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Técnicas Microbiológicas Parte 1
Técnicas Microbiológicas Parte 1
e identificacin de microorganismos para los estudiantes de educacin media y superior del rea biolgica. Se presentan algunas tcnicas bsicas microbiolgicas el cual tiene como principal objetivo poner en prctica el mtodo cientfico para despertar el inters y seguir estimulando en algunos casos al estudiante por esta rama de la ciencia.
Como una aportacin a las estructuras didcticas de este libro, colocamos una serie de imgenes de lo que esperamos en el experimento y de lo que no esperamos para poderlos comparar.
GRUPO: _______________________________________________________
CARRERA: _____________________________________________________
ESCUELA: _____________________________________________________
NDICE
Pasos a seguir para trabajo diario de un laboratorio de microbiologa _________________________________ 4 Procedimiento para la realizacin de un medio de cultivo___________________________________________ 13 Realizacin de una preparacin en fresco y fija___________________________________________________ 19 Tcnicas de tincin _________________________________________________________________________ 22 Microscopia_______________________________________________________________________________ 27 Preparacin de material utilizado en microbiologa ________________________________________________ 35 Diluciones y diluyentes _____________________________________________________________________ 43 Aislamiento por estra cruzada y vaciado en placa________________________________________________ 47 Cultivo de microorganismos _________________________________________________________________ 52 Microcultivo_______________________________________________________________________________ 59 Conservacin de cepas _____________________________________________________________________ 67 Pruebas bioqumicas _______________________________________________________________________ 72 Toma de muestras _________________________________________________________________________ 88 Determinacin de OMA ____________________________________________________________________ 97
Aplicaciones de la temperatura (pasteurizacin de leche y control de calidad) __________________________ 109 Preparacin de reactivos __________________________________________________________________ Medidas de seguridad _____________________________________________________________________ 114 120
PASOS A SEGUIR PARA TRABAJO DIARIO DE UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA La calidad en nuestro trabajo en un laboratorio de Microbiologa depende de una secuencia de pasos a seguir estrictamente por todo el personal que labora el, para ello sugerimos seguir los siguientes pasos para tratar de uniformar criterios. PASOS A SEGUIR: 1.- Preparacin del rea de trabajo 2.- Preparacin de medios de cultivo 3.- Preparacin de reactivos 4.- Preparacin de material 5.- Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras para su anlisis microbiolgico 6.- Realizacin de la tcnica 7.- Incubacin de la muestra 8.- Recuento 9.- Realizacin de los clculos 10.- Presentacin del informe. El personal de nuevo ingreso al laboratorio de Microbiologa deber de leer el manual de aseguramiento de la calidad y pondr ms inters en su rea de trabajo. PREPARACIN DEL REA DE TRABAJO Las caractersticas del rea de trabajo son las siguientes: 1.- La mesa debe ser de acero inoxidable con instalaciones de agua, luz, drenaje y gas, cada una de estas instalaciones deber de tener los siguientes cdigos de colores segn la NOM-026-STPS, Colores y seales de seguridad e higiene e identificacin de riesgos por fluidos conducidos en tuberas. LUZ AGUA GAS ROJO VERDE AMARILLO IDENTIFICACIN DE TUBERAS CONTRA INCENDIO IDENTIFICACIN DE FLUIDOS DE BAJO RIESGO IDENTIFICACIN DE FLUIDOS PELIGROSOS
2.- El rea de trabajo cuenta con luz natural principalmente y/o luz artificial. 3.- Una campana de flujo laminar para la realizacin del sembrado con instalaciones de luz. 4.- Siempre al inicio y al final de nuestras actividades la mesa se limpiar con una solucin de benzal al 10 % para desinfectarla, para ello siempre se debe tener una esponja y un atomizador con benzal, adems se debe de tener un frasco de con benzal para cuando se necesite, este reactivo hay que prepararlo frecuentemente para evitar que se contamine. 5.- La mesa debe tener dos mecheros con manguera en buen estado y una balanza granataria de 600 g de capacidad para el pesado de las muestras. 6.- En el cajn de la mesa se debe tener papel aluminio, cucharas de plstico nuevas, esptulas, frasco con torundas de algodn, hisopos, cuchillos, tijeras, pinzas, tenedores, ligas, (algunos estriles y otros no porque se pueden esterilizar con alcohol cuando se requieran)
7.- Debe existir un frasco de 2 litros de capacidad con 1 litro de benzal para colocar las puntas de las pipetas que se estn utilizando durante el anlisis perfectamente etiquetado (PUNTAS DE PIPETAS SUCIAS). 8.- En la mesa procurar distribuir el material que se necesita de tal manera que contemos con el espacio suficiente para manipular las muestras tanto en el pesado de la muestra como el sembrado, de tal forma que sugerimos apilar las placas de Petri del lado izquierdo para irlas corriendo al lado derecho. 9.- Debajo de la mesa se tendr un recipiente con una bolsa de plstico para desechar lo que no sirve, nunca las muestras, estas se guardan hasta que el anlisis y reporte estn terminados. 10.- El rea de trabajo estril no debe tener corrientes de aire para evitar contaminaciones. 11.- El analista debe traer una bata de preferencia blanca, limpia y en buen estado, con el pelo recogido y cubierto con una cofia, adems de utilizar un cubrebocas y guantes al manipular la muestra. 12.- Se debe de programar la fecha y hora de dar mantenimiento a las instalaciones as como la hora para la limpieza de este. 13.- El analista debe evitar en lo posible la entrada de personal ajeno al laboratorio o en zonas donde se preparen medios, reactivos, o rea de sembrado de muestras. 14.- Al final de cada da de trabajo el analista indicar al personal de lavado de material cual es el que tendr que lavar y esterilizar para ser utilizado nuevamente. 15.- Al desechar las muestras sobre todo las slidas utilizar una coladera para evitar que las partculas slidas de gran tamao se vayan por el drenaje.
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO El personal encargado de la preparacin de medios de cultivo debe conocer la NOM-065-SSA1-1993, Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo para poder clasificarlos, para ello mencionaremos lo siguiente: Un Medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar los microorganismos, as como efectuar pruebas de susceptibilidad, proporcionndoles las condiciones ambientales adecuadas para su desarrollo, estos requieren elementos que se encuentran en su composicin qumica. Los factores que se deben regular durante el crecimiento son los nutrientes, pH, temperatura, aireacin, concentracin de sales, y potencia inica del medio. Los componentes necesarios que debe contener un medio de cultivo deben ser: a.- Fuente de carbono Los microorganismos obtienen su energa a travs de la fotosntesis o de la oxidacin de compuestos orgnicos, son capaces de utilizar el CO2 como fuente principal de carbono. El carbono se suministra generalmente en forma de carbohidratos b.- Fuente de nitrgeno El nitrgeno es un componente de primer orden de las protenas y cidos nucleicos, las fuentes pueden ser los nitratos, nitritos, nitrgeno, amonio y aminocidos. c.- Fuentes de azufre El azufre es uno de los constituyentes orgnicas de la clula, constituye parte de la estructura de diversas coenzimas y se encuentra formando parte de la metionina y cistena, la mayora de las bacterias toman el azufre del in sulfato, otros ms lo pueden obtener a partir del H2S. d.- Fuente de fsforo Se requiere fosfato como componente de ATP, cidos nucleicos y coenzimas como el NAD, NADH y flavinas. El fosfato se asimila como fosfato inorgnico. e.- Fuentes minerales Algunos microorganismos requieren de iones Mg2+ y ferroso Fe2+, el magnesio es un componente de la molcula de clorofila y el hierro es parte de las coenzimas de los citocromos y las peroxidasas. El potasio se requiere para la funcin de los ribosomas y el calcio es un constituyente de las paredes celulares de las bacterias Gram positivas f.- Factores de crecimiento Se llama factor de crecimiento a la sustancia que favorece el crecimiento pero que el microorganismo es incapaz de sintetizar. Los factores de crecimiento pueden ser vitaminas del complejo B (tiamina, cido nicotnico, piridoxina, biotina), algunas de estas sustancias se pueden obtener del suero, yema de huevo o sangre. g.- Agar El agar utilizado en bacteriologa es un medio que esta libre de metales txicos, compuestos nitrogenados, sales insolubles, azcares libres, microorganismos muertos, bacterias termfilas y pigmentos. El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas rojas, particularmente de los gneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Acanthopeltis, qumicamente el agar es una mezcla de dos polisacridos: agarosa y la agaropectina, cuyas estructuras se revelan como polmeros de la galactosa en sus distintas formas. La proporcin de agarosa y agaropectina es variable, con valores extremos de 75 % de agarosa y 25 % de agaropectina, segn la clase de algas utilizadas. El agar con agua destilada fra tiene un poder de hinchamiento superior a veces al 3000%, en agua hirviendo el agar se disuelve totalmente en pocos minutos. La tendencia a la unin de sus partculas, que en fro se mantienen independientes producen un gel limpio y transparente que al enfriarse, ya no cede el exceso de agua absorbida. La viscosidad del gel aumenta paulatinamente a medida que la solucin disminuye en su temperatura, gelificando a los 35 40 C. Los cidos diluidos en fro, no alteran sensiblemente el agar, desde que se introdujo el agar a los medios de cultivo como agente gelificante ha resultado muy bueno debido a : a.- Su estructura le confiere gran estabilidad frente a las enzimas microbianas, muy pocas bacterias marinas son capaces de hidrolizar como Pseudomonas carragenomora.
b.- Su estabilidad qumica, le permite mantener el medio al estado slido prcticamente en cultivos de cualquier bacteria c.- Su punto de fusin, superior a 80 C, permite cultivar en medio slido bacterias termfilas que se incuban hasta temperaturas de 65 C. d.- Su temperatura de gelificacin, inferior a los 39 C, permite mezclarlos en forma lquida. e.- Su elevado poder gelificante permite su utilizacin a muy bajas concentraciones, generalmente del orden del 1 al 1,5 % (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos f.- Su empleo en concentraciones muy bajas permite la obtencin de medios semislidos en los cuales se pueden realizar pruebas de movilidad En algunas ocasiones un medio de cultivo posee algunas otras sustancias como colorantes o inhibidores para favorecer o inhibir el crecimiento de un microorganismo. Los colorantes e indicadores son de importancia en la preparacin de la mayor parte de los medios de cultivo diferenciales pues, pueden actuar de la siguiente manera: a.- Como agentes bacteriostticos b.- Como indicadores de los cambios de acidez o alcalinidad c.- Como indicadores redox en ciertos medios de cultivo. CLASIFICACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Segn la NOM los clasifica por:
Son aquellos que contienen indicadores de cido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las caractersticas tpicas de las colonias. d.- Medios para cultivar grmenes anaerbicos. Son medios de cultivo para aquellos grmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia. e.- Medios de cultivo para medir la potencia de los antibiticos. f.- Medios de transporte. Sirven para transportar los especmenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporcin original de la flora microbiana en los especmenes. g.- Medios para filtracin a travs de membrana. Pueden ser lquidos o slidos. En el primer caso, se preparan a la concentracin usual y permiten el crecimiento de microorganismos presentes en la membrana. Los medios slidos tienen un contenido mnimo de agar para favorecer la difusin de nutrientes del medio de la membrana. h.- Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras. i.- Medios especiales para cultivo de protozoarios.
C.- Especificaciones
El fabricante debe especificar en cada medio: a.- Contenido de humedad (medio deshidratado). b.- Composicin del medio. c.- Mtodo de preparacin. d.- Condiciones de presin y temperatura para la esterilizacin del medio preparado (en autoclave). e.- Advertencia de no esterilizar el medio, si es el caso. f.- Caractersticas de desarrollo de los microorganismos en el medio. g.- Advertencia sobre la conservacin de los medios preparados. h.- Resultados de las pruebas de estabilidad del medio. i.- Resultado de las pruebas de viabilidad del medio. j.- pH del medio preparado. k.- Fuerza de gel (si procede).
D.- Etiquetado
El etiquetado sobre el envase del medio de cultivo debe ser en idioma espaol, con caracteres claros y legibles, de conformidad con lo establecido en la Ley General de Salud, su Reglamento en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios y las normas oficiales mexicanas que se emitan al efecto, debiendo incluir adems: - Nombre comercial del producto. - Uso. - La leyenda "Agente de Diagnstico". - Presentacin. - Datos de conservacin y almacenaje. - Fecha de caducidad. - Nmero de lote.
- Nmero de Registro SSA. - Nombre y domicilio del fabricante. - Nombre y domicilio del distribuidor. - Mtodo de preparacin y pH final. - Frmula. Por lo tanto haciendo uso de la reglamentacin mexicana tenemos ejemplos de los medios de cultivo por su aspecto fsico. a) Medios lquidos.- Este medio no contiene agar y se emplea para obtener grandes cantidades de microorganismos o bien para la produccin de algn metabolito adems de estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen, se puede obtener el tubo o en matraz y en caso de cultivar a los mohos se puede hacer por agitacin o sin agitacin.
Figura 1: Cultivo en medio liquido (caldo nutritivo y caldo glucosa sales) b) Medios semislidos.-Se utiliza para determinar si un microorganismo tiene movilidad y su contenido de agar es de 13 g/l
Figura 2: Medio semislido (medio SIM), para observar la movilidad de un microorganismos c) Medios slidos.- Se elaboran en una placa para obtener colonias aisladas de microorganismos y la concentracin de agar es de 15 g/l, tambin lo utilizamos en medios slidos inclinados y cuando se trata de sembrar en tubo se colocan en ellos y despus de la esterilizacin se inclinan sobre una varilla de vidrio para dejar una superficie de aproximadamente 3 cm.
Figura: 3 Medio slido inclinado, slido en placa y en matraz para vaciado en placa B.- Por su uso se clasifican en: a) Medios selectivos.- Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperacin del germen o grupo de grmenes de inters.
Figura 4: Medios selectivo agar eosina azul de metileno. b) Medios selectivos de enriquecidos.- Son medios que estimulan la multiplicacin de algn germen determinado e impiden la reproduccin de otros como por ejemplo el agar Baird Parker que sirve para el aislamiento de S. aureus, estos medios de cultivo le adicionamos una sustancias enriquecida de composicin desconocida como suero, sangre, huevo, leche, extracto de hgado, etc.
Figura 5 Medio enriquecido c) Medios diferenciales.- Son aquellos que contienen indicadores de cido base para detectar cambios en el medio o en las caractersticas tpicas de la colonia.
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Fig. 9 Medio de transporte para la realizacin de exudados farngeos. C.- Tambin podemos clasificar a los medios de acuerdo a nuestras necesidades y lo podemos hacer de la siguiente forma. A.- POR SU COMPOSICIN a).- Medio sinttico.- Si un medio se le conoce el 100 % de su composicin qumica. b).- Medio complejo.- Si un medio de cultivo no conocemos su composicin qumica. La calidad del trabajo microbiolgico en el anlisis de muestras se encuentra vinculada tanto con la idoneidad de los medios de cultivo y reactivos, como de la limpieza del material de vidrio y/o plstico que se utilizan durante su preparacin y/o envase. Las mejores instalaciones y equipo disponible y la habilidad del analista pierden todo su valor si la composicin de los medios de cultivos no corresponde a la requerida y si durante la preparacin de stos no se respetan las indicaciones del fabricante. NOTAS: -Leer siempre las instrucciones del fabricante, las cuales estn en la etiqueta del frasco -Realizar los clculos para pesar exactamente lo solicitado. -Se debe siempre de fundir el medio (agar), a la temperatura de ebullicin y sobre un soporte con rejilla o sobre una parrilla de calentamiento. -Utilizar un recipiente al doble de la capacidad que se vaya a preparar -Verificar el pH con un potencimetro -Una vez preparado el medio de cultivo, si son placas y ya estn solidificadas se colocan en bolsas de plstico nuevas y en posicin invertida para evitar la deshidratacin y se colocaran en el refrigerador hasta su uso. -Si son tubos se tienen que inclinar, para ello se coloca una pipeta en una mesa plana y se sujeta con un masking, posteriormente se acomodan los tubos, de tal manera que al solidificarse quede un rea de aproximadamente 3 cm de longitud. Una vez solidificados se colocan dentro de un bote de lmina y este se introduce en una bolsa de plstico, para ser guardados en el refrigerador -Los medios que son lquidos se quedan en el interior del bote y una vez fros se colocan en el refrigerador. - No olvidar colocar en la incubadora, al menos una muestra de cada medio para testigo. -Un medio contenido en un matraz puede ser esterilizado una segunda ocasin. -El cido tartrico se esteriliza por filtracin con membrana.
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Figura 10 Medio de cultivo donde podemos preparar el medio siguiendo las instrucciones del fabricante
Fig. 11 Medios de cultivo preparados. Los cuales llevan un control de calidad y son probados con cepas ATCC, por ejemplo para el agar de sal y manitol es probado con: Resultado Crecimiento inhibido Colonias con pigmento amarillo caracterstico y halo de color amarillo (manitol positivo) ATCC12228 Colonias blancas, sin halo amarillo (manitol negativo) S. epidermidis ATCC 12453 Inhibicin parcial P. mirabilis Tabla No. 1 cepas de referencia para control positivo y negativo del agar de sal y manitol. MTODO DE PRUEBA La viabilidad de los medios se debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC (Coleccin Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas en centros de referencia) ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS Los medios de cultivo debern almacenarse en un lugar fresco y seco o en el refrigerador Microorganismo E. coli S. aureus Cepa de referencia ATCC 25922 ATCC 25923
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PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIN DE UN MEDIO DE CULTIVO 1.- Asegurarse que el frasco que contiene el medio de cultivo est bien cerrado, no presente grumos, no est hidratado y se encuentre dentro de su vigencia. 2.- Leer cuidadosamente las especificaciones del fabricante, generalmente son las siguientes: 2.1 Contenido de humedad (medio deshidratado). 2.2 Composicin del medio. 2.3 Mtodo de preparacin 2.4.- Condiciones de presin y temperatura para la esterilizacin del medio preparado
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Fig. 12 Medio slido a 45 C y vaciado en placa del medio 3.- Dejar entreabiertas las placas un momento para que el agua se evapore y no se condense en la tapa, una vez desplazada el agua tapar rpidamente.
Fig.13 Diferentes placas con medio de cultivo El medio slido tambin es utilizado para realizar el recuento y aislamiento de microorganismos por la tcnica de extensin con varilla, en esta tcnica contamos con el medio ya solidificado y adicionamos 0,1 ml del inoculo en la superficie del medio, posteriormente esterilizamos la varilla y dejamos enfriar para extender la muestra.
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Fig. 14 Tcnica de extensin con varilla Medio slido en placa, dejar entreabierta la tapa de la caja de lo contrario se formar agua de condensacin, tal y como se muestra en la figura. 14 4.- En caso de existir burbujas en el medio hay que flamear con la flama del mechero, procurando agarrar el collarn para que no se apague, tapar la placa y dejar solidificar.
Fig. 14 Cuando al vaciar nos queden burbujas, estas se pueden romper al hacer pasar la flama del mechero sobre ellas (Nunca hacer este procedimiento cuando ya se tenga el inoculo de la muestra) 5.- Los medios preparados se deben conservar de preferentemente en el refrigerador y protegidos con bolsas de plstico. 6.- Todos los medios de cultivo preparados deben llevar fecha de preparacin. 7.- De cada lote preparado de medio de cultivo, incubar dos placas a 35 C durante 48 horas como prueba de esterilidad. b.- Medios en matraz para vaciado en placa Cuando se necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle un tapn de algodn con gasa y fundir el medio. 1.- Esterilizar el medio a las condiciones que indica el fabricante. 2.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un bao Mara a una temperatura de 45 2C. 3.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio. 4.- Despus de inocular las diluciones de las muestras preparadas, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas y dejar solidificar.
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Fig. 16 Medios de cultivo a temperatura de 45C para realizar la tcnica de vaciado en placa c.- Medios en matraz para vaciado en placa de mohos levaduras. Cuando se necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle un tapn de algodn con gasa y fundir el medio. 1.- Esterilizar el medio a las condiciones que indica el fabricante. 2.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un bao Mara a una temperatura de 45 2C y adicionarle 1.4 ml de cido tartrico al 10 % por 100 mL de medio.
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3.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio d.- Medios lquidos en tubo. 1.- Preparar el medio de cultivo (caldo) en un vaso de precipitados y colocarlo en un dosificador regulado a 9 mL y proceder a colocarlo en tubos de ensaye de 16 X 150 mm con tapn de rosca, previamente etiquetados y conteniendo una campana de Durham. 2.- Procurar no cerrar los tubos de ensaye hasta el tope para evitar que estos exploten. 3.- Colocar los tubos en un bote de lmina y colocarle papel Kraft a manera de gorro y proceder a esterilizar a las condiciones que indica el fabricante. 4.- Una vez esterilizados, dejar enfriar y colocarlos en un lugar fresco y seco o en el refrigerador para evitar la evaporacin. 5.- Cuando se requiere tubos con otro tipo de caldo se le coloca a cada uno de los tubos 3 mililitros
Fig. 17 Preparacin de medios de cultivo lquido en tubo Las principales causas de error en la preparacin de medios de cultivo son: Diferencias en la medicin o peso de los medios y /o ingredientes. Falta de frescura del medio por estar bastante tiempo almacenado en el refrigerador el cual genera la deshidratacin del medio Presencia de residuos de detergente en el material utilizado. Efecto germicida de algunas sustancias presentes en el material de vidrio por mal lavado y enjuagado. Que la calidad del agua destilada utilizada no sea la indicada o que presente ciertas trazas de impurezas. Diferencias en el ajuste del pH antes de la esterilizacin o disminucin de este despus de la esterilizacin por efecto del calentamiento o bien por parte del analista. Aunque los medios sean de buena calidad podra en un momento dado tener sustancias que inhiban el crecimiento de los microorganismos. Al vaciar los medios si no se hace a la temperatura sugerida puede tener agua de condensacin y al sembrarlo puede generarnos colonias extendidas. Una mala esterilizacin por parte del personal que lo realice ya sea un sobrecalentamiento del medio trayendo como consecuencia que se desnaturalicen algunas sustancias y en ocasiones pueden perder su poder diferencial o su consistencia. Siempre que la tcnica indique esterilizar por separado alguna sustancia se deber de realizar nunca mezclarlos porque es una causa de error, que pudiera repercutir en el resultado de manera muy significativa. El esterilizar los medios ms de una vez corremos el riego de perdida de agua por lo que el medio estar ms duro de lo que debe estar, por lo tanto se deben de pesar solo cantidades necesarias. Revisar frecuentemente el funcionamiento del manmetro de la autoclave.