Está en la página 1de 9

PRÁCTICA # 8

“DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS SERICAS TOTALES POR EL MÉTODO DE BIURET”

OBJETIVO

 Que el estudiante aprenda a manejar métodos colorimétricos en la determinación de proteínas

INTRODUCCIÓN

Las proteínas son compuestos a base de carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y generalmente azufre y fósforo. El
elemento característico es el nitrógeno. Todas las enzimas, algunas hormonas y muchos componentes estructurales
importantes de la célula son proteínas.

Las moléculas de proteína son muy grandes y contienen miles de átomos; su estructura es extremadamente compleja.
Gran parte de las proteínas intracelulares son enzimas, sustancias que regulan la rapidez con que se han de tener
numerosas reacciones celulares.

Las moléculas de proteína están formadas por componentes más simples llamados aminoácidos. Puesto que cada
proteína puede tener cientos de aminoácidos combinados en ciertas proporciones y orden es posible una variedad
prácticamente infinita de moléculas de proteína. Se han ideado métodos de análisis para reconocer la disposición exacta
de aminoácidos en una molécula proteínica. La insulina, hormona secretada por el páncreas y utilizada en el
tratamiento de la diabetes, fue la primera proteína cuya estructura se conoció. La ribononucleasa, secretada por el
páncreas, fue la primera enzima de la cuál se conoció el orden exacto de aminoácidos.

Pueden distinguirse varios niveles de organización en la molécula de proteína. El primer nivel es la llamada estructura
primaria, que depende de la serie de aminoácidos en la cadena de polipéptidos. Esta serie, está determinada a su vez,
por la serie de nucleótidos de RNA y DNA del núcleo de la célula. Un segundo nivel de organización de las moléculas
proteínicas supone la adopción de la forma de hélice u otra configuración regular por la cadena de polipéptidos. Estas
cadenas ordinariamente no se encuentran planas en una molécula de proteína, sino que adoptan formas espiralazas
para dar una estructura tridimensional. Una de las estructuras secundarias comunes de las moléculas proteínicas es el
hélice en α, que se supone una formación espiralaza de la cadena de polipéptidos básica. La hélice en α es una
estructura geométrica muy uniforme con 3.6 aminoácidos que ocupan cada vuelta de la hélice. La estructura helicoidal
es determinada y mantenida por la formación de enlaces de hidrógeno entre residuos de aminoácidos en vueltas
sucesivas de espiral.

Un tercer nivel de estructura de moléculas proteínicas es el desdoblamiento de la cadena de péptidos sobre sí misma
para formar proteínas globulares. De nuevo enlaces débiles como enlaces de hidrógeno, iónicos e hidrofóbicos se
forman entre una parte de la cadena de péptidos y la otra parte, de modo que la cadena se desdobla de una manera
específica para dar una estructura general específica de la molécula proteínica. Enlaces covalentes como los de
disulfuro (-S-S-) son importantes en la estructura terciaria de muchas proteínas. La actividad biológica de una proteína
depende en gran parte de la estructura primaria específica que es mantenida junta por esos enlaces.

Cuando una proteína se calienta o trata con cualquiera de una variedad de productos químicos, se pierde la estructura
terciaria. Las cadenas de péptidos espiralazas se desdoblan para dar una configuración aleatoria acompañada por una
pérdida de la actividad biológica de la proteína. Este cambio se llama “desnaturalización”.

Los 20 aminoácidos aminados que suelen encontrarse en las proteínas poseen todos un grupo amino (-NH2) y un grupo
carboxílico (-COOH), pero sus cadenas laterales son distintas. El mas simple de todos, la glicina, tiene como cadena
lateral un H; la alanita, un grupo –CH3. El grupo amino permite al aminoácido aminado actuar como base y combinarse
con ácidos; el grupo ácido, le permite combinarse con las bases.

Los aminoácidos y las proteínas sirven de amortiguadores y pueden resistir a cambios de acidez y alcalinidad. Los
aminoácidos se unen entre sí para formar proteínas mediante un enlace peptídico entre el grupo amino de una molécula
y el grupo carboxilo de la otra.

Los aminoácidos puros obtenidos de las proteínas tienen sabor dulce. Cuando se ingieren proteínas son hidrolizadas a
aminoácidos antes de ser absorbidas a la corriente sanguínea. Los aminoácidos son llevados a todas las regiones del
organismo, donde sirven para la elaboración de nuevas proteínas, o son metabolizados para liberar energía. Las
proteínas tienen importancia primordial como componentes estructurales de las células y como constituyentes
funcionales de enzimas y algunas hormonas, pero pueden servir también como combustible para producción de energía.
Los aminoácidos pierden primero su grupo amino por una reacción enzimática llamada desaminación. El grupo amino
reacciona con otras sustancias para formar urea, que se excreta. El resto de la molécula puede transformarse por una
serie de fases intermedias en glucosa, que se utiliza pronto como combustible, o almacenarse como glucógeno.
Las plantas pueden sintetizar todos los aminoácidos a partir de sustancias simples. Los aminoácidos que los animales
no pueden sintetizar y que deben obtener en su alimentación se llaman aminoácidos esenciales. Debe comprenderse
que estos aminoácidos no son más esenciales que otros; sólo lo son respecto a la alimentación, pues no es posible
sintetizarlos.

Identificación de aminoácidos y proteínas:

℘ Reacción de Ninhidrina
Reacción para la detección de aminoácidos, actualmente acoplada a
sistemas de valoración automática Tiene como objetivo detectar y
cuantificar cantidades de aminoácidos libres. Los aminoácidos, en
general reaccionan con la ninhidrina cuando son calentados con un
exceso de la misma. Todos los aminoácidos que poseen un grupo
amino libre reaccionan y forman dióxido de carbono, amoníaco y un
aldehído que contiene un átomo de carbono menos que el compuesto
original. Esta reacción da lugar a la formación de un producto color
azul o púrpura (que posteriormente puede ser utilizado para
cuantificar el aminoácido). En el caso de la prolina, que
estructuralmente no posee el grupo amino libre, sino un grupo imino,
la coloración final es amarilla. El amoníaco, la mayoría de los
polipéptidos y las proteínas pueden desarrollar coloración en esta
reacción, pero a diferencia de los aminoácidos, no liberan CO2. La
coloración azulada o violeta será proporcional a la concentración del
aminoácido.

La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un oxidante energético


que por una desaminación oxidativa de los aminoácidos conduce a la
formación del aldehído correspondiente, con liberación de amoniaco y
gas carbónico y formación de la ninhidrina reducida o hidrindrantina.
La molécula de hidridantina, en presencia de otra de ninhidrina,
condensa a través del amoniaco produciendo una estructura
denominada indanona o púrpura de Ruhemann, manifestando un
color rojizo, excepto para la prolina, hidroxiprolina y en menor medida
para la histidina. Presenta su máximo de absorbancia a los 570 nm, exceptuando los tres aminoácidos reseñados
anteriormente.

℘ Reacción de Biuret

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la


condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. Esta
reacción está dada por aquellas sustancias cuyas moléculas contienen dos grupos
carbamino (-CO.NH) unidos directamente o a través de un solo átomo de carbono
o nitrógeno. El reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solución acuosa alcalina
(gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de
un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no
compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. Esta última
reacción provoca un cambio de coloración: violeta púrpura o violeta rosado. Debe
señalarse que el color depende de la naturaleza de las proteínas; proteínas y
péptidos dan un color rosado; la gelatina da un color azul

℘ Reacción de Millón

La reacción del Millón se debe a la presencia del grupo hidroxifenilo en la molécula proteica. Cualquier compuesto
fenólico que no esté sustituido en la posición 3,5 como la tirosina, el fenol y el timol producen resultados positivos en
esta reacción. De estos compuestos, sólo la tirosina está presente en las proteínas, de manera que sólo las proteínas
que tienen este aminoácido ofrecen resultados positivos.

En esta prueba los compuestos mercúricos en medio fuertemente ácido (ácido nítrico del reactivo) se condensan con el
grupo fenólico formando un compuesto de color rojo ladrillo o rojizo. La prueba no es satisfactoria para soluciones que
contienen sales inorgánicas en gran cantidad, ya que el mercurio del reactivo del Millón es precipitado y se vuelve
negativo, razón por la cual este reactivo no se usa para medir albúmina en orina. Debe tomarse en cuenta que en el
caso de que la solución a examinar sea muy alcalina, debe ser previamente neutralizada, ya que el álcali precipitaría al

2
ion mercurio en forma de óxidos amarillos. Además, proteínas como la ovoalbúmina producen un precipitado blanco que
progresivamente por acción del calor se torna rojo; pero las peptonas dan solamente una solución de color rojo.
℘ Reacción de Xantoproteica

Esta prueba caracteriza a los aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina, triptófano. Esta reacción se debe la
presencia de un grupo fenilo en la molécula proteica. Los complejos de la molécula proteica que son de importancia en
esta reacción son la tirosina y el triptófano. La fenilalanina no reacciona en las condiciones que se realiza en el
laboratorio. Para esta prueba se produce la nitración del anillo bencénico presente en los aminoácidos obteniéndose
nitrocompuestos de color amarillo, que se vuelven anaranjado en medio fuertemente alcalino (formación de ácido
picrámico o trinitrofenol). No puede realizarse esa reacción para identificar albúmina en orina, por el color anaranjado de
la reacción final. Las proteínas que tienen en su composición estos aminoácidos también darán la reacción. La
positividad se reconoce por la aparición de un color amarillo o verde debido a la formación de nitrocompuestos.

℘ Prueba de los grupos SH:

Es una prueba para identificar aminoácidos azufrados y las proteínas que los
contienen, se reconocen por la formación de una coloración negra o gris.

℘ Prueba de Sakaguchi

Esta prueba es positiva para compuestos que contengan el grupo guanidinio como la arginina ya
que casi todas las proteínas poseen ese aminoácido.El reactivo que se utiliza contiene α-naftol e
hipoclorito sódico, en medio alcalino. La aparición de una coloración roja es indicativa de una reacción positiva. El
desarrollo de un color rojo marca la reacción positiva y se debe a la presencia del grupo guanidina, que caracteriza la
arginina.

℘ Prueba de Hopkin-Cole

Implica la reacción del grupo indol del triptofano con el ácido glioxílico y las proteínas que lo
contienen, en presencia de ácido sulfúrico concentrado. La positividad se reconoce por la
aparición de un anillo color violeta-rojizo.

℘ Prueba de Jaffé

Si acontece la aparición de una coloración roja, se tratará de una prueba positiva para la
creatinina. Puede ser leída a 520 nm, detectándose hasta 5 μg/mL.

℘ Prueba de coagulación:

Es una prueba para identificar: albúminas, globulinas, glutelinas y prolaminas. La positividad se manifiesta por la
formación de un coágulo. No se conoce exactamente el mecanismo de reacción, se cree que ocurre cierta
deshidratación de la molécula proteica.

℘ Prueba de Sulfato de amonio:

Las proteínas, como otros coloides son precipitadas por soluciones concentradas de sales de amonio [NaCl. (NH 4)2SO4
y NaSO4 ]. Aparentemente la precipitación se debe a la neutralización y deshidratación de la molécula, seguida de
agregación y precipitación.

℘ Reacción de Ehrlich

La presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena lateral de los Aminoácidos se puede identificar
mediante la reacción con ácido sulfanílico y nitrito de Sodio por formación de sales de Diazonio fuertemente coloreadas
permitiendo así detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o formando péptidos y proteínas.

℘ Reacción con acetato de Plomo alcalino

Los Aminoácidos azufrados como Metionina, Cisteina y Cistina se reconocen por la formación de
precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reacciona con Acetato de Plomo
en medio alcalino.

3
La mayoría de las especies animales tienen valores de proteína séricas de alrededor de 7.6 g por 100 ml. En general
aumenta cuando hay una ingesta disminuida de fluidos o cuando hay pérdida de líquidos (diarrea, vómitos, quemaduras,
etc.). Cuando los niveles disminuyen a 5.3 o menos se presenta edema inmediatamente. La disminución puede deberse
a muchas causas tales como excreción renal (albuminuria) o cuando la síntesis de proteína esta disminuida debido a la
desnutrición, deficiencia de vitaminas o enfermedades de las vías digestivas y del hígado.

Proteínas séricas

Son proteínas globulares que permanecen en el suero tras la acidificación de la leche a pH = 4,6 o por la acción del
cuajo, no interviniendo en la formación de la cuajada, razón por la que también se las denomina proteínas séricas. Y se
detectan en el suero de quesería una vez separado del gel por tecnologías clásicas.

La determinación de proteínas séricas en sangre sirve para confirmar desórdenes relacionados con la sangre, riñones,
enfermedades hepáticas, deficiencias proteicas, diagnóstico de tumores.

Valores normales:

 Proteínas totales 6.6 a 7.9g/dl


 Albúmina 3.3 a 4.5g/dl
 Alpha-1-globulina 0.1 a 0.4g/dl
 Alpha-2-globulina 0.5 a 1g/dl
 Beta globulina 0.7 a 1.2g/dl
 Gamma globulina 0.5 a 1.6g/dl

Valores aumentados: en enfermedades inflamatorias; enfermedades del colágeno; deshidratación; diabetes; acidosis
diabética; cirrosis; algunos linfomas; mieloma; enfermedad de Waldenstrom; Lupus eritematoso sistémico; algunas
enfermedades infecciosas; artritis reumatoidea; vómitos y/o diarrea.

Métodos de Determinación de proteínas séricas

Debido a que la albúmina sérica y por lo menos una pequeña fracción de las globulinas se sintetizan en el hígado, las
proteínas del suero son afectadas tanto cualitativa como cuantitativamente en los procedimientos hepáticos. En
cualquier enfermedad que ocasione alteraciones hepocelulares la concentración de seralbúmina estará disminuida. En
diversas hepatopatías las globulinas séricas pueden alcanzar niveles suficientes que basten para mantener la
concentración total de proteínas a niveles normales o elevados, aun en presencia de una notable reducción de la
albúmina.

Debido a estas causas, las cifras cambiantes de albúmina sérica proporcionan índices valiosos con respecto a la
severidad, evolución y pronóstico de las hepatopatías. Los niveles bajos de albúmina y levados de globulina en suero,
indican origen hepatocelular de la ictericia o de la hepatopatía. En la ictericia obstructiva, los cambios de las proteínas
del suero se presentan tardíamente, una vez que se han instalado las alteraciones hepatocelulares secundarias. Sin
embargo, la colangitis y la cirrosis biliar ocasionan alteraciones hepáticas que pueden no ser precedidas por
alteraciones en las proteínas. Más aun, las alteraciones de las proteínas séricas pueden volver a la normalidad antes de
que la convalecencia de la hepatitis se haya completado. La interpretación del significado de la determinación de las
proteínas séricas requiere, por lo tanto, un gran cuidado y criterio.

Las concentraciones séricas de proteínas totales, albúmina y globulina pueden determinarse químicamente. El
fraccionamiento por electroforesis proporciona una determinación más exacta de los componentes de las proteínas
séricas

Las proteínas normalmente difunden desde el plasma al LCR a través de la barrera sangre-LCR. La mayor parte de las
proteínas séricas se hallan en el LCR e incluyen el fibrinógeno y la lipoproteína beta en concentraciones bajas. Las
proporciones de concentración entre plasma y LCR se relacionan moderadamente bien con los radios hidrodinámicos, y
no tan bien con los pesos moleculares.

Métodos

Los métodos utilizados para medir las proteínas totales en el LCR pueden clasificarse en 6 categorías:

1. Procedimientos turbidimétricos
a) Ácido sulfosalicílico más sulfato sódico
b) Ácido tricloroacético (TCA)

4
2. Espectrofotometría ultravioleta a 210 mn después de:
a) Cromatografía en columna.
b) Ultrafiltración
3. Métodos de Lowry utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteau
a) Con blanco
b) Sin blanco
4. Procedimientos modificados del biuret con medición a 300 nm
5. Métodos inmunológicos.

En Estados Unidos se utilizan mucho los métodos turbidimétricos. Existe una relación lineal entre la turbiedad y la
temperatura, y es esencial en control exacto de esta última para obtener resultados reproducibles. El ácido sulfosalicílico
de mayor turbiedad con la albúmina que con las globulinas; sin embargo, las variaciones de la relación albúmina-
globulina no tienen efecto significativo sobre el método de SSA/SS (3% de ácido sulfosalicílico en 7% de sulfato sódico)
de Meulmans o el método del TCA de Meulmans (3% de ácido tricloroacético). Como consecuencia de las variaciones
de reactividad observadas con la albúmina y globulina, no debe utilizarse albúmina como estándar para los métodos
turbidimétricos. Las ventajas de estos métodos comprenden su sencillez y el hecho de que algunos medicamentos que
interfieren con los procedimientos de Lowry y del Biuret sin blanco no provocan turbiedad con el SSA o el ácido
tricloroacético (TCA). Las desventajas incluyen el hecho de que se necesitan aproximadamente 500 μl de LCR, en
comparación con 25 a 200 μl para los otros métodos, y la xantocromía y el metotrexato intratecal pueden provocar
interencias.

La espectrofotometría ultravioleta (UV) a 200 nm se basa en el principio de que las soluciones de proteínas muestran
una absorbancia intensa entre 210 y 220 nm, lo cual refleja la presencia del enlace peptídico. Las interferencias debidas
a los polipéptidos de cadena corta y a los fármacos pueden eliminarse por cromatografía de columna o con un blanco
preparado por ultrafiltración. Los trastornos de la relación albúmina-globulina no tienen efecto, puesto que la albúmina y
la globulina tienen absorbancia comparable a 210 nm. La espectrofotometría UV sólo requiere entre 100 y 200 μl de
LCR y la precisión parece ser algo superior a la de los métodos turbidimétricos. Por otra parte, requiere más tiempo y es
más difícil que estos métodos; el limite superior del intervalo de regencia por este método es algo mayor (60mg/dl) que
para otras técnicas, y no todos los laboratorios disponen de la instrumentación necesaria.

El método de Lowry con el reactivo de Folin-Ciocalteau se utiliza mucho en Europa. Este método comporta dos
reacciones: a) una reacción inicial de la proteína y el cobre, relacionada con la reacción del biuret; b) una segunda
reducción de los ácidos fosfotúngstico y fosfohemolíbdico con el complejo de cobre-proteína, así como con tiosina y
triptófano. El método de Lowry sólo precisa 100 a 200 μl de LCR. Sin embargo, es más prolongado y más difícil que los
métodos turbidimétricos, y está sujeto a interferencias variables derivadas de los fenoles y fármacos producidos
endógenamente (salicilatos, cloropromacina, tetraciclina y sulfamidas).

Varios autores entre ellos Burgi (1967) han descrito métodos de Biuret modificados. No obstante estos parecen menos
utilizados que los procedimientos turbidimétricos, la espectrofotometría UV o el método de Lowry. Solo se necesita de
100 a 200 μl de LCR. Los métodos del Biuret requieren más tiempo y son más difíciles que los turbidimétricos y están
sujetos a interferencias derivadas de los polipéptidos de cadena corta (las cuales pueden compensarse utilizando como
blanco un filtrado libre de proteínas).

Aunque sean descritos métodos de fijación de colorantes, la experiencia hasta la fecha parece limitada, en comparación
con otros métodos de proteínas de LCR, es una desventaja.

También se han descrito métodos inmunológicos para las proteínas totales de LCR. Una importante ventaja consiste en
que solo se necesita pequeñas cantidades de LCR ( 25 a 50 μl). Después de establecer las condiciones de reacción y
estandarizar los reactivos, la técnica es relativamente simple y comparable a los métodos turbidimétricos. Las
desventajas estriban en que diferentes proteínas pueden originar diversas curvas de precipitinas, así como distintas
respuestas de dispersión luminosa, cuando están ligadas a su anticuerpo específicos. Así mismo, puede producirse una
variación entre diferentes lotes de antisueros. Aunque los métodos inmunológicos ofrecen ventajas significativas para las
proteínas totales del LCR, su empleo más amplio exigirá mayor experiencia, así como antisueros fiables que reaccionen
de manera uniforme con todas las proteínas del LCR.

Albúmina

Es una proteína que se encuentra en gran abundancia en el plasma sanguíneo, siendo la principal proteína de la
sangre. Es sintetizada en el hígado. Son el 75% de las proteínas del suero y el 11% de las proteínas totales, solubles en
presencia de SO4Na2 al 20%. Hay 3 tipos: lactoglobulina , lactoálbumina y seroalbúminas .

Funciones de la albúmina

 Mantenimiento de la presión oncótica.


 Transporte de hormonas tiroideas.

5
 Transporte de hormonas liposolubles.
 Transporte de ácidos grasos libres. (Esto es, no esterificados)
 Transporte de bilirrubina no conjugada.
 Transporte de muchos fármacos y drogas.
 Unión competitiva con iones de calcio.
 Control del pH.
 Funciona como un transportador de la sangre y lo contiene el plasma

Causas de la deficiencia de albúmina

 Cirrosis hepática: Por disminución en su síntesis hepática.


 Desnutrición.
 Síndrome nefrótico: Por aumento en su excreción.
 Trastornos intestinales: Pérdida en la absorción de aminoácidos durante la digestión y pérdida por las diarreas.
 Enfermedades genéticas que provocan hipoalbuminemia, que son muy raras.

Tipos de albúmina

 Seroalbúmina: Es la proteína del suero sanguíneo.


 Ovoalbúmina: Es la albúmina de la clara del huevo.
 Lactoalbúmina: Es la albúmina de la leche.

La albúmina en estudio de sangre

La albúmina es la proteína más abundante del plasma sanguíneo. Sirve como deposito móvil de aminoácidos. Los
aumentos de albúmina se relacionan casi siempre con deshidratación que produce el consecuente aumento en el
contenido proteico del plasma.

Propósito de la prueba: Proteína útil en él diagnostico de insuficiencia hepática, deshidratación aguda, pérdida de
proteínas. Es un buen marcador para detectar el déficit nutricional crónico. Daño o infección renal cuando está presente
en la orina. Diversas patologías cuando está aumentada en líquido cefalorraquídeo.
Confiabilidad de la prueba: Altamente confiable.
Tiempo insumido al paciente: 10 minutos si el estudio se hace en sangre. Si el estudio se efectúa en LCR el paciente
deberá estar internado en reposo por algunas horas luego de la punción lumbar.
Preparación del paciente: Preferentemente no consumir antes de la prueba drogas que puedan modificar el aumento de
la albúmina como por ejemplo: esteroides anabólicos, corticoesteroides, hormona de crecimiento e insulina.
Tiempo necesario para obtener los resultados: Entre 24 y 48 horas después de realizada la prueba.
Método utilizado para obtener los resultados: espectrofotometría.
Valores Normales:
Suero: 3-5 gr / 100ml
Orina: menor de 10 mg/l
LCR: 10-30 mg / dl.
Valores aumentados: Proteinuria glomerular, quiluria,deshidratación.
Valores disminuidos: Quemaduras, síndrome nefrótico, enfermedad de Cushing, malabsorción, obstrucción intestinal,
enfermedad hepática difusa (cirrosis, hepatitis crónica activa), fiebre reumática, malnutrición, ascitis, analbuminemia.

MATERIAL

2 Vasos de precipitados de 100 ml


1 Probeta de 100 ml
2 Pipetas de 5 ml
1 Pipeta 1ml
1 pipeta 0.1ml
Gradilla para tubos
5 Celdas para espectrofotómetro
1 Termómetro
1 Matraz aforado de 100 ml
10 Tubos de ensaye de 18x150
Piseta

6
Vidrio de reloj
Hisopos
Torundas con alcohol
Propipeta
Agitador de vidrio
Espátula
2 Tubos vacutainer sin anticoagulante

SUSTANCIAS:

Sulfato cuprico
Tartrato de potasio y sodio
Hidróxido de sodio
Yoduro de potasio
Albúmina de suero
Hidróxido de potasio
Reactivo de Biuret
Suero

EQUIPO:

Balanza analítica
Espectrofotómetro
Baño de temperatura controlada
Equipo vacutainer
Parrilla de calentamiento y agitación
Centrifuga

PROCEDIMIENTO

 Realizar una solución estándar de albúmina al 5%


 Agregar una solución de KOH al 10% (Si no se disuelve la proteína, agregar más KOH)
 Correr la curva estándar con el estándar de proteína como sigue:

Sln. Estándar de proteína Agua destilada Reactivo de Biuret


Densidad óptica
(ml) (ml) (ml)
0.1 0.9 4.0 0.240
0.2 0.8 4.0 0.244
0.3 0.7 4.0 0.247
0.4 0.6 4.0 0.250
0.5 0.5 4.0 0.255
0.7 0.3 4.0 0.268

 Incubar todos los tubos a 37°C por 30 min. Transferir a celdas de espectrofotómetro y leer a 540 nm. Trazar la curva
estándar tomando en cuenta que la concentración en proteína es de 0.002, 0.004, 0.006, 0.008, 0.010 y 0.014 g
para los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, respectivamente. De la pendiente de la curva.
 Para las muestras 1 y 2, con el equipo vacutainer tomar una muestra de sangre de dos
personas, colocar cada una en un tubo para la centrifuga para separar el paquete
globular (en la parte de arriba se observara el suero).
 Muestra 1 y 2: (Todas las determinaciones deben hacerse por duplicado) En un tubo de
ensaye medir:
0.9 ml e agua destilada
4.0 ml de reactivo de Biuret
0.1ml de suero
 Correr un blanco usando 0.1 ml de agua destilada en vez del suero muestra y las
mismas cantidades de agua destilada y reactivo de biuret que para las muestras.
 Incubar todos los tubos a 37 °C durante 30 min. Transferir a celdas del
espectrofotómetro y leer a 540nm usando el blanco como referencia.

Cálculos:

7
Calcular para cada tubo problema la concentración, extrapolando en la curva estándar la densidad de cada tubo.
Concentración en g X 100 = gramos de proteína por 100 ml de suero
ml de suero

Graficar densidad óptica (y) vs concentración (x)

RESULTADOS

Sujeto Densidad óptica Concentración en proteínas séricas Conc. En


(A) (gramos de proteína por 100 ml de g/dl.
suero)
Silvia 0.242 0.03 3
Miria 0.250 0.08 8
m

CONCENTRACIÓN EN PROTEÍNAS SÉRICAS

0.28
0.27
Densidad óptica

0.26
0.25
0.24
0.23
0.22
0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.014
Concentración en proteína

Serie1 Regresión lineal

0.003 g
Concentración silvia = × 100 = 0.03 g . proteína / 100ml.suero
0.1ml
0.008 g
Conc.Miriam = = 0.08 g. proteína / 100ml.suero
0.1ml

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

 Se realizó la determinación de proteínas séricas (en este caso de albúmina sérica) en el suero de 2 personas por
medio del método de Biuret, con el cual se hace una reacción en la cual aquellas sustancias cuyas moléculas
contienen dos grupos carbamino (-CO.NH) unidos directamente o a través de un solo átomo de carbono o nitrógeno
como la albúmina al formarse un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ (ya que el Biuret contiene Cu2SO4
en solución acuosa alcalina ) y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces
peptídicos, lo que provoca un cambio de coloración: violeta rosado ya que el color depende de la naturaleza de las
proteínas; proteínas y péptidos dan un color rosado.
 Se realizó la curva de calibración por medio de una solución estándar de albúmina al 5% y a través de la densidad
óptica dada, se hizo una interpolación para las 2 muestras problemas de suero, en la que Silvia presentó una
densidad óptica de 0.242 y Miriam de 0.250, lo que nos dio una concentración en proteínas séricas de 0.003g y
0.008g respectivamente. Se realizaron los cálculos y se determinó que para Silvia la concentración fue de 0.03g de
proteína por 100ml de suero y para Miriam de 0.08g de proteína por 100ml de suero.
 Ya que los valores conocidos internacionalmente se dan en g/dl, se realizó la conversión dándonos que para Silvia
fue de 3 g/dl y para Miriam de 8 g/dl. Dado que los valores normales de proteína sérica totales en un adulto sano
van de 6.0-8.5 g/dl., aunque de albúmina sérica únicamente van de 3.5g/100ml, entonces se puede deducir que
Miriam se encuentra dentro del rango normal, por lo que se podría decir que se encuentra saludable en este
aspecto, mientras que Silvia, quien obtuvo un valor bajo en esta determinación total, se podría decir que las causas
serían por desnutrición o trastornos intestinales por pérdida en la absorción de aminoácidos durante la digestión, ya

8
que estas son algunas de las principales causas de la deficiencia de proteínas séricas, sin embargo en cuanto a la
albúmina únicamente, se podría decir que en este caso Silvia se encuentra dentro de los rangos normales y Miriam
se encuentra con un alto contenido de estas proteínas, lo que se relaciona con deshidratación que produce el
consecuente aumento en el contenido proteico del plasma, lo que puede llevar a la deducción de una posible
insuficiencia hepática por deshidratación aguda y por lo tanto, pérdida de proteínas, así como para detectar el déficit
nutricional crónico.

CONCLUSIONES

La determinación de proteínas séricas es importante para un análisis bioquímico en la sangre ya que, si esta se
encuentra en cantidades elevadas o muy disminuidas podemos decir que existe un problema bioquímico en el
organismo.

La cantidad de albúmina sérica es de 3-5 g/kg de peso corporal encontrándose mas 50 por 100 fuera del espacio
vascular, para lo cual se hizo una curva de valoración y se efectuaron mediciones de soluciones problema por método
espectrofotométrico (biuret) ;las cuales se compararon con los datos normales.

REFERENCIAS:

℘ Ville, C. A.: Proteínas. En: Biología. 6ª ED. Interamericana, México, 1974. 31-33.
℘ Cabanes J (1988): Propiedades químicas y separación de los aminoácidos. En Lozano JA, Tudela J (eds):
“Prácticas de Bioquímica. Experimentación y Simulación”, 1ª Ed. Editorial Síntesis (Madrid, España), . 87–92.
℘ http://www.pucmmsti.edu.do/ (7/09/07:12:52a.m.)
℘ http://www.buenasalud.com/lib/showdoc.cfm?libdocid=3486&returncatid=1914
℘ Manual de Diagnostico Clínico y de Laboratorio. Marcus a. Krupp. Pag: 223.
℘ Diagnostico y Tratamiento Clínicos por el Laboratorio. John Bernard Henry. Pag: 633-634.