PROTOCOLO DE CITOGENTICA CULTIVO DE LINFOCITOS DE SANGRE PERIFRICA

SIEMBRA

Para cada examen se realizan dos cultivos paralelos, uno corriente (C) y otro sincronizado (S). Previamente, depositar 5 mL de medio de cultivo ( PERIPHERAL BLOOD KARYOTIPING MEDIUM) en tubos de centrfuga de 10 mL. En cada uno de los tubos de cultivo se siembra una cantidad de sangre total de la siguiente forma: 0,5 mL de sangre en adulto. 0,4 mL de sangre en nios. 0,3 mL de sangre en recin nacidos. 1 mL de sangre en mujeres gestando y en posparto.

CULTIVO Una vez sembrada la sangre en cada tubo, se inician los cultivos en estufa a 37C de la siguiente forma: Cultivo corriente 0 hrs: Siembra. 48 hrs: 50 uL de Timidina 10-1 M. 1 hr y media antes de cosecha: 25 uL Colcemid (1ug/mL). 72 hrs: Inicio de cosecha

Cultivo sincronizado

0 Hrs: Siembra. 48 hrs: 50 uL MTX. 5 hrs previo a la cosecha: 75 uL Timidina 10-3 M. 15 minutos antes de cosecha: 25 uL Colcemid (1ug/mL). 72 hrs: Inicio de cosecha.

COSECHA Antes de iniciar la cosecha, durante el tiempo que acta el Colcemid, se debe preparar una solucin de KCl 0,075 M y dejarla a 37Cen espera de la etapa de hipotona. Al finalizar el tiempo de cultivo (72 hrs) se debe centrifugar cada tubo a 1000 rpm por 10 minutos. Eliminar sobrenadante (SN), agitar pellet con vrtex y hacer hipotona agregando 10 mL de KCl 0,075 M (preparado anteriormente). Dejar por 15 minutos a 37C en bao Mara. Mientras se realiza la hipotona, preparar fijador de Metanol- cido actico en proporcin 3:1. Preparar aprx. 40 Ml por cada tubo de cultivo. Detener la hipotona agregando 1 Ml de fijador a cada tubo (a T ambiente). Luego, voltear cada tubo para asegurarse de que el fijador se mezcla con toda la muestra. Dejar el resto del fijador en el freezer. Centrifugar a 1000 rpm durante 10 minutos. Eliminar SN, agitar el pellet con vortex y agregar fijador fro hasta un volumen de 10 mL por tubo. dejar las muestras en el refrigerador por 20 minutos.