BIBLIOGRAFIA

1. Amplificacin de DNA mediante PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa). Gabriel Dorado Prez. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba. 2. Fundamentos y casos exitosos de la biotecnologa moderna. Francisco G. Bolvar Zapata. SEGUNDA EDICION. 3. http://www.karymullis.com/pdf/kmullis-interview.pdf 4. Metodos fsico-quimicos en biotecnologa. PCR. UNAM. INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA.

HISTORIA Y DESARROLLO DE LA PCR Hasta mediados de la dcada del ochenta, la nica estrategia posible para aislar un gen y obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular". 4 Este mtodo se basa en la introduccin de fragmentos de ADN, uno de los cuales contendr el gen de inters, en vectores. stos son molculas de ADN (plsmidos o ADN de bacterifagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original como de multiplicarlos dentro de bacterias. Si se conoce un pequeo tramo de la secuencia de aminocidos de una protena cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar), se pueden disear mtodos para identificar qu bacterias llevan el vector que transporta dicho gen. Este reconocimiento tambin se puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra la protena resultante del gen que se desea clonar. En este caso se reconoce la bacteria portadora porque fabrica la protena codificada por el fragmento de inters, la cual se une especficamente al anticuerpo. 4

Una vez aislado el gen no slo resulta posible determinar con exactitud su secuencia de bases o analizar en detalle la informacin de la que es portador, sino que tambin se puede estudiar su expresin (la manera en que dirige la sntesis de la protena correspondiente) en distintos organismos y tipos celulares, introducido en clulas en cultivo o en animales de experimentacin, etctera. Estas tcnicas, ya clsicas, han permitido el aislamiento y caracterizacin de decenas de miles de genes de microorganismos, animales y plantas, lo que provoc un cambio cualitativo en la comprensin del funcionamiento de la clula. 4 En 1985, K. Mullis, un investigador de la Corporacin Cetus, invent un mtodo para lograr la multiplicacin in vitro de fragmentos definidos de ADN sin necesidad de recurrir a los vectores y su replicacin en bacterias. Este mtodo revolucionara en corto tiempo el conjunto de tcnicas de la biologa molecular. Su uso se extendi rpidamente a miles de laboratorios, no slo de investigacin bsica, sino tambin de diagnstico clnico. Se trata de la reaccin en cadena de la polimerasa, ya muy conocida como PCR, siglas provenientes del ingls Polymerase Chain Reaction. 4 Esta tcnica permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el trmino que se ha impuesto) pequeas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta ms de dos mil nucletidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas. 4 Cuando el proceso era manual la tcnica de PCR era lenta y requera de trabajo intensivo. Por lo tanto, los cientficos de Cetus comenzaron a buscar las maneras de automatizar el proceso. 4 Para replicar el ADN, la tcnica PCR hizo uso, en un principio, de la ADN polimerasa de la bacteria Escherichia coli. Pero esta enzima resulta desactivada debido a la alta temperatura requerida para desnaturalizar la doble cadena del ADN, por lo cual deba agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. La primera mquina termocicladora, "Mr. Cycle" fue creada por los

ingenieros de Cetus para tratar esa necesidad de agregar la enzima fresca a cada tubo de prueba despus del calentamiento y del proceso de enfriamiento. Sin embargo, este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplaz por su equivalente de la bacteria "termfila" (Se aplica a organismos vivos que pueden soportar condiciones extremas de temperatura relativamente altas, por encima de los 45C.)Thermus aquaticus. En efecto, la ADN polimerasa de este microrganismo, denominada Taq polimerasa, acta eficientemente entre los 75C y los 80C y resiste ms de dos horas a 93C.
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La purificacin de la polimerasa de Taq dio lugar a la necesidad de una mquina que realizara un ciclo ms rpidamente entre diversas temperaturas. En 1985, Cetus se asoci con la corporacin Perkin-Elmer e introdujo la DNA Termal Cycler. De esta manera es posible mezclar todos los componentes de la PCR al comenzar el primer ciclo y la reaccin en cadena puede llevarse a cabo mediante equipos automatizados que realizarn los ciclos trmicos programados. 4 La tcnica tuvo tanto impacto en el mundo cientfico, que en 1993 le fue concedido el Premio Nobel de Qumica a su inventor oficial, Kary B. Mullis, quien describi el proceso en 1985 y 1988. Cuando la Real Academia Sueca de Ciencias otorg al Dr. Mullis el Premio Nobel, ellos dijeron que haba hastened the rapid development of genetic engineering and greatly stimulated biochemica l research and opened the way for new applications in medicine and biology.

(acelerado el rpido desarrollo de la ingeniera gentica" y la investigacin bioqumica en gran medida estimulando y abrieron el camino para nuevas aplicaciones en la medicina y la biologa). 3,4 Sin embargo, catorce aos antes (1971 y 1974), el Dr. Molineux, del grupo de Khorana, describi la misma tcnica con exquisito detalle, aunque,

lamentablemente, consideraron que dicha metodologa no era funcional. Desde su redescubrimiento oficial en 1985, la PCR se ha consolidado como la tcnica clave de la biologa molecular actual. 4

PARA QUE SIRVE LA PCR Y BREVE DESCRIPCION DE LA TECNICA Las tcnicas de biologa molecular estn basadas en la manipulacin y deteccin de gran nmero de molculas. Dicho con otras palabras, la tecnologa actual no permite, en general, el estudio de molculas aisladas o nicas. Es por ello que uno de los pasos de los proyectos de biologa molecular consiste en la amplificacin de secuencias de DNA. La PCR puede sustituir a la clonacin in vivo clsica en muchos casos, siendo en otros un aliado esencial para simplificar el proceso e incrementar la probabilidad de xito, ya que podemos amplificar en un tubo de ensayo una secuencia de DNA determinada millones de veces y adems en un tiempo mnimo de horas o incluso minutos.
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La amplificacin in vitro del DNA se logra en tres pasos bsicos:

a).-Desnaturalizacin del DNA a copiar (molde o diana). Ello se consigue incrementando la temperatura para separar las dos cadenas que componen la doble hlice del DNA. b).-Hibridacin o apareamiento de los cebadores u oligos al DNA molde. Para ello se baja la temperatura de reaccin, de forma que pequeas secuencias de DNA de cadena sencilla (tpicamente, entre 10 y 30 bases o meros) se unan a sus secuencias complementarias del DNA diana. Cada uno de ellos se une a una de las cadenas del DNA diana, de forma que sus extremos 3OH apuntan el uno hacia el otro, delimitando la secuencia a amplificar. c).-Copia de las cadenas delimitadas por los cebadores. Se consigue elevando la temperatura de la reaccin a la ptima de la polimerasa de DNA utilizada. Cada uno de los extremos 3OH de los oligos apareados a las cadenas directa y reversa sern extendidos, generndose las cadenas hijas correspondientes. El resultado son dos hlices completas Watson & Crick en la regin delimitada por los oligos. Dicho de otra forma, se duplica el nmero inicial de molculas de DNA. Estos tres pasos de desnaturalizacin, hibridacin y polimerizacin se repiten n veces, duplicndose en cada ciclo el nmero de cadenas delimitadas por los oligos. Se trata, pues, de una amplificacin exponencial o logartmica, en que las

cadenas

previamente

sinterizadas

pueden

servir

de

molde

futuras

amplificaciones. Por tanto, y mientras los reactivos no se agoten, el numero de molculas amplificadas responde a la siguiente frmula: Nmero de molculas finales por cada molcula inicial = 2n Siendo n el nmero de ciclos. Ello significa que 20 ciclos generaran 106 molculas; 30 ciclos produciran 109 molculas. Una PCR tpica amplifica de 106 a 106 veces. 1 La PCR es una tcnica tan poderosa y verstil, que prcticamente est resultando imprescindible en todas aquellas disciplinas que tienen que ver con las ciencias de la vida. As, se emplea: 1 En biologa molecular: para amplificar secuencias de DNA que luego son fcilmente clonadas y/o secuenciadas. Asimismo, tiene otras mltiples y muy interesantes aplicaciones. Por ejemplo, para generar mutaciones aleatorias o dirigidas (del ingls, site-directed mutagenesis); identificar genes expresados de forma diferencial (del ingls, differential display PCR); rastrear rpida y eficientemente bibliotecas gnicas o de cDNA; construccin de bibliotecas sustractivas de cDNA (del ingls, subtractive cDNA libraries); secuenciar mediante secuenciacin cclica (del ingls, cycle sequencing); etc. En biotecnologa: para la identificacin rpida y temprana de animales y plantas transgnicos. En gentica general, de poblaciones y evolutiva: se emplea para cartografiar genes mediante estudios de ligamiento. Asimismo, para amplificar y detectar diferentes genotipos y estudiar su evolucin dentro de las poblaciones. En mejora de plantas y animales: Cabe destacar las tcnicas de RFLPs (del ingls, Restriction Fragment Length Polymorphisms), RAPDs (del ingls, Randomly Amplified Polymorphic DNAs), SSRs (del ingls, Simple Sequence Repeats), y la ms poderosa AFLPs (del ingls, Amplified Fragment Polymorphism). Todas ellas generan, por diversos mtodos, bandas de DNA que son resueltas mediante electroforesis en gel, dando origen a patrones denominados huellas digitales (del ingls, fingerprints). De este modo pueden distinguirse especies, variedades e incluso individuos (ver ms

adelante). Estos patrones pueden asociarse con caractersticas interesantes para el mejorador. En espectrometra mutacional, toxicologa y tratamiento del cncer: para amplificar y detectar mutaciones y translocaciones cromosmicas. En salud pblica humana y veterinaria: para la deteccin de grmenes en aguas, suelo, alimentos, plantas, animales, etc. En medicina: resulta muy valiosa para el diagnstico precoz de enfermedades infecciosas como el SIDA, el sexo antes del nacimiento, o la posible existencia de enfermedades hereditarias en el embrin o adultos. En microbiologa, botnica y zoologa: para la identificacin de

microorganismos, plantas y animales, ya que usando los cebadores apropiados pueden amplificarse secuencias especficas que generan patrones de bandas tpicos de cada especie e incluso de cada individuo (fingerprinting). A tal fin se usan rRNAs, microsatlites (VNTR; del ingls, Variable Number of Tandem Repeats) y secuencias HLA y Alu en humanos. En medicina forence Para determinacin precisa de la paternidad En antropologa y geologa: pues por sorprendente que parezca, se ha amplificado DNA de restos humanos momificados del faran Tutankamon (hace 3.000 aos), as como DNA de hojas fsiles de magnolia procedente del Mioceno (hace 18 millones de aos) e incluso DNA de huesos fsiles del dinosaurio carnvoro Tyrannosaurus rex, que vivi en el Jursico (hace 70 millones de aos). La edad del DNA de magnolia fsil, determinada mediante tcnicas que miden la evolucin molecular (comparando las diferencias entre dicha secuencia y la de las magnolias actuales), ha sido confirmada por la datacin geolgica de los estratos donde se encontraron las hojas fsiles. 1

DIFERENCIAS ENTRE LA qRT- PCR (TIEMPO REAL) Y LA RT-PCR (PUNTO FINAL) 2,4 RT PCR Dado que el RNA usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer una transcripcin reversa (RT) antes de iniciar la amplificacin por PCR. La transcripcin reversa genera una copia de la hebra de RNA, pero esta copia es DNA complementario (cDNA) el cual es estable al calor y puede resistir la metodologa PCR. Los pasos de la RT-PCR son: 1. Transcripcin reversa: Unin del primer a la secuencia de RNA objetivo. 2. Transcripcin reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensin del primer mediante la incorporacin de nucletidos complementarios. 3. Fin de transcripcin reversa, se obtiene la hebra del cDNA complementario al RNA. 4. PCR. El mRNA es copiado a cDNA por la transcriptasa reversa usando un primer dT (los primers al azar se pueden tambin utilizar)(Figura 2). En PCR en tiempo real, se utiliza generalmente una transcriptasa reversa que tenga una actividad endo H. Esto elimina el mRNA permitiendo que la segunda hebra de DNA sea formada. Se adiciona una mezcla de PCR que incluya una polimerasa termoestable (tal como la Taq polimerasa), los primers especficos para el gen de inters, los deoxinucletidos y un buffer conveniente.

Figura 2. Conversin de mRNA a cDNA por la transcriptasa reversa

El cDNA se desnaturaliza a mas de 90 (~94), las dos hebras se separan. A 50 o 60 los primers especficos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. Los sitios de unin a los primers deben estar separados 400 bases, pero generalmente se encuentran a 100 bases de distancia especialmente cuando se usa el PCR en tiempo real A 72 la polimerasa extiende el DNA desde los primers. Se obtienen 4 cadenas de cDNA.

Despus de 30 o 40 ciclos de sntesis de cDNA, los productos de reaccin son analizdos usualmente por electroforesis en gel de agarosa. El gel se tie con bromuro de etidio. Los geles de agarosa para analizar los productos de cDNA de la RT-PCR no nos permite la cuantificacin ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda es perceptible sobrepasa la etapa logartmica de amplificacin. El bromuro de etidio es un colorante que se une a la doble cadena de DNA intercalandose entre los pares de bases. Emite luz fluorescente cuando se irradia en la parte UV del espectro. Sin embargo, la fluorescencia no es muy brillante. Otros colorantes, como el SYBR green, que son mucho ms fluorescentes que el bromuro de etidio, se utilizan en el PCR en tiempo real (Figura 3)

Figura 3. El SYBR green fluoresce brillantemente solo cuando se une a DNA de doble cadena.

EN TIEMPO REAL La RT-PCR es solamente semicuantitativa en el mejor de los casos, en parte por la insensibilidad del bromuro de etidio (sin embargo, hay maneras ms sensibles de detectar el producto). Los protocolos de PCR competitivos se han desarrollado para hacer el mtodo ms cuantitativo pero son a menudo complicados. As la PCR en tiempo real fue desarrollado debido a: La necesidad de cuantificar diferencias en la expresin del mRNA La disponibilidad de cantidades pequeas de mRNA en algunos procedimientos,