Curvas temporales

Cmo calcular la actividad enzimtica y llenar la tabla de purificacin?

Velocidad inicial
En el ensayo, se fij una concentracin de sustrato y enzima. Bajo estas condiciones y durante los primeros minutos de la reaccin, podemos obtener una velocidad inicial. Cmo la calculamos? 1.- Graficar la disminucin de la absorbencia del NADH vs tiempo (min).
Curva temporal de actividad enzimtica de la LDH
1.400 1.200 Absorbencia340 nm 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Tiempo (min) y = -0.1566x + 1.0424 R = 0.9979 F1 F2

2.- Tomar en cuenta solo los datos en los que hay un comportamiento lineal. 3.- Calcular el valor de la pendiente. Tomen el valor absoluto porque recuerden que por cada mol de NADH que desaparece, se genera una mol de lactato (EL PRODUCTO DE LA REACCIN).

F3

LDH + Piruvato +NADH Lactato +NAD

Revisen las unidades, la pendiente debe quedar con unidades de min-1. Si ya trazaron sus grficas con seg, no importa; slo realicen la conversin de seg a min,

Actividad volumtrica
Actividad enzimtica por mL de enzima. Para calcularla necesitamos hacer una relacin entre la disminucin de la absorbencia y la concentracin de NADH. Esta relacin se logra con la ley de Lambert-Beer: A= Cxbx Dnde: A= Absorbencia. C= Concentracin, en M. b= Longitud de la celda, en cm. = Coeficiente de extncin molar, en M-1cm-1. Para el caso del NADH es 6220 M-1cm-1.

Si despejamos la concentracin, entonces tenemos que: C= A/bx Nuestros valores de A estn dados como una variacin de absorbencia en funcin del tiempo: Abs/min, LA PENDIENTE DE LA CURVA!
Abs min Actividad= = -1 -1 M cm b cm m Abs ) -1 -1 min =mmolxmL xmin mL x1cm mmolxcm m(

Actividad volumtrica y total

El valor obtenido de la ecuacin anterior est dado por cada mL de reaccin. Para que sea actividad volumtrica, hay que reportarlo por mL de enzima; para ello hay que considerar el volumen total de la reaccin y el volumen aadido de enzima. VolReaccin mL FD mmol -1 -1 Actividad Volumtrica= =mmolxmL xmin mLxmin VolAadido de enzima mL
mL de reaccin

mL de enzima

1 1 Actividad Volumtrica=mmolxmin mL

Para obtener la actividad total, se debe considerar el volumen de la fraccin. Dado que hay diferentes volmenes para cada fraccin:

Actividad Total= Actividad volumtrica x Volfraccin = mmolxmin

Tabla de purificacin
Una vez que han calculado la actividad total, pueden completar su tabla de purificacin. Para ello necesitan sus concentraciones de protena. En el caso de F1 a F4, tomen las concentraciones promedio que utilizamos para el SDS-PAGE. Para las fracciones purificadas, tomen en cuenta las concentraciones que su equipo obtuvo. Actividad
Actividad Total Paso Nx100 Actividad Total Paso1 Especfica Paso N ActividadEspecfica Paso1

ConcFraccin x VolFraccin

ActividadTotal CantidadTotal

Paso de purificacin
Extracto crudo

Cantidad total de protena (mg)

Actividad total (mg o U)

Actividad especfica (U/mg)

Rendimiento (%)

Pureza (Veces de purificacin)

Entre ms diferencia haya entre la pureza del paso N y el paso N-1, quiere decir que es mejor el paso N para la purificacin.