 2:1 yra signalas sklos raidai. Tuo sitikinta sukrus vairius motinos-tvo genom santykius endosperme. Pasinaudojama abiej ri poliploidais: autopoliploidais ir alotetraploidais. Pastarieji yra tolimieji hibridai. Dl dvigubo magnolijn apvaisinimo, kur 1898 m. atrado rus mokslininkas S. G. Navainas, o po met - L. Guignards (tartinai netgi su tais paiais augalais), endospermo lstelse susidaro unikalus genom santykis: 2 motinos (m): 1 tvo (t) Tai taisykl, nuo kurios nukrypimas daniausiai reikia sklos abort: mmm Sunykt mmt mtt ttt
Normalus endospermas Normali sklos raida
___Sunykt ____
i taisykl galioja ir poliploidinms augal rims, kaip paprastasis kvietys (Triticum aestivum L.), kuris yra heksaploidas, turi 3 genomus A, B, D:
174 |
Tvai
42(14A + 14B + 14D 42(14A + 14B + 14D Mejoz 21(7A + 7B + 7D) Tvo gametos Dvigubas apvaisinimas
Motinos gametos 21(7A +7B + 7D)
42 (14A + 14B + 14D) Zigota/gemalas Centrin gemalo maielio lstel/ polini branduoli susiliejimas 42(14A + 14 B + 14D)
63 (21A + 21B + 21D) Endospermas/genom santykis 2m:1t
Kryminimuose manipuliuojant vairenio tetraploidiniais ir diploidiniais augalais, gauti vairs m:t genom santykiai: kai endosperme 4m+1t (hibridas 4n2n) sklos yra smulkios ir negyvybingos; kai endosperme 2m+2t (hibridas 2n4n) nenormaliai suveja endospermas, o sklos raida yra abortyvi. Kukurz sukurta dar didesn m:t genom santyki vairov: 1m:1p 5m:1p 2m:2p 5m:2p 2m:1p 3m:1p 4m:1p Tik 2m:1p ir 4m:2p (2:1) buvo normals grdai; o kai genom santykis buvo 3m:1p, isivyst smulks grdai. Visais kitais genom deriniais buvo abortyvi grdo raida. Kai santykis yra 4m:1, pirmiausia nukenia pernaos lsteli sluoksnis, kuris normaliai susidaro prajus 8 paroms po apvaisinimo, o kai santykis 2m:2t, is sluoksnis beveik visikai neisivysto. Suprantama, kad tada endospermas neaprpinamas maisto mediagomis i sporofito, nors ir susidaro iek tiek lyg normali grd, dauguma skl nunyksta. Nutrksta tropinis sporofito poveikis endospermo raidai, o per tai ir gemalo raidai. Tokia yra pernaos lsteli paskirtis. Kol endosperme genom santykis netampa 2m:1t, t. y. kol nevyko centrins lstels diploidinio branduolio susiliejimas su spermiu, nra signalo gemalo raidai. Pvz., po apvaisinimo vilnamedio centrins lstels branduolys dalijasi i karto ir po 10 dien endospermo raida jau baigiasi; zigotos branduolys pradeda dalintis tik po 2,53 dien. Kukurz is tarpas yra apie 12 val. Dauguma tvo gen kur laik neveikls, pasireikia jau nagrintas motininis efektas. Kukurz endospermo i motinos puss pavelAUGAL GENETIKA
6m:1p 7m:1p
3m:2p 4m:2p
6m:2p
| 175
dtame diploidiniame branduolyje tos DNR vietos, kurios paprastai metilinamos, yra hipometilintos. Yra tiesiogin ssaja tarp DNR metilinimo intensyvumo ir gen aktyvumo: DNR metilinimas slopina gen ir genomo veikl. Kukurz endosperme 2m genomas yra apie 13 % silpniau metilintas lyginant su tomis DNR vietomis, kurios yra metilintos normaliai veikianioje lstelje (pvz., lapo). Taip sudaromos lengvatins slygos pasireikti i motinos paveldtiems genams. Be to, DNR metilinimo skirtumai yra bdas atskirti, kuris genomas yra motinos, o kuris tvo. Kitas signalo pradti sklos raid perdavimo bdas yra susijs su ,,genomo imprintingu ir genais, kuriems is reikinys yra bdingas. Reikinio pavadinim imame kabutes, nes i ties tai nra toks genomo imprintingas, kuris bdingas gyvn genomui. 3.5.2. Vieno kelio genomo imprintingas endosperme. Epigenetinis endospermo raidos reguliavimas Genomo imprintingas tai atmintis, ym, i ko palikuonis yra paveldjs chromosom: i tvo ar motinos. ymjimo bdas DNR sek nekeiia. Tai epigenetinis reikinys. Kaip ir endospermo genom santykis 2m:1t, genomo imprintingas yra signalas, kad vyko apsivaisinimas ir laikas prasidti endospermo ir gemalo raidai. Kita vertus, tai bdas ivengti partenogenezs ir apomikss. Imprintingo pobdis. Panaiai kaip induoli, augal ymimas ne visas genomas, o tik paskiri lokusai. Suartina su induoliais ir pats imprintingo mechanizmas, taiau induoli imprintingas ciklikai kartojasi ir pasireikia suderintai i tvo ir motinos pusi. Prie gamet susidarym genomai (genai) paymimi naujai, kad vl bt aiku, kas paveldta i tvo, o kas i motinos. iedini augal genomo imprintingas yra diskutuotinas, daugiausia tirtas endospermo gen. Endospermo genams bdingas vieno kelio imprintingas. Endospermas yra laikina struktra, i kurios neisivysto joks augalo vegetatyvins fazs organas, todl atpuola ciklinis imprintingo kaitaliojimasis. Yra ir induoli organas, kuriam bdingas vieno kelio imprintingas tai placenta. Nuo tvo-motinos priklausantys genai. Tai, kad geno pasireikimas priklauso nuo to, i ko paveldtas alelis i tvo ar motinos, yra pirmasis enklas, kad genui gali bti bdingas genomo imprintingas. Pagal Mendelio dsnius, geno pasireikimas nuo tvo-motinos nepriklauso. Abipusi kryminim rezultatas yra vienodas, ar AAaa, ar aaAA. Be to, bdinga vadinamoji. bialelin raika: pasireikia abu aleliai. Heterozigotose pasireikia dominuojantysis genas, o recesyvusis yra stelbiamas, bet jeigu recesyvusis genas nors kiek yra aktyvus, aptinkami abiej gen dominuojaniojo ir recesyviojo aleli koduojami produktai. Tai vis ta pati bialelin raika. Ir dar viena svarbi ypatyb: kai recesyvusis genas, tarkime, a, yra letalus, heterozigotose jis yra slopinamas dominuojaniojo alelio A, ir tai nepriklauso, i ko paveldtas A genas i tvo ar motinos. Teigiama, kad dominuojantysis alelis A gelbsti organizmo fenotip:
176 |
Aa A tvo (t)
AA A(t)a
arba
AA
Aa A(m)a
Vienodai gyvybingi A gelbsti fenotip
A motinos (m)
Kitaip yra, kai genui bdingas imprintingas. Pasireikia tik vieno kurio, tvo ar motinos, alelis, ir tai visikai nepriklauso nuo to, ar alelis dominuojantysis, ar recesyvusis. Vairenio genome tokio tipo geriausiai itirti FIS (FERTILIZATION INDEPENDENT SEED) genai. J recesyviosios mutacijos pasireikia gana vienodai. Mutantams fis bdinga tai, kad sklos raida prasideda autonomikai, be apvaisinimo. I ia kils ios gen grups pavadinimas. Branduoliai centrinje gemalo maielio lstelje dalijasi be apvaisinimo, bet formuojasi diploidinis, o ne triploidinis endospermas, aktyvinama anktarls ir sklos apvalkallio raida, susidaro skl panaios, bet galutinai abortyvios struktros, labai padidja endospermas. I esms sutrinka priekins-upakalins ai susidarymas, nes didiausi pokyiai vyksta chalazinje endospermo dalyje. Labai padidja cista, o mazgeliai (noduls) atsiranda ir ne vietoje (ekotopikai) centrinje (arba kitaip periferinje) endospermo dalyje. Patys didiausi raidos nukrypimai atsitinka, kai turt vykti celiuliarizacija. Prisiminkime, kad tai lstels sieneli atsiradimas apie sinciio branduolius. Gemalas iuo momentu yra irdies stadijos. Mutantuose fis j ugoia labai proliferuotas, ivejs endospermas, taiau gemal galima igelbti, jeigu jis auginamas izoliuotai. Tai rodo, kad gemalo ir visos sklos ties prieastis yra endospermo raidos defektas. Deja, recesyviojo fis grups (3.10 pav.) geno sukelto endospermo raidos sutrikimo negelbsti i tvo paveldtas dominuojantysis alelis: fisfis Centrin gemalo maielio lstel FIS Spermis
fisfisFIS Sklos abortas Hibridinis endospermas Pagal Mendelio dsnius dominuojantysis FIS genas turi vyrauti ir nustelbti letalj fis gen, gelbti fenotip. Kai taip nra ir endosperme pasireikia tik i motinos paveldti aleliai, galima tarti, kad yra genomo imprintingas. Taiau vien tik i geno pasireikimo priklausymo nuo tvo-motinos sprsti apie genomo imprinting nepakanka. Pagal tai genomo imprinting sunku atskirti nuo kit reikini, kuriuos vertiname kaip motinin efekt (r. 3.5.1). Btini papildomi geno raikos endosperme tyrimai. Kol kas neabejojama dl dviej gen MEA (MEDEA) ir FWA (FLOWERING A) endospermui savito imprintingo. Labai svarbus imprintingo rodymas yra geno raikos vieta ir laikas (r. toliau). Pirmj nuo tvo-motinos priklausant gen atrado Kermikl (J.L.Kermicle) dar 1970 m. kukurz genome. Tai R-lokusas, kuris lemia raudon aleurono spalv. Toks geno pasireikimo pobdis nustatytas ir kai kuriems kitiems kukurz genams L-zeino, tub2 ir tub-4, koduojantiems mikrovamzdeli baltymus tobulinus; dzr1, kuris reguliuoja atsarginio baltymo 10 kDa zeino kaupimsi ir kt.
AUGAL GENETIKA
| 177
3.10 pav. Vairenio FIS gen grups, kurioms bdingos genomo ,,imprintingo mutacijos:
Fenotipai (skl raida anktarlse), kai endospermo genotipai yra (i kairs dein): WT; dme dme/DME; mea mea/MEA; fis2 fis2/FIS2; fie fie/FIE; bga bga/BGA; msi1 msi1/MSI1. Pasireikia embrioletals, nors augalai heterozigotiniai. Tvo WT aleliai negelbsti sklos (pagal A.-E. Guitton et al. Development. 2004, Vol. 131, P. 29712981).
FIS grups genai. MEA, kuris udo savo vaikus. FIS gen grup sudaro maiausiai 4 5 genai (r. 3.6 intarp). Tai genai MEA (MEDEA, sin. FIS1), FIS2 (FERTILIZATION INDEPENDENT SEED2), FIE (FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE, sin FIS3). I pradi FIS1-3 genus vienijo tik beveik vienodas j mutant mea, fis2, fie pasireikimas, kuris jau aptartas. Vliau sitikinta, kad FIS1-3 gen koduojami baltymai sudaro bendr didel, daugiau nei 600 KDa, o galbt ir didesn baltym kompleks, nes, kaip minta, atrandami vis nauji io komplekso genai, tarp j MSI1 (MULTICOPY SUPRESSOR OF IRA1, sin MEDICIS), BORGIA. iame komplekse svarbiausias yra genas MEA (MEDEA) (nuo senovs graik mitologijos herojs, iauriai kerijusios savo vyrui argonautui Jasonui u neitikimyb iudiusios savo ir jo vaikus PHERES ir Meidos). Toks iaurus pavadinimas teko dar ir dl to, kad tai buvo pirmasis FIS komplekso genas. Ir i ties mea mutantinis alelis udo savo vaikus sklas: mea mea i motinos MEA i tvo [Centrin gemalo [Spermis] maielio lstel] mea mea MEA [Endospermas] SKLOS ABORTAS vairiais bdais nustatyta, kad i tvo paveldtas dominuojantysis alelis MEA negelbsti sklos raidos, nes pasireikia tik i motinos paveldtas alelis: Centrins gemalo maielio lstels genotipai: MEA MEA arba mea mea Geno raika
178 |
Spermio genotipas: MEA arba mea Nepasireikia
MEA, FIS2, FIE, MSI1 ir, matyt, dar kai kurie kiti gen koduojami baltymai veikia kaip vientisas PcG kompleksas (3.6 intarpas). Jis sukelia epigenetinius pokyius chromatino remodeliavim ir DNR metilinim. Tuose chromosomos lokusuose, kuriuose tai atsitinka, chromatinas kondensuojasi, virsta heterochromatinu, o genai lokuse tampa neveikls. Taip FIS kompleksas slopina centrins lstels dalijimsi, kol nevyksta apvaisinimas, todl FIS grups genai pasireikia dar centrinje gemalo maielio lstelje. Pagal pasireikimo pradi FIS genus reikt priskirti motinini gametofito gen grupei (r. 3.5.1 sk.). Kiekvieno i gen raikos trukm, kaip ir i tvo paveldto alelio nutildymas, trunka nevienodai ilgai. MEA nutildymas trunka ilgiau negu FIE, kurio tvinis alelis neveiklus yra tik sklos raidos pradiai. Toliau abu FIE geno aleliai bna veikls.
Padtis, kai pasireikia tik vienas alelis i dviej, vadinama monoalelin raika, o kai abu aleliai yra aktyvs bialeline raika. Gemalo maielyje/endosperme vieno i tv alelio inaktyvinimas prilyginamas monoalelinei raikai, o kai pasireikia abiej tv aleliai bialelinei raikai. Taip elgiamasi todl, kad centrin lstel turi du, nors visikai tapatingus, to paties geno alelius i motinos. Tad FIE geno raika i pradi yra monoalelin, o vliau bialelin. Tokia ji ilieka visuose augalo vegetatyvins fazs organuose, kuriuose pasireikia FIE genas. Genas, su kuriuo tiesiogiai sveikauja reguliacini ir kit gen koduojami baltymai, yra vadinamas taikiniu. Taikiniu gali bti ir baltymai ar RNR molekuls. FIS komplekso taikinys. Pagrindinis FIS baltym komplekso taikinys yra iaikintas tai (Medjos snus) PHERES1 (PHE1). Su jo promotoriumi tiesiogiai fizikai jungiasi MEA ir FIE baltymai. Pats PHE1 genas koduoja baltym, kuris turi MADS domen. Taigi valdo kitus genus, kurie yra lstels ciklo reguliatoriai.
3.6 intarpas. Drozofilos ir augal PcG/FIS komplekso gen palyginimas (daugiau ini apie endospermo genomo imprintingo genus) Polycomb grups (PcG) genai pirmiausia buvo aptikti drozofilos genome kaip represoriai, kurie slopina homeozinius raidos genus. Drozofila turi genus, koduojanius du prieingo veikimo baltym kompleksus, kurie modifikuoja chromatin. J pavadinimai yra nuo atitinkam drozofilos gen grupi: trxG (trithorax G) jis aktyvina chromatin, ios grups gen, kuriems bt bdingas augal genomo imprintingas, bent kol kas neinoma; PcG (Polycomb) paskirtis yra slopinti chromatin atitinkamuose, kompleks valdomuose lokusuose; drozofila turi du Polycomb represyvius kompleksus PRC1 ir PRC2, kurie iek tiek skiriasi savo pagrindine sudtimi. Augal PcG daugiau atitinka PRC2. iuo metu PcG baltymais itin domimasi ir is susidomjimas dar ilgai nesibaigs, nes per chromatino sandaros kitimus yra savitai valdomi genai. PcG baltymai sukuria lstels atmint, epigenetinius reikinius, kurie paveldimi lsteli ir netgi individ kartose. PcG kompleksas jungiasi prie metilinto histono H3. Polycomb (PcG) ir trithorax (trxG) genai yra labai konservatyvs, turi homologus/ortologus ir kit organizm genomuose, tarp j induoli ir augal. Tuo galima sitikinti pagal genus, patirianius genomo imprinting: MEA (MEDEA, sin FIS1, kurio ortologu drozofilos genome yra Enhancer of Zeste [E(Z)], o
AUGAL GENETIKA
| 179
mogaus EZH1/2, koduoja baltym, kuris turi SET domen. domen koduojanti nukleotid seka pirm kart aptikta drozofilos genuose Su(var)329, E(z) ir Trithorax. I ia SET pavadinimas. Baltymas btinas metilinti histon H3; FIS2 (FERTILIZATION INDEPENDENT SEED 2) drozofilos genome ortologas yra Supressor of Zeste 12 [Su(Z)12], o mogaus SU(Z)12.Jis koduoja C2H2 tipo cinko pirteli baltym . FIE (FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM, FIS3) drozofilos genome Extra Sex Combs (ESC), mogaus EED.Jo koduojamas baltymas turi WD-40 kartotines (40 aminorgi ilgio) sekas su triptofanu (W) ir asparto r. (D) galuose, dalyvauja sveikose baltymasbaltymas. WD motyvai sudaro kilpas, kurios yra kaip griauiai kitiems PcG baltymams ir histon deacetilazms. Kukurz genome yra du FIE genai: FIE1 gemale nepasireikia, o FIE2 raika aptinkama gemalo ir endospermo lstelse. Ankstyvosiose endospermo raidos stadijose ji yra monoalelin, tik i motinos, o vliau bialelin, pasireikia motinos ir tvo aleliai. Be to, FIE veikia ir kituose organuose, nra bdingas tik endospermui kaip MEA. FIE pasireikia taip pat stiebe, stiebo lapuose, aknyse. Tokio pat plataus veikimo yra ir kitas centrins gemalo maielio lstels/endospermo PcG komplekso genas MSI1 (MULTICOPY SUPRESSOR OF IRA1, sin. MEDICIS). Jo koduojamas baltymas taip pat turi WD-40 kartotines sekas ir jungiasi su histonais ir RBR1 (retinoblastomos RB geno-ortologo koduojamu baltymu). is baltymas reguliuoja (slopina) lsteli dalijimsi. Drozofilos genome MSI1 ortologas yra p55, o mogaus Rbap46/p48. Kai kuri PcG komplekso gen augal genome vis dar trksta:
Drozofila
Vairenio skla
Btinai turt bti HDAC (histono deacetilazs) genas (drozofilos tai RPD3). Taip pat neaiku dl Pho (PLEIOHOMEOTIC), kurio koduojamas baltymas jungiasi prie DNR sek, PRE (Polycomb Response Element) element. Tiesiog akivaizdu, kad ir FIS kompleksas atpasta tas sekas (elementus) valdom gen promotoriuose. Tiesiogiai tai rodyta PHERES (PHE) genui, prie kurio promotoriaus jungiasi MEA ir FIE koduojami baltymai. Gal tiesiog apsieinama be tarpinink. Neaiki geno FWA (FLOWERING A) paskirtis endospermo raidai, nors neabejotinai rodytas FWA geno imprintingas endosperme. Galbt jo koduojamos maosios interferentins RNR reguliuoja FIS komplekso veikl. Taiau svarbiausiu komplekso genu, suteikianiu iam iaip jau universaliam kompleksui ypatyb veikti tik moterikajame gametofite/skloje, yra MEA genas. Kituose augalo organuose arba kitais raidos momentais j keiia kiti genai (CLF, SWN), kaip ir FIS2 (EMF2 ir VRN2). VRN2 genas pasireikia vernalizacijos reikiniuose. Aptinkami vis nauji genai, kuri veikla priklauso nuo tvo-motinos. Pvz., vairenio genas BORGIA, kukurz nrp1 (NAM-related protein1), meg1 (maternally expressed gene1) ir kt. J imprinting reikia rodyti. Didesn tikimyb, kad tai su motininiu efektu susij genai. Pvz., meg1 genui bdinga monoalelin raika tik ankstyvosiose endospermo raidos stadijose, vlesnse bialelin raika, pasireikia ir i tvinio augalo paveldti aleliai. is genas iimtinai pasireikia tik
180 |
pernaos lstelse, per kurias endosperm maitina motininis augalas. MEG1 baltymas yra patalpinamas kaip tik pernaos lsteli augose. (Drozofilos ir vairenio endospermo PcG kompleks palyginimas pagal A.-E. Guitton, F. Berger (International Journal of Development Biology 2005, Vol, 49. P. 707716)). FIS kompleksas slopina PHE1 geno raik tol, kol nevyksta apvaisinimas. Mutantuose mea, fie, fis2 PHE1 geno raika yra nekontroliuojama, todl megagametofito centrinje lstelje PHE1 baltymo kiekis labai padidja, ir joje branduoliai pradeda dalintis be apvaisinimo. Normaliai WT genotipo augaluose PHE1 genas megagametofito centrinje lstelje nepasireikia.
Apskritai PHE1 genas veikia labai trumpai (12 paras) po apvaisinimo. Vliau PHE1 ilieka veiklus tik chalazinje vairenio endospermo dalyje, kurioje, kaip inome, nevyksta celiuliarizacija, susidaro cista ir mazgeliai (noduls). PHE1 geno veikl reguliuoja ir genas DDM1 (DECREASE IN DNA METHYLATION1). Mutante ddm1 PHE1 geno raika yra daug silpnesn.
Kas valdo MEA gen? DEMETER DNR N-glikozilaz. Genetik lauk netiktumas. Genas DEMETER (DME, Demetra vaisingumo deiv) koduoja DNR reparacijos ferment DNR N-glikozilaz. Ji ikerpa metilint citozin (met-C) i MEA ir FWA promotori. Paskui ie genai tampa aktyvs. DME genas veikia prieingai kitam genui MET1 (METHYLTRANSFERASE 1), kurio koduojama DNR metiltransferaz metilina DNR CpG vietose.
Apie pat DME gen dar ne viskas aiku. Jo koduojamas baltymas yra labai didelis 1729 aminorgi, o N-glikozilazs domenui tenka tik 200 aminorgi. Neaiki likusios baltymo dalies paskirtis. DME genas yra aktyvus labai trumpai ir tik centrinje megagametofito lstelje. Po apvaisinimo jo raika labai susilpnja. Taiau i MEA promotoriaus jau paalintas met-C, todl MEA genas ir toliau lieka aktyvus po to, kai nutrksta DME raika. Vyrikajame gametofite DME bna neaktyvus. Tai viena i prieasi, kodl MEA genas yra neaktyvus iedadulkse.
Tvinio alelio nutildymo mechanizmas. Sklos gelbjimo efektas. Endosperme pasireikia abu epigenetini pokyi mechanizmai: chromatino remodeliavimas bdingesnis genams, kurie nutildomi ilgesniam laikui, tai FIS gen paskirtis,kuri pasireikia chromatino baltym modifikavimu konkreiuose lokusuose (3.6 intarpas). DNR metilinimas, kuris yra labiau trumpalaikis, jeigu neprisideda chromatino remodeliavimas. DNR metilinimo, kaip ir apskritai epigenetini kitim, iniciatoriai gali bti si (arba mi) RNR, kaip tai bdinga FWA genui (r. toliau). Endosperme veikiantis motinos genomas arba pavieniai genai (kaip FWA genas) yra hipometilinti (3.11 pav.). Pvz., kukurz endosperme i motinos paveldta DNR yra 13 %. silpniau metilinta, negu kituose augalo organuose, pvz., lapuose. Ypa akivaizds FWA geno metilinimo skirtumai endosperme ir kitose augalo dalyse gemale, sklos luobelje, lapuose, o svarbiausia iedadulkse. io geno hipometilinimas endosperme yra pagal visas DNR metilinimo vietas, bet rykiausias skirtumas palyginti su DNR metilinimu kituose organuose yra pagal CpG. Btent i viet metilinimas ir bdingas epigenetiniams reikiniams. Kit viet metilinimas yra trumpalaikis, siejamas su gen veiklos reguliavimu.
| 181
AUGAL GENETIKA
Atkreipkite dmes labai silpn DNR metilinim endosperme. Tai bdinga aktyviems genams. Pagrindin DNR metilinimo vieta FWA, kaip ir daugumos toki augalo gen, yra CpG dinukleotidas (pagal T. Kinoshita et al. Science. 2004, Vol. 303, P. 521523).
3.11 pav. FWA geno metilinimas ir jo pobdis vairiuose vairenio organuose:
Tai, kad i tvinio augalo paveldt gen imprintingas (nutildymas) yra dl DNR metilinimo, patvirtina ir skl gelbjimo tyrimai. Kaip minta, gen, kuriems bdingas imprintingas, i tvo paveldtas alelis endosperme nepasireikia, nors jis bt dominuojantysis (FWA, MEA, FIE ir kt.), o gemalo maielyje bt recesyvieji i gen aleliai (fwa, mea, fie). iuo atveju sklos raida baigiasi abortu. Dominuojantysis tvo alelis nepasireikia dl imprintingo, todl jis aktyvus tapt tik tada, jeigu bt nuslopinti genai, kurie nutildo spermio genome esant alel. Derinyje su dominuojaniaisiais tviniais aleliais (FWA, MEA ir kt.) ibandyti vairi spjamai su imprintingu susijusi gen nul mutantai. Jeigu geno koduojamas baltymas inaktyvina kur nors gen, dominuojantysis spermio alelis likt aktyvus ir gelbt sklo raid, slopindamas recesyviuosius i motinos paveldtus letaliuosius genus. Tai atsitikt todl, kad yra neaktyvs tie genai, kurie slopina spermio genus centrinje gemalo lstelje.
Pasirodo, gen ,,gelbtoj yra nedaug. FIS gen grups mutantus mea, fie, fis2, bga, msi1 gelbsti tik mutacija, kai motininio augalo genome yra ddm1 arba transgenas MET 1/s (a/s taip ymimi transgenai, kurie koduoja antiprasmin RNR, ji slopina gen, koduojant matricins sekos mRNR). Abu genai MET1 ir DDM1 yra tiesiogiai susij su DNR metilinimu. MET1 genas koduoja btent t DNR metiltransferaz, kuri metilina CpG vietas. Ibandyti ir kitas DNR transferazes koduojani gen mutantai, bet sklos jie negelbjo. Nors DDM1 (DECREASE IN DNA METHYLATION1) genas koduoja SWI2/SNF2 klass chromatino remodeliavimo baltym, io geno mutantuose ddm1 DNR metilinimas sumaja 70 proc. (i ia ir geno pavadinimas). DDM1 baltymas veikia kartu su DNR metiltransferazmis. Taip nutiesiamas tiltas tarp chromatino remodeliavimo ir DNR metilinimo. Mutanto mea raik keiia ir geno DME recesyvioji mutacija dme, taiau io geno paskirtis ikirpti MEA gene metC jau minta, todl irgi, nors ir netiesiogiai, susijusi su DNR metilinimu.
Skl gelbjimo tyrimais nustatyta, kad yra epigenetins endospermo raidos reguliacijos kaskada: DEMETER MEDEA FIE, FIS2 DDM PHERES
FWA geno reikm ioje kaskadoje neaiki, nors io geno epigenetinis reguliavimas rody-
tas paiu tikinamiausiu bdu, ir fwa mutanto fenotip irgi gelbsti met1.
182 |
FWA lokusas FLOWERING A genu pavadintas todl, kad jo mutantas fwa vlai ydi. Manyta, kad FWA genas priklauso gen, reguliuojani ydjimo laik, grupei. Vliau paaikjo du doms dalykai: fwa mutantinis fenotipas atsiranda todl, kad FWA genas pasireikia ekotopikai (ne vietoje); fwa mutantiniame alelyje nukleotid sekos nepakit. Tai epimutacija, atsiradusi dl DNR metilinimo skirtum. Kaip minta, genas tik endosperme yra silpnai metilintas. Visur kitur FWA genas yra hipermetilintas, todl yra neveiklus. Hipometilinimas aktyvina gen. Taip atsitiko ir vlai ydiniam fwa mutantui. FWA geno imprintingui rodyti pasirinktas sudtingesnis, bet todl visikai tikinantis bdas. Pasinaudota FWA geno vairove, kuri aptikta FWA geno 7-jame egzone tarp dviej pagrindini vairenio Ler (Landsberg erecta) ir Col-O (Columbia-O) ekotip (r. 1.3 intarp). Pagal nukleotid skirtumus iame egzone buvo nustatyta, kuris alelis i motinos ar tvo pasireikia endosperme: FWACol-OFWACol-O FWALer Centrin lstel Spermis Endospermo genomas FWACol-OFWACol-OFWALer Pasireikia tik FWACol-O FWALerFWALer Centrin lstel Endospermo genomas FWACol-O Spermis
FWALerFWALerFWACol-O Pasireikia tik FWALer
I tvo paveldtas alelis yra neaktyvus dl FWA geno promotoriaus hipermetilinimo. FWA genas koduoja homeodomen turint transkripcijos veiksn, priklauso HD-GL2 eimai (r. 3.3 intarp), kurios koduojami TV papildomai turi leucino utrauktuk (yra HD-ZIP). FWA raika aptinkama centrinje gemalo maielio lstelje dar prie apvaisinim ir endosperme iki 16 branduoli stadijos. domu tai, kad fwa mutantai atsiranda tada, kai FWA geno promotoriuje hipometilinamos tiesiogins kartotins sekos. Jos yra transpozon kilms ir atitinka siRNR sekas (si nuo small interference). iomis sekomis valdomi kiti genai. Nuo siRNR priklauso MET1 geno aktyvumas. Taigi FWA genas gali valdyti kitus genus dviem bdais: koduodamas transkripcijos veiksn; per siRNR.
3.6. Apomiks unikalus augal genomo klonavimo ir heterozigotikumo isaugojimo bdas

3.6.1. Apomiks tobuliausias gamtos irastas klonavimo bdas Nelytinis dauginimasis genotip klonavimo bdas. Kai evoliucijos virnje klesti tobuliausi lytinio dauginimosi bdai, keistokai atrodo kai kuri augal ir gyvn pastangos grti atgal prie nelytinio dauginimosi. Taiau apomiks tik pavirutinikai atrodo kaip kuriozika evoliucijos idaiga: sudaryti sklas, apeinant lytin proces. I ties apomiks yra vienas tobuliausi genotipo klonavimo bd. Visi palikuonys kil i vieno motininio augalo apeinant mejoz, turi bti genetikai identiki. Tai patvirtina ir DNR analiz.
AUGAL GENETIKA
| 183
Augalo strategija yra tokia: geriau isaugoti optimalius gen derinius apomikss bdu, negu kaskart kitoje kartoje bandyti naujus gen derinius ir j slygojamus fenotipus, atsirandanius dl rekombinacijos, kai dauginamasi lytiniu bdu. Ypa jeigu slygos ilieka santykinai pastovios, ir nebtinas didelis individ polimorfizmas. Nors tarp augal labai paplit vairs nelytinio (vegetatyvinio) dauginimosi bdai, apomiks, kaip genotipo klonavimo bdas, pranaesnis, kad klonuoti palikuonys raid pradeda nuo sklos. Dauginimosi sklomis privalumus jau nagrinjome. Apomiks nelytinis augalo dauginimasis sklomis. Individas, kuris yra kils apomikss bdu, vadinamas apomiktu. Apomikss paplitim tarp augal skatina ne tik genetins prieastys. Ji yra danesn ten, kur apvaisinimui slygos yra ribotos: iaurje, kur vegetacijos laikotarpis ir jo trukm yra sunkiai prognozuojami, tropikuose ir pan. Kita vertus, netgi tarp labiausiai privalomai (obligatiniai) apomiktini augal ri, kad ir nedideliu daniu pasitaiko tipikas lytinis dauginimasis, kai gemalas vystosi i spermio apvaisintos kiauialsts (r. toliau, 3.1 lentel). Tad isaugomas bdas atsirasti naujiems gen deriniams, polimorfizmui.
3.1 lentel. vairios kilms palikuoni santykis (%) dviejose apomiktinse (autonomin aposporija) vanags (Hieracium) ryse
(pagal R. A. Bicknell, A. M. Koltunow. Plant Cell. 2004, Vol. 16, Sup. 228245)
Genom kilm
H. piloselloides %
H. aurantiacum %
96,8 97,05 1. Tipika apomiktin (motinin) 2n + 0 1,74 1,91 2. a) Hibridin + S-nesuderinamumas n+nns 0,54 0,1 " " 2n+nns 0,06 b) Hibridin + S-suderinamumas n+ns 0,02 " " 2n+ns 0,83 0,94 3. Polihaploidin n+0 1. Tipika apomiktin i diploidins somatins (2n) sklapradio lstels. 2. a ir b. Hibridin vyksta lytinis apvaisinimas, i tvinio augalo dalyvauja spermis, kuris turi haploidin chromosom skaii (n), taiau (a) iedadulkms bdingas S-nesuderinamumas (krymadulka); (b) kad ir nedaug (0,06 ir 0,02 = 0,08 %), H. aurantiacum apsivaisina savo paios iedadulkmis (savidulka n+ns arba 2n+ns). H. piloselloides tyrimai tikina, kad S-nesuderinamumas gali bti ir apomiktinse ryse. Abiejose ryse pasitaiko, kad hibridins sklos gali bti kil, kai yra apvaisinama redukuota kiauialst (n+nns arba n+ns). Kur kas reiau apvaisinama neredukuota kiauialst (2n+nns arba 2n+ns). Polihaploidin tai haploidin partenogenez, gemalas vystosi i redukuotos, bet neapvaisintos kiauialsts. Abi rys yra alopoliploidai (tolimieji tarpriniai hibridai), todl haploidas yra polihaploidas, nes turi du (arba daugiau) haploidinius genomus. Nukrypimas nuo apomikss yra nedidelis, atitinkamai, tik 2,95% ir 3,2%, taiau pakankamas, kad bt isaugomas abiej ri polimorfizmas, jeigu naujieji genotipai garantuoja augalui kokius nors privalumus, kurie daniausiai irykja atrankos slygomis.
Apomiks, kaip klonavimo bdas, yra pats tobuliausias, kok tik sukr gamta. Apomikss paplitimas. Ji danesn tarp laukini, poliploidini ri, priklausani apie 130 augal geni, o ios per 40 eim. Daniausiai ji pasireikia Asteraceae, Poaceae, Rosaceae eim augaluose. Be to, apomiktini ri ir geni sraas kaskart pasipildo vis naujomis rimis ir gentimis, nes netgi toje paioje gentyje vienos rys daugina184 |
si tipiku lytiniu bdu, o kitos apomikss. Pagal apomikss pasireikimo laipsn skiriasi ne tik atskiros migls (Poa) genties rys, bet ir tos paios ries augalai, nuo tipiko lytinio dauginimosi iki beveik obligatins (r. toliau) apomikss. Skirtumus pagal apomikss pasireikim galima aptikti netgi tame paiame migls augale. Tarp ekonomikai svarbi ems kio augal apomiks reta, aptikta tik toki augal, kuri pirmaeils ekonomins svarbos augalais nepavadinsi. Tai Poa, Brachiaria, Paspalum, Pennisetum gentims priklausanios paarins ols, mangas, citrusiniai, bet ir j dauguma apomiktini ri auginamos tropikuose. Genetikams seniai rusena viltis perkelti apomikss genus tokiems augalams kaip kvieiai, kukurzai, ryiai. Bandyta tiesiogiai, kryminimais vesti apomikss genus i laukini ri ekonomikai svarbius augalus. Pvz., kryminta Tripsacum dactyloides su kukurzu (Zea mays L.), taiau hibridai tol isaugojo grtamuosiuose kryminimuose apomiks, kol buvo visos devynios Tripsacum chromosomos. Kol kas tuios pastangos perkelti apomikss genus ir gen ininerijos metodais. Atsirado netgi pesimist, kurie pastangas gauti dirbtin apomiks lygina netgi su aminojo variklio (perpetuum mobile) iradinjimu. Taiau vili teikia labai intensyvs apomikss reikinio genetiniai tyrimai. 3.6.2. Sporofitin ir gametofitin apomiks Apomikss form vairov. Apomiks skirstoma du pagrindinius tipus: gametofitin ir sporofitin. ie du tipai skiriasi pagal tai, i kokios lstels isivysto gemalas. Sporofitin apomiks, kurios sinonimas yra adventyvin (pridtin) embrionija, tiksliai nusako reikinio esm. Susidaro papildomi gemalai tiesiogiai i somatini diploidini sporofito (sklaparadio) lsteli, visikai apeinant gemalo maielio struktras. Gemalo maielis susidaro atskirai, autonomikai, todl endospermas skloje yra kils tipiku lytiniu bdu po dvigubo apvaisinimo, i centrins gemalo maielio lstels. Vienas gemalas irgi isivysto tipiku bdu po dvigubo gemalo maielio apvaisinimo. Dl ios prieasties nuo pat raidos pradios yra dviej genotip gemalai: papildomi pridtiniai gemalai sporofito klonas; gemalas, kils po lytinio apvaisinimo. Kiekvienoje skloje gemalas yra genetikai skirtingas dl rekombinacijos pagal Mendelio dsnius. Kita vertus, adventyvi gemal raida yra suderinta su gemalo maielio raidos vykiais. Ji prasideda tik tada, kai gemalo maielis yra visikai subrends. Sporofitin apomiks tarp poliploidini ri yra reta, danesn tarp diploidini ri. Bdinga mangui, citrusiniams augalams. Gametofitin apomiks (3.12 ir 3.13 pav.), atvirkiai, danesn tarp poliploidini augal ri. Kai kurios diploidins augal rys, pvz., Paspalum notatum, padvigubinus chromosom skaii (autopoliploidija) tapo apomiksinmis. Vis tip poliploiduose padidja tikimyb iderintai gen veiklai (dereguliacijai) ir raidos anomalijoms. Be to, daugybiniai gemalai gali susidaryti ir augal, kuriems bdinga gametofitin apomiks, nors paprastai sklapradyje pradeda vystytis keli gemalo maieliai, bet ilieka vienas. Kai kuriose apomiktinse augal ryse tokie papildomi gemalai yra gana danas reikinys, pvz.,
AUGAL GENETIKA
| 185
vanags (Hieracium piloselloides) H. aurantiacum netgi 17 % augal.
jie
pasitaiko
10
augal,
3.12 pav. Lytinio dauginimosi ir gametofitins apomikss palyginimas:

( pagal U. Grossniklaus, G. A. Nogler P. J. van Dijk. Plant Cell. 2001, Vol. 13, P. 14911498).
Gemalo maielio raida apomiktiniu bdu yra pagrindinis gametofitins apomikss poymis. I ia kils ir gametofitins apomikss pavadinimas, nes gemalo maielis normaliai yra augalo megagametofitas. Pagal gemalo maielio raidos bd skiriama: diplosporija; aposporija. Diplosporija kitaip diploidin partenogenez. Skla vystosi i neredukuot gemalo maielio lsteli: gemalas vystosi i kiauialsts, o endospermas i centrins gemalo maielio lstels. Tik kiauialst nra apvaisinama. arba gali vykti pseudogamija: apvaisinama centrin gemalo maielio lstel. Tai paskatina neredukuoto gemalo maielio raid skl. Pagrindin nukrypim dalis tenka mejozei, todl diplosporini augal mejoz pavadinta apomejoze. Diplosporijai bdinga didel tip vairov, bent septyni (3.13 pav.). Jie skirstomi pagal tai, kaip nukrypstama nuo tipikos mejozs ir gemalo maielio (Polygonum tipo) raidos. Pagrindinis skirstymas yra mejozin ir mitozin diplosporij.
186 |
Gametofito pertvarkos I mitoz II mitoz III mitoz pasireikimas Apomikss tipas Tipika raida
Gemalo maielio tipai
I mejoz II mejoz
Polygonum
Taraxacum
Mejozin diplosporija
Antennaria
Mitozin diplosporija
Hieracium
Aposporija
Panicum
Aposporija
3.13 pav. Apomikss tipai:

(pagal V. Bhat et al. Current Science. 2005, Vol. 89, P. 18791893).
Mejozin diplosporija (3.13 pav.) yra tada, kai gemalo maielis atsiranda po pakitusios mejozs, kaip minta, vadinamos apomejoze. Taip dauginasi, pvz., apomiktins kiaulpiens (Taraxacum) rys. Tipikiausia mitozin diplosporija yra katpds (Antennaria). Gemalo maielis isivysto i motinins megagametofito lstels (arba kitaip megasporocito) tiesiogiai mitozs bdu. Mejoz apeinama, taiau susidaro tipikas 7-i lsteli gemalo maielis. Tai rodo, kad mejoz ir gemalo maielio raida, nors yra susij, bet autonomiki vykiai. Aposporija, ko gero, pats domiausias tarp vis apomikss tip reikinys, todl ir genetini io reikinio tyrim yra daugiausia. Tipiki augalai yra laukins soros (Panicum) rys ir vanag (Hieracium). Pastaroji augal gentis labai polimorfin ir yra vienas pagrindini objekt tirti apomiks (3.13 ir 3.14 pav.). Aposporija gemalo maielio (megasporos) raida i somatini sklapradio lsteli. I pradi i somatini lsteli gali vystytis keli gemalo maieliai, bet vliau, kaip ir teistasis (skirtas lytiniam apvaisinimui), jie va. Ilieka tik vienas i somatins lstels diploidinis gemalo maielis, taiau pasitaiko vairios raidos anomalijos (3.1 lentel). Kaip minta, gali isivystyti poliembrionija. Taiau daniausiai didiojoje aposporini skl dalyje yra tik po vien gemal tik i vienos somatins sklapradio lstels. Jame yra klonuotas motininio augalo genotipas.
AUGAL GENETIKA
| 187
3.14 pav. G. Mendelio galvos skausmas vanag (Hieracium):

A sklos raidos po lytinio apvaisinimo ir po apomikss palyginimas: MML motinin mikrosporos lstel; clb centrins lstels branduolys; k kiauialst; en endospermas; g gemalas (pagal M. R. Tucker et al. Plant Cell. 2003. Vol. 15, P. 15241537); B vairi Hieracium L. ri iedai (pagal N. A. Eckardt. Plant Cell. 2003. Vol. 15, P. 14991501)
Aposporij lydi vairs gemalo maielio raidos nukrypimai, pvz., sutrinka gemalo maielio ir jame esani branduoli polikumas, sumaja iki vieno (parastai yra du), arba atvirkiai, padidja polini branduoli skaiius centrinje lstelje ir kt. Autonomin ir pseudogamin apomiks. Daugumos apomikt iedadulks yra normalios ir redukuotos: spermiai yra haploidiniai. Ar jie apvaisina gemalo maielio lsteles, priklauso nuo augalo ries. Vien augal apomiks yra (beveik) obligatin, kit fakultatyvi, endospermo raida gali bti autonomin arba pseudogamin. Apomiktini augal ri kiauialst yra neredukuota, ir gemalas i jos vystosi neapvaisintas spermio, nors pasitaiko, kad ir neredukuota kiauialst susilieja su spermiu (3.1 lentel). Taip gali atsirasti poliploidai. Taiau daugeliu atvej gemalo raidai diriguoja endospermo genai. Jiems aktyvinti btina pseudogamija: spermis arba spermiai (r. 3.7 intarp) susilieja su centrins lstels branduoliu. Taiau ne visada pseudogamija yra signalas gemalo raidai, nes aptikti du pseudogamijos tipai pagal tai, kada prasideda gemalo raida: centrins gemalo maielio lstels apvaisinimas yra btinas prasidti partenogenetinei gemalo raidai;
188 |
gemalo raida yra ankstyvesn u endospermo raid, taiau pseudogamija yra btina normaliai endospermo raidai ir sklos gyvybingumui: skla, kad ir pradeda vystytis, ji tuia. Endospermo raid lenkianti gemalo raida yra bdas ivengti neredukuotos kiauialsts apvaisinimo, kuris nors ir retai (3.1 lentel), vis tik vyksta ir apomiktinse augal ryse. Dl pseudogamijos atsiranda dar viena su endospermo geno veikla susijusi problema. Tai endospermo raidos pradiai ir genomo imprintingui btinas motinos ir tvo genom santykis 2m:1t. i problema sprendiama labai vairiai. Tai rodo, kad labai daug gen lemia apomiks. Vienas i radikaliausi sprendimo bd yra autonomin endospermo raida. Endospermas ir gemalas vystosi visikai be apsivaisinimo. Taip daugintis gali kiaulpiens (Taraxacum), vanags (Hieracium) rys.
3.7 intarpas. Kaip isaugomas endospermo genom santykis 2m:1t. Polispermija Daugelio magnolijn skla vystosi po dvigubo apvaisinimo: vienas spermis apvaisina kiauialst, o kitas centrin gemalo maielio lstel, kuri yra diploidin su dviem poliniais branduoliais. Centrins lstels apvaisinimas yra signalas sklos raidai. Kita vertus, kaip jau minta, raidai pradti btinas genom santykis 2m (motinos):1t (tvo). Kai nukrypstama nuo io santykio, sutrinka endospermo raida ir skla va. Santykis 2m:1t yra problema daugeliui diplosporijos ir aposporijos bdu besidauginani augal. Kaip minta, beveik obligatini apomikt, koki yra kiaulpiens (Taraxacum) ir vanags (Hieracium) gentyse, endospermas vystosi autonomikai. iedadulks sklos raidai nereikalingos. Kiauialst ir centrin gemalo lstel yra vienodai aseksualios. Norint tai nustatyti, pasinaudojama vyrikuoju citoplazminiu sterilumu (CVS). Priverstinis krymadulki augal apsivaisinimas vaisos bdu, nra tikinanti priemon. Augalo centrin lstel galt bti apvaisinta to paties augalo iedadulkmis. Kiaulpiens (T. officinalis) aptikti CVS augalai. Jie normaliai brandina sklas po izoliatoriais. Apseinama be kaimynini augal iedadulki. Autonomin apomiks yra labiausiai radikalus bdas isprsti genom santykio problem. Turi bti pakits ir endospermui bdingas genomo imprintingas, todl ie augalai ypatingai domina genetikus. Apomiktini augal gemalas vystosi i neredukuotos lstels ir tik labai retai apvaisinamas, o apomiktai, kuriems bdinga pseudogamija, genom santyk 2m:1t susikuria variu bdu.. Gvinjins soros (Panicum maximum Jack.) centrinje lstelje spermio branduolys susilieja tik su vienu neredukuotu (2n) branduoliu. Spermio branduolys yra haploidinis (n), nes daugumos apomikt spermiai susidaro po redukcinio dalijimosi. Gana panaiai, bet kiek kitaip atsitinka Dichanthium annulatum. io augalo neredukuoti poliniai branduoliai du, bet jie nesusilieja ir vienas i polini branduoli va. Toliau viskas vyksta panaiai kaip gvinjins soros: polinis branduolys (2m) susilieja su spermio branduoliu (1t), ir genomo santykis yra 2m:1t. Genetikus turt labiau sudominti ir tie atvejai, kai nepaisant to, kad paeistas genom santykis, apomiktini augal endospermas ir skla vystosi normaliai. Taip yra kukurzams artimam augalui Tripsacum dactyloides. Jo endosperme genom santykis yra 4m:1t. Genom santykio sprendimo bdas gali bti polispermija. Kai kuri gyvn, pvz., ilkverpio, neapvaisint kiauinl prasiskverbia ne vienas, o daug spermatozoid. is reikinys pavadintas polispermija. Manyta, kad ji augalams nebdinga, taiau apomikss tyrimais nustatyta polispermija augaluose. Ji yra vienas i bd sprsti 2m:1t santyk. Neredukuoti poliniai
AUGAL GENETIKA
| 189
branduoliai susilieja, ir centrin lstel turi tetraploidin (4n) branduol, bet tokia lstel apvaisinama ne vieno, o dviej spermi. Tai nustatyta vdryno (Ranunculus) ir gudobels (Crataegus) gentyse, ypa tikinantys rezultatai gauti, kai apvaisinimas kontroliuotas panaudojant CVS, o ploidikumas nustatytas srautiniu citofotometru. Kita vertus, netgi tai paiai augalo riai bdinga didel genom santykio endosperme sprendimo vairov. Pvz., tirtose tetraploidinse gudobels ryse per 25 % endosperm kil i dispermijos (polispermijos), o apie 60 % i monospermijos. Apie 15 % tenka vairiems kitiems mintiems sprendimo bdams. Tarp j pasitaiko dar vienas, nors ir retas: apvaisinimas neredukuotais spermiais. Lytinis dauginimasis (2x)
Dispermija (25%) Atsarginis, laisvas spermis 12x 2m:1t 4x 4x
Crataegus spp. (4x)

Monospermija (60%) Atsarginis, laisvas spermis 10x 4m:1t 4
Centrin lstel Polinis branduolys (1x) Spermis (1x) Kiauialst (1x)
Endospermas (3x), 2m:1t Gemalas (2x)
4x 2x
4x 2x 4x
(Pagal R. J. Scott. New Phytologist. 2007. Vol 173, P. 227230; ten pat N. Talent, T. A. Dickinson, P. 231249.
Autonomin endospermo raida danesn Asteraceae, o pseudogamija Rosaceae ir Poaceae eim augalams. Obligatin ir fakultatyvioji apomiks. Obligatin apomks yra tada, kai lytinis dauginimasis augal riai yra visikai nebdingas, dauginamasi vien tik apomikss bdu, taiau iuo metu sitikinta, kad netgi labiausiai obligatiniai apomiktai yra isaugoj lytin dauginimsi. Kiek jis pasireikia, priklauso ne tik nuo ries (genotipo) ypatum, bet ir nuo aplinkos slyg. Netgi tokiems augalams kaip vanag (Hieracium), anksiau laikytam obligatiniu apomiktu, tenka pridurti odel beveik obligatinis apomiktas. Santykis tarp lytinio dauginimosi ir apomikss gali svyruoti netgi viename migls (Poa) augale. Beveik obligatini apomikt isaugotas lytinis procesas yra bdas pasipildyti naujais genotipais, padidinti apomiktini ri polimorfizm. Kaip apomiktai sugeba isaugoti polimorfizm, yra speciali tyrim klausimas. Vienu i modelini augal iam klausimui sprsti yra paprastoji kiaulpien (Taraxacum officinale). Apomiktini augal polimorfizmas. Nukrypimai nuo apomikss yra ne vienintel apomikt polimorfizmo prieastis. Tuo sitikinta, kai buvo isamiau itirti kiaulpiens augalai JAV, netoli ikagos. Europoje auga dvi T. officinale formos: diploidin (2n), kuri dauginasi lytiniu bdu; triploidin(3n), kuriai bdinga diplosporija (r. 3.13 pav.). iaurs Amerikoje aptinkama tik triploidin forma, kuri yra obligatinis apomiktas. Vadinasi, turt bti klonas, taiau ios triploidins formos augalai yra labai polimorfiki. vairov nustatyta vairiais bdais: ne tik pagal morfologinius poymius, bet ir pagal izofermentus, o svarbiausia, labiausiai tikinama, pagal DNR polimorfizm, nustatyt keliais
190 |
metodais. Kokios io reikinio prieastys, kol kas tiriama. Manoma, kad galjo atsirasti genetinis nestabilumas, pasireikiantis mutacij gausa.
3.8. intarpas. Mendelis, Negelis ir vanag Pirmasis apomikss genetinius ypatumus pats to neinodamas nustat G. Mendelis. 1869 m. jis paskelb nedidel darbel apie tarprinius vanags (Hieracium) hibridus. Rezultatai griov, atrodyt, taip tikinamai rodytus Mendelio dsnius: hibrid vairov atsirado pirmojoje hibrid kartoje (F1), nors pagal dsnius, nustatytus su irniais, F1 visi hibridai turt bti vienodi; antrojoje hibrid kartoje (F2), kur kaip tik turt pasireikti hibrid skilimas, vairov, atvirkiai, iskirtos F1 formos buvo pastovios. sigaliojusi neteisinga nuomon, kad vanags hibridus Mendelis m tirti patartas tuo metu autoritetingiausio Hieracium genties tyrjo Negelio (C. Ngeli). I ties, vanags tyrimus Mendelis pradjo savo iniciatyva ir ts apie 10 met. Paskaiiuota, kad per t laik jis turjo itirti deimtis tkstani augal. Dl sunkum kryminti vanag buvo netgi laikinai apaks. I kur toks Mendelio usispyrlikas atkaklumas? Jis buvo tvirtai sitikins, kad netinkamai krymina augalus: nespja laiku kastruoti ied, ir augalai apsivaisina savo paties iedadulkmis, nes dauguma palikuoni visikai panas motinin augal. (Taip ir turt bti apomiktams). Nors Mendelis su Negeliu susirainjo, ir pastarasis itin skeptikai vertino Mendelio bandym su irniais rezultatus, vis tik, matyt, ne dl to Mendelis nustojo domtis augal hibridais. J ugriuvo kiti rpesiai dl vienuolyno, kurio virininku jis tapo. Tik praslinkus apie 40 met paaikjo tikroji prieastis, kodl vanags hibridai nesilaiko Mendelio dsni. Vanagei bdinga apomiks, tad didioji vanags palikuoni dalis yra motininio augalo klonai. Kita vertus, tai nra absoliuiai obligatinis apomiktas, todl pavyko gauti hibridus ir vairov F1, o toliau augalai vl dauginosi apomikss bdu. Ir syk Mendelio darbas buvo ne veltui. Ana Koltunow ir jos kolegos pavert vanag vienu pagrindini objekt tirti apomikss genetik.
3.6.3. Apomikss genetika keli genai lemia apomiks? Kodl sunku tirti apomikss genetik. Apomikss reikinio genetiniai tyrimai tsiasi jau kelis deimtmeius ir iki iol genetikai nesutaria, ar apomiks yra paprastas monogeninis dominuojantis poymis, ar j lemia daug gen. Mendelio vykdyti vanags (Hieracium) tarprini hibrid tyrimai (3.8 intarpas) parodo, kaip sunku kryminti, o paskui aikinti apomiktini augal tyrimo rezultatus. Trukdo apomikss tip gausa ir pasireikimo vairov. Dl i prieasi pagrindiniais apomikss genetikos tyrimo objektais tampa augalai, kuriems bdinga beveik obligatin autonomin apomiks, kaip kai kurios vanags (Hieracium) rys (Pilosella subgentis). Norint ivengti lytinio apvaisinimo pasinaudojama citoplazminiu vyrikuoju sterilumu, kuriamos apomikt vaisos linijos.
Taiau pagrindin klitis yra ta, kad nevyksta rekombinacija. Geriausiu atveju pasireikia nereguliarus skilimas, o daniausiai jo visai nebna. Dauguma palikuoni panas motinin augal, yra klonai (3.8 intarpas). Papildoma klitis hibrid analizei yra poliploidija. Dauguma apomikt yra poliploidai ir papildomai pasireikia poliploidams bdingi paveldjimo nukrypimai, pakits genom santykis centrinje gemalo maielio lstelje. Tad btina citologin apomikt analiz. Gelbsti Matzko (F. Matzk) sukurtas skl srautins citofotometrijos metodas. Didel klitis yra ir tai, kad motinin megasporos lstel (MML), arba kitaip megasporocitas, yra sunkiai prieinamoje vietoje, sklapradyje, bet svarbiausia, kol kas nra ymen, kurie enklint lstel, tampani | 191
AUGAL GENETIKA
motinine megasporos lstele. Netgi neaiku, ar signalas sklapradio lstelei tapti MML yra i iors, ar vidinis (3.9 intarpas). Bene didiausia skm kol kas, matyt, yra geno SPL (SPOROCYTELES) raikos vietos nustatymas. Jai nustatyti pritaikyta gen suliejimo technologija ir panaudoti genai reporteriai (r. 2.2 intarp). Toks reporteris buvo GUS (-glukuronidazs) genas. Lsteles, kuriose pasireikia GUS, galima atskirti pagal spalv. Taip galima nustatyti, kuriose lstelse ir kuriose j vietose pasireikia tiriamasis genas. iuo atveju SPL. Jo raikos vieta yra tik megasporoje arba aposporoje. Nei archesporio lstelje, i kurios isivysto megaspora, nei somatinse sklapradio lstelse sulietasis AtSPL::GUS genas nepasireikia. Manoma, kad tokiu bdu pavyks paenklinti geno produktais ir kitas lsteles. Ypa svarbu tai padaryti MML. Kita vertus, akivaizdu, kad SPL genas specifikai pasireikia tik sklapradio megasporoje, kokios kilms ji bebt.
Apomiks nukrypimas nuo tipiko lytinio dauginimosi. Apomiks istorikai yra atsiradusi vliau negu lytinis dauginimasis. Tai padiktuoja dvi galimybes: susikr nauji genai, kurie lemia apomiks kaip naujai gyt reikin/poym; apomiks galima vertinti kaip lytin dauginimsi lemianio geno ar gen nul mutacij. Dabartiniu metu svarstykls svyra antrosios galimybs naudai. Pagrindiniai nukrypimai nuo lytinio dauginimosi yra bent trys: nevyksta redukcinis mejozs dalijimasis, sutrikusi homologini chromosom sinaps, bivalent susidarymas, pasireikia asinaptin mejoz, kuri bdinga diplosporijai; aposporini apomikt mejoz visikai slopinama, gemalo maielis vystosi be mejozs. Mejozs mutant gausa turt tikinti, kad nukrypim reguliuoja ne vienas genas, o gen grups. Pvz., mutante ameiotic1 (am1) nevyksta mejoz, o tik mitoz. Tai bdinga ir mitozinei diplosporijai. Mutanto dyad mejoz nutrksta po pirmojo mejozs dalijimosi: sutrikusi homologini chromosom sinaps, nesusidaro bivalentos ir pan. Gemalas vystosi partenogenetikai, be apvaisinimo, ypa tai vaizdu diplosporijai. Teistai kyla klausimas, koks genas sulaiko kiauialst nuo partenogenezs. Keletui megagametogenezs mutant bdingas didelis haploid skaiius, t. y. partenogenetin redukuotos kiauialsts raida. Tarp j miei mutantas haploid initiator (hap): susidaro itin daug motinini haploid. Kelis kartus padidja motinini haploid ir mutantui indeterminate gametophyte (ig). i dviej nukrypim palyginimas tikina, kad chromosom skaiiaus redukcija ir partenogenetin gemalo raida yra du skirtingi autonominiai reikiniai. Endospermo/centrins gemalo maielio lstels raida pateikia dar vien centrini lytinio dauginimosi nukrypim: kai yra autonomin apomiks, apskritai pasidaro nereikalingos vyrikosios lytins lstels, nevyksta netgi pseudogamija. Endospermo (ir tuo paiu gemalo) raidai netrukdo netgi sutriks motinos-tvo genom santykis endosperme, kuris turt bti 2m:1t. Genai, kuri mutantuose endospermo raida gali prasidti be centrins gemalo lstels apvaisinimo, jau ms nagrinti. Tai FIS gen grup (MEDEA, FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM2, FERTILIZATION INDEPENDENT SEED2 ir kt.), kurie lemia chromatino remodeliavim, todl apomiks reguliuojama epigenetini mechanizm. Deja, fis1-3 mutant endospermo raida tik prasideda be centri192 |
ns lstels apvaisinimo. Vliau skla va, o tai parodo, kad dar ne visi pagrindiniai sklos raidos (master) genai, kontroliuojantys endospermo raid, yra iaikinti. Keli genai lemia apomiks? Dominuojanti monogenin apomiks. Po pirmj genetini apomikss tyrim buvo daroma ivada, kad apomiks paveldima kaip monogeninis dominuojantysis poymis. Kaip galjome sitikinti, pagrindo tokiam tvirtinimui yra, nes reikia tik vieno geno mutacijos, ir visa vyki grandin nutrksta. Daugumos aukiau nagrint gen mutacijos turi neigiamas pasekmes augalo fenotipui ir yra recesyviosios. Taiau pagal dar 1931 m. Fierio (R. A. Fischer) pasilyt dominavimo evoliucijos teorij aleli santykiai yra evoliucijos rezultatas. Pagal i teorij, jeigu alingas recesyvusis genas teikia organizmui privalum, kuri iki tol is neturjo, veikiant atrankai susikuria gen-modifikatori, kurie slopina neigiamas mutantinio alelio ypatybes ir paveria gen dominuojaniu, sistema. Savidulka turi privalum prie krymadulk, kai slygos yra pastovios arba apvaisinimas yra apsunkintas, bet labai greitai prarandamas heterozigotikumas ir hibridin galia (heteroz), grtama prie pradini homozigot, kaip pasakoje apie sen ir geld; Vegetatyvinis dauginimas(is) tarp augal yra labai paplits natraliai, bet daniausiai yra alia lytinio dauginimosi, efektyviai isaugomas heterozigotikumas, taiau gamtinmis slygomis klono plitimas yra labai ribotas. Apomiks jungia vis dauginimosi bd privalumus, nes ilgam isaugo susidariusius palankius heterozigotinius gen derinius, o dauginimasis sklomis padeda iems augalams plaiau ir spariau paplisti, netgi kai augal apsidulkinimo slygos yra apsunkintos. Be to, netgi labiausiai obligatiniai apomiktai yra isaugoj ir lytin dauginimsi kaip bd naujiems gen deriniams atsirasti. Apomiks veikia kaip izoliacijos veiksnys. Neleidia palankiems gen dariniams inykti ir kartu palaiko polimorfizm ries viduje. Neatsitiktinai apomiktins gentys (Poa, Hieracium) yra labai polimorfikos. Tai suteikia pakankamai erdvs pasireikti dominavimo evoliucijai. Apomikss genmodifikatori gaus patvirtina tai, kad reikin daugelyje augal ri dl apomikss pasireikimo polimorfizmo galima tirti ir kaip kiekybin poym, lemiam poligen.
ASGR (aposporijai specifinis genomo rajonas). Jau anksiau buvo pastebta, kad apomikt chromosomose yra padidjs DNR kiekis heterochromatino rajonuose. Artimo vaireniui (A. thaliana) augalo Boecheria diploidin apomiks pasireikia tik ryje B. divaricata, kuri turi heterochromin (Het) chromosom. Be to, i chromosoma yra hemizigotin, neturi homologo. Kita ris B. stricta dauginasi lytiniu bdu ir neturi Het chromosomos. Hemizigotinis yra ir chromosomos segmentas, kuris nulemia aposporij soruols (Pennisetum squamulatum) ir Cenchrus ciliaris. Jis pavadintas ASGR (angl. apospory specific genomic region), yra 50 Mbp dydio ir jau klonuotas BAC (angl. Bacterial Artificial Chromosome bakterijos dirbtin chromosom). ASGR viduje nevyksta rekombinacija, ir manoma, kad jis paveldimas kaip haplotipas, panaiai kaip S-haplotipai (r. 2.4.2.2 ir 2.6 intarp) vienu bendru bloku. Tarp apomikt P. squamulatum ir C. ciliaris yra beveik visika ASGR sintenija, nukleotid sek ir vietos chromosomoje sutapimas, tik invertuota eile (apversta 180). ASGR lokusai neaptinkami giminingose i augal ryse, kurios dauginasi lytiniu bdu. Labai domu, kad giminingas (ortologinis) ASGR lokusui segmentas aptiktas ryi (Oryza sativa) 11-osios chromosomos centromeros sudtyje.
AUGAL GENETIKA
| 193
Penki gen hipotez. Monogeninis apomikss paveldjimo bdas labiau tinka fakultatyviajai aposporijai. Akivaizdu, kad obligatin aposporija ir juo labiau displosporija reikalauja nukrypim bent nuo dviej autonomini reikini: obligatin aposporija gemalo maielio ektopins raidos i sklapradio somatins lstels ir endospermo raidos be apvaisinimo ir tuo paiu be btino lytiniam dauginimuisi genom santykio endosperme 2m:1t; diplosporija apomejozs (neredukuotos megasporos) ir partenogenezs. Mint reikini autonomija pakankamai solidiai pagrsta, todl vieno dominuojanio geno iems reikiniams nepakanka, nebent tai bt genas, reguliuojantis i karto abu autonominius reikinius. Pagal vien i nesen hipotezi ( F.Matzk et al. 2005), apomiks kontroliuoja penki pagrindiniai dominuojantieji genai:
Parthenogenesis preventer (Ppv). i hipotez pagrsta pievins migls (Poa pratensis) tyrimais srautins citofotometrijos metodu.
Apospory initiator (Ait); Apospory preventer (Apv); Megaspore development (Mdv); Parthenogenesis initiator (Pit);
Apomiks ir reguliacini gen disbalansas. Yra pakankamai tikinam pavyzdi, kad apomiks gali atsirasti isiderinus gen veiklos reguliacijai. Tokiu bdu apomiks gali atsirasti tolimuosiuose hibriduose ir naujai indukuotuose poliploiduose. Pvz., aposporija atsiranda hibriduose, kai sukryminamos dvi vdryno rys Ranunculus carpaticola x R. cassubicifolius. Kai kurios diploidins augal rys, pvz., Paspalum notatum, padvigubinus j chromosom skaii, tapo apomiktinmis. Btinas apibendrinimas. Poreikis suvokti apomikss genetik, gauti dirbtin apomiks ir j pritaikyti gen ininerijai, yra didiulis. Kol kas jis kertasi su daugybe neatsakyt klausim (3.9 intarpas), taiau nra met, kad ioje srityje nebt padaryta nauj atradim. Apomiksei, kaip ir gemalo maielio raidai, S-nesuderinamumui ir kitiems augal genetikos reikiniams yra bdingas polimorfizmas, mechanizm vairov, bet tarp nagrint spjam apomikss mechanizm didelio prietaravimo nra. ASGR lokuse gali bti ne vienas, o du ar keli genai, kaip tai yra S-lokuse, o Matzko hipotezje irgi figruoja ne tik apomikss genai (aposporijos, megasporos, partenogenezs determinatoriai), bet ir reguliatoriai (aposporijos ir partenogenezs preventoriai). Barjeras, kuris trukdo vairenio generatyvinms ir somatinms lstelms vystytis apomikss bdu, pasireikia labai anksti, dar archesporio lstelse. i gen-supresori paiekos iuo metu vykdomos.
3.9 intarpas. Sklos raida klausimai, klausimliai... Kol kas yra daug bendro pobdio neatsakyt klausim, kurie turt bti adresuoti ne tik apomiksei, bet ir apskritai augal dauginimuisi sklomis. Apomiks iuos klausimus tik labiau parykina. Bene svarbiausias j, kodl viena i sklapradio lsteli tampa motinine megasporos lstele/megasporocitu. pradeda dalintis mejozs bdu = lytinis dauginimasis; arba su mejozs nukrypimais, be redukcinio dalijimosi = diplosporija; arba apskritai be mejozs tiesiai i somatins sklapradio lstels gemalo maiel, kai kuri apomikt (pvz., Hieracium) visikai atitinkant Poligonum tip arba artim jam = aposporija. Kita vertus, akivaizdu, kad sklapradio lstels jau turi program vystytis gemalo maiel. Kokie genai arba transportuojami j produktai sukuria raidos program link gemalo maielio? Lygiai taip pat kyla klausim, kodl kai yra aposporija, i pradi vystosi daug MML /gemalo maieli, paskui ilieka tik vienas, o kiti va. Kas ,,diriguoja iam reikiniui? Kokiomis savy194 |
bmis turi pasiymti is nugaltojas, kuo skiriasi jis nuo pasmerktj, ar nugaltojas visikai niekuo nesiskiria nuo kit, o lemia atsitiktinumas ar geresn vieta sklapradyje? Taip pat akivaizdu, kad turi bti signalai, ryiai tarp lstels-nugaltojos ir vanij, nukonkuruot gemalo maieli. Kokie genai ir kokie produktai iuos ryius nustato? Kol kas neaiku, kokius signalus priima SERK1 (SOMATIC EMBRIOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE1) geno koduojama receptorin proteinkinaz. is genas itin aktyvus ne tik lytiniuose ir somatiniuose gemaluose, bet ir aposporoje. Spjama, kad SERK-signalinis kelias gali sveikauti su auksin/hormon keliu per dar vieno geno APOSTART koduojam baltym. Neseniai nustatyti skirtumai pagal io geno raik tarp augal, kurie dauginasi lytiniu arba apomikss bdu. APOSTART koduojamas baltymas turi tam bding domen START ir yra reikalingas membran/baltym sveikai. O gal tai reversija, savotikas atavizmas, nes pun susidaro kelios archegons, o paskui keli gemalai, bet visi va ir pagaliau skloje lieka tik vienas gemalas (3.2.1 sk.). Kad taip gali bti, parodo ir kukurz mutanto mac1 (multiple archesporial cells 1) fenotipas. vykus geno Mac1 mutacijai, susidaro daug megaspor (nuo 3- iki 21). Suprantama, kad somatins sklapradio lstels, i kuri tiesiogiai isivysto gemalai, kai yra adventyvin embriogenez arba nra gij programos vystytis gemalo maiel, arba i programa tokiose lstelse yra nuslopinama. Ir i kit somatini lsteli (r. somatin embriogenez, 3.3.2 sk.) isivysto tik gemalas. Tad ir ios lstels neturi programos vystytis gemalo maiel. Vl ikyla tie patys klausimai kaip apie aposporij: kokie genai nukreipia sklapradio somatines lsteles vystytis gemalus, ar tos lstels atsitiktins, ar nulemia j vieta sklapradyje, biologins i lsteli ypatybs. Mat, augal, kurie dauginasi lytiniu bdu, MML, megaspor tetradose ir degeneruojaniose megasporose intensyviai kaupiama kaloz i lsteli sienelse. Kalozs visikai neaptikta aposporinse motininse megasporos lstelse (MML) ir tai nustatyta keliose tirt geni ir ri, konkreiai Poa pratensis, Pennisetum, Brachiaria, Hieracium. Apstu hipotezi, kaip atsiranda apomejoz, kodl gametofitin apomiks danesn tarp poliploidini augal ri, kodl ir kaip apomikt chromosomose atsiranda papildomas chromatinas ir kokia jo reikm. Nra atsakyta ir klausim, kas neleidia neapvaisintai kiauialstei pradti dalintis ir kodl ji dalijasi, kai yra diploidin partenogenez/diplosporija. Daug klausimli kyla ir dl autonomins endospermo raidos. Autonomin endospermo raida progresuoja, jeigu fie geno mutacija derinasi su motininio genomo hipometilinimu. Tai rodo, kad btina dereguliuoti didel gen skaii. Galbt ia slypi ir atsakymas klausim, kaip autonominiai apomiktai ivengia genom santykio 2m:1t problemos. Spjama, kad paalinamas motinos gen imprintingas, bet vl kyla klausimas, kaip tai atsitinka? Galima bt i klausim ir nekelti, bet somatin embriogenez, aposporija kaip i somatins jau specializuotos augalo lstels isivysto augalas urnalo Science apklausos duomenimis, yra viena svarbiausi amiaus mokslo problem. Jai nagrinti bus sutelktos didels mokslinink pastangos.
AUGAL GENETIKA
| 195
SAVARANKIKAM DARBUI (r. papildomai odynl)
Pagrindins svokos Abscizo rgtis reikm brendimas Auksinas morfogenas valdomi genai neikliai atsakas mutacijos Aleuronas dygimas Apomiks tipai Daigo mutacijos Desikacija (sklos) Embriogenez stadijos Endospermas raida sincitinis celiuliarizacija tipai branduolinis lstelinis domenai aleuronas krakmolingasis genai Gemalo raida stadijos genai Gen bankai Genomo imprintingas epigenetinis FIS genai MEDEA genas Luobel (sklos) mutacijos Meristem genai Skla raida morfogenez brendimas desikacija ramyb dygimas Trichomos
196 |
4. ATSARGINI BALTYM SINTEZS GENETIKA IR GEN EVOLIUCIJA
4. Atsargini baltym sintezs genetika ir gen evoliucija

PAGRINDINS SVOKOS odynlis Atsarginiai baltymai augalo kaupiami specialiuose organuose (sklos emdosperme, sklaskiltse, gumbuose ir pan.). Sudaro atsargas greitam atsinaujinusiam augimui. Osborno atsargini baltym klasifikacija grindiama skirtingu baltym tirpumu vairiuose tirpikliuose: albuminai yra tirps vandenyje; globulinai silpnuose drusk tirpaluose; prolaminai alkoholio/vandens miinyje; glutelinai blogiausiai tirps, jie tirpinami rgi, arm arba detergent tirpaluose. Prolaminai unikals dalies Poaceae . augal atsarginiai endospermio baltymai, turi labai daug glutamino (Q) ir prolino (P). Glitimas tsi mas, kuri susidaro i kviei gliadin ir glutenin. Gluteninas pats didiausias baltym polimeras, kuris inomas gamtoje (manoma, iki 11.000 kDa). Gen evoliucija dl duplikacij ir divergencijos, gen susiliejimo. Kilms bendrumas nustatomas ne tik pagal DNR ir baltymo sek homologij, bet ir pagal erdvin sandar (pvz., kupin). Baltym saugojimo vakuols (BSV) savitas vakuoli tipas, kur gabenami atsarginiai baltymai. Bdingos dviskiliams augalams ir vienaskili globulinams ir albuminams. Baltym kneliai (BK) bdingi migliniams augalams. Gali bti dviej tip: susidaro endoplazminiame tinkle arba vakuol laipsnikai virsta BK.
4.1. Bendrieji principai ir veika

Dmesys skl atsarginms mediagoms. Sklose sukauptos atsargins maisto mediagos yra svarbios jauno daigo igyvenimui. Kita vertus, tai pagrindinis maisto altinis mogui. Svarbiausi ems kio augalai kvieiai, kukurzai, ryiai, soja ir kt. auginami pirmiausia dl produkt, kuriuos gauname i i augal grd/skl. Atsargins mediagos sudaro per 90 % visos sklos mass. Tai cukrs (daniausiai krakmolas), aliejus (daniausiai triacilgliceroliai) ir specials atsarginiai baltymai. Atsargini mediag kiekis, j santykis skloje priklauso nuo augalo ries ir veisls. ems kyje augalai netgi skirstomi pagal tai, kokios atsargins mediagos vyrauja j sklose, vaisiuose, aknyse ar gumbuose ir kam jos naudojamos (aliejiniai, techniniai augalai).
AUGAL GENETIKA
| 197
Dl ypatingos augal skl atsargini mediag svarbos mogui, i baltym sintezs genetika, gen sandara, veikimas ir evoliucija yra itin gerai itirta, todl iame skyriuje pagrindinis dmesys sutelkiamas skl/grd atsarginms mediagoms. Tai daroma dl trij prieasi: yra tiesioginis ryys su tomis iniomis, kurios dstomos 3-iajame skyriuje, nes atsargini mediag sintez, kaupimas ir panaudojimas tiesiogiai siejasi su genais, kurie reguliuoja sklos brendim-desikacij, ramybs period ir dygim; dl skl/grd ekonomins svarbos visi procesai, susij su skl atsarginmis mediagomis, yra geriausiai itirti; dl isamaus atsargini mediag genetikos itirtumo nustatyta daug principini ne tik augal, bet ir bendrosios genetikos, ypa gen raikos, evoliucijos reikini. Atsarginius baltymus ir cukrus koduojani gen raikos ir reguliacijos kitimai, kai skla brsta, pereina ramybs bsen, pradeda dygti ir kai keiiasi to paties geno reguliacija ir raika, teikia unikali augal genetikoje galimyb tikinamai parodyti, k reikia transkripcijos kodas, o didiuliai agregatai, kuriuos jungiasi skl atsargini baltym subvienetai, pastaruoju metu susilauk proteomikos dmesio. Kiekybs ir kokybs genai. Bet kuri mediag, tarp j ir atsargini, kiekis organizme paveldimas pagal kiekybini poymi genetikos principus, yra suminis gen ir aplinkos poveiki rezultatas. Jis labai priklauso nuo auginimo slyg. Augintojas stengiasi sukurti optimalias slygas, taiau ir iuo atveju pasireikia genotipo koduojami skirtumai. Net labai priirimi laukiniai ems kio augal giminaiiai neduot to derliaus, kuris gaunamas i ems kio augal. Tai nulemia ir pakitusi i augal reakcijos norma aplinkos veiksnius. Pvz., vienu metu garsjusi kviei veisl,,Bezostaja 1 pasiymi padidintu fosforo sisavinimu i dirvos, o i lietuvik vietini miei kilusi veisl ,,Diugiai yra labai atspari rgioms dirvoms. Sumuojasi poligen veikimas, pasireikia polimerija, arba kitaip pasireikia sumin (adityvi) gen sveika. Poligenai yra paveldimi pagal kiekybini poymi genetikos principus. Jiems vis laik genetikai skiria daug dmesio, o pritaikius iuolaikinius tyrimo metodus pakankamai argumentuotai rodyta, kad kiekybinius augal skirtumus lemia pagrindini gen, gen-modifikatori ir reguliacini gen aleliniai skirtumai. Tenka iekoti optimalaus i alelini gen derinio. Taip pat sitikinta, kad baltym, cukr (krakmolo), aliej kaupimasis augalo audiniuose, sklose priklauso ne tik nuo i mediag sintez reguliuojani gen, bet ir nuo anatomins augalo sandaros, lstels struktr, kuriose kaupiamos ios atsargins mediagos, taip pat veiksni, kurie vykdo atsargini mediag perna ir integravim ias lstels struktras. Gen, kurie koduoja i struktr sandar, aleliai irgi prideda savo dal kiekybini poymi genetik. Kita vertus, ir pavieni gen panaudojimas gali i esms pakeisti augalo produktyvum arba netgi specializacij pagal produkuojamas mediagas. Jau mint augimo hormon sintezs mutant pritaikymas inicijavo alij revoliucij, o kviei derlius padvigubjo (r. 3.4.4 sk. ir 3.5 intarp). Antroji aliosios revoliucijos banga nulemta augal gen ininerijos laimjim. Perkelti pavieniai genai, kurie lemia atsparum ligoms, herbi198 |
cidams, vabzdiams, taip pat reakcijos norm abiotinius veiksnius (atsparum sausrai, metalams, aliui ir kt.) labai pagerino augal augimo slygas, o tuo paiu ir derli. Gen ininerijos metodais yra ne tik gerinama atsargini mediag kokyb (pvz., nesoij riebal rgi kiekis), bet ir augalas priveriamas kaip atsargines mediagas sklose, gumbuose kaupti visikai jam svetimas mediagas, pvz., greitai suyranias plastmases, vor ilk, gyvulins kilms vaistines mediagas (imunoglobulinus, hormonus ir kt.). Augalai paveriami i mediag pigios aliavos gamintojais (producentais). Koreliaciniai ryiai ir kaip juos panaikinti. Tenka atsivelgti ir koreliacinius ryius tarp skirting atsargini mediag sintezs, pvz., baltym ir cukr santyk grdo endosperme. Pagal tai, pvz., miei veisls yra skirstomos tinkamas maistui ir gaminti al. Koreliaciniai ryiai gali bti esminiai netgi tarp tos paios grups atsargini mediag. Pavyzdys gali bti atsarginiai baltymai. Kukurz, miei didij atsargini baltym dal sudaro netirps vandenyje nepilnaveriai pagal aminorgi sudt baltymai. Juose stokojama nepakeiiamj aminorgi, ypa lizino ir triptofano. i aminorgi yra pakankamai tirpiuose vandenyje albuminuose ir globulinuose. Deja, egzistuoja atvirkias koreliacinis ryys tarp i baltym kiekio grde ir derliaus. Yra gauti kukurz, miei mutantai, kuri grduose yra pakits atsargini baltym santykis tirpij baltym naudai (r. toliau), taiau pasireikia mintasis koreliacinis ryys, ir iuos mutantus tiesiogiai panaudoti negalima. Taiau genetikai nenuleidia rank. Panaudojant daugiausia genusmodifikatorius sukurtos kukurz vadinamosios QPM (angl. Quality Protein Maize) linijos, kuriose gera atsargini baltym kokyb derinasi su pakankamu produktyvumu.
4.2. Atsarginiai baltymai

4.2.1. Atsargini baltym grups ir j paveldjimas iuo metu skl baltymai skirstomi 3 grupes: atsarginius, struktriniusmetabolizmo ir apsauginius. Be abejo, ios baltym grups persidengia. Atsarginiai baltymai gali bti amilazi ir proteazi inhibitoriai, o nuo atsargini baltym savybi priklauso ir sklos/grdo fizins savybs. Skl atsarginiai baltymai neturi fermentinio aktyvumo ir yra aminorgi rezervas dygstaniai sklai. Jie gali bti kaupiami ne tik sklose, bet ir aknyse ar stiebagumbiuose (kaip bulvi). Daugiausia atsargini baltym sukaupia pupiniai augalai, j sklose yra 2540 %. baltym, tarp j pirmauja soja (4.1 lentel), kuri vertinama ir kaip aliej altinis. Miglini . priklausani grdini kultr (jav) grduose baltym yra 23 kartus maiau (1015 %), bet ie augalai duoda mogui didiausi produkcij, yra pagrindinis pirminis baltym altinis mogui ir naminiams gyvuliams. Antrojo tkstantmeio pabaigoje grdini augal metinis derlius siek per 2000 milijon ton, 70 proc. bendros produkcijos (kukurz 604, kviei 584, ryi 563 mln.,o pupini/anktini tik per 250 mln. ton). Kita vertus, palyginimui, augal lapuose yra tik 35 % baltym. Atsargini baltym maistin kokyb yra antrasis poymis pagal kur vertinami augalai. Pirmojoje vietoje yra ryiai, grikiai ir soja. Atsargini baltym kokyb vertinama dviem atvilgiais:
AUGAL GENETIKA
| 199
mai;
pagal sisavinim (4.1 lentel): geriausiai sisavinami ryi, sojos ir griki balty4.1 lentel. Atsarginiai baltymai svarbiausi ems kio augal sklose/grduose1
Augalas
Kvieiai Kukurzai Rugiai Avios Mieiai Ryiai Soja Pupels irniai
Baltym %
12 10 13 15 1012 78 3540 30 25
Baltym Baltym grups, santykinis pasiskirstymas % sisavinimas2 % Albuminai Globulinai Prolaminai Glutelinai
4450 5258 4459 4045 6070 8386 71>90 55 Poaceae eimos augalai 47 520 614 723 25 1529 15 7085 8,512,5 2,35,7 > 12 7080 Fabaceae eimos augalai 1020 6070 1020 8090 60 2030 5060 3555 5060 1020 3555 <2025 <5% 0 0 0 25 738 17 27 7080 322 113 613
1 Pateikti lentelje skaiiai yra tik orientaciniai. I ties, baltym kiekis ir sudtis labai kinta priklausomai nuo veisls ir augimo slyg; 2 Kaip standartas imamas pieno albuminas. Jo sisavinimas prilyginamas 100 %.
pagal aminorgi sudt, ar subalansuota aminorgi sudtis, ar yra visos mogui reikalingos nepakeiiamosios aminorgtys. Kaip inoma, i aminorgi. mogaus organizmas sintetinti nesugeba, turi gauti su maistu. Pagal i savyb skiriasi ne tik augalai, bet ir j atsarginiai baltymai. Grduose trksta lizino, treonino ir triptofano, o pupini sklose cisteino ir metionino. Apskritai atsarginiai baltymai skirstomi dvi klases: skl atsarginius baltymus (SAB) ir vegetatyvinius atsarginius baltymus (VAB). SAB naudojami, kai skla dygsta, o VAB danai yra laikina baltym talpykla. Atsargini baltym klasifikavimas. Dalis sklos baltym yra funkciniai arba struktriniai. Tai nra atsarginiai grdo/sklos baltymai, bet baltym kiekis skloje yra vertinamas totaliai, todl ie baltymai atsiduria albumin ar globulin frakcijose, tarp j ir jau minti LEA (angl. Late Embryogenesis Associated) baltymai. Nuo j priklauso toleravimas stresams ir desikacijai (vandens praradimui). Nepaisant to, kad baltym tyrimai labai toli paeng, laikomasi dar praeito imtmeio pradioje Osborno (T. B. Osborne) pasilyto atsargini baltym klasifikavimo, kuris grindiamas baltym tirpumu: albuminai tirps vandenyje; globulinai silpnuose drusk tirpaluose; prolaminai alkoholio/vandens miinyje; glutelinai sunkiausiai tirpstantys, jie tirpinami rgi arba arm tirpaluose, o iuo metu j tirpdymui vartojami detergentai. Dabartin klasifikacija remiasi ne tirpumu, o baltym sandara. Ne visada ios dvi savybs sutampa, todl ketvirtosios grups, glutelin, danai atsisakoma ir atsarginiai baltymai skirstomi dvi grupes globulin ir prolamin. Geriausiai neatitikim tarp Osborno pasilyto atsargini baltym klasifikavimo ir baltym sandaros parodo ryiai. Didij j grdo atsargini baltym dal (7080 %) sudaro glutelinai, bet pagal sandar jie atitinka sojos 11S globulinus, tik yra polimeriniai
200 |
(i keli subvienet). Netgi aminorgi sudtis yra gan panai (3237 % homologijos) Dl io panaumo globulinams ryi baltymai yra gerai sisavinami. Panaiomis savybmis pasiymi ir avi atsarginiai baltymai (4.1 lentel). J grduose yra tik 1020 % prolamino avenino, o globulin 7080 %. Tiesa, avi globulinai, kaip ryi atsarginiai baltymai, sunkiau tirpsta (todl virti ryiai ilieka birs), taiau aminorgi santykis j baltymuose yra geriau subalansuotas. Tai ir yra prieastis, kodl irg (old) reikia erti avilmis (jei paersi avilm..., tai nuneiu). mons ias ryi ir avi savybes seniai pastebjo ir vertino pirmiau, negu atsirado aminorgi analizatoriai. i baltym frakcij santykis vairi augal sklose labai nevienodas. Albumin ir globulin daugiau pupini augal sklose, o prolaminai yra migliniams bdinga atsargini baltym grup. Pupiniai apskritai jos neturi (4.1 lentel). Tolesniais tyrimais buvo nustatyta, kad tai paiai frakcijai priklausantys baltymai i skirting augal skiriasi. Tai atsispindi netgi baltym pavadinimuose, kurie danai yra kil i lotyniko augalo pavadinimo. Pvz., miei prolaminai vadinami hordeinais (nuo Hordeum), o kukurz zeinais ( nuo Zea) ir pan. Antra vertus, kiekvienoje frakcijoje baltymai skirstomi smulkesnes grupes. is skirstymas daniausiai pagrstas sedimentacijos koeficientu ultracentrifuguojant arba cheminiais-struktriniais baltym skirtumais. Albuminai ir globulinai. Globulinai yra pagrindiniai daugelio dviskili skl, ypa pupini . augal, atsarginiai baltymai. I j savo puikiomis maisto savybmis ypating viet uima soja. Jos atsarginiai baltymai prilygsta msai, todl soja ir naudojama kaip msos pakaitalas. Geros kokybs atsarginius baltymus, kaip minta, turi grikiai: 33 % j atsargini baltym sudaro 13S globulinai. Griki baltymuose yra seleno ir visikai nra glutelin. Jeigu dar pridursime, kad griki sklose yra daug kraujagysles stiprinanio antioksidanto rutino, grikiai pagal maisto savybes yra tikrai iskirtinis augalas. Albuminus ir globulinus yra labai sunku atskirti. Paprastai ios dvi grups atskiriamos ultracentrifugavimu: albumin sedimentacijos koeficientas yra 1,62S, o globulin sedimentacijos koeficientais pagrsta j klasifikacija. Pupini augal skiriami 7S (4550 kDa) ir 11S (6065 kDa). 7S globulinai vadinami vairiais pavadinimais, priklausomai nuo j kilms (fazeolinai i Phaseolus vulgaris, konglicinai i Glycine max ir pan.), taiau daniausiai vartojamas j pavadinimas yra vicilinai (nuo Vicia). Visi 11S (arba artimo S) globulinai vadinami leguminais (nuo seno pupini . pavadinimo Leguminosae). Abiems globulin grupms bdinga labai didel vairov. Netgi to paties augalo sklose galima aptikti 510 skirting tos paios grups polipeptid. vairov padidina vairios j modifikacijos baltym brendimo metu: yra skaidomi maesnius arba dar daniau, atvirkiai, jungiami didesnius polipeptidus, glikozilinami. Be to, juos koduoja didelis skaiius gen. Pvz., irni yra bent 24 genai, esantys maiausiai 6 lokusuose. Pupiniams atstovaujanios liucernos (Medicago truncatuta) sklose sintetinami du 7S globulinai (vicilinas ir konvicilinas) ir 11S leguminai. domu tai, kad juos koduojani gen raika vyksta tam tikra tvarka: 14 DAP (angl. Days After Pollination) vicilinai; 10 DAP leguminai; 18 DAP konvicilinai.
Nors vairenio atsarginiai baltymai nra svarbs ekonomikai, bet jie svarbs paiam augalui, ir tarp dviskiltes sklas turini augal vairenio atsargini baltym sintezs genetika yra pakankamai gerai itirta. Vairenio atsarginiai baltymai yra trij tip: 12S globulinai vadinami kruciferinais, 2S albuminai panas vicilinus (i Vicia). Vairenio, kaip ir kit dviskili, atsarginiai baltymai kaupiami sklaskiltse. Juos koduoAUGAL GENETIKA
| 201
ja gen eimos i 4 5 nari: 2S albuminus At2S1-At2S4 ir kt., o 12S globulinus CRA-CRC ir kt. dar neidentifikuoti genai. Genai, kurie valdo i gen raik, jau nagrinti. Tai sklos brendimo genai FUS3, ABI3, LEC1, taip pat hormonas abscizo rgtis (3.1 sk.). J veikla reguliuojma hierarchiniu bdu: LEC1 valdo ABI3 ir FUS3, o ie koduoja transkripcijos veiksnius, kurie jungiasi prie mint albumin ir globulin gen cis elemento RY (CATGCA).
Miglini globulinai yra dviej tip: 7S sintetinami gemalo ir aleurono lstelse ir 12S krakmoliniame endosperme. Pastarieji panas pupini 11S leguminus. Pun skl atsarginiai baltymai irgi yra globulinai. Pvz., veimutins puies (Pinus strobus L.) sklose aptinkami dviej tip globulinai: 7S (4649 kDa) panas vicilinus ir 11S (54,6 kDa) panas leguminus. Jie gali disocijuoti 38,240,0 kDa ir 22,523,5 kDa polipeptidus. Panas atsarginiai baltymai aptikti ir kitose ryse P. abies, P. glauca. Prolaminai yra unikals dalies Poaceae . augal endospermo atsarginiai baltymai. Deja, j maistins savybs yra blogesns nei pupini augal, nes yra nesubalansuota aminorgi sudtis. Isiskiria i kit atsargini baltym labai dideliu aminorgi glutamino (Q) ir prolino (P) kiekiu, kur lemia didels, tik prolaminams bdingos, kartotins sekos PQQPFPQ (r. 4.2.3 sk.). vairi augal prolaminai, nors turi daug sandaros panaum, vadinami skirtingais pavadinimais: kukurz zeinai, kviei gliadinai ir gluteninai, miei hordeinai. Jie labai polimorfiki, jungiasi stambesnius polimerus, todl visikai pagrstai kiekvieno augalo prolaminai skirstomi dar smulkesnes grupes. Jos, kaip ir globulin, skiriasi ne tik subvienet dydiu, sedimentacijos koeficientais, aminorgi sudtimi, bet ir technologinmis ypatybmis.
Kukurz prolaminai zeinai skirstomi keturis (, , , ) poeimius. I j pats didiausias yra -zein poeimis (> 70 % vis zein). Juos koduojantys genai sudaro kelias sankaupas ir pagal molekulin mas skirstomi dar smulkiau 19 ir 22 kDa -zeinus. keturias grupes skirstomi ir miei prolaminai hordeinai. I j B hordeinas (3546 kDa) sudaro pai didiausi (7080 %) ir labiausiai polimorfin hordein grup, koduojam labai polimorfins Hor2 multigenins gen eimos. B ir hordeinai vadinami turtingais S (siera), j molekulje yra daug cisteino (Cys) ir metionino (Met) liekan. Prastos maisto kokybs C hordeinai (5575 kDa, 1020 % hordein) apskritai neturi Cys, o Met yra labai nedaug. Stambiausios molekulins mass (subvienetas per 100 kDa) D hordeinai priskiriami vadinamajai HMW atsargini baltym grupei.
Kviei gliadinai ir gluteninai. Glitimas. Kvieiai, taip pat ir rugiai, pasiymi savybe, kuria jie isiskiria i kit grdini augal. Sudrkinti j miltai sudaro tsi elasting mas - glitim, todl tinka raugintos telos duonos produktams. Gliadinai ir gluteninai yra dviej klasi prolaminai, kurie skiriasi tirpumu spirite. Gluteninai jame netirpsta. Pagal elektroforezin judrum ir baltymo struktr abi baltym klass skirstomos smulkiau. Gliadin yra keturios grups , , , . Jas koduojantys genai yra skirtinguose multigeniniuose lokusuose, nors ir toje paioje 1-ojoje kviei genomo chromosomoje: / - Gli2, o ir labai artimai sukib Gli1/Gli3. Tai tikina, kad ie multigeniniai lokusai yra atsirad dl geno-protvio duplikacij. Gluteninai skirstomi dvi grupes pagal monomer (subvienet) molekulin mas: LMW (angl. Light Molecular Weight) 3040 kDa ir HMW (High MW) 80100 kDa. J subvienetai jungiasi polimerus. Gluteninai laikomi paiais didiausiais baltym polimerais, kokie yra inomi gamtoje. J molekulin mas siekia iki 11 milijon Da (11000 tkst. kDa).
202 |
Glitimo savybes nulemia gliadin ir glutenin miinys, bet daugiausia elastingumo jam suteikia HMW gluteninai. J elastingumas prilyginamas elastinui ir titinui, netgi struktra panai elastino. Dl i glitimo savybi pastaruoju metu kviei glitimas pradtas naudoti biopakavimui (kaip pakavimo mediaga, kuri suvirkina organizmas). HMW glutenino monomerai yra sudaryti i dviej subvienet: x tipo (8388 kDa) ir y tipo (6774 kDa). Elastingum suteikia vidurinysis kartotinis domenas (4.1 pav., A).
Paprastasis kvietys (Triticum aestivum L.) yra heksaploidas. Jis turi tris genomus A, B ir D. Subvienetus x ir y koduojantys genai irgi yra visuose trijuose genomuose, todl atitinkamai ymimi 1Bx, By ir pan. (4.1 pav.). Gliadin genai irgi yra visuose trijuose paprastojo kvieio genomuose. Tad milt kokyb nulemiani gen padidja tris kartus, bet skirtinguose genomuose esani gliadin ir glutenin gen raika ir indlis technologines produkcijos savybes nevienodas. Gera telos kokyb siejama su HMW 1Ax subvienetu ( subvienet koduojantis genas yra 1-ojoje A genomo chromosomoje). Subvienetus x ir y koduoja genai, esantys tame paiame lokuse. Glu1 lokusas, kuris yra 1-ojoje T. aestivum chromosomoje, koduoja du labai panaius subvienetus x ir y. Tarp x ir y yra 80 % homologija, taiau y subvienetas turi daugiau Cys liekan, netgi kartotins sekos, bdingos prolaminams, iek tiek skiriasi (r. 4.1 pav.). Panaiai skirstomi ir rugi prolaminai, tik visi jie vadinami vienu sekalin (nuo Secale) pavadinimu.
Atsargini baltym gerinimo programos. Pirmosios programos buvo siejamos su viltimi rasti natralius arba indukuotus mutantus, kuri sklose bt kaupiami geresns kokybs, subalansuotos aminorgi sudties baltymai. Kukurz buvo aptikta bent 18 gen mutantai, kuriuose yra pakitusi grdo tekstra ar atsargini baltym santykis. Ypa populiars buvo du mutantai opaque 2(02) ir floury 2(fl2). J grduose santykinai padidjo albumin ir globulin, o sumajo prolamin kiekis. Pana gamtin miei mutant Munkas (L. Munck) aptiko kolekcijoje i Etiopijos. Jis buvo pavadintas Hiproly (lys1). i mutant grduose buvo daugiau lizino ir triptofano, bet mintiems mutantams bdinga daug neigiam ypatybi, tarp kuri svarbiausios yra menkas j derlingumas, sumajs imunitetas. Taiau i mutant tyrimai, ypa op2, padjo suvokti, kaip valdoma ne tik atsargini baltym sintez, bet ir grdo brendimas, ramybs periodas, dygimas. Opaque2 genas yra reguliacinis, koduojantis svarb transkripcijos veiksn. iuolaikins atsargini baltym gerinimo programos remiasi gen ininerijos metodais. Viena i j pakeisti aminorgi kod koduojanioje geno dalyje. iuo metu kur kas daugiau domimasi baltym pernaa vakuoles, baltyminius knelius, ar netgi riebal knelius. Labai daug laimima, kai ias struktras patalpinami rekombinantiniai, daniausiai gydymo tikslais naudojami baltymai. 4.2.2. Skl atsargini baltym sandara ir gen evoliucija Evoliucija i bendro kamieno. Ortologai ir paralogai. Vos tik pavelgus vairi prolamin ir atsargini albumin sandaros schem (4.1 pav.), matyti, kad ie baltymai yra bendros kilms, i vieno bendro kamieno. Dabar jau inoma, kad jie atsirad dl daugkartini duplikacij (padvigubjim) ir vliau vykusios divergencijos (isiskyrimo). Isiskyrimo prieastys vairios: rekombinacija tarp geno dali, koduojani baltymo subvienetus, mutacijos, judrij genomo element ir apskritai egzogenins (svetimos) DNR siterpimas (insercijos).
AUGAL GENETIKA
| 203
A
N
ALBUMINAI -21 S -25 N -21 N N -21 N S N N N N -19 S S PQQPFPQQ 79

PQQPX(XX) I1
167 A A
Maasis subvienetas
B B B 121 C
C 116 C C
Napinas Saulgr SFA8
S S A
Maasis Didysis subvienetas subvienetas Didysis subvienetas 237
A B
Ricinmedio albuminai 2S miei tripsino inhibitorius
PROLAMINAI PQQPFPQ A I2 B I3 C 241/290 S -19 S A B PQQPFPQQ 104 135 A I2 B I2 I3 B C I3 274 I4 642

PGQGQQ+GYYPTSLQQ
276 I4 684
C
Kviei -gliadinas (daug S) Miei C-hordeinas (maai S) HMW 1By9 subvienetas Miei -hordeinas (daug S) Miei B1 hordeinas (daug S)
-19
286 C I4
B
A, B, C domen pirmtakas Triplikacija
Albumin/prolamin pirmtakas A, B, C domen divergencija dl mutacij
Papildom DNR sek siterpimas
4.1 pav. Prolamin supereimos baltym sandara (A) ir spjama j kilm dl duplikacij (B):
A) S - signalo polipeptidas, kuris yra atskeliamas subrendusiame ir pastatytame viet baltyme; A, B, C domenai, bdingi visai eimai; hordein kartotins sekos (oktamero) konsensusas PQQPFPQQ: P prolinas, Q glutaminas, F fenilalaninas, kviei HMW papildomai, G glicinas, Y tirozinas, T treoninas, S serinas, L leucinas. Skaiiais nurodytas dydis aminorgi liekanomis. I1, I2, I3, I4 skirtingi rajonai daug S turini prolamin molekulje. Daug albumin (tarp j napinas) sintetinami kaip dimerai, brendimo metu suskaidomi monomerus. Tai nebdinga ricinmedio 2S albuminams ir kt. Dauguma prolamin jungiasi sudtingus oligomerus. B) Dl patrigubjimo atsirad A B C isiskyr ne tik dl pakait ir ikrit, bet ir dl naujai siterpusi DNR sek (pagal P. R. Shewry et al .Plant Cell. 1995, Vol. 7, P. 945956; P. R. Shewry N. G. Halford. Journal of Experimental Botany. 2002, Vol. 53, P. 947958;T. Fujiwara et al. Arabidopsis Book. 2002, P. 112)
204 |
Kaip matyti i 4.1 pav., vieni visai artimos sandaros baltymai priklauso tam paiam augalui, kiti skirtingiems augalams. Pagal tai genai ir baltymai skirstomi paralogus ir ortologus. Paralogai artim baltym/gen eima i tos paios ries organizmo, kilusi i vieno bendro geno-protvio, bet evoliucionavo to paties organizmo genome skirting struktr ir funkcijas lemianius genus. Ortologai artimi baltymai/genai i skirting takson, irgi turi bendr protv. Gen/baltym bendros kilms rodymai. Apie j kilms (filogenetin) ry sprendiama vairiais bdais. Pagrindinis rodymas yra homologija. Gali bti nustatoma: nukleotid sek, tarp j ir nekoduojani netransliuojam, homologija; aminorgi ir baltym sudarani subvienet, domen, funkcini aminorgi sek homologija. Taiau apie bendr baltym kilm tikinamai galima sprsti tik tada, jeigu j homologija virija 30 %. Labai sunku, netgi nemanoma nustatyti bendr baltym kilm, jeigu baltym homologija tik 20 % ar net maesn. Erdvin (antrin-tretin) baltym sandara dar vienas altinis, pagal kur sprendiama apie bendr baltym kilm. Taip atsargini globulin kilms data nukelta toli atgal, bakterij genom. Apskritai sklini augal atsargini baltym evoliucija siejama su atsparumu/tolerancija abiotiniams stresams (dehidratacijai-desikacijai, osmozs pokyiams ir kt.). Atsargini albumin ir prolamin gen evoliucija. Visi prolaminai, atsarginiai 2S albuminai, kai kuri proteazi ir -amilazs inhibitoriai yra bendros kilms. Visus juos vienija sandaros panaumai. Jie turi tris nekartotinius domenus, ymimus A, B, C (4.1 pav.). Manoma, kad genas-protvis turjo tik vien domen. Trys domenai atsirado po pakartotinos duplikacijos (triplikacijos), o i domen skirtumai atsirado dl duplikuot domen divergencijos. Gen skirtumus dar labiau padidino papildomai siterpusios DNR sekos, rekombinacija. Papildom sek insercija ypa akivaizdi prolamin genuose. Turjo atsirasti kartotins sekos, bdingos iai baltym grupei. Tai galjo atsitikti ir dl mikrosatelit (trump kartotini DNR sek) ekspansijos (pasidauginimo) geno viduje. ios kartotins sekos , kaip jau minta,koduoja polipeptid, kuriame gausu prolino (P) ir glutamino (Q). Pvz., hordeine B1 i baltymo dalis atrodo taip: NH2-1QQQPT PQQPI PQQPQPY PQQPQPY PQQPFP PQQPF PQQPV PQQPQPY PQQPFP PQQPFPQQPPFWQQKPFPQQPPFGLQ79 Pateiktos aminorgi sekos hordeine B1 tikina, kad netgi tame paiame gene ios kartotins sekos pastebimai skiriasi, todl paprastai nurodoma apibendrinanti visus inomus prolaminus seka konsensusas: PQQPFPQ
AUGAL GENETIKA
| 205
Kaip atsirado prolamin genuose ios kartotins sekos, kas j pirmtakas, kol kas nenustatyta. Artimi prolaminams baltymai irgi turi gausias prolin (P) ir glutamin (Q) sekas, pvz.: 2S antigrybinis albuminas i Raphanus sativus PQGPQQRPPLLQQ; tripsino inhibitorius PQGPQQRPPLLQQ; napinas (i turnepso) PQGPQQRPPLLQQ. Kai kuri prolamin, kurie neturi S, kaip miei hordeinas C, genuose turjo vykti ne tik kartotini sek pagausjimas, bet ir A, B, C domenus koduojanios geno dalies delecija. J molekulje yra beveik vien tik kartotins sekos (4.1 pav., A). Susidomta ir dar viena grupe baltym, kurie turi vadinamj poliprolino II kartotin sek, todl susidaro neprasta kairiojo sukinio spiral. Baltymai gana paplit. Jie bdingi ir mogui: rodopsino Tyr ProProGlnGly(YPPQG); sineksino TyrProProProProGly(YPPPPG); palyginimui kviei gliadino TyrProProProGlnPro(YPPPQP). i seka bdinga kolagenams, labai elastingiems skersaruoi raumen baltymams titinams, elastinui, kuris aptinkamas, kai sergama kai kuriomis ligomis (ateromatoze, arterioskleroze, keletu odos lig). Per poliprolino II sekas vyksta sveika baltymasbaltymas, todl susidaro didels mass elastingi polimerai amiloidai. Tokie yra ir kviei HML gluteninai. (VHLPPP)8 seka prolamin N-gale reikalinga iems baltyms sijungti endoplazmin tinkl (r. toliau, 4.2.3). Dl kartotini sek prolinai tapo netirpiais vandenyje ir drusk tirpaluose. Tai galjo bti ir naudingas gijimas apsauga nuo iplovimo skalbiant lietui. Grdui ie baltymai teikia kietumo. Panaias savybes baltymui suteikia ir kit aminorgi kartotins sekos: poliGln(Q), poliLys(K) ir pan., tad kartotinse sekose Gln visikai dera prie Pro. Pvz., kviei HMW glutenino 817 aminorgi subvienetas turi 35,7 % glutamino, 20,1 % glicino ir tik 13,1 % prolino (bet i viso ioms trims aminorgtims tenka apie 70 % viso polipeptido). Tokios kartotins sekos galjo bti i pradi paveldtos i kokio nors geno-pirmtako, bet galjo bti ir pakartotinas evoliucijos atradimas evoliucijos logikos pasireikimas. Tai galjo atsitikti, kai naudingi tapo baltymai, turintys trumpas kartotines sekas. Atsarginiai globulinai kupin supereimos ataka. ertvn ir samann sporose irgi kaupiami atsarginiai baltymai. inoma, kiekiu gerokai atsilieka nuo magnolijn. Pvz., paupinio papario (Matteuccia struthiopteris L.) sporose aptikti atsarginiai baltymai mateucinai. Jie panas Brassica napus L. globulinus. Panas atsarginiai baltymai aptikti ir kit ertvn Onoclea sensibilis L., Osmunda cinamomea L. sporose, nors bendri ertvnams ir magnolijnams protviai gyveno prie daugiau kaip 300 milijonus met. Dar labiau globulin kilms laikas nusikl atgal po to, kai buvo itirta kupin supereimos baltym evoliucija. i baltym giminyst nustatoma pagal j erdvin polipeptido sandar kupino (lot. cupa maa statinait) domen (4.2 pav.). Tai daugiaveiksniai, vairios paskirties baltymai. Savo sudtyje turi vien, du ar kelis kupino domenus ir pagal j skaii skirstomi monokupinus, bikupinus ir multikupinus. is skirstymas svarbus kupino gen evoliucijai, nes pradinis genas-protvis kodavo tik vien kupino domen, o atsarginiai globulinai yra bikupinai (4.3 pav.).
206 |
Kupinai aptinkami netgi bakterij lstelse. ia ir reikia iekoti genopirmtako ir prieasi atsirasti tokiems baltymams. Bakterijos irgi patiria vandens stok, desikacij. Ypa ji ryki, kai susidaro bacil sporos. Monokupinus sintetina Pseudomonas aeruginosa, kai pereina mukoidin bsen, o i atsiranda, kai bakterija badauja arba veikia metabolizmo inhibitoriai antibiotikai. Esant tokiai bsenai inhibitoriai negali patekti lstel ir j umuti. Kitos bakterijos Azotobacter vinelandii kupinai kaupiasi lstels apvalkallyje ir apsaugo lstel nuo idivimo ir kit stres. 4.2 pav. Dviej baltym/kupin erdvins san- Gleivn Physarum polycephalum sferudaros palyginimas: linai irgi sintetinami, kai yra nepalanA sojos (Glycine max) -konglicinas; B irnio kios slygos ir vyksta perjimas i (Pisum sativum) p54 baltymas. Abu turi po du (viesiai pavaizduotus) ,,puodelius (pagal J. Castillo et al. amebos bsenos plazmodio. VirJournal of Experimental Botany. 2005. Vol. 56, tim sporules sukelia badavimas, P. 31593169). atalimas, vandens praradimas, sunkieji metalai. Visa tai tik parykina prieastis, dl kuri atsirado i baltym funkcin grup. Manoma, kad sklini augal atsargini skl globulin pirmtaku yra bakterij batymasmonokupinas, susijs su desikacija, atsparumu sausrai. Turjo vykti duplikacija genepirmtake ir atsirasti bikupinai. Labiausiai tiesiogin atsargini globulin pirmtak kol kas pretenduoja ertvn sporose vicilin panaus baltymas. Jis jau bikupinas (4.3 pav.). Taiau punai ir magnolijnai isaugojo ir vien kupino domen turinius baltymus. Tai germinai. Ilg laik jie buvo kviei ir kit augal dygstani grd ymenys. I ia ir j pavadinimas (lot. germen gemalas). iuo metu sitikinta, kad kviei germinai yra oksalatreduktazs, apsaugo augalo lsteles nuo toksinio oksalato poveikio. toksin iskiria ir kai kurie augal patogenai, ypa vaisiapdis (Sclerotinia sclerotiorum). Oksalat darinys -oksalil-1- -diaminpropano rgtis yra stiprus neurotoksinas. Daug jo turi sjamasis pelirnis (Lathyrus sativus L.). Dar daugiau augaluose aptinkama germinus panai baltym. Jie i ties yra daugiaveiksniai. Pasireikia vairiais augalo raidos momentais (somatins ir zigotins embriogenezs, ydjimo indukcijos, vaisi brendimo, indukuojami abiotini ir biotini stres ir kt.). Skl globulinai vicilinai ir leguminai yra sudaryti i dviej kupino domen, todl yra duplikacijos rezultatas. Nesena kai kuri kviei gliadin ir LMW glutenin gen kilm. Alopoliploid panaudojimas tirti gen divergencij. i nauja genomo ir gen evoliucijos tyrimo strategija labai skmingai pirmiausia pritaikyta tirti kviei grdo atsarginius baltymus koduojani gen evoliucij. Paprastasis kvietys (Triticum aestivum) yra puikus genetinis
| 207
AUGAL GENETIKA
4.3 pav. Spjama atsargini globulin evoliucijos schema:
VPB vicilinus panas baltymai; GP germinus panas baltymai; (pagal A. D. Shutov et al. Journal of Experimental Botany. 2003, Vol. 54, P. 16451654).
Poliploidizacija kaip evoliucijos procesas sukuria daugiau kaip vien genom vienai lstelei. Daug augal ri yra poliploidins, atsirad dl autopoliploidijos, o dar daniau dl alopoliploidijos (tolimosios hibridizacijos). Greita genomo evoliucija poliploiduose yra viena i bding poliploidams savybi, taikoma tirti ne tik genomo, bet ir gen evoliucij.
208 |
objektas pritaikyti nauj gen evoliucijos tyrimo metod, nes T. aestivum yra aloheksaploidas (4.4 pav.). Jis turi tris genomus AA, BB, DD. Svarbiausia, kad inomos ir egzistuoja iuo metu visos trys augal rys A B D genom donors, todl nesunku palyginti, kokius genus turi pirmaprads rys ir kokius genus turi i j kilusi T. aestivum.
Diploidinis pirmtakas
AA genomo pirmtakas
Divergencija 2,5-6 mln.m. AuAu genomo donoras T. urartu
BB genomo donoras i Aegilops DD genomo donoras Kryminimasis Ae. tauschii (prie 0,5-3 mln.m.)
AmAm T. monococcum ssp. boeoticum
AABB T. turgidum ssp. dicoccoides Domestikacija, prie 10-12 tkst. m.
Tetraploidas AmAm T. monococcum ssp. monococcum AABB donoras T. turgidum ssp. dicoccum Kryminimasis (prie 7000-9500 m.)
AABBDD T. aestivum ssp.spelta Heksaploidas AABB T. turgidum ssp. durum Kietasis kvietys AABBDD T. aestivum Paprastasis kvietys
4.4 pav. Kviei ri kilms schema: Fone rys, kuri atliekama genom sekoskaita. Laukins rys pavaizduotos elipse, o domestikuotos rombu. Rys, dl kuri yra diskutuojama punktyru (pagal N. Chantret et al. Plant Cell. 2005, Vol. 17, P. 10331045).
AUGAL GENETIKA
| 209
iuolaikin T. aestivum ris yra trigubas alopoliploidas, kils per du nepriklausomus tolimosios hibridizacijos vykius (4.4 pav.): A genomo donorai yra du: AU i T. urartu ir jam artimas Am i T. monococcum; tetraploidins kviei rys atsirado tada, kai mintos rys susikrymino su artima kentriui (Aegilops speltoides) rimi, kuri buvo B genomo donoras po sukryminimo atsirado jau kultivuojamas alotetraploidinis dvigrdis kvietys (T. turgidum, ssp. dicoccum, AABB), vienas i variant kietasis kvietys (T. durum); heksaploidin T. aestivum ris atsirado po antrojo hibridizacijos vykio, kai T. turgidum (AABB) susikrymino su D genomo donoru artimo kvieiams augalo kentrio kita rimi Ae. tauschii. ioje T. aestivum istorijoje yra ir dar vienas gen evoliucijai tirti svarbus faktas. Jeigu pirmasis alopoliploidijos vykis, manoma, atsitiko prie 0,53 milijonus met (evoliucins genetikos mastais tai nesenas vykis), tai antrasis alopoliploidijos vykis atsitiko visikai neseniai, prie 70009500 met. Be to, mogus jau buvo pradjs domestikuoti kvieius (tai turjo prasidti prie 1012 tkst. met). Kai kurie T. aestivum prolamin genai yra atsirad visai neseniai. Tai padeda nustatyti pagrindini gliadin ir LMW glutenin lokus tyrimai T. aestivum pirmtakuose. Nustatyta, kad iuos lokusus jau turjo visi trys T. aestivum pirmtakai (T. urartu, Ae. speltoides, Ae. tauschii). Vadinasi, visi genai, kuri neturi pirmtakai, o turi T. aestivum, yra atsirad jau po to, kai susiformavo heksaploidinis jungtinis T. aestivum (A, B, D) genomas. Klasterins analizs metodu / gliadinai skirstomi 5 (A, B, C, D, E), o LMW gluteninai 4 (A, B, C, D) grupes. Tai padeda nustatyti dviej tip gliadin genus. Vieni j yra santykinai konservatyvs, nes aptinkami visuose trijuose T. aestivum genomuose. Kiti genai yra tik viename kuriame nors jo genome. Vadinasi, jie atsirado tik tada, kai jau buvo susiformavs jungtinis T. aestivum genomas. LMW glutenin genai pasiskirsto sudtingiau: A grups genai aptikti A ir D genomuose. Taiau C grups genai aptikti tik A genome, o D grups genai tik D genome. Vadinasi, yra nesenos kilms gen, koduojani gliadinus ar LMW gluteninus. Nauji prolaminus ir kitus atsarginius baltymus koduojantys genai gali atsirasti ir iuolaikinse augal veislse. Tai lemia ypatinga lokus ir gen sandara (duplikacijos, kartotins sekos). Taip paaikinami ir dideli skirtumai tarp augal veisli pagal atsarginius baltymus. Duplikuoti genai ir kartotins sekos ,,karti rekombinacijos (krosingoverio) ir mutacij takai. Kaip ne kart minta, atsarginius baltymus koduoja multigenins duplikuot gen eimos. Be to, daniausiai skirtingi lokusai yra toje paioje chromosomoje. Pvz., 1-osios kviei chromosomos trumpajame petyje yra labai artimai sukib Gli-1/Gli-3 lokusai, kurie koduoja ir gliadinus, taip pat Glu-3 lokusas, kuris koduoja LMW gluteninus; ios chromosomos ilgajame petyje yra Glu-1 lokusas, koduojantis HMW gluteninus. Duplikuoti genai ir kartotins sekos, ypa prolamin genuose, sudaro papildomas slygas naujai atsirasti atsargini baltym vairovei, nes duplikuot gen ir kartotini gen sankaupos yra karti netolygaus krosingoverio takai, taip pat atsiranda slygos praslydimui pro dal genetins mediagos, kai vyksta DNR replikacija. Visa tai gali bti prieastis mutacij, kurios apibdinamos kaip indel (nuo insercija + delecija), nes vienoje i chromosom didesnis ar maesnis rajonas padvigubja, o antrojoje homologinje chromosomoje atsiranda ikrita. Pagaliau, atsarginius baltymus koduojani gen homologija, bdinga paralogams, skatina rekombinacij netgi tada, kai genai yra vienas nuo kito nuto210 |
l ar netgi yra skirtingose, nehomologinse chromosomose. Taip gali atsirasti hibridiniai genai. Viena toki hibridini prolamin gen grup aptikta senos kilms vengrikoje kviei veislje ,,Bankuti1201. Hibridinis baltymas turi -gliadino sekas 5'-gale ir LMW glutenino sekas 3'-gale (pagal I. J. Nagy et al., 2005):
S N Kartotins sekos C galas gliadinas S S S SS S S S LMW gluteninas S S S S SS S S S
S S S S SS S S S
Hibridiniai baltymai
Ar atsarginius baltymus koduojani gen mutacijos yra neutralios? Nors kultivuojam kviei ri T. durum ir T. aestivum istorija labai nesena, skl atsarginiams baltymams ir juos koduojantiems genams bdingas labai didelis polimorfizmas ir labai didelis iuos baltymus koduojani gen skaiius T. aestivum genomuose. Priklausomai nuo veisls,yra 100 150 gen, koduojani gliadinus ir gluteninus: / gliadinus 17 60 gen (bet beveik pus j yra pseudogenai, neaktyvs), gliadinus 15 18 gen, w gliadinus 22 29 genai, LMW gluteninus 30 40 gen., o HMW gluteninus > 6 genai. O kur dar i gen aleliai. Suprantama, kad toks didelis paralog skaiius atsirado dl duplikacij, bet kartu turjo vykti labai intensyvi i duplikuot gen divergencija. Kaip tokios sparios divergencijos prieastis nurodoma spjamas atsarginius baltymus koduojani gen mutacij neutralumas. Pagal neutralios genomo evoliucijos teorij, daug mutacij (pvz., danai treiojo nukleotido mutacija kodone) nepasireikia fenotipe, todl neveikiama atrankos, yra neutrali, nors ir plinta genome. Neutralios evoliucijos alininkai mano, kad augalui yra tas pat, koks atsarginis baltymas bus sintetinamas, svarbu, kad i baltym bt pakankamai. Vis tiek sklai dygstant ie baltymai bus suskaidomi, todl atsarginius baltymus koduojani gen mutacijos yra neutralios. Neveikiamos (nealinamos) atrankos jos dreifuoja, plinta ir taip kaupiasi genome, didindamos atsarginius baltymus koduojani gen divergencij/polimorfizm. Taiau tai ginytinas poiris. Svarbiausia, neatsivelgiama toki mutacij pleiotropin (daugybin) poveik sklos/grdo raidai. Atsargini baltym gen mutacij neutralumui yra bent keletas prietaraujani fakt.
AUGAL GENETIKA
| 211
Nustatytas tiesioginis ryys tarp atsarginius baltymus koduojani gen paplitimo ir ekologini veiksni (kaip aprpinimo vandeniu, ramybs periodo eigos ir trukms, vegetacijos trukms ir kt.). Pasireikia daugybinis atsarginius baltymus koduojani gen poveikis kitoms sklos ir augalo savybms, tuo geriausiai sitikinta pagal vairias lys gen mutacijas (Hiproly, floury2, opaque2 ir kt.). Pagrstai manoma, kad atsargini baltym aminorgi sudtis yra neatsitiktin. 4.2.3. Skl atsargini baltym kaupimo ir saugojimo bdai: svarba augalui ir gen ininerijai Kaip galjome sitikinti, atsarginiai baltymai yra statybiniai blokai greitam sklos dygimui. Tok pat vaidmen jie atlieka iedadulkse arba gumbuose, taiau saugojimo bdai turi garantuoti, kad nevykt pirmalaikis i baltym skaidymas. Susintetint baltym saugojimo bdai yra tarp intensyviausiai tiriam augal genetikos problem. To prieastis yra biotechnologijos, ypa susijusios su vaist gamyba, interesai. iuolaikin gen ininerija naudoja augalus kaip bioreaktorius pagaminti didel kiek baltym. sitikinta, kad panaiu bdu kaip atsarginius baltymus verta deponuoti ir rekombinantinius baltymus. Baltymo kaupimas sklose svarba gen ininerijai. Rekombinantini baltym sintez ir saugojimas sklose yra paranks dl keli prieasi. Pirma, atsarginius baltymus koduoja multigenins duplikuot gen eimos, todl transgenui negresia nutildymo pavojus, kaip tai atsitiko, kai petunijos genom buvo perkelti papildomi chalkonsintazs genai. Tiktasi, kad dl papildom (trans)gen bus sintetinama daugiau antocianin ir petunijos iedai taps juodi. Deja, teko nusivilti. Atvirkiai, dl transgeno (kitaip egzogeno) buvo nuslopinta ir jam homologini gen (pavadint endogenais) raika. iedai pasidar arba visikai balti, arba j spalva tapo blykesn, nei ta, kuri bdinga netransgeniniam augalui. Taip 1990 m. buvo atrastas reikinys, pavadintas gen transkripcijos nutildymu (angl. transcriptional gene silencing), arba kosupresija. Mat, egzogenas ne tik pats nepasireikia, bet dar nutildomi ir jam homologiniai endogenai. Tai tiesiogiai priklauso nuo gen dozs kontroliavimo. Kosupresija grsia tiems genams, kuri doz genome yra grietai kontroliuojama: paprastai vienas genas vienam haploidiniam chromosom rinkiniui. Multigeninse sistemose transgeno vedimas nutildymo nesukelia. Dl ios prieasties labai nesunkiai pavyko padidinti atsargini baltym kiek, kai genom buvo terpti papildomi (trans)genai, endogenini gen, kurie koduoja atsarginius baltymus, homologai. Kai bet kuris transgenas sukonstruojamas taip, kad pritampa prie atsargini baltym multigenins eimos, ivengiama io transgeno nutildymo. Antra, augalai turi sukr puiki atsargini baltym kaupimo ir saugojimo strategij ir sistem. Ji prasideda nuo naujai susintetinto baltymo sitvirtinimo endoplazminiame tinkle ir baigiasi baltym kneli susidarymu arba pernaa specialias baltym saugojimo vakuoles. Be to, atsarginiai baltymai, o kartu ir j grup specialiai terptas rekombinantinis baltymas, yra puikiai apsaugoti nuo pirmalaikio suskaidymo proteazmis. Tai
212 |
danai atsitinka, kai rekombinantinis baltymas lieka citozolyje. J suskaido proteosomos arba speciali lizs vakuoli proteazs. Kol skla nedygsta, tol atsarginiai baltymai neskaidomi. Procesas labai nesudtingai valdomas: tereikia, kad skla ar grdas neibrinkt. Treia, yra dar vienas, i pairos paprastas, bet technologams svarbus rekombinantini baltym kaupimo augal sklose privalumas. Rekombinantiniai baltymai sukaupiami palyginti maame tryje, o baltym kneliai yra netirps vandenyje ir lengvai nusodinami centrifugavimo bdu. Atsargini baltym sintez. Baltym sintezs kelias yra bendras visiems organizmams. Baltym koduoja genas arba gen grup. Nuo geno kaip matricos susintetinta mRNR turi subrsti, todl vadinama pre-mRNR. Ji vairiais bdais modifikuojama: prijungiama kepur invertuotas G ir uodega poliA, ikerpami (be to, vairiu bdu) intronai, mRNR redaguojama (terpiami ar ikerpami pavieniai nukleotidai arba j grups), modifikuojami patys nukleotidai. Tik tokia mRNR gabenama i branduolio ribosomas. Ten vyksta polipeptido sintez (transliacija). Eukariot ribosomos jungiasi didelius kompleksus polisomas. Ne visos ios pre-mRNR modifikacijos bdingos atsargini baltym premRNR. Silpniausiai modifikuojama prolamin pre-mRNR. J genai neturi intronus koduojani nukleotid sek. Skirtinga sklos/grdo sandara lemia ir du skirtingus atsargini baltym saugojimo bdus: vienaskili daugiausia endosperme, o dviskili daugiausia gemalo sklaskiltse. Reguliuojama ne tik sintezs vieta, bet ir laikas. Be to, vairi atsargini sklos mediag sintezs ir gen raikos laikas nesutampa (4.5 pav.). Daugelio tirt augal intensyvi baltym sintez prasideda, kai skla pasiekia brandos vidur. Dviskili atsarginiai baltymai masikai sintetinami tik tada, kai lstels visikai nustoja dalintis. Nors sklos parametrai labai didja, bet augimas yra tstamojo pobdio. Skirtingos atsargi4.5 pav. Atsargini mediag sintezs ssaja ni baltym grups sintetinamos ne su vairenio sklos raida: vienu laiku ir skirtingose grdtojo PPA paros po apvaisinimo, m alioji mas (r. taip pat 3 sk.; pagal J. Vicente-Carbajosa, P. Carbo- endoplazminio tinklo (ET) vietose. nero. International Journal of Development Biolo- Pvz., pup (Vicia faba) i pradi sintegy. 2005, Vol. 49, P. 645651). tinami 7S vicilinai, o tik paskui 11S leguminai. Verta sidmti, kad 7S vicilinai yra labiau subalansuotos aminorgi sudties, todl nesunok sklos yra geresns maisto kokybs. Tas galioja ir aliesiems irneliams.
AUGAL GENETIKA
| 213
Dauguma baltym sintetinami citoplazmoje. Tik labai nedidel dalis baltym sintetinama mitochondrijose arba augal plastidse. Sintezs vieta neatsitiktin. Tvark lstelje padeda palaikyti ET. Dalis polisom prisitvirtina prie ET, kuris dl ios prieasties skiriasi ivaizda ir vadinamas grdtuoju ET. Vis labiau sitikinama, kad vairs baltymai (prolaminai, globulinai, paskiros i baltym grups, pvz., leguminai ar vicilinai) sintetinami skirtingose grdtojo ET vietose. Be to, sintez vyksta vadinamosios kotransliacins pernaos bdu. Dar nebaigtas sintetinti baltymas jau nukreipiamas ET vid. Suprantama, kad tai vykdo specials baltymai, tarp j BiP (nuo immunoglobulin Binding Protein). Tai iluminio oko aperon Hsp70 eimos baltymas, pirm kart aptiktas induoli lstelse, kurios sekretuoja imunoglobulin G. BiP baltymo paskirtis keleriopa. Viena i j sulaikyti susintetint baltym ET. BiP baltymo sintez labai padidja, kai augalas yra veikiamas stres sukelianio veiksnio. is reikinys pavadintas nesulankstyto baltymo atsaku (angl. unfolded protein response UPR). Vadinasi, BiP baltymas svarbus ir atsargini baltym lankstymui. BiP baltymas veikia ne vienas, o kartu su keletu kit baltym.
Paprastai baltymai, kuri bstin yra ET, C-gale turi aminorgi sek KDEL (Lys AspGluLeu) arba HDEL (His...). Jas atpasta ir receptoriai, esantys Goldio komplekse. Pagal ias sekas danai i karto sprendiama, kad baltymas sitvirtina ET. Prolaminai i sek neturi, todl sudaro dideles sankaupas ET viduje. Baltymo brendimas yra ne maiau sudtingas kaip ir mRNR brendimas. Po transliacijos polipeptidai patiria vairias modifikacijas. Susidaro disulfidins jungtys tarp dviej Cys liekan (jos bdingos S-turintiems atsarginiams baltymams). Dalis baltym yra Nglikozilinami (prijungiamas cukrus), vyksta ribota proteoliz (ikerpamos atskiros aminorgtys ar j sekos). Tai panau mRNR splaising (gali bti ikerpamos netgi specialios sekos inteinai, tai labai panau intronus). Baltymas lankstomas ir gyja jam bding erdvin sandar. Danai vienas polipeptidas dar nra funkcinis baltymas. Jis jungiasi su kitais baltymais. Susidaro funkciniai baltym kompleksai. ie procesai tokie sudtingi ir svarbs, kad isirutuliojo juos tirianti atskira mokslo aka proteomika. Kol baltymas tinkamai nesulankstytas ar nesusidaro reikiamo dydio oligomerai, jis neperneamas kitas struktras baltymo saugojimo kelyje (4.6 pav.; r taip pat 4.10 pav.).
4.6 pav. Baltym pernaa i endoplazminio tinklo (ET) lizs (LV) arba baltym saugojimo vakuoles (BSV):
dalyvauja vairi tip pernaos pslels (vezikuls): PP padengtos klatrinu; TP tankios (kondensuotos); PAC (nuo Precursor-ACcumulating); PVK provakuols (r. taip pat tekst; pagal N. A. Jollife et al. Biochemical Society Transactions. 2005, Vol. 33, P. 10161018).).
214 |
Nesubrendusiuose atsarginiuose baltymuose (prepropolipeptiduose) signalo sek yra ne viena. Ne tik jau mintos KDEL ar HDEL. Signalo sekos reikalingos ir tolesniam baltymo brendimui, pernaai Goldio kompleks ir psleles (vezikules), o vliau vakuoles. Priklauso nuo baltym grups ir j saugojimo bdo. Pvz., kukurz prolaminai KDEL arba HDEL sek neturi, bet -zeino ir kai kuri kit prolamin N-gale yra jau minta PolyPro (PPPVHL)8 seka. Ja ne tik sitvirtinama ET viduje. Ji skatina susidaryti stambius baltym agregatus. Vliau jie isirutulioja baltym knelius (BK). Ribota atsargini baltym proteoliz. Dauguma atsargini baltym sintetinami kaip prepropolipeptidai. N-dalyje jie turi signalin polipeptid (r. 4.1 pav. ir 4.7 pav.). Jame yra sekos, reikalingos nukreipti naujai susintetintus baltymus i iorins (citoplazmos) puss ET vid, taip pat sitvirtinti ET. Mutantinis kukurz floury2 fenotipas pasireikia kaip tik todl, kad nepaalinamas is signalinis polipeptidas, todl sutrinka visi tolesni vykiai: sumaja -zeino ir atsiranda BK defektai.
o po to vakuoles
Promotorius netranskribuojamoji reguliacin geno dalis; A, B legumino subvienetai; S signalinis polipeptidas, reikalingas sitvirtinti ET, po to paalinamas; BSV baltym saugojimo vakuol; BK baltym knelis BSV viduje; ET endoplazminis tinklas.
AUGAL GENETIKA
4.7 pav. 11S legumino (globulino) sintezs, brendimo, pernaos i ET BSV (baltym saugojimo vakuol) schema:
| 215
Liks propolipeptidas patiria ribot, bet labai svarbi baltymo brendimui proteoliz. Pvz., 11S legumin (4.7 pav.) tada, kai paalinamas signalinis polipeptidas (arba abu ie vykiai vyksta vienu metu), proleguminas yra lankstomas, susidaro disulfidins jungtys ir proleguminas yra speciali proteazi kerpamas du subvienetus. Jie sujungti vienas su kitu disulfidinmis jungtimis.
Aprayta prepropolipetido brendimo eiga ir tolesnis propolipetido brendimas priklauso nuo to, kuriai baltym grupei priklauso baltymas. Pvz., i 11S legumin toliau susidaro homotrimerai (4.7 pav.). Tik jie perneami toliau baltym saugojimo vakuoles, bet ir ten baltymas toliau brsta. Susidaro heksamerai. Jiems gana artimi vairenio 2S albuminai yra heterodimerai, sudaryti i dviej subvienet, nors jie kil i vieno bendro propolipeptido, koduojamo vieno bendro geno. Panaiai ir ryi glutelinai sintetinami i pradi kaip ~ 59 kDa pirmtakai. Paalinus signalin polipeptid, ~ 57 kDa proglutelinas toliau skaidomas du skirtingus 37-39 kDa ir 22-23 kDa subvienetus, o ie jungiasi stambius oligomerus.
Proproteino proteoliz yra grietai kontroliuojama. Polipeptide yra vietos, kurias atpasta bdingos proteazs. Pvz., irni 7S vicilinas turi dvi tokias vietas. Proteoliz gali vykti vienoje kurioje vietoje (1-ojoje arba 2-ojoje) arba abiejose i karto. 12,5 kDa subvienetas yra glikozilinamas. Susidaro vairaus dydio polipeptid populiacija:
1 2 47-50 kDa 2 33 kDa 1 19 kDa 1 18 kDa 13,5 kDa 2 12,5 kDa 31 kDa 12,5 kDa
Tokios populiacijos prasm kol kas neaiki. Kai tampa nereikalingos, gali bti paalinamos ir kai kurios kitos signalo sekos. Ribotos proteolizs valdymo detals dar turi bti iaikintos. Vairenio genome nustatyti 6 proteazi genai, kurie yra aktyvs tik tuo metu ir tose lstelse, kuriose vyksta sklos atsargini baltym sintez ir brendimas. Atsargini baltym kokybs kontrol ir kaip jos ivengti rekombinantiniams baltymams. Kukurz mutantas floury2 tikina, kaip svarbu atsarginiam baltymui tiksliai pereiti visus brendimo etapus. Nepaalintas signalinis peptidas turi lemting pasekmi visai grdo raidai. Atsargini baltym (kaip ir kit baltym) brendimo klaidos yra dvejopos kilms paveldimi nukrypimai dl mutacij genome kaip floury2; tikros brendimo klaidos, padarytos vairiuose baltymo brendimo etapuose.
216 |
Viena klaid prieastis gali bti todl, kad polipeptidai turi ne vien, o dvi ir daugiau Cys liekan. Dl ios prieasties Cys liekana gali praslysti ir neteisingai susidaryti disulfidins jungtys. Neivengiamos oligomerizacijos klaidos. Visas klaidas bando itaisyti aperonai, kaip ir kit neteisingai sulankstyt ir subrendusi baltym, taiau ne visada tai pavyksta padaryti. Tada: arba baltymas suskaidomas proteosom ferment dar ET arba citozolyje, pasireikia vadinamoji kokybs kontrol; arba baltymas apskritai alinamas i lstels, atsiduria u lstels rib, apoplaste. Tai bt dana situacija rekombinantiniams baltymams, jeigu j genus nebt statomos nukleotid sekos, kurios koduoja reikiamas signalo sekas rekombinantiniame baltyme. Kai prie transgen prijungiamos nukleotid sekos, kurios koduoja KDEL arba HDEL, rekombinantini baltym padidja net dviem-trim eilmis. Svarbiausia, kad manipuliuojant signalo sekomis, galima pakeisti baltymo saugojimo viet. Netgi kukurz prolaminai gali bti gabenami lapo lsteli baltym saugojimo vakuoles (BSV). Rekombinantiniai ir -zeinai saugomi tabako lap lsteli BSV. Taip pat sukonstruotas hibridinis baltymas zeolinas, kuris irgi saugomas tabako lap lstelse, bet BK. Sulieti -zeino (prolamino) ir fazeolino (globulino) genai. Zeolinas turi N- ir C-galuose esanias signalo sekas, tarp j N-gale PolyPro (PPPVHL) sek, todl is rekombinantinis genas kaupiasi vegetatyvinse tabako lap lstelse kaip BK (4.8 pav.). ie BK gali bti naudojami kaupti ir kitus rekombinantinius baltymus, taip pat tirti pat baltym saugojimo BK mechanizm. Pvz., visikai pertvarkyta mogaus kraujo serumo al4.8 pav. Rekombinantinis baltymas zeolibumino kaupimo vieta tabako lapo lstenas tabako lapo lstelje. Neprasta baltym lse. Kai buvo prijungtos KDEL ir kai k nelio (BK) vieta: kurios kitos signalo sekos, is mogaus BK vienaskiliams bdinga savyb. Buvo sulieti vien albuminas ne tik sitvirtino ET viduje, bet du atsarginius baltymus koduojantys genai: kukurz zeino ir pupeli fazeolino, siekiant rodyti, kad BK susidair buvo perneamas prolamino agregaro lapo lstelje, alia yra chloroplastas (pagal A. Vitale, A. tus. Pakeista ir gryb fitazs kaupimo Ceriotti. Plant Physiology. 2004, Vol. 136, P. 34203426). vieta. is baltymas vietoje apoplasto pateko baltym knelius.
Panaiai buvo pertvarkytas rekombinantinis mogaus baltymas 7Crp, kuris turi 7 sukibusius pagrindinius T lsteli epitop peptidus, gaunamus kaip induktorius naudojant Cry j. 1 ir Cry j. 2 alergenus. Ryi endosperme is rekombinantinis baltymas sudaro 4 % vis baltym. Toks didelis baltymo kaupimas pasiektas gana sudtingo 7Crp geno konstravimo bdu: signalin peptid koduojanios nukleotid sekos sulietos su KDEL koduojaniomis sekomis; sitvirtinimo ET signalai iame rekombinantiniame baltyme yra N- ir C-galuose; prijungtas atsarginio baltymo glutenino geno GluB-1 promotorius. Rekombinantinis baltymas naudojamas kaip vaistas slopinti alergin reakcij.
AUGAL GENETIKA
| 217
Tirti atsargini baltym saugojimo mechanizm naudojamasi ir atvirkiu vietos pakeitimu: rekombinantiniai leguminai kaupiami ne BSV, kaip tai prasta, o BK, taiau sitikinta, kad leguminai sudaro atskirus nuo prolamin BK. Baltym kneliai (BK) ir baltym saugojimo vakuols (BSV) yra patraukli vieta saugoti rekombinantinius baltymus: gaunama didel baltymo koncentracija; baltymas apsaugomas nuo proteazi/kokybs kontrols sistemos ir pernaos apoplast; pats rekombinantinis baltymas ilieka skloje tiek, kiek saugoma pati skla. Jau mintas 7Crp baltymas gali bti saugomas ryi grduose metus laiko. Geresn rekombinatinio baltymo saugykl nei t, kuri sukr gamta, sunku irasti. Baltym kneliai (BK). Prie madaug 40 met buvo pastebta, kad kukurz skl atsarginiai baltymai kaupiami ir saugomi specialiose endospermo struktrose baltym kneliuose. Jie vairaus diametro (0,520 m). Kur laik BK buvo vienas i skiriamj poymi tarp atsargini prolamin ir globulin. Manyta, kad prolaminai kaupiami tik BK, o globulinai - BSV. Tiesa tik tai, kad atsarginiai globulinai ir albuRyi I ir II tip baltym kneminai gabenami BSV. Prolamin saugo- 4.9 pav. li (BK) palyginimas (pagal Y. Takemoto et al. jimo bdas priklauso nuo augalo. KukuRice Genetics Newsletter. 1996. Vol. 13, rz, ryi, sorgo prolaminai tikrai sauP. 106 109). gomi BK. J BK susidaro ET viduje. Dauguma BK atsiskiria nuo ET, bet lieka apsupti ET membranos (4.6 pav.). Ryi BK yra dviej tip: vieni j yra kil i ET. Juose saugomi prolaminai. Jie yra sferins formos ir priskiriami I BK tipui. Kiti BK susidaro vakuolse. Tai II tipo BK. Jie amorfiki, netaisyklingos formos.
II tipo BK saugomi ne tik ryi glutelinai, bet ir kviei, miei, avi prolaminai. Pro-II-BK atsipumpuruoja nuo ET ir gabenami tankiose pslelse BSV. Ten j kaupiasi dideli kiekiai. BK susilieja, ir baltym saugojimo vakuols virsta viena ar keliomis centrinmis vakuolmis. Tai II tipo BK.Kai kuri augal juose kartu yra saugomi prolaminai ir globulinai. Bet vl pastebti skirtumai tarp augal. Avi prolaminai yra kaip intarpas globulin pripildytoje vakuolje, o kviei, atvirkiai, nedidels globulino triticino sankaupos sitais alia masyvios II BK prolamin dalies. Prolaminai BK irgi isidsto tam tikra tvarka: kukurz ir zeinai yra vidinje , o ir zeinai BK iorinje BK dalyje. vairov pasireikia netgi toje paioje ryje. Unikali iuo atvilgiu yra miei veisl ,,Nevskyj. Jos grduose nra 3 hordeino, vienintelio monomerinio prolamino. Be to, ios veisls grduose kiti ( ir ) hordeinai lieka ET, neperneami vakuoles. Jie, matyt, neturi signalo sek atsiskirti nuo ET. Taip baltymo savybs nulemia ir jo saugojimo bd.
BK, matyt, yra pakartotinas Poaceae eimos augal atradimas. Jis bdingas baltymams, kurie sudaro agregatus, o ie susidaro tose struktrose, kurios turi PolyPro ar panaias aminorgi kartotines sekas. Pvz., cianobakterijos Anabaena cylindrica sporose yra
218 |
ciano-ficino granuls. Tai atsarginiai baltymai, sudaryti tik i dviej aminorgi asparto rgties ir arginino. J subvieneto molekulin mas yra 25100 kDa. Kai susidaro agregatas/BK, didel baltymo kiek galima sukaupti maame tryje. Kodl baltym agregatus, tarp j prionus, sunkiai arba visai neveikia proteazs klausimas kol kas neiaikintas.
4.1 intarpas. Fitinai nauda augalui, ala mogui Nors fitinai yra labai paplit, btinos augalui mediagos, fitorgtis atrasta tik XIX a. pabaigoje. Vliau nustatyta viena ios mediagos ypatyb.Ji turi daug fosfato liekan. Tai myo-inozitol(1,2,3,4,5,6)heksakisfosfatas (yOP mimas InsP6). Yra jungini, kurie fosfato liekan 4 3 turi dar daugiau InsP7, InsP8. iuose junginiuoO P se yra sukaupta 7590 % ar net daugiau viso skPO los fosfato. Fosforo junginiai yra pastoviai reikaOP 5 2 OP lingi augal lstelms: nukleorgi sintezei, energijos apykaitai (ATP). Kita vertus, fitinai sklose kaupia ir vairius katijonus, yra labai stip1 6 rs chelatoriai. Daugiausia prisijung Mg2+, K+, OP Ca2+, maiau Mn2+, Ba2+, Fe2+, Zn2+. Sklose saugoma i drusk miinys, taiau saugojimo vieta nra atsitiktin. Fitinai kartu su prisijungusiais katijonais saugomi keliose vietose: endoplazminiame tinkle, baltym saugojimo vakuolse ir baltym kneliuose kartu su atsarginiais baltymais, taip pat vakuolse, kurios yra chalaziniame endosperme. Gali bti isidst difuzikai arba sutelkti vadinamuosius globoidus. Vairenio BSV esaniuose globoiduose yra sutelkti fitinai, prisijung Mg2+, K+, Ca2+. Chalaziniame endosperme (dviskiliam augalui laikiname darinyje) katijonai kaupiami dviejose skirtingose vietose: ET Mn2+, o centrinje vakuolje Zn2+. Kai endospermas degraduoja, isilaisvin Mn2+ ir Zn2+ panaudojami gemalo raidai, bet tai vyksta skirtingu laiku: Zn2+_ globuls stadijoje, o Mn2+ vlyvose gemalo raidos stadijose, kai jau aikios sklaskilts. InsP6 reikm augalams labai vairi, ne tik skl dygimui. Jie reikalingi dvigrandi DNR trki reparacijai, RNR pernaai, ATP metabolizmui, lapo ioteli varstymui, kur reguliuoja abscizo rgtis. Tad InsP6 kaupiamas ne tik sklose, bet ir iedadulkse, aknyse, gumbuose. Kai skla dygsta, fitinai suskaidomi speciali ferment fitazi myo-inozitol, mineralines mediagas.Be to,fitinai yra fitotoksiki.Tai padeda augalui apsisaugoti nuo patogen. mogui InsP6 nenaudingas. Netgi, atvirkiai, kaip stiprus chelatorius gali sukelti metal jon stok. Svarbi fitin ypatyb mogui- jie veikia kaip antikancerogenai. Gen ininerijos metodais stengiamasi fitin kiek sumainti. Panaudojami itin aktyvs fitazs genai i gryb. Kita vertus, gauti mutantai, kurie sintetina maiau fitin. Toks yra kukurz mutantas low phytic acid 1-1. Jis naudojamas tirti fitin reikm augaluose, ir konkreiai sklose.
Baltym saugojimo vakuols (BSV) yra pagrindin atsargini baltym saugojimo vieta. Jose saugomi dviskili augal atsarginiai baltymai, vienaskili globulinai ir albuminai, o taip pat dalis prolamin. BSV saugomi ir kai kurie kiti sklai svarbs baltymai: lektinai, -amilazi ir tripsino inhibitoriai, P34 baltymas, fitinai ir prie j prisijung metal jonai (4.1 intarpas). Kai kuri augal sklose lektinai sudaro per 10 % vis sklos baltym. J paskirtis apsaugin. Pup sklose yra apie 5 % lektino fitohemoaglutinino, kuris naudojamas tirti mogaus chromosomas, o kai kuriems jautriems monms gali sukelti maakraujyst. -amilazs inhibitoriai ne tik slopina sklos pirmalaik dygim, bet ir saugo skl nuo vabzdi, o tripsino inhibitoriai ir P34 baltymas, -amilazs inhibitoriai ir
AUGAL GENETIKA
| 219
nuo bakterij. Tokia pati paskirtis ir BSV saugom chitinazs, glukanazs. Tai taip pat apsaugos baltymai. BSV susidaro naujai ir yra unikali augalams bdinga lstels struktra. Jose atsargini baltym brendimas vyksta toliau. Ypa stambja agregatai. I vicilin trimer susidaro heksamerai. Susilieja vakuoles patek pro-II BK. Brendimo paskirtis ne tik sitvirtinti BSV, bet, svarbiausia, kuo kompaktikiau talpinti baltymus. Tai atlieka tam tikros paskirties endopeptidazs VPE (angl. Vacuolar Processing Enzyme). Kai susidaro II tipo BK, vakuols viduje suskaidoma kiekvieno BK atsigabenta j gaubianti ET membranos dalis. Labai svarbs yra vakuols membranos baltymai akvaporinai. ie baltymai yra ypatingos sandaros, eis kartus kerta membran ir sudaro kanalus, pro kuriuos patenka vanduo. Skl BSV turi tik jai bding akvaporin -TIP (angl. Tonoplast Intrinsic Protein). Vegetatyvini lsteli BSV yra kitas akvaporinas -TIP, todl jos vadinamos vakuolmis. Jose kaupiamos atsargos lstels raidai arba atsakui aplinkos pokyius. Bdinga tai, kad -TIP baltymas atsiranda tik sklos brendimo pabaigoje. Matyt, pasiruoiama greitai siurbti vanden, kai skla dygsta. Kita vertus, vlyvas -TIP atsiradimas yra dar vienas saugiklis nuo nesavalaikio sklos dygimo. Be to, desikacija ir rehidratacija yra reguliuojama -TIP akvaporino fosforilinimo. BSV atsiranda vairiu bdu. Vienas i j i provakuols, kuri atsiskiria tiesiogiai nuo ET arba Goldio komplekso vadinamosios trans dalies( r. 4.10 pav.). I pradi tai gali bti tik pslel, kuri virsta provakuole, o paskui BSV (r. 4.6 pav.).
KP KP
trans
TP
cis
4.10 pav. Globulin riavimo ir pernaos endplazminiu tinklu (ET) sistema nuo cis iki trans viet ir atsiskyrimo nuo ET:
KP kargo (krovinio pslel); TP tanki kondensuota pslel (vezikul), kuri atsiskyrusi gali virsti baltymo kneliu arba baltym saugojimo provakuole (pagal D. G. Robinson et al. Traffic. 2005, Vol. 6, P. 615625).
Baltym pernaa vakuoles ir BK ypatingo dmesio sulauks klausimas. Jo svarba gen ininerijai jau galjome sitikinti. Visi atsarginiai baltymai BSV gabenami kaip krovinys (kargas, isp. cargo) konteineryje. Tas konteineris yra pslel (vezikul). Ji atsiskiria nuo ET arba Goldio komplekso apsigaubusi ET membrana. Pakliuvusios vakuol pslels membrana suskaidoma. Augal vakuols yra vairios, todl turi bti mechanizmas, kuris nukreipia baltym BSV. Nustatyti bent trys pernaos BSV bdai (4.6 pav.).
Dauguma atsargini baltym (7S ir 11S globulinai, gynybiniai baltymai lektinai) perneami i ET netiesiogiai per Goldio kompleks, o paskui tankiomis pslelmis provakuol arba BSV.
220 |
Baltymai i ET pslelmis perneami tiesiogiai, be Goldio komplekso kaip tarpininko: taip perneami moligo (Cucurbita pepo) ir ricinmedio globulinai, i augal sklose is pernaos bdas pirm kart ir aptiktas; Tiesiai i ET pro vakuol arba BSV tankiomis vezikulmis gabenami ir BK. Patekimo vakuol bdai irgi yra vairs: pslel gali tiesiogiai peraugti provakuol, o paskui BSV; BK arba pslel susilieja su prevakuols arba BSV membrana; pslel arba BK patenka vakuol autofagijos bdu. Pslel tiesiog praryjama.
Nuo ET pslels atsiskiria pumpuravimo bdu. BSV vis gausja arba auga jos dydis, ir pagaliau BSV visikai istumia kitas (lizs) vakuoles. ios vairiu bdu suskaidomos, o lstel usipildo BSV. Baltym saugojimo, kaip ir riavimo bdai, yra labai svarbus klausimas. Btent iomis iniomis pasinaudojama transgeniniuose augaluose, kuri genom perkelti genai, koduojantys vairi mogui svarbi vaist sintez. Itin svarbs j saugojimo bdai, kaip apsaugoti svetim augalui baltym nuo suskaidymo lstels proteolitiniais fermentais. Atsargini baltym riavimas (angl. sorting). Kaip ir geleinkelyje, lstelje yra ,,krovini riavimo stotys, i kuri kroviniai nukreipiami vairiomis kryptimis: BSV, BK, apoplast ar citozol. Pagrindin tokia riavimo vieta yra Goldio kompleksas (4.6 pav. ir 4.10 pav), bet, kaip minta, ne visi kroviniai gabenami iuo transporto bdu ir per i ,,stot . Atsargini baltym riavimas, kur jiems keliauti, priklauso nuo daugelio veiksni. Pirmiausia nuo paties baltymo sandaros: sudaro ar nesudaro agregatus, nuo disulfidini jungi, atitinkam signalo sek, bding kiekvienam pernaos etapui. Kol kas daug atsargini baltym pernaos smulkmen yra neiaikintos. Nustatyti riavimui skirti baltymai VSR (angl. Vacuole Sorting-Receptor). Vienu toki baltym yra BP-80 (nuo Binding Protein 80). Jis nukreipia baltymus lizs vakuoles, kuriose ie turt bti suskaidomi. Iekoma bd, kaip rekombinantiniams baltymams ivengti BP-80 vykdomo nukreipimo lizs vakuoles.
Suprantama, kad skirtingu bdu perneami BSV atsarginiai baltymai turi skirtingus riavimo baltymus. Molig, kuri 12S globulinai ir 2S albuminai perneami tiesiogiai i ET, i pradi kaupiami PAC (Precursor-Accumulating Compartment) pslelse, paskui jos gabenamos vakuoles (r. 4.6 pav.). Pslels membranoje yra aptiktas baltymas PV72, kuris, manoma, yra io riavimo kelio receptorius. Kai pritaikoma antiprasmin PV72mRNR ir gaunama knock-out mutacija, pro-12S globulinai ir pro-2S albuminai atsiduria ne BSV, o apoplaste. Vairenio, kurio skl atsarginiai baltymai keliauja per Goldio kompleks, aptiktas kitas riavimo baltymas VSR1/ELP. Jo genome aptikti 7 VSR baltymus koduojantys genai, bet tik vieno j koduojamas baltymas yra skirtas atsargini baltym riavimui. Tad sveika tarp VSR ir atsargini baltym yra iems savita. VSR1/ELP yra PV72 baltymo homologas. Labai pana fenotipin poveik, kaip PV72 geno knock-out mutacija, sukelia dviej vairenio gen Maigo 1 ir 2 mutacijos. Atsarginiai baltymai irgi atsiduria u borto apoplaste. Mutanto maigo 1 (mag1) BSV yra smulkios, o patys vairenio augalai yra maagiai. MAG 1 koduoja baltym, kuris priklauso kitai baltym grupei VPS (angl. Vacuolar Protein Sorting). Jie yra sudtin baltym komplekso, vadinamo retromeru, dalis. Jis pakartotinai atkuria baltym pernaos sistem naujam pernaos ciklui. Mieli lstelse pagrindiniai retromero baltymai yra Vps 35, Vps 29, Vps 26. Maigo 1 baltymas yra homologas Vsp 29. Jis leidia pakartotinai panaudoti VSR1 baltym. Maigo 2 genas pasireikia, kai atsarginiai baltymai i ET perneami Goldio kompleks.
AUGAL GENETIKA
| 221
Atsargini baltym pernaos signalo sekos. Kiekvienam pernaos etapui yra savitos signalo sekos. Pvz., membraninio domeno seka PIEPPPHH suteikia baltymui pernaos krypt i ET vakuoles. Btent dl jos yra aplenkiamas Goldio kompleksas. Kaip ir visi 7S atsarginiai baltymai, fazeolinas yra homotrimeras (sudarytas i trij tapai subvienet). Trumpajame polipeptido C gale yra seka AFVY, btina vakuols atpainimui. Be ios sekos trimeras susidaro (r.4.7 pav.), bet nejungiamas nei vakuol, nei pslel, kuri igabena baltym i ET. Toks usiliks baltymas yra suskaidomas. Pasireikia baltymo kontrol, bdinga visiems neteisingai sulankstytiems ar net ne vietoje atsidrusiems baltymams. Riavimo baltymai atpasta riuojamuose baltymuose signalo sekas, kurios vadinamos ssVSD (angl. sequence specific Vacuolar Sorting Determinant) determinantais. Vien bendr konsensus visiems atsarginiams baltymams sunku surasti. Riavimo determinantai priklauso ne tik nuo baltym grups, bet ir nuo augalo. Jie gali bti bdingi netgi skirtingiems audiniams. Tai dar labiau apsunkina riavimo receptori ir j atpastam sek tyrimus. Pvz., vicilinai turi NPIR signalo sekas N gale, taiau fazeolin ji yra NPFYTNS, o konglicinin ji yra NPFYFRS. Bent irni 11S leguminai i sek neturi. Signalo sekos, kurios yra N arba C gale, tapusios nereikalingomis, paalinamos. Vl pasireikia ribota proteoliz, panaesn introno paalinim i pre-mRNR. SAVARANKIKAM DARBUI (r. odynl) Baltym sintez brendimas riavimas pernaa saugojimas Kajalo kneliai Kosupresija Kotransliacija Kviei HMW ir LMW Neutrali evoliucija Pslels (vezikuls) Saugojimo struktros panaudojimas GMO
222 |

1 4skyriai

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

1 4skyriai

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

EUROPOS SJUNGA Europos socialinis fondas

KURKIME ATEIT DRAUGE!

LEIDINYS PLATINAMAS NEMOKAMAI

V. Ranelis, 2008 Vilniaus universitetas, 2008

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

I DALIS 1. Augal poymi paveldjimo dsningumai

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1.1 pav. Monohibridinio kryminimo rezultatai 4-iose hibrid kartose:

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1.2. Objektas augal genetikoje

1.3 pav. Baltaiedis vairenis (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.):

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1.3. Genetiniai simboliai/augal gen pavadinimai

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1.4. Genai chromosomose. Paprasiausi augal poymi paveldjimo dsningumai

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1.5. Dihibridinis kryminimas dvi paveldjimo alternatyvos

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1.5 pav. Dihibridinis kryminimas. irni skl spalvos paveldjimas

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1.6. Nealelini gen sveikos pasireikimas hibrid kartose

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

4 3 1 ( wwM + wwmm) balta ied spalva 16 16 16

1.7. Alelini gen sveika

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

F2 hibridai susiskaido 2 fenotip grupes santykiu miu:

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1.6 pav. irni skl krakmolo grdeliai:

Taiau tai tik iorinis panaumas.

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

E1+E2 kompleksas nesusidaro

E2nul E1+ E1+E2 kompleksas nesusidaro

Aktyvus (dimerinis) baltymas

1.8. Aplinkos veiksniai ir alelini gen sveika. Geno penetrantikumas ir ekspresyvumas

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

72 bp 150 CCTAC Papildoma seka TG CACGTG G-seka

56 bp /\ 55 AT CCTACC Papildoma seka

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1.9 pav. Schema, vaizduojanti geno penetrantikum ir ekspresyvum:

100 %, 60 % penetrantikumas, ireiktas procentais.

1.9. Komplementacijos (trans) testas ir poymio genetika

poymis neisivysto; hibridas normalaus fenotipo, pasireikia komplementacija.

Komplementacija Normalus fenotipas

1.10 pav. vairi miei mutant tyrimai komplementacijos testu:

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

1. AUGAL POYMI PAVELDJIMO DSNINGUMAI

trans-padtis mutantinis poymis

cis-padtis (po krosingoverio normalus poymis)

Nealelins (skirting gen) Normalus Normalus

1.11 pav. Apibendrinti cis- trans-testo rezultatai:

Kompaundas (heterozigota a1, a2)

Transkripcija transliacija a1 a2 DNR (aleliniai genai) mRNR a1 a2 Polipeptidai (neveikls)

Kompaundas a3a4 mRNR (transkripcija) baltymas i 2-j domen