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DIVISIN DE INGENIERAS DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA Y METALURGIA BIOQUIMICA GENERAL PRCTICA EXTRACCION DE DNA DE TEJIDOS Y VEGETALES"

Introduccin

El ADN por las siglas de Acido Desoxirribonucleico, es una molcula de gran tamao que guarda y transmite de generacin en generacin toda la informacin necesaria para el desarrollo de todas las funciones biolgicas de un organismo. El ADN est formado por la unin paralela de dos cadenas, cada cadena se encuentra conformada por 4 diferentes nucletidos. Lo que hace que el ADN sea tan variado (por ejemplo de peces, plantas, bichos, humanos etc.) es la posicin y la cantidad de estos cuatro nucletidos a lo largo de las dos cadenas, a esta secuencia se le llama cdigo gnico o gentico, o bien genoma. El ADN de todos los organismos vivos est formado por solo stos cuatro nucletidos. Su estructura fue descubierta en 1953 por los cientficos Watson y Crick, descubrimiento que aos ms tarde los hara ganadores del premio Nobel. El ADN de manera global dirige la sntesis de todas las protenas, se podra decir en trminos ms sencillos que el ADN es una acumulacin de genes (fragmentos de ADN) y cada gen es la clave para la produccin de una protena. Desde el punto de vista qumico, el ADN es un polmero de nucletidos, es decir, un polinucletido. Cada nucletido est formado por un azcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser adeninaA, timinaT, citosinaC o guaninaG) y un grupo fosfato . Lo que distingue a un nucletido de otro es la base nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando slo la secuencia de sus bases. La disposicin secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena es la que codifica la informacin gentica: por ejemplo, una secuencia de ADN puede ser ATGCTAGATCGC... En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doble cadena de nucletidos, en la que las dos hebras estn unidas entre s por unas conexiones denominadas puentes de hidrgeno.

En esta prctica realizaremos la extraccin del ADN, el cual tiene mltiples aplicaciones, ya que es un procedimiento importante de la biologa molecular. Por definicin, es extraer ADN de cualquier tipo de clula con el propsito de analizarla. Entre las mquinas utilizadas para extraer el ADN estn las "Batidoras", las cuales rompen las clulas para acceder al ADN, el "Frasco de gel", el cual separa las secuencias de ADN en un gel usando una carga elctrica, y la centrifugacin (el cual es el mtodo que utilizamos), la cual hace girar una solucin de ADN y luego lo precipita (extrayndolo) utilizando sales. Una vez que se extrae el ADN, su importancia se usa para numerosas funciones, como por ejemplo: Identificacin de criminales Una razn por la cual la extraccin de ADN es importante es porque proporciona el anlisis del ADN si hay algn caso de investigacin criminal que lo requiera. La mayora de las veces, un sospechoso es declarado culpable slo por el resultado que se obtiene del anlisis de muestras de ADN, especialmente cuando no se cuenta con otras evidencias. Identificacin histrica El ADN ha sido utilizado para identificar a las vctimas y heridos del holocausto judo del 11 de septiembre. Adems, tuvo un rol vital en la identificacin de las personas que fueron secuestradas y asesinadas en Argentina en la dcada de 1970, varios aos despus de que ocurrieron los hechos. En el presente trabajo se muestra el procedimiento de la extraccin de ADN que en mi caso el material a utilizar es cebolla, el cual la finalidad de esta prctica es conocer el mtodo ( en ese caso utilizamos uno de ellos) y sobre todo poder visualizar el ADN de nuestra materia prima.

Materiales
Tubos de ensaye Pipetas Micropipetas Gradilla Licuadora Cuchillo Vasos de precipitado Sustancias Muestra (Cebolla) 2-isopropanol Tampn (agua mineral, champ, bicarbonato, sal) Bufer (citrato-salina) Azul de metileno

Mtodo de preparacin

Preparacin del tampn 1. Mezclar y enfriar a 0C. 240 ml de agua mineral 3 gr de sal 10 gr de bicarbonato 10 ml de champ

Preparacin del material biolgico 1. Triturar la muestra (cebolla) en la licuadora hasta conseguir un pur de cebolla. 2. Mezclar el pur con el tampn frio, 10ml de pur con 20 de tampn. 3. Agitar durante varios minutos. 4. Se agrega la mezcla en dos tubos y

posteriormente centrifugar por 10 minutos. 5. Tomar solo el sobrenadante, colocarlo en un vaso de precipitado y adale 10 ml de isopropanol

fro poco a poco sobre las paredes del vaso. 6. Observar como con la adicin del alcohol se empiezan a formar tres fases dentro del vaso de precipitado. 7. Tomar con una varilla la segunda capa formada (se puede distinguir por el color blanco, el cual ste contiene el ADN a utilizar). 8. Agregar el contenido en un tubo de ensaye. 9. En el tubo de ensaye dejar reposar hasta que se separe el alcohol, decantarlo y centrifugarse de nuevo. 10. En las paredes del tubo se encontrara en material biolgico. 11. Al resto del lquido todava contiene ADN si al aadir azul de metilo se tie de azul.

Caracterizacin espectral del ADN

1. Recuperar el ADN del procedimiento anterior con la ayuda de una varilla de vidrio. Eliminar el exceso de etanol escurriendo y

presionando contra la pared del vaso de precipitado. 2. Disolver el ADN en 5 ml de solucin citratosalina diluida. 3. Preparar 20 ml de una dilucin 1:10 de ADN con solucin de citratosalina diluida. 4. Determinar la absorbancia de la muestra diluida a 260 nm empleando un blanco de solucin citrato-salina diluida. 5. Si la absorbancia (Densidad ptica) es mayor de 1.0 preparar una dilucin para reducir a un valor cercano a 0.7 unidades de densidad ptica (DO). 6. Calcular la concentracin de ADN obtenido, tomando en cuenta que 50 g de ADN tienen una absorbancia de 1.0 DO a 260 nm.

Efecto hipercrmico 1. Transferir 1.5 ml de la solucin de ADN (diluida a una DO de 0.7) a 7 tubos de 5 ml. 2. Incubar por 5 minutos cada uno de los tubos a una de las

siguientes temperaturas: 0, 20, 40, 50, 60, 80 y 100 C. 3. Preparar un tubo blanco con 1.5 ml de solucin de citrato-salina

diluida e incubarlo simultneamente con el respectivo tubo problema. 4. Una vez transcurrido el tiempo, transferir inmediatamente los tubos a un bao de hielo. 5. Determinar la absorbancia de cada una de las muestras a 260 nm empleando el blanco de solucin de citraro-salina diluida

correspondiente. 6. Graficar los valores obtenidos de densidad ptica (eje Y) contra la

temperatura a la cual fue incubado el ADN (eje X) y explicar los resultados obtenidos con base a la estructura del ADN.

Resultados
Ecuacin:

Datos Abs, Temperatura Abs, Tomate Cebolla 0 24 25 40 50 60 80 100 0.494 0.477 0.494 0.492 0.5 0.535 0.566 0.509 0.564 0.555 0.551 0.534 0.542 0.539 0.523 0.514 Abs, Pepino 0.569 2.3 2.32 2.314 2.38 0.619 0.682 2.35 Abs, Huevo 0.49 0.419 0.466 0.46 0.477 0.468 0.37 0.509

Figura1 .- Grfica Absorbancia de las distintas muestras VS temperatura

0.6 0.5 0.4 A, Tomate 0.3 0.2 0.1 0 0 20 40 60 80 100 120 A, Cebolla A, Huevo

*Se puede apreciar en las tres graficas como vara la absorbancia con el aumento de la temperatura; las tres poseen un comportamiento similar, sin embargo en algunos datos registrados se puede notar una disminucion de absorbancia al aumento de la temperatura(se podra decir que esos datos extraos podra ser consecuencia del "error humano"), pero la tendencia es aumentar la absorbancia al aumento de temperatura. Figura2 .- Grfica Absorbancia del pepino VS temperatura

A, Pepino
3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 20 40 60 80 100 120 A, Pepino

En esta grfica fue la ms distinta a las otras tres muestras anteriores, mostrando mximos y mnimos de absorbancia a distintas temperaturas. Se esperaba un comportamiento ms similar a los dos vegetales utilizados.

Conclusiones
Conforme a los resultados obtenidos se puede apreciar en la grfica cmo vara la absorbancia con respecto a la temperatura, el cual aumentaba su valor (con respecto al inicial, el final si era mayor su valor en los 4 casos). Se puede observar como la cebolla, el tomate y el huevo poseen similitud en su grfica, sin embargo se nota disparidad en la grafica del pepino, esto se puede deber a algunos problemas o errores durante la prctica. Tambin se visualiza cmo la grfica de las dos muestras de origen vegetal poseen mayor similitud en su grfica, sin embargo la grafica del huevo a pesar de mostrar la misma tendencia que las otras dos anteriores posee diferencias, esto puede ser porque estamos tratando con ADN animal , y las variaciones se comporten distintas que con vegetal.

Bibliografa CARLSON, S. (1998). Deshilando el tejido de la vida. Investigacin y Ciencia. 266, 84-85. Para ms informacin: http://www.edvotek.com/ web2.thesphere.com/SAS/WebX.cgi http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Estruadn/estruadn.ht m http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleico