CISTENA PROTEASAS REVISIN

ENFERMEDADES DEL ADN MITOCONDRIAL Resumen. Introduccin. Desde hace ms de 30 aos se conocen diversas anomalas del metabolismo mitocondrial que producen enfermedades humanas. Entre ellas se encuentran los defectos en el sistema de fosforilacin oxidativa (sistema OXPHOS), la ruta final del metabolismo energtico mitocondrial que conduce a la sntesis de ATP. Desarrollo. Este sistema presenta la particularidad de que una parte de las subunidades proteicas que lo componen estn codificadas en el ADN mitocondrial. En los ltimos 12 aos se han descrito una serie de mutaciones (puntuales o deleciones) en el ADN mitocondrial que se han asociado con sndromes clnicos bien definidos originados por defectos en el sistema OXPHOS. Los caracteres clnicos de estas enfermedades son muy heterogneos y, excepto en algn caso, afectan a gran variedad de rganos y tejidos. Conclusiones. El diagnstico preciso de este grupo de trastornos requiere la obtencin de datos clnicos, morfolgicos, bioqumicos y genticos. La utilizacin de tcnicas sencillas de gentica molecular permite la deteccin rpida de mutaciones, incluso antes de que puedan realizarse otros tipos de anlisis. [REV NEUROL 2000; 31: 324-33] [http://www.revneurol.com/3104/j040324.pdf] Palabras clave. ADN mitocondrial. Enfermedades mitocondriales.

DOENAS DO DNA MITOCONDRIAL Resumo. Introduo. Desde h mais de 30 anos que se conhecem diversas anomalias do metabolismo mitocondrial que do origem a doenas humanas. Entre estas, encontram-se os defeitos no sistema de fosforilao oxidativa (sistema OXPHOS), o percurso final do metabolismo energtico mitocondrial, que conduz sntese de ATP. Desenvolvimento. Este sistema apresenta a particularidade de parte das subunidades proticas que o compem estarem codificadas no ADN mitocondrial. Nos ltimos 12 anos foram descritas uma srie de mutaes (pontuais ou deleces) no ADN mitocondrial associadas a sndromas clnicos bem definidos originados por defeitos no sistema OXPHOS. As manifestaes clnicas destas doenas so muito heterogneos e, excepto em alguns casos, afectam uma variedade de rgos e tecidos. Concluses. O diagnstico preciso deste grupo de perturbaes requer a obteno de dados clnicos, morfolgicos, bioqumicos e genticos. A utilizao de tcnicas simples de gentica molecular permite a deteco rpida de mutaes, inclusive antes de se poderem realizar outros tipos de anlise. [REV NEUROL 2000; 31: 324-33] [http://www.revneurol.com/3104/j040324.pdf] Palavras chave. ADN mitocondrial. Doenas mitocondriais.

Cistena proteasas y neurodegeneracin

J. Jordn, M.F. Galindo, V. Cea, C. Gonzlez-Garca
CYSTEINE PROTEASES AND NEURODEGENERATION Summary. Objective. This is a review of the part played by the cysteine proteases in different physiological and pathological processes. Development. Apoptotic processes have a crucial function in control of the number of cells in multicellular organisms, both during development and throughout life. Alterations in these are closely related to different pathological processes, from cancer (with fewer apoptotic processes) to the degenerative disorders in which apoptosis is increased. Although the stimuli which may induce apoptosis are very varied, the apoptotic phenotypes are similar. Different metabolic routes are involved in apoptosis and in these changes, both in transcription and postranscription. The latter form the basis of this paper. We review the role of the cysteine protease family, in which the caspases and calpains are the best representatives, which have been related to different degenerative models. In this review we describe the stimuli and cascades of intracellular signalling which occur on activation. Conclusion. These proteases are involved in many situations involving the development and maintenance of the number of cells in the tissues, both physiological and pathological. They may be considered to be possible therapeutic targets in neurodegenerative diseases such as Alzheimers disease, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinsons disease and Huntingtons chorea. [REV NEUROL 2000; 31: 333-40] [http://www.revneurol.com/3104/j040333.pdf] Key words. Apoptosis. Calpains. Caspases. Mitochondria. Neurodegeneration. Proteases.

INTRODUCCIN La disminucin del nmero de neuronas en el sistema nervioso, tanto perifrico como central, es un proceso fisiolgico que ocurre durante algunos estadios del desarrollo, en los que se ha descrito una prdida de casi un 50% en algunas poblaciones neuronales [1,2]. Esta disminucin neuronal tambin sucede en situaciones patolgicas, como la esclerosis lateral amiotrfica y las enfermedades de Alzheimer, Parkinson y corea de Huntington [3-5]. Tanto en situaciones fisiolgicas como patolgicas, los procesos de muerte celular pueden agruparse en dos bloques: apoptticos y necrticos. Estos ltimos englobaran los procesos degenerativos
Recibido: 16.06.00. Aceptado tras revisin externa sin modificaciones: 27.06.00. Instituto de Neurociencias. Facultad de Medicina. Universidad Miguel Hernndez. Alicante, Espaa. Correspondencia: Dra. Carmen Gonzlez-Garca. Instituto de Neurociencias. Facultad de Medicina. Campus de San Juan. Ctra. de Valencia N-332, km 87.

agudos como los implicados en traumatismos y focos isqumicos, entre otros [5]. Bajo el concepto de apoptosis se agrupan procesos de muerte neuronal que necesitan de la participacin de diferentes rutas metablicas, que incluyen tanto la activacin de cascadas transcripcionales [6,7] (hecho por el que tambin se conoce como muerte celular programada) como postranscripcionales. El papel de los mecanismos postranscripcionales ha adquirido mayor importancia a partir de estudios que ponen de manifiesto cmo algunos modelos apoptticos no requieren la sntesis de novo de ARN y/o de protenas. Entre las modificaciones postranscripcionales desE-03550 San Juan, Alicante. Fax: +34 96591 9490. E-mail gonzalez@umh.es Agradecimientos. Este trabajo ha sido financiado, en parte, gracias a las ayudas SAF98-0140 y 2FD97-0647 de CICYT a la Dra. Carmen Gonzlez Garca y SAF96-0169, 1FD97-0500 y Fundacin Navarro Trpodi al Dr. Valentn Cea. 2000, REVISTA DE NEUROLOGA

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critas en algunas enfermedades neurodegenerativas destacan cambios reversibles en los estados de fosforilacin de las protenas, translocaciones de protenas desde unos compartimentos a otros y cambios irreversibles como hidrlisis controlada de protenas mediante la activacin de determinadas proteasas. El papel de las proteasas en la muerte celular se puso de manifiesto en un principio gracias al uso de frmacos inhibidores de proteasas no especficos. Sin embargo, no se ha descrito una degradacin global de todas las protenas, por lo que se postula que slo un nmero determinado de proteasas est implicado en la apoptosis. Estas enzimas hidrolizaran bien protenas reguladoras de procesos anti-apoptticos, bien enzimas que promueven la muerte celular. Aunque los estmulos que desencadenan los procesos de muerte neuronal pueden ser de naturaleza muy distinta,losfenotipos apoptticos son bastante similares, lo que indica que la mayora de los mecanismos y rutas metablicas de la fase efectora estn probablemente muy conservados. Esta teora est refrendada por el hecho de que, independientemente de la naturaleza de los estmulos inductores, los procesos apoptticos pueden ser bloqueados por la inhibicin de diferentes familias de proteasas, entre las que cabe destacar, y son el eje de esta revisin, las cistena proteasas. LA FAMILIA DE LAS CISTENA PROTEASAS La familia de las cistena proteasas engloba a todas aquellas proteasas que presentan un residuo de cistena en su centro cataltico. Los miembros de esta familia que desempean un papel importante en los procesos apoptticos en el sistema nervioso son las caspasas y las calpanas. Las caspasas Las caspasas son una familia de cistena proteasas que han sido reconocidas como los homlogos en mamferos del producto del gen ced-3, descrito inicialmente en el nematodo Caenorhabditis elegans como gen proapopttico implicado en los procesos de muerte celular que tienen lugar durante su desarrollo embrionario. El trmino caspasa se basa en un sistema de nomenclatura consensuada [8]. De esta manera, comienza por c por contener un residuo de cistena en su centro activo, termina en asa por tratarse de una enzima y se intercala asp debido a su especifici-

Figura 1. Mecanismo de activacin de caspasas en respuesta al calcio o al factor de necrosis tumoral (TNF). ERO: especies reactivas de oxgeno. Tabla I. Clasificacin de las caspasas. Caspasa Caspasa-1 Caspasa-2 Caspasa-3 Caspasa-4 Caspasa-5 Caspasa-6 Caspasa-7 Caspasa-8 Caspasa-9 Caspasa-10 Caspasa-11 Caspasa-12 Caspasa-13 Caspasa-14 ERICE MICE 19q1 Otras denominaciones ICE ICH-1, Need 2 CPP32, YAMA, apopain ICErel-II, TX, ICH-2 ICErel-III, TY Mch2 Mch3, ICE-LAP3, CMH-1 FLICE, MACH, Mch5 ICE-LAP6, Mch6 Mch4, FLICE2 ICE-3 Locus 11q2 7q35 4q35 11q2 11q2 4q25 10q2 2q33 1q36 2q33 Posicin de hidrlisis de la procaspasa Asp-103, Asp-119, Asp-297, Asp-316 Asp-152, Asp-316, Asp-330 Asp-9/Asp-28, Asp-175 Asp-104, Asp-270, Asp-289 Asp-121, Asp-311, Asp-330 Asp-23, Asp-179, Asp-193 Asp-23, Asp-198 Asp-210, Asp-216, Asp-374, Asp-384 Asp-130, Asp-315, Asp-330 Asp-219, Asp-372 Centro activo WFKD DQQD IETD WVRD WVRD TEVD IQAD VETD PEPD IEAD MAED ATAD/ ADTD WVSD LGGD Secuencia de reconocimiento WEHD DEHD DEVD W/LEHD W/LHD VEHD DEVD LETD LEHD LEAD

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cuales darn lugar a la posterior activacin en cadena de otros miembros de la familia. Caspasa Estmulo Modelo Quizs por ello, se ha propuesto un papel para las caspasas en muchos modelos de Caspasa-1 Mutaciones en SOD Animales transgnicos muerte apopttica (Tabla II). Hipoxia Cultivos neuronales Isquemia/reperfusin Retina La activacin de las caspasas por estmulos extracelulares se ha relacionado con Caspasa-2 Retirada de NGF Clulas PC-12, clulas simpticas algunas protenas de membrana, como la de ganglio cervical superior -amiloide Neuronas de hipocampo familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF, del ingls Tumor NeCaspasa-3 -amiloide (25-35) Neuronas de hipocampo crosis Factor ), el receptor del factor de NMDA Neuronas de hipocampo Radiaciones gamma crecimiento nervioso (NGF, del ingls Colchicina Clulas granulares Nerve Growth Factor) y el receptor del 6-OHDA Neuronas de cerebelo Enfermedad de Parkinson Neuronas dopaminrgicas Fas (FasR), tambin conocido como Apo-1 Malonato o CD-95. Isquemia La activacin de FasR se produce en NP-3 la trimerizacin del receptor que recluta Caspasa-6 N-metil-N-nitosurea Fotorreceptores tanto la molcula adaptadora FADD (Fas Associated Death Domain) como la proCaspasa-8 N-metil-N-nitosurea Fotorreceptores FAS Motoneuronas caspasa-8 que se activa y forma un com-amiloide plejo multimrico conocido como DISC (Death-Inducing Signal Complex ). La Caspasa-9 [Ca2+], [Pb2+] Retina caspasa-8, as formada, puede a su vez Caspasa-12 -amiloide Neuronas corticales activar a otras caspasas bien de una forma directa, como ocurre con la procaspasa-3, o indirecta mediante la hidrolizadad en realizar protelisis tras un residuo de aspartato. Las caspa- cin de bid , producto de un oncogn proapopttico de la familia sas se nombran por el orden cronolgico de su descubrimiento: de los bcl-2 que induce la liberacin de citocromo c desde la caspasa-1, caspasa-2, etc., y la enzima convertidora de la interleu- mitocondria, lo cual es requerido para la posterior activacin de cina (ICE) se denomina caspasa-1; en la actualidad, se han descrito la procaspasa-9 (Fig. 1). La activacin de las caspasas va receptor est implicada en 14 caspasas (Tabla I). Las caspasas pueden dividirse en tres grandes grupos: a) cas- diferentes modelos apoptticos como el que tiene lugar en las mopasas implicadas en la produccin de citocinas (caspasas 1, 4, 5 y toneuronas espinales tras establecer el contacto con su rgano diana. 13); b) caspasas de sealizacin o de activacin de otras caspasas Dichas neuronas expresan el receptor de Fas y su ligando FasL en (caspasas 2, 8, 9 y 10), y c) caspasas efectoras de muerte o eje- el perodo en el cual los procesos de muerte neuronal programada comienzan a aparecer. La presencia de Fas-Fc, agente que bloquea cutoras (caspasas 3, 6 y 7) que hidrolizan sustratos selectivos. Los diferentes miembros de la familia de las caspasas compar- las interacciones entre FasR y FasL, o del tetrapptido IETD (un ten similitudes en sus secuencias aminoacdicas, estructuras y inhibidor de la caspasa-8), confiere neuroproteccin a los cultivos especificidad por los sustratos. Todos ellos son sintetizados como de motoneuronas de pollo [11]. La sobreexpresin de una forma precursores inactivos o cimgenos. Las caspasas presentan nor- mutada, afuncional, del receptor FADD protege a cultivos neuronamalmente una localizacin citoslica, aunque se han observado en les frente a la toxicidad inducida por un pptido amiloide [12]. Entre los estmulos intracelulares capaces de activar las caspael interior de mitocondrias y del retculo endoplasmtico, as como en el ncleo. Algunas caspasas poseen la capacidad de translocar- sas destacan los mediados por orgnulos como es el caso de la se desde un compartimento intracelular a otro tras un estmulo mitocondria. La integridad funcional de la mitocondria parece apopttico. Como ejemplo citaremos las caspasas 2 y 9 que se estar comprometida durante algunos procesos de apoptosis. La translocan desde la mitocondria al citosol, mientras que la caspa- disminucin del potencial transmembrana mitocondrial, la perturbacin de la cadena transportadora de electrones con la consecuensa-7 lo hace desde el citosol a la mitocondria [9,10]. te cada de los niveles de cido adeniltrifosfrico (ATP) y la proProcesos de activacin de las caspasas duccin de radicales libres, son eventos caractersticos de esta Como se coment anteriormente, las caspasas sesintetizan enforma alteracin. Durante los procesos de muerte celular se produce la de precursores inactivos los cuales pueden activarse por mecanismos liberacin de algunas protenas del espacio intramembrana mitomuy diversos que engloban desdeestmulosextracelularesmediados condrial al citosol, como es el caso del citocromo c, protena de la por la activacin de receptores, a estmulos intracelulares entre los que cadena transportadora de electrones requerida como cofactor en la destacaramos los mediados por segundos mensajeros (calcio y espe- formacin de un complejo, denominado apoptosoma, constituido cies reactivas a oxgeno), orgnulos (mitocondria y el retculo endo- por tres elementos ms: la molcula adaptadora apaf-1 (factor plasmtico), as como por la accin de proteasas de otras familias o por inductor de apoptosis-1 considerado homlogo del gen ced-4descrito en C. elegans), la procaspasa-9 y el dATP. La formacin del acciones autocatalticas (Fig. 1). Las procaspasas contienen en su estructura regiones que pue- apoptosoma es requerida para la activacin de la caspasa-9 [13]. den ser reconocidas e hidrolizadas por la misma caspasa a la que La capacidad de regular la liberacin del citocromo c sita a la dan origen o por otras caspasas. Dependiendo del origen del est- mitocondria como centro de decisin entre muerte y supervivencia mulo apopttico, inicialmente se activan diferentes caspasas, las celular en la cascada apopttica.
Tabla II. Participacin de caspasas en modelos de muerte neurodegenerativa.

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El calcio libre intracelular se considera Tabla III. Sustratos e inhibidores de las caspasas. en la actualidad como el segundo mensajeSustrato Inhibidor ro ms importante en muchos de los procesos neurodegenerativos. Se han descrito Caspasa Endgeno Sinttico Endgeno Sinttico modificaciones en su concentracin intra2+ CrmA, p35 Z-VAD-FMK, celular ([Ca ]i) en procesos de muerte neu- Caspasa-1 ProIL-1 Ac-YVAD-AFC/pNA, MCA-YVADAPK(DNP)-OH, Ac-VAD-CHO, ronal inducida por excitotoxicidad o por el AC-WEHD-AFC/pNA, BACMK, pptido -amiloide [14]. MCA-YEVDGWK, Z-YVAD-FMK, ZVAD-AFC/pNA, Ac-YVAD-CHO La mitocondria es un orgnulo que presenta una alta capacidad de amortiguar cam- Caspasa-2 PARP, XIAP Z-VDVAD-FMK bios en la [Ca2+]i y, en su membrana, se espectrina Glogin-160 localizan algunos miembros de la familia bcl-2 conocidos por desempear un papel Caspasa-3 PARP, MCA-DEVDAR[K-DNP]-NH2 , p35, XIAP, Z-VAD-FMK crtico en la regulacin de los procesos de DNA-PK, MCA-VDQMDGWK-(DNP)-NH2 , DIAP Ac-VAD-CHO, SER/B, Z-DEVD-AFC, Z-DEVD-FMK/CHO, muerte celular. Miembros de esta familia prho-GDI, MCA-DEVDAPK(DNP)-OH, Ac-DEVD-CHO/CMK, de oncogenes, como el propio bcl-2, son PAK2, Ac-DEVD-pNA Biotin-X-DEVD-FMK, presenilinas Ac-DMQD-CHO, capaces de regular la apertura del poro de Z-DQMD-FMK, transicin mitocondrial y desempean una AC-ESMD-CHO funcin clave en la regulacin de la activaAc-LEVD-AFC, p35 Z-VAD-FMK, cin de las caspasas. El bcl-2 es capaz de Caspasa-4 Ac-WEHD-AMC Ac-VAD-CHO, impedir la salida del citocromo c desde la Ac-LEVD-CHO/AFC mitocondria y bloquear la posterior activaMCA-LEVDGWK-(DNP)-NH2, Z-VEID-FMK, cin de las caspasas. Es ms, el bcl-2 inhibe Caspasa-5 Ac-LEVD-AFC la muerte celular en situaciones donde el citocromo c se encuentra ya en el citoplas- Caspasa-6 Lamin A Ac-WEHD-AFC, p35 Z-WEHD-FMK, Ac-VEID-AMC/pNA, Z-VEID-FMK/-CHO, ma, como sucede en clulas en las que se ha Z-VEID-AFC VEID-CHO, microinyectado dicho citocromo [15]. Aunque la translocacin del citocromo c desde Caspasa-7 PARP Ac-DQTD-AMC, p35, XIAP Z-VAD-FMK, Ac-DEVD-AMC, Ac-VAD-CHO la mitocondria al citoplasma se ha asociado MCA-VDQVDGWK-(DNP)-NH2 DVED-CHO a una cada del potencial mitocondrial, en algunos modelos estos dos sucesos no se Caspasa-8 Ac-IETD-AMC CrmA, p35 Z-IETD-FMK/CHO encuentran directamente relacionados; Ac-LEHD-AFC IAP Z-LEHD-FMK/CHO como ejemplos, citaremos la retirada del Caspasa-9 PARP NGF del medio de cultivo de neuronas simpticas o la exposicin de neuronas de hipocampo a estaurosporina [16,17]. Otros estmulos intracelulares que activan las caspasas son to e hidrlisis de los sustratos por estas enzimas. De hecho, las las especies reactivas de oxgeno (ERO). Desequilibrios del me- caspasas no hidrolizan todas las protenas que contienen dicha setabolismo oxidativo y el consecuente estrs oxidativo constitu- cuencia de aminocidos y, por ello, nunca sucede una degradacin yen un factor comn en el origen y en la progresin de procesos aleatoria de protenas celulares en los procesos de apoptosis. Entre neurodegenerativos (ver revisin en [18]). Un ejemplo del papel los sustratos descritos para las caspasas destacan numerosos elede las ERO como segundos mensajeros encargados de activar las mentos del citoesqueleto (actina, fodrina, protena tau y catenina), caspasas queda reflejado en la muerte celular en cultivos neuro- enzimas encargadas de reparar (PARP) [24] o degradar (ADNasa) nales inducida por 4-hidroxinonenal (HNE), un producto resul- [25] el ADN celular, factores de transcripcin (retinoblastoma, tante de la peroxidacin lipdica. El HNE induce la activacin de MDM2) [26], y protenas reguladoras cinasas y fosfatasas (protena diferentes caspasas como la 3, 8 y 9 y frmacos antioxidantes cinasa C, fosfatasas 2A, cinasas de adhesin focal, Akt, raf1), as como la cistena, la N-acetil-L-cistena y el ditiothreitol (DTT) como productos de la familia del oncogn bcl-2 (bid) [27]. Existen inhibidores de caspasas de naturaleza proteica como bloquean dicha activacin, as como la hidrlisis de poli ADP-ribosa polimerasa (PARP) y la fragmentacin del ADN [19]. la crmA (cytokin response modifier enzyme A), p35 y el pptido Las caspasas tambin pueden ser activadas por otras protea- inhibidor de apoptosis (IAP, del ingls Inhibitor Apoptosis Pepsas. Por ejemplo, la granzima B, liberada desde las clulas T, tide ), todos ellos de origen vrico [28-32], as como homlogos puede hidrolizar directamente a procaspasas o activar el producto de esta ltima protena en mamferos, como el pptido inhibidor del oncogn bid [20]. Por otro lado, las calpanas y las catepsinas de apoptosis neuronal (NAIP, del ingls Neuronal Inhibitor se han relacionado tambin con la activacin de las caspasas [21,22]. Apoptosis Peptide) [33-36] (Tabla III). Existen diversos frmacos de origen sinttico capaces de inSustratos e inhibidores de las caspasas hibir a uno o a varios miembros de la familia de las caspasas. La Una de las caractersticas bioqumicas ms notables de las caspasas estructura de estos frmacos contiene la secuencia de aminocies su alta especificidad por los sustratos que hidrolizan. Las caspa- dos que puede ser reconocida por una o varias caspasas. Muy sas reconocen secuencias especficas de cuatro aminocidos que brevemente destacaremos los pptidos Z-VAD-FMK contienen un residuo aspartato (Tabla I) [23]. Sin embargo, la es- [Z-Val-Ala,Asp(oMet)-CH2 F], un inhibidor irreversible altamentructura ternaria de las protenas resulta crucial en el reconocimien- te especfico para las caspasas 1, 3, 4 y 7, y el Z-DEVD-FMK

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Figura 2. Mecanismos de activacin y sustratos de calpanas.

(Asp-Glu-Val-Asp-FCMK), inhibidor de la caspasa-3. Otros inhibidores se muestran en la tabla III. En la actualidad, se est trabajando en la bsqueda de nuevos inhibidores de caspasas con una alta especificidad y capaces de atravesar mejor las membranas citoplasmticas. Las caspasas como diana teraputica Como ya se ha mencionado, diferentes miembros de la familia de las caspasas han sido implicados en procesos neurodegenerativos de diversa naturaleza (Tabla II). En muchos de ellos, la inhibicin farmacolgica de las caspasas resulta crucial para mantener la viabilidad de clulas del sistema nervioso. En esta revisin nos centramos en la caspasa-3 por ser uno de los primeros miembros descritos y por su localizacin en un lugar central o de reclutamiento dentro de la red de las caspasas. Sobre la base de datos obtenidos de modelos de muerte celular en cultivos neuronales y en estudios en animales transgnicos, se ha propuesto que la activacin de la caspasa-3 podra estar implicada en algunas enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrfica, la enfermedad de Parkinson y la corea de Huntington. El tratamiento de cultivos neuronales con el fragmento 25-35 del pptido -amiloide[A(25-35)] produce una activacin de la caspasa-3. La utilizacin de inhibidores de caspasas protege a dichos cultivos de la disminucin de la viabilidad celular inducida por A(25-35). Algunos inhibidores de caspasas como el pptido Ac-DEVD-CHO previene la fragmentacin del ADN en este cultivo [37] y el pptido ZVAD-CH2 -DCB, la hidrlisis de la enzima PARP, a la vez que mantiene la integridad de la membrana citoplasmtica [38]. Por otro lado, la caspasa-3 presenta una mayor afinidad para degradar formas mutadas de presenilinas presentes en pacientes con enfermedad de Alzheimer [39]. Mutaciones en la enzima citoplasmtica superxido dismutasa,

que disminuyen su actividad, han sido relacionadas con la esclerosis lateral amiotrfica. Ratones manipulados genticamente que expresan formas mutadas de esta enzima [SOD1(G93A)] presentan una sobreexpresin de las caspasas-1 y 3 [40]. En estos ratones la administracin intracerebroventricular del pptido inhibidor de caspasas ZVAD-FMK retrasa la aparicin de los sntomas y alarga la duracin de la vida [41]. Se est comenzando a utilizar con cierto xito los inhibidores de caspasas en pacientes con enfermedad de Parkinson. As, el pptido inhibidor Ac-YVAD-CMK favorece la viabilidad de los implantes de neuronas dopaminrgicas y mejora sustancialmente la recuperacin funcional de ratas parkinsonianas [42]. En modelos experimentales de esta enfermedad, como la prdida neuronal dopaminrgica descrita tras la administracin intraestrial de 6-hidroxidopamina (6-OH-DA) [43], el pptido ZVAD-FMK presenta efectos neuroprotectores. Este inhibidor, junto con Ac-DEVD-CHO, atenan los procesos de muerte inducidos por el 1-metil-4-fenilpiridino (MPP+), metabolito activo del MTPT. Las caspasas se han convertido en una nueva diana farmacolgica en los intentos por paliar los daos inducidos durante y tras los procesos de isquemia cerebral, donde la actividad enzimtica de la caspasa-3 est progresivamente incrementada [44]. As, el pptido DEVD-CHO disminuye el nmero de clulas apoptticas en diversos modelos de neurodegeneracin, y se ha descrito que la combinacin de inhibidores de las caspasas con antagonistas de los receptores glutamatrgicos, como la dizocilpina (MK-801), proporcionan un efecto neuroprotector sinrgico [45]. El uso de animales modificados genticamente es una herramienta til para el estudio de la implicacin de determinadas rutas metablicas en los procesos apoptticos. Animales que no expresan las caspasas 3 y 9 presentan graves malformaciones especficas en el cerebro debido a la disminucin de los procesos apoptticos y a hiperplasia del mismo durante el desarrollo [46,47]. Sin embargo, la delecin de las caspasas 1, 2 u 11 no modifica significativamente el desarrollo del cerebro [48,49], aunque los animales que carecen de caspasas 1 y 11 muestran una tolerancia mayor frente a estmulos endotxicos [50]. Las calpanas Las calpanas se engloban dentro de la superfamilia de las cistena proteasas conocida como papanas. Las calpanas se distinguen de otros miembros de esta familia porque requieren la presencia de calcio para su activacin. Los niveles de calcio intracelular necesarios para alcanzar la mitad de su actividad enzimtica mxima han servido de base para la clasificacin de las calpanas [51,52]. La -calpana requiere valores comprendidos entre 5-50 M,mientras que para la m-calpana el intervalo es de 0,2-1 M. La activacin de la procalpana requiere su translocacin y unin a la membrana citoplasmtica, seguida de una rpida autlisis. La calpana es un heterodmero compuesto por una subunidad larga de 80 kDa y otra corta de aproximadamente 30 kDa (Fig. 2) [53]. La subunidad larga contiene el centro cataltico y es

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Tabla IV. Calpanas. Sustratos Endgenos Calpana p53, bax, tropioninas, neurofilamentos, espectrina, actina, MAP-2 protena tau, p35 Sintticos Suc-Leu-Tyr-AMC Boc-Val-Leu-Lys-AMC Endgenos Calpastatina Inhibidores Sintticos Calpeptin, N-acetil-Leu-Leu-Nle-CHO (ALLN), N-acetil-Leu-Leu-Met-CHO (ALLM) Z-Val-Phe-CHO (MDL 28170), E-64, PD150606, Z-Leu-Leu-Tyr-CH 2F, Mu-Val-HPh-FMK/CH 2F

nica para cada isoenzima, mientras que la subunidad corta se considera como una subunidad reguladora y es comn para algunas calpanas [54]. La homologa de la secuencia de aminocidos entre las subunidades largas es de casi un 50%, alcanza valores cercanos al 75% en el dominio proteasa y al menos de un 50% en el lugar de unin al calcio [55]. Algunas ERO desempean un papel crucial en los procesos de activacin de las calpanas pues son capaces de alterar la homeostasis de la [Ca2+]i. Este es el caso del xido ntrico que resulta txico en cultivos neuronales de hipocampo debido a un mecanismo que implica la activacin de las calpanas [56]. Sustratos e inhibidores de las calpanas Las calpanas proteolizan una amplia variedad de sustratos implicados en los procesos de muerte neuronal como factores de transcripcin, oncogenes [57], segundos mensajeros, gran variedad de enzimas [58-60] y protenas de membrana y del citoesqueleto [58,61] (Fig. 2, Tabla IV). La afinidad hacia estos sustratos puede verse alterada por modificaciones postranscripcionales como el estado de fosforilacin y de glicosilacin de las protenas. La accin proteoltica sobre estos sustratos confiere a las calpanas un papel relevante en fenmenos celulares como las cascadas de sealizacin intracelular, el trfico de vesculas, la modulacin de la estructura celular, el crecimiento de las neuritas y la remodelacin de las dendritas, tanto en condiciones fisiolgicas como patolgicas [62,63]. Sin embargo, la sobreactivacin de las calpanas en respuesta a procesos excitotxicos o isqumicos produce un aumento de la degradacin de las protenas estructurales y contribuye a los procesos de muerte neuronal [38]. La calpastatina es el nico inhibidor endgeno conocido para las calpanas. Presenta una inhibicin reversible y especfica a la vez que carece de efecto sobre otras cistena proteasas como la catepsina B o papana. La calpastatina presenta en su estructura cinco dominios constituidos por unos 140 aminocidos, donde el dominio N-terminal es seguido por cuatro dominios homlogos que muestran su actividad inhibitoria en presencia de calcio. La secuencia consenso presente en cada dominio inhibitorio, necesaria y suficiente para inhibir a la calpana, es LGXK(R)D(E)XTIPPXYRXLL. La calpastatina es hidrolizada por las calpanas en varias regiones interdominio, de manera que se generan diferentes pptidos inhibidores y se obtiene como resultado que, a partir de una sola molcula de calpastatina, puedan inhibirse varias molculas de calpana [53]. En la actualidad, disponemos de frmacos de origen sinttico que presentan la capacidad de inhibir la actividad enzimtica de las calpanas, entre ellos destacamos ALLN (N-acetil-Leu-Leu-NleCHO), ALLM (N-acetil-Leu-Leu-Met-CHO), MDL 28170 (Z-ValPhe-CHO), E-64 y -mercaptoacrilato(PD150606).

Las calpanas en los procesos degenerativos Se ha relacionado a las calpanas con procesos degenerativos tanto en neuronas como en otros tipos celulares (senescencia de los eritrocitos). As, el dficit de calpana-3, especfica del tejido muscular esqueltico, se ha asociado a distrofias musculares y la activacin de las m- y las -calpanas con los procesos de neurodegeneracin [64]. En el sistema nervioso se ha descrito que la activacin anormal de la calpana media el dao neuronal en los procesos de excitotoxicidad en los que se han observado niveles anormales de la concentracin intracelular del ion calcio. Como ejemplo de excitotoxicidad, citaremos la exposicin de cultivos de neuronas de hipocampo a dosis letales de cido N-metil-D-asprtico (NMDA) [38], hecho que est especficamente ligado a la entrada de calcio por el receptor de NMDA y no a un incremento inespecfico de la [Ca 2+]i [65]. En la enfermedad de Alzheimer se ha descrito que la calpana I se encuentra sobreactivada en reas del neocrtex [66]. Una activacin persistente de las calpanas contribuye al dao de los neurofilamentos y a un anormal procesamiento y trfico de la protena precursora del amiloide. Otro sustrato de las calpanas es la protena tau, una protena asociada a los microtbulos que desempea un papel importante en el mantenimiento de la estructura neuronal. La protena tau se encuentra hidrolizada en pacientes con enfermedad de Alzheimer, en los cuales aparecen acmulos citoplasmticos de productos de degradacin de la protena tau que carecen de la capacidad de asociarse con los microtbulos [67]. La expresin de m-calpana se encuentra aumentada en el mesencfalo de pacientes con enfermedad de Parkinson, y presenta una localizacin en las fibras y en los soma de neuronas de la sustantia nigra, en el rea tegmental ventral, en clulas del grupo A8 catecolaminrgicas y en el locus coeruleus [68]. Tambin en los procesos isqumicos se ha descrito una sobreactivacin de -calpana en las reas isqumicas [69] y se ha observado la protelisis de la -espectrina en reas del hipocampo, tanto en las fases iniciales como en las zonas de penumbra isqumica [70]. El uso de frmacos inhibidores de las calpanas ha proporcionado informacin valiosa sobre su implicacin en procesos neurodegenerativos. Como ejemplo, citaremos el frmaco MDL28170 que promueve la recuperacin de las respuestas sinpticas en rodajas de hipocampo sometidas a hipoxia y que se muestra eficaz frente a los procesos de muerte neuronal inducidos por estmulos tan diferentes como el pptido A(25-35), la estaurosporina y el NMDA en cultivos neuronales de hipocampo de rata [71]; los compuestos ALLnL y ALLnM que protegen lneas celulares frente a estmulos como el NMDA y la glicoprotena del virus del sida gp120 [72] y, por ltimo, los derivados del -mercaptoacrilato, como el PD150606, que confieren proteccin a cultivos neurona-

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CISTENA PROTEASAS

les cerebro-corticales frente al dao inducido por estmulos hipxicos/hipoglucmicos [73]. Es de resaltar que los niveles de calpastatina, inhibidor endgeno, se encuentran tambin marcadamente reducidos en las capas II-V del neocrtex de pacientes con enfermedad de Alzheimer [66]. CONCLUSIONES A lo largo de esta revisin hemos descrito la funcin de dos familias de cistena proteasas, las caspasas y las calpanas, en diferentes modelos de neurodegeneracin. La utilizacin de frmacos inhibidores de dichas proteasas han puesto de manifiesto su papel en los procesos de muerte neuronal. En la actualidad, se estn analizando como dianas teraputicas en algunos procesos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis

lateral amiotrfica y la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, un hecho que constituye un lastre para la utilizacin de estos frmacos en la teraputica es que los procesos de apoptosis estn implicados en la homeostasis fisiolgica del nmero de clulas desde las etapas del desarrollo hasta las del envejecimiento en los organismos pluricelulares, as como en la retirada de clulas daadas tras un evento patolgico. Por lo tanto, una inhibicin inespecfica de los procesos apoptticos, mediante la utilizacin de estos frmacos, podra resultar perjudicial, ya que podra degenerar en hiperplasias, al utilizar los tejidos biolgicos los procesos de apoptosis como reguladores de su renovacin. Por todo ello, antes de la utilizacin clnica de estos frmacos se ha de profundizar en la bsqueda de inhibidores ms especficos de proteasas implicadas exclusivamente en los procesos de muerte celular en condiciones patolgicas.

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CISTENA PROTEASAS Y NEURODEGENERACIN Resumen. Objetivo. Revisar el papel que desempean las cistena proteasas en diversos procesos fisiolgicos y patolgicos. Desarrollo. Los procesos apoptticos tienen una funcin crucial en el control del nmero de clulas en los organismos pluricelulares, tanto durante su desarrollo como a lo largo de la vida. Sus alteraciones se encuentran relacionadas ntimamente con diferentes patologas que englobaran desde el cncer, con disminucin de los procesos apoptticos, a las enfermedades degenerativas, con aumento de dichos procesos. Aunque los estmulos capaces de inducir apoptosis son muy diversos, los fenotipos apoptticos son muy similares. Diferentes rutas metablicas estn implicadas en la apoptosis y en sus alteraciones, tanto a nivel transcripcional como postranscripcional. Estas ltimas constituyen el eje de este artculo; en concreto, revisamos el papel de la familia de las cistena proteasas con las caspasas y las calpanas como mejores representantes que han sido relacionadas con diferentes modelos degenerativos. A lo largo de esta revisin se presentan los estmulos y cascadas de sealizacin intracelular que conllevan a su activacin. Conclusin. Estas proteasas estn implicadas en un gran nmero de situaciones fisiolgicas (desarrollo y mantenimiento del nmero de clulas de los tejidos) y patolgicas, y podran considerarse posibles dianas teraputicas en enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrfica, la enfermedad de Parkinson y la corea de Huntington. [REV NEUROL 2000; 31: 333-40] [http://www.revneurol.com/3104/j040333.pdf] Palabras clave. Apoptosis. Calpanas. Caspasas. Mitocondria. Neurodegeneracin. Proteasas.

CISTENA PROTEASES E A NEURODEGENERESCNCIA Resumo. Objectivo. Rever o papel desempenhado pelas cistena proteases em diversos processos fisiolgicos e patolgicos. Desenvolvimento. Os processos apoptticos possuem uma funo crucial no controlo do nmero de clulas nos organismos pluricelulares, tanto durante o seu desenvolvimento, como ao longo da sua vida. As suas alteraes esto intimamente relacionadas com diferentes patologias que englobam desde o cancro, com diminuio dos processos apoptticos, s doenas degenerativas, com aumento dos referidos processos. Embora os estmulos capazes de induzir a apoptose sejam muito diversos, os fenotipos apoptticos so muito semelhantes. Na apoptose e nas suas alteraes, esto envolvidas diferentes vias metablicas, tanto a nvel da transcripo como ps-transcripcional. Estas ltimas constituem o eixo deste artigo; em concreto, revemos o papel da famlia das cistena proteases, com as caspases e calpanas como melhores representantes, tendo sido relacionadas com diferentes modelos degenerativos. Ao longo desta reviso apresentam-se os estmulos e as cascatas de sinalizao intracelular que sustentam a sua activao. Concluso. Estas proteases esto implicadas num grande nmero de situaes fisiolgicas (desenvolvimento e manuteno do nmero de clulas dos tecidos) e patolgicas, podendo ser consideradas como possveis esquemas na posologia em doenas neurodegenerativas, tais como a doena de Alzheimer, a esclerose lateral amiotrfica, doena de Parkinson e Coreia de Huntington. [REV NEUROL 2000; 31: 333-40] [http://www.revneurol.com/3104/j040333.pdf] Palavras chave. Apoptose. Calpanas. Caspasa. Mitocndria. Neurodegenerescncia. Proteases.

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