Muestreo de material vegetal y establecimiento del mtodo de desinfeccin en cultivo in vitro de yemas axilares de Polylepis incana para su micropropagacin

Espn Pamela, Guerra Karla, Guevara Patricia, Jtiva Sofa1 1 Escuela Politcnica del Ejrcito (ESPE), Departamento de Ciencias de la Vida, Carrera de Ingeniera en Biotecnologa, PO Box: 171-5-231-B. Sangolqu-Ecuador. E-mails: mpespin@espe.edu.ec, kdguerra1@espe.edu.ec, pguevara@espe.edu.ec, sejativa@espe.edu.ec RESUMEN El propsito de este trabajo fue inducir brotes de Polylepis incana a partir de yemas mediante la utilizacin de la tcnica de cultivo in vitro. Para ello se recolectaron muestras de Polylepis incana en la Reserva Ecolgica Lodge (Carchi-Ecuador). Luego, se rociaron con fungicida y cido ctrico, cubriendo el sitio del corte con papel parafilm. Su transporte al laboratorio fue en coolers. De las muestras se obtuvieron explantes; los cuales fueron desinfectados con: detergente 3% (15 minutos), agua destilada, agua estril, fungicida (15 minutos) y cloro al 2%, con 3 gotas de Tween-20 (10 minutos). Para la siembra se utiliz medio MS al 50 %. Al final se obtuvo 8 frascos sembrados (1 explante por frasco). Los resultados fueron observados a los 16 das de la siembra, los resultados obtenidos fueron en viabilidad un solo explante, en contaminacin el 50% de los medios afectados y en necrosis el 50% de los cultivos con muerte celular severa, en conclusin podemos decir que se debe efectuar un proceso de desinfeccin apropiadamente. Palabras clave: Polylepis, yemas, cultivo in vitro. INTRODUCCIN La Reserva Ecolgica Polylepis lodge est ubicada en la Provincia del Carchi (El ngel) a 3523 msnm, la cual busca la conservacin del Bosque Milenario de Polylepis incana que existe en el mundo y en los Pramos Ecuatorianos (Halberstadt, 2010). Los bosques de Polylepis constituyen la vegetacin natural de una gran parte de los Andes centrales a altitudes entre 3.500 m y 4.400 m. Las aproximadamente 28 especies del gnero ocupan una gran variedad de hbitats, desde el lmite superior de bosques de neblina hasta los volcanes ridos del Altiplano. Sin embargo, durante milenios las actividades humanas han destruido a ms del 95% de estos bosques, restringindolos a hbitats especiales y modificando su composicin florstica y faunstica (Caranqui, 2010). El gnero Polylepis pertenece a la tribu Sanguisorbeae de la familia Rosaceae, que se caracteriza por una polinizacin anemfila y por sus frutos secos. Tambin conocidos como rboles de papel o colorados, son rboles que alcanzan altitudes de 5 a 10 metros (Jadn et al., 2007).
1

Polylepis incana son rboles o arbustos de hasta 12 m con corteza exfoliante en lminas papirceas, rojizas. De vaina estipular con vellosidades en el pice. Hojas trifoliadas cubiertas con pelos cortos granulares. Las puntas de las ramas tienen gran densidad de hojas. Sus flores son aptalas de coloracin verdosa y con la presencia de llamativos estambres de color oscuro. sta especie est distribuido en Ecuador, Per y Bolivia (Betancourt, Rojas, 2011). Los bosques de Polylepis cumplen importantes funciones ecolgicas, ya que contienen una parte importante de la biodiversidad de Sudamrica, adems, controlan procesos erosivos, aumentan el aporte hdrico mediante la condensacin de neblina en sus hojas, protege las cuencas y proveen refugio a una serie de animales y plantas (Kessler, 2006). La reproduccin de este gnero a partir de semillas es muy limitada debido a su bajo poder germinativo. Las tcnicas de cultivo de tejidos vegetales, como la propagacin in vitro, es una posible solucin para las especies que presentan problemas reproductivas, de tal manera que se puede desarrollar alternativas de conservacin ex situ (Vega et al., 2007). El objetivo de este trabajo es implementar el mejor mtodo de desinfeccin para la introduccin y cultivo in vitro de Polylepis incana a partir de yemas axilares en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales. MATERIALES Y MTODOS La recoleccin del material vegetal se realiz en la Reserva Ecolgica Polylepis Lodge, ubicada en el ngel, provincia del Carchi Ecuador. Para obtener el material vegetal, se procedi a la eleccin de varios individuos de P. incata, los cuales presentaban las mejores

caractersticas fenotpicas y con mayor nmero de yemas jvenes. La obtencin de las muestras se realiz cortando ramas con una tijera de podar. Una vez que se recolectaron las ramas, se lavaron con agua corriente y estril, luego se las roci con fungicida y cido ctrico al 1%. Despus se sellaron con parafilm en la base del corte a fin de evitar la prdida de humedad y reducir el proceso de deterioro fisiolgico del material vegetal. Finalizado este proceso se envolvieron las ramas en papel toalla y se colocaron en fundas plsticas para almacenarlas en el cooler y de esta manera se transport hasta el laboratorio. Posteriormente, en el laboratorio se aislaron las yemas con primordios foliares de Polylepis incana mediante cortes con bistur, y se lav en agua corriente para eliminar residuos de tierra o impurezas. En una solucin de detergente al 3% y se sumergi las yemas por 15 minutos en agitacin, despus se descart el detergente y se enjuag los explantes dos veces con agua destilada y una vez con agua estril. Se elimin el agua y se sumergi las muestras en una solucin de fungicida al 2% y se mantuvo en agitacin por 15 minutos. Luego se sumergi las muestras en una solucin de cloro al 2%, con 5 gotas de Tween-20 por un perodo de 10 minutos en agitacin. Inmediatamente se traslad las muestras sumergidas en hipoclorito a la cmara de flujo laminar previamente esterilizada y se realiz tres lavados con agua estril dentro de la misma. Para la siembra, se realiz cortes en la parte superior e inferior del explante para eliminar todo el tejido necrosado por el cloro, y se coloc un explante por frasco de medio (1/2MS + 0.5 mg L-1de BAP + 1 gL-1 de carbn activado); siendo en total ocho frascos. Se sell el frasco con la ayuda de plstico de cocina y ligas. Se incub en la luz y se analizaron los resultados al
2

transcurrir 16 das. Las condiciones a las cuales se incub los medios fueron a: 22C, 50% de humedad y 0,6456 luxes. RESULTADOS Los resultados fueron recolectados a los 16 das de la siembra. La viabilidad del total que se observ en los explantes introducidos fue de un 12,5% que representa el nico explante con viabilidad intermedia calificado con 1 en una escala de 0 a 2 como se observa en el Grfico 1.

De igual forma, se logro determinar un porcentaje de necrosis del 50%, tanto para nivel intermedio (1) como para el nivel mximo (2) observe Grfico 2; y un porcentaje de contaminacin general del 50% debido principalmente a bacterias y hongos que colonizaban alrededor de a base del explante, en un porcentaje de contaminacin bacteriana tenemos 37,5% y contaminacin de hongos en un 12,5% observe Grfico 3.

En las imgenes que se muestra a continuacin (Imagen 1) se puede verificar el estado de los explantes a los 16 das de la siembra, donde claramente se visualiza la viabilidad de nico explante del frasco con nmero 1; de igual forma se observa la necrosis avanzada en los explantes 2, 4, 5 y 6 al igual que la intermedia en los explantes 1, 3, 7 y 8; la contaminacin por hongo en el frasco nmero 5 junto con la contaminacin por bacterias en los frascos 2, 3 y 6.

Imagen 1. Estado de los explantes de Polylepis incana a los 16 das de la siembra

DISCUSIN El mayor problema que sigui la induccin de Polylepis incana, fue un elevado porcentaje de necrosis y contaminacin que presentaron los explantes (50%). Por lo que conllevo a que solo un explante sea viable (Grfico 1). ste es un fenmeno frecuente en varias especies, especialmente en las plantas leosas puesto que al trabajar protocolo de introduccin no bien establecidos o no seguidos de la forma adecuada, resulta inevitable la presencia de contaminacin en el medio de cultivo, debido a problemas en la manipulacin o por procesos errneos al usar desinfectantes no efectivos o usarlos durante mucho tiempo provocando su oxidacin; los procesos de esterilizacin ya dependen de la especie y el tipo de explante que estemos tratando (Hernndez & Gonzles, 2010). En cuantos a la necrosis celular se pudo producir por una reaccin de especies qumicas muy fuertes por ejemplo las quinonas que en su naturaleza esta la funcin de oxidar tejidos gracias a sus compuestos fenlicos y la enzima polifenol oxidasa (PPO) (Azofeifa, 2009). Otra forma de oxidacin que propone Brayet al., (2000) es que esta se da por radicales libres, que estn en distintos componentes celulares. Como se puede apreciar en el grfico 2, los niveles de necrosis en los resultados obtenidos de los explantes conllevan un 50% de los cultivos (Grafico 2), esto puede darse gracias a que los factores particulares que se dan in vitro, como son: el efecto del desinfectante (cloro comercial al 5%), los cortes en el explante realizados en periodos muy largos

provocando que el oxigeno reaccione con los iones libres y mate el tejido vegetal (George, 1993). Por otro lado a la contaminacin de los microorganismos y de hongos se pudo dar varios factores tanto internos como externos. Aunque podemos decir que la desinfeccin fngica se obtuvo buenos resultados puesto que solo un explante de 8 fue contaminado, pero lamentablemente en la bacteriana se produjo en 3 de 8 las siguientes causas pudieron provocarlas: a) microorganismos que colonizan la superficie o el interior del explante (endfitos) y b) microorganismos introducidos durante la manipulacin en el laboratorio (Hernndez & Gonzles, 2010). Dado foco de contaminacin (alrededor del explante y se expanda desde el centro hacia los lados), se podra asumir que las bacterias provenan del mismo explante o no hubo suficiente asepsia en el momento de la siembra. Las bacterias que crecieron en el medio de cultivo eran de color blanquecino, y cubran el explante en la base a manera de una capa brillante, deacuerdo con Leifert et al. (1994) menciona que las primeras bacterias que se pueden detectan son gram negativas, segn Prescott (2007) se afirmara que son bacilos gram (-) por la formacin de sus colonias, forma de crecimiento en sus bordes tambin y porque son los ms comunes en los suelos por ese motivo estaran presentes en los explantes. CONCLUSIONES A travs de los datos experimentales obtenidos y lo revisado podemos decir que el proceso de desinfeccin con hongos
5

y bacterias debe ser muy riguroso pues al no eliminarlos correctamente a estos agentes contaminantes puede llevar graves problemas en el proceso de siembra, y la consecuencia a esto serian un retraso en los proyectos experimentales que se estn llevando a cabo. En cuanto a la necrosis se concluye que al dejar mucho tiempo en desinfectantes muy agresivos o con mucho poder de oxidacin puede provocar una necrosis muy extendida en el explante. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Azofeifa, A. (2009). Problemas de oxidacin y oscurecimiento de explantes cultivados in vitro [en lnea] [Consultado el: 19 mayo 2013]. Disponible en: <http://www.latindex.ucr.ac.cr/agrom eso-20-1/v20n1_p153-Azofeifa.pdf> 2. Betancourt J., & Rojas M. (2011). Rizognesis in vitro a partir de yemas de Polylepis incana Kunth., y Polylepis pauta Hieron., con la ulterior determinacin de la especie viable para crecimiento in situ en la zona de Papallacta. [en lnea] [Consultado el: 19 mayo 2013]. Disponible en: <http://www.dspace.ups.edu.ec/bitstr eam/123456789/3598/1/QT03005.pdf > 3. Brayet E., Serres J., Weretilnyk E. (2000). Responses to abiotic stresses. In: Buchanan, B; Gruisse, W; Biochemistry and molecular biology of plants. American Society of Plant Physiologists. Maryland-USA 4. Caranqui, J. (2010).Demografa de un rodal de Polylepis reticulata Hieron en

la reserva de produccin faunstica Chimborazo. [en lnea] [Consultado el: 19 mayo 2013]. Disponible en:< http://dspace.espoch.edu.ec/bitstream /123456789/500/1/Demografia%20Pol ylepis_Articulo.pdf> 5. George E. 1996. Plant propagation by tissue culture; In Practice. Second Edition. England 6. Halberstadt. (2010). Ecuador & the Galapagos Islands. Viva publishing Network. Ecuador. Pp 195-196. 7. Hernndez Y., & Gonzlez M. (2010). Efectos de la contaminacin microbiana y oxidacin fenlica en el establecimiento in vitro de frutales perennes [en lnea] [Consultado el: 19 mayo 2013]. Disponible en: < http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S02 58-593620100004000 15&script=sci_arttext> 8. Instituto Interamericano de Cooperacin para la Agricultura. (1987). II Curso de Cultivo de Tejidos. Memoria. Turrialba, Costa Rica. p. 83. 9. Jadn M., & Jaramillo A. (2007). Evaluacin de medios de induccin, control de la oxidacin y contaminacin en el cultivo in vitro de Junna (Polylepis microphylla). [en lnea] [Consultado el: 19 mayo 2013]. Disponible en: <http://www.uteq.edu.ec/eventos/200 7/congreso_biotecnologia/biotecnologi a/archivos/352.pdf> 10. Kessler, M. (2006). Bosques de Polylepis. [en lnea] [Consultado el: 19 mayo 2013]. Disponible en: <http://www.beisa.dk/Publications/BEI
6

SA%20Book%20pdfer/Capitulo%2007.p df> 11. Leifert C., Morris C. Y Waites W. (1994). Ecology of microbial saprophytes and pathogens in tissue culture and field grown plant: reason for contamination in vitro. Critical Review in Plant Sciences 13: 139-181 12. Prescott, 2007, Microbiologa, editorial Mac Hill, Mxico Mxico, sptima edicin. 13. Vega C., Bermejo J., Alvarado G., Portugal J., Llanos M. Y Velasco E.

(2007). Propagacin masiva de Polylepis tomentella Weddell ssp. nana mediante tcnicas de cultivo in vitro. Ecologa en Bolivia [en lnea] [Consultado el: 19 mayo 2013]. Disponible en: <http://www.scielo.org.bo/scielo.php? script=sci_arttext&pid=S160525282007000800003&lng=es&nrm=iso >. ISSN 1605-2528>