Contenido La Célula Seceién I. Introduccién L._Visin global de la célula ¢ investigacién celular 3 ‘© ORIGEN Y EVOLUCION DE LAS CELULAS) 4 Tar primer esl 7 Evolucién del metabolismo Procariotas actuales 5 Células eucariotas 9 Desarrollo de organismos multicelulares iH © CELULAS COMO MODELOS EXPERIMENTALES, 15 E, colr Levaduras, Dictyostelium discoideum Drosophila melanogaster 8 Arabidopsis thaliana Is rebraslos Is # INSTRUMENTOS DE LA BIOLOGIA CELULAR 20 Microscopia optica Microscopia eleetsénica acin subeclalar 10 de las edlulas animales en eultivo Cultivo de eélulas vegetales Virus EXPERIMENTO CLAVE: Cultivo celular animal MeDicins MOLECULAR: Virus y eiincer 2. Quimica celular aT + COMPOSICION MOLECULAR DE_LAS CELULAS, au TabaRTTTOR ss Lipids ha Acids nucleons ‘8 Proteinase 50 = PAPEL CENTRAL DE LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES BIOLOGICOS. 56 Actividad eaalzara Te Tk THT ¢ Mecansmos de cailissencimstic 8 Coensimas ai Requlacin de la sotivida envimitiea 41 * ENERGIA METABOLICA, 63 Tera bre y ATT Ts Gencracd de ATP a p. 6 Prodcidn de enersia parr de oras molgeulas orginicas n Fotosinesis e = BIOSINTESIS DE LOS COMPONENTES CELULARES 7 DOTS Lipids 75 Protsinas 76 Actos nucleicos 7» = MEMBRANAS CELULARES iw Tipo de mena Proteins de membrana acontenido Transporte a través de membranas celulares ExpERIMENTO CLAVE: Plegamiento de las cadenas polipeptidicas MEDICINA MOLECULAR: Fenileelonucia 3. Fundamentos de biologia molecular Bo + HERENCIA, GENES V ADN %9 ‘Genes y cromosomas m0 Genes enzims “1 Identiicaciin del ADN como el material genético 93 Estructura del ADN 98 Replicaciin del ADN 95 '* EXPRESION DE LA INFORMACION GENETICA, 96 Colinealidad de genes y proteinas 77 Papel del ARN mensajro 9% Cdigo genético %9 Virus ARN y transcripsin invee 100 [+ ADN RECOMBINANTE 103] Endonucleasas de restriccian TOs Generaciin de molgeulas de ADN recombinante \07 Vectoces para el ADN recombinante 108 Seeuenciacién de ADN ut Expresion de genes clonados Te Amplificacion de ADN com la reac en cadena dela polimerasa us = DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS Y PROTEINAS, 7 TTradacrin de acidor micsicos 7 Deteccion de pequetias camtidades de ADN 0 ARN por PCR 19 Sons de aiouerpos para proteinas 19 Sond de busqueda en biblioteca de ADN recombinante 21 > EUNCION DE LOS GENES EN EUCARIOTAS Anilisis genético en levaduras Transferencia de genes en plantas y animales Mutagénesis de ADN clonados Introduccién de mutaciones en genes celulares 128, Exreeimento cLave: Hipdtesis de provirus de ADN 102 Mepieina mocecutar: VIH y sida 105 Seccion II. Flujo de la informacién genética +. Organizacion y secuenciacton de Tox genomas celulares + COMPLEJIDAD DE LOS GENOMAS DE EUCARIOTAS Trivanes y exones Secuencias de ADN repettivas éniea y pseudogenes Duplicacion Composicién del genoma en los eucariotas superiores = CROMOSOMASY CROMATING Toman Centrémeros Telémeros CUENCIAS DE LOS GENOMAS COMPL TENOHTAS FOCATIOTAS T El genoma de levaduras. locontenido Los zenomas de Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster ‘Genomas de plantas. Genoma humane SNPERIMENTO CLAV Descubrimiento de los intrones, non 5. Replicacién, mantenimiento y reorganizacién del ADN gendmico 163 165 Is7 2 170 ‘* REPLICACION DEL ADN 19 ADN povimerasas 180 Horquila de replieacién 182 Fidelidad de replicacin 188 COrigenes ¢inicacin dela replicaciin 19 elomeros y telomeras: replicacion de los extremos de los cromosomus 191 ~ REPARACION DELADN TE Tnversion directa del ADN datado Tar Reparacidn por escsion 196 Reparaciin propensa al error 201 Reparacidn recombinatoria 202 [ RECOMBINACION ENTRE SECUENCIAS HOMOLOGAS DE ADN 208 Laas moléculas de ADN se recombinan mediante roturas y uniones 30 Modelos de recombinacién homloga 207 209 Enzimas implicadas en lp recombinscién homologs ‘+ REORGANIZACION DEL ADN Recombinacidn espectfiea de sitio ‘Transposicién via intermediarios de ADN Transposicion via intermediarios de ARN Amplificacién génica MEDICINA MOLECULAR: Cancer de colon y reparacién det ADN ExprRivENTO CLAVE: Reorganizacion de los genes de inmunoglok 6. Sintesis y maduracién del ARN # TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS, ARN polimerisr y WaTNCApCION Control negativo de la transeripeidn y represores Control positive de la transeripeién ARN POLIMPRASAS EUCARIOTICASY FACTORES DI TRANSCRIPCION GENERATES ARN polimienisis eucarioricas Factores de transcripeidn generales ¢ iniciacién de la transeripeién por la ARN polimerasa I Transcripcién por las ARN polimerasas I y IIL = REGULACION DE LA TRANSCRIPCION EN EUCARTOTAS: ulacion en cis: promorores y estimuladores Proteinas de regulacién transeripeional Estructura y funcién de los activadores de la transcripeion Represores eucaridticos Relacion entre Ia estructura cromatiniea y la transeripcidn Regulacion de la transcripcién por ARNS no codificantes Metilacion del ADN ‘= MADURACION Y RENOVACION DEL ARN Maduracidn de Tos ARNs ribosomieos y de transTerencia Maduracidn del ARNm en cucariot Mecanismos de corte y empalme o splicing, Corte y empalme alternative Correccidn del ARNcontenido Degradacién del ARN 24 EXPERIMENTO CLAVE: Aislamiento de un factor de transeripeién eu 251 EXPERIMENTO CLAVE: Descubrimignto del RNPsi 268 intesis de proteinas, procesamiento y regulacién # TRADUCCION DEL ARNM. 281 ARN de transferencia TT Ribosoma 283 ‘Organizacién de los ARNm mensajeros ¢ inicio de la traduccion, 289 Mecanismo de la traduceidn 201 Regulacidn de la traduccion 206 = PLEGAMIENTO ¥ PROCESAMIENTO DE PROTRINAS 298 ‘Chaperonas y plogamiento-de proveinas Enzimas y plegamiento de proteinas Escisidn de proteinas Glicosilacién, Anclaje de lipidos ‘> REGULACION DE LA FUNCION DE LAS PROTEINAS 307 Reegulacion por pequchas molecuTas Fostorilacién de proteinas Interaceiones proteinaeproteina = DEGRADACION DE PROTFINAS Ta de Te ubiquitina-proveasoma Protedlisis lisasémica EXPERIMENTO CLAVE: Papel catalitico del ARN ribos6mico MEDiciNs MOLECULAR: Antibidticos y sintesis de proteinas Seccién III. Estructura y funcién celulares 8. Micleo 323 # ENVUELTA NUCLEAR Y TRAFICO ENTRE EL NUCLEO Y EL CITOPLASMA..-- 323 Estructura do la cmvuctia nuclear Complejo del poro nuclear ‘Transporte selective de proteinas desde Regulacién del transporte de proteinas al nicleo Transporte de ARNS @ ORGANIZACION INTERNA DEL NUCLEO Tomosomas y estructura de OTGen superior de Ta CrOwaTna Dominios funcionales en el interior del nucleo. = NUCTEOLO, ‘Genes de ARN ribosomico y organizacion de Transeripeidn y procesamiento del ARNr Ensamblaje de ribosomas ‘* EL NUCLEO DURANTE LA MITOSIS ‘Disgregucion de la-envuelta nuclear Condensacién de los eromosomas nucleolo Reorganizacidn del nicleo interfasico Exprrimenro c1ave: Mentificacion de las sefiales de localizacién nuclear. Mrpicina MOLECULAR: Enfermedades de la limmina nuclearcontenido 9. Distribucién y transporte de proteinas: Reticulo endoplismico, aparato dé Golgi y lixosomas + RETICULO ENDOPLASMICO Reticulo endoplismico y seerecion de proteinas Mareaje de las proteinas para dirigirse al reticulo endoplismico Inserei6n de la proteinas en la membrana del RE Plegamiento y procesamiento de las proteinas en el RE RE liso y sintesis de lipidos Exportacion de proteinas y lipidas desde cl RE [APARATO DE GOLG Organizacion del Golet Glicosilacidn de proteinas en el Golgi Metabolismo de lipids y de polisacirides en el Golgi Distribueién y exportacién de proteinas desde el aparato de Golei [} MECANISMO DE TRANSPORTE DE LAS VESICULAS Aproximaciones experimentales al conocimiento del transporte de fas vesiculas ‘cin de la mereancia, proteinas de revestimiento y gemacién de vesiculas Fusian de las vesiculas = LISOSOMAS Hidrolasas lisosomicas acidas Endocitosis y formacién det lisosoma Fagocitosis ¥ autofagi Exren Mepicrns, IENTO CLAVE: Hipdtesis de la seal CULAR: Enfermedad de Gaucher 10. Bioenergética y metabolismo: Mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas 399 + MITOCONDRIAS 309 ‘Onsanizacion y funcion de Tas mitocondrias 00 Sistema genético de las mitocondrias sol Internalizavién de proteinas y formacién de las mitocondrias 403 ‘+ MECANISMO DE LA FOSFORILACION OXIDATIVA 08 Cadena de transporte de electrones a8 Acoplamiento quimiosmético 410 Transporte de metabolitosa traves de la membrana interna 44 = CLOROPLASTOS V OTROS PLASTIDOS a5 Tstruetura y Tuncion de Tos coropTastos oT Genoma del cloroplasto 417 Interalizacion y distribucion de las proteinas del cloroplasto ag Otros plistidos 420 = FOTOSINTESIS cn Flujo de electrones Waves de Tos TorostsTeMaR TV TT 3 Flujo ciclion de eleetrones 425 Sintesis de ATP 426 = PEROXISOMAS, 6 Famnerones de Tos peroxtsomay IZ 229 Formacién del peroxisoma MEpicins MOLECULAR: Enfermedades de las mitocondrias: neuropatia Gptica hereditaria de Leber 406 Exrrnimeto ¢LavF: Teoria quimiosmotica 412 11. Citoesqueleto y movimiento celular BS ‘+ ESTRUCTURA Y ORGANIZACION DE LOS FILAMENTOS DE ACTINA 438 Tnsamblaje y desensamblaje de Tos Tlamentos de actina Th xicontenido nizacén de los filamentos de aetina 440 Asociacién de los filamentos de atina con la membrana plasmitica 4a Protuberancias de It superficie celle 45 [2XCTINA MIOSINA Y MOVIMIENTO CEEUTARE HT] Contraccin mise a7 Asociaciones contrctiles de actina y miosina en células no musculares 351 “Miosomas no convencionales 433 Migracion y arasire celular a4 = FILAMENTOS INTERMEDIOS 455 Proteinas de fos Mlamentorintermediow 35 Ensamblaje de los filaments intermedios 56 Onganizacion inracclular de Tos filamentosintermedios 437 Funciones de las queratinas y neutofiamientos: enfermedades de la piel y sistema nervioso 459 = MICROTUBULOS ar Taructura, ensamblaje e mestbiidad dinamica de Tos mictouabulos Tar Centrosoma, centiolosy orgaizacion de los microtibulos 464 Reorganizacin de los microtibulos durante fa mitosis 366 Estabilzaciin de los microtbuls y poaridad celular 467 [= MOTORES MICROTUBULARES ¥ MOVIMIENTOS 5] Tdentifcacion de las proteinas motores mierotubulares Tar Transporte de orginules y organizacinintacelular an Senaracidn de Tos eromosomas mitéicos a7 Cilios y Nagetos an Exprnivento cLavet La expresion de una gueratina mutante causa un desarrollo andmao de a piel 460 Expenivurvro craves Aislamiento de la quiesina 370 a 12. Superficie celular 483 “+ ESTRUCTURA DF LA MEMBRANA PLASMATICA 483. ‘Bicapa Tipiica aa Proteinas de membrana 486 Mowilidad de fas proteinas de Ia membrana 490 Giicocti an = TRANSPORTE DE MOLFECULAS PEOUFNAS, Ditusin paste pr Difusinfaciltada y proteinas transportadoras 494 496 Transporte activo dirigido por la hidrdtisis de ATP 503 Transporc ative driido por gradi 507 + ENDOCITOSIS 508 TFagocitosis. 7 tosis mediada por receptor sil Tritico de proteinas en la endocitosis 515 = PAREDES CELULARESY MATRIZ EXTRAC Paredes colulares acter Paredes celulares vegetales Matriz extracelular ‘= INTERACCIONES CRLULA-CELULA Proteinas de adhesion celular Unio Uniones de tipo gap. Adhesion de las eélulas vegetales y plasmodesmos Mrpicina MOLECULAR: Fibrosis quist Exrerimento cave: Receptor de las LDL TARcontenido Seccién IV. Regulacion celular ializacibn por Notch IZADORAS Y SUS RECEPTORES 541 alizacton eelala-eal 3 Hormonas esteroideas y superfamilia de receptores de esteroides 543 Oxido nitrico y mondxide de carbono 545 Neurotransmisores 546 Hormonas peptidicas y Factores de crecimiento 546 icosanoiies Sas Hormonas vegciales 9 FUNCIONES DF. LOS RECEPTORES DE LA SUPERFICIE CELULAR. 350 Receprores asociados a provers 331 Receptores proteina-titosina quinasa 553 Receptores dle citoquinas ¥ proteina-tirosina quinasas no reeeptoras 557 Receptores asociados a otras actividades enzimiticas 557 VIAS DE-TRANSDUCCION INTRACELULAR DE SENALES 558 Via del AMPc: segundos mensajeros y fosforlacion de profeinas 359 GMP ciclico 561 Fosfolipidos y Ca2¥ 502 Ras, Rat y via de las MAP quinasas 565 Via JAK/STAT 570 TRANSDUCCION DE SENALES ¥ CITOESQUELETO =] Tntcgrinas y transduvcein de sefales 377 Rogulacién del citoesqueleto de actina 574 SENALIZACION EN EL DESARROLLO ¥ EN LA DIFERENCIACION 35 Via del receptor tirosina quinasa/Ras/Rat ERK en Drosophila y en C. elezans 3S Hedgchog y W ee Se 578 14. Ciclo celular REGULACION DE LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA, ‘Caspasas ¥ apoptosis 380 Receptores implicados en la muerte celular y la activacién de las easpasas 582 582 Sefalizacion de la supervivencia celular XPERIMENTO CLAVE: Proteina-tirosina quinasa Sre MEbicins MOLECULAR Cancer, transduccién de sefales y oncogenes ras ICLO CE so ses del cielo celular Sor Regulacin del ciclo celular por el crecimiento celular y por scfalesextracclulares sos Pantos de control del ciclo celui 506 Restrngir ba repicaciin del ADN a una ver por ciclo celular 598 = REGULADORES DE LA PROGRESION DEL CICLO CELULAR, 599 MPF: an dimero de Ce2y eclina So Familias de eicinas y quinasas dependientes de cicinas 03 Factores de erecimicntoy cielinas de tipo D «0s Inhbidores de ta progresién del ciclo cela 606 (=S0csos pra SE am] tapas de Tr mitosis am MPF y peogresin a a maf on Proteolisis einactivac telofase 613contenido Citocinesis an ‘© MEIOSIS ¥ FECUNDACION ots: Procesa de Ta cians ory Regulacisn de ka meiosis en los oocitos ols. Fecundacin 20 ‘+ CELULAS MADRE Y MANTENIMIENTO DE TEJIDOS ADULTOS et PROTTETRCTOW Ce Tas CTU THTETETCTAS Células madre Aplicaciones médicas de las células madre 624 EXPERIMENO CLAVE: Descubrimiento del MPF 600) MrpiciNa MOLECULAR: Cultivo de eélulas madre embrionarias 622 Tipos de cancer oT Desarrollo del céneer 633 ‘ausas del cdncer 634 Propiedades de las células cancerosas 636 Transformacién de las células en cultiva 640, ‘= VIRUS TUMORALES. a0. Virus de la hepatitis By C eal SV40 y poliomavirus, oa Papilomavirus 62 Adenovirus 683 Herpesvirus 643 Rotrovirus an ‘* ONCOGENES, at ‘Oncogencs retroviricos os Proto-oncogenes. 646 LLos oncogenes en el cdneer en el hombre 649 Funciones de los productos oncogénicos 633 * GENES SUPRESORES DE TUMORES 657 THRenUTIcacTon de Tos genes SUPICSOTES Ue TUMORS oS Funciones de los productos de los genes supresores de tumores 661 Papel de los oncogenes y de los genes supresores de tumores en el desarrollo del tumor 663 + APLICACIONES DE LA BIOLOGIA MOLECULAR PARA LA PREVENCION Y EL TRATAMIENTO DEL CANCER 664 Prevencion y deteccion precoz 6 Diagnéstico molecular 665 Tratamiento 6566 Experisteyro cLave: Descubrimiento de los proto- 648 MEDICIN\ MOLECULAR: STI-S71; Tratamiento del cincer dirigido contra el oncogén ber/abl 667 Respuestas a las cuestiones Glosario.Organizacion y caracteristicas de La Célula La Célla ha sido disefiado para ser un texto de ficil comprensién y ensefianza que puede set cubierto en un solo semestre, a la vez que permite a los estudiantes dominar el material de todo el libro. Damos por hecho que se poseen ciertos conocimientos generales de biologia y quimica aunque no supo- ica, bioquimica 0 biologia molecular. Muchos aspec~ 1s del libro nos ayudaran a acerearnos a la materia, Organizacion La Célula se divide en cuatro partes, cada una de ellas es independiente, por lo que el orden y los temas pueden variar ficilmente segin las necesidades de cada curso. La seceiéin / del libro aborda los origenes de la evolucién de tas cétulas, sus métodos de estudio, su composicién quimica y los findamentos de la biologia molecular moderna, Para aquellos estudiantes, que tengan una gran formacién en cursos de introduccién a la biologia 0 en cursos previos de biologia lat, pueden obviar varias partes de este libro o pueden usarlas de repaso, La seecidn Ise centra en la biologia molecular de las células asi como en la organi 6n de fragmentos de ADN, trascripeiin del ARN; y sintesis, procesos y regulacién de proteinas. Los capitulos estin ordenados siguiendo el mismo orden de wcidn y secuen- ccias del genoma; duplicacion, reparacién y combinak la informacién genética (ADN -» ARN ~* proteina) y proporciona un coneiso pero actual campo de vision de estas materias. La seccidn II analiza ta estructura y funcionamie icleo, organulos citoplasmiti~ 0s, citoesqueleto y superficie celular. Esta parte del libro comienza adaptando lo mencionado en la see cién II sobre biologia molecular a las eélulas eucaristicas y continiia a través de los orgiinulos del cito- plasma y citoesqueleto hasta la membrana plasmética, Sin embargo, estos capitulos son relativamente independientes y pueden textarse en distinto orden, sezan sean mas apropiados para un curso en concre to. Finalm nte, la seceidin IV comprende los mecanismos de regulacion de las actividades de la célu- la, tratando temas como los estimulos celulares, el ciclo de la eélula y la muerte controlada de células. Esta cuarta parte coneluye con un capitulo sobre el cai scuencias de los fallos de weer que sintetiza las los mecanismos bisicos de funcionamiento de las e¢lulOrganizacion y caracteristicas de La Célula Caracteristicas Para ayudar a los estudiantes a dominar ¢ integrar los contenido de La Célula, se han incorporado varias caracteristicas que se han organizado para guiar a los estudiantes en el trato eon este libro de la siguiente manera: Organizacién de capitulos, Cada capitulo se divide en cuatro o cinco secciones principales, las cua- les estin a su vez divididas en un niimero similar de apartados. Un esquema de las secciones principales al principio de cada capitulo muestra de modo rapido Ia organizacion de cada uno de ellos, Términos claves y glosario. Los términos claves aparecen en negrita a lo largo del capitulo, ademas dde enunciarse en el sumario y definirse en el glosario de final del libro. Iustraciones y microforografias. Se ha desarrollado cuidadosamente un completo programa de ilus- tracién a todo color y de microfotografias para complementar y reforzar visualmente el texto. Experimentos y ensayos de medicina molecular. Cada capitulo contiene dos Experimentos clave © ‘un Experimento clave y caracteristicas de Medi al lector en las bases experimentales de la eélula y la biologia molecular y sus aplicaciones a la medicina 1a molecular, Est practicas tienen por objeto el instruir moderna, Las pricticas también pueden utilizarse como bases itiles para discusiones de estudiantes, que pueden acompafiarse con una revisién del texto original sobre el que se basan los Experimentos clave, Resumen de capitulo. El sumario esta organizado a modo de esquema, que correspond a las suce- sivas div y apartados de cada capitulo. Este formato se acompafia de una lista con los jones en secciones ‘términos claves, proporcionando asi un conciso repaso del mater Preguntas y respuestas. Una extensa bateria de preguntas al final de cada capitulo (con las res puestas al Final del libro) tienen como propésito facilitar la revision del material de cada capitulo y animar aterial para predecir o interpretar los resultados experiments alos estudiantes a usar dicho n lo permiten el acceso rapido a las as bibliogrifieas del final de cada cay Bibliosgrafia ‘paginas correspondientes del libro, Para ayudar a identificar articulos de interés, las referencias estin orga nizadas de acuerdo con las secciones de los capitulos. Los articulos de interés y las paginas importantes se identifican con las iniciales [R] y [P] respectivamente. viLa CélulaSeccién I Introduccion 1 Visién global de la célula e investigacion celular 2 Quimica celular 3 Fundamentos de biologia molecularOrigen y evolucién de las células 4 Células como modelos experimentales 15, Instrumentos de la biologia celular 20, EXPEAIMENTO CLAVE: Cultvo celular animal 32 Mepicina mouccuLan: Vitus y cancer 35 cuyo entendimiento es fundamental para todas las ciencias biolégicas. Esto es cierto no sdlo desde el punto de partida de la ciencia basica, sino también respecto a un niimero creciente de aplicaciones practicas en agricultu- ra, biotecnologia y medicina. Especialmente tras haber completado la secuen: cia del genoma humano, el progreso de la biologia celular y molecular esta abriendo nuevos horizontes en la préctica médica. Ejemplos llamativos inoluyen 1 desarrollo de nuevos férmacos especialmente disefiados para interferir con el crecimiento de células cancerosas y con el uso potencial de células madre para sustituir tejidos dafiados y tratar pacientes que padecen condiciones como la diabetes, enfermedad de Parkinson, de Alzheimer, lesiones de la médula espi- nal y enfermedades cardiacas, Dado que la biologia celular y molecular es un campo de investigacién de rapido crecimiento, este capitulo se centrara en cémo se estudian las células, asi como serviré para revisar sus propiedades basicas. La apreciacion de las similitudes y diferencias entre las células resulta particularmente importante para entender la biologia celular. La primera seccién de este capitulo por lo tanto discutira la unidad y la diversidad de las células presentes hoy en dia en términos de su evolucién desde un ancestro comin. Por otra parte, todas las células comparten propiedades fundamentales que se han conservado a través de la evolucién. Por ejemplo, todas las células utiizan ADN como material ge- nético, estén rodeadas por una membrana piasmatica y usan los mismos meca- nismos basicos para el metabolismo energético. Por otro lado, las células ac- tuales han evolucionado en diferentes estilos de vida. Muchos organismos, como las bacterias, amebas y levaduras, se componen de céiulas Unicas capa- ces de autorreplicarse independientemente. Los organismos mas complejos estén compuestos por una coleccién de células que funcionan de manera coor dinada, con diferentes células especializadas para desartollar funciones part culares. El cuerpo humano, por ejemplo, esté compuesto de mas de 200 tipos diferentes de células, cada una de ellas especializada para cada funcién distint- va como la memoria, la vista, el movimiento, o la digestién. La diversidad exhibi- da por los diferentes tipos de células es sorprendente; por ejemplo, considere- mos las diferencias entre las bacterias y las células del cerebro humano. Las similtudes fundamentales entre los diferentes tipos de células proporcio- nan un marco comiin paral la biologia celular, permitiendo que los principios basi- cos aprendidos a partir de experimentos con un solo tipo de célula puedan ser extrapolados y generalizados a otros tipos de células. Diversos tipos de células y organismos son extensamente utlizados para estudiar los diferentes aspectos de la biologia celular y molecular; la segunda seccién de este capitulo ciscute algu- nas de las propiedades de estas oélulas que las hacen partcularmente valiosas 3 | BIOLOGIA MOLEGULAR DE LAS GELULAS es un area de investigacion activa4 @ Seccidn | * Introduccion como modelos experimentales. Finalmente, es importante reconocer que el pro- reso de la biologia celular depende también de los instrumentos experimentales que permiten a los cientificos hacer nuevas observaciones o desarrollar experi- mentos novedosos. Este capitulo de presentacién concluye por tanto con una discusién acerca de algunos experimentos utilizados para el estudio de las célu- las, a la vez que resume algunos de los descubrimientos hist6ricos que han lleva- do a nuestro conocimiento actual sobre la estructura de la célula y su funcion. Origen y evolucién de las células Las células se dividen en dos clases principales, inicialmente definidas segiin donde situaran al nucleo. Las eélulas procariotas (bacterias) carecen de en- voltura nuclear; las ¢élulas eucariotas presentan un niicleo donde el material genético esta separado del citoplasma. Las oélulas procariotas son general- mente mas pequefias y simples que las células eucariotas: ademas de la ausencia de nucleo, sus genomas son menos complejos y no contienen organu- los citoplasmaticos o citoesqueleto (Tabla 1.1), Al margen de estas diferencias, los mismos mecanismos moleculares basicos gobiernan las vidas de procario- tas y eucariotas, indicando que todas las células presentes hoy descienden de un ancestro primordial nico. ,Cémo se desarrollé la primera célula? g¥ como evolucionaron la complejidad y la diversidad que exhiben las células actuales? La primera célula Parece ser que la vida emergié hace, al menos, 3.800 millones de afios, aproxi- madamente 750 millones de afios después de que se formara La Tierra (Fig. 1.1). Como se origind la vida y cémo la primera célula se convirtié en un ser son cuestiones de especulacién, puesto que estos acontecimientos no pueden re- producirse en el laboratorio. No obstante, diferentes tipos de experimentos han proporcionado evidencias importantes sobre algunos pasos del proceso. En 1920 se sugirié por primera vez que moléculas orgénicas simples po- drian polimerizar espontaneamente y formar macromoléculas bajo las condicio- nes que se pensaba que existian en la atmésfera primitiva. En el momento en el que surgié la vida, la atmésfera de La Tierra se piensa que contenia poco 0 nada oxigeno libre, constando principalmente de CO. y N. ademas de peque- ‘tas cantidades de gases como H.,H,, y CO. Tal atmésfera proporciona condi ciones reductoras en las que las moléculas organicas, con una fuente de ener- {gia como la luz solar o descargas eléctricas, se pueden formar esponténeamente, La formacién espontanea de las moléculas organicas {ue demostrada por pri- mera vez experimentalmente en los afios 50, cuando Stanley Miller (un estu- diante graduado en aquel entonces) demostrd que la descarga de chispas eléc- tricas en una mezcla de H,, CH,, y NH,, en presencia de agua, conducia a la formacién de una variedad de moléculas organicas, incluyendo varios aminoa- cidos (Fig. 1.2). Aunque el experiment de Miller no reprodujo con precision las Caracteristicas Procariota Eucariota Nucloo Ausonto Presente Didmetro de una eélula pica 1 um 10-100 jm Gitoesqueleto| ‘Ausonte Presente Crgénulos ctoplasmétices ——_Ausentes Presentes Contenido de ADN (pares do 1 x 1085 x 108 15% 10725 x10? bases) (Cromosomas Una molécula de ADN Multiples motéculas de ADN ‘creulae linearCapitulo 1 * Visién global de la célula e investigacién celular @ 5 Pree ose S 100 ete = i t t Ciera é eo sae § 3.000 Fosintesis Pier cl 4.000 bec! 4.000 Foul dT 000 condiciones primitivas de La Tierra, claramente demostré la plausibilidad de la sintesis espontanea de las moléculas organicas, proporcionando los materiales basicos desde donde surgieron los primeros organismos vives. El siguiente paso en la evolucién fue la formacion de las macromoléculas, ‘Se ha demostrado que los bloques monomeéricos que constituyen las macromo- léculas se polimerizan espontaneamente bajo condiciones prebidticas plausi- bles. El calentamiento de mezclas secas de aminoacidos, por ejemplo, da como resultado su polimerizacién para formar polipéptidos. Pero la caracteristica fun- damental de la macromolécula de ia que surgio la vida debe tener la habilidad de replicarse por si misma. Solamente una macromolécula capaz de dirigir la sinte- sis de nuevas copias de si misma seria capaz de reproducirse y evolucionar. De las dos clases principales de macromoléculas que aportan informacion en las células actuales (acidos nucleicos y proteinas), solo los acidos nucleicos son capaces de dirigir su propia replicacién. Los acidos nucleicos pueden servir Figura 1.2 Formacién espontinea de las moléculas organicas. El vapor de agua se expulsaba a una atmésfera que consistia en CH,. NH, y H., en la que se descargaban chispas de ‘electricidad. El anilisis de los productos de la reaccion revelo ia formacion de varias molé~ culas organicas, incluyendo los aminodcidos alanina, acido aspartico, acido glutamico y glicina, Figura 1.4 Escala temporal de la evolucién. La escala indica e! momento aproximado en {1 que ocurrieron algunos de los acontec mientos més importantes en la evolucion de las células. fenirainto -— Motécuias orgsnicas arin Acido aspirico Acido gltémico lina Urea Acida\dctco — Acido acéteo ~Aeido térmico6 @ Seccidn | * Introduccion Figura 1.3 ‘Autorreplicacion propia del ARN. Las parejas complementarias entre los nu Cledtidos (adenina [A] con uracilo [U] y ‘quanina [G] con citosina {Cl} permiten ‘que una hebra de ARN sirva como molde para la sintesis de una nueva hebra con la Secuencia complementaria, Figura 1.4 Recubrimiento del ARN do cacién con una membrana de fosfoli dos. Se cree que la primera célula surgio dol recubrimiento del ARN autorreplicante y sus molaculas asociadas por una mem- brana compuesta de fosfolipidos. Cada rmolécula de fosfolipidos presenta dos lar- ‘92S Colas hidroldbieas unidas a un grupo hidrolfico, Las colas hidrofébicas estan ‘embebidas en la bicapa lipidica; las cabe- 22a8 hidrofilias estan expuestas al agua a ‘ambos lados de la membrana como molde para su propia sintesis como resultado del apareamiento de ba- ses especificas entre nuclestidos complementarios (Fig. 1.3). Uno de los pasos criticos en el aprendizaje de la evolucién molecular ocurris a principios de los afios 80, cuando se descubrié en los laboratorios de Sid Altman y Tom Cech que el ARN es capaz de catalizar numerosas reacciones quimicas, incluyendo la polimerizacién de nuclestidos. El ARN es, por tanto, el Unico capaz de servir como molde y catalizar su propia replicacién. Como consecuencia, se cree que el ARN ha sido el sistema genético inicial, y que una etapa temprana de la evolucién quimica estuvo basada en moléculas de ARN con replicacién propia —un periodo de la evolucién conocido como el mundo del ARN—. Las interao- ciones en orden entre el ARN y los aminodcidos evolucionaron a lo que hoy es el cédigo genético, y eventualmente el ADN reemplazé al ARN como el material genético La primera célula, se presupone, que surgié de la envoltura del ARN de replicaci6n propia en una membrana compuesta por fosfolipides (Fig. 1.4). Tal y como se discutira en detalle en el préximo capitulo, los fosfolipidos son los componentes basicos de todas las membranas bioligicas presentes hoy dia, incluyendo la membrana plasmatica de células procariotas y eucariotas. La ca- racteristica clave de los fosfolipidos que forman las membranas es que son moléculas anfipaticas, lo que quiere decir que una porcién de Ia molécula es soluble en agua y la otra porcién no. Los fosfolipidos presentan largas cadenas hidrocarbonadas insolubles en agua (hidrofébicas) unidas a grupos solubles Membrana de fostolipidosCapitulo 1 * Visién global de la célulae investigacion celular @ 7 en agua (hidrofilicos) que contienen fosfatos. En contacto con el agua, los {osfolipidos espontaneamente se agrupan en una bicapa con los grupos que contienen fosfatos en el exterior en contacto con el agua y sus colas hidrocarbo- nadas en el interior en contacto unas con otras. Esta bicapa fosfolipidica forma una barrera estable entre dos compartimentos acuosos —por ejemplo, sepa- rando el interior de la célula de su ambiente externo— La envoltura del ARN autorreplicantey las moléculas asociadas a una mem- bana lipidica se han mantenido, por tanto, como una unidad, capaz de reprodu- cirse a si misma y evolucionar. La sintesis de proteinas a partir del ARN pudo ya haber evolucionado, en cuyo caso la primera célula consistiria en un ARN de replicacién propia y sus proteinas codificadas. Evolucién del metabolismo Debido a que las células se originaron en un mar de moléculas organicas, éstas eran capaces de obtener alimentoy energia directamente de su ambiente. Pero Una situacién como ésta es limitada en si misma, por lo que las células necesi taron evolucionar sus propios mecanismos de creacién de energia y sintetizar las moléculas necesarias para su replicacion. La creacién y la utlizacién contro- lada de la energia metabélica es primordial para todas las actividades celulares, yy los procesos principales de metabolismo energético (discutidos en detalle en el Cap. 2) se han conservado practicamente intactos en las células actuales. Todas las células utilizan adenosina 5'-trifosfato (ATP) como fuente de ener- gia metabolica para llevar a cabo la sintesis de los constituyentes celulares y conducir otras actividades que requieren energia, como el movimiento (p. ej. la contraccién muscular). Los mecanismos utilizados por las células para generar ATP han evolucionado en tres etapas, correspondientes a la evolucién de la glicolisis, fotosintesis y metabolismo oxidativo (Fig. 1.5). El desarrollo de estos procesos metabélicos cambié la atméstera de la Tierra, en consecuencia alte- rando el curso de la evolucién. En la atmésfera anaerobia inicial de la Tierra, las primeras reacciones gene- radoras de energia presumiblemente implicaron la escision de moléculas orga- nicas en ausencia de oxigeno, Estas reacciones parecen ser una forma de la actual glicolisis —la rotura anaerobia de la glucosa a acido lactico, con la ga- nancia neta de energia de dos moléculas de ATP. Ademas de utilizar ATP como su fuente de energia quimica intracelular, todas las células actuales llevan a cabo la glicolisis, de acuerdo con la idea de que estas reacciones surgieron muy pronto en la evolucién, La glcolisis proporcioné un mecanismo mediante el cual la energia en molé- culas organicas ya formadas (p. ¢j., Ja glucosa) podia convertirse en ATP, que ar ea Ras * Figura 1.5 ee % Fe a de merle mele ns 660, + 6H,0 (GxBBY + co, Cosa en dcido lactico. La fotosintesis util dala energia del sol para conducla sin- fesis de la glucosa a partir del CO, y cl 110, liborando ©, coro producto. EI, ee eae, liberado por la fotosintesis !o utiliza el (BEY +00, ———r 600, + eno rd metabolsmo oxidative, en el que la gu- Cosa se rompe en CO. y H.0, liberanco ae mucha mas energia que la obtenida de la gledisie8 @ Seccidn | * Introduccion Figura 1.6 Microgratia electronica de E. coll. La ‘ceiula esta rodeada por una pared colviar dentro de la que se encuentra la membra- ‘na plasmatica. El ADN se encuentra en el rnucleoide. (Menge and. Wurtz/Biozen- trum, University of BaselScience Photo Library/Photo Researchers, Inc.) plastica Pare collar podia ser utilizado como fuente de energia para dirigir otras reacciones metabo: licas. El desarrollo de la fotosintesis fue el siguiente paso mas importante de la evolucién, que permitié a la oélula generar energia a partir de la luz solar y ser independientes de la utilizacién de las moléculas organicas ya existentes. La primera bacteria fotosintética, que evoluciond hace mas de 3 billones de aos, probablemente utilizaba H.S para convertir CO, en moléculas organicas —to- davia algunas bacterias utilizan un proceso de fotosintesis similar. La utilizacion de H,O como donante de electrones e hidrégeno para la conversion del CO, a compuestos organicos evolucioné mas tarde y tuvo la importante consecuencia de cambiarla atméstera de la Tierra. El uso de H,O en reacciones fotosintéticas produce O, libre; se cree que este mecanismo ha sido el responsable de hacer a la atmésfera de la Tierra tan abundante en O>. La liberacién de ©, como consecuencia de la fotosintesis cambio el medio en el que las células evolucionaron y se cree que determind el desarrollo de! metabolismo oxidativo. Altemativamente, ei metabolismo oxidative podria ha- ber evolucionado antes que la fotosintesis, y el aumento del O, atmosférico proporcionaria una importante ventaja selectiva a los organismos capaces de utilizar O, en las reacciones de generacion de energia. En cualquier caso, el O, es una molécula altamente reactiva, y e| metabolismo oxidativo, usando esta reactividad, ha proporcionado un mecanismo de generacidn de energia a partir de moléculas organicas mucho més eficiente que la glicolisis anaerobia. Por ejemplo, la rotura oxidativa completa de la glucosa en CO, y H,0 produce energia equivalente a 36 6 38 moléculas de ATP, en comparacién con las 2 moléculas de ATP que se forman en la glcolisis anaerobia. Con pocas excep: ciones, las células actuales utilizan reacciones oxidativas como fuente princi- pal de energ} Procariotas actuales Los procariotas actuales, que incluyen todos os tipos de bacterias, estan dividi- dos en dos grupos —las arquebacterias y las eubacterias— que se diferen- ciaron al principio de la evolucién. Algunas arquebacterias viven en condiciones extremas, que hoy en dia son inusuales pero que pudieron prevalecer en la primitiva Tierra. Por ejemplo, los termoacidsfilos viven en pozos calientes de sulfuro con temperaturas hasta de 80 ‘C y valores de pH de 2. Las eubacterias incluyenlas formas comunes que estan presentes en nuestros dias —un amplio grupo de organismos que viven en una gran variedad de ambientes, como la tierra, el agua, y otros organismos (p. e., los patogenos humanos). La mayoria de las células bacterianas son estéricas, en forma de bastén, 0 espiral, con diametros que oscilan de 1 a 10 um. Su contenido de ADN varia desde unos 0,6 millones a5 millones de pares de bases, cantidad suticiente para codificar unas 5.000 proteinas diferentes. Los procariotas mas grandes y com- plejos son las cianobacterias, bacterias en las que evolucioné la fotosintesis. La estructura de célula procariota tipica es la de Escherichia coli (E. coll), un habitante comin del tracto intestinal humano (Fig. 1.6). La célula tiene forma de bast6n, alrededor de 1 j1m de didmetro y cerca de 2 um de longitud. Como la mayoria de los otros procariotas, E. coli esta rodeada por una pared celular bacteriana rigida compuesta de polisacaridos y péptidos. Dentro de la pared celular se encuentra la membrana plasmatica, que es una bicapa de fosfolipi- dos y proteinas asociadas. Mientras que la pared celular es porosa y puede ser penetrada por una variedad de moléculas, la membrana plasmatica proporciona tuna separacién funcional entre el interior de la eélula y su medio externo. El ADN de E. coties una molécula circular Unica en el nucleoide, que, en compara- cidn con el nucleo de los eucariotas, no esta rodeado por una membrana que lo separe del citoplasma. El citoplasma contiene aproximadamente 30.000 ribo- ‘somas (ugar de la sintesis de proteinas), que destacan por su apatiencia gra- ular.Capitulo 1 * Vision global de la célula e investigacion celular @ 9 Células eucariotas Como las células procariotas, todas las células eucariotas estan rodeadas por ‘membranas plasméticas y contienen ribosomas. No obstante, las células euca- riotas son mucho mas complejas y contienen un nucleo, variedad de orgdnulos citoplasmaticos, y un citoesqueleto (Fig. 1.7). El organulo mas grande y promi- nente de las células eucariotas es el nticleo, con un diametro aproximado de 5 jum. El nticleo contiene la informacién genética de la célula, que en los eucario- tas se encuentra organizada de forma linear en lugar de moléculas de ADN Circular. El nucleo es el sitio de la replicacion del ADN y de la sintesis del ARN; Ia tradueci6n del ARN en proteinas tiene lugar en los ribosomas del citoplasma. ‘Ademas de un nlicleo, las células eucariotas contienen una variedad de or- ganulos delimitados por membranas dentro del citoplasma. Estos organulos proporcionan diferentes compartimentos en los que se localizan las distintas actividades metabdlicas. Las células eucarioticas son por lo general mas gran- des que as células procariotas, con frecuencia presentando un volumen celular cien veces mayor. La compartimentalizacion proporcionada por los organulos citoplasmaticos es lo que permite a las células eucariotas tuncionar con eficien- cia, Dos de estos orgénulos, las mitocondrias y los cloroplastos, juegan pa- peles imprescindibles en el metabolismo energético, Las mitocondrias, que se encuentran en casi todas las células eucariotas, son los centros del metabolis- mo oxidativo y son por tanto las responsables de generar la mayoria del ATP derivado de la rotura de moléculas orgdnicas. Los cloroplastos son los centros donde se lleva a cabo la fotosintesis y se encuentran exclusivamente en las células de las plantas y algas verdes. Los lisosomas y los peroxisomas tam- bien proporcionan compartimentos metabélicos especializados para la diges- tidn de macromoléculas y varias reacciones oxidativas, respectivamente. Ade- mas, la mayoria de las células de las plantas contienen grandes vacuolas que desarrollan variedad de funciones, incluyendo la digestion de macromoléculas y el almacenaje de productos de desecho y nutrientes. Debido al tamaho y complejidad de as células eucariotas, el transporte de protainas a sus destinos dentro de la célula es una labor formidable, Dos orga- rulos citoplasmaticos, el reticulo endoplasmitico y el aparato de Golgi, es- tan especificamente dedicados a la diferenciacién y transporte de las proteinas destinadas a la secrecin, a la incorporacién en la membrana plasmatica, y a la incorporacién en los lisosomas. El reticulo endoplasmatico es una red extensa de membranas intracelulares, que se extienden desde la membrana nuclear hasta atravesar todo el citoplasma. No solo acta en el proceso y transporte de proteinas, sino también en la sintesis de lipidos. Desde el reticulo endoplasma- tico, las proteinas son transportadas dentro de pequenias vesiculas al aparato de Golgi, donde siguen siendo procesadas y clasificadas para el transporte a sus destinos finales. Ademas de esta funcion de transporte de proteinas, el aparato de Golgi presenta sintesis de lipidos y (en células de las plantas) sinte- sis de algunos polisacciridos que componen la pared celular. Las células eucariotas tienen otro nivel de organizacién interna: el citoes- queleto, una red de filamentos proteinicos que se extienden por el citoplasma. El citoesqueleto proporciona el marco estructural de la célula, determinando la forma celular y la organizacion general del citoplasma, Ademas, el citoesquele- to es responsable de los movimientos de todas las células (por ej., la contrac cién de las células musculares), del transporte intracelular y la posicion de los organulos y otras estructuras, incluyendo los movimientos de los cromosomas durante la division celular. Los eucariotas se desarrollaron hace al menos 2.700 millones de afios, des- pués de 1.000 6 1.500 millones de aiios de la evolucién procariota. Los estudios de sus secuencias de ADN indican que las arquebacterias y eubacterias son tan diferentes entre si como lo son de los eucariotas actuales. Por lo tanto, parece ser que un acontecimiento en la primera etapa de la evolucién ha sido el motivo10 © Seccion| * Introduccion Figura 1.7 Estructuras de las células animales y vegetales. Las céiulas animales y vege- tales estan rodeadas por una membrana plasmatica y contienen un nucleo, un ci toesqueleto, y muchos orgénulos citoplas- maticos an comin. Las células vegetales también estan rodeadas por una pared celular y contianen cloroplastos y vacuo- las grandes. A i de la divergencia de tres lineas de descendencia a partir de un antepasado comin, dando lugar a las actuales arquebacterias, eubacterias, y eucariotas. Resulta interesante que muchos genes de las arquebacterias son mas simila- res @ los de los eucariotas que a los de las eubacterias, indicando que las arquebacterias y los eucariotas comparten una linea comun de descendencia evolutiva y que estan mas estrechamente relacionados entre ellos que con las eubacterias (Fig. 1.8). Un paso critico en la evolucion de las células eucariotas fue la adquisicion de la envoltura membranosa de los orgénulos subcelulares, permitiendo el desa- rrollo de la complejidad caracteristica de estas oélulas. Estos organulos se cree ‘que han sido adquiridos como resultado de la asociacién de células procariotas con el antepasado de los eucariotas. La hipétesis de que las células eucariotas evolucionaron a partir de una aso- ciacién simbiotica de las procariotas —endosimbiosis— se sustenta con los estudios de las mitocondrias y los cloroplastos, los cuales se cree que han evo- lucionado desde bacterias que vivian en células grandes. Las mitocondrias y los cloroplastos tienen un tamafio similar al de las bacterias, y como ellas, se repro- ducen mediante su escisién bipartita. Lo mas importante, es que las mitocon- Arias y los cloroplastos contienen su propio ADN, que codifica algunos de sus ‘componentes. El ADN de las mitocondrias y cloroplastos se replica cada vez que el organulo se divide, y los genes que contiene se transcriben dentro del orgainulo y se traducen en los ribosomas de este. Por lo tanto, las mitocondrias y los cloroplastos contienen sus propios sistemas genéticos, que son diferentesCapitulo 1 * Vision global de la célulae investigacion celular @ 11 F893 Oras CCancbacterias eubacteras ——Plantas n Wy Animales (levaduras) Protas Arquebactoras Cloroasios Figura 1.8 Evolucién de las células. Las oélulas actuales evolucionaron desde un antepa- ‘sado procariota comon a tres largas li- rneas de descendencia, dando lugar a las larqueobacterias, eubacterias, y eucano- tas. Las mitocondrias y los cloropiastos tuvieron su origen en la asociacion sim- bidtica entre las bacterias aerobias y las ianobactorias, respectivament, con los ancestros de las eucariotas. tocondias12 @ Seccién| * Introduccion TABLA 1.2. Contenido de ADN enlas células ‘Contenido de ADN. haploide (millones Organismo ‘de pares de bases) Bacterias ‘Mycoplasma 06 Ecol 48 Eucariotas unicelulares ‘Saccharomyces (lovaduras) Dictyastelum 7 ‘discoideum Euglena 3.000 Plantas Arabidopsis 125 thaliana Zea mais (maiz) 5.000 ‘Animales Cavnorhabettis 7 elegans (nomatodo) Drosophita 180 ‘melanogaster (mosca de la frst) Palio 1.200 Pez cobra 1,700 Raton 3.000 Humano 3.000 Figura 1.10 Microgratia éptica de Amoeba pro- teus. (M. |. Walker! Photo Researchers, Inc.) Figura 1.9 Microgratia electronica de barrido de Saccharomyces cerevisiae. Micogratia con color artificial. (Andrew Syed:Sciene Photo Library Photo Researchers, Inc dol genoma nuclear de la célula, Ademas, los ribosomas y los ARN ribosémicos de estos organulos estan mas relacionados con los bacterianos que aquellos codificados por los genomas nucleares de los eucariotas, En general, se ha aceptado un origen endosimbidtico de estos organulos, suponiendo que la mitocondria ha evolucionado a partir de las bacterias aero- bias y los cloroplastos de las bacterias fotosintéticas, como las cianobacterias. La adquisicién de bacterias aerobias podria provenir de una célula aerobia con la habilidad de llevar a cabo un metabolismo oxidativo, La adquisicién de bacte- rias fotosintéticas podria provenir de la independencia nutricional conseguida al desarrollar la fotosintesis. Por tanto, estas asociaciones endosimbicticas resulta- ron muy beneficiosas para sus asociados, que fueron seleccionados en el curso de la evolucién. A través del tiempo, la mayoria de los genes originalmente pre- sentes en estas bacterias en apariencia pasaron a incorporarse dentro del geno- ma nuclear de la célula, asi que solamente algunos componentes de las mitocon- Grias y cloroplastos siguen siendo codificados por los genomas de los organulos. anismos multicelulares Desarrollo de org Muchos eucariotas son organismos unicelulares que, como las bacterias, se ‘componen de células tnicas capaces de su propia replicacidn. Los eucariotas mas simples son las levaduras, Las levaduras son mas complejas que las bac terias, pero mucho mas pequenias y simples que las células animales o vegeta- les. Por ejemplo, la levadura hasta ahora mas estudiada Saccharomyces cere- visiae tiene un didmetro aproximado de 6 sim y contiene 12 millones de pares de bases de ADN (Fig. 1.9). Sin embargo, otros eucariotas unicelulares son células ‘mucho mas complejas, algunas contienen tanto ADN como el que contienen las células humanas (Tabla 1.2). Estos incluyen organismos especializados para de- sarrollar gran variedad de funciones, incluyendo la fotosintesis, el movimiento, y la captura e ingestién de otros organismos como alimento. La Amoaba proteus, por ejemplo, es una célula grande y compleja. Su volumen es 100.000 veces ‘mayor que el de E. coll, y su longitud puede sobrepasar 1 mm cuando la célula esta completamente extendida (Fig. 1.10). Las amebas son organismos muy méviles que utilizan extensiones citoplasmaticas, lamadas pseudopodia 0 pseudépodos, para moverse y envolver a otros organismos, incluyendo bacteCapitulo 1 © Vision global de la célula e investigacion celular @ 13 rias y levaduras, como alimento. Otros eucariotas unicelulares (las algas ver- des} contionen cloroplasios y son capaces de llevar a cabo la fotosintesis. ‘Los organismos multicelulares evolucionaron de los eucaritas unicelulares hace al menos 1.700 millones de afios. Algunos eucariotas unicelulares forman agregados multicelulares que parecen representar una transicién evolutiva des- de una tinica célula a un organismo multicelular. Por ejemplo, las células de muchas algas (por ej., el alga verde Volvox) se asocian unas con otras para formar colonias multicelulares (Fig. 1.11), las cuales se cree que son los precur- sores evolutivos de las plantas actuales. El aumento de la especializacion celu- lar determino la transicion de las colonias agregadas a los verdaderos organis- mos multicelulares. La continua especializacién y la division de las funciones entre las células de un organismo ha proporcionado la complejidad y diversidad observada en los muchos tipos de células que componen las plantas y animales de hoy, incluyendo a los seres humanos. Las plantas se componen de menos tipos de oélulas que los animales, pero cada tipo diferente de célula vegetal esta especializada para desarrollar funcio- nes especificas requeridas por el organismo en su conjunto (Fig. 1.12). Las células vegetales estan organizadas en tres sistemas de tejidos principales tejido basal, tide dérmico, y tejide vascular. El tejido basal contiene a las eélu- las del parénquima, que lleva a cabo la mayoria de las reacciones metabdlicas Figura 1.12 Microgratias épticas de células vegetales representativas. (A) Céluias del parénqui- rma, responsables de la fotosintesis y de otras reacciones metabolvas. (B) Células del co- lenquima, especializadas para dar soporte y endurecer las paredes celviares. (C) Células fepidermicas en la superficie de una hoja. (D) Los elementos de los vasos y las traqueidas ‘son células alargadas que se d'sponen entrentadas para formar los vasos del xilema. (A, Jack M, Bastsack/Visuals Uniimited: 8, A. J. KarpottVisuals Unimited; C, Alfred Owezarzak/ Biological Photo Service: D, Biophoto Associates/Scionce Source/Photo researchers Inc.) “ ® Figura 1.11 Alga verde colonial. Las células indi duales de Volvox forman colonias que consisten en esferas huecas en las que estan embebidas en una masa gelatinosa Cientos 0 miles de células. (Cabisco/Vi- ‘uals Unlimited.)14_@ Secciénl * Introduccién (Aj Boca Figura 1.13, IMicrogratias 6pticas de células anima- les representativas. (A) Células epitelia- ies dea boca (una lamina multstratiica- da gruesa), conducto bila, @intestno. (8) Los fibroblastos son células dal tejdo co- nectivo caracterizadas por su forma de huso alargado, (©) Erivocitas, granuloa tos, lnfoctos, y moneestos en sangre Mu= mana. ((A)y (Ali, G.W. Wilisiological Photo Service; (A)iii, Biophoto Associate- iPhoto Researchers, Inc: B, Don W. FawcetvVisvals Unlimited: G, G. W Wil Biological Photo Service | de la planta, incluyendo la fotosintesis. El tejido basal también contiene dos tipos de células especializadas (células del colénquima y células del escle- rénquima) que se caracterizan por paredes celulares gruesas y por proporcio- nar el soporte estructural de la planta. El tejido dérmico cubre la superficie de la planta y est compuesto por células epidérmicas, que forman un revestimien- to de proteccién y permiten la absorcidn de nutrientes. Finalmente, el sistema vascular (el xilema y floema) esta tormado por diversos tipos de células alarga- das, y es el responsable del transporte de agua y nutrientes a través de la planta, Las células presentes en animales son considerablemente mas diversas, que las de las plantas. El cuerpo humano, por ejemplo, esta compuesto por mas de 200 tipos de células diferentes, consideradas generalmente como compo- entes de los cinco tipos principales de tejidos: tejido epitelial, tejido conectivo, sangre, tejido nervioso, y tejido muscular (Fig. 1.13). Las células epiteliales forman laminas que cubren la superficie del cuerpo y delimitan los érganos in- (A) Conduct bar (A Intestino © nigCapitulo 1 * Visién global de la célulae investigacién celular @ 15 temos. Existen muchos tipos diferentes de células epiteliales, cada una espe- cializada para una funcién especifica, incluyendo proteccién (la piel), absorcion (por ¢j., las células del intestino delgado), y secrecién (por ej., células de la glandula salivar). El tejido conectivo incluye hueso, cartilago ¥ tejido adiposo, cada uno de los cuales esta formado por diferentes tipos de células (osteoblas- tos, condrocitos, y adipocitos, respectivamente). El tejido conestivo suelto que delimita con las capas epiteliales y rellena los espacios entre los drganos y tejidos del cuerpo esta formado por otra tipo de células, los fibroblastos. La sangre contiene diferentes tipos de células, que funcionan en el transporte del oxigeno (gl6bulos rojos, o eritrocitos), reacciones inflamatorias (granulocitos, monocitos, y macréfagos), y la respuesta inmune (linfocitos). El tejido ner- vioso esta formado por células nerviosas, 0 neuronas, que estan altamente especializadas en la trasmision de sefiales a través del cuerpo. Varios tipos de células sensoriales, como las células del ojo y el ofdo, estan atin mas especial: zadas en la recepcién de senales del ambiente. Finalmente, diferentes tipos de células musculares son responsables de la produccién de fuerza y movimiento. La evolucién de los animales claramente implica el desarrollo de una diversidad y especializacién considerable a nivel celular. Entender los mecanismos que controlan el crecimiento y diferenciacién de estas células tan complejas y espe- cializadas, desde la fertilizacién de un solo huevo, es uno de los mayores desa- fios de la biolog(a celular y molecular contemporanea Células como modelos experimentales La evolucién de las células actuales a partir de su antepasado comin tiene impor- tantes implicaciones para la biologia celular y molecular como ciencia experimen- tal. Debido a que las propiedades fundamentales de todas las células se han conservado durante la evolucién, los principios basicos obtenidos de los experi- mentos desarrollados con un solo tipo de oélula son generalmente aplicables a otras eélulas. Por otra parte, debido a la dversidad de las ceiulas actuales, muchos de los experimentos son mas faciles de llevar acabo con un tipo de células en lugar de otras. Se utizan diferentes tipos de cétuias y organismos como modelos experi- mentales para estudiar diversos aspectos de la biologia celular y molecular. Las caracteristicas de algunas de estas células que resultan particularmente venta- josas como modelos experimentales se discuten en las siguientes secciones, E, coli Debido a la simplicidad de su comparativa, las células procariotas (bacterias) son los modelos ideales para el estudio de los aspectos fundamentales de la biologia molecular y la bioquimica. La especie de bacterias mejor estudiada es E. coli, que ha sido el organismo por excelencia en la investigacién de los meca- nismos bésicos de la genética molecular. La mayoria de los conceptos actuales de la biologia molecular —incluyendo nuestra comprensién sobre la replicacién del ADN, el cédigo genético, la expresién génica y la sintesis de proteinas— derivan de los estudios sobre esta humilde bacteria. E. coli ha resultado especialmente itil para los biélogos moleculares debido a su rolativa simplicidad y la faclidad para propagarse y ser estudiada en el laborato- fio. El genoma de E. coli, por ejemplo, consiste en aproximadamente 4,6 millones de pares de bases y contiene aproximadamente unos 4.000 genes. El genoma humano es casi mil veces mayor (aproximadamente 3 billones de pares de bases) y/se cree que contiene 30-40,000 genes (véase Tabla 1.2). El tamafio pequefio del genoma de E. col (que se secuencié por completo en 1997) proporciona claras \entajas para el analisis genético. Los experimentos genéticos moleculares se ven facilitados por el répido creci- miento de E. colibajo condiciones de laboratorio predeterminadas. Bajo condicio- nes 6ptimas de cultivo, E, colise divide cada 20 minutos. Ademés, una poblacién16 @ Seccién| * Introduccién a Figura 1.14 Colonias de bacterias. Fotografia de Colonias de E. colicreciendo en ia superfi- ie de un medio de agar. (A. M. Siegel mar/Visuals Unlimited.) Figura 1.15 Microgratia electronica de Saccha- romyces cerevisiae. (David Schart/Pe- ter Amold, Inc.) clénica de E. coli, en la que todas las céluias se derivan de la division de una tinica célula original, se puede aislar facilmente como una colonia en crecimiento en un medio que contenga agar semisdlido (Fig. 1.14). Debido a que las colonias bacterianas que contienen mas de 10° células se pueden desarrollar en una no- che, la seleccion de variantes genéticas de una cepa de E. coli —por ejemplo, mutantes que son resistentes a un antibidtico, como la penicilina— es facil y rapida. La facilidad con la que estos mutantes pueden ser seleccionados y lizados result clave para el éxito de los experimentos que definen los principios basicos de la genética molecular, discutidos en el Capitulo 3, Las mezclas nuttitivas en las que E. colise divide mas rapidamente incluyen glucosa, sales, y varios compuestos organicos, tales como aminodcidos, vitami- nas, y precursores de dcidos nucleicos. No obstante, E. coii también puede crecer en un medio mucho mas simple que contenga solamente sales, una fuente de nitrégeno (como el amoniaco), y una fuente de carbén y energia (como la glucosa). En este medio, la bactoria crece un poco mas lenta (con un tiempo de divisién de unos 40 minutos) ya que tiene que sintetizar todos sus aminoacidos, nuclestidos, y otros compuestos organicos. La habilidad de E. coli para llevar a cabo estas reacciones biosintéticas en un medio simple ha hecho que sea extremadamente titi para el descubrimiento de los procesos bioquimi cos implicados. Por tanto, el rapido crecimiento y los simples requisitos nutricio- nales de E. coli han taciitado los experimentos fundamentales de la biologia molecular y la bioquimica. Levaduras ‘Aunque las bacterias han sido un modelo de valor incalculable para el estudio de muchas de las propiedades conservadas de las oélulas, éstas obviamente no pueden ser utilizadas para estudiar aspectos de la estructura y funcion celu- lares que son tinicos de eucariotas. Las levaduras, los eucariotas mas simples, aportan numerosas ventajas experimentales similares a las de E. coli. En con- secuencia, las levaduras han proporcionado un modelo crucial para el estudio de muchos de los aspectos fundamentales de la biologia celular eucariota. El genoma de la levadura que con mas frecuencia se ha estudiado, Saccha- romyces cerevisiae, consiste en 12 millones de pares de bases de ADN y con- tiene alrededor de 6.000 genes. Aunque el genoma de las levaduras es aproxi- madamente tres veces mayor que el de E. coli, resulta mas manejable que los genomas de eucariotas mas complejos, como el de los humanos. Incluso en su simplicidad, la célula de levadura exhibe las caracteristicas tipicas de las célu- las eucariotas (Fig. 1.15): Contiene un nicleo distinto rodeado por una membra- na nuclear, su ADN genémico esta organizado en 16 cromosomas lineales, y su citoplasma contiene un citoesqueleto y orgdnulos subcelulares. Las levaduras pueden crecer con facilidad en el laboratorio y pueden ser estudiadas bajo muchos de los mismos protocolos genéticos moleculares que han resultado satisfactorios con E. coli. Aunque las levaduras no se replican tan rapido como las bacterias, se dividen cada 2 horas y pueden crecer facilmente dando lugar a colonias a partir de una sola célula. Las levaduras se pueden utilizar en variedad de manipulaciones genéticas similares a aquellas que se pueden realizar utilizando bacterias. Estas caracteristicas han hecho a las levaduras las células eucariotas mas accesibles desde el punto de vista de la biologia molecular. Las levaduras mutan- tes han resultado importantes para la comprensién de muchos procesos funda~ mentales en eucariotas, incluyendo la replicacién del ADN, transcripcién, proce- samiento del ARN, ensamblaje de proteinas, y la regulacién de la division celular, tal y como discutiremos en capitulos siguientes. La unidad de la biologia celular molecular se presenta clara debido al hecho de que los principios generales de la estructura y funcion celulares revelados por los estudios de las levaduras se pueden aplicar a todas las células eucariotas,Capitulo 1 * Visién global de la célula e investigacion celular @ 17 Dictyostelium discoideum Dictyostelium discoideum es un moho celular del todo, el cual, como las levadu- ras, es un eucariota unicelular comparativamente simple. El genoma de Dictyoste- um es aproxmadamente diez veces mayor que el de E. coli—mas complejo que el genoma de las levaduras pero considerablemente mas simple que los genomas de los eucariotas superiores—. Ademés, Dictyostelium puede crecer con facilidad €n el aboratoro y resulta susceptible a una variedad de manipulaciones geneéticas. Bajo condiciones nutrtivas abundantes, Dictyostelium vive como una ame- ba de una nica célula, que se alimenta de bacterias y levaduras. Es una oélula movil, y esta propiedad ha hecho que Dictyostelium sea un modelo importante para el estudio de los mecanismos moleculares responsables de los movimien- tos de las células animales (Fig. 1.16). Por ejemplo, la introduccién de mutacio- nes apropiadas en Dictyostelium ha revelado las funciones de varios genes im- plicados en la movilidad celular. ‘tra de las caracteristicas interesantes de Dictyostelium es la habilidad de las células Unicas para agregarse formando estructuras multicelulares. Si el su- plemento adecuado de comida no esta disponible, las células se asocian para formar estructuras parecidas a lombrices llamadas babosas, cada una de ellas constituida por mas de 100.000 células que funcionan como una unidad. Dict- yostelium se siti por tanto en la frontera entre los organismos unicelulares y multicelulares, proporcionando un modelo importante para los estudios de se- jializacién celular e interacciones célula-célula. Caenorhabditis elegans Los eucariotas unicelulares Saccharomyces y Dictyostelium son modelos im- portantes para el estudio de las células eucariotas, pero entender el desarrollo de los organismos multicelulares requiere los andlisis experimentales de plan- tas y animales, organismos que son mucho mas complejos. El nematodo Cae- norhabditis elegans (Fig. 1.17) posee diversas caracteristicas notables que hacen que sea uno de los modelos mas utilizados en los estudios de desarrollo. animal y diferenciacion celular. Aunque el genoma de C. elegans (aproximadamente 100 millones de pares de bases) es mayor que los eucariotas unicelulares, es mas simple y més mane- jable que los genomas de la mayoria de los animales. Su secuencia ha sido de- terminada por completo, revelando que el genoma de C. elegans contiene aproxi madamente 19.000 genes —alrededor de tres veces mas que el niimero de genes de levaduras, y un quinto del ntimero de genes previsibles en humanos—. Biolbgicamente, C. elegans es también un organismo mulicelular relativamente simple: Las lombrices adultas solamente se componen de 959 células somati- ‘cas, y de 1.000 a 2.000 eélulas germinales. Ademés, C. elegans puede ser repro- ducida con facilidad y ser sometida a manipulaciones genéticas en el laboratorio. La simplicidad de C. elegans ha permitido que el curso de su desarrollo se haya estudiado en detalle mediante observacin microscépica. Estos analisis, Farge Hucws ‘va Reto Ano Tm Figura 1.16 Dyctiostelium discoideum. Estas {clo gratias muestran el movimiento de dos amebas durante 40 segundos. (Cortesia de David Knecht, University of Connect cut.) Figura 1.17 Caenorhabditis elegans. (De J. E. Suis- ton y H.R. Homvitz, 1977. Dev. Biol 56: 110.)18 @ Seccién| ¢ Introduccion Figura 1.18 Drosophila melanogaster. (Darwin Dale! Photo Researchers, Inc.) Figura 1.19 Arabidopsis thaliana. (Jeremy Burgess! Photo Researchers, Inc.) han trazado satistactoriamente el origen embrionario y el linaje de todas las células en la lombriz aduita. Los estudios genéticos también han identificado algunas de las mutaciones responsables de anormalidades del desarrollo, condu ciendo al aislamiento y descripcién de genes claves que controlan el desarrollo y diferenciacién del nematodo. Cabe destacar que se han encontrado similares genes que funcionan en animales complejos (incluyendo humanos), resultando C. elegans un importante modelo para los estudios del desarrollo animal. Drosophila melanogaster Al igual que C. elegans, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Fig. 1.18) ha sido un modelo de organismo crucial en la biologia del desarrollo. El genoma de Drosophilaes similar al tamafio del genoma de C. elegans, pudiéndose man tener y reproducir facilmente en el laboratorio. Ademas, el corto ciclo de repro: duccién de Drosophila (unas 2 semanas) la convierte en un organismo muy iti para los experimentos genéticos. Muchos conceptos fundamentales de la gené- tica como la relacién entre genes y cromosomas— se derivaron de los estu- dios en Drosophila a principios del siglo veinte (véase el Cap. 3) Los exhaustivos analisis genéticos en Drosophila han descubierto muchos de los genes que controlan el desarrollo y la diferenciacidn, siendo los métodos actua- les de la biologia molecular los que han permitido el anaiisis en detalle de las fun- ciones de estos genes. Como consecuencia, los estudios de Drosophila han permi- tido avanzar en el entendimiento de los mecanismos moleculares que gobiernan el desarrollo animal, particularmente respecto a la formacién del cuerpo de organismos multicelulares complejos. Al igual que C. elegans, en vertebrados existen genes y mecanismos similares, validando el uso de Drosophila como uno de los mode: los experimentales mas importantes de la biologia contempordnea del desarrollo. Arabidopsis thaliana El estudio del desarrollo y la biologia molecular vegetal es un campo activo y en expansién de considerable importancia econémica al igual que de interés inte: lectual. Desde que los genomas de las plantas cubren una dimension de comple- jidad comparable a los genomas animales (véase la Tabla 1.2), un modelo optimo para el estudio del desarrollo vegetal seria un organismo relativamente simple Que poseyera alguna de las ventajas de C. elegans y Drosophila. La pequena planta con flor Arabidopsis thaliana (Fig. 1.19) recoge estos criterios, por lo que se utiliza como modelo para el estudio de la biologia molecular en plantas, Arabidopsis resulta notable por su genoma de tan s6lo unos 120 millones de pares de bases que contiene aproximadamente 15.000 genes diferentes —una complejidad similar a la de C. elegans y Drosophila. Ademés, la Arabidopsis es facil de cultivar en el laboratorio, y ya se han desarrollado métodos para su manipulacién genética molecular. Estos estudios han llevado a la identificacién de genes implicados en varios aspectos del desarrollo vegetal, como es el de. sarrollo de las flores. El analisis de estos genes indica la existencia de numero: sas similitudes, pero también diferencias notables, entre los mecanismos que controlan el desarrollo de vegetales y animales. Vertebrados Los animales mas complejos son los vertebrados, incluyendo a los humanos y otros mamiferos. El genoma humano se compone aproximadamente de 3 billones de pares de bases —alrededor de 30 veces mas que los genomas de C. elegans, Drosophila, 0 Arabidopsis— y contiene 30-40.000 genes. Ademés, el cuerpo hu- mano se compone de mas de 200 clases diferentes de tipos de células especializa- das. Esta complejidad hace que los vertebrados sean dificles de estudiar desde el punto de vista de la biologia celular y molecular, aunque la mayoria del interés de las ciencias biol6gicas nace del deseo de entender el organismo humano. Ademas, entender muchas de las cuestiones sobre la importancia de la prctica inmediataCapitulo 1 * Visién global de la célula e investigacién celular @ 19 (por ej., en medicina) deben estar basadas en estudios de células humanas (0 estrechamente relacionadas). Un avance importante en ol estudio de células humanas y de los mamiferos es el crecimiento de células aisladas en cultivo, don- de pueden ser manipuladas bajo condiciones de laboratorio contro- ladas. El uso de células cultivadas ha permitido realizar estudios sobre diversos aspectos de la biologia celular de los mamiferos, incluyendo experimentos que han iluminado los mecanismos de la replicacién del ADN, expresion génica, sintesis y procesamiento de proteinas, y divisién celular. Ademés, la habilidad de cultivar Células en un medio quimico definido ha permitido realizar estudios sobre los mecanismos de sefiales que normalmente controlan el crecimiento y la diferenciacién celular en el organismo intacto. Las propiedades especializadas de algunos tipos de células al- tamente diferenciadas han hecho de ellas importantes modelos para el estudio de aspectos detorminados de la biologia celular. Las células musculares, por ejemplo, estan altamente especializadas para realy pioura 1,20 zat la contracci6n, produciendo fuerza y movimiento. Debido a esta especializa- Huevos de la rana Xenopus laevis. cién, las células musculares son un modelo crucial para el estudio del movimiento _(Cortesia de Michael Danilchik y Kimberly celular @ nivel molecular. Otro ejemplo lo proporciona las células nerviosas Fay.) (neuronas), que estan especializadas en la conduccién de sefales electroqui- micas a larga distancia. En humanos, los axones de las células nerviosas pue- den tener mas de un metro de largo, y algunos invertebrados, como el calamar, tienen neuronas gigantes con axones de hasta 1mm de diametro. Debido a su estructura y funcidn tan especializadas, estas neuronas gigantes han sido im- portantes modelos en el estudio del transporte de iones a través de la membra- na, y del papel del citoesqueleto en el transporte de orgdnulos citoplasmaticos. La rana Xenopus laevis es un modelo importante para los estudios del de- sarrollo tomprano de los vertebrados. Los huevos de Xenopus son normalmen- te grandes células, con un diémetto aproximado de 1 mm (Fig. 1.20). Debido a {que estos huevos se desarrollan fuera de la madre, todas las etapas del desa- rrollo desde el huevo hasta el renacuajo se pueden estudiar con facilidad en el laboratorio. Ademas, los huevos de Xenopus se pueden obtener en grandes cantidades, facilitando e! analisis bioquimico. Gracias a estos avances técnicos, se ha utiizado Xenopus ampliamente en estudios sobre el desarrollo biologico y ha proporcionado importantes descubrimientos en los mecanismos que contro- lan el desarrollo, diferenciacion, y division celular del embrién. Elpez cebra (Fig, 1.21) posee numerosas ventajas para los estudios genéti- cos del desarrollo de los vertebrados. Este pequefio pez es facil de mantener en “ Figura 1.21 Pez cebra. (A) Embrion de 24 horas. (B) Pez adulto. (A, cortesia de Charles Kimmel, University of Oregon: B, cortesia de S. Kondo), ®20 © Seccién | * Introduccion Figura 1.22 EI ratén como modelo del desarrollo humano. Nifo y ratén muestran defectos similares en la pigmentacién (piebaldis- ‘mo) como resultado de mutaciones en un {gen necesario para la migracién normal de los melanocitos (células responsables de la pigmentacién de la piel) durante el desarrollo embrionario, (Cortesia de R.A. Fleischman, Markey cancer Center, Uni versity of Kentucky.) wd 1 laboratorio y se reproduce con rapidez. Ademés, los embriones se desarro llan fuera de la madre y son transparentes, por lo que las primeras etapas del desarrollo pueden ser observadas con clatidad. Se han desarrollado métodos poderosos para facilitar el aislamiento de las mutaciones que afectan al desa~ rrollo del pez cebra, consiguiendo la identificacién de varios cientos de estas mutaciones. Ya que el pez cebra es un vertebrado de facil estudio, promete ser el puente entre los humanos y los sistemas mas simples de invertebrados, como C. elegans y Drosophila Entre los mamiferos, el ratén es el mas manejable para los analisis genét: os, lo cual se faciltard con la reciente finalizacién de la secuenciacién del ge- noma del ratén. Aunque las dificultades técnicas de estudio de la genética del ratén (comparada, por ejemplo, a la genética de las levaduras 0 Drosophila) son inmensas, se han identificado varias mutaciones que afectan al desarrollo del rat6n, Mas importantes aun son, los recientes avances en la biologia molecular que han permitido la produccién de ratones transgénicos, en los que se han introducido genes mutantes especificos en la linea germinal del ratén, por lo que sus efectos en el desarrollo u otros aspectos de la funcién celular pueden ser estudiados en el contexto de! animal completo. La manejabilidad del ratén como modelo del desarrollo humano se corresponde con el hecho de que las mutaciones en genes homélogos dan lugar a defectos del desarrollo similares en ambas especies; el plebaldismo es un ejemplo claro (Fig. 1.22). Instrumentos de la biologia celular Como en todas las ciencias experimentales, la investigacién en biologia celular depende de los métodos de laboratorio que se puedan utilizar para estudiar la estructura y funcién celulares. Muchos avances importantes sobre el funciona- miento de las células han conducido directamente al desarrollo de nuevos mé- todos de investigacién. La apreciacién de los instrumentos experimentales dis- ponibles para el bidiogo celular resulta por tanto critica para entender el estado actual y futuro de las direcciones de este area de la ciencia que se mueve con tanta rapidez. Algunos de los métodos generales importantes de la biologia ce- lular estan descritos en secciones siguientes. Otros avances experimentales, que incluyen los métodos de la bioquimica y de la biologia molecular, se discuti- ran en capitulos posteriores.Capitulo 1 * Visién global de la célulae Microscopia éptica Debido a que la mayoria de las células son demasiado pequertas para ser ob- servadas a simple vista, el estudio de las células ha dependido primordialmente del uso del microscopio. Es mas, el descubrimiento real de las células surgio del desarrollo del microscopia: Robert Hooke fue el primero que acuno el termino de «célula» siguiendo sus observaciones de una pieza de corcho con un simple mmicroscopio dptico en 1665 (Fig. 1.23). Utiizando un microscopio que ampliaba los objetos hasta 300 veces su tamafo real, Antony van Leeuwenhoek, en 1670 ¥ afios posteriores, fue capaz de observar diferentes tipos de células, incluyen- do esperma, giébulos rojos, y bacterias. La propuesta de la teoria celular plan- teada por Matthias Schleiden y Theodor Schwann en 1838 debe tomarse como el nacimiento de la biologia celular contempordnea. Los estudios microscépicos de tejido vegetal por Schleiden y los de tejido animal por Schwann condujeron a la misma conclusién: Todos los organismos estén compuestos por células. Mas tarde, se reconocié que las células no se forman de novo sino que emergen Linicamente por la divisién de las células preexistentes. Por tanto, la célula con: siguid su actual reconocimiento como la unidad fundamental de todos los orga- riismos vives debido a las observaciones realizadas con el microscopio dptico E| microscopio optico continta siendo un instrumento basico para los bidlo- {0s celulares, que con mejoras técnicas permiten la visualizacién de los deta iles aumentados de la estructura celular. Los microscopios dpticos contemporé- ines son capaces de aumentar los objetos hasta unas mil veces. Dado que la imayoria de las células se encuentran entre 1 y 100 jm de didmetro, pueden ser observadas en el microscopio dptico, como pueden ser también algunos de los ‘orgénulos subcelulares, como el nticleo, los cloroplastos, y las mitocondiias. Sin embargo, el microscopio Optico no es lo suficientemente poderoso para ob- servar pequerios detalles de la estructura celular, cuya resolucién —ia capaci- dad de un microscopio para distinguir objetos separados por pequefas distar cias— es mucho més importante que el aumento. Las imagenes se pueden aumentar tanto como se desee (por ejemplo, mediante la proyeccion en una pantalla grande), pero tal aumento no incrementa el nivel de detalle que se puede observar. Ellimite de resolucién del microscopio dptico es aproximadamente de 0.2 jim; dos objetos separados por menos de esta distancia aparecen como una tinica imagen, en lugar de distinguirse una de otra. Esta limitacién tedrica de la mi- investigacion celular @ 21 Figura 1.23 Estructura celular del corcho. Una re- produccién de un dibujo de Robert Hooke de una Kimina de corcho examinada con tn microscopio dptico. Las «células» que Hooke obserus fueron en realidad las pa- redes celulares que quedan cuando las células han muerto hace tiempo. Figura 1.24 Apertura numérica. La luz se enfoca en la muestra mediante la lente condensado- ray se recoge en la lente del objetivo del micrascopio. La apertura numénca esta determinada por el angulo del cono de la luz-que entra en el objetivo de la lente (3) y por el indice de refraccién del medio (nor: malmente agua o aceite) entre a lente y a muestra,22_@ Seccién | © Introduccién Figura 1.25 Microgratia de campo luminoso de teji- do tendo. Soccién de un tumor renal be- rigno. (G. W. Wills/Servicio de Fotogratia Biolsgica.) croscopia éptica esté determinada por dos tactores —la longitud de onda (7) de laluz visible y el poder de captacién de luz de las lentes del microscopio (apertu- ra numérica, AN) —de acuerdo con la siguiente eouacién: 0617 AN Resolucién = La longitud de onda de la luz visible es de 0,4 @ 0,7 sim, por lo que el valor de se calcula en 0,5 ym para el microscopio éptico. La apertura numérica puede pre- verse como el tamafo del cono de luz que entra en la lente det mictoscopio des- pues de pasara través dela muestra (Fig. 1.24). Esto se obtiene de la ecuacion AN = sen x donde 1 es el indice de refraccién del medio a través del cual la luz viaja entre la muestra y la lente. El valor de para el aire es de 1,0, pero puede aumentar hasta tun maximo aproximado de 1,4 utilizando una lente inmersa en aceite para ver la muestra a través de una gota de aceite. El angulo x corresponde a la mitad de la anchura del cono de luz recogido por la lente, El valor maximo de » es de 90, en ‘el que el sen 7 = 1, por lo que el valor mas alto de la apertura numérica es de 1.4 El limite te6rico de resolucién del microscopio éptico se puede por tanto calcular de la siguiente forma: 061 x05 14 Los microscopios capaces de llegar a este nivel de resolucién se consiguieron fabricar a finales del siglo diecinueve; no se pueden esperar en estos aspectos nuevas mejoras de la microscopia éptica. Rutinariamente se utilizan diferentes tipos de microscopia éptica para estu- diar varios aspectos de la estructura celular. El mas simple es el microscopio de campo luminoso, en el que la luz pasa directamente a través de la célulay en el que la habilidad para distinguir las diferentes partes de la célula depende del contraste que se obtiene de la absorcién de la luz visible por los componentes Celulares. En muchos casos, las células se tien con tintes que reaccionan con proteinas y acidos nucleicos para resaltar el contraste entre las diferentes partes dela célula. Antes de tefir, Jas muestras son normalmente tratadas con fijadores (como el alcohol, acido acético, 0 formaldehido) para estabilizar y conservar sus estructuras. El examen de los tejidos fijados y tefidos mediante el microscopio Resolucién 0,22 umCapitulo 1 « Vision global de la célula e investigacién celular @ 23 Figura 1.26 & ‘Observacion microscépica de células vivas. Microfotogratias de oélulas bucales huma- ‘nas oblenidas con (A) campo luminoso, (B) contraste de fases, (C) mictoscopia de interte- rencia-contraste diferencial, (Cortesia de Mort Abramowitz, Olympus america, Inc.) de campo luminoso es la practica estandar para analizar las muestras de tejidos en los laboratorios histol6gicos (Fig. 1.25). Tales procedimientos de tincién ma- tan a las células, no obstante, y por tanto no resultan apropiados para muchos ‘experimentos en donde se desea una observacién de células vivas. Sin la tincién, el paso directo de la luz no proporciona el contraste suticiente para distinguir muchas de las partes de la célula, limitando la utilidad de! micros- ‘copio de campo luminoso. No obstante, ias variaciones épticas del microscopi ptico se pueden utilizar para potenciar el contraste entre las ondas de luz que pasan a través de regiones de la célula con diferentes densidades. Los dos méto- ‘dos mas comunes para la visualizacién de células vivas son la microscopia de contraste de fases y la microscopia de interferencia-contraste diferencial (Fig, 1.26). Los dos tipos de microscopia utilizan sistemas opticos que convier- ten las variaciones de densidad o grosor entre las diferentes partes de la célula en diferencias de contraste que se pueden apreciar en la imagen final. En la microscopia de campo luminoso, las estructuras transparentes (como el nd ‘cleo) presentan poco contraste porque absorben pobremente la luz. Sin embar- go, la luz disminuye cuando pasa a través de estas estructuras por lo que su fase se altera en comparacién a la luz que ha pasado a través del citoplasma {que las rodea. Las microscopias de contraste de fases y de interferencia-con- traste diferencial convierten estas diferencias de fase en diferencias de contras- te, mejorando de ese modo las imagenes de las células vivas sin tefir. Elpoder del microscopio éptico se ha extendido mediante el uso de cémaras de video y ordenadores para el andlisis y procesamiento de imagenes. Tales sistemas de procesamiento de imagenes pueden potenciar sustancialmente el contraste de las imagenes obtenidas con el microscopio optico, permitiendo la visualizacién de objetos pequefios que de otra forma no hubieran podido ser detectados. Por ejemplo, la microscopia de interferencia-contraste diferen- cial video potenciada ha permitido la visualizacion de! movimiento de los orga- a nulos a lo largo de los microtibulos, que son filamentos de proteinas citoesque- léticas con un diametros de tan solo 0,025 «m (Fig. 1.27). Sin embargo, esta potenciacién no consigue llegar al limite tedrice de resolucién del microscopio Optico, aproximadamente 0,2 jim. Por tanto, aunque la potenciacién por video permite la visualizaci6n de los microtibulos, aparecen como imagenes turbias a menos de 0,2 jm de diémetro y un microtdbulo individual no puede ser distingui- do de un haz de estructuras adyacentes La microscopia éptica se ha llevado al nivel del analisis molecular mediante métodos que marcan moléculas especificas y que pueden ser visualizadas den- tro de las células. Genes especificos o transoritos de ARN se pueden detectar mediante hibridaci6n con sondas de acidos nucleicos de secuencia comple- mentaria, y las proteinas pueden detectarse usando anticuerpos apropiados (véase el Cap. 3). Tanto las sondas de acidos nucleicos como los anticuerpos se pueden sefalar con variedad de marcadores que permitan su visualizacion en el microscopio éptico, permitiendo determinar la localizacién de moléculas especiticas en células individuales. La microscopia de fluorescencia so utiliza extensamente y es un método muy sensible para el estudio de la distribucién intracelular de las moléculas (Fig 1.28). Se utiliza una tincién fluorescent para marcar las moléculas que intere~ Figura 1.27 Microscopia de interferencia-contraste diferencial potenciada con video. El proce- ssamiento de una imagen electronica permite la visualizacion de microtabulos individuales, (Cortesia de E. D. Salmon, University of North Carclina, Chapel Hil.)24 @ Seccion | ¢ Introduccion Figura 1.28 Microscopia de fluorescencia. (A) La luz pasa através de un itro de excitacion fa seleccionar la luz de la longitud de ‘onda (por ej, azul) que excita el inte fluo- fescente. Después un espejo dicroico desvia la luz excitada hacia la muestra ‘a luz fivorescente emitida por la muss ra (por @)., verde) pasa a través de ut ‘egpejo dicroico y un segundo fro (ol fi ‘o bartera) para seleccionar a luz de lon: gitud de onda emitida por el tinte. (B) Mi Crogratia fluorescente de un pulmén de ritén en el que el ADN esta tenido de azul y los microtubulos en e! citoplasma de verde. (Conly S. Rieder/Biclogical Photo Service. Figura 1.29 Microscopia de fluorescencia de una proteina mar- cada con GFP. Una proteina mitocondrial fusionada con GFP fue intraducida en células humanas en cuttvo y visualizada por microscopia de fluorescencia. (Cortosia de BD Biosciences Clontech.) Fir bare spel dcrico san tanto en células fijadas 0 vivas. La tincién fluorescente es una molécula que absorbe la luz a una longitud de onda y emite luz a una segunda longitud, onda. Esta fluorescencia se detecia mediante la iluminacién de la muestra con una luz de una longitud de onda que excita al tinte fluorescente, usandose mas tarde filtros apropiados para detectar la longitud de onda especifica que emite el tinte. La microscopia fluorescente se puede utilizar para estudiar una gran va iedad de moléculas dentro de las eélulas. Una de las aplicaciones mas frecuen: tes es la sefializacion de anticuerpos con tintes fluorescentes dirigidos contra una proteina especifica, de manera que se pueda determinar la distribucién intracelular de la proteina Un avance reciente importante en la microscopia de fluorescencia ha sido e! empleo de la proteina verde fluorescente (GFP: green fluorescent protein) de las medusas para visualizar proteinas en el interior de células vivas. La GFP puede fusionarse con cualquier proteina de interés mediante métodos estandar de ADN recombinante, y la proteina marcada con GFP puede a continuacién introducirse en células y detectarse por microscopia de fluorescencia, sin nece- sidad de fijacién y tincién de las células tal y como se necesitaria para la detec: cién de proteinas mediante el uso de anticuerpos. Gracias a su versatilidad, el uso de GFP esta muy extendido en biologia celular, y ha sido empleada para seguir la localizacion y movimientos de una amplia variedad de proteinas en el interior de células vivas (Figura 1.29)Capitulo 1 ¢ Vision global de la célula e investigacion celular @ 25 a 1.30 Microscopia confocal. Un punto de luz es enfocado en la muestra a una distancia deter ‘minaga, ylaluz luorescente emitida se recoge en un detector. Antes de alcanzar el detec: tor, la luz fluorescente emitida por la muestra debe pasar a través de una apertura conto. cal situada en el punto en que la luz emitida desde la distancia elegida de la muestra se tentoca. Como resultado, solamente se detecta la uz enfocada emitida desde la distancia elegida del espécimen. La microscopia confocal combina la microscopia fluorescente con el anali- sis electrénico de la imagen para obtener imagenes tridimensionales. Un peque- fo punto de luz, normalmente producido por un laser, se enfoca en la muesira a una profundidad determinada. La luz fluorescente emitida se recoge utiizando un detector, como una video camara. Antes de que la luz emitida alcance el detector, esta debe atravesar ol agujero de una aguja (llamado apertura focal) situada pre- cisamente en el punto donde la luz emitida desde la profundidad elegida de la muestra es enfocada (Fig. 1.30). Por tanto, solamente la luz emitida desde el plano de enfoque es capaz de alcanzar el detector. El barrido a lo largo de la muestra genera una imagen del plano de enfoque en dos dimensiones, una ima- gen mucho mas detallada que la obtenida con la microscopia fluorescente habi: tual (Fig. 1.31). Ademas, es posible fundir una serie de imagenes obtenidas a distintas profundidades para reconstruir una imagen tridimensional de la muestra, La microscopia de excitacién multifoténica es una altemativa a la micros copia tridimensional que también puede aplicarse a las células vivas. La muestra se ilumina con una luz de una longitud de onda tal que la excitacién del tinte fluorescente requiera la absorcién simultanea de dos o mas fotones (Fig 1.32). La probabilidad de que los dos fotones exciten simultaneamente al tinte fluorescente solamente es importante en e| punto de la muestra en el que el laser esta enfoca- do, de tal manera que la fluorescencia sélo se emite desde el plano de enfoque de la luz. Esta potente excitacién automaticamente proporciona una solucién tridi ‘mensional, sin necesidad de que la luz emitida atraviese la apertura de una aguia, como en la microscopia confocal. Ademas, la localizacion de la excitacion reduce el dafio de la muestra, permitiendo imagenes tridimensionales de células vivas, Microscopia electronica Debido a la limitada resolucién de! microscopio dptico, el andlisis de los detalles de la estructura celular ha necesitado una técnica de microscopia mucho mas poderosas, llamada microscopia electronica, que fue desarrollada en los aos Figura 1.317 Microgratia confocal de oélulas humanas. Microtibulos y fllamen- tos de actina aparecen tenidos con colorantes fluorescentes rojo y ver de, respectivamente. (K. G. Murti’ Visuals Unlimited.)26 @ Seccion | * Introduccién Figura 1.22 Microscopia por excitacién de dos fo- tones. Se requiore la absorcion simul nea de dos fotones para excitar el tinte Tluorescente. Esto sélo sucede en el punto de la muestra donde se enfoca la luz, de fal forma que la luz fluorescente solo se femite desde la distancia elegida de la muestra Figura 1.33 incién positiva, Micrografla de trans: mision de electrones de un gldbulo blanco tehido positivamente. (Don W. FawcetV suals Unlimited.) Fluoretoro enn ae Excitacn da ds fotones Fetch 1980 y aplicada por primera vez a muestras biolégicas por Albert Claude, Keith Porter y George Palade en los aftos 1940 y 1950. El microscopio electronico puede alcanzar una resolucion mucho mayor que la obtenida con el microsco- pio optico puesto que la longitud de onda de los electrones es menor que la de la luz. La longitud de onda de los electrones en un microscopio electronico puede ser de hasta 0,004 nm —alrededor de 100,000 veces mas corta que la longitud de onda de la luz visible—. Teéricamente, esta longitud de onda puede alcanzar na resolucién de 0,002 nm, pero tal resolucién no ha podide obtenerse en la préctica, puesto que no solo esta determinada por la longitud de onda sino tam- bién por la apertura numérica de la lente del microscopio. La apertura numérica @s un factor limitante para la microscopia electronica puesto que las propieda- des inherentes de las lentes electromagnéticas limitan sus angulos de apertura alrededor de 0,5 grados, correspondientes a aberturas numéricas de solo 0,01 Por tanto, bajo condiciones dptimas, el poder de resolucién de! microscopio electrénico es aproximadamente de 0,2 nm. Ademés, la resolucion que se puede obtener con muestras biolégicas esta limitada por la falta de contraste inherente. En consecuencia, en muestras bioldgicas el limite practico de resolucion para el microscopio electronico es desde 1 a 2 nm. Aunque esta resolucién es mucho ‘menor que la predicha por la longitud de onda de los electrones, representa una mejora de mas de cien veces del poder de resolucién de! microscopic éptico. En el estudio de las células se utiizan dos tipos de microscopia electronica —transmisién y barrido. En principio, la microscopia electrénica de transmi- sién es similar a la observacién de células teniidas con sales de metales pesa- dos, que proporcionan contraste mediante los electrones dispersos. Un haz de electrones pasa a través de la muestra y se enfoca para formar una imagen en na pantalla fluorescente. Los electrones que chocan con un ién de metal pesa- do cuando pasan por las muestra se reflejan y no contribuyen a la imagen final, de tal forma que las zonas tefiidas de la muestra aparecen oscuras. Las muestras que se van a analizar por microscopia de transmision de elec- trones se pueden preparar con tintes positivos o negatives. En a tincién posit- va, las muestras de tejido se cortan en secciones finas y se tifien con sales de metales pesados (como el tetroxido de osmio, acetato de uranilo, y citrato de lomo) que reaccionan con lipides, proteinas, y Acidos nucleicos. Estos iones de metales pesados se unena gran variedad de estructuras celulares, que apa- recen oscuras ena imagen final (Fig. 1.33). Los procedimientos de tincién posi tiva también se pueden utilizar para identificar macromoléculas especificas dentro de las células. Por ejemplo, los anticuerpos marcados con metales pesa- dos densos en electrones (como particulas de oro) se utilizan con frecuencia para determinar la localizacién subcelular de proteinas especificas con el mi croscopio electrénico. Este método es similar al uso de anticuerpos marcados Con tintes fluorescentes en la microscopia fluorescent.Capitulo 1 © Visién global de la célula e investigacion celular @ 27 Figura 1.34 Tincién negativa. Microgratia de trans: misién de electrones de filamentos do 2c: tina tehidos negativamente. (Cortesia de Roger Craig, University of Massachusetts Medical Center.) La tincién negativa resulta util para la visualizacion de estructuras bioldgicas intactas, como las bacterias, los orgénulos subcelulares aislados, y macromolé- culas (Fig. 1.34). En este método, la muestra biol6gica se deposita en una lami- 1na, permitiendo que una gota de metal pesado rodee su superficie. La muestra sin tefir se rodea con una lémina densa en electrones, produciendo una imagen en la que la muestra aparece clara en contra de un fondo oscuro. El sombreado de metal es otra técnica que se utiliza para visualizar la super: ficie de estructuras subcelulares aisladas o macromoléculas en el microscopio de iransmisién de electrones (Fig. 1.35). La muestra se cubre con una fina capa de metal evaporado, como el platino. Se pulveriza el metal en la muestra desde un determinado angulo, de tal manera que las superficies de la muestra que se en- cuentran de frente al pulverizador de moléculas de metal evaporadas se cubren mas que las otras. Esta diferencia de envoltura crea un efecto de sombra, dan- do a la muestra una apariencia tridimensional en las microgratias electrénicas. La preparacion de las muestras mediante la separacién por congelacion o criofractura, en combinacién con el sombrado de metal, ha resultado particu- larmente importante en los estudios de la estructura de la membrana, Las mues- ‘ras se congelan en nitrégeno liquido (@ -196 “C) y se separan con el filo de un bisturi. El proceso con frecuencia separa la bicapa lipidica, mostrando las caras interiores de la membrana celular (Fig. 1.36). La muestra se sombrea mas tarde con platino, y el material bioldgico se disuelve en Acido, produciéndose una réplica de metal de la superticie de la muestra. El examen de tales réplicas en el micros- copio electrénico revela muchas alteraciones de la superficie, que corresponden las proteinas que ocupan la bicapa lipidica. Una variacién de la separacion por ccongelacién llamada grabado por congelacién permite la observacién de las superficies externas de las membranas celulares ademas de sus caras internas. Figura 1.35 ‘Sombreado de metal. Microgratia elec: ttonica de filamentos de actinalmiosina del citoesqueleio _preparada_mediante sombreado de metal. (Don W. Fawcett, J Heuser/Photo Researchers, Inc.)28 @ Seccién | * Introducci Figura 1.36 Separacién por congelacién. (A) La se paracion por congelacion divide la bicapa lipidica, dejando las proteinas embebidas fen la membrana asociadas a una de las dos partes de la membrana, (B) Microgratia de las membranas plasmaticas de dos cé- lulas adyacentes separadas por congela cidn, Las proteinas que cubren la bicapa aparecen como particulas intermembrano- sas (flecha). (Don W. Fawcelt/Photo Re searchers, Inc.) Fostalipidos EI segundo tipo de microscopia electrénica, a microscopia electrénica de barrido, se utiliza para obtener una imagen tridimensional de las células (Fig. 1.37). En la microscopia electrdnica de barrido el haz de electrones no pasa a través de la muestra. En su lugar, la superficie de la oélula se recubre de un metal pesado, y se utiliza un haz de electrones que barre toda la muestra. Los electrones aislados 0 emitidos por la superficie de la muestra se recogen para generar una imagen tridimensional a la vez que el haz de electrones se mueve a lo largo de la célula. Debido a que la resolucion de la microscopia electronica de barrido solo es de unos 10 nm, su uso esta restringido al estudio de células completas en lugar de suborgadnulos celulares 0 macromoléculas. Separacién subcelular ‘Aunque el microscopio electrénico ha permitido una observacién detallada de la estructura celular, la microscopia en exclusiva no resulta suficiente para definir las funciones de los numerosos componentes de las células eucariotas. Para contestar muchas de las preguntas que atafien a la funcién de los organulos celulares, ha sido necesario aislar a los organulos de las células eucariotas de forma que puedan utlizarse para estudios bioquimicos. Normaimente esto se realiza mediante la centritugacién diferencial —un método desarrollado por Al- bert Claude, Christian de Duve, y sus colegas en los afios 1940 y 1950 para sepa- rar los componentes de las células de acuerdo con sus tamafios y densidades. EI primer paso en la separacién subcelular es la rotura de la membrana plasmética bajo condiciones que no destruyan los componentes intermos de la célula. Se utilizan diferentes métodos, que incluyen la sonicacion (exposicion a sonidos de alta frecuencia), reduccién en un homogeneizador mecénico, o el tratamiento con una batidora de alta velocidad. Todos estos procedimientos rompen la membrana plasmética y el reticulo endoplasmatico en pequefios fragmentos mientras que dejan a otros componentes de a célula (como el n= cleo, lisosomas, peroxisomas, mitacondtia, y cloroplastos) intactos. La suspensién de las células rotas (llamado lisado u homogeneizado) se Figura 1.37 Microscopia electrénica de barrido. Mi ‘rogralia electronica de bartido de un ma. _fracciona en sus componentes mediante una serie de centritugaciones en una ‘rotago. (David Phillps/Visuals Unlimited.) _ultracentrifuga que procesa las muestras a una alta velocidad (mas deCapitulo 1 ¢ Visién global de la célula e investigacion celular @ 29 100,000 rpm) para producir fuerzas alrededor de 500.000 veces mayores que la gravedad. Esta fuerza determina que los componentes celulares se sitden al fondo det tubo de centrifugacién y que formen un precipitado (proceso llamado sedimentacién) en un grado que depende del tamano y la densidad, sedimen- tandose las estructuras mas grandes y pesadas con mayor rapidez (Fig. 1.38). Normalmente el homogeneizado celular se centrifuga la primera vez a veloci- dad lenta, que sedimenta solamente las células que no se han roto y las gran- des estructuras celulares —los niicleos. Por tanto, se puede obtener una frac- cidn rica en nucleos del precipitado que se forma en la centrifugacién a velocidad lenta mientras que otros componentes celulares continuan suspendidos en el sobrenadante (el resto de la solucién). El sobrenadante se centrifuga después a velocidad répida para sedimentar mitocondrias, cloroplastos, lisosomas, y pero- xisomas. La recentrifugacién del sobrenadante a gran velocidad sedimenta fragmentos de la membrana plasmatica y del reticulo endoplasmatico. Una cuarta centrifugacién a gran velocidad sedimenta ribosomas, dejando exclusi- vamente la porcién soluble del citoplasma (el citosol) en el sobrenadante. Las fracciones obtenidas de la centrifugacién diferencial corresponden a preparaciones de orgdnulos enriquecidas, pero no puras. Se puede obtener un mayor nivel de purificacién mediante la centrifugacion en gradiente de densi dad, en la que los orgdnulos se separan mediante la sedimentacién en funcién al gradiente de una sustancia densa, como la sacarosa. En la centrifugacion por velocidad, el material primario se estratitica en el gradiente de sacarosa (Fig. 1.39). Particulas de diferentes tamafios se sedimentan por el gradiente en diferentes escalas, moviéndose como bandas discretas. Después de la centrifu- ‘gacidn, la coleccién de fracciones individuales del gradiente proporciona la in- formacién necesaria para separar a los organulos de tamafios similares, como mitocondrias, lisosomas, y peroxisomas, La centrifugacién de equilibrio en gradiente de densidad puede utlizarse para separar componentes subcelulares funcién de su migracién en un gradien- te de densidad, independientemente de su tamafio y forma. En este procedi- miento, la muestra se centrifuga en un gradiente que contiene una alta concen- tracién de sacarosa o cloruro de cesio, En lugar de separarse de acuerdo con su velocidad de sedimentacién, las particulas de la muestra se centrifugan hasta que han alcanzado una posicién de equilibrio en la que su densidad es igual a la de la solucién de sacarosa o cloruro de cesio. Estas centrifugaciones de equill- bro resultan utiles a la hora de separar diferentes tipos de membranas y son lo suficientemente sensibles para separar macromoléculas marcadas con diferen- tes isctopos. Un ejemplo clasico, discutido en el Capitulo 3, es el anélisis de la replicacién del ADN mediante la separacién de las moléculas de ADN que con- tienen isétopos pesados y ligeros de nitrogeno ("°N y “*N) mediante la centrifu- gacién de equilibrio en gradientes de cloruro de cesio. Crecimiento de las células animales en cultivo La habilidad para estudiar las células depende en su mayoria de la facilidad con la que pueden crecer y ser manipuladas en el laboratorio. Aunque el proceso es técnicamente mucho mas dificil que e! cultivo de bacterias o levaduras, una gran variedad de células animales y vegetales pueden ser cultivadas y manipuladas en cultivo. Los sistemas de cultivo celular in vitro han permitido a los cientiticos estudiar el crecimiento y diferenciacién celular, asi como desarrollar manipula: clones genéticas necesarias para entender la estructura y funcidn de los genes. Los cultivos de células animales se inician mediante la dispersion de una parte de tojido en una suspensién de sus componentes celulares, que se anade mas tarde a una placa de cultivo que contiene un medio nuttitivo. La mayoria de los tipos de células animales, como los fibroblastos y las células epiteliales, se adhieren y crecen en la superficie plastica de las placas usadas para el cultivo de células (Fig. 1.40). Se utlizan con frecuencia embriones y tumores como30 © Seccion| * Introduccion Figura 1.38 Division subcelular. Las csiulas se lisan y los componentes suboelulares se sepa ran mediante una serie de centrifugacio- nes que van aumentando de velocidad. Después de cada centrifugacién, los orga- rnulos que han sedimentado en el fondo del tubo se recogen en forma de precipita- {do sdlido, El sobrenadante se centrifuga a una mayor velocidad para sedimentar el siguiente orgénulo mas grande. mee Ss 800 X gravecad (oman de céldlasrotas contene componentes ‘subceulares como lisosomas, perorsomas Yy fagmontos de merérana Sobronadante al Ss centri gado 15.000 X gravedad (10min) Sedimento — ais eontriugado 100.000 X gravodad (som) Seuimento de mitocondias, heosomse Yy peroxsomas Sobrenadante => | S ‘entrtugad 200,000 X gravedad (horas) SSodimenta de ragmentas deka mombrans plasmic yo eticulo ‘endoplasmatice ar 6Capitulo 1 © Visién global de la célula e investigaci {Ga mucstia descansa encima Ge un gradiente de sacarosa _JPanicuias de torantes tomatoe CCentrtugacion diene | ———>- \ \ partes da secimentacion répida S ee _t i é Pariculas do Sedimentacin répia Panieuas de sedmentacon lana material de iniciacién, debido a que contienen células de crecimiento rapido. Los fibroblastos embrionarios crecen particularmente bien en cultivo y en con- secuencia son uno de los tipos de células animales mas estudiados. Bajo condi- ciones apropiadas, sin embargo, algunas células especializadas también pue- den crecer en cultivo, permitiendo asi el estudio de sus propiedades en un ambiente experimental controlado. Las células madre embrionarias constitu- yen un ejemplo especialmente notable. Estas células se establecen en cultivo a partir de embriones tempranos y mantienen su capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares presentes en los organismos adultos. En consecuen- Cia, las oélulas madre embrionarias han representado un papel importante en el estudio de las funciones de una variedad de genes del desarrollo murino, ade- ‘mas de ofrecer la posibilidad de contribuir al tratamiento de enfermedades hu- ‘manas, al constituir una fuente de tejido para las terapias de trasplante, EI megio de cultivo necesario para la propagacién de células animales es mucho mas complejo que el medio minimo para sustentar el crecimiento de las bacterias y levaduras. Los primeros estudios de cultivo celular utiizaban un me- dio que consistia en componentes indefinidos, como plasma, suero, y extractos embrionarios. Se avanz6 atin mas en 1955, cuando Harry Eagle describié el primer medio definido que sustentaba el crecimiento de las células animales. ncelular @ 31 Figura 1.39 Velocidad de centrifugacién en un gra- diente de densidad, La muestra descan- ‘sa encima de un gradiente de sacarosa, y particulas de diferentes tamafos sedi- mentana través del gradiente en forma de bandas discretas. Las particulas separa- das pueden recogerse en fracciones indi viduales del gradiente, que pueden obte- rnerse simplemente punzando el fondo del tubo de centritugacién y recogiendo las gotas. Figura 1.40 Células animales en cultivo. Microgra fla electronica de barrido de fibroblastos humanos unidos a la superficie del disco de cultivo (David M, Philips/Visuals Un rmited.)32_@ Seccién | Introduccion Experimento clave Cultivo celular animal Requisitos nutritivos de las células de mamieros en cultivos de tejidos Harry Eagle "National Institutes of Health, Bethesda, MD ‘Soience, Volumen 122, 1895, pags. 501-504 Contexto Los primeros cultivos celulares se basaban en el crecimiento celulara pari de fragmentos de tejido que estaban embebidos en coagulos de plasma, un sistema de cultvo que estaba lejos de ser adecuado para el andiisis experimental. A finales de los afios 1940, uno de los mayores avances fue establecer lineas celulares que crecian a partir de células aisladas adheridas a la superficie de las placas de cultivo. Pero estas células seguian creciendo en un medio indefinido que consistia en diversas combinaciones de suero y exiractos embrionarios. Por ejemplo, una de las lineas cancerigenas humanas mas uilizadas (lamada células HeLa) ‘se establecié por primera vez en 1952 mediante su crecimiento en tun medio que consistia en plasma de pollo, exiractos de embrién ‘vino, y suero del cordén umbilical humano. El uso de tal complejo y el medio de cultvo indefinido hicieron imposible el andlisis de las necesidades especificas de crecimiento de las células animales. Harry Eagle fue o| primero en resolver este problema, llevando a cabo un analisis sistematico de los nutrientes necesarios para sustentar el ‘crecimiento de las células animales en cultvo, Experimentos Eagle estudié el crecimiento de dos lineas celulares preestablecidas: Jas células HeLa y una linea de fibroblastos del raién llamada células L. Fue capaz de hacer crecer a estas células en un medio compuesto por una mezcla de sales, carbhidratos, aminodcidos, y vitaminas, y un suplemento de proteinas séricas. Mediante la variacion sistematica de los componentes del medio, Eagle tue capaz de determinar los nutrientes especificos necesarios AEA para el crecimiento celular células animales. Su uso ha Ademas de sales y glucosa, estos permitido a los investigadores el hutrientes incluyen 13 aminodcidos _crecimmiento de una basta variedad y diversas vitaminas. También de céiulas bajo condiciones Tesullaron necesarias una pequenia _experimentales definidas, las cantidad do proteinas séricas. El cuales han sido eriicas para el medio basico desarroliado por estudio del crecimiento y la Eagle esta descrito ena siguiente _diferenciacidn de las osiulas tabla, reproducida de su ensayo de animales, incluyendo la identificacion 1955. e los faciores de crecimiento presentes en el suero —ahora se Impacto incluyen polipépidos que controlan E|medio deserito por Eagle todavia__—€! comportamiento de las células faslita ol frecio asco ankzado indivisuales dentro del animal para los cultivos de intacto—. Tabla 4. Meco basico para el culvo de la oélula HeLa y de los fbroblastos do ratén (10) [Laminodcidos" (mia) Vitaminas’ (mM) Diversos Arginina 0.1 Biota 107 Glucosa 5 mMg Cisteina 0.05 (0,02)" Colina 103 Peniclina 0.008" Ghuiamina 2.0. {1,0)) ‘Acido toico «10? -——Estroptomicina 0,0085% Histicina 0.05 (0,02)* Ncotnamiéa 10% Rojo fenol 0.00054 Isoleueina 02 ‘Acido pantoténieo 102 |S — Leucina” 02 (0,1)t 10> Para eatudios de nuticion oular can te oo pal Jo2 Dials suero de caballo, 1% Motionina 0.05 Fiboflavina 10+ _Didlisis suero human, 52% Fenlalanina 0.1 (0,05) sues GM Para culves de caniidaa Treonina 02 (0.1) eseeen ‘Suro de caballo compieto, Sct Teptstane 0.02 (0101)+ wacr TOD Suero humane completo, 10% Tiosina 0.1 KC, 5 Valna” 02 (0,1)t NaH.PO,-HO 5 NaHCO, 20 cach Mc, 08 Es convelane quardaro an alreigerader como una solu nica que conttens 20 yest la corceriracion ince se cada sma. | ES convents quarario come unasoluion nia que contenga 1006 1.000 veeslacorcentracn read do ada varia: mantener congea. {Es convenents quardaro en rergerasren dos seluiones una cue contanga NaC} KCl NaM.PO., NaHCO, sn does crear iad prcaah yaar concn CACY Wh, 208 | Eo cermmert gure come una soln 109 mit congelado curio nose use {rs convener utara oro na aotuen Unca que cotanga 100 veces a concertacon idea de ental estepromcina, yr} enaCapitulo 1 * Visién global de la célulae investigacion celular @ 33 ‘Ademas de sales y glucosa, el medio utiizado para los cultivos de células ani- males contiene varios aminodcidos y vitaminas, que las células no pueden pro- ducir por si mismas. El medio de crecimiento de muchas células animales en cultivo también incluye suero, que sirve como fuente de factores de crecimiento polipeptidicos que son necesarios para estimular la divisién celular. Se han identificado varios factores de crecimiento. Actian como reguladores criticos, del crecimiento y la diferenciacién celular en organismos mutticelulares, propor- cionando senales mediante las que diferentes células se comunican unas con otras. Por ejemplo, una funcidn importante de los fibroblastos de la piel en el animal intacto es la proliferacién cuando se necesita reparar el dario causado por un corte o una herida. Su division esta desencadenada por un factor de crecimiento liberado por las plaquetas durante la coagulacién, derivando la esti- ‘mulacin de la proliferacién de los fibroblastos del entomo del tejido dafiado. La identificacién de los factores de crecimiento individuales ha hecho posible e! cultivo de una variedad de células en un medio libre de suero (medio en el que et suero ha sido reemplazado por factores de crecimiento especificos necesarios para la prolferacién de las células en cuestidn). Los cultvos iniciales de células establecidos a partir de un tejido se denomi- nan cultivos primarios (Fig. 1.41). Las células en UN reigo, Cultivo primario normaimente crecen hasta cubrir la su- perficie de la placa de cultivo. Después pueden ser reti- —\ radas de la placa y reponerse a baja densidad para for- mar cultivos secundarios. Este proceso se puede repetir muchas veces, aunque la mayoria de las célu- las normales no pueden crecer en cuttivo indefinida- mente. Por ejemplo, los fibroblastos humanos norma- | Seite or una suopeniin les admiten desde 50 a 100 duplicaciones de la |e odiasinawduates poblacién, después de las cuales paran de crecer y mueren, Por el contrario, las células que se derivan de tumores con frecuencia proliferan indefinidamente en cultivo y reciben el nombre de lineas celulares inmor- Las cas oe colocan tales. Ademas, se ha conseguido aislar un importante Sammons numero de lineas celulares inmortalizadas de roedores procedentes de cultivos de fibroblasts normales. En lugar de morir como la mayoria de sus homdlogos, algu- nas células de estos cultivos contintan proiferando in- definidamente, formando lineas celulares como aque- llas que se derivan de los tumores. Tales lineas colulares permanentes han resultado muy utiles para muchos tipos de experimentos ya que proporcionan | Las ulate a calvo primase tuna fuente continua y uniforme de células que pueden | iver a superice oa placa de cto ser manipuladas, clonadas, y cultivadas indefinida- mente en el laboratorio. Incluso bajo condiciones éptimas, el tiempo de divi- sign de la mayoria de las células animales que crecen activamente es del orden de 20 horas —diez veces mas largo que el tiempo de division de las levaduras— Por tanto, los experimentos con células animales cult vvadas son mucho mas dificiles y mas largos que aque- | Las lias entonces pueden ecogorse llos con bacterias y levaduras. Por ejemplo, el creci- | Su nadasun segunda caw miento de una colonia visible de células animales a partir de una sola célula dura una semana omas, mien- tras que las colonias de E. coli de levaduras se desa- rrollan durante una noche. No obstante, las manipula- clones genéticas de las células animales en cultivo resultan indispensables para el entendimiento dela es- Figura 1.41 tructura y funcién de la célula, Cultivo de cétulas animales. Suspensién celular ~34 @ Seccién| * Introduccion Figura 1.42 Células vegetales en cultivo. Una masa indiferenciada de céluias vegetales (un caallo) creciendo en un medio sdlido. (John N. A. LotuBiological Photo Service.) Figura 1.43 Estructura de un virus animal. (A) Par- ticulas del papllomavirus que contienen luna pequena molécula de ADN circular encapsulada en una cubierta de proteinas (la capsida). (B) Microgratia electronica de particulas del virus del papiloma huma: no. Sehan afadido colores artfciales. (B, Linda Standard/Science Photo Library! Photo Researchers, Inc.) Cultivo de células vegetales Las células vegetales también pueden ser cultiva- das en un medio nutritive que contenga las molé- culas apropiadas para la regulacién del crecimien- to. Al contrario que los factores de crecimiento polipeptidicos que regulan la proliferacién de la mayoria de las células animales, los reguladores del crecimiento de las células vegetales son pe- quefas moléculas capaces de atravesar la pared celular vegetal. Cuando se suministran mezclas apropiadas con estas moléculas reguladoras de! crecimiento, muchos tipos de células vegetales pro: liferan en cultivo, produciendo una masa de células no diferenciadas denominadas callo (Fig. 1.42). Es importante tener en cuenta que muchas cé- lulas vegetales son capaces de formar cualquiera de los distintos tipos celulares ¥ tejidos necesarios para regenerar una planta completa. En consecuencia, me- diante la manipulaci6n apropiada de nutrientes y de las moléculas regulacoras dol crecimiento, las células vegetales no diferenciadas en cultivo pueden ser inducidas para formar variedad de tejidos vegetales, incluyendo raices, tallos, y hojas. En muchos casos, incluso una planta entera puede regenerarse a partir de una sola célula en cultive. Ademds de su interés tedrico, la habilidad de producir una nueva planta desde una sola célula manipulada en cultivo hace posible la introduccién de alteraciones genéticas en las plantas, abriendo impor- tantes posibilidades para la ingenieria genética agricola Virus Los virus son pardsitos intracelulares incapaces de replicarse por si mismos. Se reproducen mediante la infeccién de células huésped y la usurpacién de la ma- quinaria celular para producir méis particulas virales. En sus formas mas sim- ples, los virus consisten solamente en dcido nucleico genémico (ADN o ARN) rodeado de una cubierta proteinica (Fig. 1.43). Los virus son importantes para la biologia molecular y celular porque proporcionan sistemas simples que pueden ser ulilizados para investigar las funciones de las células. Ya que la replicacién de los virus depende del metabolismo de las células infectadas, los estudios sobre virus han revelado muchos de los aspectos fundamentales de la biologia celular. Estudios sobre los virus bacterianos contribuyeron sustancialmente a la comprensién de los mecanismos basicos de la genética molecular, y fueron los ‘experimentos con virus vegetales (con el virus del mosaico del tabaco) los que demostraron por primera vez el potencial genético del ARN. Los virus animales “ ® Proteinas de la cépsidaCapitulo 1 © Vision global de la célulae investigacién celular @ 35 Medicina molecular La enfermedad El céncer incluye un conjunto de ‘enfermedades caracterizadas por la proliferacion celular incontrolada. El crecimiento de las células animales normales esta cuidadosamente regulado para mantener las necesidades del organismo al ‘completo. Por el contrario, las células cancerigenas crecen de manera descontrolada, invadiendo @ interfiriendo en la funcién de tojidos y érganos normales. El cancer es la segunda causa mas comtin de muarte (después de las enfermedades cardiacas) en los Estados Unidos. Aproximadamente tno de cada tres americanos desarrollard cancer en algun momento de su vida y, en espera a mejores avances en su tratamiento, cerca de uno de cada cuatro americanos morira de esta enfermedad. Entender las causas del cancer y el desarrollo de nuevos metodos de tratamiento resultan poor tanto los principales objetivos de la invastigacion médica, Bases moleculares y celulares ‘Actualmente sabemos que el cancer es el resultado de ‘utaciones en los genes que normalmente controlan la proliferacion celular. Los ‘escubrimientos fundamentales que han conducido a la identificacion de estos genes han surgido de los. studios de virus que causan cancer fen animales, e! prototipo de los ‘ales {ue aislado por Peyton Rous en 1911. Rous descubrié que los sarcomas (un cancer del tejido ‘conectivo) en pollos podian transmitrse mediante un virus, © SV (siglas en inglés del virus de! Sarcoma de Rous). Debido a que SV es un retrovirus con un genoma de tan solo 10.000 pares de bases, Virus y cancer éste podia someterse a andlisis moleculares mucho més fécilmente que les complejos genomas de los pollos u otras células animales. Esios estugios condujeron a la identiicacién de un gen espectico causante del cdncer (oncogén) transportado por el virus, y al descubrimiento de genes relacionados en las céluias normales de todas las especies de vertebrados, incluyendo a los humanos. Algunos ceaneeres en los humanos se sabe que estan causados por virus; otros resultan de las mutaciones en los genes de las oéiulas normales de forma similar al primer oncogén identiicado en el RSV. Prevencién y tratamiento Los cénceres humanos que estén Ccausados por virus incluyen el cervical y otros canceres anogenitales (virus del papiloma) cancer de higado (virus de la hepatitis B y C), y algunos tipos de linfomas (virus Epstein-Barr y el Virus humano linfotrépico de las Células T). Juntos, estos ednceres inducidos por virus representan alrededor del 20% de la incidencia de céncer en el mundo. En principio, estos cénceres se podrian prevenir ‘con vacunas en contra del virus responsable, consiguiéndose un progreso considerable en este area el desarrollo de una vacuna efectiva contra el virus de la hepatitis B. Otros canceres humanos estan causados por la mutacin de genes en células normales, muchas de las cuales ocurren durante la vida del individuo en lugar de heredarse, Los studios sobre los virus causantes de canceres han proporcionado la identificacion de muchos genes responsables de los canceres no inducidos por virus, y el entendimiento de los mecanismos moleculares responsables del desarrollo del cancer. Se estan haciendo vverdaderos esfuerzos para utilizar la biologia molecular y celular del cancer para desarrollar nuevos avances en Su tratamiento. De hecho, la primera droga de disefo eficaz en el tratamiento del cancer humane (la droga STI-571, estudiada en el capitulo 15) fue desarrollada contra tun gen muy similar al oneogen RSV. Referencia Rous, P. 1911. Un sarcoma del ave do corral ransmisipe por un agente separable {las calulas tumarales, J, Exp. Med. 13: aer4ti El tumor tragplantado del que fue aislado el vis del sarcoma de Rous, han proporcionado pruebas sensibles para las investigaciones de varias activi dades de las células eucariotas. El rapido crecimiento y el pequeno tamano de las bacterias hacen de ellas un elemento excelente para los experimentos en biologia molecular, y los virus bbacterianos (bacteriéfagos) han simplticado el estudio de la genética bacteriana, Uno de los bacteriofagos mas importantes es T4, que infecta y se replica en E.36 @ Seccién | ¢ Introduccion Figura 1.44 Placas de bacteriéfagos. Las placas de T4 son visibles en un tapiz de E. col: Cada placa se forma por la replicacion de una sola particula del virus. (E. C. S Chen Visuals Unlimited.) coli. La infeccién con una sola particula de T4 conduce a la formacién de una progenie de aproximadamente 200 particulas virales en 20-30 minutos. La célu: la infectada iniciaimente después estalla (se lisa). liberando las particulas vira- les al medio, donde pueden infectar a nuevas células. En un cultivo de bacterias creciendo en un medio con agar, la replicacion de T4 conduce a la formacion de una zona clara de células lisadas (una placa) en una plancha 0 «césped» de bacterias (Fig. 1.44). Silas particulas virales intecciosas son faciles de reprodu- cir y de manipular, los mutantes virales —por ejemplo, virus que creceran en una cepa de E. coli pero no en otra— son faciles de aislar. Por tanto, T4 se manipula con mayor frecuencia que E. colfen estudios de genética molecular. ‘Ademas, e! genoma de T4 es 20 veces menor que el de E. coli —aproximada- mente 0,2 millones de pares de bases— lo cual facilta el andlisis genético. Otros bacteridtagos tienen incluso genomas mas pequefios —el mas simple consiste en moléculas de ARN de tan solo 3.600 nuclectidos—. Los virus bacterianos han proporcionado, por tanto, unos sistemas de experimentacién extremadamente litiles para la genética molecular. Los estudios de estos virus son los responsa- bles del descubrimiento de principios fundamentales de la biologia molecular. Debido al aumento de la complejidad del genoma de las células animales, los virus han sido atin més importantes en los estudios de las células animales que en los estudios de las bacterias. Muchos virus animales se replican y se estudian mediante la formacién de placas en los cultivos celulares, mucho mas que los bacteriofagos. Ademas, los genomas de los virus animales son simila~ res en complejidad a los virus bacterianos (variando aproximadamente desde 3,000 a 300.000 pares de bases), de tal forma que los virus animales son mu- cho mas manejables que los de sus células huésped. Existen diversidad de virus animales, cada uno de ellos presentando ADN o ARN como material genético (Tabla 1.3). Una familia de virus animales —los retrovirus— contienen genomas de ARN en sus particulas virales pero sintetizan tuna copia de ADN de su genoma en las células infectadas. Estos virus proporcio- nan un buen ejemplo de la importancia de los virus como modelos, ya que los estudios de los retrovirus fueron los que demostraron la sintesis del ADN a partir de los moldes de ARN —una manera fundamental de transferencia de informa- cidn genética ahora conocida en células procariotas y eucariotas. Otros ejemplos en los que los virus animales han proporcionado modelos importantes para la investigacion de sus células huésped incluyen estudios de la replicacion del ADN, transcripcion, procesamiento del ARN, y transporte y secrecion de proteinas. Cabe destacar que la infeccién por algunos virus animales, en lugar de ma- tara la célula huésped, convierten a una célula normal en una célula cancerosa. Los estudios sobre estos virus causantes de cénceres, descrites por primera Familia del virus Miembro representative (miles de pares de bases) Genomas ARN Picornavanus Polovins 73 Togavius Virus dela rubéola 12 Flavivius Vitus eta ere amarila 10 Paramixovirus Virus ol sarampion 16.20 Oxomixovius Vitus de la gripe 14 Retrovius Vis de a irmunodeticoncia 8 hhuranee Genomes ADN Hepacnavicus Virus dela hepatitis B 32 Papovavis Papilomavirus human 53 ‘Adenovirus Adenovirus 36 Herpesvirus Virus dol nerpos simple 120-200 Poxwinus Virus vaccinia 130-280Capitulo 1 * Visién global de la célula e investigacion celular @ 37 vez por Peyton Rous en 191 1, no solo han proporcionado las bases de nuestro actual conocimiento del cancer a nivel molecular y celular. sino que también han ‘conducido al descubrimiento de muchos mecanismos moleculares que contro- lan el crecimiento y la diferenciacién de las células animales. ORIGEN Y EVOLUCION DE LAS CELULAS La primera cétula: Todas las células existentes en la actualidad, procariotas y eucariotas, descienden de un tinico antepasado. Se cree que la primera célula apareci6 al menos hace 3.800 billones de afios como resultado del recubri- miento de! ARN, capaz de autorreplicarse, en una membrana de fosfolipidos.. Evolucién det metabolismo. Las primeras reacciones para la creacion de energia metabdlica fueron en forma de glicolisis anaerobia. Después evolu- cioné la fotosintesis, seguida del metabolismo oxidativo. Actuales procariotas: Los actuales procariotas se encuentran divididos en dos grupos, las arquebacterias y las eubacterias, que divergen al principio de fa evolucion, Células eucariotas: Las células eucariotas, que son mas grandes y comple- jas que las células procariotas, contienen un nucleo, organulos citoplasmati- 08, y un citoesqueleto. Se cree que han evolucionado de una asociacion simbidtica de las procariotas. Desarrollo de los organismos mutticelulares: Los eucariotas mas simples ‘son organismos unicelulares, como las levaduras y las amebas. Los organis- mos multicelulares evolucionaron por la asociacion entre los eucariotas unice- lulares, y la reproduccién por divisi6n condujo al desarrollo de muchas clases de células especializadas que forman las plantas y animales del presente. CELULAS COMO MODELOS EXPERIMENTALES E. coll: Debido a su simplicidad genética y su facil estudio, las bacterias, como €, col resultan particularmente utiles para la investigacion de los as- pectos fundamentaales de la bioquimica y biologia molecular. Levaduras: Por ser las células eucariotas mas simples, las levaduras son un modelo importante para el estudio de diversos aspectos de la biologia celular eucariota. Dictyostelium discoideum: El eucariota unicelular Dictyostelium se utiliza extensamente para el andlisis experimental del movimiento celular. Caenorhabditis elegans: El nematode C. elegans es un organismo multice- lular simple que sirve como modelo importante para la biologia del desarrollo, Drosophila melanogaster: Debido al andlisis genético tan extenso, los es- tudios de la mosca de la fruta Drosophila han conducide a avances superio- res en el entendimiento del desarrollo animal. Arabidopsis thaliana: La pequetia planta de tlor Arabidopsis se utiliza como modelo para los estudios de la biologia molecular de las plantas y su desarrollo, Vertebrados: Muchos tipos de células de los vertebrados pueden crecer en cultivo, donde pueden ser estudiadas bajo condiciones de laboratorio contro- ladas. Los tipos de células especializadas, como las neuronas y las células musculares, proporcionan modelos ittiles para la investigacién de determina- dos aspectos de la biologia celular. La rana Xenopus laevis y el pez cebra son importantes modelos para el estudio del desarrollo de los primeros vertebra- dos, y el ratén es la especie de mamitero adecuada para el andlisis genético, célula procariote, célula eucariota, ‘mundo dol ARN, fostolipido antipstices, hidrofébico, hidrofilico fenosina S-Arlfosfato (ATP), glicoisis, fotosintesis, metabolismo oxidative pared celular, membrana plasmstica, ‘lbosoma ‘icleo, mitocondria, cloroplasto, lisosoma, peroxisoma, vacuola,reticulo tendoplasmatico, aparato de Gola), cltoesqueleto, endosimbiosis levadura, Saccharomyces cerevisiae, ‘seudopodium, célula epitelal, fibrobiasto, eritrocto, granulocito, ‘monocito, macrétago, linfocito, neurona Dictyostelium discoideum Caenorhabditis elegans Drosophita melanogaster Arabidopsis thaliana Xenopus laevis, pez cebra,ratén ‘ransgénico38 @ Seccién | * Introduccién INSTRUMENTOS DE LA BIOLOGIA CELULAR Microscopia éptica: Se aplican diversos métodos para visualizar las células y las estructuras subcelulares y para determinar la localizacién intracelular de moléculas especificas usando el microscopic éptico. ‘Microscopia electrénica: La microscopia electronica, con una resolucién apro- ximada cien veces mayor que la del microscopio éptico, se utiliza para analizar los detalles de la estructura celular. ‘Separacién subcelular. Los organulos de las células eucariotas se pueden ais- lar para su andlisis bioquimico mediante la centrifugacion diferencia, Crecimiento de células animales en cultivo: La propagacion de las oélu- las animales en cultivo ha permitido el estudio de los mecanismos que con- trolan el crecimiento y la diferenciacién. Cultivo de células vegetales: Los cultivos de células vegetales se pueden diferenciar para formar tipos de células especializadas, en algunos casos, pueden regenerar plantas enteras. Virus: Los virus proporcionan modelos simples para el estudio de la funcién. celular. Preguntas 1. {Qué caracteristicas fundamentales 6. _Discute las evidencias que apuntan poseen todas las células vivas presentes fn la Tietra? (Dar al menos tres). 2. {Qué demastraron los experimentos de Stanley Miller sobre la formacién de moléculas organicas? 3. {Qué tipo de macromolécula es ca- az de dirigir su propia autorreplicacién? 4. {Por qué se cree que la fotosintesis ha favorecido la evolucién del metabolis- ‘mo oxidative? 8. ;Por|a formacién de una membrana plasmatica semipermeable en torno a un grupo de macromoléculas autorreplican: tes un paso tan importante en el origen de la vida? ‘que las mitocondrias y os cloroplastos se originaron a partir de bacterias que {ue- ron internalizadas por el precursor de las ccélulas eucariotas. 7. Qué resolucién se puede obtener ‘con un microscopio éptico si la muestra se observa al airo on lugar do a través de aceite? Asume que la longitud de onda de la luz visible es 0,5 jam 8. {Qué ventaja poses ol uso de la pro- teina verde fluorescente (PFV) sobre e! empleo de anticuerpos marcados con sondas fluorescentes para el estudio de la localizacion y movimiento de una pro- teina en el interior celular? resolucién, microscopia de campo tuminoso, microscopia de fase-contraste, ‘microscopia interferencia-contraste diferencia, microseopia Inteferencia-contraste diferencia! ppotenciada con video, micrascopia ftuorescente, proteinafluorescente verde (PFV), microscopia contocal, Imicroscopia por excitacién multifoténica ‘microscopia de transmision de ‘lectrones, sombreado de metal, ‘separacién por congelacion, microscopia clectronica de barride centritugacién diferencia tultracentritugacién, centritugacién en radiente densidad, centritugacién por ‘velocidad, centritugacion de equilibrio ‘célula madre embrionaria, cultivo primario, inea celular cello bacterisfago, retrovirus 9. identifica las distinas caracteristicas de las propiedades de los orgdnulos que permiten la separacién por centritugacion de velocidad en un gradiente de sucrosa ¥ centriftugacion de equilbrio en un gra- diente de sucrosa 10. Las levaduras se han utilzado como ‘modelos para el estudio de muchos as- pects de la biologia de las células euca- riots. {Por qué no resultan un modelo apropiado para ol analisis do los movi- rmientos celulares animales? 11. (Por qué es importante la capacidad de cultivar céluias madre embrionarias? 12. Diferenciar entre cultvos de células primarias ylineas celulares inmortaizadas.Capitulo 1 * Visién global de la célulae investigacion celular @ 39 Bibliografia Origen y evolucion de las células Andersson, S.G. E,, A. Zomorodipour, JO. ‘Andlersson, T. Sicheritz-Ponten, U. C. M. AAlsmark, R. M. Podowski, AK. Naslund, A-S. Frksson, H. H. Winkler and C. G. Kurland. 1998. The genome sequence of Ricktisa prowazekii and the origin of mito chondria. Native 396: 138-140. [P] Brocks, J 1G. A. Logan, R. Buick and R. E Summons, 1999. Archean molecular fos silgand the early rise of eukaryotes, Scien 2 285: 1033-1036. [P] Bult,C. J. and 39 others. 1996. Complete ge- ome sequence of the methanogenic Ar- chaeon, Methanacaccus jannaschit. Science 373: 1088-1073. [P] Cech, T.R1986, A model forthe RNA-catal ‘yeed replication of RNA. Proc, Natl. Acad Sei, USA 83: 4360-4363. [P] Crick, F. H.C. 1968, The origin of the genetic code. J. Mol. Biol. 38: 367-379. [P] Darnell, J. E-and W. F. Doolittle. 1986. Spe- culations on the early course of evolution. Proc Natl Aaa. Sei, USA 83: 1271-1275 IPI Doolittle, W. F. 1999. Phylogenetic dlassification and the universal tee. Seer fe 284 2124-2128. [K] Gesteland, RF, T- RCech and J. F, Atkins {eels}, 1999, The RNA World. 3nd ed. Plain view, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. bert, W. 1986, The RNA world. Nature 319: 618. [R] Johnston, W. K.,P.]-Unrau, M.S, Laverence, ML E-Glasner and D. P- Bartel. 2001. RNA catalyzed RNA polymerization: accurate dnd general RNA-templated primer ex- tension, Science 292: 1319-1325. [P] Joyce, G. F. 1989, RNA evolution and the ori ns of life. Nate 398: 217-224, [R] Kasting, J F-and JL. Siefert. 2002. Life and the evolution of Earth's atmosphere Science 296; 1066-1068. [R] Knoll, A. H. 1992, The early evolution of eukaryotes: A geological perspective. Science 256, 622-627. [R) Margulis, L. 1992. Sybinsis in Cell Evolution. ‘nd ed. New York: W. H. Freeman. Miller, 5. L. 1953. A production of amino acids lunder possible primitive earth conditions, Science 117: 528-529. [P] Mojesis, S.J, G. Arrhenius, K. D. McKeegan, TM. Harrison, A. P. Natman and C. RL. Friend. 1986, Evidence for lfe on Earth be fore 3800 mallion years ago. Nature 384: 5559. (P] (Orgel, LE. 1998. The origin of life—a review fof facts and speculations. Trends Biochem Su, 25:491-495. IR] Pace, N.B, 1997, A molecular view of micro- bial diversity and the biosphere. Science 276: 734-740. [R] Shixing, Z. nd C. Huineng, 1995, Megasco- pic multicellular organisms. from. the c 17oximiltion-year-old Tuanshanzi forma tion in the Jixian area, north China, Science 270: 620-622. [P] Woese, C. K,, 0. Kandler and ML. Wheelis 1990. Towards a natural system of orga rnisms: Proposal for the domains Archae, Bacteria, and Eucarya. Proc. Null. Acnd. Sei USA 87: 4576-1579. [P] Células come modelos experimentales Adams, M. D. and 194 others. 2000. The ge Thome sequence of Drosophila melanogaster Science 287: 2185-2195, [P] Blattner, F.R, G. Plunkett IIL, C. A. Bloch, N.T- Pema, V. Burland, M. Riley, J. Coll do-Vides, JD. Glasner, C. K. Rode, G. F Mayhew, J. Gregor, NW. Davis, HLA. Kirkpatrick, M. A. Goeden, D. J. Rose, B ‘Mau'and Y. Shao. 1997. The complete ge- home sequence of Eschevichin coli Kel Science 277: 1453-1462. [P] Botstein, D, S.A. Chervitz and J. M. Cherry 1087. Yeast as. model organism. Science 27; 1259-1260. [R] Goffeau, A. and 15 others. 1996, Life with {5000 genes. Science 274: 546-567. [P] Hamilton, B.A. and W.N. Frankel. 2001. OF ‘mice and genome sequence. Cell 107: 13- 16.18] Hogan, B., R. Beddington, F. Costantini and E. Lacey, 1994. Manipulating the Mouse Embryo, 2nd ed. Plainview, NY: Cold nig Harbor Laboratory Press. International Human Genome Sequencing Concortivm. 2001. Initial sequencing andi analysis of the human genome. Nature 4408: 860.921. [P] Maliga,P., DF Klessig, A. R. Cashmore, W. Gruissom and JE. Varner (eds). 1995. ‘Methods in Plant Molecular Biology. Plain ‘view, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Meyerowitz, E. M.20X2. Plants compared to ‘animals: the broadest comparative study fof development. Science 295: 1482-1485, IR] Neidhardt, F. C., R. Curtiss IL, J Le Ingra- ham, E.C.C. Lin, K. B. Low je, BL Maga- sani W. Reznikoff, M. Riley, M. Schaech= ter and H. E. Umbarger (eds). 1996, Escherichia coli aid Salmonella: Cellular fad Molecular Biology. 2nd ed. Washing: ton, DC: ASM Press. Sive, HL, RLM. (Grainger and RM. Harland (eds). 199. Enrty Development of Xenopus laevis: A Course Manu. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. The Arabidopsis Genome Initiative. 2000 ‘Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana, Nati- re 408: 79815, (PL Te C. elogans Sequencing Consortium. 1998, Genome sequence of the nematode C. le- sans platform for investigating biology Science 282: 2012-2018. [P] Thisse, C. and L. L Zon. 2002. Organogene- Sis—heart and blood formation from the Zebrafish point of view. Science 295: 457- 462. [R] Venter, |. C. and 273 others. 2001, The se "quence of the human genome. Scene 291 1304-1351. [P] Instrumentos de la biologia molecular Bowers, WF 1998, Christian de Dave and the discovery of lysosomes and perosis0 ines. Trends Cel Bi) 8. 350.333 [R] Calms} 6. Stent and J.D. Watson feds) 1082, age an he Oris of Meal Bi logy: Planview, NY: Cole Spring Harboe [Aboratory Prove Chali, M1985. Green thorescent protein Photche. Potoa 6: 631-656.) Claude, A975, The coming of age of the all Scene 199243045.) DeDaive, 1975, Exploring cells with ean trifuge Siete 199 186194. [R] Eagle HL 1958. Notrition nee of mamms an cols intsue culture Sconce 235 442 unin Flin 8 J LW. Engust, RM. King V.R Racanillo and A.M. Skalka. 199. Pr pies of Vrsogy: Meco Bay, Paine Isis and Canto Washington, DC: ABM Press Graham, J-and D. Rickwood fed), 1997, Sl CelutrFractination: A Prato Approach New York, Oxtond University Press Kam, E Zamir and 8. Geiger. 200, Pro ing molecular processes in live cals by uanitative "multidimensional crow Sop Troe Catt Bi. 11-325-84. [8] Lacey, A.J (es) 1999, Light cress in Tag A Praca! Approach. New York Oxford University Pres Palade, G. 1975. Intacelllar aspects ofthe roses of protein sitesi Si 13 S756. Piston, D_W-198, Imaging living cells and Tissues by tworphoton excation micros opy. Trends Cll Bk 9: 669 I Torte KR, A. Claude and FF Fall 1043, A study of tissue culture cells hy election microscopy. J Ex Mad. 8: 233 oir Rous, P1911, A sarcoma of the fowl tans missile by an agent separable fom the tumor cells Exp: Mat 1397-311 [PI] Salmon, E. B_1995, VEDIC light micros cepy and the discovery of kinesin. Tends CMe 5151158 TR pevtr, D1, R, Goldman and. Lelnwand 7298 Celt A Laratory Alena. Pa views, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press Tsien, RY. and A Miyawaki. 1998. Seeing the machinery of live ella, Scr 28 10541955 TRComposicion molecular de las células 41 Papel central de las enzimas como catalizadores bioldgicas 56 Energia metabdlica 63 Biosintesis de los componentes colulares 73 Membranas celuiares 79 Exrenimento cLavE Piegamiento de las cadenas polipeptidicas 52 MEDIGINA MOLECULAR: Fenilcetonuna 77 Quimica celular {AS CELULAS SON ESTRUCTURAS INCREISLEMENTE COMPLEJAS Y VARIADAS, ca- paces no sélo de auto-replicarse —la propia esencia de la vida— sino también de realizar una amplia gama de tareas especializadas en orga- nismos pluricelulares. Sin embargo, las células siguen las mismas leyes de la quimica y la fisica que determinan el comportamiento de los sistemas inertes, En consecuencia, la biologia molecular modema trata de entender los procesos moleculares en términos de reacciones fisicas y quimicas. Este capitulo trata los principios fundamentales de la quimica biol6gica que gobiernan la vida de las células. No pretende ni ser un tratado extenso sobre bioquimica ni describir todas las reacciones metabdlicas de las células. Mas bien, el capitulo se centrara en cinco temas principales: tipos de moléculas den- tro de las células, papel central de las proteinas como catalizadores biol6gicos, generacién y utilizacion de energia metabdlica, biosintesis de los principales Componentes celulares y estructura de las membranas biologicas. La com- prensién de estos fundamentos quimicos constituye la base para entender los distintos aspectos de la estructura y funcion celulares que se trataran en este texto. n molecular de las células Composi Las células estan compuestas do agua, iones inorganicos y moléculas que con- tienen carbono (orgdnicas). El agua es la molécula mds abundante en las célu- las, representando el 70% o mas de la masa celular total. En consecuencia, las interacciones entre el agua y el resto de los componentes celulares tienen una importancia central en la quimica biolégica. La propiedad critica del agua al respecto es que es una molécula polar, donde los atomos de hidrégeno poseen una carga ligeramente positiva y el oxigeno posee una carga ligeramente nega- tiva (Fig, 2.1). Debido a su naturaleza polar, las moléculas de agua pueden formar enlaces o puentes de hidrégeno entre si 0 con otras moléculas polares, asi como interaccionar con iones cargados positiva o negativamente. Como resultado de estas interacciones, los iones y las moléculas polares son facil- mente solubles en agua (hidrofilas). Por el contrario, las moléculas no polares, que no pueden interaccionar con el agua, son escasamente solubles en un me- dio acuoso (hidréfobas). En consecuencia, las moléculas no polares tienden a minimizar su contacto con e! agua relacionandose estrechamente entre si Como se trata mas adelante en este capitulo, las interacciones de moléculas polares y no polares con el agua y entre si desemperian papeles cruciales en la formacion de estructuras biolégicas, como las membranas celulares. a42 @ Seccidn | + Introduccién “ ® Q Eeloe 0 apts de rider ” | / oO 2s Figura 2.1 Caracteristicas del agua. (A) E! agua es una molécula polar, con una carga ligeramente ‘negativa (0) en el atomo de oxigeno y una carga ligeramente positva (9°) en los atomos de hidrégeno, Debido a esta polaridad, las moléculas de agua pueden formar enlaces 0 ppuentes de hidrégeno (lIneas discontinuas) bien entre si o con otras moléculas polares (B), ademas de interaccionar con iones cargados (C). Los iones inorganicos de la célula, incluyendo el sodio (Na"), potasio (K’), magnesio (Mg**), calcio (Ca®), fosfato (HPO; ), cloro (CI) y bicarbonato (HCO,), constituyen un 1% 0 menos de la masa celular total. Estos jones estén implicados en numerosos aspectos del metabolismo celular, y de este modo, se unen mediante un'enlace entre los carbones 1 y 4, eee ea ‘que por ello recibe el nombre de enlace glucosidico x (1-»4).44 © Seccidn | Introduccién Amitopectina (almidén) Glucégeno Colulosa ————-_, Figura 24 Estructura de los polisacéridos. Los ppolisacaridos son macromoléculas cons tituidas por cientos o miles de azUcaras simples. El glucégeno, e| almidon y la ce- lulosa estén todos compuestos unica- mente por residuos de glucosa, que es- ‘an unidos por enlaces glucosidicos 2 (14) en el glucageno y e! almidén, pero por enlaces (1-4) en la celulosa, El ‘glucdgeno y una forma de almidon (ami Topeotina) tambien presentan ocasional mente enlaces 2 (1 -»6), que sirven como ppuntos de ramificacién al unir dos cade- has independientes « (1-+4) (Reasnue hace que la celulosa forme largas cadenas lineales que se empaquetan una junto a otra para formar fibras con gran fuerza mecénica, ‘Ademas de sus papeles en el almacenamiento de energia y en la estructura celular, los oligosacaridos y los polisacéridos son importantes en una variedad de procesos de sefalizacién celular. Por ejemplo, los oligosacaridos se encuen- tran frecuentemente ligados a proteinas, donde funcionan como marcadores para dirigir las proteinas a la superficie celular o para incorporarias a distintas organelas subcelulares. Los oligosacairidos y los polisacaridos también funcio- nan como marcadores en la superficie celular, desempenando importantes pa- peles en el recanocimiento celular y en las interacciones entre células en los tejidos de los organismos pluricelulares. Lipidos Los lipides desempefian tres funciones basicas en las células. Primero, pro- porcionan una importante fuente de energia. Después, y de gran importancia en la biologia celular, los lipidos son el componente principal de las membranas celulares. Y por ultimo, los lipidos desemperian importantes papeles en la seria- lizacién celular, bien como hormonas esteroideas (p. e., estrageno y testostero- na), o como mensajeros moleculares que trasiadan senales desde los recepto- res de la superficie celular hasta dianas dentro de la célula. Los lipidos mas simples son los acidos grasos, consistentes en largas ca- denas hidrocarbonadas, que con mayor frecuencia contienen 16 0 18 atomos de carbono, con un grupo carboxilo (COO) en un extremo (Fig. 2.5). Los dcidosCapitulo 2 * Quimica celular @ 45 bien! Estesiete (Ci) Stes Cl Estructura de los acidos grasos. Los cides grasos consisten en largas cade- ras hidrocarbonadas que terminan en un ‘grupo earboxilo (COO). El palmiato y el estearato son acidos grasos saturados que constan de 16 y 18 atomos de carbo- no respectivamente. El oleato es un dcido {graso insaturado de 18 carbonos que con: tiene un doble enlace entre los caroonos 9 10, Observen que el doble enlace produ: ‘ce un acodamiento en la cadena hidrocar- bonada cticart MG Se aol ine ie Progresién dela reaccion —> Figura 2.22 Diagramas energéticos para reaccio- nes catalizadas y no catalizadas. La reaccion ilustrada es la conversion simple e un sustrato $a un producto P. Debido fa que el estado final de energia de Pes menor que el de S, la reaccion progresa de izquierda a derecha. Para que la reac- cién tenga lugar, sin embargo, S debe pa- ‘sar primero por Un estado de transicion de ‘mayor energia. La energia requerida para alcanzar este estado de transicion (la fenergia de activacién) representa una ba- rrera al desarrollo de la reaccion y por lo tanto determina la velocidad a la que la reaccion avanza. En presencia de un ca: talizador (p. 6)., una enzima), la energia de activacion disminuye y la reaccion se produce a una velocidad acelerada, Figura 2.23 Catilisis enzimética de una reaccién entre dos sustratos. La enzima propor- ciona un molde sobre el que los reactan- tes se aproximan en la posicin y orienta- ci6n adecuada para reaccionar entre si Producto58 @ Seccién | ¢ Introducci “ P Sustrato Mecanismos de catdlisis enzimatica La unién del sustrato al sitio activo de una enzima es una interaccién muy Silesia especifica. Los lugares activos son grietas o hendiduras en la superficie lallavey de una enzima, habitualmente compuestas de aminoacidos de diferentes la cerradura partes de la cadena polipeptidica que se aproximan con la estructura ter- — ciaria de la proteina plegada. Los sustratos se ligan inicialmente al lugar activo mediante interacciones no covalentes, incluyendo enlaces de hi- drogeno, enlaces inicos e interacciones hidrdfobas. Una vez que el sus: E! sustrato y la enzima trato esté unido al lugar activo de una enzima, miltipies mecanismos pue- la conformacion del ‘Aunque este sencillo ejemplo tratado en la seccién anterior implicaba @ @ sondisiorsionacosa den acelerar su conversion en el producto de la reaccién estado de transic’on _yna Unica molécula de sustrato, la mayoria de las reacciones bioquimicas Aiuste implican interacciones entre dos o més sustratos ciferentes. Por ejemplo, inducigo la formacién de un enlace peptidico implica la unién de dos aminoacidos, — Para reacciones como esta, la unién de dos o mas sustratos al lugar acti- Figura 2.24 ‘Modelos de la interaccién enzima-sus- trato. (A) Enel modelo de la llave y la co- rradura, el sustrato encaja perfectamente en el sitio activo de la enzima, (B) En ol ‘modelo de ajuste inducida, la unién del sustrato distorsiona las conformaciones tanto de la enzima como del sustrato, Esta distorsién aproxima al sustrato ala contor- macion del astado de transicion, aceleran- {do de este modo la reaccién, Figura 2.25 Ligamiento del sustrato por las se- rin proteasas. El aminoacido adya- ‘cente al enlace peptidico que sera roto se inserta en un sbolsillo» en el sitio activo de la enzima. En la quimotrips: ra, el bolslo liga aminoacidos hidisfo- bos; el boisila de union de la tripsina ‘contiene un residuo de aspartato car. gado negativamente que liga aminod- cides basicos mediante una interac cidn ionica vo en la posicion y orientacién adecuada acelera la reaccion (Fig. 2.23) La enzima proporciona un molde sobre el que los reactantes se aproxi- man y se orientan correctamente para favorecer la formacion del estado de transicion en el que interactuan. Las enzimas también aceleran las reacciones alterando la contormacién de sus sustratos para acercarse al del estado de transicién. El modelo mas sencillo de interaccién enzima-sustrato es el modelo de la lave y la cerradura, on el que el sustrato encaja perfectamente en el sitio activo (Fig. 2.24). En muchos casos, sin embargo, las contiguraciones tanto de la enzima como del sustrato son modificadas por la unién del sustrato —un proceso denominado ajuste in- ducido—. En estos casos la conformacién del sustrato se altera de tal forma que se asemeja mas a la del estado de transicién. El estrés producido por esta distorsién en el sustrato puede facilitar atin mas su conversion hasta alcanzar el estado de transicién debilitando enlaces cruciales. Ademds, el estado de transi cidn se estabiliza por su estrecha union a la enzima, disminuyendo de este modo la energia de activacién requerida. Aparte de reunir miltiples sustratos y distorsionar la conformacién de los sustratos para aproximarios al estado de transicién, muchas enzimas participan directamente en el proceso catalitico. En estos casos, las cadenas laterales especificas de aminodcidos en el sitio activo pueden reaccionar con el sustrato y formar enlaces con intermediiarios de la reaccién. Los aminodicidos acidos y basicos estan frecuentemente implicados en estos mecanismos catallticos, como se demuestra en la siguiente discusién sobre la quimotripsina como un ejemplo de catalisis enzimatica Enlace peptisico que sera escindido Interaceién hidrotébica Interaccién ténicaFigura 2.26 Mecanismo catalitico de la quimiotrip- sina, Tres aminodcidos en el sitio acto (Ser-195, His-57 y Asp-102) desemperian ppapeles crucialos on la catalisis. La quimotripsina es miembro de una familia de enzimas (las serin pro- teasas) que digieren las proteinas ca- talizando la hidrolisis de los enlaces peptidicos. La reaccién puede escribir- se como sigue: Proteina + H.0 > Péptido, + Péptido, Los diferentes miembros de la fami- lia de las serin proteasas (incluyendo quimotripsina, tripsina, elastasa y trom- bina) tienen especificidades de sustra- to caracteristicas; rompen preferente- mente enlaces peptidicos adyacentes a diferentes aminodcidos. Por ejem- plo, mientras que la quimotripsina di- giere enlaces adyacentes a aminoaci- dos hidréfobos, como el triptéfano y la fenilalanina, la tripsina digiere enlaces junto a aminoacidos basicos, como la lisina y la arginina. Todas las serin pro- teasas, sin embargo, son similares en estructura y emplean el mismo meca- rnismo de catalisis. Los sitios activos de estas enzimas contienen tres ami- noacidos cruciales —serina, histidina y aspartato— que conducen la hidrdlisis del enlace peptidico, En verdad, estas enzimas se denominan serin protea- sas debido al papel central del residuo de serina, Los sustratos se ligan a as serin proteasas mediante la insercién del aminodcido adyacente al sitio de corte en un bolsilio en el lugar activo de la enzima (Fig. 2.25). La naturaleza de este bolsillo determina la especificidad de sustrato de los diferentes miembros de la familia de las serin proteasas. Por ejemplo, el bolsillo de union de la quimotripsina contiene aminoacidos hidr6fobos que interaccionan con las cadenas laterales hidrofobicas de sus sustratos preferidos. En contraste, el bolsillo de unién de la tripsina contiene un aminodcido cargado negativamen- te (aspartato), que es capaz de formar un enlace iénico con residuos de argi- nina o de lisina de sus sustratos, vm % ee wena oh vm o ° Sto de corte / ef “co terminal e | eT | we Sono! Ne che | Capitulo 2 * Quimica celular @ 59 La Sor-195 transfiore un H” ata His-57 y forma un intermediario 0 estado tatrahedrico de transicion ‘con el sustrato. EI Asp: 102 ‘estabiliza la transferencia del H” ala His-57 mediante una interaceién nica 1C terminal ELH" transferido de la peptide libre | His-57 al sustrato;ruptura| del enlace poptiaico Entra H,0 en el sitio activa formando un enlace de hidrageno con la His-57 E1H,0 transliere un H" ala His-57_ y OW al sustrato, fommando un Segundo estado de transicién terrandareco EIH* transtorido de la His-57 de vuelta @ la Ser-195; el peptido N terminal se libera de la enzima60 © Seccién | * Introduccion La unién del sustrato sitda al enlace peptidico para ser desdoblado cercano ala serina del lugar activo (Fig. 2.26). El proton de esta serina entonces se transfiere a la histidina del lugar activo. La conformacién del lugar activo favo- rece esta transferencia de protones porque la histidina interacoiona con el re- siduo de aspartato cargado negativamente. La serina reacciona con el sustra- to, formando un intermediario 0 estado de transicion tetrahédrico. El eniace peptidico entonces se desdobla, y la porcién C-terminal del sustrato se libera de Ja enzima. Sin embargo, el péptido N-terminal permanece unido a la serina. Esta situacién se resuelve cuando una molécula de agua (el segundo sustrato) entra en el sitio activo y revierte las reacciones precedentes. El proton de la molécula de agua se transfiere a la histidina, y su grupo hidroxilo al péptido, formando un segundo estado de transicién tetrahédrico. El protén se transtiere entonces de la histidina de vuelta a la serina, y el péptido se libera de la enzima, completando la reaccién. Este ejemplo ilustra diversos aspectos de la catélisis enzimatica; la especiti- cidad de las interacciones enzima-sustrato, la colocacién de las distintas molé- culas de sustrato en el sitio activo, y la implicacién de los residuos del sitio activo en la formacién y estabilizacion del estado de transicién. Aunque miles de enzi- - —_ |] ue @ \_/ Figura 2.27 Papel del NAD" en las reacciones de éxido-reduc- cién. (A) Elnicotinamin adenin dinuclestido (NAD") acta como un transportador de electrones en las reacciones de ‘Oxido-reduccion aceplando electrones (e°) para formar NADH, (8) Por ejemplo, el NAD" puede aceptar electrons dde un sustrato (S1), produciendo S1 oxidado mas NADH. EI NADH formado en esta reaccién puede entonces trans- {enrsus electronesa un segundo sustrato (S2), producien- ddo $2 reducido y regenerando NAD". El efecto nete es la, transterencia de electrones (transportados por NADH) de 'S1 (que se oxida) a S2 (que se reduce).Capitulo 2 ¢ Quimica celular @ 61 Coenzima Vitamina relacionada —_-Reaccion quimica NAD, NADP* Niacina Ondo reduesion FAD ibolavin (,) Srido-eaecion Tamia piolestato Tiana (8) “Translerencia de grupos aldehido Cooraira A Pantienico Transtoronca de grupos aco Totrahicrfolto ——Foato “Transleronca de grupos de un carbon Bitna Biotina Carboxiacion| Prdoxalfostte idol (8) Transaminacien mas en las células catalizan muchos diferentes tipos de reacciones quimicas, Jos mismos principios basicos se aplican a su funcionamiento. Coenzimas Ademas de unir a sus sustratos, los lugares activos de muchas enzimas ligan otras pequenas moléculas que participan en la catélisis. Los grupos prostéticos. son pequefias moléculas unidas a proteinas en las que desempefian papeles. cruciales. Por ejemplo, el oxigeno transportado por la mioglobina y la hemoglobi- na esta unido al hemo, un grupo prostético de estas proteinas. En muchos casos iones metalicos (como el cinc o el hierro) estan unidos a enzimas y desempenan papeles centrales en el proceso catalitico. Ademas, varias moléculas organicas Ge bajo peso molecular participan en tipos especticos de reacciones enzimat- cas. Estas moléculas se denominan coenzimas porque trabajan junto con las enzimas para aumentar la velocidad de reaccién, A diferencia de los sustratos, las Coenzimas no se atean de forma iteversible por las reacciones en las que parti pan, Mas bien, se reciclan y pueden participar en miltiples reacciones enzimaticas. Las eoenzimas siren como transportadores de distintos tipos de grupos quimicos. Un ejemplo importante de una coenzima es el nicotinamin adenin dinucleétido (NAD*), que funciona como transportador de electrones en reac- clones de éxido-reduccién (Fig. 2.27). EI NAD" puede aceptar un ién de hideo- geno (H’) y dos electrones (2°) de un sustrato, formando NADH. EI NADH pue- de entonces donar estos electrones a un segundo sustrato, reformando NAD". De este modo, el NAD” transfiere electrones del primer sustrato (que se oxida) al segundo (que se reduce). tras coenzimas diversas también actin como transportadores de electro- Figura 2.28 nes, e incluso otras estan implicados en la transferencia de una variedad de —_Inhibicion Ls retroalinenecién. el grupos quimicos adicionales (p. ej., grupos carboxilo y grupos acilo; Tabla 2.1). deel tmp br tga weg {lag mismas coenzimas funcionan junto a una variedad de diferentes enzimas _¢/Scioucina es eatalzago por la enzima para catalizar la transferencia de grupos quimicos especificos entre una amplia. esta enzima esta inhibida por la isoleuct gama de sustratos. Muchas coenzimas estan estrechamente relacionados con _na, el producto final de la via. fas vlaminas, que contibuyen a formar parte o toda la estructura de la coenz- ima. Las vitaminas no son necesarias para bacterias como E. colipero son com- a ponentes necesarios de la dieta de los humanos y otros animales superiores, ps que han perdido la capacidad para sintetizar estos compuestos. tastes] ©. Regutaci6n de la actividad enzimatica e-Getobutirato Un aspecto importante de la mayoria de las enzimas es que sus actividades no son constantes, pero en cambio pueden ser moduladas. Esto es, las activida- g des de las enzimas pueden ser reguladas de tal forma que funcionan adecuada- y mente para cubrir las diversas necesidades fisiol6gicas que pueden surgir du- rante el ciclo celular. Un tipo trecuente de regulacién enzimatica es la inhibicién por retroali- fsoleucina mentacién, en la que el producto de una via metabdlica inhibe la actividad de62 @ Seccidn | * Introduce! Figura 2.20 Regulacion alostérica. En este ejemplo, la actividad enzimatica es inhibida por la unin de una molécula requladora a un si tio alostérico, En ausencia del inhibidor, sustrato se une al sitio activo de la enzima la reaceion progresa. La unién del inhibi dor al sitio alostérico induce un cambio cconformacional en la enzima o impide la Unién del sustrato, La mayorla de las enzi- mas alostéricas constan de muttiples su- bunicades. Figura 2.30 Fosforilacién de proteinas. Algunas en- Zimas estan reguladas por la adicién de ‘grupos fosfato a los grupos OH de las cade- nas laterales de residuos de serina (como se muestra aqui), treonina o trosina. Por ejemplo, la enzima glucégeno fosforilasa, que calaliza la conversion del glucégeno a glucosa- -fosfato, es activada por fosfori- lacién en respuesta a la union de epinetri- naa las células musculares, Active Inactive ‘Sustrato unido al sitio activo Inhibidor unico alsitio alosterico una de las enzimas implicadas en su sintesis. Por ejemplo, el aminodcido iso- leucina se sintetiza a través de una serie de reacciones comenzando por el aminodcido treonina (Fig. 2.28). El primer paso de la via esta catalizado por la ‘enzima treonina deaminasa, que es inhibida por la isoleucina, el producto final de la via. De este modo, una cantidad adecuada de isoleucina en la célula inhi be la treonina desaminasa, bloqueando una sintesis mayor de isoleucina, Si la concentracién de isoleucina disminuye, la inhibicién por retroalimentacién dis- minuye, la treonina desaminasa ya no se inhibe, y se sintetiza isoleucina adicio- nal. Regulando de este modo la actividad de la treonina desaminasa, la célula sintetiza la cantidad necesaria de isoleucina pero evita desperdiciar energia en la sintesis de més isoleucina de la necesaria La inhibicion por retroalimentacion es un ejemplo de la regulaci6n alostéri- ca, en la que a actividad enzimatica se controla por la union de moléculas pe- quenas a los lugares reguladores de la enzima (Fig. 2.29). El término «regu- ° ° Ho Ho —y-6-d- -N-€-G- a AT CH, CHy 1 if oH ° sorina e Epinetrina Glucogeno Glucosa-1- fostatoCapitulo 2 * Quimica celular © 63 lacion alostérica deriva del hecho de que las moléculas reguladoras no se unen al sitio catalitico, sino a un sitio especitico en la proteina (allo=«otro» y steric=«si- tio»), La unién de la molécula reguladora cambia la conformacién de la proteina, lo que a su vez altera la forma del sitio activo y la actividad catalitica de la enzima, En el caso de la treonina desaminasa, el ligamiento de la molécula reguladora ('soleu- cina) inhibe la actividad enzimatica. En otros casos las moléculas reguladoras ac- tuan como activadores, estimulando en vez de inhibir sus enzimas diana. Las actividades de las enzimas también pueden ser reguladas por sus inte- racciones con otras proteinas y por modificaciones covalentes, como la adicion de grupos fosfato a residuos de serina, treonina otirosina. La fosforilacién es un ‘mecanismo especialmente frecuente para regular la actividad enzimatica; la adi- Cién de grupos fosfato puede estimular o inhibir las actividades de muchas enzi- mas diferentes (Fig. 2:30). Por ejemplo, las células musculares responden a la epinefrina (adrenalina) degradando el glucégeno a glucosa, proporcionando de este modo una fuente de energia para una actividad muscular aumentada. La de- gradacién del glucégeno es catalizada por la enzima glucégeno fosforilasa, que se activa por la fostorilacién en respuesta a la unién de la epinefrina a un receptor en la superficie de la célula muscular. La fosforiacion de proteinas desemperia un papel central en el control no sélo de las reacciones metabdlicas sino también de muchas otras funciones celulares, incluyendo el crecimiento y diferenciacién celular. Energia metabélica Muchas tareas que debe realizar una célula, como el movimiento y la sinte- sis de macromoléculas, requieren de energia. Una gran parte de las actividades de la célula estan por Io tanto dedicadas a obtener energia del entorno y a em- plear esa energia para activar reacciones que la necesitan. Aunque las enzimas controlan la velocidad de pricticamente todas las reacciones quimicas dentro de las células, la situacién de equilibrio de las reacciones quimicas no esté afectada por la catalisis enzimatica. Las leyes de la termodindmica gobieman el equilibrio quimico y determinan la direccién energéticamente favorable en todas las reac- ciones quimicas. Muchas de las reacciones que deben tener lugar dentro de las células son energeticamente desfavorables, y por lo tanto slo pueden producirse con un ingreso adicional de energia. En consecuencia, las células deben gastar constantemente energia derivada del entorno. La generacién y utilizacién de energia metabslica es por lo tanto fundamental en toda la biologia celular. Energia libre y ATP La energética de las reacciones bioquimicas se describe mejor en términos de funcién termodinamica denominada energia libre de Gibbs (G), asi llamada por Josiah Willard Gibbs, La variacién en la energia libre (AG) de una reaccién combina los electos de cambios en la entalpia (el calor que se libera o es absorbido durante na reaccién quimica) y la entropia (el grado de desorden que resulta de una reac- ién) para predecir si una reaccién es 0 no energéticamente favorable. Todas las reacciones quimicas progresan espontaneamente en la direccién energética- mente favorable, acompanadas por un descenso en la energia libre (AG < 0) Por ejemplo, considérese una hipotética reaccidn en la que A se convierte en B: A=B Si AG <0, esta reaccién progresaré en la direcci6n directa, como se ha eset to. SiAG > 0, sin embargo, la reaccién progresard en la direccién inversa y B se convertira en A. La AG de una reaccién viene determinada no sélo por las propiedades intrin- ssecas de los reactantes y los productos, sino también por sus concentraciones y otras condiciones de la reaccién (p. ej. , la temperatura). De este modo, es uti definirla variacién de energia libre de una reaccion en condiciones estandar. (Las64 @ Secciénl ¢ Introduccién condiciones estdindar se considera que son 1M de concentracién de todos los reactantes y productos y 1 atm de presién). La variacién de energia libre estandar (AG) de una reaccién esta directamente relacionada con su situacion de equil brio porque la AG actual es una funcién de tanto AG” como de las concentracio- nes de reactantes y productos. Por ejemplo, considérese la reaccion A=B La variacién de energia libre puede escribirse como sigue: AG = AG" + ATIn [B) (Al donde Fes la constante de gases y Tes la temperatura absoluta. En equilibrio, AG=0 y la reaccién no progresa en ninguna direccién. La constante de equilibrio para la reaccién (K= [B] [A] en equilibrio) esta de este modo directamente rolacionada con AG por la reaccién anterior, que puede ‘expresarse como sigue: 0=AG°+ATINK AG® =-ATIn Kk Sila relacién actual (B]/[A] es mayor que la razén de ecuilibrio (K), AG > Oy la accion procede en al sentido inverso (conversion de B en A) Por otra parie, si la razén [B]/[A] es menor que la razén de equilirio, AG <0y Aes convertida en B. La variacion de energia libre estandar (AG') de una reaccién por lo tanto determina su equilibrio quimico y predice en que direccién progresard la reac- cién en cualquier conjunto dado de condiciones, Para las reacciones bioquimi- cas, la variacion de energia libre estandar se expresa habitualmente como AG ", que es la variacion de energia libre estandar de una reaccién en un medio acuoso a pH = 7. aproximadamente las condiciones dentro de una oélula. Muchas reacciones biolégicas (como la sintesis de macromoléculas) son termodinamicamente desfavorables (AG > 0) en condiciones celulares. Para que estas reacciones puedan progreser, se necesita una fuente adicional de energia, Por ejemplo, considérese la reaccion A=B AG=+10 kcal/mol La conversién de A en B es energéticamente desfavorable, de modo que la reaccién progresa en la direccién inversa en vez de en la directa. Sin embargo, la direccion puede conducirse en la direccién directa acoplando la conversion de A en B con una reaccién energéticamente favorable, como: C=D AG=-20kcal/mol Siestas dos reacciones se combinan, la reaccién combinada puede escribirse como sigue! A+C=B+D AG=-10kcal/mol La AG de la reaccién combinada es la suma de las variaciones en la energia libre de sus componentes individuales, asi que la reaccién combinada es ener- géticamente favorable y progresara como se describe. De este modo, la con- versién energéticamente desfavorable de A en B esta facilitada por su combina- cién con una segunda reaccién asociada con una gran disminucién en la energia libre. Las enzimas son responsables de llevar a cabo estas reacciones combinadas de una forma coordinada. La célula utiliza este mecanismo basico para faciltar las muchas reacciones energéticamente desfavorables que deben tener lugar en los sistemas bio\égicos. El adenosin 5-trifostato (ATP) desempera un papel protagonista en este pro-Capitulo 2 * Quimica celular © 65 0-#-0-#-0-re é o -0-F-0-P-04 (@@) oe 8 8 é Fr no depot de aneraa ire. Los enlaces ent os grupos oso dol ATP SAT com Gene Soe cman: «| ae SN ECE an te eens th iaae POLIS aa es edaora ‘ceso actuando como un depésito de energia libre dentro de la célula (Fig. 2.31). Los enlaces entre los fosfatos del ATP se conocen como enlaces de alta ener- gia porque su hidrdlisis se acomparia de un descenso relativamente grande en la energia libre. No hay nada especial en los enlaces quimicos en si mismos; se denominan enlaces de alta energia sélo porque una gran cantidad de energia libre se libera cuando son hidrolizados dentro de ia célula. En la hidrdlisis del ATP a ADP mas fostato (P), AG’ = 7.3 kcal/mol. Recuérdese, sin embargo, que AG se refiere a las «condiciones estandar» en las que las concentraciones de todos los productos y reactantes son de 1 M. Las concentraciones reales de P, son aproximadamente de 10” M, y las concentraciones intracelulares de ATP son mayores de las de ADP. Estas diferencias entre las concentraciones intracelu- lares y las del estado esténdar favorecen la hidrolisis de ATP, asi que para la hidrdlisis de ATP dentro de la célula AG es aproximadamente -12 kcal/mol. De forma altemativa, el ATP puede ser hidrolizado a AMP mas pirotostato (PP). Esta reaccién produce aproximadamente la misma cantidad de energia libre que la hidrdlisis de ATP a ADP. Sin embargo, el pirofostato producido en esta reaccién a su vez répidamente se hidroliza, con una AG similar a la de la hidrélisis de ATP. De este modo, la variacién total de energia libre que resulta de la hidrdlisis de ATP a AMP es aproximadamente el doble de la obtenida de la hidrolisis de ATP a ADP. En comparacién, el enlace entre el azticar y el grupo fosfato del AMP, en vez de tener alta energia, es un tipico enlace covalente; para la hidrélisis de AMP, AG” = -3,3 keal/mol.66 © Secciénl + Introduccién Debido al descenso acompafante en la energia libre, la hidrélisis de ATP puede emplearse para promover otras reacciones que requieren energia dentro de la céluia. Por ejemplo, la primera reaccién de la glicolisis (tratada en la quiente seccién) es la conversién de glucosa a glucosa-6-fostato. La reaccion puede escribirse como sigue: Glucosa + Fostato (HPO,*-) + Glucosa-6-fostato + H,O Debido a que esta reaccién es energéticamente desfavorable tal y como esta escrita (AG” = +3,3 kcal/mol), debe facilitarse en la direccién directa aco- plandose a la hidrolisis de ATP (AG = 7,3 kcal/mol) ATP +H.O + ADP + HPO,? La reaccién combinada puede escribirse como sigue: Glucosa + ATP — Glucosa-6-fosfato + ADP La variacién de energia libre para esta reaccién es la suma de las variaciones de energia libre de las reacciones individuales, asi que para la reaccién combi- nada AG” = ~4,0 kcal/mol, favoreciendo la formacién de glucosa-6-fosfato. Otras moléculas, incluyendo otros nuclestidos trifosfatos (p. ¢)., GTP), tam- bién tienen enlaces de alta energia y pueden utilizarse como el ATP para pro- mover reacciones que requieren energia. Para la mayoria de las reacciones, sin embargo, el ATP proporciona la energia libre. Las reacciones que producen energia dentro de la célula estan por lo tanto acopladas a la sintesis de ATP, mientras que las reacciones que requieren energia estan acopladas a la hidréli- sis de ATP. Los enlaces de alta energia del ATP desemperian de este modo un papel crucial en el metabolismo celular al servir como forma de depésito de ‘energia libre utilizable. Generacién de ATP a partir de glucosa La degradacién de carbohidratos, particularmente glucosa, es la fuente princi- pal de energia celular. La degradacién oxidativa completa de glucosa a CO, y H.O puede escribirse como sigue: C.H,,0, +6 ~6CO.+6 La reaccion produce una gran cantidad de energia libre: AG’ = ~686 keal/mol. Para convertir esta energia en una forma utilizable, la glucosa se oxida dentro de las células en una serie de pasos acoplados a la sintesis de ATP. La glicolisis, Ia etapa inicial en la degradacién de glucosa, es similar practi- camente en todas las células. La glicolisis ocurre en ausencia de oxigeno y puede proporcionar toda la energia metabolica de organismos anaerobios. En las células aerobias, sin embargo, la glicolisis es sélo la primera etapa en la degradacion de glucosa. Las reacciones de la glicolisis dan lugar a la degradacién de glucosa a piru- vato, con una ganancia neta de dos moléculas de ATP (Fig. 2.32). Las reaccio- nes iniciales de la via de hecho consumen energia, usando el ATP para fostori- lar la glucosa a glucosa-6-lostato y luego la fructosa-6-fosfato a fructosa-1,6- difosfato. Las enzimas que catalizan estas dos reacciones —hexoquinasa y fos- fofructoquinasa respectivamente— son importantes puntos reguladores de la via glucolitica. El principal elemento de control es la fosfofructoquinasa, que es inhibida por niveles altos de ATP. La inhibicidn de la fosfofructoquinasa da lugar al acumulo de la glucosa-6-fosfato, que a su vez inhibe a la hexoquinasa. De este modo, cuando la célula tiene un suministro adecuado de energia metaboli- ca disponible en forma de ATP, se inhibe la degradacién de glucosa. Las reacciones que siguen a la formacién de fructosa-1,6-ditostato constitu- yen a parte productora de energia de la via glucolitica, La degradacion de fruc- tosa-t,6-difostato produce dos moléculas del azicar de tres carbonos gliceral-Glucosa Glucosa-6- fostato Fructosa-6 fostato Fructosa-1,6- sifostato 4, -08 HQ=o0 0 <> Hg-on HOH 10-08 Gliceraldehido-3 Ditidroxiacetona fosfato fostato Figura 2.32 Reacciones de la glucélisis. La glucosa se dagrada a pituvato, con la formacién neta de dos moléculas tanto de ATP como de NADH. En condiciones anaerdbicas, el NADH ‘se reoxida por la conversion de piruvato a lactato o etanol. En condiciones aerdbicas, 21 pirvato es metabolizado en el ciclo del ‘acido citrico. Obsérvese que una Unica mo lecula de glucosa produce dos moléculas de ‘cada uno de los derivados de tres carbonos productores de energia. Capitulo 2 * Quimica celular @ 67 Energia producida ira 0-9 08 H@-OH 1,3.Ditosfogicerato - — — * OO" 4-08 oS 0@ Fostoenoipinvato He * ’ prwao _Coneiias erobine JOO" © EEE §— Actos citco Hs,68 © Seccion | © Introduccion Figura 2.33 Descarboxilacién oxidativa del piruva- to. Elppiruvato se convierte en CO, y ace- ‘CoA, y se produce en este proceso una molécula de NADH. La coenzima A (CoA- SH) es un transportador general de gru- pos aceliloactivados en diversas reaccio- + — Go. + consO-OH, + HEED © + CoA-sH + Hs Prato Con-si 3 “0-F=0 i Tio ° 6~ch,-cH,-n--6-¢—cit,-0-P=0 Hi On cH, o cH,—CH,—SH 7 dehido-3-fosfato, que se oxida a 1,3-difosfoglicerato. El grupo fosfato de este compuesto tiene una energia libre de hidrdlisis muy alta (AG ' = 11,5 kcal/mol), asi que se utiliza en la siguiente reaccién de la glicolisis para promover la sinte- sis de ATP a partir de ADP. El producto de esta reaccion, 3-fostoglicerato, se convierte entonces en fostoenolpiruvato, el segundo intermediario de alta ener- gia de la glicolisis. En la hidrdlisis del fostato de alta energia del fosioenolpiruva- to, AG" = —14,6 kcal/mol, su conversion a piruvato esta acoplada a la sintesis de ATP. Cada molécula de gliceraldehido-3-fosfato convertida a piruvato se acopla de este modo a la generacién de dos moléculas de ATP; en total, se sintetizan cuatro moléculas de ATP a partir de cada molécula inicial de glucosa. Puesto que se requieren dos ATPs para promover las reacciones iniciales, la ganancia neta de la glicolisis es de dos moléculas de ATP. demas de producir ATP, la glicolisis convierte dos moléculas de coenzima NAD’ a NADH. En esta reaccidn, el NAD” actiia como un agente oxidante que acepta electrones del gliceraldehido-3-osfato. EI NADH formado como produc- to debe ser reciclado sirviendo como donante de electrones para otras reaccio- nes redox dentro de la célula. En condiciones anaerdbicas, el NADH formado durante la glucolisis se reoxida a NAD’ por la conversion de piruvato a lactato o etanol. En organismos aerobios, sin embargo, el NADH sirve como una fuente adicional de energia al donar sus electrones a la cadena de transporte de elec- trones, donde finalmente se utilizan para reducir O, a H,O, acoplado a la gene- racién de ATP adicional En células eucaridticas, la glicolisis tiene lugar en el citoplasma. El piruvato entonces se transporta a la mitocondria, donde su oxidaci6n completa a CO. y H,0 proporciona la mayoria del ATP derivado de la degradacién de glucosa. El siguiente paso en el metabolismo del piruvato es su descarboxilacion oxidativa en presencia de la coenzima A (CoA), que funciona como transportador de grupos acetilo en diversas reacciones metabilicas (Fig. 2.33). Un carbono del piruvato se libera como CO. y los dos carbonos restantes se unen a la CoA para formar aceti-CoA. En este proceso, una molécula de NAD” se reduce a NADH. Elacetil-Coa formado en esta reaccidn entra en el ciclo del acido citrico 0 ciclo de Krebs (Fig. 2.34), que es la via central en el metabolismo oxidativo. El grupo acetilo de dos carbonos se combina con oxalacetato (cuatro carbonos) para producir citrato (seis carbonos). A través de otras acho reacciones, dos carbonos del citrato se oxidan completamente a CO, y se regenera el oxalace- tato, Durante el ciclo, se forma un enlace de alta energia en forma de GTP, que se emplea directamente para promover la sintesis de una molécula de ATP. ‘Ademas, cada vuelta del ciclo produce tres moléculas de NADH y una moléculaCapitulo 2 * Quimica celular @ 69 S-CoA Acell-CoA CoA-SH Oxalacetato Malato Ciclo del ci Fumarato ‘citrico Hi ap a i He b CoA-SH Succinate ° Coa-SH Dp S-CoA : = i [nai] Succiniicon QOD de flavin adenin dinuclestido reducida (FADH,), que es otro transportador de electrones en reacciones redox. El ciclo del acido citrico completa la oxidacién de glucosa a seis moléculas de CO>, Se obtienen cuatro moléculas de ATP directamente de cada molécula de glucosa —dos de la glicalisis y dos del ciclo del acide citrico (una por cada molécula de piruvato), Ademds, diez moléculas de NADH (dos de la glicolisis, dos de la conversién de piruvato a acetil-CoA, y seis del ciclo del acid citrico) y se forman dos moléculas de FADH,. El resto de la energia derivada de la degra dacién de la glucosa proviene de la reoxidacién del NADH y FADH., con sus ‘electrones siendo transferidos a lo largo de la cadena de transporte de electro- nes a (finalmente) reducir el O, a H.O. Durante la fosforilacién oxidativa, los electrones del NADH y FADH, se He Citrato cis-Asconitato Hi > Isocitrato Ho l, [NADH] He S ee e-Getoglutarato Figura 2.34 Ciclo del acide citrico. Un grupo acetilo de dos catbonos es transferido del acetil- CoA al oxalacetato, formando citrato. Dos Carbonos del citrato son entonces oxida- dos a CO, y se regenera al oxalacetato. Cada vuetta del cicio produce una mole- cula de GTP, tres de NADH y una de FADH,,70 © Seccién| ¢ Introduccién Figura 2.35 Cadena de transporte de electrones. Los clectrones del NADH y FADH, so transtioren al 20 ©, a través de una serie de transportadores or: ganizados en cuatro complejos proteicos en la { membrana mitocondral. La energia libre deriva- Los electrones son transteridos da de as reacciones de transporte de lecrones — Gompigioi Ce1NADH alain, FAN fenlos eomplejos', ily IV se emplea para promo- monorucledti a > ver la sintesis de ATP. bnaced fein deaiind i coonaima @ (Coa) Fes 2@ ———> Fes. ——— ov Los electrones del FADH: Complejo i! entran en la cadena de transporte de electrones a un nivel energético menor donde son transferidos a la CoQ, Los electrones son transteridos letocromo (eto) y one transportados al complejo IV. complejo { “wD Fes ote, ce raurecmrneecn| cmpeacsperareai Gta Compiejow 192810. ‘|| > cia, 2H + 120, ® ‘combinan con O>, y la energia liberada en el proceso promueve la sintesis de ATP a partir de ADP. La transferencia de electrones de NADH a O. libera una {gran cantidad de energia libre: AG” = ~52,5 kcal/’mol por cada par de electro- nes transferido. De modo que esta energia pueda convertirse en una forma ulilizable, el proceso tiene lugar gradualmente a través del paso de electrones, por una serie de transportadores, que constituyen la cadena de transporte de electrones (Fig. 2.35). Los componentes de la cadena de transporte de electro- nes esian localizados en la parte interna de la membrana mitocondrial de las células eucaridticas, y la fosforilacion oxidativa se consideraré con mayor deta- lle cuando se expliquen las mitocondrias en el Capitulo 10. En las bacterias aerébicas, que utlizan un sistema comparable, los componentes de la cadena de transporte de electrones estan localizados en la membrana plasmatica, En ambos casos, la transferencia de electrones del NADH al O. produce suficiente energia para promover la sintesis de aproximadamente tres moléculas de ATP. Los electrones del FADH, entran en la cadena de transporte de electrones a unCapitulo 2 * Quimica celular @ 71 Figura 2.36 COxidaci6n de los acidos grasos. E| dcido graso (p. ¢), el Acido graso saturado de 16 carbonos palmitato) iniciaimente se une a la Coenzima A a expensas de una molécula de ATP. La oxidacion del acido graso progresa entonces con la retirada paso a paso de dos Unidades de carbono como acetiCoA, acoplada a la formacién de una molécula de NADH y otra de FADH,. nivel mas bajo, asi que su transferencia al O2 produce menos energia libre util- zable, s6lo dos moléculas de ATP. ‘Anora es posible calcular la produccién total de ATP de la oxidacién de la glucosa. La ganancia neta de la glicolisis es de dos moléculas de ATP y dos moléculas de NADH. La conversion de piruvato a acetil-CoA y su metabolismo por la via del ciclo del acido citrico produce dos moléculas adicionales de ATP, ‘ocho de NADH y dos de FADH,. Aceptando que se derivan tres moléculas de ATP de la oxidacién de cada NADH y dos de cada FADH,, la produccion total es de 38 moléculas de ATP por molécula de glucosa. Sin embargo, esta produccién es menor en algunas células porque las dos moléculas de NADH generadas en la glicolsis en el citoplasma son incapaces de penetrar directamente en la mitocon- dria, En su lugar, sus electrones deben ser transferidos a la mitocondria por un sistema lanzadera. Dependiendo de! sistema empleado, esta transterencia pue- de dar lugar a la entrada de estos electrones en la cadena de transporte de elec- trones al nivel del FADH,, En estos casos, las dos moléculas de NADH derivadas de la glicolisis dan lugar a dos en vez de tres moléculas de ATP, reduciendo la produccién total a 36 en vez de 38 ATP por molécula de glucosa. Producciéu de energia a partir de otras moléculas orgdnicas Laenergia en forma de ATP puede obtenerse de la degradacicn de otras molé- culas organicas, teniendo las vias implicadas en la degradacién de la glucosa de huevo un papel central. Los nuclestidos, por ejemplo, pueden ser degradados a azticares, que entonces entran en la via glucolitica, y los aminoacidos son degra- dados por la via del ciclo del Acido citrico. Las dos formas principales de almace- namiento de energia dentro de las células, los polisacaridos y los lipidos, también pueden ser degradados para producir ATP. Los polisacéridos pueden ser degra- dados a aziicares libres, que son entonces metabolizados como se vio en la seccion anterior. Los lipidos, sin embargo, son moléculas todavia mas eficaces en el almacenamiento de energia. Debido a que los lipidos estan mas reducidos que los carbohidratos, consistiendo basicamente en cadenas hidrocarbonadas, ‘su oxidacién produce substancialmente mas energia por peso de material inicial Las grasas (triacilgliceroles) son la principal forma de almacenamiento de lipides. El primer paso en su utlizacién es su degradacién a glicerol y acidos grasos libres. Cada Acido graso se une a una coenzima A, produciendo un acil- CoA graso a expensas de una molécula de ATP (Fig. 2.36). Entonces, los aci dos grasos se degradan paso a paso en un proceso oxidativo, dos carbonos cada vez, produciendo aceti-CoA mas un acil-CoA graso con dos carbonos menos. Cada ronda de oxidacién también produce una molécula de NADH y otra de FADH,. El aceti-CoA entra entonces en el ciclo del acide citrico, y la degradacién del resto del acido graso contintia del mismo modo. La degradacién de un acido graso de 16 carbonos produce de este modo siete moléculas de NADH, siete de FADH., y ocho de acetil-CoA. En términos de generacién de ATP, esta producci6n corresponde a 21 moléculas de ATP derivadas de NADH (3x7), 14 ATP de FADH, (2 x7) y 96 de acetil-CoA (8 x 12). Como se utilizé un ATP para poner en marcha el proceso, la ganancia nota os de 130 ATP por molécula de acido graso de 16 catbonos. Comparese esta produccién con la ganancia neta de 38 ATP por molécula de glucosa. Puesto que el peso molecular de un acido graso saturado de 16 carbonos es de 256 y el de la glucosa es de 180, la produccion de ATP es aproximadamente 2,5 veces mayor por gramo de dcido graso —de ahi la ventaja de los lipidos sobre oO Cons + 8-0) CHs Acido graso =“ wD 07-26 ® ° m CoA~S—C— (CH) 4~CHs Cy, Acil CoA ap oon GoA-S-C-G=C- (CH) o CH, 4 7. oe CoA-S-C-CH,-E~ (CHC 4 oo ~~ OE + G8 Cok-S-C—CHy-C- (CH) CH CoA-SH 9 7 CoA-S-C-CH, AcetlCoA +. e Gon-5~C—(6H)-GH Cs Aci COA72 @ Seccién | * Introduccion en clorotia b en clorofila a porfirina — CH, CH, Hoo! 4 io CH ie Cola hidrocerbonada luminosas de la fotosintesis. La enorgia de la luz solar se emplea Figura 2.97 Estructura de la clorofila, Las clorofilas consisten en estructuras de anillos porticinicos ligadas a colas nidrocarbonadas. Las clorotllas a y b differen en un unico grupo funcional fn el anilo de portrina los polisacdridos como moléculas de almacenamiento de energia Fotosintesis La generacién de energia a partir de la oxidacién de carbohidratos y lipides depende de la degradacion de compuestos organicos preformados. La energia necesaria para la sintesis de estos compuestos se deriva en ultimo termino de la luz solar, que se recoge y emplea por las plantas y las bacterias fotosinteti- zantes para promover la sintesis de carbohidratos. Al convertir la energia de la luz solar en una forma utilizable de energia quimica, la fotosintesis es la fuente de practicamente toda la energia metabdlica en los sistemas biologicos. La ecuacién global de la fotosintesis puede escribirse como sigue: Luz 6 CO, +6 H.0 —Y > CH,.0, +6 Os El proceso es mucho més complejo, sin embargo, y tiene lugar en dos eta- pas distintas. En la primera, llamada las reacciones luminosas, ia energia absorbida de la luz solar promueve la sintesis de ATP y NADPH (una coenzima similar al NADH), acoplada a la oxidacion de H.0 a O:. El ATP y el NADPH generados en las reacciones luminosas promuevenla sintesis de carbohidratos a partir de CO, y H;0 en un segundo conjunto de reacciones, llamadas las reacciones oscuras porque no requieren luz solar. En células eucariotas, tanto las reacciones luminosas como las oscuras tienen lugar en los cloroplastos. Los pigmentos fotosintéticos capturan energia de la luz solar absorbiendo fotones. La absorcién de luz por parte de estos pigmentos provoca que un elec- trén se mueva de su orbital molecular normal a uno de mayor energia, convir- tiendo de este modo la energia de la luz solar en energia quimica. En las plan- tas los pigmentos fotosintéticos mas abundantes son las clorofilas (Fig. 237), que juntas absorben la luz solar de todas las longitudes de onda excepto la verde. Pigmentos adicionales absorben la luz de otras longitudes de onda, asi ue basicamente el espectro comple- to de la luz visible puede ser captura- do y utilizado para la fotosintesis. We La energia capturada por la absor- ci6n de la luz se emplea para convertir el H.0 en O> (Fig. 2.98). Los electro- nes de alta energia derivados de este proceso entran entonces en una ca- dena de transporte de electrones, en la que su transferencia por una serie MaQ2 + 2H* de transportadores estd acoplada a la 26 sintesis de ATP. Ademas, estos elec- trones de alta energia reducen el NADP a NADPH. Cama transporte dep electrones para escindir el H,0 a ©... Entonces los electrones de alta energia derivados de fsle proceso se transportan a través de una serie de transportadores y son em- pleados para convertir el NADP" en NADPH. La energia detivada de las reaccio- res de transporte de elactrones también promueve la sintesis de ATP. Los detalles de estas reacciones se tratan en el Capitulo 10. | sem sw A pomCapitulo 2 ¢ Quimica celular @ 73 ed Figura 2.39 lo de Calvin. Se muestra aqui la sintesis de una molscula de glucosa a wali rola parlide seis moléculas de CO. Cada (erode pe meiiaie| molécula de CO, se ariade a la rbuo- SH.00) sa-1,S-difostato para producir dos H.01 ‘ostoglicerato GHOD) SFostoaicersto oigeulas de Slosloglicerato, Ses moléculas de CO, conducen de este modio a la formacién de 12 moléculas de gliceraldehido-3-tosfato al precio o- H-G-0H 12°° GD —_de 12 moiéculas tanto de ATP como cade de NADPH. Dos moléculas de glice- ea iene esa pueden emgioar 12 se entonces para sintetizar glucosa y H.08 Fibulosa: 1 5dfostato f 10819" Seis moléculas de ATP para la sinte- * aiicerato sis de ribulosa-1,5-difostato. aie o “o@ | eae a Ribvlosa-5- ei foto [12 moléculas ‘emma 08 ©. n-d-on b | tesrauenao-s ou fostato En las reacciones oscuras, el ATP y el NADPH producidos en las reacciones luminosas promueven la sintesis de carbohidratos a partir del CO, y H.O. Las moiéculas de CO, se afiaden una a una a un ciclo de reacciones —conocidas como el ciclo de Calvin, en honor a su descubridor, Melvin Calvin— que con- duce a la formacién de carbohidratos (Fig. 2.99). En total, el ciclo de Calvin consume 18 moléculas de ATP y 12. de NADPH por cada molécula de glucosa sintetizada. Se necesitan dos electrones para convertir cada molécula de NADP” a NADPH, asi que deben pasar 24 electrones por la cadena de trans- porte de electrones para generar suficiente NADPH para sintetizar una molécu- la de glucosa. Estos electrones se obtienen de la conversion de 12 moléculas de H,0 a seis moléculas de O>, lo que produce la formacién de seis moléculas de O, por cada molécula de glucosa. No esté claro, sin embargo, si el paso de estos mismos 24 electrones por la cadena de transporte de electrones es tam- bién suficiente para generarlos 18 ATP que se requieren para el ciclo de Calvin. Algunos de estas moléculas de ATP pueden generarse en cambio por cadenas de transporte de electrones alternativas que utilizan la energia derivada de la luz solar para sintetizar ATP sin la sintesis de NADPH (véase Cap. 10). Biosintesis de los componentes celulares La secci6n anterior repasaba las principales reacciones metabdlicas a través de las cuales la célula obtiene y almacena energia en forma de ATP. Esta energia ‘metabélica se emplea entonces para realizar diversas tareas, incluyendo la sin-74 @ Seccién| * Introduccién tesis de macromoléculas y otros constituyentes celulares. De este modo, la energia derivada de la degradacién de moléculas orgénicas (catabolismo) se utiliza para promover la sintesis de otros componentes necesarios de la céiula, La mayoria de las vias catabélicas implican la oxidacién de moléculas orgéni- cas acoplada a la generacién tanto de energia (ATP) como de poder reductor (NADH). En contraste, las vias biosintéticas (anabdlicas) generalmente impli can a utiizacion tanto de ATP como de poder reductor (habitualmente en forma de NADPH) para la produccién de nuevos compuestos organicos. Una via bio- sintética importante, la sintesis de carbohidratos a partir de CO. y HO durante las reacciones oscuras de la fotosintesis, ya se trat6 en la seccién anterior. Otras vias que conducen a la biosintesis de los principales constituyentes celu: lares (carbohidratos, lipides, proteinas y écidos nucleicos) se revisan en las siguientes secciones. Carbohidratos ‘Ademés de obtenerse directamente de la alimentacién o generada por la foto- sintesis, la glucosa puede sintetizarse a partir de otras moléculas orgénicas. En células animales, la sintesis de glucosa (gluconeogenesis) comienza habitual- ‘mente con lactato (producido en la glicolisis anaerobia), aminodcidos (deriva- dos de la degradacién de proteinas), 0 glicerol (producide en la degradacién de lipidos). Las plantas (pero no los animales) también son capaces de sintetizar glucosa a partir de dcidos grasos —un proceso que es especialmente importan- te durante la germinacién de las semillas, cuando la energia almacenada como grasas debe ser transformada en carbohidratos para sustentar el crecimiento dela planta—. Tanto en células animales como vegetales, los azticares simples son polimerizados y almacenados como polisacéridos. La gluconeogénesis implica la conversién de piruvato en glucosa —esen- cialmente es lo inverso a la glicolisis. Sin embargo, como se ha tratado anterior- mente, la conversion glucolitica de glucosa a piruvato es una via productora de ‘energia, generando dos moléculas de ATP y de NADH. Aunque algunas reac- ciones de la glcolisis son facilmente reversibles, otras solamente se produciran en la direccién de la degradacion de glucosa, porque estan asociadas con un gran descenso en la energia libre. Estas reacciones energéticamente favora: bles de la glicolisis son puenteadas durante la gluconeogénesis por otias reaccio- nes (catalizadas por enzimas diferentes) que estan acopiadas al consumo de ATP y NADH para poder conducitlas en la direccién de la sintesis de glucosa. En total, la generacién de glucosa a partir de dos moléculas de piruvato requiere de cuatro moléculas de ATP, dos de GTP y dos de NADH. Este proceso es conside- rablemente mas costoso que la simple inversion de la glicolisis (que requeriria dos moléculas de ATP y dos de NADH), demostrando la necesidad de energia adicional para conducir la via en la direccién de la biosintesis Tanto en las células animales como en las vegetales, la glucosa se almace. na en forma de polisacaridos (glucdgeno y almidon, respectivamente). La sinte- sis de polisacaridos, como la del resto de macromoléculas, es una reaccién que requiere energia. Como se observa anteriormente, la union de dos azucares por Lun enlace glucosidico puede deseribirse como una reaccion de deshidratacion, donde se retira H.O (véase Fig. 2.3). Dicha reaccién, sin embargo, es energéti- camente destavorable y por Io tanto incapaz de progresar en la direccién direc- ta. En consecuencia, la formacién de un enlace glucosidico debe estar acopla- daa una reaccién productora de energia, que se consigue empleando azicares nucleotidicos como intermediarios en la sintesis de polisacairidos (Fig. 2.40). En primer lugar, la glucosa se fostorila en una reaccién promovida por ATP a gluco- a-6-fosfato, que entonces se convierte en glucosa-1-fosfato. La glucosa-1-fos- fato reacciona con UTP (uridin trfosfato), produciendo UDP-glucosa més piro- fosfato, que se hidroliza a fosfato con la liberacién de energia libre adicional. La UDP-glucosa es un intermediatio activado que entonces dona su residuo deCapitulo 2 ¢ Quimica celular @ 75 Glucesa Figura 2.40 Sintesis de polisacéridos. La glucosa se convierte primero en una forma activada, UDP-gluco- coy 82, 8costadeuna moigcula de ATP y ota do UTP, Eres de gucosa enionces puede ransi- rirse de la UDP-glucosa a una cadena polisacarida creciente en una reaccién energeticament favorable case sine won ° ® ‘OH 9 @ HO: oO 4 oO 4-0 — Uitan +66, AL ce the hers a ox ow ia 2 WD k + OH (OH HO. a glucosa a una cadena polisacdrida creciente en una reaccién energéticamente favorable, De este modo, la energia quimica en forma de ATP y UTP promueve la sintesis de polisacdridos a partir de azucares simples. Lipidos Los lipidos son importantes moléculas de depésito de energia y los componen- tes principales de las membranas celulares. Se sintetizan a partir de aceti-CoA, que se forma en la degradacién de los carbohidratos, en una serie de reaccio- nes que se parecen a la inversa de la oxidacién de dcidos grasos. Como en la biosintesis de carbohidratos, sin embargo, las reacciones que conducen a la sintesis de acidos grasos difieren de las implicadas en su degradacién y son impulsadas en la direccién de la biosintesis acoplandose al consumo tanto de energia en forma de ATP como de poder reductor en forma de NADPH. Los cidos grasos se sintetizan al afiadir paso a paso unidades de dos carbonos derivados de acetil-CoA a una cadena creciente. La adicién de cada una de estas unidades de dos carbonos requiere del gasto de una molécula de ATP y dos moléculas de NADPH.76 @ Sec Figura 2.41 Asimilacion de nitrégeno a los com- puestos organicos. £1 amoniaco se in- Corpora a 10s compuestos orgénicos en todos los organismos. Algunas bacterias, ‘son capaces de convert el nitrégeno al- ‘mostérico en amoniaco, y la mayoria de las bacterias, hongos y plantas pueden Utlizar ol nitrato de la tierra Esencial ‘No esencial Histidina ‘Alanina Isoleucina Arginina® Levaina Asparragina Lsina Aspartato Metionina Cisteine Fenisionina Glutamate Troonina Giutamina Toptétano Glicina Valina Protina Setina Tirsina Los amnosedes exon daboncbtonerco do la ota os aminoscido no esociais pueden ser Sinletzasos ps calles ruranes aunque larga s lsiea como un seninaaece na sre, os nas an eoermerto ‘Sebon ora un apone da gina aor on 5 etn de los aminodcidos. Los ‘esqueletos carbonados de los aminoaci- dos se obtionen a parti do intermediarios dela glucoliss y del ciclo del acido citrico. inl © Introduccion Bactoras fadoras Todos Np deoxigeno los organismos = Amoniaco: Compuestos Niwsjono cms AT® ane Bacterias Honges Piantas Nos trata) EI principal producto de la biosintesis de cidos grasos, que sucede en el citoplasma de las células eucariotas, es el palmitato, acido graso de 16 carbo- nos. Entonces, los principales componentes de las membranas celulares (losfo~ lipidos, esfingomielina, y glucolipidos) se sintetizan a partir de acidos grasos libres en el reticulo endoplasmico y en el aparato de Golgi (véase Cap. 9). Proteinas A diferencia de los carbohidratos y los lipidos, las proteinas (asi como los dci- dos nucleicos) contienen nitrgeno ademas de carbono, hidrégeno y oxigeno. El nitrégeno se incorpora a los compuestos orgénicos a partir de fuentes dife- rentes en diferentes organismos (Fig. 2.41). Algunas bacterias pueden usar Np atmosférico por un proceso denominado fijacién de nitrégeno, en el que N. se reduce a NH, a expensas de energia en forma de ATP. Aunque relativamente pocas especies de bacterias son capaces de fijar nitrogeno, la mayoria de lasCapitulo 2 * Quimica celular @ 77 Medicina molecula r Fenilcetonuria bioquimica precisa no se conoce, e| retraso mental es una consecuencia crucial del actimulo de estos motabolitos anormales de la fenilalanina. La enfermedad Lafenilcetonuria, o FON, es un error congénito del metabolismo de los aminodcidos con efectos dovastadores. Afecta ‘aproximadamente a uno de cada 10.000 recién nacidos y, sino se trata, provoca un retraso mental severo. Afortunadamente, el ‘conocimiento de la naturaleza de! defecto responsable de la fenilcetonuria ha permitido su diagnéstico precoz y tratamiento eficaz, Prevencién y tratamiento La deficiencia enzimatica no produce dificultades mientras el feto: esta en el utero, asi que los rios ‘con ferilcetonuria son normales al nacer. Si no son tratados, sin embargo, los nifios afectados se vuelven permanente y proftundamente retrasados en o! primer afio de vida. Bases moleculares Afortunadamente, los recién y celulares La fenilcetonuria se debe a una deficiencia en la enzima fenilalanina hidroxilasa, que convierte la fenilalanina en tirosina. Esta eticiencia provoca que la {enilalanina se acumule a niveles muy altos y sulra otras reacciones, como la conversién en fenilpiruvato. La fenilalanina, el fenilpiruvato, y ottos metabolios anormales s¢ ‘acumulan en la sangre y son excretades a niveles altos en la orina (el nombre de la enfermedad procede de los altos niveles de fenilpiruvato, una fenilcetona, tencontrados en la orina de los ninios ‘afectados). Aunque la causa Fernilatanina bacterias, hongos, y plantas pueden usar nitrato (NO;), que es un componente frecuente de la tierra, reduciéndolo a NH, gracias a los electrones derivados de! NADH o NADPH. Finalmente, todos los organismos son capaces de incorporar ‘amoniaco (NH:) a componentes organicos. EINH, se incorpora a las moléculas organicas principalmente durante la sin- tesis de los aminoacidos glutamato y glutamina, que se obtienen a partir del inter- mediario del ciclo del Acido cirico, x-cetoglutarato. Estos aminoicidos funcionan después como donantes de grupos amino durante la sintesis de los otros ami- nodcidos, que también se producen a partir de otras vias metabolicas centrales, ‘como a glcolisis 0 el ciclo del acido citrico (Fig. 2.42). Asi el material basico para la sintesis de aminodcidos se obtiene de la glucosa, y los aminodcidos se sinteti- zan a costa de energia (ATP) y de poder reductor (NADPH). Muchas bacterias y plantas pueden sintetizar todos los 20 aminoacidos. Los humanos y otros mami fer0s, sin embargo, solo pueden sintetizar aproximadamente la mitad de los ami- nodicidos que requieren; ol resto debe obtenerse de la dieta (Tabla 2.2). La polimerizacion de los aminodcidos para formar proteinas también requie- reenergia. Como la sintesis de polisacaridos, la formacién de un enlace peptidi- co puede considerarse como una reaccion de deshidratacidn, que debe reali- zarse en la direcci6n de la sintesis de proteinas acoplandose a otra fuente de rnacidos con enilcetonuria pueden ser fdcilmente identificados por pruebas rutinarias de deteccién precoz que detectan niveles ‘elevados de fenilalanina en sangre. El retraso mental se puede prevenir alimentando a los nifios afectados con una dieta sintética baja en fonilalanina. Este tratamiento dietético elimina el actimulo de ‘metabolites toxicos de la fenilalanina y previene eficazmente el retraso mental que se produciria de otro modo. La deteccién precoz rutinaria de la fenilcetonuria es por Io tanto una prueba crucial en todos los recién nacidos. re (cH—¢-coo- A Trosina ° i cH,-C-Coo- Fenipiravato {una fenileetona) ‘Metabolismo anormal de fa fenilalamina en pacientes con fenicetonuria78 @ Seccién | ¢ Introduccién Figura 2.43 @ Formacién de un enlace peptidico. Un aminoacido-es actva- o @ do primero @ través de la unin a su ARNE en una reaccion de So-G- HH dos pases que implica la hidrlisis de ATP a AMP. Los ARNE of Siren cono adaptadores para alinear loa aminodcidos en un olde de ARNm unidoa ribosomas. Cada aminodcido es trans- ap ferido entonces al extremo C terminal de una cadena peptidica craciente a costa de dos moléculas adicionales de GTP. oo,—-e ° 0 1 ot Aminoaci-AMP —_Adenosina~O-F—-0 © Cf, OH OH Aminoacil-ARNt, Extremo 3° Cadena peptidica ereciente i? Ae G-ARN, + ARNE, ho 4} N-term— energia metabilica. En la biosintesis de polisacaridos, este acoplamiento se consigue a través de la conversién de los azticares a intermediarios activados, ‘como la UDP-glucosa. Los aminodcidos son activados de forma similar antes de utilizarse para la sintesis de proteinas, Una diferencia crucial entre la sintesis de proteinas y la de polisacaridos es ue los aminoacidos se incorporan a las proteinas en un orden particular, espe- cificado por un gen. El orden de los nucledtidos en un gen especifica la secuen- cia de aminodicidos de una proteina a través de la traduccion, en la que el ARN mensajero (ARNm) acttia como molde pata la sintesis proteinica (véase Cap. 3). Cada aminoacido se une primero a una molécula de ARN de transferencia (ARN) especifica en una reaccidn acoplada a la hidrdlisis de ATP (Fig. 2.43). Entonces los aminoacil ARNt se alinean en el molde de ARNm unido a los ribo- somas, y cada aminodcido se afiade al extremo C terminal de una cadena pep- tidica creciente por medio de una serie de reacciones que seran tratadas en detalle en el Capitulo 7. Durante el proceso, se hidrolizan dos moléculas adicio-Capitulo 2 ¢ Quimica celular @ 79 Cadena polinucleotidica creciente Figura 2.44 Extremo 5) Sintesis de polinucleétides. Nucledsidos trifostato se unen al extremo 3’ de una cade: $ ‘ha polinucleotidica creciente con la liberacion de pirotostato. i oF | 3 i a + OH OH Esai Nuclebsido trifosfato Extremo 5! 3 | 0-P=0 ‘0 @ 1 cH, OW L ~ 5 oH o-R=0 $ CH, 0. Exaromo 3’ OH OH nales de GTP, asi que la incorporacién de cada aminoacido a una proteina esta acoplada a la hidrdlisis de una molécula de ATP y dos de GTP. Acidos nucleicos Los precursores de los acidos nucleicos, los nucledtidos, estén compuestos de azticares de cinco carbonos fosforilados unidos a bases nucleicas. Los nuclesti- dos pueden ser sintetizados a partir de carbohidratos y aminodcidos; también pueden ser obtenidos de la dieta 0 reutilizados tras la degradacion de acids rnucleicos. El punto de partida para la biosintesis de nucledtidos es el aziicar fostorilado ribosa-5-fosfato, que se obtiene a partir de glucosa-6-fosfato, Vias divergentes conducen entonces a la sintesis de ribonuclestidos de purina y piri- midina, que son los precursores inmediatos de la sintesis de ARN. Estos ribonu- cledtidos se convierten en desoxirribonuclestidos, que sirven como ladrillos de construccién monoméricos de! ADN. EIARN y ADN son polimeros de nucledsidos monofosfato. Como para otras macromoléculas, sin embargo, la polimerizacién directa de nucledsidos mono- fosfato es energéticamente desfavorable, y la sintesis de polinuclestidos utiliza fen su lugar nucleésidos trifosfatos como precursores activados (Fig. 2.44). Un nucleésido 5-trifosfato se afiade a un grupo 3' hidroxilo de una cadena polinu- cleotidica creciente, con la liberacién y posterior hidrdlisis de pirotostato como promotor de la reaccidn en la direccién de la sintesis de polinucledtidos. Membranas celulares La estructura y funcién de las células dependen de forma crucial de las mem- branas, que no sélo separan el interior de la célula de su entorno sino que tam-80 © Seccién | © Introduce! HO Grupo polar _ de cabeza |—-Cola hidrétoba, HO Figura 2.45 Bicapa fosfolipidica. Los fostolipidos forman espontaneamente bicapas esta- bles, con sus grupos polares de cabeza expuiestos al agua y sus colas hidrofobas enterradas en el interior de la membrana, Figura 2.46 Mavilidad de los fostolipidos en una ‘membrana. Fosfolipidos individuales puo- den rotar y moverse lateralmente dentro bién definen los compartimentos intemmos de las células eucariotas, incluyendo las organelas de nucleo y citoplasma. La formacién de membranas biologicas se basa en las propiedades de los lipidos, y todas las membranas celulares ‘comparten una misma organizacién estructural: bicapas de fostolipidos con proteinas asociadas. Estas proteinas de membrana son responsables de mu- has funciones especializadas; algunas acttian como receptores que permiten a la célula responder a senales externas, algunas son responsables del trans- porte selectivo de moléculas a través de la membrana, y otras participan en el transporte de electrones y en la fosforilacion oxidativa. Ademas, las proteinas de membrana controlan las interacciones entre células de organismos pluricelu- lares. La organizacién estructural comun de las membranas subyace de este modo en una gran variedad de procesos biolégicos y funciones especializadas de membrana, que se trataran con detalle en otros capitulos, Lipidos de membrana Los bioques de construccién fundamentales de todas las membranas celulares son los fosfolipidos, que son moléculas anfipaticas, que consisten en dos cade- nas de Acidos grasos hidr6fobos ligadas a un grupo de cabeza hidrétilo que contiene fostato (véase Fig. 2.7). Debido a que sus colas de acidos grasos son escasamente solubles en agua, los fosfolipidos forman bicapas esponténea: ‘mente en soluciones acuosas, con las colas hidréfobas enterradas en el interior de la membrana y los grupos polares de cabeza expuestos en ambos lados, en contacto con el agua (Fig. 2.45). Dichas bicapas fosfolipidicas forman una barrera estable entre dos compartimentos acuosos y representan la estructura basica de todas las membranas bioldgicas. Los lipidos constituyen aproximadamente el 50 % de la masa de la mayoria de las membranas celulares, aunque esta proporcién varia dependiendo del tipo de membrana. Las membranas plasmaticas, por ejemplo, son aproximada- mente un 50% de lipidos y 50% de proteinas. La membrana interna de la mito- condria, por otra parte, contiene una fraccién inusualmente alta (aproximada- mente 75%) de proteinas, reflejando la abundancia de complejos proteinicos implicados en el transporte de electrones y la fostorilacién oxidativa, La composi- cin lipidica de las diferentes membranas celulares también varia (Tabla 2.3). La membrana plasmatica de E. coli contiene predominantemente fostatidiletanola- mina, que constituye el 80% del total de lipidos. Las membranas plasmaticas de los mamiferos son mas complejas, conteniendo cuatro fosfolipidos principales —osfatidilcolina, fosfatidiserina, fostatidiletanolamina, y esfingomielina— que juntos constituyen entre e1 50% y el 60% del total de lipidos de membrana. Ade- mas de los fosfolipidos, la membrana plasmatica de las células animales contie- ne glucolipidos y colesterol, que generalmente corresponden a aproximada- mente e! 40% de las moléculas de lipidos totales. Reticulo Membran HET fendoplasmético mitocondriales Lipido Ecol Eritrocito rugeso ‘externas Fostatictina | ° 7 55 50 Fosfaticiserina ° 6 8 2 Fosfatciotanot 80 16 16 23 ‘mina Estingomietina ° 7 3 5 ‘Glucatipidos ° 2 ° ° Golestero! ° 45 6 3 Fuente: Datos de Pag, 1983. Tho Marbranes of Col, 2d ed San Diego, Academic Press. neonposin de lamembrans esta lnicae come el porcentjereir dees pnpales pos cortiuyentss,Capitulo 2 * Quimica celular @ 81 Figura 2.47 Grupo de cabeza Grupo _Colesterol Insercion de colesterol en una membrana. El colesterol se inserta en la membrana dol estalipido_—hidroxlo / Con Su grupo hidroxiio polar proximo a los grupos polares de cabeza de los fostolipides. \ polar f (Colas de acidos ‘grasos grasos mas cortas son menos rigidas y se mantienen fluidas a temperaturas ‘mas bajas. Los lipidos que contienen acidos grasos insaturados incrementan de forma similar la fluidez de la membrana porque la presencia de dobles enlaces introduce curvamientos en las cadenas de acidos grasos, haciendo mas dificil que se empaqueten juntas. Debido @ su estructura de anillo hidrocarbonado (véase Fig. 2.9), el coleste- rol desempefia un papel importante en la determinacion de la fluidez de la mem- brana. Las moléculas de colesterol se insertan en la bicapa con sus grupos polares hidroxilo proximos a los grupos de cabeza hidrotilicos de los fostolipidos (Fig. 2.47) Los anillos hidrocarbonados rigidos del colesterol interactUan por lo tanto con las regiones de las cadenas de dcidos grasos que son adyacentes & los grupos de cabeza de los fosfolipidos. Esta interaccién disminuye la movi dad de las porciones externas de las cadenas de acidos grasos, haciendo que esta parte de la membrana sea mas rigida. Por otra parte, la insercién del coles- terol interfiere con las interacciones entre cadenas de Acidos grasos, mante- niendo de este modo la fluidez de la membrana a temperaturas mas bajas. Una importante propiedad de las bicapas lipidicas es que se comportan como fluidos bidimensionales en los que moléculas individuales (tanto lipidos como pro- teinas) son libres para rotar y moverse en direcciones laterales (Fig, 2.46). Esta {luidez es una propiedad crucial de las membranas y esta determinada tanto por la temperatura como por la composicién lipidica. Por ejemplo, las interacciones entre cadenas mas cortas de acidos grasos son mas débiles que aquellas entre cadenas mas largas, asi que las membranas que contienen cadenas de acidos Proteinas de membrana Las proteinas son el otro constituyente principal de las membranas celulares, onstituyendo entre el 25 y el 75% de la masa de las diversas membranas de la Célula. El modelo actual de la estructura de la membrana, propuesto por Jona- than Singer y Garth Nicolson en 1972, considera las membranas como un mo- saico fluido en el que las proteinas estan insertadas en una bicapa lipidica (Fig. 2.48). Mientras los fostolipidos proporcionan la organizacién estructural baisica de las membranas, las proteinas de membrana desempefian las funcio- nes especificas de las diferentes membranas de la célula. Estas proteinas se dividen en dos tipos generales, baséndose en la naturaleza de su asociacion con la membrana. Las proteinas integrales de membrana estan embebidas directamente dentro de la bicapa lipidica. Las proteinas periféricas de mem- brana no estan insertadas en la bicapa lipidica pero estan asociadas con la membrana indirectamente, generalmente a través de interacciones con las pro- teinas integrales de membrana, Muchas proteinas integrales de membrana (llamadas proteinas trans- membrana) alraviesan la bicapa lipidica, con partes expuestas en ambos lados de la membrana. Las partes de estas proteinas que atraviesan la membrana son habitualmente regiones 2-helicoidales de entre 20 a 25 aminoacidos no polares. Las cadenas laterales hidréfobas de estos aminodicidos interaccionan con as cadenas de Acidos grasos de los Iipidos de membrana, y a formacion de Una shélice neutraliza el cardcter polar de los enlaces peptidicos, como se discute previamente en este Capitulo con respecto al plegamiento de las protei- nas. La tnica otra estructura proteica conocida que atraviesa bicapas lipidicas es el barrikf, formada por el plegamiento de ldminas-/i en una estructura se- mejante a un barril, que se encuentra en algunas proteinas transmembrana de bacterias, cloroplastos, y mitocondrias (Fig. 2.49). Como los fosfolipidos, las proteinas transmembrana son moléculas anfipaticas, con sus partes hidrofilas82 @ Seccién| ¢ Introduccion Carvohidrato Exterior 2 As Figura 2.48 ‘Modelo del mosaico fluido de: tura de la membrana. Las membranas biolégicas consisten en proteinas inserta- {das en una bicapa lipidica. Las proteinas Integrales de membrana estan embebidas fen la membrana, habitualmente a través de regiones s-helicoidales de entra 20 a 25 aminodtcidos hidréfobos. Algunas pro- teinas trans membrana atraviesan la ‘membrana una sola vez; otras tienen mule tiples regiones que atraviesan la membra- na. Ademas, algunas proteinas estan an- cladas en la membrana a través de lipidos {que estan igadas de forma covalente a la cadena polpeptidica. Estas proteinas pueden estar ancladas a la vertiente ex- tracelular de la membrana por glicolipidos a la vertiemte citosolica por dcidos gra- 05 0 grupos pronilo (véase las estructu- ras en Cap. 7). Las proteinas peritéricas de membrana no estan insertadas en la membrana poro estan acheridas a través de interacciones con proteinas integrales de membrana, Proteinas Proteina periférica de membrana expuestas al medio acuoso a ambos lados de la membrana. Algunas proteinas transmembrana atraviesan la membrana una sola vez; otras tienen muiples regiones que atraviesan la membrana. La mayoria de las proteinas transmem- brana de las membranas plasmaticas eucariotas han sido modificadas con la adicién de carbohidratos, que estan expuestos en la superficie de la célula y pueden participar en interacciones célula-célula Las proteinas también pueden estar ancladas en las membranas por lipidos ‘que estan ligados de forma covalent a la cadena polipeptidica (vease Cap. 7) Modificaciones lipidicas especificas ancian proteinas a las vertientes citosolica y extracelular de la membrana plasmatica. Las proteinas pueden estar ancla- das a la vertiente citosdlica de la membrana bien por la adicién de un acido {graso de 14 carbonos (Acido miristico) a su extremo amino terminal o bien por la adicion de un acido graso de 16 carbonos (écido palmitico) o de grupos preri- lode 15 6 20 carbonos a las cadenas laterales de los residuos de cisteina. De forma alternativa, las proteinas son ancladas a la vertiente extracelular de la mombrana plasmatica a través de la adicién de glicolipidos a su extremo carbo- xilo terminal Transporte a través de membranas celulares La permeabilidad selectiva de las membranas bioligicas a las moléculas pe- quefias permite a la célula controlar y mantener su composicién interna. SéloCapitulo 2 * Quimica celular @ 83 las moléculas pequerias no cargadas pueden difundir libremente a través de las bicapas de fostolipidos (Fig. 2.0). Las moléculas pequefias no polares, como el 0, y el CO,, son solubles en la bicapa lipidica y por lo tanto pueden cruzar facilmente las membranas celulares. Las moléculas polares pequefias no car- gadas, como el H,O, también pueden difundir a través de las membranas, pero moléculas polares no cargadas mayores, como la glucosa, no pueden. Las mo- léculas cargadas, como los iones, son incapaces de difundir a través de una bicapa de fostolipidos independientemente de su tamafo; incluso los iones H no pueden cruzar una bicapa lipidica por difusion libre. ‘Aunque los iones y la mayoria de las moléculas polaresno pueden difundir a través de una bicapa lipidica, muchas de estas moléculas (como la glucosa) son capaces de atravesar las membranas celulares. Estas moléculas pasan a tra- vés de las membranas gracias a la actuacién de proteinas especificas trans- membrana, que actian como transportadores. Dichas proteinas de transporte determinan la permeabilidad selectiva de las membranas celulares y de este modo desempefian un papel crucial en la funcién de la membrana. Contienen multiples regiones que atraviesan la membrana formando un conducto a través de la bicapa lipidica, permitiendo que moléculas polares o cargadas atraviesen la membrana por un poro proteinico sin interaccionar con las cadenas hidrofo- bas de dcidos grasos de los fosfolipidos de membrana ‘Como se trata en detalle en el Capitulo 12, hay dos tipos principales de proteinas de transporte de membrana (Fig. 2.51). Los eanales proteinicos for- man pores abiertos a través de la membrana, permitiendo libremente e! paso de cualquier molécula del tamafio adecuado. Los canales iénicos, por ejemplo, permiten el paso de iones inorgdnicos como Na", K’, Ca™, y Cla través de la membrana plasmatica. Una vez abiertos, los canales proteinices forman poros pequeiios a través de los cuales pueden cruzar la membrana por difusién libre iones del tamafo y carga adecuados. Los poros formados por estos canales proteinicos no estan permanentemente abiertos; mas bien, pueden ser abiertos 0 cerrados selectivamente en respuesta a sefiales extracelulares, permitiendo ala célula controlar el movimiento de iones a través de la membrana. Estos canales iénicos regulados han sido estudiados especialmente bien en célu- las nerviosas y musculares, donde median la transmision de sefales electro- quimicas, En contraste con los canales proteinicos, las proteinas transportadoras uunen y transportan selectivamente moléculas pequenas especificas, como la glucosa. En vez de formar canales abiertos, las proteinas de transporte actiian Moléculas peque Moléculas polares mayores e iones T Ho # Glucosa Giicarol Amindicidos Ee (p.e), alaninay Intemo Figura 2.49 Estructura de un barril/f. Algunas pro- nas transmemirana atraviesan la bica- pa fostolipidica como léminas-/i plagadas fen una estructura semejante a un bart Figura 2.50 Permeabilidad de las bicapas de fosfo- lipides. Moléculas pequenias no carga das pueden cifundir libremente a través de una bicapa de fosfolipidos. Sin embar- 190, la bicapa es impermeable a moléculas olares mayores (como la glucosa y los ‘aminodcides) y a los iones.84 © Seccién | * Introduccion “ ® Proteina @ canal transpertadora proteinico| ih cambio ‘onformacional —— Figura 2.51 Canales proteinicos y proteinas de transporte. (A) Los canales protelnicos foiman poros abiertos a través de los cua- les las moléculas del tamano apropiado (0.6), iones) pueden cruzar la membrana. (B) Las proteinas transportadoras unen selactivamente las pequenas moléculas {que seran transportadas y entonces expe: ‘imentan un cambio conformacional para Niberar la motécula al otro lado de la mem- brana, @aro ‘como enzimas para faciltar el paso de moléculas especiticas a través de las membranas. En particular, las proteinas de transporte unen moléculas especiti- ‘cas y después experimentan cambios conformacionales que abren canales a través de los cuales la molécula que sera transportada puede pasar a través de la membrana y ser liberada en el otro lado. ‘Como se describe hasta ahora, las moléculas transportadas bien a través de canales proteinicos o de proteinas transportadoras cruzan las membranas en la direccion energéticamente favorable, determinada por los gradientes de con- centracién y electroquimico —un proceso conocido como transporte pasivo. Sin embargo, las proteinas transportadoras también proporcionan un mecanis- mo a través del cual los cambios energéticos asociados con el transporte de moléculas a través de una membrana puede ser acoplado a la uliizacion 0 Figura 2:52 Modelo de transporte activo. La energia derivada de la hidrolsis de ATP es empleada para transportar H’ en contra de un gradiente electroquimico (de una baja a una alta Concentracion de H’). La unin de H’ esta acompaniada por la fosforilacion de la proteina de transporte, lo que induce un cambio conformacional que promueve el transporte de H* Contra el gradiente electroquimico. La liberacién de H’ y la hidrélisis del grupo fostato ligado restablecen entonces el transportador a su conformacion orginalCapitulo 2 * Quimica celular © 85 produccién de otras formas de energia metabdlica, igual que las reacciones enzimaticas pueden ser acopladas a la hidrélisis 0 sintesis de ATP. Por ejem- plo, las moléculas pueden ser transportadas en una direocién energéticamente destavorable a través de una membrana (p. ej., contra un gradiente de concen- tracién) si su transporte en esa direccicn esta acoplado a la hidrdlisis de ATP ‘como fuente de energia —un proceso denominado transporte activo (Fig 2.52). La energia libre almacenada como ATP puede de este modo ser usada para controlar la composicidn intema de la oélula, asi como para promover la biosintesis de los componentes celulares. COMPOSICION MOLECULAR DE LAS CELULAS Carbohidratos: Los carbohidratos incluyen aziicares simples y polisacari- dos. Los polisacaridos sirven como formas de almacenamiento de azucares, componentas estructurales de las células y marcadores en procesos de re- conocimiento celular. Lipides: Los lipidos son los principales componentes de las membranas ce- lulares, y sirven come depésito de energia y moléculas de sefializacion. Los {osfolipidos consisten en dos cadenas de dcidos grasos hidrofobos unidas a un grupo hidréfilo de cabeza que contiene fosfato. Acidos nucleicos: Los acidos nucleicos son las principales moléculas de in- formacién de la célula. Tanto el ADN como el ARN son polimeros de nuclesti- dos de purina y pirimidina. Los enlaces de hidrogeno entre pares de bases complementatias permiten a los acidos nucleicos dirigir su propia replicacion. Proteinas: Las proteinas son polimeros de 20 aminoacidos distintos, cada Uno de los cuales tiene una cadena lateral distinta con propiedades quimicas especificas. Cada proteina tiene una secuencia de aminoacidos propia, que determina su estructura tridimensional. En la mayoria de las proteinas, combi- aciones de a-hélices y hojas /} se pliegan en dominios globulares con ami- nodcidos hidréfobos en el interior y aminodcidos hidrafilos en la superficie. PAPEL CENTRAL DE LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES BIOLOGICOS Actividad catalitica de las enzimas: Practicamente todas las reacciones quimicas dentro de las células son catalizadas por enzimas. Mecanismos de catélisis enzimética: Las enzimas incrementan la veloc dad de las reacciones uniendo sustratos en la posicién adecuada, alterando la. conformacidn de los sustratos para aproximartos al estado de transicion, y participando directamente en las reacciones quimicas. Coenzimas: Las coenzimas trabajan junto con las enzimas para transportar grupos bioquimicos entre sustratos. Regulacién de la actividad enzimética: Las actividades de las enzimas son reguladas para cubrir las necesidades fisiolégicas de la célula. La actividad tenzimatica puede ser controlada a través de la uni6n de moléculas pequefias, de interacciones con otras proteinas, y de modificaciones covalentes. carbohidrato, monosacérido, enlace alicosidico, oligosacérido, polisacérido, slucégeno, almidén, celulosa lipido, écide graso, tiaciglicerol, gr {osfolipido, estingomielina, antipatico, licolipido, colesterol, hormona esteroidea Acido desoxirribonucleico (ADN), acido ribonueleico (ARN), ARN mensajero (ARNm), ARN ribosémico, ARN de transferencia, nucleotide, purine, pirimidina, adenina, guanina, citosina timina, uracilo, 2-desoxiribosa, ribo nucledsido, enlace fostodiester, oligonuctestido, polinuclestido proteina, aminodeido, enlace peptidico ppolipéptido, cristalografia de rayos X, ‘estructura primaria, estructura ‘secundaria, -hélloe, hoja estructura terciaria, dominio, estructura cuaternaria ‘enzima, sustrato, producto, estado de transiclén, energia de activacion, sitio activo ‘modelo de ta tlave y 1a cerradura, ajuste Inducido ‘grupo prostetico, coenzima,nicotidamin fenin dinucleotide (NAD‘) Inhibicion por etroatimentacién, regulacién alostérica, fosterilacion86 @ Seccion | * Introduccion ‘energia libre de Gibbs (G), adenosin Strifostato (ATP), enlace de alta energia ‘ailcolisis, coenzima A (CoA), ciclo del ‘cide etreo, ciclo de Krebbs, flavin ‘adenin dinuclestido (FADH,), {ostorilacién oxidativa, cadena de ‘transporte de electrones reacciones luminosas, reacciones ‘oscuras, pigmentos fotosinteticos, clorofila, ciclo de Calvin ‘gluconeogenesis fijaclén de nitrégeno bicapa de fostolipidos ‘mosaico fluido, proteina integral de ‘membrana, proteina periférica de ‘membrana, proteina transmembrana, bari canal protelco, proteina transportadora, transporte pasivo, transporte activo ENERGIA METABOLICA Energia libre y ATP. El ATP funciona como un depésito de energia libre, que es empleado para promover reacciones que requieren energia dentro de las células. Generacion de ATP a partir de glucosa: La degradacién de glucosa es una fuente importante de energia celular. En células aerdbicas, la oxidacién com pleta de la glucosa produce entre 36 y 38 moléculas de ATP. La mayoria de este ATP se deriva de las reacciones de transporte de electrones en las que el , es reducido a H,O. Obtencién de energia de otras moléculas orgdnicas: El ATP también puede ser obtenido a partir de la degradacion de otras moléculas orgénicas aparte de la glucosa, Debido a que las grasas estan mas reducidas que los carbohidra- tos, proporcionan una fuente mas eficaz de almacenamiento de energia. Fotosintesis: La energia requerida para la sintesis de moléculas orgénicas se obliene en ultimo término de la luz solar, que es aprovechada por las plantas y las bacterias fotosinteticas. En la primera etapa de la fotosintesis, la energia de la luz solar se emplea para promover la sintesis de ATP y NADPH, acoplada a la oxidacién de H,O a O;. El ATP y el NADPH produci- dos en estas reacciones son empleados entonces para sintetizar glucosa a partir de CO, y H.0. BIOSINTESIS DE LOS COMPONENTES CELULARES Carbohidratos: La glucosa puede ser sintetizada a partir de otras moléculas organicas, empleando energia y poder reductor en forma de ATP y NADH, respectivamente. Entonces se necesita ATP adicional para promover la sin- tesis de polisacaridos a partir de azticares simples, Lipidos: Los lipidos son sintetizados a partir de acetil CoA, que se forma en la degradacién de los carbohiaratos. Proteinas: Los aminodcidos son sintetizados a partir de intermediarios de la licoliss y del ciclo del Acido citrico. Su polimerizacién para formar proteinas requiere energia adicional en forma de ATP y GTP. Acidos nucleicos: Los nuclestidos de purina y pirimidina son sintetizados a partir de carbohidratos y aminodcidos. Su polimerizacién a ADN y ARN es promovida por la utiizacién de nucledsidos tritostatos como precursores ac- tivados. MEMBRANAS CELULARES Lipidos de membrana: La estructura basica de todas las membranas celu- lares es una bicapa de fosfolipidos. Las membranas de células animales también contienen glucolipidos y colesterol, Proteinas de membrana: Las proteinas pueden estar insertadas en la bica- pa lipidica o bien asociadas a la membrana indirectamente, a través de inte- racciones proteina-proteina. Algunas proteinas atraviesan la bicapa lipidica; otras estan ancladas a una vertiente de la membrana. Transporte a través de membranas celulares: Las bicapas lipidicas son permeables sélo a moléculas pequefias no cargadas. Los iones y la mayoria de las moléculas polares son transportados a través de las membranas celu- lares por proteinas de transporte especificas, cuya actuacién puede ser aco- plada a la hidrdlisis 0 sintesis de ATPPreguntas 1. (Qué caracteristicas del agua la ha- can ideal como la molécula mas abun- dante en las células? 2. Explica la diferencia entre un oligo: sacdrido y un polisacarido, 3, LCuiiles la diferencia entre glucége- no y celulosa? 4. "LEN qué se diferencia un Acido graso de una grasa? 5. {Cualles son las principales funcio- nes de las grasas y los fosfolipidos en las, células? 6. Ademas de servir como bloques de construccion para los acidos nucleicos, {qué otras funciones importantes po- seen los nuciestidos on tas céiulas? Bibliografia Bibliografia general erg, JM. J. L. Tymoceko and L. Stryer. 2102. Biochemistry. 5th ed. New York: W. HH, Freeman, Mathews, C. K., K, E. van Holde and K. G. ‘Ahern. 2001 Biochemistry. Sed ec Reds wood City, CA: Benjamin Cummings. Composicién motecutar de tas células Anginsen, C, B, 1973. Principles that govern the folding of protein chains, Sciner 181 223-230. [P] Branden, C, and J. Tooze, 1999, lntraducton to Protein Structure. 2nd ed. New York: Garland CChothia, C. and A. V, Finkelstein, 1990. The Classification and origins of protein fol- ‘ing patterns, in, Re Bison. 58 1007 1059. [R] Holm, [and C. Sander, 19%. Mapping the protein tniverse. Science 27% $9562, ik) Kendrew, JC. 1961. The three-imensional ‘structure of a protein molecule. Sci. An. 2146): 96-111. IR] Levitt, M., M, Gerstein, E. Huang, 5: Sub: bial andl. Tsai. 1997. Protein foleing: The tendgame. Ann. Rev. Bioche, 66; 518-579, RL Pauling, L, R.B, Corey, and H. R. Branson. 951. The structure of proteins: Two hydrogen bonded configurations of the polypeptide chain. Ps. Natl. Aeud. Sc. Usa-37: 205-211. [P| Richardson, J. 5. 1981, The anatomy and ta ‘onomy of protein structure. Al, Protein Chen, 34: 167339. [R] Sanger, F. 1988. Sequences, sequences, andl sequences. Ann. Rev. Biochem, 57, 1-28. [R] Tantord, €. 1978, The hydrophobic effect ‘and the organizatinn of ving, matter. ‘Science 200: 1012-1018, [R] Capitulo 2 * Quimica celular @ 87 7. Identiica diez aminoacidos apolares y describe dénde tienden a localizarseen tuna enzima soluble en agua tipica, 8. El «bolsillo» de union de la tripsina contiene un residuo de aspartato. ,Cémo crees que alectaria @ la actividad enzi- ‘matica el cambiar este aminoacide por i 9. Considera la reaccién A= 8 +C, en la que AG’ = 43,5 keallmol, Calcula AG en condiciones intracelulares, sabiendo que la concentracion de A es 10° My las concentraciones de B y C son ambas de 10? M. Z&n que direccion progresara la reacelon en la célula? Para tus calcu los, R= 1,98 x 10 kcalimoVgrado y Papel central de las enzimas como catalizadores bioldgicos Keshland, D. E. 1984, Control of enzyme ac- tivity and metabolic pathways. Trends Bio- chert, Se, 9: 155-159. [R] Lienhard, G. E. 1973, Enzymatic catalysis land transition-state theory. Science 180: 149454 IR) Lipscomb, W. N. 1983, Structure and catal {ysis enzymes, Art, Rew. Biahemt 5 17- MIR] Monod, JP. Changewx and F. Jacobs 1963 ‘Allosteric proteins and cellular control systems, J. Mol. Biol 6: 306-329. [P] Natlikar, G. J. and D. Herschlag. 1997. Me: Chonistic aspects of enzymatic catalysis: Lessons from comparison of RNA and protein enzymes, Am. Rev. Biocon. 66: 19-59. [R Nourath, HL. 1984, Evolution of proteolytic fenzyimes. Scteice 224 350157, [R] ‘Schramm, VL. 1058, Enzymatic transition states and transition state analog design ‘ann. Rie Hiocera, 67: 693-720. IR] Energia metabética Boinert, HL, R. H. Holm and E. Munck, 197. Tron-sulfur clusters: Nature's. modular, multipurpose strictures, Science 277: 65%. 659. [RI Bennett, 1 1979, The protein that harvests Sunlight, Teel Biol, Sci 4: 268-271. [RI Calvin, M. 1962. The path of earhon in pho osynthesis, Seine 135: $79.889. IR] Deisenhoter,J.and H. Michel. 1991. Steuctu- Tes of bacterial photosynthetic reaction centers. Art, Ree. Coll Ba. 7:1-23.[R] Krebs, HA. 1971 The history of the tricar- Toxic cyele. Perspret. Biol) Mod. V4 154 170. IR Kubhlbrandt, W.,.D.N. Wang ancl. Fujiyes Iii 1994, Atonsic model of plant light-har- vesting complex by” electron crystallo graphy, Nature 367: 614-621. [P] 298K (25 C). Recuerda que In (x) = 2,3 og 10 (x). 10. {,Cudles son las reacciones lumini cas y las reacciones oscuras de la foto- sintesis? 11, Apesar de que las proteinas trans- portadoras y los canales proteicos son ‘muy similares, como la especificidad y ssaturacién a concentraciones olevadas del soluto transportado, las proteinas transportadoras son mas lentas que los canales proteicos. Explica 12. EPor qué son las regiones que atra- viesan la membrana de las proteinas transmembrana frecuentemente »-héli- ces? Nichols, D.G. and §. J. Ferguson, 2002, Bie nergetis. Sed ed, London: Academie Press Saraste, M. 1999. Oxidative phosphoryla tion atthe fin de siecle. Science 243: 1488 1493. [RI Biosintesis de los componentes celulares Hers, H.G.and 1. Hue. 1983, Gluconeogene- ‘is and related aspocts of glycolysis. “im, Reo. Biochem, 52: 017-653. [8] Jones, M. E. 198i. Pyrimidine nucleotide ‘biosynthesis in animals: Genes, enzymes, ‘and regulation of UMP biosynthesis. inn Rev. Biocon. 49: 258-279. [8] Kornberg, A-and TA. Baker. 1991. DNA Re- plication, 2nd ed, New York: WH. Feo Tolbert, N. E, 1981, Metabolic pathways in [peroxisomes and glyosysomes, Art. Red Biochem. 50: 133-157, [R] Umibarger, 1. F. 1978. Amino acid biosy thesis and its regulation, Aur. Rev, Bi ‘her, 47: 533-606. TR] ‘Van den Bosch, H., RB. H. Schutyens, R. ‘A. Wanders and |. M. Tager. 1982. Broche istry of peroxisomes, Zinn Rew, Biachem 61: 157-197. [RI Wakil $.), J. K-Stoops and V.C. Joshi. 198 Fatty ackl synthesis and its regulation ‘Ani, Rev. Balen, 52: 587-579. [R Membranas celulares Bretscher, M. 1985. The molecules ofthe cell ‘membrane, Sct Att, 25%) 10-108. [8] Dowham, W. 1997. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: Why are there so many lipids? Aut. Reo, Bi ‘he 665 199-212. [R] Englunl, PT. 1093, The structureand biosy- rithesis of glycosyl phosphatidy inositol protein anchors. Aun. Ree, Biol. 62: 121-138. [R] Faraz, TA, G Waksman and J. 1, Gordon,88 @ Seccién | ¢ Introduccion 2001. The biology and enzymology of pro: tein N-myristoylation. Amn, Reo. Biocho. 276: 39501-30504. [R] Potty, H. R, 1993. Moleadar Biology of Mem branes: Structure and Function, New York Plenum Press Singer, S|. 1990. "The structure and insertion ‘oF integral proteins in. membranes. “nn Rec Cell Biol. 6: 247-296. 1R] Singer, 5. J. and G. L. Nicolson. 1972. The ‘uid mosaic model of the structure of ell ‘membranes, Seiewce 175: 720-731. [PI Tamm, LK. A. Arora and J. H. Kleins- ‘chmidt 2001, Steucture and assembly of /- barrel membrane proteins. J. Biol Chev 276: 32399-32402. [R] Towler, D. A, J. Gordon, 8. P. Adams and 1. Glaser, 1988, The biology and enzymo: logy of eukaryotic protein acylation. in. Rev. Biohen. 57: 69-59, [R] White, §. H., A. §. Ladokhin, S. Jayasinghe and K. Hristova, 2001. Hew membranes Shope protein structure) Biel. Chem. 2 32595.32398, [ Yeagle, P-L. 1993. The Membranes of Cel 2nd ed. San Diego, CA: Academic Press. Zhang, FL. and P. |. Casey, 1996, Protein prenylation: Molecular mechanisms and functional consequences. Ann Reo. Bio hn, 65: 241-260, TR]Herencia, genes y ADN. 89 Expresién de la informacion genética 96 ADN recombinante Deteccin de dcidos nucleicos y proteinas, 17 103 Funcién de los genes en eucariotas ExPERIMENTO CLAVE: Hipétesis del provirus de ADN Meoicina movecutar: VIM y sida 105 102 123 Fundamentos de biolo molecular ‘comprensién de los mecanismos responsables de la transmisidn y expre- ssi6n de la informacién genética que en ultimo término determinan la es- tructura y funcién celulares. Como fue expuesto en el Capitulo 1, todas las célu- las comparten un numero de propiedades biisicas, y ésta unidad subyacente de la biologia celular es particularmente evidente en el nivel molecular. Tal unidad ha permitido a los cientificos elegir organismos sencillos (como las bacterias) como modelos para muchos experimentos fundamentales asumiendo que me- canismos moleculares similares son comunes en organismos tan distintos como E. coliy el organismo humano. Numerosos experimentos han demostra- do la validez de esta premisa, y actualmente es evidente que la biologia mole- cular celular proporeiona un marco unificador para comprender diversos aspec- tos del comportamiento celular. Los avances iniciales en biologia molecular se lograron aprovechando el rapido crecimiento y la facilidad de manipulacién del genoma de bacterias sen- cillas como E. coli, y sus virus. A continuacién, el desarrollo del ADN recombi- ante permitio establecer tanto los principios fundamentales, como diversos procedimientos experimentales desarroliados en un principio en procariolas y aplicados posteriormente a células eucariotas. La aplicaci6n de la tecnologia del ADN recombinante ha tenido un enorme impacto, inicialmente permitiendo el aislamiento y caracterizacion de genes eucaridticos individuales, y mas re- cientemente permitiendo la determinacién de secuencias completas del geno ma de animales y plantas superiores, incluyendo el humano. | A BIOLOGIA MOLECULAR CONTEMPORANEA se ocupa principalmente de la Herencia, genes y ADN Quiza la propiedad fundamental de todos los seres vivos es la capacidad de reproducirse, Todos los organismos heredan de sus progenitores la informacion genética especificando su estructura y funcion. De igual forma, todas las células provienen de otras células preexistentes, por lo que el material genético ha de ser replicado y transferido del progenitor a la célula hija en cada division celular. El modo por el cual la informacién genética es replicada y transmitida de célula a célula y de organismo a organismo representa pues una de las cuestiones centrales de la Biologia. Asi, la elucidacién de los mecanismos de la transi sion genética y la identificacién del ADN como el material genético fueron des- cubrimientos que constituyen los cimientos de nuestro entendimiento actual de la biologia a nivel molecular. 8990 @ Seccion | * Introduccion Figura 3.1 Herencia de genes dominantes y recesivos. Genes y cromosomas Los principios genéticos cldsicos fueron deducidos por Gregor Mendel en 1865, basdndose en experimentos con guisantes. Mendel estudi la herencia de un intimero de rasgos bien definides, como el color de la semilla, y fue capaz de deducir las reglas generales para su transmisién. Interpret correctamente los patrones de herencia observados asumiendo que cada rasgo esta determinado por un par de factores heredados, conocidos actualmente como genes. De cada progenitor se hereda una copia del gen (llamada alelo) especificando cada rasgo. Por ejemplo cruzando dos variedades de guisantes —una con se- millas amarillas y otra con semillas verdes — se obtienen los siguientes resulta- dos (Fig. 3.1): Las cepas progenitoras tienen cada una dos copias idénticas del gen que especifica el color amarillo (¥) 0 verde (y) de las semilas, respectiva- mente. Las plantas hijas son por lo tanto hibridos, habiendo heredado un gen para semillas amarillas (¥) y otro para semillas verdes (y). Todas estas plantas hijas (la primera generacion o F,) tiene semillas amarillas, por lo que se dice que el amarillo (Y) es dominante y el verde (y) recesivo. El genotipo (composicién genética) de los guisantes F, es entonces Yy, y su fenotipo (apariencia fisica) es amarillo, Si se cruza un descendiente F, con otro, dando lugar a la genera- cién F,, los genes de las semillas amarillas y verdes se segregan de tal forma que la proporcién entre plantas F, con -semillas amarillas y aquellas con semi- llas verdes es 3:1. Los descubrimientos de Mendel, aparentemente por delante de su tiempo, fueron ignorados hasta 1900, cuando las leyes de Mendel fueron redescubier- tas y se reconocié su importancia. Poco después se prapuso el papel de los cromosomas como portadores de genes, al evidenciar que la mayor parte de las células de plantas superiores y animales son diploides, es decir, contienen dos copias de cada cromosoma. Sin embargo, la formacién de las células ger- minales (el espermatozoide y el dvulo) se produce a través de un tipo caracte- ristico de divisién celular (meiosis) en el cual un tinico cromosoma de cada par se transmite a cada célula hija (Fig. 3.2). Por lo tanto, el espermatozoide y el 6vulo son haploides, dado que contione una copia de cada cromosoma, La union de estas dos células haploides en la fertilizacién da lugar a un nuevo Tas eapas progeniiovas poseen cada una dos] Cepas ® i) copias (alelos) del gen que coditica el color progentoras rma (Y) vrds las soma Los progenitores producen células germinales (gametos), cada una de las comms @——-@) | Semana ar dan lugar a la generacion hibrida Fy c Dado que ¥ es dominanie, todas las jeneracién Fy plantas de la F; tienen sernilas amarilas Gametos Q aw ® @® \© (eam em mera | <" | lugar ala generacion Fp, con una. > | essere ne / meen, | Densidad ADN hibrido ||qree| fen aumento Ne Figura 3.7, Demostracién experimental de la repli- ecacion semiconservativa. Se translie- ren bacterias que han sido cultivadas en lun medio con et isdtopo normal det rit: ‘geno (N"*) a un medio que contiene un isdtopo pesado (N') y se dejan crecer du- rante varias generaciones. Se transfieren de nuevo a un medio que sélo contiene N'*y se dejan crecer durante una genere- ‘G6n adicional. Se extrae su ADN y se ana- liza por centrifugacién de equilibria con tuna solucién del CsCl, el cual sedimenta formando un gradiente de densidad. Las rmoléculas de ADN se depositan a una al- tura a la que su densidad es equivalent a la del CsCl. El ADN de la bacteria crecica fen N° que fue transferida para un unico ‘clo en N' se deposita a una altura inter- media entre las de! ADN de bacterias cul tivadas exclusivamente en N'*y N'. Esto significa que es una molécula hibrida con tuna hebra ligera y otra pesada98 @ Seccidn | * Introduccion Mutaciones: Proteina normal 4 y 5 Figura 3.9 Sintesis de ARN a partir de ADN. Las dos hebras de ADN se desenrolian, y una es usada como molde para la sintesis de luna hebra de ARN. ' Y ' Y Y ’ ' ADN DNONIVOWNIWWRNIVIOINININIIVIOILONYIVINIDIWINDOIR ot 4 | iO” OO TOSOOOO COO OOO 66°) Figura 3.8 Colinealidad de genes y proteinas. Una serie de mutaciones (puntas de flecha) fueron mapeadas en el gen de E.coli que coditica la triptotano sintotasa (linea superior). Las sustituciones de aminoacidos resuitantes de cada mutacion fueron determinadas por se- ‘cuenciacion de las proteinas de la bacteria mulante (linea inferior). Estos analisisrevela- ron que el orden de las mutaciones en el ADN era e! mismo que el orden de las sustitucio, ‘nes de aminodicides en la proteina coditicada. Papel del ARN mensajero ‘Aunque la secuencia de nuclestidos en el ADN parecia especificar el orden de los aminoacids en las proteinas, eso no significaba necesariamente que el ADN dirigiera por si mismo la sintesis de proteinas. De hecho, no parecia ser el caso, dado que el ADN se localiza en el nucleo de las células eucaristicas, mieniras que la sintesis proteinica se lleva a cabo en el citoplasma. Era necesa- ria otra molécula para llevar la informacién genética del ADN a los sitios donde se realiza la sintesis de proteinas (los ribosomas) EI ARN se antojaba un buen candidato para ser dicho intermediario porque {a similitud de su estructura con la del ADN sugeria que el ARN podia ser sitet zado a partir de un molde de ADN (Fig. 3.9). El ARN difiere del ADN en que se compone de una cadena tnica en vez de ser de doble cadena, sus aziicares son ribosas en vez de desoxirribosas y contiene la base pirimidinica uracilo (U) en vez de timina (T) (véase la Fig. 2.10). Sin embargo, ni el cambio de azticar ni la sustitucion de T por U altera el apareamiento de las bases, por lo que la sintesis de ARN puede ser realizada de manera directa sobre un molde de ADN. Ademas, dado que el ARN se localiza primariamente en el citoplasma, parecia un intermediario légico para transferir la informacién del ADN a los ribosomas. Estas caracteristicas del ARN sugirieron una via para el flujo de informacion genética que se conoce como el dogma central de la biologia mo- lecular ADN —- ARN —> Proteina De acuerdo con este concepto, las moléculas de ARN se sintetizan a partir de moldes de ADN (un proceso llamado transcripeién), y las proteinas se sintet: zan a partir de moldes de ARN (un proceso denominado traduccién). La evidencia experimental sobre la intermediacion del ARN postulada por el ‘dogma central fue obtenida por Sidney Brenner, Francois Jacob y Matthew Me- selson en estudios de E. col infectados por el bacteridtago T4. La sintesis de ARN de E, coli se interrumpe tras la infeccién por el bacteristago T4, después de lo cual el unico ARN de nueva sintesis en bacterias infectadas es transcrito a partir del ADN del T4. Este ARN del T4 se une a ribosomas bacterianos, transf Fiendo la informacién del ADN al lugar donde se realiza la sintesis proteinica Debide a su funcién como intermediarios en el flujo de informacién genética, las, moléculas de ARN que sirven de moldes para la sintesis proteinica se denomi- nan ARNs mensajeros (ARNm). Son transcritos por una enzima (ARN poli- ‘merasa) que cataliza la sintesis de ARN a partir de un molde de ADN. Aparte del ARNm, existen otros dos tipos de moléculas de ARN que son importantes en la sintes's proteinica. El ARN ribosémico (ARNr) es un compo-Capitulo 3 ¢ Fundamentos de biologia molecular @ 99 nente de los ribosomas, y el ARN de transferencia (ARNt) funciona como una molécula adaptadora que alinea los aminosicidos a lo largo del molde de ARNm. La estructura y funcién de estas moléculas se tratan en la siguiente seccién y en mayor detalle en los Capitulos 6 y 7. Cédigo genético 4COmo se traduce la secuencia de nucledtidos del ARNm a la secuencia de aminodcidos de una proteina? En este escaldn de la expresién génica se trans- fiere informacion genética entre macromoléculas quimicamente no relaciona- das —acidos nucleicos y proteinas— y plantea dos nuevos problemas para en- tender la accién de los genes. Primero, dado que los aminoacidos no se relacionan estructuralmente con las bases de los acidos nucleicos, el apareamiento complementario directo en- tre las bases de! ARNm y los aminodcidos durante la incorporacion de éstos a las proteinas parecia imposible. ; Como se alineaban entonces los aminoacidos sobre el moide de ARN durante la sintesis proteinica? Esta cuestion se aclaro con el descubrimiento de que los ARNt sirven de adaptadores entre los aminoa- cidos y el ARNm durante la traduccién (Fig. 3.10). Previamente a su utilizacion en la sintesis proteinica, cada aminodcido se une a su ARNt por medio de una enzima specifica. E| apareamiento de bases entre una secuencia de reconoci- miento del ARNI y una Secuencia complementaria en el ARNm dirige al aminoa- cido a su posicidn correcta en el molde de ARNm. El segundo problema para traducir una secuencia de nuoledtides a una se- cuencia de aminodicidos era la determinacién del cédigo genético. Como se podria transterir la informacién contenida en una secuencia nucleotidica de cua- tro elementos a la secuencia de 20 aminodcidos distintos que compone las pro- teinas? Dado que cuatro nucledtidos deben codificar 20 aminodcidos, son preci- sos al menos tres nucledtidos para codificar cada aminodcido. Tomados individualmente, los cuatro nucledtidos slo pueden codifcar cuatro aminoacidos, y tomados en parejas cuatro nuclestidos sélo codifican dieciséis (4°) aminoaci dos. Sin embargo, tomados de tres en tres cuatro nuclestidos podrian codificar 64 (4°) aminod.cidos distintos —mas que suficiente para los 20 aminoacidos existentes on las proteinas. La evidencia experimental directa se obtuvo en estudios con el bacteridfago 4, portador de mutaciones en un gen conocido detalladamente, llamado rll Los fagos con mutaciones en este gen forman placas anormalmente grandes, que son facilmente distinguibles de las formadas por fagos del tipo salvaje. Por lo tanto, fue sencillo aislar y mapear un cierto numero de estas mutaciones en el rl, lo cual llevé al establecimiento de un detallado mapa genético de este Jocus. Elestudio de las recombinaciones entre mutantes del gen ll que surgieron por adiciones 0 deleciones de nucledtidos revelo que los fagos que contenian adi ciones 0 deleciones de uno 0 dos nuclestidos siempre mostraban el fenotipo mutante. Sin embargo, los fagos que contenian adiciones o deleciones de tres, nucledtidos eran {uncionalmente del tipo salvaje (Fig. 3.11). Estos hallazgos sugirieron que el gen se lee en grupos de tres nuclestidos, empezando a partir de un punto fjo, Adiciones o deleciones de uno o dos nuclestidos alterarian el ‘marco de lectura de todo el gen, levando a la codificacién de aminoacidos anor- males a lo largo de toda la proteina. Por el contrario, la adicidn 0 delecién de tres nucledtidos lleva a la adicién o delecion de un solo aminoacido; el resto de Figura 3.10 Funcién del ARN de transterencia. EI ARN de transferencia sirve como un adaptador durante la sintesis proteica, Cada aminodicido (pe). histidina) se une al extreme 3 de un NAL por una enzima apropiada (una aminoacil RNAt sintetasa). El RNAt cargado se alinea sobre un molde de RNAm por complementariedad de bases. ants 7 Histiginil ARN sintetasa ARN cargado Apareamiente por _ complementariodad [sxrases100 © Seccion| * Introduccion Figura 3.11 Evidencia genética de! cédigo de tri- pletes. Fueron estudiadas una serie de Mutaciones que consistian en la adicion ‘de uno, dos 0 tres nuclestidos en ol gen rl del bacteridfago T4. La adicion de uno 6 dos nucledtidos altora ol marco de lectura de todo @! resto del gen. Por tanto todos los aminodcidos son anormales y se pro- duce una proteina inactiva, dando lugar a Un fago mutante, La adicion de tres nu- cledtidos, por el contrario, altera un unico ‘aminoacido. El marco de lectura det resto el gen es normal, y se produce una pro- teina activa que da lugar al fago de tipo salvaje (TS). Figura 3.12 EI triplete UUU codifica a la fenilalni- na. La traduccion in vitro de-un ARN sintético compuesto de uracil repetidos (un molde de uracilos repetidos (un mol de de poli-U) lleva ala sintesis de un po- lipptido compuesto unicamente por feni- lalanina, Molde de pol-U Traduecion inviro rcs EBEBERED AON ACG TGA TAT GOG GAT ACG GAG Qe a sc) 0 KON) AON ACG GTC ATA TCC GCA TAC COAG . BOB Aminodcidos (an\(ValY \) " AON ACG GAT CAT ATC CGC ATA CCG.AG ee OOOOOG ADN ACG GAC TCA TAT CCG CAT ACC GAG. OOOO) la secuencia aminoacidica permanece inalterada, produciendo frecuentemente una proteina activa. El desciframiento del cédigo genético se convirtié en un problema de asignar tripletes de nucledtidos a sus correspondientes aminoacidos. La aproximacion al problema consistié en el uso de sistemas in vitro que realizaran sintesis pro- teinica (traduccién in vitro). Se sabia que los extractos celulares que contie- nen ribosomas, aminodcidos, ARNt y las enzimas responsables de unir a los aminoacidos con su correspondiente ARN! (aminoacil-ARNt sintetasas) son ca- paces de catalizar la incorporacién de aminodcidos a las proteinas. Esta sinte- sis proteinica depende de la presencia de ARNm unido a los ribosomas, y se puede aumentar anadiendo ARNm purificado. Dado que el ARNm dirige la sin- {esis proteinica en estos sistemas, el cédigo genético podria ser descodificado estudiando la traduccién de ARNm sintético de secuencia conocida. El primero de dichos experiments, llevado a cabo por Marshall Nirenberg y Heinrich Matthaei, consistié en la traduccién in vitro de un polimero de ARNm que Unicamente contenia uracilo (Fig. 3.12). Este molde de poli-U dirigié la in- corporacién de un Unico aminoacido —fenilalanina—en un polipéptido formado por residuos repetidos de fenilalanina. Por lo tanto el triplete UUU codifica el aminoacido fenilalanina, Experimentos similares con polimeros de ARNm com- puestos de un Unico nuclestido establecieron que AAA coditica la lisina y CCC codifica la prolina. El resto del cédigo fue descifrado utilizando polimeros de ARNm compuestos de mezclas de nuclestidos, llevando a la asignacién de los 64 posibles triplotes (denominados codones) (Tabla 3.1). De los 64 codones, 61 codifican algun aminodcido: los tres restantes (UAA, UAG y UGA) son codo- nes de parada o stop que sefializan la terminacién de la sintesis proteinica. El cédigo esté degenerado, dado que muchos aminodcidos estan codificados por mas de un codon. Con pocas excepciones (discutidas en el Cap. 10), todos los organismos utilizan el mismo eédigo genético, apoyando con tuerza la conclu- sion de que todas las células actuales han evolucionado a partir de un ancestro comin. Gen normal Proteina activa —» Fago TS +1 nuclestido Proteina inactva—e Mutante rt +2 nuclectidos Proteina inactva—e Mutante ri! +3 nuctestidos Proteina activa —» Fago TS Virus ARN y transcripeién inversa Con el esclarecimiento del cédigo genético, los principios fundamentales de la biologia molecular celular parecian estar establecidos. De acuerdo con el dog- ‘ma central, el material genético es el ADN, que es capaz de autorreplicarse ademés de transcribirse a ARNm, que sirve a su vez de molde para la sintesis proteinica. Sin embargo, como fue expuesto en el Capitulo 1, muchos virus contienen ARN en vez de ADN como material genético, lo cual implica la exis- tencia de otros modos de transferencia de informacion,Capitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 101 Phe ser wr os u 1 Phe ser ua ys ce Leu Ser STOP STOP A Leu Ser STOP T. 6 Leu Po His ag u Leu Pro His ag © fi Leu Pro Gin ag A Leu Po Gin Ag 6 Ne tw Asn ‘Ser v Ne The Asn ‘Ser c | Ne The us Ag A Mot The us Ag 6 val Ala Asp sy v Val Ala Asp ey c e val Ala Gu sy A Val Ala Gu ey 6 Los genomas de ARN fueron descubiertos en primer lugar en virus vegeta- les, muchos de los cuales se componen tinicamente de ARN y proteinas. En los afios 60 se obtuvo evidencia directa de que el ARN acta como material genéti- co por medio de experimentos que demostraron que el ARN purificado del virus del mosaico del tabaco podia infectar nuevas células, dando lugar a una proge- nie de virus infectivos. £! modo de replicacién de la mayoria de los genomas virales ARN se determind posteriormente en estudios de los bacteridfagos ARN de E. coli Estos virus codifican una enzima espectfica que cataliza la sintesis de ARN a partir de un molde de ARN (sintesis de ARN dirigida por ARN), util- zando el mismo mecanismo de apareamiento de bases entre hebras comple- mentarias que se da durante la replicacién del ADN 0 durante la transcripcién de ARN a partir de ADN ‘Aunque la mayoria de los virus animales, como el poliovirus 0 el virus in- fluenza, se observé que se replicaban por sintesis de ARN dirigida por ARN, este mecanismo no parecia explicar la replicacién de una familia de virus ani- males (los virus ARN tumorigénicos), que eran de especial interés debido a su capacidad de causar cancer en animales infectados. Pese a que estos virus contienen ARN gendmico en las particulas virales, los experimentos llevados @ cabo por Howard Temin en los 60 indicaron que se requeria sintesis de ADN en las células infectadas para completar su ciclo vital, llevando a la hipotesis de que los virus tumorales de ARN (denominados actualmente retrovirus) se re- plicaban por medio de la sintesis de un ADN intermediario, llamado provirus de ADN (Fig. 3.13). Esta hipétesis fue recibida inicialmente con incredulidad gene- ralizada dado que implica la sintesis de ADN dirigida por ARN —una inversion de! dogma central de la biologia molecular—. Sin embargo, en 1970 Howard Temin y David Baltimore descubrieron de forma independiente que el ARN de los virus tumorales contenia una enzima que cataliza la sintesis de ADN desde unmolde de ARN. Adicionalmente se obtuvo evidencia fehaciente de la existen- cia de secuencias de ADN viral en las células infectadas. La sintesis de ADN a partir de ARN, ahora denominada transcripcién inversa, fue establecida como lun nuevo modo de transterencia de informacion en sistemas biol6gicos.102_@ Seccion! » Introduccion Experimento clave Hipotesis del provirus de ADN Naturaleza del provirus del sarcoma de Rous Impacto Howard M. Temin La hipdtesis dal provirus de ADN se Laboratorio McArdle, Universidad de Wisconsin, Madison, WL ropuso basandose en experimentos WI genéticos y en los efectos de inhibidores tities ia aed metabélicos. Era una propuesta radical que contradecia el aceptado dogma central de la biologia molecular. En este Contexto, la hipotesis de Temin de que el VSR se replicaba transfiriendo su informacién de ARN a ADN no sélo no fue aceptada por la comunidad Cientifica, sino que fue recibida con Contexto En primer luge, los estudios de Fea ee ete te transformacion celular utlizando : . mutantes de VSR indicaron que la (VSR), el primer vius inductor defn genalicn Sel ne Considerable interés como sistema _eterminaba importantes ‘experimental para el estudio de la Caractristicas en las células Sa ree transtormadas. Esta informacion se trancmilia@ las e6ulas hjas tras : : Howard Tin comenzd su Ss in neue eres Coee ganda peccads oe” d® oplcacin viral. Temin propuso 1958, desarroll6 el primer método Bee a ier weenie én do cout para fa transtormacién de células en una forma estable y heredable, tras su infeccién por el VSR. La As Enon Prous. La evidencia de que el provirus disponibilidad de un método ‘cuantitativo in vitro proporcioné Ia S@.Compone de ADN se derivé de herramienta necesaria para ‘experimentos con inhibidores tabdlicos. La actinomicina D, ‘studios posteriores de et , transformacién celulary replicacién que inhibe la sintesis de ARN a viral. Mientras Temin realizaba partir de un molde de ADN, inhibia dichos estudios, realizé una serie la produccion de virus en células de inesperadas observaciones que _nfectadas por el VSR (véase la Figura). Por otro lado, los indlaronqolaroplcsciénde VSP. hires dea sis de ADN Hialan scans peowe ee toro deus ARN. Ese goa collar for VBR. Es, peimeiee torn aTonn® — Cloodereriiguomueseremmia, sara graacade. Sa onbayo Tenn froponerla pecs dl powus | Comoe EAN a guncploose corns uence shoe 60 ee Go AON, que simaba cue IAF) tesny arco oARN drigda ipminaiee uae Se spa a Mialcecopaba aADN enias PoraGNvuraouucronhie sretcu nas connec obkiesifecadaeuna propuesta Eo wala pepuesiaSoamoal pies Sus esverae cura on goin cretmmcinenomitchl TF insem une coAaial itibeorlancbeiets porter) central de la biologia molecular, ge70ma ARN viral, Temin trato de Satoshi Mizutani, e independientemente eres vaicice ums parveatlameen aetee eae ietsosiicberuaia jn Seu crou mad cemee eran Experimentos detectar secuencias virales en el inversa, que sintetiza ADN a partir aia Catiieatt del roiiideANas RON Soconice cen ram aseas Ue uen amuoerenon Eaicen Uoumeyannonal gawomaden ea oer Heats resutees asia cs eeomeen tae eperbleseretewadeytee debs coal pone wiarnene Sraeleenaaa tasa contr incl) 10 ugimi 8 12 16 20 24 Horas Produccién de vius (porcantaje de Con actinomicina D La transcripcién inversa es importante no sélo en la replicacién de los retro- virus sino también en al menos otros dos aspectos de la biologia molecular y celular. Primero, la transcripcién inversa no es exclusiva de los retrovirus; ocu- rre también en las células y frecuentemente es responsable de la transposicion de secuencias de ADN de una localizacién cromosémica a otra, como se discuCapitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 103 Hipétesis del provirus de ADN (continuacién) Temin concluyé su articulo de 1970 con la afirmacién de que los, resultados «constituyen una fuerte ‘evidencia de que la hipétesis del provirus de ADN es correcta y que los virus tumorales de ARN tienen un genoma de ADN cuando estan dentro de las células y un genoma de ARN cuando estan en forma de viriones. Estos resultados pueden tener importantes implicaciones en la carcinogénesis de origen viral y posiblemente en los modelos de transferencia de informacién en otros sistemas biolégicos». predijo Temin, el descubrimiento de la sintosis de ADN dirigida por ARN ha llevado a importantes avances en el entendimiento del cancer, los retrovirus humanos y el reordenamiento genético. La trancriptasa inversa se ha convertido en una herramienta critica para clonar el ADN, repercutiendo en virtualmente todas las areas de la biologia celular y molecular contemporénea. te en el Capitulo 5. Segundo, las enzimas que catalizan la sintesis de ADN dirigida por ARN (transcriptasas inversas) se utiizan experimentalmente para generar copias de ADN a partir de una molécula de ARNm. El uso de la trans criptasa inversa ha permitido el estudio del ARNm de células eucaridticas por medio de los métodos moleculares de manipulacién del ADN utilizados actual- mente, como sera expuesto en la siguiente seccién, ADN recombinante Los experimentos cldsicos en biologia molecular fueron llamativamente exito- sos en el desarrollo de los conceptos fundamentales sobre la naturaleza y ex- Partcula de retrovirus Garame APN Oh, ™ Transcriooion inversa a : i : D: ee < —, Paniculas virales 3 Howard Temin| Figura 3.13. ‘Transcripcién inversa y replicacién de retrovirus. Los retrovirus contienen ge- nomas de ARN en sus particulas virales. Cuando un retrovirus infecta una célula hhuésped se sintetiza una copia de ADN del ARN viral por medio de la transcripta: sa inversa. Este ADN viral se integra en el ADN cromosomico del huésped para cons: tiuir un provirus de ADN, que se transcri- be para dar lugar a virus ARN hijs.104 @ Seccidén| * Introduccién presién de los genes. Dado que estos estudios se basaron en el andlisis genéti- co, su éxito dependia en gran medida en la eleccién como modelos de organis- mos simples y de répida replicacion (como las bacterias y los virus). Sin embar- {g0, no estaba claro como se podrian generalizar estos principio fundamentales ara proporcionar un entendimiento molecular de la complejidad de las células eucariticas, teniendo en cuenta que los genomas de la mayoria de los eucario- tas (p. e}., el genoma humano) son hasta mil veces mas complejos que el de E. coli. A principios de los afios 70 el panorama de estudiar dichos genomas a un nivel molecular era desalentador. En particular, no parecia haber una manera de aislar y estudiar genes individuales. Este obstdculo para el progreso de la biologia molecular fue superado por el desarrollo de la tecnologia del ADN recombinante, que proporcioné alos cienti- ficos la posibilidad de aislar, secuenciar y manipular genes individuales deriva- dos de cualquier tipo celular. La aplicacién del ADN recombinante ha permitido el estudio molecular detallado de la estructura y funcién de los genes eucarist- cos, revolucionando nuestro entendimiento de la biologia celular. Endonucleasas de restriccién El primer paso en el desarrollo de la tecnologia del ADN recombinante fue la caracterizacion de las endonucleasas de restriccién —enzimas que cortan el ADN en lugares concretos y especificos de su secuencia—. Fueron identiica- das en bacterias, donde aparentemente cumplen una funcién defensiva frente a la entrada en la célula de ADN extrafo (p. ¢j., de un virus). Las bacterias poseen na amplia variedad de endonucleasas de restriccidn que cortan el ADN en mas de un centenar de sitios de reconocimiento, cada uno de los cuales consiste en Una secuencia especifica de entre cuatro y acho pares de bases (se muestran ejemplos en la Tabla 3.2). Dado que las endonucleasas de restriccién digieren el ADN a nivel de se~ cuencias especificas, pueden ser utiizadas para cortar una molécula de ADN en sitios Unicos. Por ejemplo, la endonucleasa de restriccién EcoRI reconoce las secuencia de seis pares de bases GAATTC. Esta secuencia esta presente cinco veces en el ADN del bacteriofago 7, por lo que digiere el ADN del fago en seis fragmentos de entre 3,6 y 21,2 kilobases de longitud (1 kilobase 0 kb = 1.000 pares de bases) (Fig. 3.14). Estos fragmentos pueden separarse segun su ta- Fuente ‘Secuencia de reconocimiento” actus amylotquetaciens H aatoo Escherichia coh RS GaatTo. Haemophitus aegyptius seco Haemophiis inivenzae Ra aaccTT Haemophits paraintvenzae rraac Haemophilus parainfuenzae cose Moraxella bovis Gate Nocardia ottiis-caviarum aesecese ‘Streptomyces fmbviatus GGCCNNNNNGGCE ‘Thermus aquatious Toca * Las enzines se nombran segue especie de la que se asaron, soguld por un némore pa dating istreas (qrames asides a purr dl mame organise (3), Fal y Poa "ig saci de reconee montomusran uncarsntelasecvencia d wna cacena cl ADN de dee cadens she representa cuslquior baseCapitulo 3 « Fundamentos de biologia molecular @ 105 Medicina molecular La enfermedad EI sindrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) es una nueva enfermedad, deserita por primera vez en 1981. Se ha convertido en una pandemia a nivel mundial, con mas de 47 millones de personas infectadas y mas de 14 millones de muertes por sida. En los Estados Unidos es la primera causa de muerte en los hombres de entre 25 y 44 afios. Las manifestaciones Clinicas se derivan principaimente de la incapacidad del sistema inmune para funcionar con normatidad. En ausencia de una inmunidad normal, los pacientes con sida son sensibles a infecciones oportunistas por agentes (virus, bacterias, hongos y pprotozo0s) a los que un individuo sano es resistente. Los enfermos de sida sufren también una mayor incidencia de determinados tipos de cancer, particularmente linfomas y sarcoma de Kaposi, aunque las enfermedades oportunistas son responsables de la mayoria de las muertes. Bases moleculares y celulares El sida esta causado por un retrovirus (el virus de la inmunodeficiencia humana o VIH) {que fue descubierto por los grupos investigadores de Robert Gallo y Luc Montagnier en 1983. El HIV infecta Un tipo especttico de linfocito (ol linfocito T4) que es necesario para una respuesta inmune normal. Al ‘contrario que otfos retrovirus, como €l virus del sarcoma de Rous, el ViH 1g induce la malignizacion de las células alas que infecta. El VIH finaimente mata las céluias en las ue se replica, produciendo una deplecién de linfocitos T4 y el fallo dl sistema inmune del individuo afectado, Este fallo del sistema inmune lleva a la aparicion de las infecciones oportunistas y de las neoplasias que constituyen el ‘cuadro clinico del sida, Prevencién y tratamiento Enel momento actual la Unica forma de prevenir el sida es evitar VIH y sida la infeccién por el VIH. El VIH es un virus fragil que pierde rapidamente ‘su infectividad fuera del cuerpo, por Jo que no se transmite por el ‘contacto casual con una persona infectada. Se puede transmitir de tres maneras: por contacto sexual, a través de hemoderivados contaminados y de la madre al hijo durante el embarazo 0 la lactancia. Tras el aislamiento del VHI se desarrollaron test de screening para garantizar la seguridad de los concentrados de factores de coagulacién y otros derivados sanguineos utllizados en las transfusiones. Prevenir la Infeccién por VIH por otras vias depende de la minimizacién de los riesgos individuales, con la practica de sexo seguro y evitando fuentes de sangre contaminada, como las jeringuillas compartidas ppara la inyeccion intravenosa de drogas. Mas alld de la modificacién de los habitos individuales para reducir el riesgo de infeccién, ia identificacién del VIH como el causante del sida abre ciertas posibilidades para su prevencidn y tratamiento. La busqueda de una vacuna para prevenir la infecoién por VIH se esta Nevando a cabo de manera activa, aunque determinadas caracteristicas de la biologia del VIH hacen dificil esta via. De forma alternativa, el desarrollo de farmacos que inhiben la replicacién viral ha proporcionado terapias efectivas para los pacientes infectados por VIH. Estos farmacos actlan como inhibidores, bien de la transcriptasa inversa, bien de la proteasa del VIH, que es una enzima necesaria para el procesamiento de las proteinas Virales. Las combinaciones de dichos térmacos estén prolongando la vida de los enfermos de sida, aunque es necesario sequir trabajando para desarrollar farmacos que sean no solo mas eficaces sino ademas menos. costosos y mas practicos para su uso en paises en desarrollo. Mierogratia por bartido de electrones de VIH brotando de un infocito T. (Ceci Fox’ Photo Researches, nc)106 @ Seccién | © Introduccion Figura 3.14 Digestion con EcoRI y electroforesis, del ADN del fago 2. La enzima EcoRI corta el ADN del fag0 / por cinco sitios, (tlechas), produciendo seis fragmentos de ADN. Estos fragmentos se separan por electroforesis en gel de agarosa. Los frag mentos de ADN migran hacia el electrodo positivo, desplazndose con mas rapidez los de menor tamafo. Tras la electrofore- sis el ADN se tine con un pigmento fluo rescente y se fotografia. Se indican los ta mafios dé los fragmentos de ADN. + 4 {_ OO ase Digestion con EcoF! % 212 kb 7.5 kb 5.7 Ko 56D 49kb 3.6%> FJ Electroforesis en gel Y Electrodo (-) 212kb Migracion aia dol ADN S76 Be KD 2306 36 kb Y electrod (+) Fotogralia dol gol majo por medio de electroforesis en ge! —un método por el que se separan las moléculas basdndose en su velocidad de migracién en un campo eléctrico. El gel, habitualmente compuesto de agarosa o poliacrilamida, se sittia entre dos compartimentos con electrodos en los que se dispone un tampon o butter. La muestra (p. ¢)., la mezcla de fragmentos de ADN para ser analizados) se depo- sita en ranuras preformadas y se aplica el campo eléctrico. Los acidos nucleicos tienen carga negativa (debido a los residuos fosfato de su estructura), por lo que migran hacia el electrodo positivo. El gel se comporta como un filtro poroso que retrasa la migracion de los fragmentos mas grandes. Las moléculas de menor tamafo se mueven a través del gel con mayor rapidez, permitiendo la separa- cién de una mezcla de Acidos nucleicos en funcion de su tamafo. Elorden de los tragmentos de restriccién se puede determinar por una serie de métodos, obteniéndose (por ejemplo) un mapa de los sitios de corte de EcoR! ‘enel ADN del fago /. Se pueden utilizar los sitios de corte de varias endonuclea- sas de restriccién para generar mapas de restriccion detallados de las molé- culas de ADN, como los genomas virales (Fig. 3.15). Es posible aislarcon elec- troforesis fragmentos individuales de ADN producidos por la digestion con endonucleasas de restriccidn para su estudio posterior —incluyendo la determi nacién de su secuencia de bases—. De esta forma se han caracterizado los ADNs de muchos virus. La digestion con endonucleasas de restriccién por si sola no proporciona suficiente resolucién para el andlisis de moléculas de ADN mayores, como ge-Capitulo 3 « Fundamentos de biologia molecular @ 107 ‘Adenovieus y Bari Y Econ! 1 Hind nomas celulares. Una endonucleasa de restriccién con una secuencia de reco- nocimento de seis pares de bases (como la EcoR!) cota el ADN con una fre~ cuencia estadistica de un corte cada 4.096 pares de bases (1/4°). Una molécula ‘como el ADN de (48,5 kb) se podria esperar que diera unos diez tragmentos Ecofil, lo cual es consistente con los resultados ilustrados en la Fig. 3.16. Sin ‘embargo, la digestion con endonucleasas de restriocién de genomas de mayor tamano proporciona resultados muy distintos. El genoma humano tiene unas 3.x 10° kb por lo que daria unos 500.000 tragmentos EcoRI. Un nimero tan {grande de fragmentos no se pueden separar entre si y tras la electroforesis en gel de agarosa del ADN humano digerido con EcoRI se obtiene una banda continua en vez de un patrén discreto de tragmentos de ADN. Dado que es imposible aislar fragmentos de restriccién individuales, la digestion con endo- nucleasas de restriccién por si misma no proporciona una fuente de ADN ho- ‘mogeneo apropiado para ser estudiado. Sin embargo, se pueden obtener canti- dades suficientes de fragmentos de ADN purificado a través de la clonacién ‘molecular. Generacién de moléculas de ADN recombinante La estrategia basica en la clonacién molecular es insertar un fragmento de ADN de interés (p. ¢., un segmento de ADN humano) en una molécula (llamada vector) que es capaz de replicarse de forma independiente en una célula hués- ped. El resultado es una molécula recombinante o clon molecular, compues- to de las secuencias del ADN insertado y del vector. Se pueden obtener gran- des cantidades del ADN insertado si se permite replicarse a la molécula recombinante en un huésped apropiado. Por ejemplo, se pueden olonar frag mentos de ADN humano con el ADN del bacterisfago / de E. coli como vector (Fig. 3.16). Se introducen estas moléculas recombinantes en E. coli, donde so reproducen de forma eficaz produciendo millones de fagos hijos que contienen 1 ADN humano insertado. El ADN de estos fagos puede ser aislado, obtenién- dose grandes cantidades de moléculas recombinantes que contienen un frag- mento Unico de ADN humano. Mientras que este fragmento representa el 0,001 % del ADN genémico humano total, constituye el 10% del genoma total del vector. El fragmento puede ser aislado de manera sencilla del resto del ADN del vector utilizando las mismas endonucleasas de restriccién usadas para su insercién y realizando una electroforesis en gel, permitiendo el analisis y poste- rior manipulacién de un fragmento puro de ADN humano, Los fragmentos de ADN utlizados para crear moléculas de ADN recombinan- te son generados por digestion con endonucieasas de restriccién, Muchas de estas enzimas cortan sus secuencias de reconacimiento de forma escalonada, generando extremos complementarios 0 cohesivos de una sola hebra que pue- den asociarse entre si por apareamiento complementario de bases (Fig. 3.17). Los extremos complementarios emparejacios pueden conectarse de forma defini- tiva por medio de una ADN ligasa, una enzima que repara roturas en las hebras de ADN (véase Cap. 5). De esta forma dos tragmentos distintos de ADN (p. e}. un ADN humano y un ADN del vector’) acondicionados tras digestion por la misma endonucleasa de restriccién pueden ser unidos para crear una molécula de ADN recombinante, Figura 3.15 Mapas de restriccién del ADN de .y del ADN del adenovirus humano 2. La lo: calizacién de los sitios de corte de BamHl EcoAlly Hindll se muestran en fos ADNS del bacterisfago / de E.coli (48.5 kb} y del adenovirus humano 2 (35,9 kb) Inserto de ADN humano Vector i Unién de los ADNS hhumanos y del vector Molécula recombinante Introduccion on Ecol ‘ge | Replicacién del ADN => Fagos conteniendo eLADN recombinant Figura 3.16 Generacion de una molécula de ADN recombinante. Se inserta un fragmento de ADN humana en un vactor de ADN La molécula resultante de ADN recombi- rnante se introduce después en E. coll, donde se replica para dar fagos hijos que contienen el fragmento insertado de ADN humane,108 @ Seccién | ¢ Introduccién Figura 3.47 Unién de moléculas de ADN. El ADN pasajero y el dol vector se digieren con luna endonucleasa de restriccidn (como la EcoRil), que corta en sitios escalonados dejando extremos compiementarios de cadena simple. EL ADN que se desea in- sertar y ol del vector se asocian por apa: reamiento complementario de bases, y la nién covalente de las hebras de ADN por medio de una ADN ligasa produce una ‘movécula recombinante, ARNe Co (Se uiliza la \ranscriptasa inversa para generar una copia \de ADNe complementaro| la parti de una molécula (de ARNm. oo [Seunenaios lextromos del ADNE ‘aligonuclectidos ladaptadores 0 linkers 'que cantienen sitios de ‘conte de endonucieasas \de restricién, [Se liga et ADNe al vector ‘apropiad (Clon de ADNe Figura 9.18 Clonacin de ADN complementario. Inseto de ABN AON de vector cor esol 8 8 8 3 coh ee | core ook | Core oor ET cova eon ESOT 8 ¢ prods dos etemos 2 Conexvs de cadena “| smo a s 8 8 Apareamionto complementario de bases 5 3 a s UUnién por ADN ligase 5 Molécula recombinante EE ea: | ARAMA | thrfafafe! Los fragmentos de ADN que pueden ser clonados no se limitan a aquellos que terminan en sitios de corte de enzimas de restriccién. Es posible afadir a los extremos de cualquier fragmento de ADN adaptadores o linkers, que son secuen- cias sintéticas que contienen sitios de corte de endonucleasas de restriccion. Los adaptadores son oligonuciestidos cortos que se obtienen con facilidad por sinte- sis quimica, permitiendo preparar practicamente cualquier fragmento de ADN para ser ligado a un vestor. ‘Ademas del ADN, es posible clonar también secuencias de ARN (Fig. 3.18). El primer paso es sintetizar una copia de ADN a partir del ARN por medio de la trans- criptasa inversa. El ADN producico (denominado ADNe poraue es complementario al ARN utiizado como molde) se liga al vector de ADN del modo antes descrito. Dado que los genes eucaristicos estan habitualmente interrumpidos por secuen Cias no codificantes (intrones; vease Cap. 4), que se eliminan del ARNm por corte y ‘empaimado o spicing, la posibilidad de clonar ADNG ademas del ADN gendmico ha sido critica para el entendimiento de la estructura y funcién de los genes. 3 Vectores para el ADN recombinante Dependiendo del tamafio del ADN que se inserta y del propésito del experimen: to es posible utilizar distintos vectores de clonacién para generar moléculas recombinantes. Los sistemas mas basicos para el aislamiento y propagacion deCapitulo 3 ¢ Fundamentos de biologia molecular @ 109 Fragmentos de ADN humana 2 ge La Eco digiore viiga Empaquelamiento en fagos Fago recombinante Terese Infeccion a E. cob Capa bacteriana jogo recombinante forma una dnica (Calva de un fago eae ADN clonado se exponen aqui. Otros tipos de vectores desarrollados para ex- presar ADN clonado e introduccir moléculas recombinantes en células eucarié- ticas se discuten en secciones posteriores. Los bacteriéfagos / son frecuentemente utilizados como vectores para el aislamiento inicial de ADN gendmico o de clones de ADNe de células eucariét cas (Fig. 3.21). En los vectores de clonado /. se han eliminado secuencias pres- cindibles del genoma viral y han sido reemplazadas por sitios de restriccién para insertar ADN clonado. Para conseguir un genoma recombinante que pue- da ser empaquetado dentro de los fagos los fragmentos de ADN que se inserten pueden ser de hasta 15 kb. Para aislar clones genémicos de ADN humano, por ‘ejemplo, se ligan fragmentos al azar de ADN humano de un tamafio medio de 15 kb al ADN de los vectores 7. Estas moléculas recombinantes de ADN se ‘empaquetan dentro de particulas de fago mezclandolas con las proteinas del / (denominadas extractos de empaquetamiento) in vitro. Las particulas obtenidas se utilzan para infectar cultivos de E.coll, Dado que cada fago recombinante forma una calva nica, pueden aislarse recombinantes portadores de un Unico ‘ADN humano, Con metodos de hilbridacién de dcidos nucieicos y otras técnicas ‘es posible identificar fagos recombinantes portadores de determinados genes de interés, como sera expuesto en la siguiente seccién. Los plésmidos (Fig. 3.20) son vectores que permiten una manipulacién mas sencilla de las secuencias de ADN clonado que los fagos. Los plsmidos son pequefias moléculas de ADN circular que se replican en el interior de las bacterias de forma independiente (sin necesidad de asociarse al ADN cromos6- Figura 3.19 Clonacién con bacteriétagos + como vectores. EI vector contiene un stio de restiiccin (p. ¢)., un sitio EcoRI) para la in- sercién de ADNe. Adicionalmente el vector Contiene en ambos extramos de su ADN si- tios cos (extremos cohesivos), que son ne~ Ccesarios para empaquetar ol ADN on os fa gos. El ADN pasajero (p. 6). ADN humano) Se liga al vector, y las moléculas recombi- nantes se empaquetan en fagos mezclan- dose con proteinas virales. Los fagos re- ‘combinantes se utlizan para infectar Ecol Cada fago recombinante, que contiene un fragmento Unico de ADN clonado, forma ‘una caiva Unica en el cultivo bacteriano in fectado, La progonie del fago que contiene un fragmento unico de ADN se puede ais- Jar de una calva individual y ser cultivada fen grandes cantidades.110 @ Seccidén| ¢ Introduccion Fragmentos de ADN para insertar EcoRt Vector plasmidico Ame Figura 3.20 Clonacién con vectores plasmidicos. El vector es una pequefia molécula cirou- lar que contiene un origen de replicacion (on), un gen que confiere resistencia a ampicilina (Amp) y un sitio de restriecién (p. 6), EcoRI) que puede utiizarse para Inserlar ADN extrano. El ADN pasajero se liga a vector y los plasmidos recombi- nantes son usados para transformar E. coli Las bacterias so cultivan en un me dio que contiene ampiclina, por lo que ‘Snicamente forman colonias las bacte- Flas que contienen el plasmido y son re- sistentes a ampicilina. Cada colonia de bbacterias conteniendo el plasmido puede fentonces aisiarse y hacerse crecer en ‘grandes cantidades, pera aislar os plas- midos recombinantes, Digestin y tratamiento con la ligasa Ecol ADN insertado 0 pasajero Plasmido recombinante amg \ recombinantes a { ulivo de las bacterias en un medio | ‘Transformacion de E. coli con plasmidos con ampiciina Medio de cutive con ampiciina resistentes a ampiciina Bacterias conteniendo el plasmido recombinante mico). Lo Unico que se necesita es que en el ADN plasmidico exista un origen de replicacion —ia secuencia de ADN que sefializa el inicio de replicacion a la ADN polimerasa de la célula huésped—. Los plasmidos portan genes que con- fieren resistencia a antibisticos (p. ej., resistencia a la ampicilina), por lo que las bacterias que portan los plasmidos pueden ser seleccionadas. El ADN de los plasmidos contiene tinicamente entre 2 y 4 kb de ADN, en contraste con las 30 a 45 kb del ADN de los fagos /, facilitando el andlisis del fragmento de ADN inser- tado. Para clonar utlizando un piasmido como vector, se liga el fragmento de ADN ‘que se desea insertar 0 pasajero a un sitio de restriccién apropiado en el vectorCapitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 111 y la molécula recombinante se usa para transformar un cultivo de E.col. Las colonias resistentes, que contienen el piésmido, son seleccionadas. Estas bacte- rias poseedoras del plésmido se hacen crecer en grandes cantidades y se extrac SUADN, Las pequefias moléculas circulares de ADN plasmidico, de las que hay ccentenares de copias por bacteria, se separan del ADN cromosémico bacteriano; 1 resultado es ADN plasmidico purticado apropiado para el andlisis del fragmen- to insertado. En determinados estudios de andlisis de ADN genémico es preciso clonar fragmentos de ADN mayores de lo que un fago / puede portar. Existen cinco tipos principales de vectores empleados con este fin (Tabla 3.3). Vectores de tipo césmico que acomodan insertos de aproximadamente 45 kb. Estos veotores contienen secuencias del bacteriétago 7 que permiten el empaquetamiento et ciente del ADN clonado en particulas de fago. Ademas, los césmicos contienen origenes de replicacién y genes para la resistencia a antibiéticos que son caracte- ristioos de los plasmidos, de modo que pueden replicarse como plasmidos en el interior de células bacterianas. Otros dos tipos de vectores se derivan del bacte- ridfago P1, en lugar del bacteridtago 7. Los vectores detivados del bactericfago Pi, que permiten acomodar fragmentos de ADN de 70 a 700 kb, contienen se- cuencias que permiten el empaquetamiento de moléculas recombinantes jn vitro en particulas de fago P1 para a continuacién replicarse como plésmidos en E, col. Los vectores de tipo cromosoma artificial P1 (PAC) también contienen secuencias del bacteri6lago P1, pero se introducen directamente como plasmi- des en E. coliy pueden acomodar insertos mayores de 130 a 150 kb. Los vecto- res de tipo cromosoma artificial de bacteriofago (BAC) se derivan de un plas ‘mido que ocurre de forma natural en E. coli (denominado el factor F). Elorigen de replicacién y otras secuencias del factor F permite a los BAC replicarse como plasmidos estables que contienen insertos de 120 a 300 kb. Fragmentos incluso mayores de ADN (250-400kb) pueden clonarse en vectores de tipo cromosoma artificial de levadura (YAC). Estos vectores contienen origenes de replicacion de levaduras ademas de otras secuencias (entrémeros y telomeres, estudiados en el Capitulo 4) que les permiten replicarse como moléculas lineares tipo cromo- soma en el interior de células de levadura. Secuenciacion de ADN La clonacién molecular de un fragmento individual de ADN permite el aisiamien- to de las grandes cantidades de material genético necesarias para su estudio detallado, incluyendo la determinacién de su secuencia de nuclestidos. La de- terminacién de las secuencias nucleotidicas de un gran numero de genes ha permitido estudiar no s6lo la estructura de sus productos proteinicos, sino tam- bién las propiedades de las secuencias de ADN que regulan la expresién géni: ca, Ademas, las secuencias codificantes de genes de reciente descubrimiento estan relacionadas frecuentemente con las de genes previamente estudiados, y la funcién de los genes aislados de novo se puede con frecuencia deducir co- rrectamente basandose en dichas similitudes. Inserto de ADN (kb) Célula huésped Césmidos 30-45 E cot Bacteriotago P1 70-109 E.cot ‘Cromasoma aritcial Pt (PAC) 1490-150 Ecol Cromasoma artitcial bacterano (BAC) 120-300 E coll ‘Cromosoma artificial de levadura (YAC) 250-400 Levadura112 @ Seccién | Introduccién CCebador o iniiador radioactivo ~ 5 8 ‘Sintesis de ADN en presencia de didesoxinuclectidos terminadores de cadena 2,,9'didesoxinucledtido Figura 3.21 Secuenciacién de ADN por el método de Sanger. Los didesoxinuciestidos, que carocen de los grupos OH en las posicio- nes 2 y 3. se usan para interrumpir la sintesis de ADN en bases especticas. Estas moléculas se incorporan de forma normal ala hebra de ADN. Sin embargo, dado que carecen del OH 3" el siguiente rnucledtido no puede ser afjadido y se para la sintesis. La sintesis de ADN co- ‘mienza con un cebador 0 primerradioac- tivo, Se llevan a cabo cuatro reacciones distintas, cada una con un didesoxinu- ‘clestido mezclado con su homélogo nor- mal y los otros tres nuctestidos normaies. Cuando se incorpora el didesoxinucle do se para la sintesis de ADN, por lo que cada reaccién produce una serie de frag- rmentos que empiezan en el iniciador y acaban en la base sustituida por el dide- soxinucledtido. Los productos de cada reaccion se separan por electratoresis y se analizan por autorradiogratia para de- terminar la secuencia de ADN. Electrotoresis ¥ Asorasouate Migracion de los fragmentos: Secuencia de la hebra complomentaria DOO>PrOrad Los métodos actuales de secuenciacién de ADN son rapidos y precisos, y la determinacién de una secuencia de varias kilobases es una tarea sencilla para la mayoria de los laboratorios de biologia molecular. De este modo, es mucho mas facil clonar y secuenciar ADN que determinar la secuencia de aminodcidos de una proteina. Dado que la secuencia de nucledtidos de un gen puede tradu- cirse facilmente a la secuencia de aminodcidos de la proteina codificada, la manera mas sencilla de determinar la secuencia de una proteina es secuenciar tun gen clonado 0 ADNe. El método més comun de secuenciacién de ADN se basa en la interrupcién prematura de la sintesis de ADN por la inclusion de didesoxinucledtidos (que no contienen el grupo hidroxilo en 3}) terminadores de cadena en reacciones de la AON polimerasa (Fig. 3.21). Se inicia la sintesis de ADN a partir de un inicia~ dor o cebador que ha sido marcado con un radioisétopo en su extremo 5’, en cuatro medios a la vez. Cada medio de incubacién contiene, ademdis de los cuatro desoxirribonuclestidos trifostato, el anélogo didesoxi de uno de ellos. La incorporacién de un didesoxinuclestido paraliza la sintesis porque no hay grupo 3’ al que afiadir otro nucletido. Se genera entonces una serie de moléculas de ADN marcado de distinta longitud que contienen en el extremo 3° el analogo didesoxi de la base que estaba codificada. Estos tragmentos se separan por electroforesis segtin su tamafio y se detectan por la exposicién del gel a una pelicula radiogratica (autorradiogratia). El tamafo de cada fragmento esta de-Capitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 113 ‘AON de simple cadena para ser secuenciado 2 WROORATO Fleacciones de secuenciacién utlizando iniciadores ma dos ‘con etiquetas fluorescentes distinas para cada didesoxinuclestido Conjunto de productos Electrotoresis Migracion de les tragmentos Haz de sor terminado por su desoxinucledtide terminal, por lo que la secuencia de ADN se corresponde con el orden de los fragmentos en ol gel. La secuenciacion de ADN a gran escala se realiza frecuentemente con si temas automaticos, que utiizan iniciadores 0 cebadores fluorescentes en reac- ciones de secuenciacién con didesoxinucledtidos (Fig. 3.22), Las hebras de ADN sintetizadas se someten a electroforesis y se van pasando a través de un haz de laser que excita el marcador fluorescente. La luz emitida es detectada por un fotomuttiplicador, y un ordenador recoge y analiza los datos. Este tipo de secuenciacién automatica de ADN ha permitido el andlisis a gran escala nece- sario para la determinacién de la secuencia completa del genoma humano, ade- mas de las secuencias del genoma de un numero de especies de bacterias, levaduras, Arabidopsis, C. elegans, Drosophila y el rat6n. Expresion de genes clonados ‘Ademas de permit la determinacién de la secuencia de nuclestides de los ge- nes —y pore tanto la secuencia de aminodcidos de las proteinas cocificadas— la clonacién molecular ha proporcionado nuevas posibilidades en la obtencién de grandes cantidades de proteinas para su caracterizacion estructural y fun- cional. Muchas proteinas de interés estan presentes a muy baja concentracion en células eucaristicas y por lo tanto no pueden purificarse en cantidades signi- ficativas por técnicas bioquimicas convencionales. Sin embargo una vez clona- Fluorescencia (Ordenador Figura 3.22 Secuenciacién automatica de ADN. Se realizan cuatro reacciones separadas de ssecuenciacion, cada una con un didesoxi- ‘nucledtido terminador de cadena y un ce- bador marcado con una etiqueta distinta, Los productos se juntan y se someten a electroforesis. A la vez que las hebras de ‘AON migran en el gel, pasan a traves de tun haz de laser que excita e! marcador fluoroscente, La luz emitida es detectada ppor un fotomultiplicador conectado a un ‘ordenador que recoge y analiza los datos.114 @ Seccion| ¢ Introducci Figura 3.23 Promotor bacterano y secuencias Expresin en bacterias de genes clonados. Los vectores de de unién al nbosoma texpresion contienen las secuencias promotoras (pro) que drigen ta tanseripcion del ADN insertado en bacteras y las secuencias BOS _Sio.do conacion hecesatias para la union del ARNm al los ribosomas (secuencias ‘Shine-Delgaro [S0)). Es posible expresar de forma eficiente un ADNe eucaristico insertado junto a estas secuencias, oblenién- dose proteinas eucariéticas a partir de bacterias transformadas. Vector Amp de expresion Insereion del ADNe eucariotico 2 on ADNe insertado Ame Transtormacién de E. coli — 8B | eee ZB / do su gen este problema puede ser solucionado con el desarrollo de vectores que consigan altos niveles de expresién genética en bacterias o células euca- ridticas. Para expresar un gen eucaritico en E, colfel ADNc de interés se clona con un fago 0 un plasmido (denominados vectores de expresién) que contenga las secuencias que dirigen la transcripcién y traduccion del gen insertado en bacte- rias (Fig. 8.23). Los genes insertados se llegan a expresar a niveles tales que la proteina codificada por el gen clonado supone el 10% del total de la produccion de proteina bacteriana. La putificacién posterior de cantidades suficientes de la proteina para estudios bioquimicos o estructurales es una tarea sencilla En ocasiones es mas util expresar un gen clonado en una célula eucaridtica, en lugar de hacerlo en una bacteria. Este modo de expresi6n es importante, por ejemplo, para asegurarse de que las moditicaciones postraduccionales de laCapitulo 3 ¢ Fundamentos de biologia molecular @ 115 proteina (como la adicién de carbohidratos 0 lipidos) se producen de forma normal, La expresién de proteinas en células eucaridticas se consigue insertan- do el gen clonado en un vector (habitualmente derivado de un virus) que induce tna expresién génica de alto nivel. Un sistema utilizado a menudo para expre- sar proteinas en células eucaristicas es la infeccién de células de insecto por un vector baculovirus, que induce altos niveles de expresién de genes insertados ‘enel lugar de una proteina estructural viral. Alternativamente es posible obtener altos niveles de expresién proteinica usando vectores adecuados en células de mamilero, La expresion de genes clonados en levaduras es particularmente tt porque se pueden emplear técnicas genéticas sencillas para identiicar protei nas que interacitian con otras proteinas clonadas 0 con secuencias de ADN especificas. Amplificacién de ADN con ta reaccién en cadena de la polimerasa Laclonacién molecular permite produciry aislar grandes cantidades de un ADN en particular, La reaccién en cadena de la polimerasa (PCR), desarrollada por Kary Mullis en 1988, es un método alternativo para conseguir un gran nuime~ ro de fragmentos de material genético a partir de una unica copia de ADN. Siempre que se conozca parte de la secuencia de la molécula de ADN, la PCR. puede conseguir una gran amplificacion del ADN por medio de reacciones lleva~ das a cabo completamente in vitro, La ADN polimerasa se emplea para replicar repetidamente un segmento determinado de ADN. Ei nimero de secuencias de ADN va incrementando de modo exponencial, dobléndose con cada ciclo de replicacién, por lo que se puede obtener una cantidad sustancial de copias a partir de un pequefio nimero de moldes de ADN iniciales. Por ejemplo, una Unica molécula de ADN sometida a 30 ciclos de amplificacion da lugar a 2"° co- pias (aproximadamente mil millones). Por tanto se pueden amplificar moléculas Unicas de ADN para producir cantidades facilmente detectables de ADN, que pueden aislarse por clonacién molecular o ser analizadas directamente por di- gestion con endonucleasas de restriccién 0 secuenciacion de nucledtidos. El proceso de amplificacién de ADN por PCR se muestra en la Figura 3.24. EI material de partida puede ser bien un fragmento de ADN clonado o una mez- cla de moléculas de ADN —por ejemplo, todo el ADN de células humanas—. A partir de esta mezcla es posible ampiificar una region especrtica de ADN, siem- pre que conozcamos la secuencia de nucledtidos que rodea dicha regién para poder disenar cebadores 0 primers que comiencen la sintesis de ADN en el punto deseado. Los cebadores son habitualmente oligonuclestidos sintetizados quimicamente compuestos de 15 a 20 bases de ADN. Dos iniciadores comien- zan la sintesis de ADN en direcciones opuestas desde hebras opuestas. La reaccién empieza calentando el ADN diana a altas temperaturas (p. @j., 95 C) lo cual separa las hebras. Se desciende la temperatura para que los cebadores se emparejen con sus secuencias complementarias en las hebras del ADN. La ADN polimerasa utiliza los cebadores para sintetizar una nueva hebra comple- mentaria sobre cada hebra de ADN preexistente. En un ciclo de amplificacion se obtienen dos moléculas de ADN nuevas a partir de la original. El proceso se puede repetir muitiples veces, doblandose el numero de moléculas de ADN en cada ciclo de amplificacion. Los multiples ciclos de calentamiento y enfriamiento se llevan a cabo por medio de sistemas térmicos programables denominados termocicladores, Las ADN polimerasas empleadas son enzimas termoestables de bacterias como Thermus aquaticus, que viven en manantiales calientes a temperaturas de unos 75 C. Estas polimerasas son estables incluso a las altas temperaturas emplea- das para separar las hebras del ADN de doble hebra, porlo que la amplificacion de ADN se puede realizar de modo rapido y automatico. Es posible amplificar secuencias de ARN por este método, sintetizando una copia de ADNc por me- dio de la transcriptasa inversa previamente a la amplificacién por PCR116 @ Seccidn | * Introduccion AON inicial 3 Oa efefrfa|rfalalalc! calc Fey fod EN fal EY fad J Fd Ky 8 Calantamiento @ 95°C ‘Separacién de las hebras de ADN rE i Ta 3 el{tfala]c|c{cfals fey 2) 0 fa fad fa Fd 55°C Los cebadores ge unen a las hebras molde del ADN Cebador 1 ULE EEE EEE 20 La polimerasa Tag alarga las hebras de ADN : SGEEGEG. _HURAGUGHEH GEE AER SERIAEREEETRE a ee 7 MEERA EELAAEL | TESTESAOED LOSES AOREGE © EEUTEREEOEEEEETEEESGHEE | TEP EGFR SE L aa etc, 4 pacman f° Bou ocoue fo) fad 9 FS Fd Cad Cod Figura 3.24 ‘Amplificacién del ADN por PCR. La region de ADN que se desea amplificar Si se conoce suficiente de la secuencia de una gen como para especificar esta flanqueada por dos secuencias util’ Ig cebadores, la amplificacién por PCR proporciona un método extremada- Zadas para cebar a sinless de ADN. EI mente potente para obtener canfidades fécimente detectables y manipulables para separarlashebras y después se en. de ADN a partir de un material inicial que puede contener unicamente unas pocas Fa para permitr que los esbadores tha-_copias dela Secuencia de ADN deseada mezcladas con otras muchas moléculas bitualmente oligonuctedtidos de entre 15 de ADN. Por ejemplo, es posible ampliticar secuencias definidas de ADN de va- 4 0 bates) se unan a cade hebra de rigs klobases a partir del ADN gendmico compet, 0 se puede aimpiiicar un aquaiicus (polmerasa Taq) se usa para dterminado ADNe partiendo del ARN celular completo. Después estos segmen- Sintetizar nuevas hebras de ADN empe- _ tos de ADN amplificado pueden ser manipulados o analizados para, por ejemplo, zando en los cebadores, produciéndose —_detectar mutaciones en un gen concreto. La PCR es una potente aportacidn al ta formacién de dos nuevas moléculas de arsenal de técnicas de ADN recombinante. Su potencia se pone particularmente ADN El roe ae pusde repels MH. Ge manifesto enapleacones ales como el dagrésteo de enfermedades Mere una amplificacién det doble de ADN. tarias, los estudios de la expresién génica durante el desarrollo y la medicina forense.Capitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 117 Deteccién de acidos nucleicos y proteinas El desarrollo de la clonacién molecular ha permitido el aislamiento y caracteriza- cién de genes individuales de células eucaridticas. Sin embargo, la comprension de la funcién de los genes en las células precisa del andlisis de la organizacion y expresion intracelular de los genes y las proteinas que codifican, En esta seccion se discuten los procedimientos basicos disponibles para la deteccién de acidos rnucleicos y proteinas. Estas técnicas son importantes en una amplia variedad de estudios, inciuyendo el mapeo de genes y cromosomas, el analisis de la expre- sign génica y la localizacién de proteinas y organelas subcelulares. Estos mismos procedimientos generales se usan para aislar genes especificos para ser clona- dos. Hibridacién de dcidos nucleicos La clave para la deteccién de secuencias especificas de dcidos nucleicos es el apareamiento de bases entre hebras complementarias de ARN o ADN. Someti- das a allas temperaturas (p. ej., 90 a 100°C) las hebras complementarias de AON se separan (desnaturalizaci6n) dando moléculas de cadena simple. Si di- cchas hebras desnaturalizadas de ADN se incuban en condiciones adecuadas (65 C), renaturalizaran para formar moléculas de doble cadena por apareamien- to complementario de bases —un proceso denominado hibridacién de écidos nucleicos—. Pueden hibridar entre si dos hebras de ADN, dos hebras de ARN y una de ADN con otra de ARN. La hibridacién de Acidos nucleicos proporciona un método para detectar se- cuencias de ADN o ARN complementarias a cualquier acido nucleico conocido, ‘como un genoma viral 0 una secuencia de ADN cionada (Fig. 3.25). El ADN clonado se marca radiactivamente, habitualmente siendo sintetizado en presen- cia de nuclestidos radiactivos. Este ADN radiactivo se utiliza como sonda para la hibridacion de secuencias complementarias de ADN o ARN, que se detectan en Virlud de la radioactividad de las moléculas hibridas de doble cadena. La transferencia Southern o Southern biotting (técnica desarrollada por E, M. Southern) se utiliza de modo generalizado para la deteccion de genes especi- ficos en el ADN celular (Fig. 3.26). El ADN problema es digerido por una endonu- cleasa de restriccién, y los fragmentos obtenidos se separan por electroforesis. El gel se adhiere a un filtro de nitrocelulosa o nylon, al cual se transfieren los frag- ‘mentos de ADN, para dar una réplica del gel. El filtro se incuba posteriormente ‘con una sonda marcada, que hibrida con jos fragmentos de ADN que contienen la secuencia complementaria. Los fragmentos se visualizan tras exposicién del fitro ‘a una pelicula radiografica. La transferencia Northern o Northern blotting es una variante de la técnica de transferencia de Southem, utilizada para la deteccién de ARN en vez de ADN. La totalidad del ARN celular es extraida y fraccionada segun su tamatio por elec- troforesis en gel. De igual forma que en la transferencia de Souther, los ARNs se transfieren a un fitro y se detectan por hibridacién con una sonda radiactiva. La transferencia de Northem se usa con frecuencia en estudios sobre expresion ae 2 § ag ‘La proteina mutante bloquea Ja accidn de la proteina normal formando complejos no de su homéloga normal cuando se expresan en la misma célula —por ejemplo, ‘compitiendo por la unién a su molécula diana—. Se pueden introducir por trans- ferencia génica ADNs clonados que codifiquen dichas proteinas (denominadas mutantes inhibitorios dominantes) para estudiar los efectos del bloqueo de genes normales. HERENCIA, GENES Y ADN Genes y cromosomas: Los cromosomas son los portadores de los genes. Genes y enzimas: Un gen determina la secuencia de aminodcidos de una cadena polipeptidica. Identificacién del ADN como material genético: Se identificé el ADN como material genético gracias a experimentos de transtormacion bac- teriana. Estructura de! ADN: €| ADN es una doble hélice en la que se forman enla- ces de hidrégeno entre las purinas y las pirimidinas de cadenas opuestas. Debido al apareamiento especifico de bases —A con T y G con C— las dos cadenas de una molécula de ADN tienen una secuencia complementaria. Replicacién del ADN. E| ADN se replica por un mecanismo semiconservati- vo, en el que las dos cadenas se separan y cada una sirve de modelo para la sintesis de una nueva cadena hija.Capitulo 3 ¢ Fundamentos de biologia molecular @ 133 EXPRESION DE LA INFORMACION GENETICA, Colinearidad entre genes y proteinas: El orden de los nuclestidos en el ADN determina el orden de los aminoacidos en las proteinas, Papel del ARN mensajero: E| ARN mensajero funciona como intermediario en el transporte de la informacin desde el ADN hasta los ribosomas, donde se utiliza como molde en la sintesis de proteinas. Codigo genético: El ARN de transferencia o transferente se utiliza como adapiador entre los aminodcides y el ARNm durante la sintesis proteinica, Cada aminoacido se especifica por un codén que consta de tres nuclestidos. Virus ARN y transcripcién inversa; Se puede sintetizar el ADN a partir de moldes de ARN, como fue descubierto en los retrovirus en primer lugar. ADN RECOMBINANTE Endonucleasas de restriccidn: Las endonucleasas de restriccién cortan secuencias de ADN especificas, obteniéndose tragmentos definidos a partir de moléculas de ADN. Generacion de moléculas de ADN recombinante: Las moléculas de ADN recombinante constan de un fragmento de ADN de interés ligado a un vector que es capaz de replicarse independientemente en una célula huésped apropiada. Vectores para ADN recombinante: Se utilizan diversos vectores para clo- nar fragmentos de ADN de diferentes tamafos. Secuenciacion del ADN: La secuencia de nucleotides de los fragmentos de ADN clonados se puede determinar facilmente. Expresién de los genes clonados: Las proteinas coditicadas porlos genes clonados pueden expresarse a gran escala tanto en bacterias como en célu- las eucariotas. Ampliticacién del ADN mediante la reaccién en cadena de /a polimera- ‘saz la PCR permite la amplificacion y el aislamiento de fragmentos especifi- cos de ADN in vitro. DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS Y PROTEINAS Hibridacion de acidos nucleicos: La hibridacién de Acidos nucleicos per- mite detectar secuencias concretas de ADN o ARN. Deteccién de pequeftas cantidades de ADN o ARN por PCR: La PCR constituye un método sensible para detectar pequefias cantidades de molé- culas especificas de ADN 0 ARN. Anticuerpos como sondas para proteinas: los anticuerpos pueden ser ulili- zados para detectar proteinas espectficas en células 0 extractos celulares. ‘Sondas para la busqueda en bibliotecas de ADN recombinante: Es posi ble detectar tragmentos especiticos de ADN insertado en las bibliotecas de ADN recombinante por medio de la hibridacién de acidos nucleicos o de las sondas de anticuerpos. ‘dogma central, transeripcién, traduccién, ARN mensajero (ARN), [ARN polimerasa, ARN ribosémico (ARNG), ARN de transferencia (AFI) digo genético, traduecién in vitro, codén retrovirus, ranscripeién inversa, transeriptasa inversa clonacién molecular, vector, molécula recombinante, clon molecular, ligasa de |ADN, ADNe- plésmiso, origen de la replicacion, ‘e6smido, cromosoma arifcial PY (PAC), ‘cromosoma artificial bacteriano (BAC), ‘cromosoma artificial de levadura didesoxinucledtido, autorradiogratia vector de expresién, baculovirus reacclén en cadena de la polimerasa (Pcr) hibridacion de deidos nucteicos, son transterencia Southern, transferencia Northern, microarrays de ADN, hibridacion in situ anticuerpo, antigeno, anticuerpo ‘monoclonal, inmunotransterencia, transterencia Western, inmunoprecipitacién, electroforesis on ‘90! de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) biblioteca de ADN recombinante, biblioteca genémica, biblioteca de ADNe134 @ Seccion | ¢ Introduc: mutante sensible ala temperatura transferencia génica, transteccion, ‘expresién transitora, liposoma, lectroporacién, ratén transgénico, ‘célula madre embrionaria (CME), plasmido Th genética inversa, mutagénesis in vitro recombinacién homéloge, acidos jucleicos antisentido, interferencia de ‘ARN, mutante inhibitorio dominante Preguntas 1. Define la traduccién en el contexto de la biologia molecular. 2. {Qué componentes deben estar pre- senles para poder hacer una sintesis prateica in vitro? 3. {Como se descubrié la primera co- rrespondencia de un codon con un ami- noacido? 4. {Qué significa decir que el codigo {genético es degenerado? 5. La adicién 0 delecién de uno 0 mas ‘nuoladtidos en la parte codificante de un gen produce una proteina afuncional, mientras que la adicion o delecién de tres rnucladtidos @ menudo produce una pro- teina con una funcién casi normal. Exp calo. 6. Describe las caracteristicas que debe poseer un cromosoma artificial de levaduras para clonar un fragmento de FUNCION GENETICA EN EUCARIOTAS Anilisis genético en levaduras: La sencilez de su genética y la rapida replicacién de las levaduras facilita la clonacién molecular de cualquier gen que corresponda a una mutacién de la levadura, Transferencia génica en plantas y animales: Los genes clonados pueden ser introducidos en células eucariotas complejas y en organismos multicelu- lares para su andlisis funcional. Mutagénesis de ADN clonado: La mutagénesis in vitro del ADN clonado sirve para estudiar el efecto de las mutaciones en la funcién génica. Introduccién de mutaciones en genes celulares: Pueden introducirse mutaciones en las copias de genes cromosémicos mediante la recombina- cién homéloga con secuencias de ADN clonado. Ademas, se puede blo- quear la expresién o funcién de productos génicos especiticos mediante aci- dos nucleicos antisentido 0 con mutaciones inhibitorias dominantes. ‘ADN humano cortado con EcoRt en le- 0.5 kb, 1 kb y 2.5 kb. Dibuje el mapa de vadura. restricci6n indicando la posicion de los 7. {Por qué resulta tan uti la reaccién puntos de corte de EcoRl y Hind cen cadena de la polimerasa (POR)? 11. Comenzando con ADN de un solo 8. {Qué diferencia existe entre una bi blicteca genémica y una biblioteca de ADNc? espermatozoide, zcuantas copias de una secuencia génica especifica se conse. ‘uiran después de 10 cicios de amplifica: 9. Esta estudiando una enzima en la ‘cual existe un residuo de cisteina activo que esté codificado por el triplete UGU. 2Cémo afectaria a la funcién enzimatica lamutacion de la tercera base por una C? 2Y la mutacion por una A? 10. La digestion de una molécula de ADN de 4 kb con EcoRI produce dos fragmentos de 1 kb y 3 kb cada uno, La ‘digestion de la misma molécula con Aina proporciona fragmentos de 1.5 kb y 2,5 kb. Por titimo, tras la digestion combinada con coRiy Hindi se obtionen fragmentos de cién con PCR? ZY tras 30 ciclos? 12, Ha clonado un ADNe de funcién desconacida. Como determinaria expe: rimentalmente la localizacion subcelular de la proteina que codifica? 13. Esta interesado en identiticar los re siduos de aminodcidos importantes para la actividad calalitica de una enzima, ‘Asumiendo que dispone de un clon del ADNe, qué estrategias experimentales emplearia?Bibliografia Referencias generales Lewin, B, 2000, Genes Vil. Oxford: Oxtordt ‘Unit, Press ‘Weaver, RF. 21K, Molecular Biology. 2nd ed. New York: McGraw-Hill. Herencia, genes y ADN Avery, 0. T, CM. Macleod and M. McCarty. 1984, Studies on the chemical nature ofthe substance ineucing transtor~ mation of pneumococcal types. [Exp Mad. 79: 137-158. [P] Franklin, RE and RG. Gosling, 1953. Mo- Tecular configuration in sodium thymont- cleate. Nataoe 171: 740-74. [P] Komberg, A. 1960, Biologic synthesis of ‘deoxyribonuclefe acid. Seience 131: 150% 1548. IF] Meselson, M. and F, W. Stahl, 1958, The re- Plication of DNA in Escherichia coli. Proc Natl. Acad. Sci, USA A 671-682. [P] Watson, J.D. and F. H. C. Crick, 1993, Gene- tical implications of the structure of deo- syribo nucleic acid, Nature 171: 964-967 el ‘Watson, LD. and P, H.C. Crick. 1953. Mole: ‘lar structure of nucleic acids: A struct re for deoxyribose mucleie acid Nature 171: 737-738. (P] Wilkins, M.H, F,, A. R. Stokes and H.R. Wil son, 1958. Molecular structure of deoxy pentose nucleic acids. Nature 171: 738-740, rh Expresién de la informacion genética Baltimore, D. 1970, RNA-dependent DNA ‘polymerase in virions of RNA tumour ¥ Fuses. Nature 26: 1208-1211. [P Brenner, 5., Jacob and M. Meselson. 1961 An unstable intermediate carrying infor mation from genes to ribosomes for pro- tein synthesis, Notre 190: 876-581. [P] Crick, F H.C. L. Barnett, S. Brenner and R. J Wats-Tobin. 161. General nature ofthe genetic code. for proteins. Nature 192: Tha7- 1282. [P] Ingram, V. M. 1957. Gene mutations in hu- ‘man hemoglobin: The chemical difference betiveen normal and sickle cell hemoglo- bin. Nature IS 326-328. [P] Nirenberg, M. and P. Leder. 1964, RNA co- dewords and protein synthesis. Science 145, 1399-1407. [P] Nirenberg, M. W. and J. H. Matthael, 1961 The dependence of cell-free protein synthesis in Ecol upon naturally occu rring or synthetic polyribonucleotides Proc. Natl, Acad, Sci. USA 47: 1588-1602, ry ‘Temin, HM. and S, Mizutani, 1970, RNA. dependent DNA polymerase virions of Rous sarcoma virus, Notte 226: 1211 2213. (F] Yanoisky, C. B.C. Carlton, . R. Guest, D. R. elinski and U, Henning, Wed. On the co- linearity of gene structure and protein structure. Prix. Null. Ant, Sci. USA SI 266272. 1P] Capitulo 3 ¢ Fundamentos de biologia molecular @ 135 ADN recombinante Ausubel, P.M, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, JG, Seiclman, J. A. Smith and K, Struhl. eds. 1989. Current Protocns in ‘Mofectdar Biology. New York: Greene Pu: blishing and Wiley Interscience. IR] Burke, D. T,, G. E. Carle and M. V. Olson. 1987. Cloning of large segments of exoge- rows DNA into yeast by means of artificial Chromosome vectors. Sconce 236: 6-812. Wh Cohen, N., A.C. Y. Chang, H. W. Boyer ‘and R. B. Heling, 1973. Construction of biologically functional bacterial plasmids inciro, Proc, Natl. Acad, Se. USA 70: 3240- 3244. [P] Nathan, D- and H. ©. Smith. 1975. Restric- tion endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules. An Feo, Bichem 44: 273-298. [R] Soiki, R. K., D. H. Gelfand, 5. Stoffel, 8. | ‘Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mu llisand H. A. Erlich, 1988, Primersirected ‘enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA. polymerase. Scene 239: 487-491. [PL ‘Sambrook, J and D. Russell. 2001, Molecular Clonng? A Laboratory Manuel. 3rd el Plainview, N.Y. Cold Spring Harbor La- boratory Press Sanger, F, 8. Nicklen and A. R. Coulson 1977. DNA sequencing with chain-term hating inhibitors, Proc. Natl. Aon. Sct USA 7A: 5463-5467. [P] Deteccidn de dcidos nucleicos y proteinas Ausubel, F. M, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, JG. Seiciman, J. A. Smith and K, Strub. eds. 1988. Current Protects in Molecular Biology. New York: Greene Pu: blishing and Wiley Interscience. Benton, W. D. and K. W. Davis. 1977, Soree ning /gt recombinant clones by hybridiza- tion to single plaques i situ. Science 196: 1s-182. [PI Broome, 5. and W. Gilbert. 1978. Immunolo- ‘gical Screening method to detect specific translation products. Proc. Natl, Acad. Set USA 75: 2746-2749. [P] Brown, P.O. and D. Botstein, 1999, Eyplo- Ting the new world of the genome with DNA microarrays, Nature Genetics 21: 33- a7.1R) Caruthers, M.H. 1985, Gene synthesis ma- ‘chines: DNA chemistry and its uses, Siw ce 230; 281-285. [RI Gerhold, D., T. Rushmore and C. T. Caskey. 19989, DNA chips: promising toys have be come powerful tools. Treks Biochem. Sc 24: 168-173. [R] Ghunstein, Mand D.S, Hogness, 1925. Co: lony hybridization: A method for the iso: lation of cloned DNAs that contain a spe Gifle gene. Proc. Natl Aenl. Sci. USA 72 3961-3965. [P| Harlow, E. and D, Lane, 1999, Using Antito- dies A Laboratory Maral. Cold Spring Harboe, N.Y. Cold Spring Harbor Labora tory Press Kohler, Gand C. Milstein, 1975. Continuous ‘cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495 497, (P] Maniatis, T, Ro C. Hardison, B. Lacy, J Lauer, C. O'Connell, D. Quon, G. K, Sim and A. Fistratiadis. 1978, The isolation of Structural yenes from libraries of eucaryo: tic DNA. Cell 15: 687-701. [P] Sambrook, and D. Russel. 2001. Molecular (Cloning: A. Laboratory Maral. 3rd Plainview, N.Y Cold Spring Harbor La boratory Press Schildkraut, C. L., J. Marmur and P. Doty 1861, The formation of hybrid DNA mole- cles, and their use in stidies of DNA ho- mologies, [, Mo. Biol, 3: 595-617. IP] Southern, E. M. 1975, Detection of specific Sequences among DNA fragments separa ted by gel electrophoresis. Ml Bil 9 503-517. [P] Funcién génica en eucariotas Botstein, D, and D, Shortle. 1985. Strategies ‘and applications of in vitro mutagenesis, Science 229: 1195-1201. [R] Bronson, §. K, and O. Smithies. 1994, Alte- ing mice by homologous recombination Using embryonic stem cells.) Bil. Chem. Dé: 27155-27158. [8] Capecchi, M.R. 1988, Altering the genome by homologous recombination, "Science 2H 1288-1292. [R] Gasser, C. 8. and R.T. Fraley. 1989, Genet ‘ally engineering plants for crop improve- iment Sciice 244" 1295-1290, [R] Gordon, |.W.,G. A Scangos, DJ. Plotkin, ‘A, Barbosa and F. H. Rule. 1980, Gene: tic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl. Acad. Sci, USA 77: 7380-7384. [P] Herskowitz, I. 1987. Functional inactivation ‘of genes by dominant negative mutations Nature 329: 219.222. [RI Horsch, RB, J. E. Fry, N. L. Hoffmann, D. Fichholtz, & G. Rogers and RT. Fraley. 1985. A simple and general method for transferring Renes into plants Scene 227: 1229-1231. [P) Hutvagner, Gand P, D. Zamore. 2002. RNAI nature abhors a double-strand Carr, Opin, Genet, Dev. 12: 225-232. [R] ant, J-G. and H. Weintraub 1984, Inhibi tion of thymidine kinase gene expression by antisense RNA: A molecular approach to genetic analysis. Cll 1007-1015, [P] Jaenisch, K. 1968, Transgenic animals, Scie ce 240; 1468-1474. [R] Joyner, AL, ed. 1993, Gene Target Practical Approach. Oxford, nglond: IRL Press, Kuhn, R, F. Schwenk, M. Aguet and K. Ra- jewsky, 1995, Inducible gene targeting in mice. Science 269: 1427-1429. [P] Maliga,P.,D. FE. Klessig, AR. Cashmore, W. ‘Gruissem and JE. Vamer, eds. 1984. Me Iiods in Plant Molecular Biology: A. Labor tory Conse Manual, Psigwiew, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Palmiter, Re D. and R. 1; Brinster, 1986.136 @ Seccidn | ¢ introduc jerm-line transformation of mice. Art. Rev. Genet, 20: 465-499, [R] Robertson, E, A. Bradley, M. Kuehn and M. Evans, 1986, Germline transmission of ge nes introduced into cultured plaripoten- tial cells by retroviral vector. Nature 323 45-448. [P] Seivy, J. M. 1999. Gene targeting and soma- tic cell genetics: A rebisth oF a coming, of age? Tres Genet. 15: 88-90. 18) Sharp, P. A. 2001. RNA interference 2001 Genes Dev. 15: 485-490. [R] Smith, M. 1985, ft offro mutagenesis. Ann Ret. Gens! 19: 423-462. [R] Strahl, K. 1983. The new yenst genetics. Ni re 305; 391-397. [R] Thomas, K. R. and M. R. Capecchi, 1987. wdirected mutagenesis by gene targe Fing.in mouse embryo-derived stem cells Cell 51: 503512, [P] Wagner, R. W. 1994. Gene inhibition using antisense oligonucleotides, Nature 372 333-335. 18) Wigler, M, R. Sweet, G. K. Sim, B. Wold, A Pollicer, F- Lacy, T Maniatis, 5 Silverstein and Ro Axel. 1979. Transformation of ‘mammalian cells with genes from prokae yotes and eukaryotes. Coll 16: 777-785, [PSeccién I I Flujo de la informacion genética 4 Organizacion y secuenciacion de los genomas celulares 5 Replicacién, mantenimiento, y reorganizacion del ADN genémico 6 Sintesis y maduracién del ARN 7 Sintesis de proteinas, procesamiento y regulacionCComplelidad de los genomas de eucariotas 139 Cromosomas y cromatina 150 Secuencias de los genomas compietos 158 Exrenmmento oLave Descubsimiento de los intrones 142 Exeenimento c.ave Elgenomahumano 170 (OMO MATERIAL GENETICO, EL ADN PROPORCIONA UN PATRON que dirige todas las actividades celulares y determina el plan de desarrollo de los organis- ‘mos multicelulares. Por lo tanto, entender la estructura genética y su fun- cién resulta fundamental para obtener una vision de la biologia molecular de las Células. El desarrollo de la clonacion de genes ha supuesto un gran paso hacia estos objetivos, permitiendo a los cientificos diseccionar genomas eucariotas complejos y probar las funciones de los genes eucaridticos. Los continuados avances en la tecnologia recombinante de! ADN nos conducen hasta el inquie~ tante momento de determinar las secuencias de genomas compietos, acercan- donos a descifrar las bases genéticas del comportamiento celular Tal y como se repasé en el Capitulo 3, las aplicaciones iniciales del ADN recombinante estuvieron dirigidas al aislamiento y andlisis de genes individua- les. Recientemente, se ha conseguido secuenciar genomas enteros —no s6lo en bacterias y levaduras, sino también en los complejos genomas de plantas y animales, incluyendo a humanos—. En la actualidad se conocen secuencias génicas completas de diversas bacterias, levaduras y genomas animales proto- tipicos —los del nematodo C. elegans y el de la mosca de la fruta Drosophila ‘melanogaster—. También se han producidos progresos importantes en la de- terminacion de la secuencia génica humana, cuyo final se espera en un futuro proximo. Las secuencias de estos genomas celulares completos aportan una Tica fuente de informacién, incluyendo la identiticacion de muchos genes desco- nocidos hasta ahora. El resultado de estos proyectos de secuenciacién de ge- nomas se espera que estimulen muchos afios de investigacién en la biologia molecular y celular, y tener un profundo impacto sobre nuestra comprensién y tratamiento de enfermedades humanas. Complejidad de los genomas de eucariotas Los genomas de la mayoria de los eucariotas son grandes y mas complejos que los de procariotas (Fig. 4.1). El gran tamafo de los genomas eucariotas no re- sulta sorprendente, puesto que uno debe esperar encontrar mas genes en orga: nismos que son mas complejos. Sin embargo, el tamano del genoma de mu- chos eucariotas no parece estar relacionado con la complejidad genética. Por ejemplo, los genomas de las salamandras y lirios contienen diez veces mas cantidad de ADN que la encontrada en el genoma humano, y estos organismos no son diez veces mas complejos que los humanos. 139140 @ Seccidn Il ¢ Flujo de la informacién genética Figura 4.1 Tamano del genoma. La variedad de ta- ‘mafios de los genomas de los grupos re- presentativos de organismos se muestra fen una escala logaritmica : ey umanos | 108 108 107 10 10° 10% 10" 10% ares de bases por genoma haploide Esta aparente paradoja se resolvié por el descubrimiento de que los geno- mas de la mayoria de las células eucariotas contienen no solo genes funciona~ les sino también grandes cantidades de secuencias de ADN que no codifican proteinas. La diferencia de tamafios entre los genomas de la salamandra y del hombre refleja grandes cantidades de ADN no codificante, en lugar de mas genes, en el genoma de la salamandra. La presencia de grandes cantidades deCapitulo 4 * Organizacién y secuenciacion de los genomas celulares @ 141 secuencias no codificantes es una propiedad universal de los genomas de los eucariotas complejos. Por tanto, el hecho de que el genoma humano es mil ‘veces mayor en comparacidn con el de E. colino solo se debe a un gran numero de genes. Se cree que el genoma humano contiene aproximadamente 100.000 genes-alrededor de 25 veces mas de los que contiene E. coli. Gran parte de la ‘complejidad de los eucariotas humanos resulta de la abundancia de varios tipos diferentes de secuencias no codificantes, que constituyen la mayoria del ADN de las células eucariotas superiores. Intrones y exones En términos moleculares, un gen puede definirse como un segmento de ADN que se expresa para dar un producto funcional, que puede ser un ARN (p. €}., ribosémico y transferente) o un polipéptido. Algunos ADN no codificantes en eucariotas representan largas secuencias de ADN que residen entre genes (se- cuencias espaciadoras). Sin embargo, también se encuentran grandes canti- dades de ADN no codificante dentro de la mayoria de los genes eucariotas. Tales genes presentan una estructura dividida en la que los segmentos de se- cuencia codificante (\lamados exones) estan separados por secuencias no co- dificantes (secuencias intermedias, 0 intrones) (Fig. 4.2). El gen completo se transcribe para producir una molécula larga de ARN en la que los intrones se han retirado mediante splicing 0 empalmes, por lo que solo los exones se en- cuentran incluidos en el ARNM. Aunque la mayoria no tienen una funcién cono- cida, representan una fraccién sustancial de ADN en los genomas de los euca~ riotas superiores. Los intrones se descubrieron por primera vez en 1977, en los laboratorios de Phillip Sharp y Richard Roberts independientemente, durante el estudio de la replicacién de los adenovirus en cultivos de células humanas. Los adenovirus resultan ser un modelo util para el estudio de la expresién génica, debido a que fe! genoma viral ocupa alrededor de 3,5 x 10* pares de bases y porque los 'ARNm de los adenovirus se producen a niveles muy altos en las céiulas infecta- das. Uno de los métodos para describir los ARNm de los adenovirus consistio en determinar las localizaciones de los correspondientes genes virales median- te el examen de los hibridos de ARN-ADN en el microscopio electronico. Debido a que los hibridos de ARN-ADN se distinguen de los ADN de una sola hebra, es posible determinar las posiciones de los transcritos de ARN en una molécula de ADN. Sorprendentemente, tales experimentos revelaron que los ARNm de los adenovirus no hibridan con una sola regién del ADN viral (Fig. 4.3). En su lugar, tuna sola molécula de ARNm hibrida con diversas regiones separadas del geno- ma viral. Por tanto, el ARNm del adenovirus no corresponde a un transcrito ininterrumpido de la hebra molde de ADN; sino que el ARNm se compone de bloques distintos de secuencias que proceden de diferentes partes del ADN viral. Se demostré que esto se debia al splicing o empalme del ARN, que se discutird en detalle en el Capitulo 6. ADN cromosémico Secuencia espaciadora _Inlién 1 Intron 2 Seovencia espaciadora 5 = SS ee mae Exén 1 Exon2 ein ‘igure ° at Estructura de los genes eucariotas. La Transeripelon mmayoria de los genes eucariolas contienen segmentos de secuencias codiicantes ARN rans gp yp 9 {exones) interumpidas por secuencias no primario codiicadoras (intfones). Los exones e in- Empalme o spy trones se Wanseriben para produc un intrones se desprenden mediante splicing ARNm 5 ‘© empaime para formar el ARNm maduro.142_©@ Seccién Il * Flujo de la informacién genética Experimento clave Descubrimiento de los intrones ‘Splicing o empaime de segmentos en el extremo 5’ del ARNm tardio del adenovirus 2 Susan M. Berget, Claire Moore, y Phillip A. Sharp Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, Proceedings ofthe National Academy of Science USA, Volume 74, 1997, pigs. 3.1713.175. Contexto Anterior a la clonacién molecular, ‘se sabia poco sobre la sintesis del ‘ARNm en las oélulas eucariotas, ‘Sin embargo, estaba claro que el proceso era mucho mas complejo fen eucariotas que en bacterias. La sintesis de ARNm de eucariotas parece necesitar no solo la transeripcién, sino también reacciones de procesamiento que modifican la estructura de los transcritos primarios. Es mas, los ARNm eucariotas parocian sinteizarse como transeritos, primarios largos, localizados en el cleo, que luego son escindidos para dar lugar a moléculas de ‘ARNm mucho mas cortas que se exportan al citoplasma. Estos pasos del procesamiento ‘se asumieron como los responsables de la eiminacién de las secuencias de los extremos 5’ y 8'de los transcritos primarios. En este modelo, los ARNm embebidos dentro de los transeritos primarios laigos estarian codficados por ssecuencias de ADN no interrumpidas. Esta visién de los ARNm eucariotas cambio radicalmente cuando se descubrid el splicing o empaime, de forma independiente por Berget, Moore, y Sharp, y por Louise Chow, Richard Gelinas, Tom Broker, y Richard Roberts (Una organizacion increible de secuencia en los extremos 5’ del ARN mensajero del adenovirus 2, Cell 12: 1-8, 1977). Experimentos ‘Ambos grupos de investigacion que descubrieron el splicing o empalme utilizaron el adenovirus 2 para investigar la sintesis del ARNm en las células humanas. La mayor ventaja del virus es que proporciona un modelo que resulta mucho mas simple que ia célula huésped. El ADN viral se puede aislar directamente de las Patticulas virales, los ARNm Codificadores de las esiructuras de proteinas virales estan presentes fen tal cantidad que pueden ser utficados directamente de las Células infectadas. Berget, Moore, y Sharp centraron sus experimentos en un ARN abundante que coditica un polipéptido viral estructural Conocido como el hexon. Para mapear el ARNm del hexon en el genoma viral, se hibridé ARNm puro con ADN de adenovirus, y las moléculas hibridas se examinaron por microscopia éptica. Como se ‘esperaba, el «cuerpo» del ARNM del hoxon formé hibridos con fragmentos de restriccién del ADN del adenovirus que previamente se habia mostrado que contenian el gen del hexon. Sorprendentemente, sin embargo, secuencias en el ‘extrema 5° del ARNm de! hexon fallaron en la hibridacién con las secuencias de ADN adyacentes a aquellas codificadoras del «cuerpo» del ‘mensaje, sugiriendo que el extremo 5" del ARNm habia surgido de secuencias localizadas en alguna otra parte del genoma viral. Esta posibilidad se probd mediante la hibridacién del ARNm del exon con un fragmento de restriccién situado upstream del gen del hexon. Los hibridos ARNm-ADN formados en este ‘experimento desplegaron una compleja estructura en forma de lazo (véase Figura). El «cuerpo» del ARNm ford una larga regién hibrida con las secuencias de ADN del hexon previamente identificadas. Notablemente, el extremo 5° del ARNm del hexon hibridé con tres regiones upstream cortas del ADN, que estaban separadas entre ellas y del «cuerpo» del mensajero por largos lazos de ADN de una sola hebra. Las secuencias en el extremo 5° del ARNm del hexon por tanto parecian estar transcritas por tres regiones separadas del genoma viral, que fueron empaimadas al «cuerpo» del ARNm durante el procesamiento de un transcrito primario largo. Impacto El descubrimiento del splicing o fempaime en ol ARNm del adenovirus estuvo seguido por experimentos similares con ARNm celulares, demostrando que los genes eucariotas ‘tenian una estructura no esperada. En ‘Microgratiaelectrinica y dibujo dol ARN del hexén hibidado con at ADN del adenovirus. Los laos de haba Unica designados con A, B, y C cortesponden a intrones,Capitulo 4 * Organizacién y secuenciacién de los genomas celulares @ 143 Descubrimiento de los intrones (continuacién) lugar de ser continuas, sus secuencias codificantes estaban interrumpidas por intrones, que se eliminaban de los transcrtos primarios mediante empaime. ‘Anora se sabe que los intrones representan la mayoria del ADN de los genomas eucariotas, y su papel en la evolucién y en la regulacion de la expresién genica continua formando parte de una de las areas de investigacion mas activa. El descubrimiento del splicing 0 ‘empaime también estimuld el interés por el mecanismo de esta reaccién inesperada en e! procesamiento det ARN. Como se discute en el Capitulo 6, estos estudios no solo han arrojado luz sobre nuevos mecanismos de regulacién génica; han revelado también nuevas actividades cataliticas del ARN y proporcionado evidencia critica para sustentar la hip6tesis de que la evolucion mas temprana estuvo basada en la autorreplicacion de las moléculas de ARN. La inesperada estructura del ARNm de los adenovirus ha tenido por tanto un impacto esencial en diversas areas de la biologia celular y molecular. Gen del hexon “ Exones — ADN del adenovirus (@) ADN monocate Exon 1 Ineon 4 Invones Extromo 5’ dol ARN Intén 2 cg 4 Philp Sharp Richard Roberts Figura 4.3 Identificacién de intrones en el ARNm del adenovirus. (A) El gen couificante del hoxon adenovirus (una proteina es: ‘ructural principal de la particula viral) se ‘compone de cuatro exones, interrumpidos. Por tres intrones. (B) Este dibujo ilustra a Luna microgratia electronica de un hibrido hipotetico entre ARN det hexon y una porcicn del ADN del adenovirus. Los exo: hes seven como regiones hibridas de ARIN-ADN, que estan separadas por lazos de ADN monocatenario correspondientes a los intrones. Intten 3 Hibrido ARN-ADN, Poco después del descubrimiento de los intrones en los adenovirus, se hi- cieron observaciones similares en genes clonados de células eucariotas. Por ejemplo, el andlisis por microscopio electrénico de los hibridos de ARN-ADN y de las secuencias de nuclestidos siguientes de los ADN y ADNcclonados indicd que la regién codificante del gen de la {/-globina del ratén {que codifica la subu- nidad /! de la hemogiobina) esta interrumpida por dos intrones que se retiran del144 @ Seccidn Il * Flujo de la informacién genética Figura 4.4 Gen de la f globina en el ratén. Este igen contiene dos intrones, que dividen a la region codificadora en tres exones. El ‘exon 1 codifica a los aminodcidos del 1 al 30, 61 exon 2 codifica aminoacidos del 31 al 104, y el exon 3 codifica a fos aminaci- {dos del 105 al 146. Los exones 1 y 3 tam- bién contienen regiones no traducidas (UTR) en los extremos 5' y 3° del ARN, respectivamente, Exon Intron Exon2 Intron 2 Exon 3 Transeripeién Empaime Exon 1 Exén2 Exon 3 ABN 9 a cE | fcece UI Protein TT 1 30 108146 ARNm mediante empalme o splicing (Fig. 4.4). La estructura intrén-exén de muchos genes eucariotas es complicada, siendo la cantidad de ADN en las secuencias de los intrones con frecuencia mas grandes que la de los exones. La secuencia del genoma humano indica que un gen humano promedio contie- ne aproximadamente 9 exones, interrumpidos por 8 intrones y distribuido a lo largo de aproximadamente 30.000 pares de bases (30 kilobases, o kb) de ADN genémico. Generalmente los exones suman en toro a 2 kb, de modo que mas del 90% de un gen humano promedio consiste en intrones. Los intrones estan presentes en la mayoria de los gones de los eucariotas ‘complejos, aunque no son universales. Casi todos los genes de las histonas, por ejemplo, carecen de intrones, por lo que claramente los intrones no son necesarios para la funcién del gen en las células eucariotas. Ademas, no se ‘encuentran intrones en la mayoria de los genes de los eucariotas simples, como las levaduras. Por el contrario, los intrones estan presentes en raros genes pro- cariotas. La presencia o ausencia de intrones no es por tanto una distincion absoluta entre los genes procariotas y eucariotas, aunque los intrones prevalez~ can en los eucariotas superiores (plantas y animales), donde representan una cantidad sustancial del ADN genémico total La mayoria de los intrones no especifican la sintesis de un producto celular, aunque algunos si codifican ARNs 0 proteinas funcionales. Sin embargo, los intrones juegan papeles importantes en el control de la expresién génica. Por ‘ejemplo, la presencia de intrones permite que los exones de un gen se unan en distintas combinaciones, resultando en la sintesis de distintas proteinas a partir del mismo gen. Este proceso, denominado procesamiento alternativo 0 spli- cing (Figura 4.5), ocurre con frecuencia en los genes de eucariotas complejos, y se cree muy importante para la exiensién del repertorio funcional de los '30,000-40.000 genes del genoma humano. ‘Ademas se cree que los intrones han jugado un papel importante en la evo- luci6n, facilitando la recombinacién entre regiones codificantes de proteina (exones) de distintos genes —un proceso conocido como arrastre de exones. Los exones con frecuencia codifican dominios de proteinas funcionales, de modo que la recombinacién entre intrones de diferentes genes daria lugar a nuevos genes con nuevas combinaciones de secuencias codificantes de protei- nas. Tal y como se predijo en la hipdtesis, los estudios de secuenciacién del ‘ADN han demostrado que algunos genes son quimeras de exones derivados de ‘otros varios genes, y proporcionan evidencia directa de que se pueden formar nuevos genes mediante la recombinacién de secuencias de intrones. El origen evolutivo de los intrones sigue siendo un tema controvertido. Una posibilidad es que los intrones estuviesen presentes en estadios tempranos de la evolucién, antes de la divergencia de las células procariotas y eucariotas. De acuerdo con esta hipotesis, los intrones desempefiarian un papel importante en la unién inicial entre las secuencias codificadoras de proteinas en los antepasa- dos de las células actuales. Los intrones se fueron perdiendo paulatinamenteCapitulo 4 * Organizacién y secuenciacién de los genomas celulares @ 145 covcoresno 3 =} — =} $f $f —— | Transcripesén ARN transcrit primatio 5 3 1 2 3 4 5 6 Procesamiento allemativo ARN —_—_—— 1 2 4 5 6 + 3 5 6 1 3 4 5 6 | Traduecion | Traduccién { Traduccién Proteina 1 Proteina 2 Proteina 3 Figura 4.5 en la mayoria de los genes procariotas y en los eucariotas simples (p. ej. leva- Procesamiento alternativo. £1 gen ilus- Gluras) como respuesta a la seleccién evolutiva de ia répida replicacién, fo que ado, contene seis exons, separadce condujo al esbozo de los genomas de estos organismos. Sin embargo, puesto _hativo permite que estos exones se unan {ue la répida division celular no es una ventaja para los eucariotas superiores, on diferentes combinaciones. resultando los intrones se han retenido en sus genomas. Alternativamente, los introneshan Na formacién de tres ARNm y proteinas podido surgir mas tarde en la evolucién como resultado de la insercién de se Gferentes a partir deun solotranscrto pre cuencias de ADN en genes que se habian formado como secuencias codifica- doras de proteinas continuas. El arrastre de exones entonces hubiera desem- pefiado un papel importante en la evolucién de los genes en los eucariotas ‘superiores pero no hubiera participado en la unin inicial de las secuencias co- dificadoras de proteinas antes de la divergencia evolutiva de las células proca- riotas y eucariotas. Secuencias de ADN repetitivas Los intrones forman una contribucién sustancial al gran tamafo de los genomas de eucariotas superiores. En humanos, por ejemplo, los intrones forman aproxi- madamente e! 25% del ADN gendmico total. Sin embargo, una porcién incluso mayor del genoma de los eucariotas complejos consiste en secuencias alta- mente repetidas de ADN no codificante. Estas secuencias, algunas veces pre- senites en cientos de miles de copias por genoma, fueron demostradas por pri- mera vez por Roy Britten y David Kohne mientras estudiaban los valores de reasociacién de fragmentos desnaturalizados de ADN celular (Fig. 4.6). Las hebras desnaturalizadas de ADN hibridan unas con otras (se reasocian), vol viendo a formar moléculas de dobie hebra (véase Fig. 3.25). Puesto que la rea- sociacion de ADN es una reaccién bimolecular (dos hebras separadas de ADN desnaturalizado deben colisionar entre elias para hibridar), la velocidad de rea- sociacién depende de la concentracién de hebras de ADN. Cuando se desnatu- ralizaron fragmentos de ADN de E. coliy se permitié que hibridaran entre ellos, todo el ADN se reasocié a la misma velocidad, tal y como se esperaria si cada secuencia de ADN estuviera representada una sola vez por genoma. Sin em- bargo, la reasociacion de fragmentos de ADN extraidos de células de mami- feros mostraron un patron muy diferente. Aproximadamente el 50% de los fragmentos de ADN se reasocié a una velocidad calculada para secuencias presentes una sola vez por genoma, pero el resto se reasocié mucho mas rapi-146 @ Seccion Il ¢ Flujo de la informacién genética Figura 4.6 Identificacién de secuencias repetitivas mediante rea- sociacién del ADN. La cinética de la reasociacién de los fragmentos de ADN de . coli y bovino se ilustran como, tuna funcién de Cyt, que es la concentracion inicial de ADN. ‘multiplicada por el tiempo de incubacién. El ADN de E. coli se reasocia en una proporcién uniforme, de acuerdo con {que cada fragmento se representa una vez en un genoma de 4,7 x 10° pares de bases. Por el contrario, los fragmen- tos de ADN bovino muestran dos pasos diferentes en su reasociacion, Alrededor del 60% de los fragmentos (las secuencias no repetitivas) se reasocia mas lentamente ‘que e! ADN de E- col, tal y como so esperaba para las, ‘secuencias representadas como tnicas copias en el geno- ma bovino (3 x 10? pares de bases). Sin embargo, el otro 40% de los fragmentos del ADN bovino (las secuencias Tepetitivas) se reasocia mas rapidamente que el ADN de E. col, indicando la presencia de multiples copias de estas ssecuencias. Fraccién de ADN monocatenaro restante 10? 10% 107 Secuencias bovinas repettvas + 10 102108 t08 Gat (Mx sec) do de lo esperado. La interpretacién de estos resultados fue que algunas se- cuencias estaban presentes en multiples copias y por tanto reasooiaban mas répidamente que aquellas secuencias que estaban representadas una sola vez por genoma. En particular, estos experimentos indicaron que aproximadamente 1 50% del ADN de mamiferos consiste en secuencias altamente repetitivas, algunas de las cuales se repiten de 10° a 10° veces. Un mayor analisis, culminando en la secuenciacion de genomas completos, ha identificado varios tipos de estas secuencias altamente repetidas (Tabla 4.1) Una clase (denominada repeticiones de secuencias sencillas) consiste en re- peliciones en tandem de hasta miles de copias de secuencias cortas, que varian desde 1 hasta 500 nuclestidos. Por ejemplo, un tipo de repeticion de secuencia sencilla en Drosophila consiste en repeticiones en tandem de una unidad de siete nuclestidos ACAAACT. Gracias a su composicién de bases caracteristica, mu- ‘chos ADN de secuencia sencilla pueden ser separados del resto de ADN genomi- ‘co mediante la centrifugacién de equilibrio en gradientes de densidad de CsCl. La densidad del ADN esta determinada por su composicién de bases, donde las secuencias ricas en pares AT son menos densas que las secuensias ricas en pares GC. Asi, un ADN de secuencia sencilla rico en AT bandea en un gradiente de CsCl a una densidad inferior que el resto del ADN genémico de Drosophila (Fig. 4.7). Ya que estas secuencias repetidas de ADN bandean como «satélites» separados de la banda principal de ADN, a menudo se denominan ADNs satéli- te. Estas secuencias esta repetidas millones de veces por genoma, constituyen: do aproximadamente el 10% del ADN de la mayoria de los eucariotas superiores. Los ADN de secuencia sencilla no se transoriben y no proporcionan informacion genética funcional. Algunos, sin embargo, representan papeles importantes en la estructura cromosémica, como se estudia en la siguiente seccién de este capitulo. Tipo de secuencia ‘Mimero de copias _‘Fraccién del genoma ‘Repetciones de secuencia sencilla >1.000.000 10% Rotroransposones LINES 850.000 21% ‘INES 1.500.000 13% Elomontos de tipo retrovirus 450.000 Be “Transposones de ADN 300.000 ~ 3% * conned repeticions de secvecia snc nel gorera harane apart ea taccén de hetrceremaina resonCapitulo 4 * Organizacioén y secuenciacién de los genomas celulares @ 147 Otras secuencias repetitivas de ADN se encuentran dispersas a través del ‘genoma en lugar de agrupadas en repeticiones en tandem. Estos elementos repetitivos dispersos son un contribuyente muy importante para el tamafio del ‘genoma, constituyendo aproximadamente el 45% del ADN genémico humano. Las dos clases mas predominantes de estas secuencias se denominan SINES (shor interspersed elements) y LINEs (iong interspersed elements). Los SINES poseen una longitud de 100 a 300 pares de bases. Unas 1,5 millones de estas secuencias se encuentran dispersadas a través de! genoma, constituyendo aproximadamente un 13% del ADN humano total. Aunque los SINEs se trans- criben a ARN, no codifican proteinas y su funcién es desconocida. Los LINES humanos principales poseen una longitud de 6-8 kb, aunque muchas de las secuencias repetidas derivadas de LINEs son mds cortas, con un tamafio apro- ximado de 1 kb. Existen aproximadamente 850.000 repeticiones de secuencias LINEs en el genoma, constituyendo el 21% del ADN humano. Los LINES se transcriben y al menos algunos de ellos codifican para proteinas, pero al igual ‘que los SINEs, no poseen una funcién conocida en la fisiologia celular Tanto las secuencias SINEs como LINEs son ejemplos de elementos trans- ponibles, que son capaces de moverse a puntos distintos en el ADN genémico. Tal y como se describe en detalle en el Capitulo 5, tanto las secuencias SINEs como LINEs son retrotransposones, lo que significa que su transposicion esta mediada por la transcripcion inversa (Fig. 4.8).Un ARN copia de una secuencia SINE 0 LINE es convertido en ADN por la transcriptasa inversa en el interior celular, y la nueva copia de ADN se integra en un nuevo punto del genoma. Una tercera clase de secuencias repetitivas dispersas, que se asemejan fuertemen- tea los retrovirus se denominan elementos semejantes a retrovirus, también se mueven dentro del genoma por transcripcién inversa. Los elementos seme- jantos a retrovirus humanos varian desde aproximadamente 2-10 kb de longi- tud. Existen aproximadamente 450.000 elementos semejantes a retrovirus en el genoma humano, lo que constituye aproximadamente un 8% de ADN humano. Por el contrario, a cuarta clase de elementos repetitivos dispersos (transposo- nes de ADN) se mueven por el genoma siendo copiados y reinsertados como secuencias de ADN, en lugar de moverse mediante transcripcién inversa, En el genoma humano existen unas 800.000 copias de transposones de ADN, varian- do desde 80 a 3.000 pares de bases de longitud y constituyendo aproximada- mente un 3% del ADN humano. Asi, practicamente la mitad del genoma humiano consiste en elementos repe- titivs dispersos que se han replicado y movido a través del genoma a través de intermediarios de ARN 0 ADN. Merece la pena notar que la gran mayoria de Retrotransposén | “Teneo inte | Iniegracén on Retrotransposén de ADN 1 ADN eromasémico Retrotransposon Punto ceromesémico 1701 (anda principal) Cantidad de AON diem | 1.687 1,872 TUT See Gradiente de densidad (glcm*) Figura 4.7 ‘ADN satélite. La centifugacién de equil- briodel ADN de Drosophila en un gracien- te de CsCl separa los ADN satélites (de- signados IV) con densidades en el gfaciente (en g/cm’) de 1,672, 1,687, y 4,705 de la banda principal del ADN gond- rmico (con una densidad en el gradiente de 4,701), wy 4,705 Figura 4.8 Movimiento de retrotransposones Un retrotransposén presente en un punto del ADN cromosémico se transcribe en ARN, y a continuacién es convertido de nuevo en ADN mediante transcripcién in- versa. Elretrotransposon de ADN puede a continuacién integrarse en un nuevo pun- {0 cromosémico.148 @ Seccidn Il © Flujo de la informacion genética Figura 4.9 Familias del gen de la globina. Los miembros de las familias de los genes hu- manos de la 2 y j? globina se agrupan en. los eromosomas 18 y 11, respectivamen: te, Cada familia contiene genes que se ‘expresan especificamente en los tejidos ‘embrionario, fetal, y adulto, ademés de las ccopias de genes no funcionales (pseudo- genes). estos elementos se transponen a través de intermediarios de ARN. de modo que la transcripcién inversa ha sido responsable de la generacion de mas del 40% del ‘genoma humano. Algunas de estas secuencias pueden ayudar en la regulacién de la expresién génica, pero la mayoria de las secuencias repetitivas dispersas no parecen hacer una contribucién uti a la célula, Por el contrario, parecen repre- sentar los «elementos de ADN egoistas» que han sido selecoionados por su pro- pia capacidad de replicacion dentro del genoma, en lugar de proporcionar una ventaja selectiva a su huésped. En algunos casos, sin embargo, los elementos transponibles han jugado un papel evolutive importante, estimulando los reorde- namientos genéticos y contribuyendo a la generacién de la diversidad genética. Duplicacion génica y pseudogenes Otro de los factores que favorecen al gran tamafio de los genomas eucariotas €s que algunos genes estan presentes en miiltiples copias, algunas de las cua- les frecuentemente son afuncionales. En algunos casos, multiples copias de genes son necesarias para producir ARNS o proteinas requeridas en grandes cantidades, como los ARNs ribosémicos 0 las histonas. En otros casos, miem- bros concretos de un grupo de genes relacionados (denominado una familia ‘génica) pueden ser transcritos en diferentes tejidos o en diferentes etapas del desarrollo. Por ejemplo, las subunidades 7 y i de la hemoglobina se encuentran codificadas por familias de genes en el genoma humano, con diferentes miem- bros de esa familia expresados en el tejido embrionario, fetal, y tejidos adultos (Fig. 4.9). Los miembros de muchas familias de genes (p. ¢j., los genes de la globina) se agrupan en una regién del ADN; los miembros de otras familias estan dispersos en cromosomas diferentes, Las familias de genes se cree que han surgido de la duplicacion de un gen ancestral original, divergiendo los diferentes miembros de una familia como ‘consecuencia de mutaciones durante la evolucion. Tal divergencia puede de- sembocar en la evolucién de proteinas relacionadas capaces de funcionar en Iejidos diferentes o en diferentes etapas del desarrollo, Por ejemplo, las globi- nas fetales presentan una mayor afinidad para el O, que las globinas adultas —una diferencia que permite al feto obtener O, de la circulacién materna. ‘Como cabria esperar, sin embargo, no todas las mutaciones favorecen la Iuncién del gen. Aigunas copias genéticas presentan mutaciones sustanciales que ocasionan la pérdida de la capacidad para producir un producto genético funcional. Por ejemplo, las familias de genes humanos de la x y / glooina contie- nen dos genes que han sido desactivados por mutaciones. Tales copias genéti- ‘cas no funcionales (llamados pseudogenes) representan reliquias evolutivas ‘que aumentan considerablemente el tamario de los genomas eucariotas sin ha- cer ninguna contribucién genética funcional. Las duplicaciones génicas pueden surgir por dos mecanismos diferentes. La primera es la duplicacién de un segmento de ADN, que puede resuitar en la Iransferencia de un bloque de ADN a una nueva localizacion en el genoma. Se estima que dichas duplicaciones de segmentos de ADN de entre 1 kb y mas de Secuencia Locus delaw-globina_¢ espaciadora wo wot 02 al cromesoma 16 Embrionario Pseudogenes — Felaly ‘adulto Secuencia Locus dela globina yii2__¢_espaciadora Gr Ay B18 cromosoma 11 Pseudogenes: Fetal Pseudoganes Adulto EmbronarioCapitulo 4 * Organizacién y secuenciacién de los genomas celulares @ 149 Exon _inon 1 Exén 2 Intron 2 Extn Figura 4.10 con 3° Formacién de un pseudogén procesa- 5 do. Un genes transcrito y procesado para sranaipaion dae lugar a un ARNm del eval se han eli: nado los intrones. El ARNm es copiado ‘mediante transcripcion inversa, dando lu- {gar a una copia de ADNe careciente de in- ABN es trones. La integracion en el ADN cromo. somico resulta en la formacién de un pseudogen procesado, Procesamiento “Transcripcién inversa Integracion on un nuevo punto eromasomico 50 kb, forman aproximadamente el 5% del genoma humano. Por otro lado, los genes pueden duplicarse mediante transcripcién inversa de un ARNm, seguido de integracion de la copia de ADNc en un nuevo punto cromosémico (Fig. 4.10). Este modo de duplicacion génica, andlogo a la transposicion de elementos re- pelitivos a través de intermediarios de ARN, resulta en la formacion de copias genéticas que carecen de intrones y que carecen también de las secuencias cromosémicas normales que dirigen la transoripcion de un gen en ARNm Como resultado, la duplicacién de un gen por transcripcién inversa generalmen- te da lugar a una copia génica inactiva denominada pseudogén procesado. Se estima que existen varios miles de pseudogenes procesados en el genoma humano. Composicién del genoma en los eucariotas superiores Una vez vistos varios tipos de ADN no codificante que contribuyen a la comple: dad gen6mica de los eucariotas superiores, es de interés revisar la composicion de los genomas celulares. En los genomas bacterianos, la mayor parte del ADN codifica proteinas. Por ejemplo, el genoma de E. coli es aproximadamente de unas 4,6 x 10° pares de bases de longitud y contiene unos 4.000 genes, donde casi un 90% del ADN son secuencias codificantes para proteinas, El genoma de levaduras, que consiste en 12 x 10° pares de bases, posee un tamafio 2,5 ve- ces el de E. coli, pero sigue siendo extremadamente compacto. Sélo e! 4% de los genes de Saccharomyces cerevisiae contienen intrones, y normaimente és tos s6lo poseen un pequefio intrén cerca del comienzo de la secuencia codi cante. Aproximadamente un 70% del genoma de levaduras se emplea en se- cuencias codificantes de proteinas, especificando un total de aproximadamente 6.000 proteinas. Los genomas animales relativamente sencillos de C. elegans y Drosophila son unas 10 veces mas grandes que el genoma de levaduras, pero contienen sélo 2-3 veces mas genes. Por el contrario, estos genomas animales sencillos contienen més intrones y mas secuencias repetitivas, de modo que las secuen- cias cogificantes de proteinas corresponden solo al 25% del genoma de C. ele- {gans y un 13% del genoma de Drosophila. El genoma de la planta modelo Ara~ bidopsis contiene un numero similar de genes, donde aproximadamente un 26% del genoma corresponde a secuencias cocificantes de proteinas. Los genomas de animales superiores (como el humano) son aproximada- mente 20-30 veces mas grandes que los de C. elegans y Drosophila. Sin embar- {go, una gran sorpresa obtenida al descifrar la secuencia del genoma humano, fue el descubrimiento de que el genoma humano sdlo contiene aproximada- mente de 30.000 a 40.000 genes —justo el doble del ntimero de genes presente en el genoma de C. elegans 0 Drosophila—. Parece que sdio del 1 al 1,5% del ‘genoma humano consiste en secuencias codificantes de proteina. Aproximada- ‘mente el 25% del genoma consiste en intrones, y mas del 60% esta compuesto150 @ Seccidn Il © Flujo de la informacion genética por varios tipos de secuencias de ADN repetitivo y duplicado, donde el resto esta compuesto por pseudogenes, secuencias espaciadoras no repetitivas en- tre genes y secuencias de exones que estan presentes en los extremos 5° y 3° de los ARNm pero que no se traducen en proteinas. El aumento del tamanio de os genomas de los eucariotas superiores, por lo tanto, se debe mucho mas a la presencia de grandes cantidades de secuencias repetitivas e intrones, que al incremento del nimero de genes Cromosomas y cromatina No sélo los genomas de la mayoria de los eucariotas son mas complejos que los de los procariotas, sino que el ADN de las céiulas eucariotas se encuentra organi- zado de forma diferente al de las células procariotas. Los genomas de los proca- riotas los contienen cromosomas nicos, que normaimente son moléculas de ADN circulares. Por el contrario, los genomas de los eucatiotas estin compues- tos por mitiples cromosomas, cada uno de los cuales contiene una molécula de ADN linear. Aunque el ntimero y el tamano de los cromosomas varia considera- blemente entre las especies (Tabla 4.2), su estructura basica es la misma en todos Ios eucarictas. El ADN de las células eucariotas esta fuertemente unido a unas pequefias proteinas basicas (histonas) que empaquetan el ADN de manera ordenada en el niicleo de la célula. Esta caracteristica resulta primordial, y se da enel ADN de la mayoria de los eucariotas. Por ejemplo, la longitud total extendida del ADN en una célula humana es de unos 2 m, pero este ADN debe caber en un ncleo con un diémetro de tan solo de 5 a 10 jm Cromatina Los complejo entre el ADN eucaridtico y las proteinas forman la cromatina, que contiene alrededor del doble de protaina que de ADN. Las proteinas prinei- pales en la cromatina son las histonas —pequefias proteinas que contienen una gran proporcién de aminodcidos basicos (arginina y lisina) que facilitan la nién con la molécula de ADN cargada negativamente—. Existen 5 tipos impor- tantes de histonas —llamadas H1, H2A, H2B, H3, y H4— que resultan muy similares entre las diferentes especies eucariotas (Tabla 4.3). Las histonas son Levadura 2 16 (Saccharomyces cerevisiae) ‘Moho del ado (Dyetostelium) 70 7 Arabidopsis thaliana 125 5 Maiz 5.000 10 Cabal 15,000 8 io 50,000 2 Nométodo 7 6 (Casnorhabatis elegans) ‘Mosca dela truta (Drosophila) 180 4 ‘Sapo (Xenopus laevis) 3.000 18 ez pulmn 50.000 7 Pollo 1.200 9 atén 3.000 20 Vaca 3.090 % Porro 3.000 30 Humano 3.000 23 "Tanto ol tamafo de genoa coma el ndmere de crmouemas son para ells hapten. o'=milones oo pares de oasosCapitulo 4 * Organizacién y secuenciacién de los genomas celulares @ 151 Peso Numero de Porcentaje de molecular aminoscidos lisina + arginina HI 22500 28a 08 Hon 13.960 129 20.2 HOB: 1374 135 4 3 15273 195 229 Ha 11.236 102 245 “bates par in nstons de cone) ybowina tremendamente abundantes en las células eucarictas; su masa total resulta aproximadamente igual al ADN de la célula. Ademas, la cromatina contiene aproximadamente una masa igual de una variedad de proteinas cromosémicas diferentes a las histonas. Existen mas de un millar de tipos diferentes de estas proteinas, que estan implicadas miltiples actividades, incluyendo la replicacion del ADN y la expresién génica La unidad basica estructural de la cromatina, el nucleosoma, fue descrito por Roger Komberg en 1974 (Fig. 4.11). Komberg propuso el modelo de nu- cleosoma de acuerdo con dos tipos de experimentos. Primero, la digestion par- cial de la cromatina con la nucleasa micrococal (una enzima que degrada el ADN) produjo fragmentos de ADN con una longitud de 200 pares de bases. Por el contrario, una digestién similar de ADN desnudo (no asociado a protel- rnas)produjo una mancha continua de fragmentos de diterentes tamafos. Estos resultados sugirieron que la unién de las proteinas al ADN en la cromatina pro- tege algunas regiones del ADN de la digestion por la nucleasa, de manera que la enzima puede atacar al ADN solamente en lugares separados por aproxima- “ Particula central el nucleosoma ADN enlace o tinker Proteina no | Fistona Ftora ® , Tmorvios de 200 pares co bases * z co” ae ja: og os” i § 5 Fa: 200 | — am Figura 4.11 Organizacién de la cromatina en nu- cleosomas. (A) El ADN se envuelvealre: dedor de las histonas en las particulas centrales 0 core del nucieosoma y es su- jetado por la histona Hi. Las proteinas no histonas se unen al ADN de enlace o lin Kerentre los nucleosomas y as particulas contrales. (8) Gel de electroforesis de ‘ragmentos de AON obtenidos de a diges- tion parcial de la cromatina con la nuclea- ‘sa micrococal. El ADN de enlace entre las. partioulas centrales o core del nucleoso: ‘ma es especialmente sensible, por lo que la digestion limitada de la cromatina pro- duce fragmentos correspondientes a mu tiplos de 200 pares de bases. (C) Una mi crogratia electronica de una fibra de cromatina extendida, ilustrando su apa- fiencia de collar de cuentas. (B, cortesia de Roger Kornberg, Stanford University ; cortesia de Ada L. Olins y Donaid Olin, Oak Ridge National Laboratory.)2 moléculas de cada HOA, H2B, H3 y He Fibra de 10nm Panticula contralo core ol nucieosoma n Il * Flujo de la informacién genética Figura 4.12 Estructura de un cromatosoma. (A) La particula central o core de nucieosoma consta de 146 pares de bases de ADN envuelto 1,65 vueltas alrededor de un octamero de histonas que consta de dos moléculas de cada H2A, H2B, H3, y Hd, Un cromatosoma contione dos ‘yuoltas completas de ADN (166 pares de bases) sujelas por una molécula de M1. (B) Mode- 'o de una particula central o core del nucieosoma. Las cadenas de ADN se muestran en marron y en turquesa, Las histonas se muestran en azul (H3), verde (H4), amarillo (HA), y rojo (H2B). (B, de K. Luger et al., 1997. Nature 389. damente 200 pares de bases. De acuerdo con esta idea, a mictoscopia electro: nica revel6 que las fibras de cromatina tienen una apariencia de collar de cuen: tas, con las cuentas separadas a intervalos de unas 200 pares de bases. Por tanto, la digestion por ia nucleasa y los estudios por microscopia electronica sugirieron que la cromatina esta compuesta por unidades que se repiten cada 200 pares de bases, que fueron llamadas nucleosomes. Una aigestion mas extensa de la cromatina con la nucleasa micrococal prod cia particulas (llamadas particulas centrales o cores de! nucleosoma) que correspondian a las cuentas visibles por microscopia electrénica. Un andlisis de- tallado de estas particulas demostré que contienen 146 pares de bases de ADN enrolladas 1,65 veces alrededor del centro de histonas formado por dos moléculas de H2A, HB, H3, y H4 (las histonas del centro) (Fig. 4.12). Una molécula de la quinta histona, H1, se encuentra unida al ADN cuando entra en una particula cen: tral o core del nucleosoma. Esto forma una subunidad de cromatina llamada ¢ro- matosoma, que esta compuesto por 166 pares de bases de ADN envuelto alre dedor del centro de histonas y sujeto en su lugar por H1 (una histona de enlace) El empaquetamiento del ADN con histonas produce una fibra de cromatina aproximadamente de 10 nm de didmetro y compuesta por cromatosomas sepa- rados por segmentos de enlace o linker de ADN de unas 80 pares de bases de longitud (Fig. 4.13). En el microscopio electronica, esta fibra de 10 nm presenta la apariencia de collar de cuentas que sugiere el modelo del nucleosoma. Em- paquetar el ADN en una fibra de cromatina de 10 nm reduce su longitud aproxi: madamente seis veces. La cromatina se puede condensar atin mas enrollando- la en fibras de 30 nm, estructura que atin no se ha conseguido determinar. Las Figura 4.13 ras de cromatina. El empaquetamiento del ADN en los nucleosomas produce una fbra de cromatina de aproximadamente 10 nm de Giémetro. La cromatina se condensa aun mas tenroliéndase en una fibra de 30 nm de diametro, con unos seis nucleosomas por vuelta (Fotografias cortasia de Ada L. Olins y Donald E. Olins, Oak Ridge National Laboratory.) 30 nm Fibra de 30.nm Pas TOO a ToOnmCapitulo 4 © Organizacion y secuenciacién de los genomas celulares © 153 Figura 4.14 Cromatina en la interfase. Microgratia electronica de un ncleo en Interfase. La eucromatina se distribuye por el nucleo Lahetorocromatina se indica con los trian ulos y el nuciéolo con una fecha. (Corte- sia de Ada L. Olins y Donald E. Olins, Oak Ridge National Laboratory.) interacciones con las histonas H1 parece ser que desempefian un importante papel en esta etapa de la condensacién de la cromatina. La duracién de la condensacién de la cromatina varia segun el ciclo de la vida de la célula. En céiulas en interfase (sin dividirse), la mayoria de la cromat na (llamada eucromatina) se encuentra relativamente sin condensar y distr bbuida por todo e! nucleo (Fig. 4.14). Durante este periodo del ciclo celular, los genes se transcriben y el ADN se replica como preparacién para la division. La mayoria de la eucromatina en los nuicleos en interfase parece presentarse en forma de fibras de 30 nm, organizadas en grandes lazos que contienen aprox: madamente de 50 a 100 kb de ADN. Alrededor del 10% de la eucromatina, que contiene los genes que son transcritos activamente, se encuentra en un estado menos condensado (formacién en 10 nm) lo que permite la transcripcién. La estructura de la cromatina esta por tanto unida al control de la expresién génica en los eucariotas, tal y como se discutira en el Capitulo 6. Al contrario de la eucromatina, alrededor del 10% de la cromatina de la interfase (llamada heterocromatina) se encuentra en un estado muy conden- sado que recuerda a la cromatina de las células que llevan a cabo la mitosis. La helerocromatina es transcripcionalmente inactiva y contiene secuencias de ADN altamente repetitivas, como aquellas presentes en los centrémeros y telomeros. Cuando la célula entra en mitosis, sus cromosomas se condensan para poder ser distriuidos a las células hijas. Los lazos de fibras de cromatina de 30 nm se ‘cree que se doblan sobre si mismos para formar los cromosomas compactos de la metafase de las células mitsticas, en las que et ADN se ha condensado cerca de 10.000 veces (Fig. 4.15). Esta cromatina condensada no puede ser utlizada ‘como molde para la sintesis de ARN, asi que la transcripcién cesa durante la Figura 4.15 Condensacién de la cromatina durante la mitosis. Microgralia electronica de barrido de cromosomas de metafase. Afiadido color artificial. (Biophoto Associates/Photo Researchers, Inc.)154 @ Seccién Il * Flujo de la informacion genética ‘Andamio de proteinas Lazos de ADN Figura 4.16 Estructura de los cromosomas de la metatase. Una microgratia electrénica de lazos {de ADN unidos al andamio de proteina de los cromosomas en metafase que han si liberados de las histonas. (De J. R. Paulson y U. K. Laemmli, 1977. Coll 12: 817. mitosis. Las micrografias electrénicas indican que el ADN en los cromosomas de la metatase esta organizado en grandes lazos unidos a un andamio 0 escalén de proteinas (Fig. 4.16), aunque todavia no se ha llegado a entender con detalle la estructura de la cromatina condensada ni el mecanismo de condensacion de ésta. Los cromosomas de la metatase se encuentran en un estado de concentra: ion muy alto, tanto que su morfologia puede ser estudiada a través del micros copio dptico (Fig. 4.17). Las diferentes técnicas de tincién proporcionan patro- nes caracteristicos de bandas cromosémicas luminosas y oscuras, como resultado de la unién preferente de los tintes fluorescentes 0 de manchas a las secuencias de ADN ricas en AT en lugar de las secuencias ricas en GC. Estas son especificas para cada cromosoma y parecen representar diferentes regio: nes de los cromosomas. Los genes pueden ser localizados en bandas cromo- somicas especificas mediante hibridacién in situ, indicando que el empaqueta miento del ADN en los cromosomas de la metafase es un proceso con un riguroso orden y de cardcter reproducible, Centrémeros El centromero es una region especializada del cromosoma cuyo papel es ase gurar la correcta distribucién de los cromosomas duplicados a las células hijas durante la mitosis (Fig. 4.18). El ADN celular se duplica durante la intertase, resultando la formacién de dos copias de cada cromosoma antes de que co- mience la mitosis, Cuando la célula entra en mitosis, la condensacién de la cromatina conduce a la formacién de los cromosomas de la metatase que con: sisten en dos crométidas hermanas idénticas. Estas cromatidas hermanas se ‘Cromosomas humanos en metafase. Una micrografia de cromosomas humanos exten: didos a partir de una célula en metafase, (Leonard Lessin/Peter Amold, Inc.)Capitulo 4 © Organizacién y secuenciacién de los genomas celulares © 155 [En la metafase, los eromosomas altamente condensados consisten de 'd0s copias idénticas (cromatidas hhermanas) unidas por el centrémero. Las fibcas del huso mitotico se unen al ccantiomero, nla primera etapa de Ja mitosis (profase), los cromosomas se ‘condensan y se mueven al centro de la célua, Intertase Centrémero Fibras del huso Centrosoma Cromatina descondensada [En la anatase, las lcromatidas hermanas se separan y se Imueven a los polos _Srométidas hermanas lopuestos dela célula Durante la etapa final de la mitosis (telotase), las membranas rnucloares so reforman y los ‘eromosomas se descondensan. ‘Se Forman dos Ccélulas hijas por division collar. mantienen unidas por el centrémero, e! cual se considera como una regién cro- mosomica compacta. Una vez iniciada la mitosis, los microtabulos del huso mi- totico se adhieren al centrémero, y las dos cromatidas hermanas se separan y se dirigen a los polos opuestos del huso. Al final de la mitosis, las membranas nucleares se restablecen y los cromosomas se descondensan, resultando la formacién de los nicleos de las oélulas hermanas que contienen una copia de cada cromosoma parental Los centrémeros, por tanto, sirven como sitios de asociacion de las cromati- das hermanas y como sitios de unién para los microtubules del huso mitético. Son secuencias especificas de ADN a las que se unen numerosas proteinas de Union asociadas a los centrémeros, formando una estructura llamada cinetoco- 0 (Fig. 4.19). La unidn de los microtuibulos a las proteinas del cinetocoro dirige la union de los cromosomas al huso mitotico, Las proteinas asociadas al cineto- coro actiian como «motores moleculares» que conducen el movimiento de los cromosomas a lo largo de las fibras del huso, segregando los cromosomas a los, nicleos de las células hijas. Las mejores secuencias de ADN centroméricas han sido descritas en leva- duras, donde su funcién puede probarse siguiendo la segregacion de los plas- midos en mitosis (Fig. 4.20). Los plasmidos que contienen centrémeros funcio- ales se segregan como los cromosomas y se distribuyen de igual forma a las células hijas una vez terminada la mitosis. En ausencia de un centromero fun- cional, sin embargo, el plasmido no se segrega adecuadamente, y muchas cé- lulas hijas no heredan el ADN del plésmido. Los ensayos de este tipo han permi- tido determinar las secuencias necesarias para la funcién del centrémero, Este tipo de experimentos mostraron por primera vez que las secuencias de los cen- tromeros de la lovadura Saccharomyces cerevisiae se encuentran aproximada- mente en 125 pares de bases divididas en tres elementos de secuencia: dos Figura 4.18 Cromosomas durante la mitosis. Pues: to que el ADN se replica durante ia interta se, la célula contiene dos copias duplica das identicas de cada cromosoma antes de entrar en mitosis, Cromatida /Fibras de! F sso Figura 4.19 Centrémero en cromosomas de metatase. El centromero es la region por donde las dos cromatidas hermanas siguen unidas en la metafase. Proteinas tespecificas se unen al ADN centromerico, formando el cinetocoro, que es el lugar de anciaje de las fbras del huso156 @ Seccidn Il * Flujo de la informacion genética ARS. Leu2 ‘Sepregacién «errénea> de plasmidos. ARS. Leu2 CEN hf ( = SS PY Plasmidos regularmente ‘segregades y > &q® “Se a so nara cee Bd Algunas células hijas plerden el plasmio y requieren Todas las células heredan el plasmido y pueden leucina para el crecimionto ‘racer en un medio carente de leucina Figura 4.20 Ensayo de un centrémero en. levaduras. Ambos plasmidos contienen un marcador (LEU2) y secuencias de ‘ADN aue sirven como origenes de replicacién en levaduras (ARS, que significa secuencia de replicacién ‘autonoma). Sin embargo, el plasmido | ‘carece de un centrémero y por lo tanto se Pierde con frecuencia como resultado de luna segragacion erronea durante la mitosis. Por el contrario, a presencia de tun centrémero (CEN) en el plasmido Il segura su transmisiOn regular a las colulas hias. secuencias cortas de 8 a 25 pares de bases separadas por 78-86 pares de bases de un ADN muy rico en AT (Fig. 4.214). Las secuencias cortas de los centrémeros definidas en S. cerevisiae, no obstante, no parecen retlejar la situacién en otros eucariotas. Estudios mas recientes han definido los centrémeros de la levadura de fisién Schizosaccha- romyces pombe mediante un método funcional similar. Aunque S. cerevisiae y S. pombe son levaduras, parecen ser muy divergentes la una de la otra y muy diferentes en muchos aspectos de su biologia celular. Estas dos especies de levaduras proporcionan modelos complementarios para el estudio de células eucariotas simples y de facil estudio. Los centrémeros de S. pombe se extien- den de 40 a 100 kb de ADN; son aproximadamente mil veces mas largos que los de S. cerevisiae. Se componen de un centro de 4 a7 ke de una sola copia de ADN flanqueada por secuencias repetitivas (Fig. 4.218). Tanto el centro como las secuencias repetitivas tlanqueantes son necesarios para el funciona- miento del centromero, por lo que los centromeros de S. pombe parecen ser considerablemente mas complejos que los de S. cerevisiae. Los estudios de un cromosoma de Drosophila han proporcionado la primera descripcién de un centrémero en eucariotas superiores Fig. 4.210). El centré- mero de Drosophila se extiende 420 kb, del cual la mayoria (mas del 85%) consta de dos ADN satélites muy repetitivos con las secuencias AATAT y AAGAG. El resto del centrémero consta de elementos transponibles dispersos, que se encuentran también en otros sitios en el genoma de Drosophila, ademas de una regién no repetitiva de ADN rica en AT. La delecién de las secuenciasCapitulo 4 * Organizacién y secuenciacién de los genomas celulares @ 157 (A) 8. corevisiag CoE! COE CoE I PuTCAC PuTG| TGTxTxTGyyTTGCGAAYYYYYAAA 78-88 bp >90% AT 125 bp = > (8) S. pombe B K LB K LB oc BOL i 5 ~ 65k | (C) Drosophila melanogaster cI 420 Kb WAAGAG Satclte BD ADN no repetiivo i Transposones TLAATAT Satelite satélites y de los elementos transponibles, ademas del ADN no repetitivo, redu- ce la actividad del centrémero en los ensayos funcionales. Por tanto, las se- cuencias repetitivas y no repetitivas parecen contribuira la formacién del cineto- coro y a la funcién del centrémero. Los centrémeros de Arabidopsis también parecen acupar de 500 a 1,000 kb y consisten principaimente en secuencias altamente repetitivas. Los centromeros de mamiferos se caracterizan por las extensas regiones de heterocromatina que consisten en secuencias de ADN satélite altamente repeti- tivas. En humanos y otfos primates la secuencia centromérica principal es el ADN satélite z, que es una secuencia de 171 pares de bases situada en repeti- ciones en tandem que pueden abarcar hasta millones de pares de bases. Se ha visto que el ADN satélte « une proteinas asociadas al centromero, y experimen tos recientes han demostrado que la zona del satélite x centromérico del cromo- soma X humano es suficiente para actuar como un centromero funcional. Sin embargo, también se han descrito cromosomas humanos anémalos con centro- meros funcionales que carecen de ADN satélite z, de modo que las necesida- des exactas para la correcta funcidn del centrémero en los eucariotas superio- res siguen siendo desconocidas, Telémeros Las secuencias situadas al final de los cromosomas de eucariotas, llamados teld- meros, desempefian un papel criico en la replicacién y el mantenimiento del cro- mosoma. Los telSmeros inicialmente se reconocieron como estructuras distintas ya que los cromosomas rotos eran altamente inestables en las células eucariotas, implicando la necesidad de secuencias especiticas en las terminaclones cromo- somicas normales. Esto se demostré mediante experimentos en los que los teld- eros del protozoo Tetrahymena fueron afiadidos a los extremos de moléculas lineales de ADN plasmidico de levaduras. La suma de estas secuencias de ADN telomérico permitiéa estos plasmidos replicarse como cromosomas lineales igual ‘que las moléculas en las levaduras, demostrando directamente que los telomeros ‘son necesatios para la replicacién de las moléculas lineales de ADN, Figura 4.21 Centromeros de S. cerevisiae, S. pom- ‘bey Drosophila melanogaster. (A) Las secuencias del centromero de S. cevev- siae (CEN) se componen de dos secuen- cias conservadas cortas (CDE! y CDEIII) Separadas por 78 a 86 pares de bases (pb) de ADN rico en AT (CDEII). Las secuen- cias mostradas son secuencias consenso derivadas del andlisis de las secuencias de los cemtrémeros de cromosomas indi- Viduales de levaduras. Pu=A0G;x-A0 T; y = cualquier base. (B) Se ilusta la or- ganizacion de las secuencias del centro- ‘mero del cromosoma Il de S. pombe. El centromero consiste en un grupo central (CO) de secuencia tinica de ADN, rodea {0 por repeticiones en tandem de tres ele- rmentos de secuencia repeiitives (B. K, y L). (©) El centrémero de Drosophila con- siste en dos secuencias satélte, elemen tos transponibies y ADN no repetitive.158 @ Seccién Il * Flujo de la informacion genética Figura 4.22 Estructura de un telémero. El ADN telomérico forma un bucie sobre si mismo para formar una estructura circular que se asocia, con un nimero de proteinas que protegen los extremos de los cro- Secuencia telomérica Orgenismo repetida Levaduras ‘Saccharomyces cerevisiae GT Schisosaccharomyces pombe , ,TTAC Protoz00 Tetrahymena gccort Dyctiostelium Gish Pianta Arabidopsis agecrTT Mamitero Humano acactT Las secuencias de ADN de los telmeros de los eucariotas son similares, presentando repeticiones de una secuencia simple de ADN que contiene gru- pos de residuos de G en una hebra (Tabla 4.4), Por ejemplo, la secuencia de las repeticiones de los telémeros en humanos y en otros mamiteros es AGGGTT, y la repeticién telomérica en Tetrahymena es GGGGTT. Estas secuencias se re- piten cientos o miles de veces, por tanto extendiéndose hasta varias kilobases, yterminando con un resto de ADN de hebra tinica. Las secuencias repetidas del ADN telomérico forman bucles al final de los cromosomas ademas de unir un cierto ntimero de proteinas que protegen los extremos del cromosoma de la degradacién o de ser unidos (Figura 4.22) Los telmeros desempeftan un papel importante en la replicacién de los ex- tremos de las moléculas de ADN linear (véase Cap. 5). La ADN polimerasa es capaz de extender una cadena de ADN en crecimiento pero no puede iniciar la sintesis de una nueva cadena al final de una molécula linear de ADN. Como ‘consecuencia, las terminaciones de los cromosomas lineales no pueden ser replicadas por la ADN polimerasa en condiciones normales, Este problema se ha solucionado mediante la evolucién de un mecanismo especial, que implica la actividad de la transcriptasa inversa, para replicar las secuencias de ADN telo- mérico. El mantenimiento de los telmeros parece ser un factor importante a la hora de determinar las expectativas de vida y la capacidad reproductiva de las células, por lo que los estudios de los telmeros y de la telomerasa son prome- tedores al respecto de nuevos datos sobre cuestiones como la edad y el cancer. Secuencias de los genomas completos Algunos de los esfuerzos mas excitantes en la biologia molecular son los dirigi- dos actualmente hacia la obtencién y andlisis de las secuencias completas de nuclestides del genoma humano y de los genomas de diversos modelos de organismos, incluyendo a E. coll, Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila, Arabidopsis y el raton (Tabla 4.5). Los resultados de la secuenciacién de genomas completos nos han llevado mas alld de la caracter zaci6n de genes individuales hasta una visién global de la organizacién y conte- nido génico de genomas completos. En principio, este enfoque posee el poten- cial de identificar a todos los genes de un organismo, que por tanto, se volveran accesibles a investigaciones sobre su estructura y funcion. Sin embargo, apren- der cémo interpretar una cantidad tan inmensa de datos generados por la se- cuenciacién de genomas completos supone nuevos retos, y ha dado lugar aCapitulo 4 * Organizacién y secuenciacién de los genomas celulares @ 159 ‘Secuencia Tamafo del Numero de codificadora Organismo genoma (Mb)* ‘genes de proteinas Bacteras ‘Mycoplasma gontalium 058 470 8% H.invenza 18 1743 Be Ecol 45. 4288 88% Levaduras ©. corovisiae 2 6.000 70% S. pombe a 4.800 60% Inverteorados, C. elegans 97 19.000 25% Drosophta 180 19.600 13% Plantas “Arabidopsis thaliana 125 26,000 25% ‘oz 440 '30.000-50.000 10% Mamiteros Humano 9200 :30:900-40.000 118% ~ Mo = ilones do pares de base. una nueva érea de estudio denominada bioinformatica, que se encuentra en el interfaz entre la biologia y la informatica y esta enfocada hacia el desarrollo de los métodos computacionales necesarios para analizar y obtener informacion biolégica util, a partir de la secuencia de miles de millones de bases que compo- nen un genoma tan grande como el humano. Aunque queda mucho por apren- der, las secuencias de genomas que ya estan disponibles han proporcionados a los cientificos una base de datos tinica, consistente en las secuencias de nu- cledtidos de grupos completos de genes. Debido a que muchos de estos genes no habian sido con anterioridad identificados, la determinacién de sus funciones constituird la base de futuros estudios en biologia celular. Genomas procariotas ‘Ahora conocemos las secuencias completas del genoma de mas de sesenta bacterias diferentes, y aun mas estan en proceso de ser determinadas. La pri mera secuencia completa de un genoma celular, anunciada en 1995 por un equipo de investigadores dirigido por J. Craig Venter, fue el de la bacteria Hae- ‘mophilus influenzae, un habitante comin del tracto respiratorio humano. El ge- noma de H. influenzae tiene aproximadamente 1,8 x 10° pares de bases (1.8 megabases 0 Mb), un poco menos de la mitad del tamao del genoma de E. col La secuencia completa de nuclestidos indiod que el genoma de H. influen- zae es una molécula circular compuesta por 1.830.137 pares de bases. La se- cuencia fue analizada para identificar los genes que codifican los ARNr, ARN y proteinas. Las regiones potenciales codificadoras de proteinas se identificaron mediante el andlisis por ordenador de la secuencia de ADN para detectar las fases de lectura abiertas —tramos largos de secuencia de nucie6tidos que pue- den codificar polipéptidos ya que no contienen ninguno de los tres codones de terminacién de la cadena (UAA, UAG, y UGA)—. Debido a que estos codones de terminacién de la cadena aparecen aleatoriamente una vez cada 21 codones (Bcodones de terminacion en un total de 64), los marcos de lectura abiertos que se extienden mas de cien codones normalmente representan genes funcionales. Este analisis identiicd seis copias de genes ARNT, 54 genes ARNT diferen- tes, y 1.743 regiones potenciales codificadoras de proteinas en el genoma de H. influenzae (Fig. 4.23). De éstas, més de mil pueden tener un papel biolégico (p. ej., una enzima del ciclo del acido citrico) en base a su relacién con secuencias de proteinas conocidas, pero los otros representan genes de funciones no co-160 © Seccién Il * Flujo de la informacion genética Figura 4.23 Genoma de Haemophilus influenzae. Las regiones codificadoras de proteinas predecibles se designan con las barras de Colores. Los numeros indican pares de bases de ADN. (De R. D. Fleischmann et all, 1995. Science 269: 496.) 1.800.000 100.000, 1.400.000 nocidas hasta ahora. Las secuencias codificantes esperadas tienen un tamafo medio de aproximadamente 900 pares de bases, por lo que cubren unas 1,6 Mo de ADN, correspondiendo a casi un 90% del genoma de H. influenzae. La secuencia completa del genoma de Mycoplasma genitalium es de part cular interés puesto que los micoplasmas son las bacterias mas simples pre- sentes hoy en dia y contienen los genomas mas pequeftos de todas las células conocidas. El genoma de M. genitalium es de tan s6lo 580 kb (0,58 Mb) de largo y debe representar el menor juego de genes necesarios para mantener la repli- cacién propia de un organismo. El andlisis de su secuencia de ADN indica que M. genitalium contiene 470 secuencias codificadoras de proteinas , que corres- ponde aproximadamente al 88% del ADN genémico (Fig. 4.21). Muchas de estas secuencias fueron identificadas como genes codificadores de proteinas implicados en la replicacién del ADN, transcripcién, traduccién, transporte a tra~ vés de membranas y metabolismo energético. Sin embargo, M. genitaliumcon- tiene menos genes para enzimas metabdlicas que H.influenzae, mostrando un metabolismo mas limitado. Por ejemplo, muchos genes conocidos que codif- can componentes de procesos biosintéticos no se encuentran en el genoma de M. genitalium, probando su necesidad de obtener precursores de aminodcidos y Nuclectidos de un organismo huésped. De forma interesante, él genoma de ‘Mycoplasma también incluye aproximadamente 150 genes con funcién desco- Nocida. Por tanto, incluso en las células mas simples, los papeles biol6gicos de muchos genes continuan por determinarse. La secuencia del genoma de la arqueobacteria Metanococcus jannaschi, anunciado en 1996, aporté una nueva visién sobre las relaciones evolutivas entre las arqueobacterias, eubacterias y los eucariotas. El genoma de M. jannaschit tiene 1,7 Mb y contiene 1.738 supuestas secuencias codificadoras de proteinas —similar en tamafio al genoma de H. influenzae—. Sin embargo, solamente alre- dedor de un tercio de las secuencias codificadoras de proteinas identificadas en M, jannaschii estaban relacionadas con genes conocidos de eubacterias 0 euca- riotas, demostrando la composiciin genética diferente de las arqueobacterias. Los genes de M. jannaschii codificadores de proteinas implicados en la produc- cién de energia y en la biosintesis de los constituyentes de la célula estan rela- ionados con los de las eubacterias, lo que sugiere que el proceso metabdiicoCapitulo 4 * Organizacién y secuenciacién de los genomas celulares @ 161 basico evolucioné a partir de un antepasado comuin de las arqueobacterias y eubacterias. Es importante, sin embargo, que los genes de IM. jannaschi' cocitica- dores de proteinas implicados en la replicacién del ADN, transcripcion, y traduccién ‘estan mas relacionados con los eucariotas que con las eubacterias. La secuen- clacién del genoma de esta arqueobacteria indica por tanto que las arqueobac- terias y los eucariotas comparten una linea comtn de descendencia evolutiva y que estan més relacionados entre si que con las eubacterias (véase Fig. 1.8). ‘Aunque la relativa simplicidad y facilidad de la genética de E. colilo ha conver- tido en un organismo favorable para la biologia molecular, el genoma de 4,6 Mb de E. colino se complets hasta 1997. El andlisis de la secuencia de E. colirevela un total de 4.288 genes, con un 88% del genoma representado por Secuencias coditicadoras de proteinas. De los 4.288 descubiertos mediante secuenciacion, 1.895 habian sido identiicados con anterioridad y las funciones de 821 pudieron ser deducidas por comparaciones con las secuencias de genes ya descritos en otros organismos. Sin embargo, las funciones de 1.632 genes de E. coli (cerca del 40% del genoma) no pudieron ser determinadas. Por tanto, incluso para un organismo tan estudiado como E. col, la secuenciacién genémica demuestra que atin queda mucho por descubrirse en la biologia celular de los procariotas. El genoma de levaduras Como ya dijimos anteriormente, e! genoma eucariota mas sencillo (1,2 x 107 pares de bases de ADN) se encuentra en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Ademés, las levaduras crecen rapido y son objeto de manipulaciones genéticas simples. Por tanto, las levaduras son un modelo de célula eucariota que puede ser estudiada con mayor facilidad que las células de los mamiferos u otros eucariotas superiores. Como consecuencia, la secuenciacién completa de un cromosoma de levadura en 1992 (Fig. 4.22), seguida de la determinacién de la secuencia completa del genoma en 1996, representaron los pasos mas impor- tantes en el entendimiento de la biologia molecular de las células eucariotas. El genoma de S. cerevisiae contiene unos 6.000 genes, incluyendo 5.885 supuestas secuencias codificadoras de proteinas, 140 genes de ARN ribosomi- ‘cos, 275 genes de ARN transferente y 40 genes codificadores de pequefios ARN nucleares implicados en el procesamiento del ARN (discutido en el Cap. 6). Las levaduras tienen, por tanto, una alta densidad de secuencias codificado- ras de proteinas, similara los genomas bacterianos, que representan aproxima- damente el 70% del ADN total de la levadura. De acuerdo con esto, los genes de S. cerevisiae que contienen intrones. normaimente tienen un Unico intron pequeio cerca del principio de! gen. El analisis por ordenador fue capaz de asignar una supuesta funcién a aproxi- madamente 3.000 de las secuencias codificadoras de proteinas de S. cerevisiae basado en las similitudes con las secuencias de genes conocidos. En base al andlisis de estos genes, result6 que aproximadamente el 11 % de las proteinas de levaduras funciona en el metabolismo, 3% en la produccién y almacenaje de la energia metabslica, 3% en la replicacién del ADN, reparacién, y recombina- cidn, 7% en la transcripcién, 6% en la traduccién, y un 14% en la clasificacién y transporte de proteinas. Sin embargo, las funciones de muchos de estos genes se conocen solamente en términos generales (como «factores de transcripcién»), de tal forma que su funcién especifica dentro de la célula aun necesita ser deter- minada. Ademas, debido a que la mitad de las proteinas codificadas por el geno- ma de las levaduras no estaban relacionadas con los genes o fases de lectura abiertas desoritos con anterioridad, es necesario descubrir mediante analisis ge- néticos y bioquimicos las funciones de otras 3.000 proteinas desconocidas. La secuencia del genoma de S. cerevisiae ha sido sequida recientemente por la secuencia del genoma de la levadura de fisién, S. pombe, Como se ha desorito previamente en este capitulo, S. cerevisiae y S. pombe son bastante divergentes, y diferentes en muchos aspectos de su biologia, incluyendo la estructura de sus162 @ Seccidn Il * Flujo de la informacion genética 20 250 Figura 4.24 Cromosoma Ill de levaduras. Las ba- ras superiores azules designan los clo- nes utilizados para la secuenciacion del AON. Los marcos abiertos de lectura o fa ‘ses de lectura abiertas se indican con fle- chas, (De S. G. Oliver et al, 1992. Nature 357: 38) de ao centrémeros (Fig. 4.21). Es interesante notar que sus genomas también mues- tran diferencias considerables. A pesar de que tanto S. cerevisiae como S. pom- be poseen aproximadamente la misma cantidad de ADN de secuencia unica (12,5 Mb), S. pombe parece contener sélo unos 4.800 genes. Los intrones son mucho mas prevalecientes en S. pombe que en S. cerevisiae. Aproximadamente @1 43% de los genes de S. pombe contienen intrones y ‘estos son mayores que los de S. cerevisiae, de modo que la secuencia codificadora de proteina const- tuye aproximadamente el 60% del genoma de S. pombe. La mayoria de los genes de S. pombe poseen homdlogos en el genoma de S. cerevisiae, pero aproximadamente 700 genes son exclusivos de S. pombe. ‘Ahora que se han completado las secuencias de los genomas de levaduras, la determinacidn de las funciones de los muchos nuevos genes descritos tanto para S. cerevisiae y S. pombe es una objetivo principal. Afortunadamente, las levaduras resultan muy manejables para levar a cabo el andlisis funcional de los genes desconocidos debido a la facilidad con la que los Joc’ cromosémicos normales pueden ser desactivados por recombinacion homdloga con secuen- clas clonadas (véase Fig. 3.39). Por tanto, sistematicamente se puede aplicar Un anélisis funcional directo a los genes de las levaduras que inicialmente fue- ron identificados en funcién de su Secuencia de nuclestidos. La secuenciacion del genoma de las levaduras ha abierto la puerta al estudio de nuevas areas de la biologia de esta célula eucariota simple. Se espera que estos estudios descu- bran las funciones de muchos genes nuevos que no son exclusivos de las leva~ ‘duras sino que son comunes a todos los eucariotas, incluyendo a los humanos.Capitulo 4 * Organizacién y secuenciacién de los genomas celulares @ 163 Los genomas de Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster Los genomas de C. elegans y Drosophila son genomas animales relativamente sencillos, intermedios en tamafo y complejidad entre las levaduras y los huma- nos. Caracteristicas distintivas de cada uno de estos organismos los convierte en modelos importantes para el andlisis gendmico: C. elegans ha sido utilizado ampliamente en estudios de desarrollo animales y Drosophila ha sido especial- mente bien analizado genéticamente. Los genomas de estos organismos, sin embargo, son aproximadamente diez veces mayores que los de levaduras, in- troduciendo un nuevo orden de dificultad en el mapeo y la secuenciacion genéti- ca. La determinacién de la secuencia de C. elegans en 1998 represents, por tanto, un hito importante en el andlisis genémico, que extendié la secuenciacion genémica desde los organismos unicelulares (bacterias y levaduras) a un orga- nismo multicelular reconocido como modelo importante de! desarrollo animal. Las fases iniciales del andlisis del genoma de C. elegans se utlizaron frag- mentos de ADN clonados en césmidos, que situaron inserciones de ADN de unas 40 kb (véase Fig. 3.23). Este paso, sin embargo, no fue capaz de cubrir el genoma completo, con lo que fue sustituido por la clonacion de piezas de ADN mucho mas largas en vectores de cromosomas artificiales de levaduras (YAC; del inglés, yeast artificial chromosome) (Fig. 4.23). La unica caracteristi- ca de los YAC, es que contienen centrémeros y telémeros, permitiendo su repli- cacién como cromosomas lineales en levaduras ‘Se pueden utilizar, por tanto, para clonar fragmentos de ADN del tamafo del ADN cromosémico de las levaduras-miles de kilobases de longitud. Las inser- ciones de largos fragmentos de ADN clonados en los YAGs son esenciales en el mapeo de genomas complejos. El genoma de C. elegans comprende 97 x 10° pares de bases y contiene 19.099 supuestas secuencias codificadoras de proteinas-aproximadamente tres veces el niimero de genes en levaduras y un quinto del numero de genes calculado en humanos. Al contrario de la organizacién compacta del genoma de levaduras, los genes en C. elegans se extienden unas 5 kilobases y contienen una media de cinco intrones. Las secuencias codificadoras de proteinas repre- sentan, por tanto, solamente el 25 % del genoma de C. elegans, comparado con @1 70% de las levaduras y cerca del 90% de los genomas bacterianos. Aproximadamente el 40% de las supuestas proteinas de C. elegans mues- tra similitudes significativas con las proteinas conocidas de otros organismos. Como se esperaba, existen mas similitudes entre las proteinas de C. elegans y de los humanos que entre C. elegans y las levaduras 0 bacterias. Las proteinas que son comunes entre C. elegans y levaduras podrian funcionar en los proce- sos celulares basicos compartidos por estos organismos, como el metabolismo, v e 10 f DB secuencias | | Genes predichos =| Hi Simiiares a las levaduras wi L ¥ Serre sen ree RRR Figura 4.25 El genoma de C. elegans. Las posicio- nes predichas de los genes de C. elegans sobre cada cromosoma estan indicadas por barras rojas. Aquellas que son simila- ‘es alos genes de levaduras se indican en Violeta. (De The C. elegans Sequencing Consortium, 1998. Science 282:2012.)164 @ Seccién Il * Flujo de la informacion genética Figura 4.26 Cromosomas politénicos en Drosophi- Ja. Microgratia dptica de cromosomas ta- flidos de la glandula salivar. Los cuatro cromosomas (X, 2, 3y 4) estan unidos por sus centromeros. (Peter J. Bryan¥Biologi- cal Photo Service.) replicacion del ADN, transcripcién, traduccién y clasificacién de proteinas. Es: tos procesos biolégices esenciales parecen estar llevados a cabo por un niime- ro parecido de genes en ambos organismos, siendo posible que estos genes sean compartidos por todas las células eucariotas. Por el contrario, la mayoria de los genes de C. elegans no se encuentran en levaduras y funcionan en las actividades reguladoras mas complicadas necesarias para el desarrollo de los organismos multicelulares. El descubrimiento de estos genes parece ser part cularmente excitante en términos del conocimiento del desarrollo animal. Aun- que los adultos de la especie C. elegans tienen una longitud aproximada de 11mm y contienen solamente 959 células somaticas en el cuerpo entero, pre- sentan todas las células especializadas que se puedan encontrar en animales més complicados. Ademéds, se ha deserito el patrén completo de las divisiones celulares que conducen al desarrollo de C. elegans, incluyendo el analisis de las conexiones hechas por 302 neuronas en el animal adulto. Muchos de los genes involucrados en el desarrollo y diferenciacién de C. elegans se ha encontrado que estan relacionados con genes implicados en el control de la diferenciacion y proliferacién de las células de los mamiferos, sustentando la validez de C. ele~ gans como modelo de animales mas complejos. Sin ninguna duda, los estudios de secuenciacién del genoma de C. elegans seguiran descubriendo genes pri- mordiales en el control del desarrollo celular. Drosophila es otro modelo clave para el desarrollo animal, el cual ha sido descrito genéticamente en detalle. Las ventajas de Drosophila para el andlisis genético incluyen su genoma relativamente simple y el hecho de que puede ser mantenida y criada en el laboratorio. Ademas, Drosophila aporta un instrumento especial para el andlisis genético en los cromosomas politénicos gigantes que se encuentran en algunos tejidos come las glandulas salivares de la larva. Los cromosomas se forman en las células que no se dividen como consecuen- cia de la replicacién repetitiva de las hebras de ADN que no se pueden separar la una de la otra. Por tanto, cada cromosoma politénico contiene cientos de moléculas de ADN idénticas alienadas en paralelo, Debido a su tamano, estos cromosomas politénicos son visibles al microscopio éptico, y con técnicas de tincion apropiadas se puede distinguir un patron de bandas (Fig. 4.26). El ban- deo de los cromosomas politénicos proporciona un mayor grado de resolucion que el oblenido por los cromosomas de metafase (p. ¢). véase Fig. 4.17). Los cromosomas politénicos son cromosomas de Interfase descondensados que contienen genes expresados activamente. Son visibles mas de 5.000 bandas,Capitulo 4 * Organizacién y secuenciacion de los genomas celulares @ 165 cada una de ellas correspondiente a un tamafo aproximado de 20 kb de ADN Por el contari, las bandas identiicadas en los cromosomas de metafase hu manos contienen varias megabases de ADN El patrén de bandas de los cromosomas politicos proporciona un mapa de alta resolucion del genoma de Drasophifa. La delecién de genes se puede relacio nar con la pérdida de una banda cromosomica espectica,definiendo por tanto la localzacion tisica del gen en el cromosoma. Adem, los ADNs cionados pueden mapearse por hiridacion in situ de los cromosomas politicos, con frecuencia con una resolucion suficiente para locelizar los genes clonados en las bandas especificas (Fig. 4.27). Por tanto, las posiciones en el mapa de los clones de cosmidos 0 de los VACs (que ocupan muchas bandas) pueden determinarse con facidad, proporcionando la base para ol andisis de la secuencia genémica Debido al poder de la genética de Drosophila, ia secuenciacion completa del genoma de Drosophila al comienzo del ano 2000 fue uno de los pasos mas importantes en el analisis genémico. El genoma de Drosophila consiste en 180 x 10° pares de bases, de las que un tercio es heterocromatina, La hetero- cromatina consiste principalmente en repeticiones satelite de secuencia senci lla, ademas de elementos ransponibles cispersos, y no se incluyé en la secuen: ciacién genémica. Las restantes 120 x 10° pares de bases de eucromatina fueron secuenciadas empleando una combinacisn de clones de cromosomas bacterianos atificiales (BAC), que portan grandes insertos de ADN, y un méto- do de escopeta en el que peque'ios fragmentos de ADN son clonados al azar y secuenciados en vectores plasmidicos. Las secuencias de estos pequefios frag- mentos de ADN fueron organizadas a continuacin en una larga secuencia conti- 507 5, gua mediante la identicacion de Secuencias comunes entre fragmentos, y estas Sue eT omasoma organizaciones de secuencias alineadas con los clones BAC para dar lugar a —_politénico de Drosophila. Se ilustra la una secuencia completa de la porcion eucromatica del genoma de Drosophila, bracionde uncon de YAC con un eo El genoma de Drosophila contiene aproximadamente 13.600 genes, canti- soma polténico, La regn dela Nb dag un tanto inferior al numero de genes en C. elegans. Aligual que C: elegans, dation se nica conuna leche. (Conesia los genes de Drosophila contienen un promedio de 4 intrones, y la cantidad total“ * e de secuencias intrénicas es similar a la cantidad de secuencias exénicas. En total, las secuencias codticadoras de proteinas constituyen aproximadamente €1 13% del genoma de Drosophila. A pesar de que Drosophila contiene menos genes que C. elegans, es importante notar que muchos de los genes se en ‘cuentran repetidos en ambos organismos. Cuando se tienen en cuenta estas duplicaciones, parece que el niimero de genes tnicos es similar tanto en Dro- sopiilacomo en C. elegans—entre 8.000 y 9.000—. Aproximadamente un 20% de los genes de Drosophila estan relacionados con genes presertes tanto en levaduras como en C. elegans —las proteinas codificadas por estos genes pue den realizar funciones que son comunes a todas las células euariotas—. Otros genes de Drosophila estan relacionados con genes encontrados en C. elegans pero no en levaduras, mientras que otros genes son exclusivos de Drosophila, Resulta especialmente llamativo que un animal complejo como Drosophila ‘slo contenga aproximadamente el doble de genes Unicos que los encontrados enlas levaduras, que parece un organismo mucho mas seneillo. Aparentemen- te, la complejdad de los organismos multicelulares no esta simplemente rela- cionada con un mayor numero de genes. Parte del incremento en complejidad biolégica de Drosophilay C. elegans puede deberse al hecho de que sus protel- ras son en general mas grandes y contienen mas dominios funcionales que las proteinas de levaduras. Mas estudios y analisis funcionales de los genes que se han descubierto mediante la secuenciacion de los genomas de Drosophila y C. elegans jugaran un papel muy importante en la comprensin de las formas en que estos genes actian para drgire! complejo proceso del desarrollo animal Genomas de plantas ‘Al completar la secuencia del genoma de Arabidopsis thaliana en el afo 2000 se extendié la secuenciacion genémica de los animales a los vegetales, y tue,166 @ Seccidn Il * Flujo de la informacion genética por tanto, un hecho muy importante en la biologia vegetal. Arabidopsis thaliana @s una planta sencilla, fanerégama, ampliamente utilizada como modelo en es- tudios de biologia molecular y del desarrollo de plantas. Sus ventajas como organismo modelo para la biologia molecular y la genética incluyen su genoma relativamente pequerio de aproximadamente 125 x 10° pares de bases, similar en tamaiio a los genomas de C. elegans y Drosophila. Al igual que el genoma de Drosophila, el genoma de Arabidopsis fue secuenciado principalmente me- diante el uso de vectores BAC para acomodar grandes insertos de ADN. Sorprendentemente, el andlisis del genoma de Arabidopsis indicaba que contenia aproximadamente 26.000 genes codificantes de proteina —significa vamente mas genes que los encontrados en C. elegans 0 en Drosophila—. Sin ‘embargo, este ntimero inesperadamente elevado de genes no refleja una ma- yor diversidad de proteinas codificadas por el genoma de Arabidopsis. Por el Contrario, parece que el elevado numero de genes de Arabidopsis es el resulta- do de duplicaciones de grandes segmentos del genoma de Arabidopsis. Estas duplicaciones implican aproximadamente a un 60% del genoma, de modo que el ntimero de genes codificantes de proteina diferentes en Arabidopsis se esti- ma en tomo a unos 15.000 —similar al nimero de genes en C. elegans 0 Dro- sophia La densidad génica de Arabidopsis también es similar a la de C. elegans, con secuencias codificantes de proteina responsables de aproximadamente el 25% del genoma de Arabidopsis. Como media, los genes de Arabidopsistienen aproximadamente 4 intrones, y la longitud total de las secuencias intrénicas es aproximadamente igual a la longitud total de las secuencias exdnicas. Los elementos transponibles constituyen un 10% del genoma de Arabidopsis, Al igual que en Drosophila, las repeticiones de elementos transponibles se encuentran agrupadas en los centrémeros junto con las secuencias repetitivas satélite Un andlisis comparativo de las funciones de los genes de Arabidopsis ha revelado tanto similitudes como diferencias interesantes entre los genes de ani- males y plantas. Los genes de Arabidopsis implicados en procesos celulares fundamentales como la replicacién del ADN, reparacién, transcripcién, traduc- cidn y trafico de proteinas son similares a los de las levaduras, C. elegans y Drosophila reflejando el origen evolutivo comtin de todas las células eucariti- cas. Por el contrario, los genes de Arabidopsis que codifican proteinas implica- das en procesos como la senalizacién celular y el transporte de membrana son bastante diferentes de los de las células animales, lo que es paralelo alas gran- des diferencias en cuanto a fisiologia y desarrollo entre animales y plantas. Aproximadamente una tercera parte de todos los genes de Arabidopsis parecen ser exclusivos de las plantas, ya que no se encuentran en los genomas de levaduras y animales. El grupo funcional mayor de genes de Arabidopsis, corres- pondiente a un 22% del genoma, coditica proteinas implicadas en el metabolis: mo y la fotosintesis (Fig. 4.28). Otro grupo grande de genes (12% del genoma) codifican proteinas implicadas en las defensas de la planta. También resulta notable el hecho de que Arabidopsis codifica mas de 3.000 proteinas que regu- lan fa transcripci6n (correspondiendo a un 17% del genoma). Este numero de proteinas reguladoras génicas (lactores de transcripcién) es dos o tres veces superior al encontrado en Drosophila y C. elegans, respectivamente. Muchos de los factores de transcripcién de Arabidopsis son exclusivos para plantas, teflejando presumiblemente las caracteristicas distintas de la expresion génica en el desarrollo de las plantas y en la respuesta de las plantas a su entorno. La secuencia de Arabidopsis tue seguida, en el afo 2002, por la publicacién de las secuencias borradior del genoma del arroz. El arroz es de gran importan- cia como cereal de cultivo, y es el alimento base de mas de la mitad de la poblacion mundial, de modo que la secuenciacién del genoma del arroz posee el potencial de conllevar aplicaciones muy significativas en la agricultura y bio- tecnologia. Dos grupos de investigacién han descrito secuencias borrador de los ‘genomas de dos subespecies de arroz: a subespecie indica, que es la subespe-Capitulo 4 + Organizacion y secuenciacién de los genomas celulares @ 167 Transcripcién _—_Crecimiento celular, division celular Figura 4.26 Metabolismo y yssintesis de ADN Funciones de los genes predichos de fotosintesis Arabidopsis thaliana. | diagrama lus: tra la proporcién de Arabidopsis en dite- tentes categorias funcionales. (De The ‘Arabidopsis Genome Initiative, 2000. Na- ture 408:796.) Rescate celular, datensa, _ muerte celular, envojecimiento _— Comunicacién celular’ twansduccién dea seal —— Trico de proteinas ‘Transporte intracelular ~ Biogénesis celular Transporte NS ans — Homeostasis nica cie mas ampliamente cultivada en China y la mayor parte del resto de Asia; y la subespecie japonica, que es la variedad preferida en Japon. A pesar de que ‘ambas secuencias gendmicas se encuentran actualmente en borradores en lu- {gar de en su forma completa, con muchos huecos en las secuencias que deben ser rellenados, proporcionan una gran cantidad de informacién uti Ei genoma del arroz consiste en unas 440 x 10° pares de bases de ADN —casi 4 veces mayor que el genoma de Arabidopsis. Aproximadamente un ‘45% del genoma del arroz consiste en secuencias repetitivas, incluidas repeti- ciones de secuencia sencilla y elementos transponibles. Las estimaciones de! rniimero de genes del borrador del genoma del arroz varian entre 32.000 y 50,000. Estas estimaciones difieren entre grupos de investigacién, y seran puli- das tras un mayor andlisis. De todos modos, parece que el genoma del arroz contiene mas genes que Arabidopsis, y posiblemente mas genes de los que ‘estén presentes en el genoma humano. Al igual que Arabidopsis, el arroz con- iene muchos genes duplicados (mas del 70%), que pueden haber surgido ‘como resultado de la duplicacién de grandes segmentos del genoma, Curiosa~ mente, mas del 80% de los genes identificados en Arabidopsis también se en- ‘cuenta en el arroz. Muchos de los genes compartidos entre Arabidopsis y el artoz no se encuentran en genomas de levaduras ni animales y, por lo tanto, parecen ser especificos de plantas. Ademas, muchos de los genes predichos enel arroz no poseen equivalentes en Arabidopsis, aunque todavia debe deter- minarse si estos genes «predichos» de hecho codifican proteinas. A pesar de {que siguen existiendo muchas preguntas, se espera que la complecion y anal sis continuado de la secuencia del genoma del arroz contribuya no solo a nues- tra comprensién de la biologia de plantas, sino también a mejoras en la produc- ‘ign de cereales que ayudard en la lucha contra el hambre mundial. Genoma humano Para muchos cientificos, el objetivo final del andlisis genémico era la determina- ién de la secuencia completa de nuciestidos del genoma humano: aproxima- damente 3 x 10° pares de bases de ADN. Para comprender la magnitud de este objetivo, recuerde que el genoma humano es més de diez veces mayor que el168 @ Seccidn Il * Flujo de la informacién genética 176Mb 163M 4BMb 140 Mb ; ‘0 1 ‘2 3 “4 7 1M MBM 12M 118MB 0PM sen oh Fou 4.20 Cee Sern tnsnasoe! Exige re ona mostands al paton de andes colonise despuss dla tren slogondton ih l Ce. Se 19 2 2 2 x ’ re cote sue aw 163 Mb 51 MbCapitulo 4 * Organizacién y secuenciacién de los genomas celulares @ 169 40 Drosophila; que el cromosoma humano mas pequefio es varias veces supe: rior al genoma completo de levaduras; y que la longitud extendida del ADN que compone el genoma humano es de aproximadamente 1 m de largo. Partiendc de todas estas perspectivas, la determinacién de la secuencia del genoma hu: ‘mano {ue un trabajo fendmeno, y su publicacién en forma de borrador en el arto 2001 se ha considerado como un logro cientifico de magnitud histérica. El genoma humano se distribuye a lo largo de 24 cromosomas (22 autoso- mas y 2 cromosomas sexuales), donde cada uno contiene entre 45 y 280 Mb de ADN (Fig. 4.29). Antes de la determinacién de la secuencia del genoma, varios, miles de genes humanos habian sido identificados y mapeados en posiciones de los cromosomas humanos, Un método empleado con frecuencia para local zar genes es la hibridacion in situ de sondas marcadas con colorantes fluores: centes a los cromosomas —un método generalmente denominado hibridacién de fluorescencia in situ, 0 FISH (/luorescent in situ hybridization) (Fig. 4.30). La hibridacién in situ a los cromosomas en metafase permite el mapeo de un gen clonado a un locus definido mediante una banda cromosémica. Ya que cada banda de los cromosomas metafasicos humanos contiene miles de kiloba- 0s de ADN, la hibridacién in situa cromosomas metafasicos humanos no pro- porciona la informacién de mapeo detallada obtenida con los cromosomas poli- \énicos de Drosophila, que permite la localizacién de los genes a bandas de cromosomas en interfase que contienen sélo de 10 a 20 kb de ADN. Sin embar- 90, puede obtenerse una mayor resolucién mediante la hibridacién a cromoso: mas humanos mas extendidos de células en prometafase o en interfase, permi- tiendo el uso de la hibridacién in situpara mapear genes clonados a regiones de unas 100 kb. Ademas del FISH, el andlisis de ligamiento genético y el mapeo fisico de secuencias genémicas clonadas y ADN¢c fueron utlizados para det minar los mapas fisioos y genéticos del genoma humano. En 1996, los marca- dores correspondientes a aproximadamente 30.000 genes habian sido localiza: dos en cromosomas humanos, estableciendo una base para la secuenciacion genémica (Fig. 4.31), Las secuencias borrador del genoma humano publicadas en el 2001 fueron producidas por dos grupos independientes de Investigacion. EI Internacional Human Genome Sequencing Consortium empleé clones de BAC que habian sido mapeados a sitios sobre los cromosomas humanos como susiratos para la secuenciacién. El otro, dirigido por Craig Venter de Celera Genomics, empled un método de escopeta en el que se clonaron y secuenciaron pequenos frag- Figura 4.30 Hibridacién fluorescente in situ. U ssonda fluorescent del gon que codit receptor de la lamina B se hibrida con cro- mosomas humanos de metatase tenidos (azul). Las sehales de hibrida genes simples son d rescencia roja. (C yJ.B. Lawrence, University of Massachu- setts Medical Cente Centromero: i cs Figura 4.31 Mapa transcrito del cromosoma 1 humano. Los marcadores STS de los, clones de ADNe que representan unos 30,000 genes humanos han sido mapeadis en los cromosomas humanos Se muestra un mapa ‘eromasoma 1. El histograma de la derecha ilustra la distribucion de los {genes a lo largo del cromosoma. (De Genome Maps 7, 1996. Science 274 547.)170 @ Seccion Il * Flujo de a informacion gené| Experimento clave La Secuencia del Genoma Humano J. Craig Venter y otros 273 Contexto La idea de secuenciar por completo el genoma humano fue concebida fen primer lugar a mediado de los afios 80. Inicialmente recibié un amplio escepticismo entre los bidlogos, la mayoria de los cuales pensaban que no era un proyecto factible. En ese momento, el genoa mas grande que se habia sSecuenciado por completo era el del virus de Epstein-Barr, que alcanzaba un total de aproximadamente 180.000 pares de bases de ADN. Desde esta pperspectiva, la secuenciacién del genoma, que era unas 20.000 veces mas grande, parecia inconcebible para muchos. Sin ‘embargo, la idea de un proyecto tan grande en biologia capté la ‘maginacion de otros, incluyendo a Charles DeLisi, quien estaba en ‘ese momento al mando de la Oficina de Salud ¢ Investigacion Medioambiental en el Departamento de Energia. En 1986, DeLisi consiguié lanzar la Iniciativa del Genoma Humano como un proyecto del Departamento de Energia. El proyecto obtuvo mayor apoyo en 1988, cuando fue apoyado por tun comité del Consejo Nacional de Investigacién. Este comité recomendaba un mayor esfuerzo, incluyendo la secuenciacién de genomas de varios organismos modelo y el desarrollo paralelo de mapas genéticos y fisicos de los cromosomas humanos. Este esfuerzo se centré en jos Institutos Nacionales de Salud, inicialmente bajo la direccién de James Watson (codescubridor de la estructura de! ‘ADN), y después bajo el liderazao de Frances Colins. ‘Scianca, Volumen 291, 2001, pags 1304-1351 El genoma humano ‘Secuenciacién Inicial y Analisis del Genoma Humano_ En 1998, Venter forré una Intemacional Human Genome Sequencing Consortium nueva compania, Celera ‘Nature, Volumen 409, 2001, pags 860-921 Genomics, y anuncio sus planes de ‘emplear tecnologias avanzadas de secuenciacién para obtener la ‘secuencia completa del genoma humano en 3 afios. Colins y otros lideres del proyecto genoma El primer genoma completo que _financiados con fondos paiblicos sse secuencio fue el de la bacteria _respondieron acelerando sus ‘Haemophilus influenzae, reportado _esfuerzos, resultando en una por Craig Venter y sus carrera que finalmente dio lugar ala colaboradores en 1995.Venter publicacién de dos secuencias habia formado parte del proyecto _borrador del genoma humano en de secuenciacién genémica en los febrero del 2001 Institutos Nacionales de Salud, pero habia pasado a drigir una Compania sin animo de wero, 1 -EXPerimentos Instituto para la Investigacion Los dos grupos de cientificos Genémica, en 1991. Durante este _emplearon métodos diferentes para tiempo, se habia consequido un obtener la secuencia del genoma progreso considerable en el mapeo _humano. E1 equipo financiado con del genoma humano, y la fondos publices, el intemacional secuencia inicial de H. influenzae Human Genome Sequencing fue seguida de las secuencias de Consortium, encabezado por Eric otras bacterias, levaduras y C. Lander, secuencié fragmentos de ‘elegans en 1988. ADN derivados de clones BAC que [Un genoma diana es AADN gonémico fragmentadoy clonado binoteca de un vector de Biblioteca BAC. LSBAS ER O ‘clonacién de fragmentos SP ty 8 andes (BAC) Grandes clones { Tos fragmenios de cortiguos AD N gendémico son mapeadosy | organized en un mapa ‘organizados ete secuenciado tisico. -. oe [yetones BAG indvi- |] Glonesdo 5 297A Oe SN | cle son slocine escopeta “Nae G8 fe dos y seouenciados | mediante la estrategia de Ia escopeta aleatoria, Las secuendias de los escopala eee clones son ensambiadas| para reconstruna Ensam- Secuencia dei genoma bie ae Estrategia para la secuenciacién genémica mediante clones de BAC que habian sido ‘organizades en grupos solapantes (contiguos) y mapeados a cromosomas humans.Capitulo 4 * Organizacién y secuenciacién de los genomas celulares @ 171 El genoma humano (continuacién) habian sido previamente del genoma (aproximadamente 300 modo que cada gen puede codificar mapeados a cromosomas Mb) permaneciendo sin una media de tres proteinas humanos, de forma similar al secuenciar. diferentes. Los intrones constituyen metodo empieado para determinar. Es importante reconocer que fen tomo al 25% del genoma humano, la secuencia de los genomas de _ambas versiones publicadas y las secuencias repetitivas un levadura y C. elegans (ver figura). _inicialmente son borradores, en 60%, Es notable que mas del 40% Por el contrario, el equipode Celera lugar de secuencias completadas. del ADN humano esta compuesto Genomics empled un método de. —‘Existen huecos en la secuencia, de por secuencias derivadas de la secuenciacién de escopetacon el modo que los borradores transcripcién inversa, lo que resalta ‘genoma completo, que Venter y publicados corresponden a la importancia de este modo de sus colaboradores habian ‘aproximadamente el 90% de la transferencia de informacién en la ‘empleado previamente para ssecuencia de la porcién de formacién de nuestro genoma. secuenciar el genoma de H. eucromatina del genoma. Ademas, _-Mas alla de estas conclusiones influenzae. En este método, los algunos bloques de secuencia en’ _inmediatas, la secuencia de! fragmentos de ADN se secuencian los borradores pueden estar genoma humano, junto con las aleatoriamente, y las repeticiones _incorrectamente recompuestos. Secuencias gendmicas de otros entre fragmentos se emplearon Sin embargo, las secuencias organismos, proporcionaré una para recomponer una secuencia __obtenidas de estos borradores se __ nueva base para la biologia y del genoma completo, Ambas cconsideran muy precisas, de modo _medicina en los afios venideros. €1 secuencias cubren sdlo la porcién que proporcionan un gran recurso —_ impacto de la secuencia gendmica de eucromatina del genoma para la biologia y la medicina. se sentird en o! descubrimiento de humano—aproximadamente 2.900 ‘nuevos genes y sus funciones, la Mo de ADN—con la porciénricaen Impacto comprensién de la regulacién repeticiones de la heterocromatina génica, descubrir la base de Inmediatamente surgieron muchas enfermedades humanas y ‘conclusiones importantes _desarrollar nuevas estrategias para WH a paride las secuencias la provencidn y tratamiento | del genome humano. En _basados en el fondo genético de los | primer lugar, el numero __individuos. Ei conocimiento del | de genes humanos parece —_genoma humano puede en ultima | estar entre 30.000 y instancia contribuir a alcanzar lo 40.000 —sustancialmente que Venter y sus colaboradores menor que la prediccién —_denominan «El verdadero reto de la anterior de 100.000— biologia humana... explicar cémo Resulta interesante que el__nuestras mentes han liegado a procesamiento alterativo —_organizar suficientemente sus parece ser frecuente en el __penisamientos para investigar genoma humano, de huestra propia existencia.» Evie Lander mentos, y las partes repetidas entre segmentos fueron empleadas para organi- zar la secuencia del genoma. Ambas secuencias eran inicialmente borradores incompletos, en los que aproximadamente el 90% de la porcién de eucromatina del genoma se habia secuenciado y organizado. Los esluerzos posteriores han cerrado los vacios de las secuencias borrador, dando lugar a la complecion de una secuencia del genoma humano de alta calidad en el ano 2003 La porcién de eucromatina genémica secuenciada incluye aproximadamen- te 2,9 x 10° kb de ADN (Fig. 4.32). El tamario total del genoma es de aproxima- damente 3,2 x 10° kb, donde e! 10% restante de! genoma (0,3 x 10° kb) corres: ponde a secuencias altamente repetidas de la heterocromatina. Como se ha descrito antes en este capitulo, las secuencias repetitivas dispersas, ja mayoria de las cuales son elementos transponibles que se han desplazado por el geno- ma mediante la transcripcién inversa de intermediarios de ARN, forman aproxi- madamente el 45% de la secuencia de eucromatina humana. Otro 5% del geno- ma consiste en segmentos duplicados de ADN, de modo que en tomo al 60% del genoma humano consiste en secuencias repetitivas de ADN Una gran sorpresa obtenida de las secuencias genomicas fue el numero inesperadamente bajo de genes humanos. El genoma humano parece contener sélo 30.000-40,000 genes, lo que es bastante inferior a estimaciones anteriores172 @ Seccidn Il * Flujo de la informacién genética Genes AND LN RR |) | 1 ENN 50 Figura 4.22 Secuencia del cromosoma 1 humano. Se indian las posiciones de los genes identificados en la Secuencia borrador del cromosoma 1 humano. (De Internacional Human Genome Sequencing Consortium, 2001. Nature 409:860.) Cromasome 1 ~~” ft maa 23s Me Heme mR ee a 80 Mb de aproximadamente 100.000 genes en el genoma humano, Por el contrario, parece que los humanos sdlo poseen en torno al doble del nuimero de genes que animales mas sencillos como C. elegans 0 Drosophila. De hecho, os hu- manos pueden tener menos genes que el arroz, lo que da énfasis a una de las principales conclusiones que ha surgido como resultado de la secuenciacién genémica: la complejidad biolégica de un organismo no es simplemente una funcién del numero de genes en su genoma. Por otro lado, parece existir una gran cantidad de procesamiento altemnativo en los genes humanos, permitiendo un solo gen especificar mas de una proteina (véase Fig. 4.5). Del analisis hasta la fecha, parece que el procesamiento alternative puede resultar en la formacién de tres 0 mas ARNm a partir de un gen humano promedio. Como resultado, los 30,000-40,000 genes humanos estimados codifican 100.000 0 mas proteinas diferentes. El procesamiento alternativo también tiene lugar en C. elegans y en Drosophila, pero es mucho menos frecuente que en el humano. El predominio del procesamiento alternativo en humanos puede, por lo tanto, conllevar la formacién de aproximadamente cinco veces el numero de proteinas distintas en humanos que en C. elegans 0 en Drosophila. Los genes humanos se extienden sobre distancias mucho mayores y contie- nen mas secuencias intronicas que los genes de Drosophila y C. elegans. La secuencia codificadora de proteina media en los genes humanos es de aprox madamente 1.400 pares de bases, semejante a los de Drosophila C. elegans. Sin embargo, el gen humano medio abarca unas 30 kb de ADN, donde mas del 90% correspondea intrones. Asi, aproximadamente el 25% del genoma consis- te en intrones, y sdlo del 1 al 1,5% del genoma humano corresponde a secuen- cias codficadoras de proteinas. Mas del 40% de las proteinas humanas predichas estén relacionadas con proteinas de otros organismos secuenciados, incluyendo a Drosophila y C. ele- gans. Muchas de estas proteinas conservadas funcionan en procesos celulares basicos, como el metabolismo, replicacién y reparacién del ADN, transcripcién, traduccion y trfico proteico. La mayoria de las proteinas que son exclusivas del hombre se componen de dominios proteicos que también se encuentran en otros organismos, pero estos dominios se organizan en nuevas combinaciones para dar lugar a proteinas diferentes en humanos. Comparado con Drosophila y C. elegans, el genoma humano contiene niimeros expandidos de genes implica- dos en funciones relacionadas con la mayor complejidad de los vertebrados, ‘como la respuesta inmune, el sistema nervioso y la coagulacién sanguinea, ademas de una elevacién del nimero de genes implicados en el desarrollo, sefializacidn celular y regulacion de la transcripcion. La secuencia del genoma humano, junto con las secuencias de otros geno- mas, proporciona una riqueza de informacién que forma un nuevo marco para los estudios de biologia celular y molecular. Tal y como se evidenciara en los capitulos sucesivos, nuevos genes implicados en muchos procesos celulares podréin identificarse mediante el andlisis de la secuencia genémica y su compaCapitulo 4 © Organizacion y secuenciacién de los genomas celulares @ 173 racién con las secuencias de otros organisms. La exploraciGn de las funciones de estos genes, al igual que de muchos genes nuevos descubiertos por la se- ‘cuenciacién genémica, formara la base de muchos estudios de funcién celular en los préximos anos. La disponibilidad de la secuencia del genoma humano también tendra grandes aplicaciones ayudando a descubrir nuevos genes impli- cados en muchas enfermedades que afigen a la humanidad, incluyendo el can- cer, enfermedades cardiacas y enfermedades degenerativas del sistema ner- vioso, como la enfermedad de Parkinson o de Alzheimer. Descifrar la secuencia del genoma humano revelard no sélo las secuencias, codilicantes de proteina de los genes, sino también las secuencias reguladoras que controlan la expresin génica. Tal y como se analiza en capitulos sucesi vos, la regulacion de la expresion génica es critica para muchos aspectos de la funcién celular, incluyendo el desarrollo de jos organismos mutticelulares com plejos. La comprensi6n de los mecanismos que controlan la expresién génica es un gran reto de la biologia celular y molecular contemporanea, y se espera {que la disponibilidad de secuencias genémicas contribuyan considerablemente a este trabajo. Desgraciadamente, actualmente es mucho mas dificil identificar las secuencias reguladoras génicas que las secuencias codificadoras de protei ras, especialmente en genomas grandes como el humano. Probablemente di- chos estudios estaran faciltados por la comparacion de secuencias genémicas de organismos relacionados. Por ejemplo, la secuencia recientemente comple- tada del genoma del ratén indica, como se esperaba, una gran cantidad de conservacién entre las secuencias codificadoras de proteinas de! humano y el raton. Una conservacién parecida de las secuencias reguladoras génicas pue- de ayudar a determinar dichas secuencias y comprender su funcion, La disponibilidad de secuencias genémicas adicionales de especies estre: chamente relacionadas también nos permitira estuciar la base de las diferen- cias entre especies. Por ejemplo, pronto podremos comparar el genoma huma no no sdlo con el de invertebrados como Drosophila 0 C. elegans, sino también con el de otros mamiferos, como el ratén, y con otros primates, como el chim- paneé, Adicionalmente, podremos comparar las secuencias de diferentes indi- viduos entre si. Los genomas de humans individuales se diferencian en una de cada mil bases. El andlisis de estas variaciones entre individuos permitiré aso- ciar genes especiticos con la susceptibilidad a ciertas enfermedades, y permiti- ra los médicos elaborar estrategias para prevenir y tratar enfermedades espe- cificas para el fondo genético de pacientes individuales. La comparacion entre genomas de diferentes individuos también puede ayudar a elucidar la contribu- cidn de nuestros genes a otras caracteristicas tinicas, como la capacidad atléti- ca ola inteligencia, y a comprender mejor las interacciones entre los genes y el ambiente que desencadena los complejos comportamientos humanos, COMPLEJIDAD DE LOS GENOMAS EUCARIOTAS Intrones y exones: La mayoria de los genes eucariotas presentan una es- _Gen, secuencia espacial, ex6n,intrén tructura dividida en la que los segmentos de secuencias codificadoras 0 co- _—empalme o splicing del ARN, kilobase (kb), procesamiento alternative dificantes (exones) estan interrumpidas por secuencias no codificadoras (in- trones). En los eucariotas complejos, los intrones representan unas diez veces mas ADN que los exones. ‘Secuencias repetitivas de ADN: Aproximadamente el 40% del ADN de los _—Repeticion de secuencia senciia, ADN mamiferos consiste en secuencias de ADN altamente repetitivas, algunas de _sallite, SINE, LINE, retrotransposon las cuales estén presentes en 10° y 10° copias por genoma. Estas secuen- acelin clas incluyen las repeticiones de secuencia sencilla y los elementos repetiti- vvos que se han desplazado a través del genoma mediante intermediarios de ARN 0 ADN.174 @ Seccidn Il * Flujo de la informacion genética Familia génica, pseudogén, pseudegén _-Duplicacién génica y pseudogenes: Muchos genes eucaristicos estan Procesado —_presentes en multiples copias, denominadas familias génicas, que han surgi do por duplicacién de genes ancestrales. Algunos miembros de las familias g6nicas funcionan en tejidos diferentes o durante distintas fases del desarro- lio. Otros miembros de las familias génicas (pseudogenes) han sido inactiva- dos por mutaciones y ya no representan genes funcionales. Las duplicacio- nes génicas pueden ocurtir tanto por duplicacién de un segmento de ADN como por transcripcién inversa de un ARNm, dando lugar a un pseudogén procesado. Aproximadamente el 5% del genoma humano consiste en seg- mentos de ADN duplicados. Adicionalmente, se estima que existen varios miles de pseudogenes procesados en el genoma humano. Composicién de los genomas de los eucariotas superiores: Sdlo una Pequefia fraccién de! genoma en los eucariotas complejos corresponde a secuencias codificadoras de proteina. El genoma humano se estima que contiene 30,000-40,000 genes, donde la secuencia codificadora de proteina corresponde solamente al 1-1,5% del ADN. Aproximadamente el 25% del genoma humano consiste en intrones, y mas del 60% esté compuesto por secuencias de ADN repetitivas y duplicadas. CROMOSOMAS Y CROMATINA Cromatina: El ADN de las células eucariotas se encuentra envuelto por his: tonas que forman nucleosomas. La cromatina se puede compactar atin mas mediante el plegamiento de los nucleosomas en estructuras altamente orde- nadas, incluyendo la condensacién de los cromosomas en metafase de las células entrando en mitosis. Centrémero, cinetocoro -—-Centrémeros: Los centrémeros son regiones especializadas de los cromo: ‘somas eucariotas que sirven como sitios de asociacién entre las cromati- das hermanas y como sitios de adhesién de las fibras del huso durante la mitosis. Telomero __Te/meros: Los telémeros son secuencias especializadas necesarias para el mantenimiento de los extremos de los cromosomas eucariotas. Bioinformitica SECUENCIAS DE GENOMAS COMPLETOS Megabase (Wb), marco abierto detectura _--»« Genomas procariotas: Los genomas de cerca de una docena de bacterias, fase delectura abierta ——_incluyendo E. col, ya han sido completamente secuenciadas. El genoma de E. colicontiene 4.288 genes, con secuencias codificadoras de proteinas que tepresentan casi el 90% del ADN. ‘Secuenciacién del genoma de levaduras: El primer genoma eucariota en ser secuenciado fue el de S. cerevisiae. El genoma de las levaduras contie- ne unos 6.000 genes, y las secuencias codificadoras de proteinas represen- tan aproximadamente el 70% del genoma. El genoma de la levadura de fi- sién S. pombe contiene menos genes (unos 5.000) y mds intrones que S. cerevisiae, donde la secuencia codificadora de proteinas corresponde a aproximadamente el 60% del genoma de S. pombe. Cromosoma antficlal de levaduras. —-»- Genomas de Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster: E! ge- (YAC), cromosoma politénice, noma de C. elegans fue el primer genoma secuenciado de un organismo cromosoma artical bacteriano (BAC) myjticelular. El genoma de C. elegans contiene unas 19.000 secuencias co- dificadoras de proteina, que corresponden solamente al 25% del genoma. El genoma de Drosophila contiene aproximadamente 13.600 genes, con se- cuencias codificadoras de proteina correspondiendo al 13% del genoma. A pesar de que Drosophila contiene menos genes que C. elegans, muchos genes en ambas especies estén duplicados, y parece que ambas especies contienen de 8.000 a 9.000 genes Unicos. Algunos de estos genes estanCapitulo 4 * Organizacién y secuenciacién de los genomas celulares © 175 ‘compartidos por Drosophilay C. elegans, y levaduras —estos genes pueden codificar proteinas con funciones comunes a todas las oélulas eucariotas. Sin embargo, la mayoria de los genes de Drosophila y C. elegans no se ‘encuentran en levaduras y probablemente funcionan en la regulacion y de- sarrollo de los animales multicelulares, Genomas de plantas: E| genoma de la pequefia planta angiosperma Arabi- dopsis thaliana contiene aproximadamente 26.000 genes —curiosamente mas genes de los encontrados en Drosophila o en C. elegans. Sin embargo, muchos de estos genes son el resultado de duplicaciones de grandes seg- mentos del genoma de Arabidopsis, de modo que el ntimero de genes uni- cos en Arabidopsis es de unos 15.000, Muchos de estos genes son exclusi- vos de plantas, incluyendo genes implicados en la fisiologia, desarrollo y defensa de la planta. La secuencia del genoma del arroz es de especial inte- 16s para la agricultura porque el arroz es el alimento base de més de la mitad de la poblacién mundial. La secuencia borrador del genoma del arroz estima que contiene entre 30.000 y 50.000 genes, muchos de los cuales estan du- plicados y pueden haber surgido por la duplicacion de grandes segmentos del genoma. El genoma humano: El genoma humano parece contener 30.000-40.000 genes —sélo el doble del ntimero de genes encontrados en animales mas sencillos como Drosophila 0 C. elegans. Sin embargo, el procesamiento al- temativo parece ser frecuente en el humano, y puede resultar en la produc- cién de tres o més ARNm (y proteinas) a partir de un gen promedio. Mas del 40% de las proteinas humanas predichas estan relacionadas con proteinas encontradas en otros organismos secuenciados, incluyendo Drosophila y C. elegans. Ademés, el genoma humano contiene niimeros expandidos de ge- nes implicados en el sistema nervioso, el sistema inmune, la coagulacion sanguinea, el desarrollo, la sefializacién celular y la regulacién de la expre- sién génica. Preguntas 1. Muchos organismos poseen microtUbulos de! huso. ,Cémo se tamafios de gonoma que son mucho mayoras de lo que su complejidad parece requerir. Explica esta paradoia. 2. {Cémo fueron descubierios los invones y exones durante ios estudios de ARNm de adenovirus? 3. {Cua es la importancia del procesamiento altemativo? 4, {Como puede separarse el ADN repetitive de secuencia sencilla del resto del ADN nuclear? 8. ;Cudl es la diferencia entre un centrémero y el cinetécoro? 6. Los centromeros de levaduras forman un cinetécoro que se une a un solo microtdbulo, mientras que la mayoria de los animales poseen cinetécoros que se unen a unos 20 reflejan estas diferencias en la estructura de sus contrémeros? 7. 5' La sintesis procede Con la incorporacién de la base correcta (A) 8 g Figura 5.12 Doble lectura de la ADN polimerasa. Se incorpota G en lugar de A como resultado de un mal apareamiento.con T en la hebra molde. Debido a este mal apareamiento, la G del extremo 3 terminal no se une me- diante enlaces de hidrégeno a la hebra molde. Este error de emparejamiento on el extremo 3’ de la cadena en crecimiento ‘8 racanocido y eliminado por Ia actividad exonucleasa 3°5' de la ADN polimerasa, quien necesita para continuar la sintesis tun oebador unido por puentes de hicroge- no ala hebra mode, Tras la escisiOn de la G desapareada, a sintesis de ADN cont- nua con la incoporacién del nuclestido correcta (A), Fidelidad de replicacién La exactitud de la replicacion del ADN es critica para la reproduccion celular, y las estimaciones de mutacién para una variedad de genes indican que la fre cuencia de errores durante la replicacién corresponde tan solo a una base inco- rrecta por cada 10° a 10°° nuclestidos incorporados. Esta frecuencia de error es mucho menor que la predicha simplemente a causa del apareamiento de las bases complementarias, En particular, las diferencias de energia libre resultan: tes de cambios entre los enlaces de hidrogeno establecidos entre bases empa- rejadas correcta e incorrectamente, solo son lo suficientemente grandes como para favorecer la formacién de pares de bases emparejadas correctamente unas 1.000 veces. Como consecuencia, la seleccién de las bases determinada simplemente por los enlaces de hidrégeno entre bases complementarias, resul- taria en una frecuencia de error correspondiente a la incorporacién de aprox: madamente una base incorrecta por cada 10°. El alto grado de fidelided real- mente alcanzado es el resultado de las actividades de la ADN polimerasa. Uno de los mecanismos por los que la ADN polimerasa aumenta la fidelidad de la replicacién es ayudando a seleccionar la base correcta para la insercién enel nuevo ADN sintetizado. La polimerasa no solo cataliza la incorporacién de cualquier nuclestido unio por un puente de hidrégeno a la hebra moide. En su lugar. discrimina activamente en contra de la incorporacién de una base desa- pareada, presumiblemente mediante la adaptacién de la conformacion de un ar de bases correcto. El mecanismo molecular responsable de la capacidad de las ADN polimerasas para seleccionar en contra de bases incorrectas alin no se ha descitrado, pero esta seleccién parece aumentar la exactitud de la replica- cidn alrededor de cien veces, reduciendo la frecuencia de error esperada de 10 aproximadamente a 10° El otro mecanismo principal responsable de la exactitud de la replicacion del ADN es la actividad de doble lectura de la ADN polimerasa. Como ya hemos dicho, la polimerasa I de E. colitiene una actividad exonucleasa 3’a Sy 5’ a3 Laexonucleasa de 5’a 3 opera en la direccién de la sintesis de ADN y ayuda a eliminar los cebadores de ARN de los fragmentos de Okazaki. La exonucieasa de 3 a Sopera en cireccién opuesta a la sintesis de ADN, y participa en la doble lectura del nuevo ADN sintetizado (Fig. 5.12). La doble lectura es efectiva porque la ADN polimerasa necesita un cebador y no es capaz de iniciar la sintesis de novo. Los iniciadores que estan unidos por puentes de hidrégeno al molde son los preferidos para su utilizacién, asi que cuando una base incorrecta es incorpo- rada, se eliminard por la actividad de la exonucleasa 3' a 5’ en lugar de continuar la sintesis. Tales actividades de las exonucleasas 3' a Stambién se encuentran asociadas a la polimerasa Ill de E. coy a las polimerasas eucariotas 6 y :. Las exonucleasas 3’ a Side estas polimerasas escinden selectivamente las bases de- sapareadas que han sido incorporadas al final de una cadena de ADN en creci mmiento, por lo que aumenta la exactitud de la replicacion de cien a mil veces més. La importancia de la doble lectura podria explicar el hecho de que las ADN polimerasas necesitan cebadores y que catalizan el crecimiento de las hebras de ADN solamente en el sentido 5’ a 3’. Cuando el ADN se sintetiza en el senti- do 5’ a 3, la energia necesaria para la polimerizacion se deriva de la hidrdlisis del grupo 5-trifosfato de un dNTP libre y es afadido al grupo 3'-hidroxilo de la cadena creciente (véase Fig. 5.2). Si el ADN se tuviera que extender en sentido 3° 25;, la energia de polimerizacién tendria que derivarse de la hidrdlisis del grupo 5 -trifosfato del nucledtido terminal recién incorporado al ADN. Esto elim naria la posibilidad de la doble lectura, debido a que la eliminacién de un nucles- tido terminal desapareado también eliminaria al grupo 5'-trifostato necesario como fuente de energia para la elongacién de la cadena. Por tanto, aunque la capacidad de la ADN polimerasa para extender un cebador en sentido 5’ a 3pa- rece hacer a la replicacién un proceso complicado, resulta necesario para ase- gurar la duplicacién exacta del material genético.Capitulo 5 © Replicacién, mantenimiento y reorganizacion del ADN gendmico © 189 ‘Combinada con la capacidad de discriminar en contra de la insercién de bases desapareadas, la actividad de doble lectura de las ADN polimerasas es suficiente para reducir la frecuencia de error de replicacién a alrededor de una base desapareada por cada 10’. Mecanismos adicionales (discutidos en la sec- cién «Reparacién del ADN») actuan para eliminar las bases desemparejadas que han sido incorporadas en el nuevo ADN sintetizado, asegurando asi aun mas la correcta replicacién de la informacién genética, Origenes e iniciacién de la replicacién La replicacién del ADN procariota y eucariota comienza en una nica secuencia llamada origen de replicacién, que sirve como un sitio especitico de unién para proteinas que inician el proceso de replicacién. El primer origen descrito fue el de E. coli, en cuyo analisis genético mostraba que la replicacion siempre ‘empezaba en un tinico sitio del cromosoma bacteriano. El origen de E. coli se ha estudiado en detalle y se sabe que se compone de 245 pares de bases de ADN, elementos que sirven como sitios de unin para las proteinas necesarias para iniciar la replicacién del ADN (Fig. 5.13). El paso clave es la unién de una proteina iniciadora a secuencias especiticas del ADN dentro del origen. La pro- {eina iniciadora comienza desenrollando el origen del ADN y recluta a las otras proteinas implicadas en la sintesis del ADN. La helicasa junto con proteinas de unién al ADN monocatenario continuan desenrollando y presentando al ADN molde, y la primasa inicia la sintesis de las hebras conductoras. Se forman dos horquillas de replicacién que se mueven en sentidos opuestos @ lo largo del ‘cromosoma circular de E. col. El origen de la replicacién en los virus de animales, como el SV40, se ha estudiado como modelo para la iniciacién de la sintesis en eucariotas. SV40 presenta un solo origen de replicacién (consiste en 64 pares de bases) que funciona tanto en células infectadas como en sistemas libres de células, La replicacién comienza por una proteina codificada por el virus (llamada antigeno T) quo se une al origen y que acta como helicasa. Se requiere una proteina de unién al ADN monocatenario para estabilizar a la hebra molde desenroliada. y tun complejo ADN polimerasa z-primasa comienza entonces la sintesis de ADN. ‘Aunque resulta suficiente un solo origen para dirigir la replicacién de geno- mas bacterianos y virales, se necesitan multiples origenes para replicar los ge~ nomas mds largos de las células eucariotas en un periodo de tiempo razonable. Por ejemplo, el genoma completo de E. colf(4 x 10° pares de bases) se replica partiendo de un solo origen en unos 30 minutos. Si os genomas de mamiferos (3x 10® pares de bases) se replicaran a partir de un solo origen esto requeriria Figura $13 Origen de la replicacion de E. coli. La replicacién se inicia en un Unico sitio del eromo- soma de E. coll, denominado origen (or), El primer acontecimiento es la union de una proteina iniciadora al ADN oi, que conduce el desenrollamiento parcial del moide. EI ADN Continia desenrallandase dabido a la accion de la helicasa y de las proteinas de union al ‘ADN de hebra simple, mientras que los cebadores son sintetizados por la primasa. Las dos horquilas de roplicacion formadas en el origen se mueven en direcciones opuestas a lo largo de la motécula de ADN circular. Cebadorde ARN. __ Proteinas de union Helicasa A a BON de hebra Iniciador simple Sintesis de los cobadores @ de ARN, — ss —+ Union de Desenrollamianto’ Formacién de la proteina {del ADN por os horquillas iniciadora lahelicasa y de replicacién las proteinas de unién al ADN do hebra simple190 © Seccidn Il * Flujo de la informacion genética Figura 5.14 ‘Origones de roplicacién en los cromo- ‘somas eucariotas. La replicacion se ini- cia en multiples origenes (or), cada uno de los cuales produce dos horquillas de replicacion, alrededor de 3 semanas (30.000 minutos). El problema se exacerba por el hecho de que el ritmo de la replicacion del ADN en las células de mamiferos es diez veces ‘menor que en E. col posiblemente como resultado del empaquetamiento del ADN eucariota en cromatina. No obstante, el genoma de las células de mamiferos se replica en pocas horas, necesitando el uso de miles de origenes de replicacion. La presencia de multiples origenes de replicacién en las células eucariotas se demostré por primera vez mediante la exposicién de un cultivo de células de mamiferos a timidina radiactiva durante intervalos de tiempo diferentes, segui- do de una autorradiografia para detectar el ADN recién sintetizado, Los resulta- dos de estos estudios indicaron que la sintesis de ADN se inicia en multiples sitios, desde donde se prosigue en ambas direcciones a Io largo del cromosoma (Fig. 5.14). Los origenes de replicacién de las células de mamiteros se encuen- tran separados por intervalos de 50 a 300 kb aproximadamente; por lo que el genoma humano tiene alrededor de 30.000 origenes de replicacidn. Los geno- mas de eucariotas simples también tienen multiples origenes; por ejemplo, la replicacion en levaduras se inicia en origenes separados por unas 40 kb Los origenes de replicacion de los cromosomas eucariotas han sido estudiados enlevaduras, en las que se han identificado como secuencias que pueden soportar la replicacion de plasmidos en células transformadas (Fig. 5.15). Esto ha proporcio- nado un ensayo funcional para estas secuencias, y el aislamiento de otros muchos elementos (llamados secuencias de replicacién auténoma, 0 ARSS, por las si- glas del inglés autonomously replicating sequences). El papel de los origenes de replicacién se ha vericado por un anlisis bioquimico directo, no solo en plésmi- dos sino también en el ADN cromosémico de levaduras, Los elementos funcionales ARS se expanden alredador de 100 pares de bases, incluyendo una secuencia central de 11 pares de bases comin a mu- chos ARS diferentes (Fig. 5.16). Esta secuencia central es esencial para la fun- cién de los elementos ARS y se sabe que es el sitio de union para un complejo (llamado complejo del origen de replicacién, 0 ORC, origin replication com- plex) que es necesario para la iniciacién de la replicacion del ADN en los orige- nes de las levaduras. El complejo ORC parece reclutar a otras proteinas (inclui- das ADN helicasas) en el origen, lo que conduce a iniciar la replicacion. El mecanismo de iniciacién de la replicacién del ADN en levaduras parece por tanto similar al de los virus procariotas y eucariotas; es decir, una proteina de iniciacién se une especificamente a las secuencias de origen. Estudios subsiguientes han demostrado que el papel de las proteinas ORC como iniciadores de la replicacién esta conservado en todos los eucariotas, desde las levaduras hasta los mamiferos. Sin embargo, los origenes de replica: cién de otros eucariotas estan mucho peor definidos que los elementos ARS de S. cerevisiae. En la levadura de fisién S. pombe, las secuencias de origen se encuentran dispersas sobre aproximadamente 1 kb de ADN. Los origenes de BURRESS NORTE NENA la replicacion Ac Horquillas moviendose ADN recién Horus movin ee |: eccore puenaeCapitulo § * Replicacién, mantenimiento y reorganizacién del ADN genémico @ 191 | Cus tanstormaddas de evasuras OO 6@ ‘ (~~) ) Células transformadas (oe levaduras | wer | Placa en un medio carento de lucina ‘Se obtienen slo células transformadas raras en las que el plésmido se ha integrado fon el ADN cramasémico S. pombe carecen del sitio de unién claramente definido para ORC que poseen los elementos ARS de S. cerevisiae, pero contienen repeticiones de secuencias ricas en AT que parecen actuar como puntos de union para el complejo ORC de S. pombe. Se ha encontrado que un origen de replicacién de Drosophila abarca 2 kb de ADN y contiene varios puntos de unién de ORC, pero estas secuencias no se han definido. En mamiferos, algunos origenes se han localizado en pocas kb de ADN. En otros casos, sin embargo, la replicacion puede iniciarse en muiti- ples origenes con grandes «zonas de iniciacién que abarcan de 10 a 50 kb. Asi, parece que las secuencias que definen los origenes de replicacion varian mucho entre eucariotas, aunque el papel de las proteinas ORC como iniciado- res de replicacién se encuentra altamente conservado. Telémeros y telomerasa: replicacién de los extremos de los cromosomas Debido a que las ADN polimerasas sélo extienden los cabadores en sentido de 5! a3, son incapaces de copiar los extremos 5° de las moléculas lineales de Placa en un meio carente de leucina, SS Nv ootonias de Y levaduras lwanstormagas CObtencion de numerosas cclulas transtormadas debido fa que el plasmido se replica sin integracion en fl cromosoma Figura 5.15 Identificacion de los origenes de repli- ‘cacién en levaduras. Los piasinidos ly I ccontienen un gen marcador selectivo (LEU 2) que permite a las células transtormadas ‘erecer en un medio carente de leucina, So- lamente el plésmido II contiene un origen de replicacion (ARS). La transformacion de las levaduras con el plasmido | produce ex: Clusivamente células transformadas raras fen las que el plasmido se ha integrado en e| AON cromosdmico. El plasmido I, sin embargo, es capaz de replicarse sin la in tegracién en el cromosoma de la levadura (replicacién auténoma), de manera que se obliene un numero mayor de celulas trans- formadas a parir de su introduccién en las ‘células de levaduras.192 @ Seccién Il © Flujo de la informacion genética Figura $.16 Elemento ARS de leveduras. El cle- mento contiene una secuencia consenso [ARS co 11 pares de bases (ACS), que es el sitiode union especitico para el comple- jo del origen de replicacién (ORC). Otros tres elementos adicionales (B1, B2 y 83) que individualmente no son esenciales, contribuyen a la funcién de ARS. ADN (ATTyTTTATICNAGTTTAT) ADN. Como consecuencia, se requieren mecanismos especiales para replicar las secuencias terminales de los cromosomas lineales de las células eucario- tas. Estas secuencias (telémeros) se componen de repeticiones en tandem de secuencias simples de ADN (véase Cap. 4). Son replicadas por la accion de una encima tinica llamada telomerasa, que es capaz de mantener a los telémeros calalizando de su sintesis en ausencia de una hebra mokde de ADN. La telomerasa es una transcriptasa inversa, una de las clases de las ADN polimerasas, descubiertas por primera vez en retrovirus (véase Cap. 3), que sintetizan ADN a partir de un molde de ARN. Cabe destacar que la telomerasa porta su propio molde de ARN, que es complementario a las secuencias repeti- das de los telomeros, como parte del complejo enzimatico. El uso de este ARN como molde permite a la telomerasa generar multiples copias de las secuencias repetidas teloméricas, manteniendo por tanto a los telémeros en la ausencia de un molde de ADN convencional para dirigir su sintesis. EI mecanismo de accién de la telomerasa fue descubierto en 1985 por Carol Greider y Elisabeth Blackburn con los estudios del protozoo Tetrahy- mena (Fig. 5.17). La telomerasa de Tetrahymena esta unida a un ARN de 159-nucledtidos de longitud que incluye la secuencia 3-AACCCCAAC-5 Esta secuencia es complementaria a la repeticion telémerica de Tetrahymena (6-TTGGGG-3)) y sirve como molde para la sintesis del ADN telomérico. La utllizacion de este ARN como molde permite a la telomerasa extender el extremo 3' del ADN cromosémico una unidad de repeticion detras de su longi iud original. La hebra complementaria puede ser entonces sintetizada por el complejo polimerasa »-primasa utilizando como iniciador al ARN convencional Lacliminacién de los ARN cebadores deja un extremo 3’ del ADN cromosémico suelto, que puede formar lazos al final de los cromosomas eucariotas (véase Fig. 4.22). La telomerasa ha sido identificada en una gran variedad de eucariotas, y los genes codificadores de los ARN de ésta se han clonado en Tretahymena, levadu- ras, raiones y humanos. En cada caso, el ARN de ia telomerasa contiene secuen- clas complementarias a la secuencia telomérica repetida de este organismo (véase Tabla 4.3). Ademds, la introduccién de genes mutantes del ARN de la telomera- sa en levaduras han dado como resultado alteraciones correspondientes a las secuencias cromosémicas teloméricas repetidas, demostrando directamente la funcién de la telomerasa en el mantenimiento de los extremos de los cromoso- mas eucariotas. Reparacién del ADN EIADN, como cualquier otra molécula, es capaz de participar en diversas reac- clones quimicas. Debido a que solo el ADN sitve de copia permanente del geno- ‘ma celular los cambios en su estructura tienen mas transcendencia que altera- ciones en otros componentes celulares, como el ARN o las proteinas. Las mutaciones pueden surgir de la incorporacién de bases incorrectas durante la replicacion del ADN. Ademas, se producen diversos cambios bien espontaneosCapitulo 5 © Replicacién, mantenimiento y reorganizacion del ADN gendmico @ 193 Figura $8.17 ‘Acci6n de la telomerasa. El ADN telo- mérico es una secuencia repetida simple ‘con un extramo 3’ sueito en la hebra con- Guctora recién sintetizada. La telomerasa lleva consigo su propia molécula de ARN, ADN telomérico ‘con el extremo 3 sueto obra tara rin ‘que es complementaria al ADN telorér sintetzada 60, como parte del complejo enzimatico. Unién a la ARN El extremo suelto del ADN telomerico se telomerasa tne al ARN de la telomerasa, que iuego servird como molde para la extension de la hebra conductora en una unidad mas {de repeticion. La hebra tardia dol ADN te- lomérico puede ser a su vez sintetizada ‘mediante iniciacién convencional de ARN. ¥y actividad polimerasa del AON. Actividad transcriptasa inversa de la tolomerasa Exiremo 3' de la hebra 5 conductora extondida en ‘una unidad de repeticion Extonsién de la hebra tardia por la primasa y polimerasa SOoeeOeeewe elclalaleleleletala Eliminacion del cebador de ARN SSSbbeoooo blelelelalalelelelels (Fig. 5.18) 0 como resultado de la exposicién a agentes quimicos o radiacion (Fig. 5.19). Este tipo de dafios en el ADN pueden bloquear la replicacién 0 la {ranscripcién, pudiendo dar lugar @ una alta frecuencia de mutaciones-conse- ccuencias que son inaceptables desde el punto de vista de la reproduccién celu- lar. Para mantener la integridad de sus genomas, las células han tenido por é By aa ooooueo alalelelelelalate e ie ¢ 5) ADN telomético fextensido en una ‘unidad de repeticion194 @ Seccién Il * Flujo de la informacién genética Figura 5.18 Dano espontineo del ADN. Existen dos formas fundamentales de dafio esponta- neo del ADN: (A) desaminacién de adeni- na, citosina y guanina, y (B) depurinacién (pérdida de bases de purina) acausa dela rotura del enlace entre las bases de purina y la desoxiribosa, dejando un sitio apuri- nico (AP) en el ADN. dGMP = desoxigua- nosina monotosfato, tanto que desarrollar mecanismos de reparacién del ADN danado. Estos meca- nismos de reparacién del ADN se pueden dividir en dos ciases principales: (1) inversidn directa de la reaccién quimica responsable del dano al ADN, y (2) eliminacién de las bases dafiadas seguida de su reposicién con ADN recién sintetizado. Allé donde la reparacion del ADN falla, las células han desarrollado mecanismos adicionales que permiten a estas acabar con los dafios. Inversién directa del ADN daiiado Lamayoria de los dafos producidos en el ADN son reparados mediante la el nnacién de las bases dafadas seguida de la sintesis de la region escindida. Algu nas lesiones en al ADN, sin embargo, se pueden reparar mediante inversion directa del dafio, pudiendo ser un camino mas eficiente a la hora de tratar con tipos especificos de dafos al ADN que se dan con frecuencia. Tan solo ciertos tipos de dafos al ADN se reparan de esta forma, en particular los dimeros de pirimidina que resultan de la exposicion a la luz ultravioleta (UV) y los residuos de guanina alquilada que se han modificado por la adicién de grupos metilos y atilos en la posicion O° del anillo de purina. La luz UV es una de las fuentes mas importantes de dafio al ADN y también esla forma mas estudiada de ADN dafiado en términos de mecanismos de repa- (A) Desaminacisn Adenina Hipoxantina| (8) Depurinacion Cadena de ADN Sitio APCapitulo 5 * Replicacién, mantenimiento y reorganizacién del ADN gendmico @ 195 (A) Exposicion a la uz UV Timinas adyacentes en el ADN (B) Alquilacion ah HI of \ ne” 30 we aL eH HOR 3 On, Guanina 0®-metiquanina (C) Reaceion con un earcinogeno _Bielobutano Dimero de timina ‘Adicion de un grupo voluminoso raci6n. Su importancia se ilustra por el hecho de que la exposicién a la radiacion solar UV es la causa de la mayoria de los canceres de piel humanos. EI principal tipo de dario inducido por la luz UV es la formacién de dimeros de pirimidina, en los que las pirimidinas adyacentes en la misma hebra de ADN estan unidas por la formacién de un anillo de ciclobutano que resulta de la saturacién de los dobles enlaces entre el carbono 5 y el 6 (véase Fig. 5.19A), La formacion de dichos dimeros distorsiona la estructura de la cadena de ADN y bioquea la transcripcion co replicacion al pasar por el dafio, de manera que su reparacién esta relacionada con la capacidad de las células para sobrevivir a la radiacién. Uno de los meca- nismos de reparacién de los dimeros de pirimidina inducidos por UV es la inver- sion directa de la reaccién de dimerizacién. El proceso se denomina fotorreacti- vacién puesto que la energia derivada de la luz visible se utiliza para romper el anillo ciclobutano (Fig. 5.20). Las bases originales de pirimidina continuian en el ADN, ahora repuestas a su estado normal. Tal y como se esperaria del hecho de HN, oH ‘oH on Figura 5.19 Ejemplos de dafios al ADN inducidos por radiacién y agentes quimicos. (A) La luz UV induce la formacién de dimeros de pirimidina, en los que dos. pirimicinas adyacentes (p. e)..timinas) se unen me- diante un ciclobutano en estructura de anillo. (B) La alquiacion es la adicion de {grupos matio o etila en posiciones diver- sas en las bases de ADN. En este ejem: Plo, la alquilacion de a guanina en posi ign O° da lugar a la formacion de una O°- ‘metiiguanina. (C) Muchos carcinogenos (p. e., benzo-(a)pireno) reaccionan con las bases del ADN, produciendo la adicion de grupos quimicos voluminosos a la mo- lecula de ADN,196 @ Seccion II * Flujo de la informacion genética Dimero de timina Luz Enzima fotorteactivadora mina. Los dimeros de timina inducidos porla radiacién UV se pueden reparar me- slante fotorreactivacion, en la que la ener- gia procedente de la luz visible se utiliza para dividir los enlaces formados en el anillo de ciclobutano. Figura 5.21 Reparacién de una O'-metilguanina. Una O"-metiiguanina metitransferasa trans- fiere el grupo metilo de la O°-metiiguanina ‘un residuo de cisteina en el sitio de act- vacién de la enzima, que la radiacién solar UV es la fuente principal de dafios al ADN en diversos tipos de células, la reparacién por fotoactivacién de los dimeros de pirimidina es comtin en una variedad de células procariotas y eucariotas, incluyendo E, coli, levadu- ras, y algunas especies de plantas y animales. Curiosamente, sin embargo, la fotorreactivacion no es universal; muchas especies (incluyendo los humanos) carecen de este mecanismo de reparacién del ADN. Otra forma de reparacién directa corresponde al dafio producido por la reac- ci6n entre agentes alquilantes y el ADN. Los agentes alquilantes son compues- tos reactivos que son capaces de transferir grupos metilo y etilo a una base de ADN, modificando por tanto quimicamente la base (véase Fig. 5.20B). Un tipo de dafio particularmente importante es la metilacion de la guanina en posicién O°, debido a que el producto, O°-metilguanina, forma pares de bases complementa- rias con timina en lugar de citosina. Esta lesion puede ser reparada por una enzi- ma (llamada O*-metilguanina metiltransterasa) que transfiere e| grupo metilo desde la O°-metiiguanina al sitio activo de un residuo de cisteina (Fig. 5.21). Por tanto se elimina la modificacién quimica mutagénica potencial, y se restaura la guanina original. Las enzimas que catalizan esta reaccién directa de reparacién se encuentran en abundancia en procariotas y eucariotas, incluidos los humanos. Reparacién por escision ‘Aunque la reparacién directa es una manera eficiente de tratar con tipos particu- lares de dafios al ADN, la reparacién por escisién abarca la reparacion de gran variedad de alteraciones quimicas en el ADN. En consecuencia, los diferentes tipos de reparacién por escisién son los mecanismos mas importantes de repara- HOH O-metilguanina metitransterasaCapitulo 5 * Replicacién, mantenimiento y reorganizacién del ADN genémico @ 197 cién del ADN en las células procariotas y eucariotas. En la reparacién por esci- sidn, el ADN dafiado es reconoeido y eliminado, como bases independientes 0 como nucledtides. El espacio vacio generado se rellena con la sintesis de una nueva hebra de ADN, utilizando la hebra complementaria no dafiada como mol- de. Los tres tipos de reparacién por escisién —reparaci6n por escisién de base, reparacién por escisién de nuclestido y reparacién del desapareamiento— pet ten a las células resolver una variedad de tipos diferentes de ADN daniado. La reparacion de un ADN que contiene uracilo es un buen ejemplo de la repara- cidn por escision de base, en la que bases dafiadas de forma tinica son recono- cidas y eliminadas de la molécula de ADN (Fig. 5.22). El uracilo puede surgir en el ADN por dos mecanismos: (1) el uracilo (como dUTP (desoxiuridina trfosfato)) se incorpora ocasionalmente en el lugar de una timina durante la sintesis del ADN, y (2) el uracilo se puede formar en el ADN por la desaminaciGn de una citosina (véa- se Fig, 5.18A). El segundo mecanismo es de mayor importancia biologica puesto que altera el patron normal de pares de bases complementarias lo que representa lun acontecimiento mutagénico. La escisién del uracilo en e! ADN esta catalizada por la ADN glicosilasa, una enzima que rompe el enlace de unién de la base de ADN conteniendo U formado por uracilo con el esqueleto de desoxirribosa del ADN. Esta reaccién produce un uraci- la deaminacién de C lo libre y un sitio apirimidinico —un azucar sin base—. La ADN glucosilasa también reconoce y elimina otras bases anémalas, incluyendo la hipoxantina formada por la desaminacién de adenina, dimeros de pirimidina, purinas alquiladas distintas que la O*-alquilguanina, y bases dafiadas por oxidacion o radiacion ionizante. El resultado de la accién de la ADN glicosilasa es la formacién de un sitio apirimidinico o apurinico (generalmente llamado sitio AP) en el ADN. Se forman sitios AP similares como resultado de la pérdida espontanea de bases de purina RI (véase Fig. 5.18B), que se da en proporciones significativas bajo condiciones celulares normales. Por ejemplo, cada célula en el cuerpo humano se estima que pierde varios miles de bases de purina diariamente. Estos sitios son repara: dos por la AP endonucleasa, que rompe de forma adyacente al sitio AP (véase Fig, 5.22). La desoxirribosa restante por tanto se elimina, y el espacio de una sola base resultante es relienado por la ADN polimerasa y la ligasa Mientras que la ADN glicosilasa reconoce solamente formas espectticas de bases dafiadas, otro sistema de reparacién reconoce a una gran variedad de |= bases dafiadas que distorsionan a la molécula de ADN, incluyendo dimeros de pirimidina inducidos por UV y grupos voluminosos aftadidos a las bases de ADN como resultado de la reaccién de muchos carcinégenos con el ADN (véase Fig. 5.19C), Esta forma tan extendida de reparacion del ADN se conoce como repa- racién por escision de nuclestidos, debido a que las bases (0. ¢)., un dimero de timina) son eliminadas como parte de un oligonuclestido que contiene la lesion (Fig. 5.23) En E. coli, la reparacién por escision de nuclestidos esta catalizada por los Eos productos de tres genes (uvrA, B, C) que fueron identificados debido a que las mutaciones en estos Joci resultan extremadamente sensibles a a luz UV. La proteina UvrA reconoce al ADN dafiado y recluta a UvrB y UvrC al sitio dela E lesidn. UvrB y UvrC entonces rompen los extremos 3° y 5’ del sitio dafiado, respectivamente, y por tanto escinden un oligonuclestide que consiste en 12.6 13 bases. El complejo UvrABC con frecuencia se denomina escinucleasa, un nombre que refleja su capacidad para escindir un oligonucledtido. Posterior- Fgura 5.22 = Reparacion por escisién de bases. En este ejemplo, ol uracilo(U) se ha formado por dosarninacion de la ctosina (C)y es por tanto opuesto a una guanina (G) en la hebra comple ‘mentaria del ADN. El enlace entre e! uracio y la desoximibosa lo rompe una ADN giicosiasa ddejando un azicar sin base unido al ADN (un sitio AP). El sitio es reconocido por una AP tendonucleasa, que rompe la cadena de ADN. La desoxiribosa restante es eliminada por la ‘desoxiinosafosfodiesterasa, El espacio que resulta lo rellena la ADN poimerasa y lo une tna igaea, conduciondo a la incorporacién de la base correcta (C) opuesta a G.198 © Seccién Il * Flujo de la informacion genética Figura 5.28 Reparacién por escisién de nuclesti- dos de los dimeros de timina. El ADN dafiado es reconocido y después cortado ‘a_ambos lados del dimero de timina por las nucleasas 3' y 5'. El desenrollamiento por una helicasa produce la escisién de un ‘cligonucledtide que contione las bases dafiadas. El espacio resultante lo rellena la ADN polimerasa y lo une una ligasa. mente se requiere la accién de una helicasa para eliminar al oligonuclestide que ontiene el dafo de la molécula de ADN de doble hélice, y el espacio resultante serd rellenado por la ADN polimerasa | y unido por la ligasa. Los sistemas de reparacion por escision de nucledtidos se han estudiado extensamente en eucariotas, en particular en levaduras y en humanos. En leva- duras, como ocurre en E. coli, se han identificado diversos genes implicados en la reparacién del ADN (llamados genes RAD por sensibles a la rachacién) me- diante el aislamiento de mutantes con sensibilidad aumentada a la luz UV. En humanos, los genes de la reparacién del ADN se han identificado mediante el estudio de individuos que sutren de enfermedades hereditarias que resultan de las deficiencias en la capacidad de reparar el ADN danado. De estas enfermeda- des la mas estudiada es el xeroderma pigmentosum (XP), un desorden genético raro que afecta aproximadamente a uno de cada 250.000 individuos. Los indivi duos con esta enfermedad son extremadamente sensibies ala luz UV y desarro- llan miitiples canceres de piel en las regiones del cuerpo que estan expuestas a la luz solar. En 1968 James Cleaver hizo el descubrimiento clave de que las oéluias ‘en cuttivo de pacientes con XP tenian deficiencias en llevar a cabo el sistema de LL Ge EL Reconocimiento del dano Corte por nucteasa Helicasa Oligonuctestido ‘escindido AON polimerasa Ligasa La aaCapitulo 5 + Replicacién, mantenimiento y reorganizacién del ADN genémico © 199 reparacién por escisién de nucledtidos. Esta observacién no solo proporcioné la primera conexién entre la reparacion del ADN y el cancer, sino que sugirié el uso de células XP como sistema experimental para identfcar a los genes humanos repa~ radores del ADN. La identificacién de los genes humanos reparadores del ADN se ha llevado a cabo mediante estudios no solo con células XP, sino con otras dos enfermedades humanas que resultan de defectos en la reparacion del ADN (Sin- drome de Cockayne y tricatioistrofia) y con mutantes sensibles a UV procedentes de lineas celulares de roedores. La disponibildad de células de los mamiferos con defectos en la reparacién del ADN ha permitido la clonacién de genes reparadores basada en la capacidad de los alelos de tipo salvaje de restaurar la sensiblidad normal al UV en as células mutantes mediante ensayos de transferenvcia de genes, dejando una puerta abierta a los analisis experimentales de reparacién por escision de nuclestidos en las células de los mamiferos. La clonacién molecular hasta ahora ha identificado siete genes de repara- xpc. cidn diferentes (designados desde XPA hasta XPG) que mutados en los casos Reconocimiento de xeroderma pigmentosum, como en algunos casos de sindrome de Cockay HHRZIBS dol dano ne, tricotiodistrofia, y mutantes sensibles a la radiacion UV de células de roedo- res. Las proteinas codificadas por estos genes de reparacién del ADN de mami- xPC. feros estan muy relacionadas con las proteinas codificadas por los genes RAD de levaduras, lo que indica que la reparacién por escisién de nucledtidos esta muy conservada entre los eucariotas. Con la disponibilidad de genes de repara- cion de levaduras y mamiferos clonados, ha sido posible purificar las proteinas que codifican y desarrollar sistemas in vitro para estudiar sus papeles en el TFIIH proceso de reparacién (Figura 5.24). El paso inicial de la reparacion por esc (XPBy XPD) sién en las células de mamifero implica el reconocimiento de un fallo en el apa- xPGA) Helcasa reamiento de bases mediante un complejo formado por XPC y una proteina denominada hHR23B, que es un homélogo de la proteina Rad23 de levaduras. Esto es seguido del reciutamiento de las proteinas XPB, XPD y XPG al ADN afectado. Las proteinas XPB y XPD son componentes de un factor de transcrip- cién de multiples subunidades (denominado TFiIlH) necesario para iniciar la transcripcion de los genes eucaristicos (véase Capitulo 6); actiian como helica- sas para desenrollar aproximadamente 30 pares de bases de ADN en toro al pHR236 punto dafado, La proteina XPA entonces actda para confirmar el dai, y reclu- PA. taa XPF como un heterodimero con ERCC1 (proteina de reparacién identifica- XPFIEROG | da en células de roedores sensibles a la radiacién UV) al complejo de repara- cién. XPF/ERCC1 y XPG son endonucleasas, que escinden el ADN en los xPE extremos 5’ y 3° del punto dafado, respectivamente. Esta escisién libera un = oligonucledtido que esta formado por aproximadamente 30 bases. El hueco re- sultante es ahora rellenado por la ADN polimerasa 6 0 « (en asociacion con RFC. y PCNA) y sellado por la ligasa. Mientras que el complejo XPC/hHR23B puede reconocer el ADN dafiado a xPA lo largo del genoma, una forma alternativa de reparacion por escision de nu- Conte y clestidos, denominada reparacién acoplada a la transcripcion, se dedica es- excision dal pecificamente a la reparacién del dafo en el interior de genes activamente ogpmicioens transcritos. Una conexién entre la transcripcién y la reparacién fue sugerida en primer lugar por experimentos que demostraban que las hebras transcritas de ADN se reparan mas rapido que las hebras no transcritas, tanto en E. colicomo Di oollitt Figura 5.24 Reparacién por escision de nucleétidos en células de mamifero. El dafo del ADN ADN polimerasa {(P. 8}. un dimero de timina) es reconccido por el compiejo XPG/hHR23B. E! factor de Ugesa ttanscripcién TFIIH, que contione las helicasas XPB y XPD y XPG son reclutados al ADN, dafiado. Después del desenrollamiento del ADN por parte de XPB y XPD, el dafio es confirmado por XPA y entonces es reclutado el complejo XPF/ERCC1. A continuacion e! — 'ADN es escindido por las endonucleasas XPF/ERCC! y XPG, escindiendo el oligonucied- tido daniado. El hueco resultante es rellenado por la ADN polimerasa y sellado por la ligasa.200 © Seccién Il * Flujo de la informacion genética [ARN polimerasa detenida en la lesion ose: Trin OSM (PB y XPD), xPG: XPA- XPFIERCC!: XP xPA Ezcision det aligonuclestido Sintesis de ADN yligacion Figura 5.25 Reparacion acoplada a la transcripcion en células de mamifero. La ARN polimerasa 8 detiene ena lesion de la hebra de ADN que se transcibe. La ARN polmerasa detenida fs reconocida por las proteinas de reparacidn acopladas a la transcripcién CSA y CSB, que reclutan a TFIIH y XPG al ADN dariado. La reparacién entonces procede por la via de reparacién por escisicn general en células de mamifero. Ya que el ADN dafado bloquea la transcripcién, se ‘fee que esta reparacién acoplada a la transcripcién resulta ventajosa permi- tiendo que la célula repare preferentemente el dafo a genes que se expresan activamente. En E. coll, el mecanismo de reparacién acoplado a la transcripcion implica el reconocimiento de la ARN polimerasa detenida en la lesion de la he- bra de ADN que se esta transcribiendo. La ARN polimerasa detenida es recono- cida por una proteina denominada factor de reparacion acoplado a la transcrip: cién, que desplaza a la ARN polimerasa y recluta la escinucleasa UvrABC al sitio dafiado, En células de mamifero, la reparacién acoplada a la transcripcién implica el reconocimiento de la ARN polimerasa detenida, por parte de las proteinas CSA y CSB, que estan codificadas por los genes responsables del sindrome de Coc: kayne (Fig. 5.25). En contraste con pacientes con xeroderma pigmentosum. los pacientes con el sindrome de Cockayne son especificamente deficientes en la reparacién acoplada a la transcripcién, lo que resulta consecuente con el pape! de CSA y CSB como factores de reparacién acoplada a la transcripcién. CSA y CSB actiian andlogamente al complejo XPC/MHR23B en el reclutamiento de XPA y el complejo XPF/ERCC1, y a la escisién del oligonuclestido daftado. La reparacién acoplada a la transcripeién ahora procede de forma similar a la repa- racién por escisién de nuclestidos general, excepto por el reconocimiento inicial de la ARN polimerasa detenida por parte de CSA y CSB, en lugar de su recono- cimiento directo por el complejo XPC/NHR23B. Untercer sistema de reparacién reconoce a las bases no complementarias que se incorporan durante la replicacién del ADN. Muchas de estas bases no complementarias se eliminan por la actividad de la doble lectura de la ADN polimerasa. Las que se pierden son el objetivo de una correccién posterior por parte del sistema de reparacién no complementaria, que barre de nuevo al ‘ADN replicado. Si se encuentra una no-complementariedad, las enzimas de este sistema de reparacién son capaces de identificar y escindir la base no complementaria especiticamente de la hebra de ADN recién replicada, permi- tiendo que se corrija el error y la secuencia original sea reemplazada En E. coli, la capacidad del sistema de reparacién no complementaria para distinguir la hebra de ADN parental de la hebra de ADN recién sintetizada se basa en el hecho de que el ADN de esta bacteria se modifica por la metilacion de los residuos de adenina en la secuencia GATC para formar 6-metiladenina (Fig. 5.26). Puesto que la metilacién ocurre despues de la replicacién, las he- bras de ADN recién sintetizadas, no estan metiladas y pueden ser reconocidas especificamente por las enzimas del sistema de reparacién no compiementaria. La teparacién no complementaria se inicia con la proteina MutS, que reconoce la no-complementariedad y forma un complejo con otras dos proteinas llamadas MutL y MutH. La endonucleasa MutH! rompe la hebra de ADN sin metilar en la secuencia GATC, MutL y MutS actian después juntas con una exonucleasa y una helicasa para escindir el ADN entre la «brecha» de la hebra y la no-comple~ mentariedad, dejando un espacio que lo rellenaran la ADN polimerasa y la ligasa. Los eucariotas tienen un sistema de reparacion no complementaria similar, aunque el mecanismo por el que las células eucariotas identifican al ADN recién sintetizado es distinto al usado por E. coli. En las células de los mamiferos, parece ser que la especificidad de la hebra para la reparacion no complementa- fia no esta determinada por la metilacién del ADN. En su lugar, esta determina- da por la presencia de roturas de hebra simple (que estaran presentes en elCapitulo 5 * Replicacién, mantenimiento y reorganizacion del ADN gendmico @ 201 Home Hy Hla Habra antigua Reparacion de apareamientos en E. coll. El sistema de reparacion de apareamientos detecta y escinde las bases despareadas en ol ADN recién replicado, que se iterencia de eben nueva la hebra parental debido a que todavia no ha sido metiada, MutS se une ala base desa- pareada, seguido de MutL. La union a MutL activa a MutH, que rompe a la hebra no uns, Mune, Mant rodificada opuesta al sitio de la metilacién. MutS y MutL, junto con una helicasa y una -_-desapareada texonucleasa, escinden la porcion de la hebra no modificada que contiene el desaparea- miento. La ADN polimerasa reliena ol espacio que finalmente queda unkdo por la ligasa. cH Cy ADN recién replica) © asociaciones con ls homélogos eucarisicosde Mus = {_) wale lulS, Mull, heleasa, y MutL con la maquinaria de replicacién, pueden especificar la hebra a reparar. ‘A continuacién, los homdlogos eucariotas de MutS y MutL se unen a la base no complementaria y escinden al ADN entre la rotura de la hebra y la baseno CH, chy ‘complementaria, como en E. coli. La importancia de este sistema de reparacion se verifica dramaticamente por el hecho de que mutaciones en los homélogos humanos de MutS y Mull. son responsables de un tipo de céncer de colon here- ditario (cancer colorrectal hereditario no poliposo, 0 HNPCC). HNPCC es una de las enfermedades hereditarias mas comunes; afecta a uno de cada 200 indi- viduos y es responsable del 15% de todos los canceres colorrectales en los. CMs Hy Estados Unidos. La relacién enire el HNPCC y los defectos de la reparacién no complementaria se descubrié en 1993, cuando dos grupos de investigacién clo- rnaron al homélogo humano de MutS y encontraron que las mutaciones en este gen eran las responsables de casi la mitad de todos los casos de HNPCC. Estudios posteriores han demostrado que la mayoria de los casos restantes de HNPCC estan causados por mutaciones en uno de los tres genes humanos que son homdlogos a Mutt, Defectos en estos genes parecen resultar en una eleva- da frecuencia de mutaciones en otros genes celulares, con una elevada proba- bilidad correspondiente de que alguna de estas mutaciones finaimente desen- cadene el desarrollo de cancer. exonucleasa ADN polimerasa yligasa Reparacién propensa al error Los sistemas de reversion directa y la reparacion por escision actuan para co- rregir daiios del ADN antes de la replicacién, para que la sintesis de ADN repli- cativo pueda proceder empleando una hebra de ADN no dafada como molde. Siestos sistemas fallasen, sin embargo, la célula pose mecanismos alternati- vos para tratar el ADN dafiado en la horquilla de replicacion. Los dimeros de pirimidina y muchos otros tipos de lesiones no pueden copiarse por la accién normal de las ADN polimerasas, asi que la replicacin se bloquea en puntos con dichas lesiones, Sin embargo, las céluias también poseen varias ADN polimera- sas especializadas capaces de replicar a través de un punto de ADN dahado. La replicacién del ADN dafado por estas polimerasas especializadas puede llevar frecuentemente a la incorporacién de bases incorrectas, de modo que esta forma de hacer frente al ADN danado se denomina reparacién propensa al error. La primera ADN polimerasa propensa al error fue descubierta en E. colien 1999. Esta enzima, denominada polimerasa V, es inducida en respuesta a una extensa irradiacidn UV y puede sintetizar una nueva hebra de ADN opuesta a un dimero de timina (Fig. 5.27). Otras dos ADN polimeras de E. col, las polime- rasas ll y lV, se inducen de forma similar por el ADN lesionado y funcionan en la reparaci6n propensa al error. Las células eucaridticas también contienen multi- ples ADN polimerasas propensas al error, asi se han descrito nueve enzimas de esie tipo en el hombre hasta la fecha. Todas estas ADN polimerasas propensas al error muestran una baja fidelidad cuando copian ADN no danado, con tasas de error que oscilan entre 100 y 10.000 veces superior que las tasas de error de las ADN polimerasas replicativas normales (p. ela polimerasa Ill de E. colic las polimerasas » y « de eucariotas). Ademés, las polimerasas propensas al202 @ Seccidn Il * Flujo de la informacién genética Replicacién normal bloqueada por un dimero de tina AON polimerasa propensa al error iigida ala lesion Sintesis de ADN a to largo de la lesién por la ADN polimerasa jpropensa al error Reanudacién de ta replicacion normal ‘escision de la lesion Figura 5.27 Reparacién post-replicacién. La_pre- sencia de un dimero de timina bloquea la replicacion, pero la ADN polimerasa pue- de esquivar la lesion y reiniciar la replica- ‘cin en un lugar nuevo curso abajo del di mero. El resultado es un espacio 0 gap ‘opuesto al dimero en la hebra de ADN re- cién sintetizada, En la reparacion recom- binatoria, este espacio 0 gap se rellona poor la recombinacién con la hebra paren- tal sin dafar. Aunque esto deja un espacio fn la hebra parental intacta, el espacio 0 ‘gap puede rellenarse mediante la accidn de la polimerasa y ligasa, utiizando a la hebva hija intacta como molde. Se forman ppor tanto dos moléculas intactas de ADN, y el dimero de timina eventualmente pue- {e ser eliminado por escision. [sss de error carecen de la actividad correctora 3' —> 5’ que caracteriza a las ADN poli merasas replicativas normales (véase Fig. 5.12) Es importante notar, sin embargo, que las polimerasas propensas al error estan especializadas en la insercién de la base correcta opuesta a lesiones, ‘especificas en el ADN dafiado, y por tanto pueden sintetizar con precision una nueva hebra empleando algunas formas de ADN dafado como molde, Por ejemplo, la polimerasa V de E. coli reconoce especificamente los dimeros de timina e inserta correctamente AA en la hebra opuesta. Por otro lado, la polime- rasa V comete una elevada frecuencia de errores cuando sintetiza una nueva hebra de ADN opuesta a otras formas de ADN dahado. Asi, estas enzimas son capaces de insertar especiticamente las bases correctas opuestas a ciertas formas de lesiones de! ADN, aunque Son «propensas al error» cuando insertan bases opuestas a otras formas de ADN dafiado o en la sintesis de ADN a apartr de un molde de ADN normal no dafiado, Reparacién recombinatoria Otro modo de reparacién del ADN, la reparacién recombinatoria, se basa en la sustitucién del ADN danado mediante la recombinacién con una molécula sana. Este mecanismo es utilizado frecuentemente para reparar lesiones en- contradas durante la replicacién del ADN, donde la presencia de dimeros de timina u otras lesiones que no pueden ser copiadas por las ADN polimerasas replicativas normales bloquean el avance de la horquilla de replicacion. La repa- racién recombinatoria depende del hecho de que una hebra del ADN parental estaba sana y por lo tanto, se copié durante la replicacion para dar lugar a una molécula hija normal, que entonces podra usarse para repararla hebra dafiada Los mecanismos moleculares de la reparacién recombinatoria no se com- prenden por completo y pueden variar entre los distintos tipos celulares, pero se presenta un modelo ilustrativo en la Figura 5.28. En este ejemplo, la replicacion normal esta bloqueada por la presencia de un dimero de timina en una hebra del ADN. Mas adelante del punto dafiado, sin embargo, la replicacion puede iniciarse de nuevo por la sintesis de un fragmento de Okazaki y puede proceder alo largo de la hebra molde. El resultado es una hebra hija que posee un hueco ‘opuesto al punto dafiado en la hebra parental. La hebra parental sana, que se ha replicado para dar lugar a una molécula hija normal, puede entonces utilizar ‘se para rellenar el hueco opuesto al punto dafiado por recombinacién entre secuencias homélogas de ADN (véase la siguiente seccién). Ya que el hueco resultante en la hebra parental previamente intacta se encuentra frente a una ‘molécula sana, puede ser rellenado por una ADN polimerasa. Aunque la otra ‘molécula parental sigue reteniendo la lesién original (p. ej. un dimero de timi- na), el dano ahora reside enfrente de una hebra normal y puede tratarse mas tarde por reparacién por escisién La reparacién recombinatoria también proporciona un mecanismo principal para la reparacién de las roturas de doble hebra, que pueden ser introducidas en 1 ADN por la radiacion ionizante (como los rayos X) y algunos agentes quimicos (Fig. 5.29). Ya que este tipo de lesién afecta a ambas hebras de ADN, es espe- cialmente dificil de reparar. La recombinacién con secuencias de ADN homo- logas sobre un cromosoma sano proporciona un mecanismo de reparacion de este tipo de dano y permite restablecer la secuencia normal de ADN. Por otra parte, las roturas de doble hebra pueden repararse simplemente uniendo los extremos rotos de una molécula sencilla de ADN, pero esto desencadena una elevada frecuencia de errores resultantes de la delecién de bases en torno al punto daftado. Debe notarse que los genes responsables del cancer de mama hereditario (BRCA! y BRCA2) codifican proteinas implicadas en la reparacion de roturas de doble hebra por recombinacién homéloga, sugiriendo que defec- tos en este tipo de reparacién del ADN puede llevar al desarrollo de uno de los canceres mas comunes en mujeres.Capitulo 5 * Replicacién, mantenimiento y reorganizacién del ADN genémico © 203 Medicina molecular Cancer de colon y reparacion del ADN La enfermedad Los canceres de colon y recto (canceres colorrectales) son uno de los tipos de cénceres mas comunes fen los paises del oeste, contando con cerca de 14.000 casos de cancer cada ano en los Estados Unidos (aproximadamente un 10% de la incidencia total del cancer). La mayoria de los canceres de colon (al igual que otros tipos de cancer) no Son enfermedades hereditarias; fs decir, que no se transmiten directamente de padres a hijos. Sin ‘embargo, se han descrito dos formas hereditarias de céncer de colon. En estos dos sindromes, la herencia de un gen susceptible al cancer presenta un potencial muy alto de desarrollar cancer. Una de las formas heredadas de cancer de colon (poliposis adenomatosa familiar) es extromadamente rara, representando menos del 11% de la incidencia total del cancer de colon. La segunda forma heredada del ‘cancer de colon (céncer colorrectal hereditario no poliposo, o HNPCC) 2s mas comin y representa alrededor del 15% de todos 1os ‘casos céncer de colon. Ademas, el HNPCC es una de las ‘enfermedades hereditarias mas comunes, afectando a una de cada 200 personas. Aunque los canceres de colon son la manifestacién mas clara de esta enfermedad, los individuos afectados tambien sutren Un incremento de la incidencia de ‘otros tipos de cancer, como son el céncer de ovario y endometrio. Bases moleculares y celulares Igual que otros canceres, el cancer colorectal es el resultado de mutaciones producidas en genes que rogulan la prolferacion celular, ‘conduciendo al crecimiento incontrolado de las células ‘cancerigenas. En la mayorla de los ‘ca80s estas mutaciones ocurren de forma esporadica en las céiulas, somaticas, En los cénceres hereditarios, sin embargo, las mutaciones de la linea germinal predisponen al individuo a desarrollar el cancer. En 1993 se produjo un avance extraordinario con el descubrimiento de que un gen responsable de aproximadamente el 50% de los casos de HNPCC codificaba a una enzima implicada ‘en la reparacion de los apareamientos en el ADN; este gen ‘es un homélogo humano del gen de E. coli MutS. Estudios posteriores han demostrado que otros tres genes, responsables de la mayoria de los casos restantes de HNPCC, ‘son homélogos de MutL y que por tanto estan implicados en el proceso de reparacién de apareamientos. Los dofectos en ‘estos genes parecen corresponderse ‘con una alta frecuencia de mutaciones en otros genes celulares, y.@ su vez con una alta probablidad de que algunas de estas mutaciones ‘conduzcan eventualmente al desarrollo del cancer por afectar a genes que regulan la proliferacion celular. Prevencién y tratamiento De manera similar a otras enfermedades hereditarias, la identiticacion de los genes responsables de HNPCC permite que los individuos con riesgo de heredar el cancer sean identificados a través de una prueba genetica. ‘Ademés, el diagnéstico genético prenatal podria ser de vital importancia para los portadores de mutaciones HNPCC que pianean tener descendencia. No obstante, los beneficios potenciales de la deteccidn de estas mutaciones no se limitan a preven la transmision de genes mutantes a la siguiente {eneracidn: su deteccién también puede ayudar a prevenir el desarrollo del céncer en individuos afectados. En términos de prevencién de la enfermedad, una de las ccaracteristicas claves del cancer de colon es su desarrollo gradual durante varios afios. El diagndstico temprano de la enfermedad mejora sustancialmente las posibilidades de supervivencia del paciente. La {ase inicial de desarrollo del cancer de colon es el crecimiento de pequefios pélipos benignos, que Coon el tiempo se transformaran en, ‘malignos e invadiran el tejido conectivo de su alrededor. Anterior al desarrollo de la malignidad, sin ‘embargo, los polipos se pueden liminar quirdrgicamente con facilidad, previniendo de forma eficaz el crecimiento de un tumor maligno. Los polipos y las primeras fases del cancer de colon se pueden detectar a través del examen det colon con un tubo delgado iluminado (colonoscopia), de manera que la colonoscopia frecuente en pacientes con HNPCC podria permit la eliminacion de los pélipos antes de que el cancer se desarrolle. Ademas, diversos medicamentos se han estado probando como inhibidores potenciales del desarrollo del cancer {de colon, pudiendo resultar un gran beneficio para los pacientes con HNPCC. Permitiendo la aplicacién controlada de tales medidas preventivas, la identificacion de mutaciones responsables de HNPCC podria contribuir de manera significante a la prevencién de la enfermedad. Un pélipo del colon visuaizade por colonos- copia, (David M. Martin, MO/SPLPhoto Re- searches, Inc)204 © Seccidn Il * Flujo de la informacion genética Figura $28 Reparacion/post-replicacion. La presen- ‘ia de un dimero de timina bloquea la re- plicacion, pero Ia ADN polimerasa puede esquivar la lesién y reiniciar la replicacion fn un lugar nuevo curso abajo del dimero. El resullado es un espacio 0 gap opuesto. al dimero en le hebra de ADN recién sinte- lizada. En la reparacion recombinatoria, este espacio o gap se rellena por la «¢ combinacion con la hebra parental sin da- far. Aunque esto deja un espacio en ia obra parental intacta, e espacio © gap puede rellenarse mediante la accion de la. polimerasa y ligasa, utlizando a la hebra hija intacta como molde, Se forman por tanto dos moléculas intactas de ADN, y el dimero de timina eventualmente puede ser eliminado por escision. Replicacién bioqueada or un dimera de pirmigina La polimerasa reincia corriente abajo de dimero Espacio 0 gap opuesto al dimoro on la hebra hia La hebia parental sin dahar se recombina en e! espacio La recombinacion deja un espacio en ta hebra parental previamente imacta Espacio 0 gap relienado por la polimerasa y la igasa Recombinacién entre secuencias homélogas de ADN La replicacién exacta del ADN y la reparacién de los dafios en el ADN resultan esenciales para el mantenimiento de la informacion genética y la transmision fiel de padres a hijos. Desde el punto de vista de la evolucién, sin embargo, también ha sido importante generar diversidad genética, Las diferencias genét cas entre los individuos proporcionan el material esencial de partida para la selecci6n natural, que permite a las especies evolucionar y adaptarse a los cambios de las condiciones ambientales. La recombinacién juega un papel im- portante en este proceso permitiendo a los genes distribuirse en diferentes combinaciones. Por ejemplo, la recombinacién genética resulta del intercambio de genes entre ios pares de cromosomas homologos durante la meiosis (véase Fig. 3.4). Sin embargo, el aumento de la diversidad genética no es el Unico papel de la recombinacién. Tal y como discutimos en la secci6n anterior, la recombinacién también es un mecanismo importante para la reparacién del ADN. Ademés, la recombinacién esta implicada en la reorganizacién de se- cuencias especiticas de ADN que alteran la expresién y la funcién de algunos genes durante el desarrollo y la diferenciacién. Por tanto, la recombinacién de- semperia papeles importantes en la vida de las células de un individuo y en la de los organismos, al igual que contribuye a la diversidad genética de las especiesCapitulo 5 * Replicacion, mantenimiento y reorganizacién del ADN gendmico © 205 Radiacié ionizante 5 Recombinacin oméloga eeunin de extremos [Eee § ADN hom — al =e 2 5 Bases perdidas Ea Perdida de bases en los extremos Reparacién libre de errores Esta seccién discutiré los mecanismos moleculares de la recombinacién entre las moléculas de ADN que comparten secuencias homologas extensas. Los ejemplos incluyen la recombinacién entre pares de cromosomas eucariotas du rante la meiosis y la recombinacion entre cromosomas bacterianos durante la reproduccién. Puesto que esta forma de recombinacion implica el intercambio de informacion genética entre dos moléculas homdlogas de ADN, no se altera la ‘organizacién global de los genes en un cromosoma. Otros tipos de recombina~ ci6n, sin embargo, no requieren secuencias homdlogas extensas y por tanto pue- den producirse entre moléculas ADN no relacionadas. Este tipo de recombinacion ‘conduce a la reorganizacion de genes, que se discutird mas tarde en este capitulo. Las moléculas de ADN se recombinan mediante roturas y uniones La recombinacin genética se defini6 por primera vez tras estudios en Drosop- hila, basados en la observacién de que genes en diferentes copias de cromoso- mas homélogos se podian reorganizar durante la meiosis. Con el descubrimien- to posterior de que los genes se componian de ADN, se consideraron dos ‘modelos alternativos para explicar la recombinacién a nivel molecular (Fig. 5.30). El modelo «eleccién de copia» proponia que la molécula recombinante se gene- Elecclon de copia Sintesis de nuevos ADN hijos Cambio para copiar los otros moldes par ET zs zien | Rotura y unién AON parentales i FRotura y unién cruzada aaa aaa Figura 5.28 Reparacién de roturas de doble hebra. La radiacion ionizante y algunos agentes {quimicos inducen roturas de doble hebra ‘en el ADN. Estas roluras pueden ser repa- radas por recombinacion homéloga con tun eromosoma normal, dando lugar a la restauracion de la secuencia original de ‘ADN, Por el contrario, los extremos de la molécula rota pueden ser reunidos, con tna frecuente perdida de bases en torno al punto danado. Figura 5.30 Modelos de recombinacién. En la elec- ‘clon de copia, a recombinacion se produ- ce durante la sintesis de moléculas hijas de ADN. La replicacion del ADN comienza con un molde de ADN parental y despues cambia a una segunda molécuia parental ‘dando como resultado la sintesis de AON, recombinantes hijos que contienen se- ‘cuencias homdiogas con ambos progen: tores. En la rotura y union, la recombina- cién ocurre como resultado de romper y tunir cruzadas las dos moléculas parenta- les de ADN. rentalesADN hijos recombinantes —206 © Seccién Il * Flujo de la informacion genética Figura 5.31 Demostracién experimental de recom- binacién por roturay unin. Se cutivan virus parentales genéticamente distintos enun medio que contiene isotopes ligeros ‘pesados de carbono (C0 C") y nitro- ‘geno (No N") para marcar la densidad do as moléculas ADN. Se infecta a E. coll bajo condiciones que inhiben la replica- ion, recogiendose los virus de la proge- hie y analzandose por centritugacion de equlibrio en un gradiente de GsCi para determinar la densidad de los. recombi nantes genéticos. Los virus recombinan- tes mostraron tener densidades interme dias, indicando que habian adquifde ADN de ambos virus parentales mediante un mecanisma de rolura y union AON parentales 3 : [ADN parentales rotos en sitios no Foor tes (mE: : 3 heteroduplex Virus parentales SS CCrecen en medio eon [ein eatiednarie fr Sone Determinar distribucion de ADN ligoros yy pesados separando los virus on un gradiente de densidad de CsCl Vis pariae tp [= ¥ Virus recombinantes de densidad |= intarmadia Crecen en medio Cent Virus parentales pesados raba durante la sintesis de ADN, como resultado de copiar primero una hebra parental de ADN y después cambiar para copiar un molde distinto. La propuesta alternativa fue que la recombinacién resultaba de la rotura y la unin de dos moléculas parentales de ADN en lugar de la sintesis de un nuevo ADN. Estas alternativas se apreciaron por primera vez en 1961 mediante estudios de recombinacién entre los genomas de virus bacterianos (Fig. 5.31). La infec- cién de E. colicon virus portadores de diferentes marcadores genéticos produjo progeni¢ recombinante. Para determinar si esta recombinacién implicaba rotu- ras y uniones de los ADN parentales, uno de los virus parentales se cultive en un medio que contenia isétopos pesados de carbono ('°C) y nitrégeno ('°N), mien- tras que otro fue cultivado en un medio con los isdtopos ligeros normales ("°C y '4N). El resultado fueron virus parentales con densidades diferentes, de manera que pudieron separarse mediante centrifugacion de equlibrio en un gradiente de Figura §.92 Recombinacién homéloga mediante complementariedad de bases. Los ADN paren: tales se rompen en sitios no coincidentes, intercambiandose las regiones de hebra simple mediante un apareamiento de bases con las secuencias homdlogas, El resultado es una region heteroduplex, en la que las dos hebras de ADN se derivan de moléculas parentales diferentes,Capitulo 5 * Replicacién, mantenimiento y reorganizacién del ADN genémico © 207 Figura $39. ‘Modelo de Holliday para la recombinacién homéloga. Los cortes de hebra simple se Introducen en la misma posicién on ambas hebras paternas. Las hebras cortadas se inter- ccambian mediante complementariedad de bases, y el igamiento produce un intermediario de hebras cruzadas denominado unién de Holliday. densidad de CsCl. Se infecté de nuevo E. colicon estos virus parentales marca dos de diferente forma bajo condiciones en las que se inhibia la replicacion, analizéndose la densidad y las caracteristicas genéticas de la progenie de virus producidos. El resultado mas importante fue que los virus genéticamente re- combinantes obtenidos presentaban densidades intermedias, indicando que habian adquirido ADN de ambos virus parentales, tal y como 0 predecia el mo- delo de rotura-y-unién, y no el de oportunidad de copia. Modelos de recombinacién homéloga El descubrimiento de que la recombinacién ocurre por rotura y unién plantes luna cuestién critica: como pueden romperse dos moléculas parentales de ADN exactamente en el mismo punto, de manera que se puedan unir sin muta- ciones resultantes de la ganancia o perdida de nucledtidos en el punto de rotura? Durante la recombinacién entre moléculas de ADN homélogas (recombinacién homéloga general), se proporciona este alineamiento mediante el apareamien- to de bases entre las hebras de ADN complementarias (Fig. 5.32). Entre las moléculas de ADN homdlogas se intercambian hebras simples que estan em- palmadas las unas a las otras, conduciendo a la formacién de una regisn hete- roduplex, en la que las dos hebras de la doble hélice recombinante se derivan de diferentes moléculas progenitoras. Si la regién heterodtiplex contiene una diferencia genética, el resultado es una progenie de moléculas de ADN que contiene dos marcadores genéticos. En algunos casos, las bases no empareja- das en un heteroduplex pueden reconocerse y corregirse mediante los sistemas de reparacién de emparejamientos, como discutimos en secciones anteriores en este capitulo. La evidencia genética de la formacién y reparacion de estas regiones heterodtiplex, obtenida por los estudios de recombinacién en hongos y en bacterias, condujo al desarrollo de un modelo molecular de recombinacion en 1964, Este modelo, conocido como el modelo de Holliday (por Robin Holl day), continud proporcionando las bases de la corriente de pensamiento actual sobre ios mecanismos de recombinacién, aunque se ha ido modificando con la obtencién de nuevos datos, Laversién original del modelo de Holliday proponia que la recombinacién se iniciaba mediante la introduccién de costes en la misma posicién en las dos moléculas parentales (Fig. 5.33). Las hebras de ADN con el corte se desenrolla- ban parcialmente, invadiendo cada una a la otra molécula por medio de la com- plementariedad con la hebra sin romper. Ei ligamiento de las hebras rotas pro- ducia un intermediario de hebras cruzadas, conocido como la union o Intermediario de Holliday, que es él intermediario central en la recombinacién. La demostracién directa de la unién de Holliday por microscopia electronica ha coroborado este modelo de recombinacién (Fig. 5.34) Figura 5.34 Identificacién de la unin de Holliday mediante microscopia electronica. Microgra fia electrénica de una unién 0 intermediario de Holiday que fue detectada durante la re- combinacion del ADN de plasmidos en E. col, Debajo se muestra una interpretacion dibu- jada de la estructura. La molécula ilustra una unién de Holliday en configuracion abierta como resultado de la rotacién del intermediario de hebras cruzadas (véase Fig, 5.33) (Cortesia de Huntington Potter, University of South Florida, y David Dressler, University of Oxford) Corte de los ADN parentales 3 5 g 3 _ = ae 5 5 hebras teres ncn de Holiday saree 3 8 5 5 sg 3 s 5 Region heteroduplex208 @ Seccidn Il * Flujo de la informacién genética Unién de Holiday isomerizada ‘de Holiday Inicial a 8 Rotacin de la Fotacion dela porcién basal 180° porcion derecha 180" el FRotura y reunion de las hebras cruzadas b 8 Fotura y reunion do las hebras cruzadas | | \A4 an : + b A A b a a + 8 Heteroddplex no recombinantes Hoterodiplex recombinantes Figura 5.95: Isomerizacién y resolucién de las uniones de Holliday. Las uniones o intermediatios de Holiday se resuelven cortando y uniendo las hebras cruzadas. Si se resuelve la union Holliday formada por el intercambio inicial de hebras, la progenie resultante son heterodu- plex para no son recombinantes para los marcadores genéticos fuera de la regién hetero- ‘duplex. Sin embargo, dos rotaciones de la molécula de hebras cruzadas produce un iso- mero en el que las hebras parentales que no se rompen se cruzan, en lugar de las heoras, inicialmente cortadas. El corte y la union de las hebras cruzadas de este isémero produ: ‘cen una pragenie que es heteroduplex recombinants. Una vez que el intermediario Holliday se ha formado, se puede resolver cor- tando y volviendo a unir las hebras oruzadas para producir moléculas recombi- nantes (Fig. 5.35). Esto puede ocurrir de dos maneras diferentes, dependiendo de la orientacién de la union Holliday, que puede a su vez formar dos isomeros. En el isémero resultante del intercambio de hebras inicial, las hebras cruzadas son aquéllas que se rompieron al inicio del proceso de recombinacion. Sin em- argo, la simple rotacién de esta estructura produce un isomero distinto en el que se cruzan las hebras parentales sin romper. La solucién de estos isémeros tiene consecuencias genéticas diferentes. En el primer caso, la progenie de moléculas contiene regiones heteroduplex pero no son recombinantes en el ADN que flanquea esta regiones. Si se da la isomerizacién, sin embargo, el corte y la unién de las hebras cruzadas dan como resultado una progenie de ‘moléculas que son recombinantes en el ADN que flanquea las regiones hetero- duplex. La estructura del intermediario Holliday proporciona por tanto la posibili- dad de generar heteroduplex recombinantes y no recombinantes, confirmando los datos genéticos en los que se basaba el modelo de Holliday.Capitulo 5 * Replicacién, mantenimiento y reorganizacion del ADN gendmico ©@ 209 Como se propuso inicialmente, el modelo Holliday no explicaba cémo se Iniciaba la recombinacién por el corte simulténeo de ambas moléculas parenta- Jes en la misma posicién. Ahora parece que la recombinacién generalmente se inicia en las roturas de doble hebra, tanto durante la reparacién del ADN como durante la recombinacién entre cromosomas homélogos durante la meiosis (Fig. 5.36). Ambas hebras de ADN en la rotura de doble hebra son en primer lugar reseccionadas en direccién 5’ a 3" por parte de nucleasas que digieren el ‘ADN, dando lugar a extremos libres seneillos. Estas hebras sencillas entonces invaden a la otra molécula parental por apareamiento de bases homdlogas. A continuacién los huecos son rellenados por la sintesis de reparacién y las he- bras son unidas por ligacién para dar lugar a una molécula con una interseccion doble de Holliday, la cual puede resolverse para dar lugar a moléculas hetero- duplex recombinantes 0 no recombinantes, como se ha descrito previamente. Enzimas implicadas en la recombinacién homéloga Lamayoria de las enzimas conocidas por participar en la recombinacién se han identificado mediante el analisis de mutantes defectivos en la recombinacion de E. coll. Estos andlisis genéticos han establecido que la recombinacién requiere enzimas especificas, ademas de proteinas (como la ADN polimerasa, ligasa, y proteinas de unién al ADN de hebra simple) que funcionan en diversos aspec- tos del metabolismo del ADN. La identificacién de los genes requeridos en una recombinacién eficiente en E. coli condujo al aislamiento de sus proteinas codi- ficadas, que han sido caracterizadas bioquimicamente en sistemas libres de Células. Estos estudios han permitido descubrir la accién de diversas enzimas en la catalizacién de la formacién y resolucién de uniones de Holliday. ‘AON parenteral aivaanae | men de hetras 5 ° 5 e 5 S Fowa 5.96 é 5) Inlacin de ta recombinacién por ro- turas de doble hebra. Ambas hebras de onl AON son digeridas por nucleasas en el LUgacion punto de rotura de doble hebra en la direc: cion 5 a 3. A continuacién, las hebras 3) sencillas invaden la otra molécula paren 5 tal por apareamiento de bases homdlo- gas. Ahora ios huecos son rellenados me- 5, Glante la sintosis de reparacion y sellados 3 mediante ligacion, dando lugar a una Union de Hotliday dobie Union de Holliday dobie.210 @ Seccién Il * Flujo de la informacion genética Figura 5.37 ADN de hebra simple Funcién de la proteina RecA. RecA se lune inicialmente a un ADN de hebra sim= \ ple para formar un filamento de ADN-pro- teina, La proteina RecA que envuclve al |ADN de hebra simple se une ana segun- dda molécula de ADN de doble hebra para formar un complejo sin apareamiento de Union de RecA bases. Seguidamente se produce la com- DN culbierlo con Rec plementanedad de bases y elintercambio ‘de hebras, formando una region heterodi- plex La proteina central implicada en la recombinacién homdloga es RecA, que promueve el intercambio de hebras entre las moléculas de ADN homélogas que causa la formacion de los heteroduplex (Fig. 5.37). La accion de RecA puede dividitse en tres etapas. En la primera, la proteina RecA se une al ADN de hebra simple, envolviendo al ADN pata formar un filamento de proteina-ADN. Debido ‘a que RecA contiene dos sitios de union al ADN, la proteina RecA que esta unida a la hebra simple de ADN es capaz de unirse a una segunda molécula de ADN de hebra doble, para formar un complejo entre las dos moléculas de ADN. La asociacién no especifica mediada por RecA continua con el apareamiento especifico de bases entre e! ADN de hebra simple y su complementario. La proteina RecA cataliza después el intercambio de hebras, con la hebra simple originalmente envuelta por RecA desplazando su hebra homéloga para formar un heterodiiplex. Por tanto, la proteina RecA es capaz de catalizar, por si mis- ma, las reacciones del intercambio de hebras que es esencial para la formacion de los intermediarios de Holliday.Capitulo 5 * Replicacién, mantenimiento y reorganizacién del ADN genémico @ 211 En las levaduras, una proteina relacionada con RecA, llamada RADS1, es necesaria tanto para la recombinacién genética como para la reparacién de las roturas de hebra doble. RAD51 no solo es estructuralmente similar a RecA; como RecA, también es capaz de catalizar las reacciones de intercambio de hebras in vitro. Las proteinas relacionadas con RADS'1 han sido identificadas en eucariotas complejos, incluyendo a los humanos, indicando que las proteinas relacionadas con RecA desemperian papeles claves en la recombinacién ho- méloga de las células procariotas y eucariotas. Una vez que se ha formado una interseccién de Holliday, un complejo de otras tres proteinas de E. coli (Ruv A, B y C) se implican en la recombinacion (Fig. 5.38). Ruv A reconoce a la interseccion de Holliday y recluta a Ruy B, que acta como un motor que dirige la migraci6n del punto en el que se cruzan las hebras de ADN, variando asi la extensién de la region del heteroduplex y la posicién en la que las hebras cruzadas seran cortas y estar’an reunidas, Ruv C ahora resuelve las intersecciones de Holliday cortando las hebras de ADN cru- zadas. La reunién de las hebras cortadas mediante ligacién completa el proce- so, dando lugar a dos moléculas recombinantes. Las oélulas eucaristicas no poseen homélogos de las proteinas Ruv A, By C do E. coli, Por el contrario, la resolucion de las intersecciones de Holliday en células eucariotas parece estar mediada por otras proteinas, que siguen sin estar totalmente caracterizadas, Reorganizacién del ADN La recombinacién homdloga da lugar a la reorganizacién de genes entre pares de cromosomas sin alterar la disposicién de los genes en el genoma. Por el contrario, otros procesos recombinatorios conducen a la reorganizacién del ADN genémico. Algunas de estas organizaciones del ADN son importantes para el control de la expresién génica en determinados tipos de céluias; otros pueden desempefiar un papel evolutivo al contribuir con la diversidad genética. El descubrimiento de que los genes son capaces de moverse a diferentes localizaciones surgié a raiz de los estudios de Barbara McClintock con maiz en los aiios cuarenta. Basada estrictamente en analisis genéticos, McCiintock des- cribié nuevos elementos genéticos que podian moverse a distintas localizacio- nes en el genoma y que alteraban la expresion de los genes adyacentes, Sin embargo tuvieron que pasar cerca de tres décadas después del descubrimiento de McClintock hasta que la mayoria de los cientificos aceptaran el descubri miento de elementos transposables en bacterias y la nocién de elementos ge- néticos méviles. Actualmente se reconocen diversos tipos de reorganizaciones del ADN, incluyendo la transposicién de los elementos inicialmente descrita por McClintock, en las células procariotas y eucariotas. Es mas, en la actualidad se sabe que los elementos transponibles constituyen una gran fraccién de los ge- nomas de animales y plantas, incluyendo casi la mitad del genoma humano, pecifica de sitio Contraria a la recombinacién homéloga, que ocurre en cualquier region de se- cuencia homloga, la recombinacién especifica de sitio se da entre secuen- cias especificas de ADN, que normalmente son homdlogas en tan solo una franja estrecha de ADN. La interaccion principal en este proceso esté mediada or proteinas que reconocen las secuencias especificas diana del ADN en lugar de la complementariedad de bases. El prototipo de la recombinacién especifica de sitio se ha obtenido de los estudios del bacterisfago /. Cuando / infecta a E. coli, bien se replica para causarla lisis celular 0 puede integrarse en el cromosoma bacteriano, formando un profago que se mantiene como parte del genoma de E. coli (proceso denomi: nado lisogenia) (Fig. 5.39). Bajo las condiciones apropiadas, la integracion del ADN se puede invertir, provocando la escisién del ADN del fago 7 y la iniciacion Uni6n 0 intermediario de Holiday rave Migracién de ramas uve Rotura de las hobras cruzadas Moléculas recombinantes | Loantro } Figura 5.38 Migracion de ramas y resolucion de las uniones o intermediarios de Holliday. Dos proteinas de E. col (RuvA y RuvB) catalizan el movimiento del punto donde las hebras se cruzan en las uniones de Holliday (migracién de ramas). RuvC re- suolve las uniones de Holliday rompiendo las hebras eruzadas, que son unidas por tuna ligasa,212 @ Seccién Il * Flujo de la informaci Figura 5.39 Procesos litico y lisogénico del bacte- 190 4. La infeccién de E. cols inicia ‘con la inyeccién del ADN dol 2, que pasa a ser circular una vez dentro de la céiula huésped. En la infeccion Itiea, el ADN de 7. 8e replica y ditige la sintosis do prota ras virales. El ADN viral se empaqueta en los virus de la progenie, que son liberados despues de la isis de la célula. En lainfeo- cidn lisogenica, e! ADN de / se recombina con el genoma del huesped para formar n protago que se integra en el cromoso- ma de E, coll. El ADN de 2 integrado no dirige la sintesis de virus, sino que se re- plica junto con el genoma de la bacteria n gené de la replicacién viral Itica. Tanto la integracién como la escisién del ADN de implican la recombinacion especitica de sitio entre las secuencias del ADN viral y la célula huésped. EIADN de E. coliy el ADN del 7 se recombinan en sitios especiticos, lla- mados sitios de adhesin (att; del inglés attachment sites). Por tanto, la integra: cién de! ADN de / implica la recombinacién entre los sitios att del fago (att?) y de la bacteria (att), que presentan 240 y 25 nucledtidos, respectivamente (Fig. 5.40). El proceso esta mediado por una proteina de / llamada integrasa (Int, que se une espectficamente a las secuencias aly att8 Int inicialmente se une a attP, formando un complejo en el que el ADN altP esta envuelto por multiples Bacteridtago % Gy \ seers coscnn la célula huesped y forma A ADN de E. col? ¥ tuna molécula circular Replicacisn del EIADN dol. se ‘ADN del fago & y recombina con sintesis de las, el cromasoma e E col proteinas virales ° ° a ‘ADN empaquetado paniculas virales Célula portadora sis colular Liberacién de ie profagos en los virus sivisién normal oo Lisogenia Ciclo iticoCapitulo 5 * Replicacién, mantenimiento y reorganizacion del ADN gendmico @ 213 copias de la proteina Int. El complejo Int-attP se une a attB, alineando los sitios att del fago y de la bacteria. El fago y la bacteria intercambian hebras dentro de una secuencia central de 15 nucledtidos compartidos por attP y alfB (Fig. 5.40). La proteina Int introduce cortes en el interior de la region central homologa a att y altP, cataliza el intercambio de hebras, y liga las hebras rotas, integrando al ADN de 7 en el cromosoma de E. col. La proteina Int también acta en la escision del profago /, que esencialmente es la inversiin del proceso de integracion. La recombinacién especitica de sitio es importante no solo en la interaccién entre virus como / y sus ¢élulas huésped, sino también en las reorganizaciones programadas dentro de los genomas celulares. En los vertebrados, la recombi ADN de E. colt} Int ate \ tae no eat Profago ken el cromocoma de E coli La integrasa introduce cortes ‘monacatenatios en sitios especifcos ena region central homéloga Figura 5.40 Integracién del ADN de mediante re- combinacién especitica de sitio. La in a tegracion resulta de la recombinacion entre secuiencias especificas en los genomas de 2y E. col, lamados att? y atfB, respect- vamente. El proceso esta catalizado por tuna enzima codificada por ol virus (inte: (grasa), que reconoce las secuencias ati? y att. Intercamblo de habras y ligamiento Sood uuududouna fey Ey 9 0) yd 0 fe) fa Fd a Figura 5.41 Mecanismo de recombinacién especifica de 7. La recombi rnacién especifica de sitio ocurre en una secuencia con un cen- tro de 15 nucledtidos homélogos compartidos por attP y attB La integrasa (Int) rompe en sitios especificos de esta secuen: la para generar colas de ADN de hebra simple. Después cata- liza el intercambio de hebras y su ligamiento, dando como re- sultado la recombinacién entre attP y atlB y [a integracién del ADN de i214 @ Seccién Il * Flujo de la informacion genética Region N vanables N Ragién N ‘constanta Coast r tigre cadens peseda YY Figura 5.42 Estructura de una inmunogiobulina. Las inmunoglobulinas so componen de dos cadenas pesadas y dos cadenas lige- ras, unidas por puentes disulfuro. Las ca~ denas pesadas y ligeras prosentan regio- nies variables y constantes. nacién de especifica de sitio resulta critica para el desarrollo del sistema inmu- ne, que reconoce sustancias ajenas (antigenos) y proporciona proteccién fren- te a agentes infecciosos. Existen dos clases principales de respuestas inmu- nes, las cuales estan mediadas por linfocitos B y T. Los linfocitos B producen anticuerpos (inmunoglobulinas) que reaccionan con antigenos solubles: los linfocitos T expresan proteinas de superficie celular (llamados receptores de células T) que reaccionan con antigenos expresados en la superficie de otras células. La caracteristica principal de las inmunoglobulinas y los receptores de células T es su enorme diversidad, que permite a diferentes moléculas de ant: cuerpos y receptores de las células T reconocer a un vasto nimero de antige- nos ajenos. Por ejemplo, cada individuo es capaz de producir mas de 10" molé- culas diferentes de anticuerpos, lo que es en exceso superior al ntimero total de genes en el genoma humano (30,000-40,000). En lugar de estar codificados en la linea germinal del ADN, estos anticuerpos tan diversos (y los receptores de las células T) estan codificados por genes Unicos de linfocitos que se forman durante el desarrollo del sistema inmune como resultado de la recombinacion specifica de sitio entre los distintos segmentos de los genes de las inmunoglo- bulinas y los receptores celulares T. El papel de la recombinacién de sitio especifico en la formacién de los genes de las inmunoglobulinas lo demostré por primera vez Susumu Tonegawa en 1976. Las inmunoglobulinas consisten en pares de cadenas de nucledtidos pe- ssadas y ligeras idénticas (Fig. 5.42). Las cadenas pesadas y ligeras se compo- nen de regiones C-terminal constantes y regiones N-terminal variables. Las re- giones variables, que contienen diferentes secuencias de aminoacidos en diferentes moléculas de inmunoglobulinas, son las responsables de la unién con el antigeno, y es la diversidad de las secuencias de aminoacids de las regiones variables las que permiten a los anticuerpos de un individuo reconocer a antigenos Unicos. Aunque cada individuo es capaz de producir un vasto es- pectro de anticuerpos distintos, cada linfocito B produce un solo tipo de anti- cuerpo. El descubrimiento clave de Tonegawa fue que cada anticuerpo esta codificado por genes unicos formados por recombinacién especitica de sitio durante el desarrollo de los linfocitos B. Estas reorganizaciones genéticas crean diferentes genes de inmunoglobulinas en los diferentes linfocitos B del indivi- duo, de manera que la poblacién aproximada de 10" linfocitos B en el cuerpo humano incluye células capaces de producir anticuerpos en contra de una gran diversidad de antigenos. Los genes que codifican las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas cons- tan de tres regiones: una regién V que codifica entre 95 y 96 aminoacidos N- terminales de Ia region polipeptidica variable; una region de union (J) que codif- ca entre 12 y 14 aminodcidos C-terminales de la regién polipepticica variable; y tuna region C que codifica a la regién polipeptidica constante (Fig. 5.43). La clase principal de genes que codifican la cadena ligera en el raton se forman por la ‘combinacién de aproximadamente 250 regiones V y cuatro regiones J con una sola regién C. La recombinacién especifica de sitio durante el desarrollo de los linfocitos conduce a la reorganizacién del gen en la que una sola region V se recombina con una sola regién J para generar un gen de cadena ligera funcional. Diferentes regiones V y J se reorganizan en diferentes linfocitos B, de modo que las combinaciones posibles de 250 regiones V con 4 regiones J pueden generar aproximadamente 1.000 (4 x 250) cadenas ligeras tnicas. Los genes de las cadenas pesadas incluyen una cuarta regién (conocida ‘como la de diversidad, o regidn D), que codifica los aminoacidos situados entre las regiones V y J (Fig. 5.44). El ensamblaje del gen funcional de la cadena pesa- {da requiere dos procesos de recombinacién: Una regidn D se recombina con una region J, y después una region V se recombina con el segmento recombinado DJ Enel ratén, existen alrededor de 500 regiones V de cadena pesada, 12 regiones D, y 4 regiones J, por lo que el numero total de cadenas pesadas que se pueden {generar mediante los procesos de recombinacion es 24.000 (500 x 12 x 4),Capitulo § * Replicacién, mantenimiento y reorganizacién del ADN gendmico © 215 Linea germinal del ADN v2 | Roorgenizaién dol gen a v250 20 ———> Jt Reecombinacion espectica de sitio ADN reorganized enol oct & [| — feet — Fees — vi ve V3 3 4 | Transcpién c Transco pinero SS — aaa —— va J3 | scion ARN de la inmunoglebulna aT ve CO wm Las combinaciones entre las 1.000 cadenas ligeras diferentes y las 24.000 cadenas pesadas diferentes que se han formado por recombinacién especrfica de sitio pueden generar aproximadamente 2 x 10° moléculas de inmunoglobuli- na diferentes. Esta diversidad aumenta ain mas debido a que las uniones entre los segmentos genéticos de las inmunoglobulinas son con frecuencia impreci- sas, perdiéndose desde uno hasta varios nuclestidos 0 ganandose otros en los sitios de unidn. Las mutaciones que resultan de estas deleciones e inserciones incrementan la divetsidad de las regiones variables de las inmunoglobulinas aproximadamente unas 100 veces mas, correspondiendo con la formacién de unas 10° cadenas ligeras diferentes y 2 x 10° cadenas pesadas, que pueden combinarse después para formar mas de 10” anticuerpos distintos, Aun asi, des- Linea germinal det ADN p10 p12. vi?! vs00 | Union de os segmentos ze vi” 500 D1 D2 03 D4 Ds J2 | Union de V al segment 7 : vi! v2505u2 J3 Transeripcién Transcrito primario V2505N2 v3 c | Escision ARN! ve5 052 C Figura 5.43 Reorganizacion de los genes de cade- na ligera de las inmunoglobulinas. Gada gen de cadena ligera (se lustran las cadena ligeras « del ratén) consta de una regién constante (C), una region de union (W)y de una region variable (V). Existen aproximadamente 250 reaiones V diferen- tos, que estan soparadas de J y C por lunas 20 kb en la linea germinal del ADN. Durante of desarrolio de los lintocitos B, la recombinacion especitica de sitio une una de las regiones V a una de las cuatro re ‘giones J. Esta reorganizacion activa la iranscripcion, resultande la formacion de un tanserito primario que contiene la re {gin organizada VJ junto con las regiones Jy C restantes. Las tegiones J no utiliza: {das y los intrones entre Jy C se eliminan ppor escisiOn, produciendo un ARNm fun- ional Ss 02 D3 D4 D506 07 DB DS DIT a 2 38 Ut c Dys a by Figura 5.44 Reorganizacién de los ge- nes de cadena pesada de las inmunoglobulinas. Los go- nes de la cadena pesada con: lionen regiones D ademas de regiones V, J, y C. Primero se tunen los segmentos D y J. Despuss se une un segmento Vala region ya organizada DJ Los intrones entre J y C se eli- ‘minan por escisién para dar ol AFINm de la cadena pesada216 @ Seccién Il * Flujo de la informacion genética Figura 5.45 Cadena c Cadena s Estructura de un receptor de células T. Los receptores de células T se componen de / dos cadenas polipeptidicas (x y /) que alraviesan la membrana plasmati constantes, Regiones ‘constantes Unidas por puentes disulfuro, Las cadenas 2 y fi se componen de regiones variables y pués de la formacién de los genes recombinantes de inmunoglobulinas se sigue ‘generando mayor diversidad de anticuerpos a través del proceso conocido como hipermutacién somdtica, que consiste en la introduccién de mutaciones frecuen- tes en las regiones variables en los genes de las cadenas pesadas y ligeras. Los receptores de las células T de forma similar se componen de dos cadenas (lamadas + y fi), cada una de ellas presentando regiones variables y constantes (Fig. 5.45). Los genes que codifican estos polipéptidos se generan por la recom binacion entre los segmentos V y J (la cadena 2) 0 entre los segmentos V, D, y J ((a cadena /!), andlogamente a la formacién de los genes de las inmunoglobuli- | nas. La recombinacién especifica de sitio entre los distintos segmentos de ADN, | ‘en combinacién con las mutaciones introducidas durante la recombinacién, gene- Membrena plasmatica ra un grado de diversidad de los receptores de células T similar al de as inmuno: globulinas. Sin embargo, los receptores de células T difieren de las inmunoglo- bulinas en que ellas no aumentan su diversidad por hipermutacién somatica, La recombinacién VDJ est mediada por un complejo de dos proteinas, deno- minadas RAG1 y RAG2, que se expresan especificamente en linfocitos. Las pro- teinas RAG reconocen las secuencias sefial de recombinacién (RS) adyacentes a las secuencias codificadoras de cada segmento, génico, e inician las reorgani- zaciones de ADN introduciendo una rotura de doble hebra entre las secuencias RS las secuencias codificantes (Fig. 5.46). A continuacién, se unen los extremos codificantes de los segmentos génicos para dar lugar a un gen reorganizado de inmunoglobulina o receptor de células T. Resuita interesante que RAG1 esta int: ‘mamente relacionada con las enzimas que catalizan la transposicion e integracion de ADN retroviral, como discutiremos en la siguiente seccién de este capitulo. Transposicién via intermediarios de ADN La recombinacién especitica de sitio ocurre entre dos secuencias especificas que contienen al menos un pequefio centro homdlogo, Por el contrario, ia trans- posicién implica e! movimiento de secuencias a través del genoma y no requie- Te secuencias homélogas. Los elementos que se mueven por transposicion como aquellos que describié por primera vez McClintock, se denominan mentos transponibles, o transposones. Se dividen en dos clases generales, dependiendo de si se transponen mediante un intermediario de ADN o por un intermediario de ARN. La primera clase de elementos transponibles se discute aqui: la transposicién a través de intermediarios de ARN se considera en la proxima seccion. Los transposones mejor conocidos hasta ahora son los de las bacterias, moviéndose todos ellos por medio de intermediarios de ADN (Fig. 5.47). Los elementos mas simples son las secuencias de insercién, con una variedad de tamaiio entre los 800 y los 2.000 nuclestidos. Las secuencias de insercion se com- pponen solamente del gen de la enzima que participa en la transposicion (transposa- sa) flanqueada por repeticiones invertidas cortas, que son los sitios donde acta la transposasa. Los transposones complejos se componen de dos secuencias de inserci6n que flanquean a otros genes, que se mueven como una unidad. Las secuencias de insercién se mueven desde un sitio cromosémico hasta otro sin replicar su AON (Fig. 5.48). La transposasa introduce una rotura simple en el ADN diana y corta en los extremos de las secuencias invertidas repetidas del transposon. Aunque la transposasa acttia especificamente en las repeticio- nes invertidas del transposon, normaimente es menos especifica respecto a la secuencia del ADN diana, de manera que cataliza el movimiento del transposénCapitulo 5 * Replicacién, mantenimiento y reorganizacién del ADN gendmico @ 217 ~ Union de RAGIRAGS RAG? RAG, Unién de las hebras codificantes rotas =z Secuencia de insercién ‘abod dcba iz “Transposasa 1B Transposén complejo is NN, wm Genes bacterianos Transposasa Figura 5.46 Recombinacién VDJ. Los segmentos Codificadores de los gones de las inmuno- ¢globulinas y los receptores de células T (p. 9j., un sogmento V y D) estan flanqueados por secuencias de sefial de recombinacion ccortas (RS), opuestamente ofientadas en los extremos 5'y 8 de las secuencias coo ficadoras. Las RS son reconocidas por un complejo de proteinas de recombinacion ‘especifica de linfocitos RAG! y RAG2, que rompen el ADN entre las secuencias cod ficadoras y las RS. Las hebras codtficaco- ras rotas se unen para producir un seg- mento del gen reorganizaco, Figura 5.47 Transposones bacterianos. Las se ‘cuencias de insercién varian de 800 a 2,000 nuclestidos y contianen un gen para la transposasa flanqueado por repeticio- nes invertidas (IR) de unos 20 nucieot dos. Los transposones complejos se com- ponen de dos secuencias de insercion {que flanquean a otros genes y tienen una longitud caracteristica de 5 a 20 kb.218 @ Seccién Il * Flujo de la informacion genética Experimento clave Reorganizacion de los genes de inmunoglobulinas Evidencia de la reorganizacién somatica de genes por electroforesis en gel de agarosa. El de Inmumoglobullie que codifican les regiones variable y conatente gel se corté en laminas, y el ADN Nobumichi Hozumi y Susumu Tonegawa extraido de cada lamina fue hibridado Instituto de Inmunologia de Basel, Basel, Suecia con sondas marcadas radiactivamente Procedings ofthe National Academy of Sconces, USA, Volime 75, 1976. pigs. 9626-9632 Preparadas a partir de ARNm de Re cen EE SSPE Irquunogiobulas sisladas do lac Contexto linfocitos. Se aproximaron brasil eS el ; experimentalmente utiizando la fos sondas, correspondientes al ARNm parapet byseagaiel Ltes de digestion por endonucleasas de ‘completo de la inmunoglobulina o al los vertebrados para reconocet 3 —_restriccién para comparar la cextremo 3’ del ARNm, compuesto ua varedad inna de mojscuasSrgarizacion de las secuencias de oxlusivamente de secuencias con oN cpeces da peace las regiones variable y constante _‘fegiones constantes. son capaces de product a en ADN extraldos de embriones de El resultado fundamental fue la omosponene vata verdad de Falany do clus de un obtancién de patrones completamente piper aoe oe ee Diasmocitoma de ratén (un tumor _disinlos para las secuencias de las feconocimiento mune, comprender do. linfocitos B que produce una regiones variables y las regiones. oe ores Sola especie de inmunoglobulinas). _constantes detectadas en el ADN del aparentemente se codifica un Loe. ADN sel emereny a cence ABN numero ilimitado de diferentes plasmoctoma fueron digeridos con encontrados en el ADN del Ree etaiice Gn TDN la endonucleasa de restriccién blasmectoma (véase figure), En ol ADN ‘genémico es uno de los principales BamHI, separandose los A del embrién, la sonda completa hibrida Sees Kala a nunolece. fragmentos de diferentes tamanos Con dos fragmentos BamHI de unas 8.6 Previamente a los experimentos Le aerial de Hozumi y Tonegawa, la ss secuenciacién de proteinas de "ADN ARN] 94KD varias inmunogiobulinas habia Embrisn | Completo demostrado que las cadenas Embrion | Mitad 3 ligeras y pesadas se componian de Piasmacitoma | Gompleto distintas reaiones variables y Piasmacitoma | Mitad 8 a constantes. Estudios genéticos posteriores indicaron que los fatones solo heredaban copias simples de los genes de fa region cconstante. Estas observaciones Ccondujeron a proponer que las inmunoglobuiinas estén codificadas or mcitiples genes de regiones variables que pueden asociarse con tn gen de regién constante. El descubrimiento de las reorganizaciones genéticas de las inmunoglobuiinas por Hozumi y ‘Tonegawa proporcion6 la primera base experimental para esta hipétesis y supuso el inicio dat tentencimiento de la base molecular de la diversidad de anticuerpos. & 8 a6 Kb g ‘Cuenta por minuto (CPM) en et hibrido 8 5 Experimentos Mgracén (cm) Hozum y Tonagawa probaron fa — pireceion de ia electotress Debajo posibilidad de que los genes que Codtican las regiones variable y an Get de eecroloresis dos ADNS de ern yplasmoctoma dgerios con Bam biases Constante de las inmunogiobulinas San senses coreapensertoc al Am complo ou part3 el At Jol puso, Lo estuvieran unidos a nivel del ADN datos estan representados tal y como se detecté la radioactividad en las motéculas hibridas con durante el desarolo de los AADN on cada prc de ge.Capitulo 5 * Replicacién, mantenimiento y reorganizacién del ADN gendmico @ 219 Reorganizacion de los genes de inmunoglobulinas (continuacion) Solamente el fragmento de 8,6 kb hibrida con la sonda 3’, sugiriendo que el fragmento de 8,6 kb Contione las secuencias de la regién constante y que el fragmento de 5,6 kb contiene las secuencias de la regién variable. Por el contrario, ambas sondas hibridan con un solo fragmento de 3,4 kb en el ADN del plasmocitoma. La interprotacién de estos resultados fue que las secuencias de la regién variable y constante estaban separadas en el [ADN det embrién pero que se reorganizaron para formar un solo {gen de inmunoglobulina durante el desarrollo del linfocito. Impacto Los resultados niciales de Hozumi y Tonegawa, basados on los datos felativamente indirectos del mapeo con la endonucleasa de restriccién, se confirmaron y ampliaron a través de la clonacion ‘Transposdn integrado en el silo donante IR Sitio diana BL y secuenciacién molecular de los genes de inmunoglobulinas. Estos estudios establecieron que estos genes se generan por recombinacién especifica de sitio ‘entre distintos segmentos de ADN en los linfocitos B. En los linfocitos T, reorganizamientos similares del ADN son los responsables de la formacion de los genes codificadores do los receptores de células T. Por tanto, la recombinacién las reorganizacones genéticas programadas son esenciales para el desarrollo del sistema inmune. Estudios posteriores han demostrado que las regiones variables de las inmunoglobulinas y los receptores de células T se generan mediante eorganizaciones de dos o tres ‘seamentos diferentes de ADN. La habilidad de estos segmentos para recombinarse, junto a una frecuencia elevada de mutaciones —= [Seeeeceseecaa | } ‘Transposasa rompe en los extiemos de las repeticiones inventidas dol transposén ® inttoduce cortes monacatenarios fen el ADN diana 4 | ~\ Extremos sueltos del AON diana unido al transposén zz —— Roparacién de los espacios por la sintesis de ADN fo Repeiiciones directs del sitio diana del ADN ‘Susumu Tonegawa introducidas en los sitios de recombinacién, es la responsable de la diversidad de las inmunoglobulinas y los receptores de células T. El descubrimiento de los reorganizaciones genéticas de las inmunoglobulinas proporciond las bases para llegar a entender ‘como el sistema inmune puede reconocer y responder a una variedad virtualmente ilimitada de sustancias ajenas. Figura 5.48 Transposicion de secuencias de inser- clon. La transposicion simple no implica la replicacion del AON del transposén. La transposasa rompe en ambos extremos del transposén e introduce un corte mono- catenario en ol ADN diana, Los extremos sSueltos del ADN diana se unen al transpo- én, reparandose los espacios que resul- tan do los cortes monocatenarios. El re- sultado es la formacion de repeticiones directas cortas del sitio diana del ADN (de 5a 10 nucleotides de longitud) flanquean- do al transposon integrado.220 © Seccidn Il * Flujo de la informacion genética Figura 5.49 Organizacién de un ADN retroviral. EI ADN proviral integrada esta flanqueado or repeticiones terminales largas (LTR), que son repeticiones directas de varios clentos de nuciedtidos. Los genes virales, Incluyendo los genes para la transcriptasa inversa y proteinas estructurales de la particula viral, estan localizados entre las secuencias LTRs. El provirus integrado esta flanqueado por repeticiones directas corias del ADN hudsped, allo largo del genoma. Tras el corte del transposén y de los sitios diana del ADN, la transposasa une los exiremos que cuelgan del ADN diana al elemento trans- ponible. El espacio resultante en el ADN diana se repara mediante la sintesis de ADN, seguida por el ligamiento a la otra hebra del transposén. El resultado de este proceso es una repeticion directa corta del sitio diana del ADN a ambos lados del elemento transponible —una marca de la integracién del transposén—. Este mecanismo de transposicion determina el movimiento del transposon desde un sitio cromosémico a otto. Otros tipos de transposones se mueven mediante un mecanismo mas complejo, en el que el transposon se replica de acuerdo con su integracién en el nuevo sitio diana. Este mecanismo produce la integraci6n de una copia del transposén en una nueva posicién en e! genoma, mientras que la otra copia permanece en su posicion original. Los transposones que se trasiadan mediante intermediarios de ADN se en- cuentran presentes en eucariotas ademas de en bacterias. Por ejemplo, el ge~ noma humano contiene aproximadamente 300,000 transposones de ADN, que constituyen el 3% del ADN humano. Los elementos transponibles originalmente descritos por McClintock en el maiz se trasladan mediante un mecanismo no replicativo, al iqual que la mayoria de los elementos transponibles de otras plan: tas y animales. De igual manera que los transposones bacterianos, estos ele- mentos se mueven a muchos puntos diana diferentes a lo largo del genoma. El movimiento de estos transposones a sitios no especificos del genoma no pare- ce ser muy ventajoso para las células en las que ocurre, pero sin duda ha jugado un papel fundamental en la evolucién estimulando las reorganizaciones de ADN. En levaduras y protozoos, sin embargo, la transposicion a través de un me- canismo replicativo es responsable de reorganizaciones programadas del ADN que regulan la expresién génica. En estos casos la transposiciGn se inicia por la accién de una nucleasa especifica de sitio que rompe en un sitio diana especifi- co, en donde se inserta una copia del elemento transponible. Los elementos transponibles son por tanto capaces no solo de moverse a sitios no especificos del genoma, sino también de participar en la reorganizacion especifica de ge- nes determinando cambios programados en la expresion genica. Transposicién via intermediarios de ARN La mayoria de los transposones en las células eucariéticas son retrotranspo- ‘sones, que se trasiadan via transcripcidn inversa de intermediarios de ARN. En el hombre, hay casi 3 millones de copias de transposones, constituyendo mas del 40% del genoma (véase Tabla 4.1). El mecanismo de transposicion de estos elementos es similar a la replicacién de los retrovirus, los cuales han proporcio- nado el prototipo de sistema para el estudio de esta clase de secuencias de ‘ADN méviles. Los retrovirus contienen genomas de ARN en sus particulas virales pero se replican mediante la sintesis de un provirus de ADN, que se integra en el cromo- soma de ADN de las células infectadas (véase Fig. 3.13). La enzima trans- criptasa inversa sintetiza una copia de ADN partiendo del ARN viral. A través de este mecanismo se produce la sintesis de una molécula de ADN que con- tiene repeticiones directas de varios cientos de nucledtidos en ambos extre- mos (Fig. 5.49). Estas secuencias repetidas, llamadas repeticiones termina- les largas, 0 LTRs (del inglés, long terminal repeats), surgen de la duplicacion de los sitios del ARN donde se unen los cebadores para comenzar la sintesis de LR, UR ‘DN Genes viales *ADN huésped gg tsp ProvinusCapitulo 5 * Replicacién, mantenimiento y reorganizacion del ADN genomico @ 221 )ARN cobador ARN viral = RUS PBS us Fi La transcriptasa inversa sintetiza el cebador ‘en direccion 5) del molde de ARN RUS PBS. us A La ARNasa H degrada la hebra de ARN el duplex de ARN-AON RUS que PBS La transeriptasa inversa sata por hibridacién U9 ‘del ADN con la secuencia Ron el extremo 3' del ARN RUS [ces PBS us A La wanscriptasa invorsa sintetiza el cebador ‘diiplox de ARN-ADN dogradado por la Nasa H U3 AUS, de la Segunda hebra de ADN PEE | El fragmento de ARN inicia la sintes's us _R_US: | Sintoss do as hebras de ADN gc PBS: U3 RUS: U3 AUS PES. ‘Segundo salto por hibridacién do las secuencias PBS SELES EET PEST YESS ESET PBS us RUS; | Sintesis de ADN compieta USB US PBS U3 RUS; Bae uA ur ADN. Las secuencias LTR se presentan como un elemento central para la transcripcién inversa, ademas de estar implicadas en la integracién y posterior transcripcién del provirus de ADN. Como todas las ADN polimerasas, la transcriptasa inversa necesita un ce- bador, que en e! caso de los retrovirus es una molécula de ARN! unida a un sitio especitico (sitio de union del cebador) cerca del extremo 5’ del ARN viral ion de las LTR durante la transcripeion inversa. Las LTA se com: ponen de tres elementos secuenciales: luna Secuencia de ropeticién corta (R) de unos 20 nucleotidos que esta presente en ‘ambos extremos del ARN viral: una se- ‘cuencia nica del extrerno 5) del ARN viral (US): y una secuencia Unica del extrerno 3 del ARN viral (U3). Las repeticiones de ‘estas secuencias se generan durante la sintesis del ADN cuando la transcripiasa inversa salta dos veces entre los ext: mos de su molde. La sintesis comienza utiizando un cebedor de ARNI unido a un sitio de union al cebador (PBS) adyacente US en ol exiremo 5’ del ARN viral. La polimerasa copia a A, y la hebra de ARN del hibrido de ARN-ADN es degradada por la ARNasa H. Después la polimorasa Salta al extremo 3' del ARN viral para sin {etizar una hebra completa de ADN com: plementaria ala hebra molde de ARN. La polimerasa salta de nuevo durante la si Tesis de la segunda hebra de ADN, que también se inicia por la union de un ceba- dor cerca del extremo 5 de su molde, El resultado de estos saltos es la formacion de LTRs que contienen secuencias US-R Us.222 @ Seccién Il * Flujo de la informacion gené! (Fig. 5.50). Puesto que la sintesis del ADN es en el sentido de 5 a 3’, solamente lun pequeno segmento de ADN es sintetizado antes de que la transcriptasa in versa alcance el final de su molde. La continuacién de la sintesis del ADN de- pende de la capacidad de la transcriptasa inversa para «saltar» al extremo 3’ de la molécula molde de ARN. Esto se consigue gracias a la actividad ARNasa H de la transcriptasa inversa, que degrada la hebra de ARN de los hibridos de ADN-ARN, Como resultado, el ADN recién sintetizado se convierte en una mo- Iécula de hebra simple, que puede hibridar con alguna secuencia repetida corta que esté presente en los extremos 5’ y 3' del ARN viral. Por tanto la sintesis de! ADN puede continuar, produciendo una molécula de ADN de hebra unica com: plementaria al ARN viral. La sintesis de la hebra opuesta de ADN comienza a través de un fragmento del ARN viral que actiia como iniciador, en un sitio cerca del extremo 3’ de la hebra molde de ADN. De nuevo el resultado es un segmen- to corto de ADN, que incluye el sitio de union del cebador copiado a partir del ARN utilizado como cebadorinicial de la transcripcién inversa. La secuencia de unién all cebador de ARNt es degradada por la ARNasa H, dejando una hebra de ADN colgando que de nuevo «salta» para emparejarse con su secuencia complementaria al otro extremo del molde. Asi, la sintesis del ADN puede conti- nuar una vez mas, resultando finalmente un ADN linear con LTRs en ambos extremos. EIADN viral linear se integra en el cromosoma de la célula huésped mediante un proceso que recuerda a la integracion de los elementos transponibles. La inte- gracién esta catalizada por una proteina de integracién viral y se da en muchas secuencias diana diferentes del ADN celular. La proteina de integracién rompe dos bases antes de los extremos del ADN viral e introduce un corte monocatena- rio en el sitio diana del ADN celular. Los extremos colgantes del ADN celular se unen al extremo del ADN viral, y el espacio es rellenado con la sintesis de ADN. El provirus integrado esta por tanto tlanqueado por una repeticion directa de las secuencias celulares, similar a las repeticiones que flanquean a los transposo- nes de ADN. El ciclo de vida del virus continua con la transcripcién del provirus integrado, que produce ARN genémico viral como ARNm que dirige la sintesis de las pro- teinas virales (incluyendo la transcriptasa inversa y la proteina de integracidn). EIARN genémico se empaqueta en las particulas virales, que son liberadas de la célula huésped. Esta progenie viral pueden infectar a una célula nueva, ini- ciando asi otro proceso de sintesis ¢ integracién del ADN. El efecto neto pode- mos definirlo como el movimiento det provirus desde un sitio cromosémico a otro, mediante la sintesis y la transcripcién inversa de un intermediario de ARN. Otros retrotransposones differen de los retrovirus en que no se empaquetan enparticulas infecciosas y por lo tanto no pueden pasar de una célula a otra. Sin embargo, estos retrotransposones pueden moverse a una nueva diana cromo- sémica dentro de una misma céiula, mediante mecanismos fundamentalmente similares a los implicados en la replicacién de los retrovirus. Algunos retrotransposones (denominados elementos semejantes a los re- trovirus 0 retrotransposones LTR) son similares estructuralmente a los retrovi- Levadura Ty! 390 pb 330 pb =F ‘Secuencias que codiican proteinas a ee Figura 5.51 Estructura del retrotransposén LTR. E! elemento transponible de levaduras Ty1 pre~ ssenta la misma organizacion que un retrovirus. Las secuencias codificadoras de protel- ras, incluyendo genes para la transcriptasa inversa y proteinas de imtegracion, estan fla queadas por LTRs (lamados elementos i) de unas 330 pares de bases (pb). El transposon integrado esta flanqueado por repeticiones directas cortas del sito diana del ADN.Capitulo § * Replicacién, mantenimiento y reorganizacién del ADN gendmico @ 223 rus (Figura 5.51). Los retrotransposones de este tipo constituyen aproximada- mente el 8% del genoma humano, Poseen secuencias LTR en ambos extre- mos; codifican la transcriptasa inversa y la integrasa; y se transponen (como retrovirus) mediante la transcripcién a ARN, sintesis de una nueva copia de ADN por la transcriptasa inversa ¢ integracién en el ADN celular. Los retrotransposones no LTR difieren de los retrovirus en que no contienen secuencias LTR, aunque si codifican su propia transcriptasa inversa. En mami- foros, la clase principal de estos retrotransposones consiste en elementos dis persos largos y altamente repetitivos (LINES: long interspersed elements), que Se repiten aproximadamente 850.000 veces en el genoma y constituyen aproxi- madamente el 21% del ADN genémico (véase Capitulo 4). Un elemento LINE completo es de 6 a 7 kb de largo, aunque la mayoria de los miembros de la familia estan truncados en su extremo 5’ (Fig. 5.52). En su extremo 3', los LINES poseen regiones de secuencias ricas en A que se creen derivadas de la trans- Cripcién inversa de las colas de poliA que se afaden a los ARNm despues de la transcripcién (véase Capitulo 6). Al igual que otros elementos transponibles, los LINEs se encuentran flanqueados por pequenas repeticiones directas del punto diana del ADN, indicando que la integracion implica cortes escalonados y repa- racion por sintesis. Puesto que los LINEs no contienen secuencias LTR, el mecanismo de su trans- ctipcion inversa y posterior integracién en el ADN cromosémico debe ser distinto de aque! utlizado por los retrovirus y la clase | (contienen LTRs) de retrotransposones. En particular, la transcripcidn inversa se inicia con la rotura de un extremo del ADN cromosémico por el sitio de integracién , que resulta del corte en el sitio diana del ADN por una nucleasa codificada por el retrotransposén (Fig. 5.53). Se inicia por tanto la transcripcién inversa con la cola poli-A en el extremo 3 del transposon de ‘ABN y que continia a lo largo de la molécula. La hebra opuesta de ADN se sinteti- za utlizando como cebador el otro extremo roto del sitio diana del ADN, resultando asi simullaneas la sintesis y la integracién del retrotransposén de ADN. Otros elementos secuenciales, que no codifican su propia transcriptasa in- versa, también se transponen via intermediarios de ARN. Estos elementos in- cluyen a las secuencias altamente repetitivas cortas dispersas (SINEs), de las que existen cerca de un millén de copias en los genomas de los mamiferos (véase Capitulo 4). La principal familia que representa a estos elementos se ‘compone de secuencias Alu, que constan aproximadamente de 300 bases de longitud. Estas secuencias son ricas en segmentos de poli-A en sus extremos 3 yeestan flanqueadas por duplicaciones cortas de las secuencias diana del ADN, una estructura similar a la de los retrotransposones que carecian de secuencias LTR (p.e., los LINEs). Los SINEs surgen de la transcripcién inversa de peque- fos ARN, que incluyen alos ARNt y a pequefos ARN citoplasmaticos implica dos en el transporte de proteinas. Puesto que los SINEs no coditican productos funcionales de! ARN, representan pseudogenes que se forman por la transposi- cién de ARN. Los pseudogenes de muchos genes codificadores de proteinas (lamados pseudogenes procesados) surgen de forma similar a través de la {ranscripcion inversa del ARNm (Fig. 5.54). Estos pseudogenes procesados se PTE Hae - Transcrpiasa inversa « ew Figura 5.52 Estructura de LINEs humanos. Los LINEs carecen de LTRs, pero coditican la transcrip- tasa inversa, Presenta tramos de secuencias ricas en A (designadas A,) en sus extremos 3), que se cree que derivan de la transcripcién inversa de colas de poli-A anacidas al fextremo 3’ de los ARNm. Al igual que otros elementos transponibles, los LINEs estan lanqueados por repeticiones directas cortas del sitio diana del ADN,224 @ Seccidn Il * Flujo de la informacion genética Figura 5.53 Modelo de transcripcién inversa e inte- grador de LINES. El punto diana dol ADN @s escindido por una nucleasa codificada porel rotrotransposén. La transcripcion ine versa, desencadenada por un extremo roto del ADN diana, se inicia en el interior de la cola de poli en el extremo 3' de! retro- transposon de ARN. La sintesis de la he- bra puesta del retrotransposon de ADN se desencadena de forma similar por la otra hebra de ADN en el punto diana. Escision de ADN diana ADN diana con cortes escalonados 8 ee | 9 3 fet 8 Retrotransposén §° AN 3 de ABN ADN diana utlizado ‘como cebador © primer para la tanscricgn inverse 8 3° [iia _ 5 Sintesis de una hebra complementaria al retrotransposén de ARN. Degradacién de ARN por ARNasa H 3 — 5 SSS arr Sintesis de la hebra ‘puesta de ADN pueden reconocer facilmente no sélo por la presencia de los segmentos ricos en A sino también por que se han eliminado los intrones que estaban presentes en el correspondiente gen normal durante el procesamicnto del ARNm. La transposicién de los SINEs y otros pseudogenes procesados se cree que trans curre de manera similar a la transposicion de los LINEs. Sin embargo, debido a que estos elementos no incluyen los genes para la transcriptasa inversa u otra nucleasa, su transposicién presumiblemente implica la accién de transcriptasas inversas y nucleasas que estan codificadas en alain otro lugar del genoma —po- siblemente por retrotransposones de clase | 0 Il, como los LINES—: ‘Aunque los altamente repetitivos SINEs y LINEs representan una fraccion significativa del ADN genémioo, su transposicién a sitios aleatorios en el genoma parece ser que no resulta muy util para la célula en la que se enouentran. Estos transposones inducen mutaciones cuando se integran en un sitio diana nuevo, y al igual que las mutaciones inducidas por otros agentes, la mayorla de las muta- ciones resultantes de la integracién por transposicion se espera que sea danina para la célula, De hecho, las mutaciones se han asociado con algunos casos de hemofiia, dstrofia muscular, y cancer de colon. Por el contrario, algunas mutaci nes derivadas de la transposicién de estos elementos puede ser beneficiosa, contribuyendo de manera posttva en la evolucién de las especies. Por ejemplo, algunos retrotransposones en los genomas de mamiferos contienen secuencias, reguladoras que controlan la expresion de genes adyacentes. ‘Ademeés de su papel como mutagenos, los retrotransposones también pue- den contribuir ala diversidad genética mediante la estimulacién de reorganiza- ciones del ADN. Las secuencias de ADN celular que se encuentran adyacentes a los LINEs con frecuencia se intercambian en el proceso de transposicion. Como consecuencia, la transposicién de los LINES puede dar lugar al movi- miento de secuencias de ADN celulara sitios nuevos en el genoma, Puesto que los LINEs son capaces de integrarse dentro de genes activos, la transposiciénCapitulo 5 * Replicacién, mantenimiento y reorganizacion del ADN gendmico @ 225 Exon non Exén 2 inwén2 xn Figura 5.54 So SSS 2 Ge" egomtcrac content ror oxonen Gen 3 s do. El gen ilustrado contiene tres exones, sseparades por dos intrones. Los intone Transeipcién se eliminan del transcrito primar. me dante escision, y se afade una cola de Transerto px] $s ~~] pal-A al extremo 3 del ARNm. La trans primaro E tripcién inversa y la integracion producen Escisiin {un pseudogén procesado, que no conto he inlrones y presenta un tramo rico en A fn su extreme 3. El pseudogén procesa 40 esta flanqueado por repeticiones direc- tas cortas del sitio diana del ADN que se. -ranasiiita eho {generaron durante la integracion. Iniegracion en un sitio eromosémico ‘nuevo PA TE Adicion de una cola polrA asociada de las secuencias de ADN celular puede conducir a la formacién de nuevas combinaciones de secuencias reguladores y/o codificadoras y contribuir directamente a la evolucion de nuevos genes. La gran mayoria de los elementos transponibles del genoma humano son inactivos, con sélo unas 100 copias de LINEs que mantienen las secuencias codificadoras de proteina necesarias para su transposicién. Todos los transpo- sones de ADN humanos y la mayoria de los retrotransposones representan asi reliquias de la evolucién en lugar de elementos actualmente funcionales. Sin ‘embargo, éste no es el caso en otras especies, incluyendo Arabidopsis, C. ele-

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  The Handmaid's Tale

  Margaret Atwood

  Calificación: 4 de 5 estrellas

  4/5 (13226)
• Elon Musk

  

  De Everand

  Elon Musk

  Walter Isaacson

  Calificación: 4.5 de 5 estrellas

  4.5/5 (440)
• To Kill a Mockingbird \ Matar a un ruiseñor (Spanish edition)

  

  De Everand

  To Kill a Mockingbird \ Matar a un ruiseñor (Spanish edition)

  Harper Lee

  Calificación: 4.5 de 5 estrellas

  4.5/5 (22958)
• Pride and Prejudice: Bestsellers and famous Books

  

  De Everand

  Pride and Prejudice: Bestsellers and famous Books

  Jane Austen

  Calificación: 4.5 de 5 estrellas

  4.5/5 (20479)
• Never Split the Difference: Negotiating As If Your Life Depended On It

  

  De Everand

  Never Split the Difference: Negotiating As If Your Life Depended On It

  Chris Voss

  Calificación: 4.5 de 5 estrellas

  4.5/5 (3285)
• Oscar Wilde: The Unrepentant Years

  

  De Everand

  Oscar Wilde: The Unrepentant Years

  Nicholas Frankel

  Calificación: 4 de 5 estrellas

  4/5 (10242)
• Anna Karenina: Bestsellers and famous Books

  

  De Everand

  Anna Karenina: Bestsellers and famous Books

  Leo Tolstoy

  Calificación: 4 de 5 estrellas

  4/5 (7503)
• The Hobbit

  

  De Everand

  The Hobbit

  J. R. R. Tolkien

  Calificación: 4.5 de 5 estrellas

  4.5/5 (24728)
• American Gods: The Tenth Anniversary Edition

  

  De Everand

  American Gods: The Tenth Anniversary Edition

  Neil Gaiman

  Calificación: 4 de 5 estrellas

  4/5 (12949)
• Matar a un ruisenor (To Kill a Mockingbird - Spanish Edition)

  

  De Everand

  Matar a un ruisenor (To Kill a Mockingbird - Spanish Edition)

  Harper Lee

  Calificación: 4.5 de 5 estrellas

  4.5/5 (23060)
• Wuthering Heights (Seasons Edition -- Winter)

  

  De Everand

  Wuthering Heights (Seasons Edition -- Winter)

  Emily Bronte

  Calificación: 4 de 5 estrellas

  4/5 (9486)
• Ana Karenina: Clásicos de la literatura

  

  De Everand

  Ana Karenina: Clásicos de la literatura

  León Tolstói

  Calificación: 4 de 5 estrellas

  4/5 (7440)
• The Iliad: A New Translation by Caroline Alexander

  

  De Everand

  The Iliad: A New Translation by Caroline Alexander

  Homer

  Calificación: 4 de 5 estrellas

  4/5 (5719)
• The Picture of Dorian Gray: Classic Tales Edition

  

  De Everand

  The Picture of Dorian Gray: Classic Tales Edition

  Oscar Wilde

  Calificación: 4 de 5 estrellas

  4/5 (9758)