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Microbiologia Ambiental

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Primera edición: noviembre de 2004

D.R.

© Instituto Nacional de Ecología (INE-SEMARNAT)
Periférico sur 5000. Col. Insurgentes Cuicuilco, C.P. 04530. México, D.F. Internet: www.ine.gob.mx

COORDINACIÓN EDITORIAL Y TIPOGRAFÍA: Raúl Marcó del Pont Lalli DISEÑO DE
LA PORTADA:

Álvaro Figueroa

FOTO DE LA PORTADA: Alejandro Martínez CORRECCIÓN DE ESTILO: Eduardo Chagoya Medina Foto de la portada: gota de agua con ciliados en bipartición, euglenas y numerosas bacterias (bacilos). Tomadas en contraste de fases con filtro azul y ayuda de microflash a 1/2,000 seg. Aumentos 336 x.

ISBN: 968-817-707-5

Impreso y hecho en México

Microbiología ambiental
Irma Rosas, Alejandro Cravioto y Exequiel Ezcurra (compiladores)

SECRETARÍA DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES INSTITUTO NACIONAL DE ECOLOGÍA PROGRAMA UNIVERSITARIO DEL MEDIO AMBIENTE-UNAM

ÍNDICE

AGRADECIMIENTOS PRÓLOGO
José Sarukhán

8 9

I NTRODUCCIÓN
Irma Rosas, Alejandro Cravioto y Exequiel Ezcurra

13

B AC T E R I A S

EN L A AT M Ó S F E R A

15

Irma Rosas, Eva Salinas, Leticia Martínez, Carlos Eslava y Alejandro Cravioto

Vibrio cholerae: UNA BAC T E R I A A M B I E N TA L CON D I F E R E N T E S T I P O S DE V I D A
Carlos Eslava, Irma Rosas, Martha Solano, Gabriela Delgado, Maritoña Ramírez, Jorge Villaseca y Alejandro Cravioto
L A E C O LO G Í A DE L AS A M I B AS PAT Ó G E NAS DE V I DA L I B R E EN A M B I E N T E S A C U Á T I C O S

47

67

Patricia Bonilla, Elizabeth Ramírez, Ricardo Ortíz y Carlos Eslava

CIANOBACTERIAS,

MICROORGANISMOS DEL FITOPLANCTON Y SU R E L A C I Ó N CON LA S A L U D HUMANA

83

Pedro Ramírez, Evaristo Martínez, María Dolores Martínez y Carlos Eslava

LA

E C O LO G Í A M I C RO B I A NA : U NA N U E VA C I E N C I A PAR A U N NUEVO S I G LO

107

Valeria Souza, Ana Escalante, Ana Noguez, Laura Espinosa-Asuar, René Cerritos y Luis Eguiarte

AGRADECIMIENTOS

Los compiladores de esta obra desean agradecerle la revisión y la asesoría técnica al Programa Universitario de Medio Ambiente (PUMA) de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y a la Srta. Ángeles Prado.

P RÓLOGO

SOMOS PRODUCTO DE LA DIVERSIDAD. Todos nosotros. Nuestra especie y las más de un
millón setecientas cincuenta mil que han sido nombradas y depositadas en museos y herbarios de todo el mundo por taxónomos especialistas en muy diferentes grupos. Nuestras miles de culturas y lenguas diferentes también son producto de la diversidad, lo mismo que nuestro desarrollo cultural, lo que actualmente llamamos “nuestra civilización” con todos sus claroscuros. , A pesar de lo anterior, somos enormemente ignorantes de esa diversidad de la que provenimos. No solo eso, sino que en ocasiones parece que estamos empeñados en despreciarla y aun borrarla. Algunos ejemplos para ilustrar lo anterior: seis millones de hectáreas de zonas áridas se desertifican cada año. Las selvas tropicales se pierden a una velocidad de 30 hectáreas por minuto. Existen ya cerca de 50 zonas muertas en los océanos por causa de la eutrofización originada por el uso ineficiente de fertilizantes. Se introduce más nitrógeno en los sistemas terrestres por intervención humana que el que se fija naturalmente, y casi la mitad del mismo se pierde por lixiviación. Más de dos terceras partes de las pesquerías comerciales están agotadas y 90% de los grandes depredadores marinos han desaparecido. No lo hemos hecho mucho mejor en lo que se refiere al conocimiento y la conservación de las diferencias culturales que se ha desarrollado en cada una de las regiones de la Tierra. Año con año se pierden, por un complejo de circunstancias derivadas de la forma en que nos hemos desarrollado, cientos de lenguas que ya no serán habladas nunca más. No será difícil que nuestra era, como otras geológicas, sea conocida por un epíteto que la distinga: el del Homogeoceno, es decir, la era de la aniquilación de la diversidad y de la homogeneización biológica y cultural del planeta producida por las actividades humanas.

[9]

9 José Sarukhán

Ese millón setecientas cincuenta mil especies conocidas hasta la fecha representan, dependiendo del especialista, entre el 15 y el 5% de todas las especies que se calcula existen en el mundo. En otras palabras, desconocemos, por lo menos por un orden de magnitud, la dimensión de la diversidad biológica que existe en la Tierra y de la que somos producto. En contraste, hemos mostrado una destreza asombrosa en otras áreas del conocimiento humano. Por un lado, podemos calcular con precisión apabullante la trayectoria, composición y edad de objetos celestes que ni siquiera vemos a simple vista; por otro, hemos penetrado hasta los más reducidos espacios de la materia al estudiar su estructura, y hemos descifrado los códigos más íntimos de la regulación de nuestros procesos hereditarios. Paradójicamente, quizá porque se encuentra situado entre lo ultramicroscópico y las escalas inmensas del universo, hemos abandonado el esfuerzo por incrementar nuestro conocimiento del mundo biológico que nos rodea y sin el cual no podemos vivir. No solamente no sabemos con razonable aproximación cuántas especies conviven con nosotros en la Tierra, sino que ignoramos las funciones que desempeñan en la trama de la vida y ni siquiera para la enorme mayoría de ellas, desde el enfoque más antropocéntrico y utilitario, sabemos si pueden o no resultar útiles para satisfacer las múltiples necesidades de las sociedades. Por ello, resulta muy gratificante atestiguar el nacimiento de obras como la presente que enfocan su interés en el conocimiento de uno de los grupos biológicos menos estudiados: el de las bacterias y algunos otros microorganismos unicelulares. Otra vez, con un error de un orden de magnitud, se calcula que existen en nuestro planeta entre cien mil y un millón de especies de este grupo. Obviamente la dificultad de su observación y el enorme reto que representa la definición de lo que en este caso es una entidad taxonómica (especie) han contribuido al lento avance de su conocimiento. Esto es en especial grave debido al enorme papel que este grupo juega en los procesos vitales de los sistemas ecológicos y biológicos en la Tierra y a que representan los tabiques biológicos básicos de la construcción de los sistemas vivos, incluyéndonos a los seres humanos. Su importancia e interés ciertamente va mucho más allá del común de la gente les asigna en lo que se refiere a los problemas de salud humana, los cuales, desde luego, no son de manera alguna nimios. Baste recordar enfermedades tan serias como la tuberculosis, el cólera (tratado en un capítulo especialmente por el Dr. Carlos Eslava y colaboradores) la difteria, las disenterías o el tifo. No es aventurado afirmar que toda una nueva biología está a la espera de ser descubierta en estos organismos, que funcionan por rutas metabólicas y mecanis-

10

Prefacio

mos ecológicos, fisiológicos, y probablemente evolutivos, que podrían ser harto diferentes de los que conocemos para la mayor parte de los “organismos superiores” . Como grupo, las bacterias representan los seres vivos más antiguos, habiéndoseles encontrado en estratos geológicos de hace tres mil quinientos millones de años. El rango de hábitats en los que pueden vivir es el más amplio de cualquier otro grupo de organismos (como el artículo de la Dra. Valeria Souza y colaboradores lo ilustra ampliamente), desde profundidades de más de 400 m en el hielo de la Antártida hasta temperaturas cercanas a los 80 °C en géiseres. Su papel en los procesos ecológicos es en extremo importante (un ejemplo de ello lo constituye el interesante capítulo sobre cianobacterias del Dr. Pedro Ramírez y colaboradores): como fijadores de CO2 y mantenedores del balance de carbono en la biosfera; como descomponedores de materia orgánica y el consecuente reciclado de nutrientes, especialmente importante en suelos agrícolas, los cuales pueden contener, en un solo gramo, cerca de 2,500 millones de bacterias; lo anterior como una adición a su fundamental papel como fijadores de nitrógeno, no solamente en los suelos agrícolas sino en todos los ecosistemas terrestres. Hay que felicitar la idea y el esfuerzo de estructurar un libro cuyos capítulos tocan una variedad de temas relacionados con las bacterias y algunos otros microorganismos, como es el caso del capítulo escrito por la Dra. Patricia Bonilla y colaboradores sobre amibas de vida libre. La obra nace en un terreno que no es particularmente fértil en ejemplos como el presente. Se trata de una iniciativa muy útil para enriquecer la cultura biológica de nuestro país, dado que está escrito para un público no necesariamente especialista en los temas, y es en especial útil para aquellos lectores cuyo acceso a obras en lenguas extranjeras está limitado. Es de remarcarse que la mayoría de los autores son académicos de diversas dependencias de la Universidad Nacional Autónoma de México, aspecto que subraya el papel central de esta institución en la investigación científica y en la difusión del conocimiento a la sociedad en general. Hay que desear que el cometido educativo e informativo del libro se logre de la mejor forma; será el mejor obsequio a los esfuerzos de los autores y editores de este trabajo. José Sarukhán INSTITUTO DE ECOLOGÍA, UNAM

11 José Sarukhán

12

Prefacio

I NTRODUCCIÓN

NOS MARAVILLA EL CONOCIMIENTO que hoy tenemos sobre la gran diversidad microbiana. Sin embargo, poco se habla de ello, a pesar de su enorme importancia. El gran espectro metabólico existente entre los distintos microorganismos, los capacita para colonizar cualquier ambiente por inhóspito que parezca, de tal forma que su presencia nos asegura que la energía entra al ecosistemal ya sea a través de la fotosíntesis o del ciclo del detritus. Es por ello que cuando hablamos de la evolución del planeta, de las ciencias ambientales, de la biotecnología ambiental, de la ecología funcional, del cambio climático o de la generación de gases de efecto invernadero, invariablemente el tema central son los microorganismos, principalmente los procariontes. Abordar el tema de la microbiología ambiental resulta largo y complejo, pero seleccionando algunos ejemplos es posible dar una idea clara de la importancia de conocer la interacción entre los parámetros ambientales y los microorganismos. Su presencia en la atmósfera, sin ser esencialmente un hábitat para ellos, implica dispersión a cortas o largas distancias y colonización de sustratos diferentes al de su fuente de origen, en donde pueden actuar en procesos físicos atmosféricos, como fitopatógenos, alergenos, colonizadores primarios, etc. Su interacción con los parámetros ambientales es de gran importancia ya que estos seleccionarán aquellos microorganismos que presenten ciertas habilidades para soportar la pérdida de agua y los efectos de la radiación ultravioleta, entre otros. Al tratarse el tema de Vibrio cholera, una bacteria de vida libre, heterótrofa, de gran importancia en ecosistemas acuáticos salobres y marinos, se resalta el hecho de ser potencialmente patógena y generalmente la relacionamos solo con daños a la salud. Olvidamos su gran versatilidad y centramos nuestra atención en los parámetros ambientales que han estado asociados a eventos epidémicos. Las cianobacterias, organismos extraordinarios que forman parte del plancton, bentos y perifiton, y por lo tanto, de la producción primaria de los sistema acuá[13]

13 José Sarukhán

14

Prefacio

tico, llevan a cabo fotosíntesis y fijación de nitrógeno, son capaces de sobrevivir en situaciones desfavorables para otros microorganismos llegando a constituir grandes poblaciones, por lo que la ingestión del agua en estas condiciones representa un riesgo de salud debido a la producción de toxinas. Entre los protozoarios, que resultan un importante eslabón en la cadena alimentaria, reguladores de las poblaciones bacterianas, se encuentran microorganimos de vida libre que pueden actuar como patógenos oportunistas, y cuya interacción con los parámetros ambientales determina en gran parte el riesgo que implica su ingestión, contacto o inhalación. La gran diversidad fenotípica de los microorganismos encuentra su respuesta en su exploración genómica y en el conocimiento de los distintos mecanismos de recombinación genética. Todo ello nos permite describir la estructura y función de las comunidades microbianas, de gran importancia en el estudio de los diversos ecosistemas o como agentes etiológicos de diversas enfermedades. Por lo anterior, se considera importante realizar estudios sobre el impacto en la estructura y función de las comunidades microbianas de vida libre por el continuo intercambio de microorganismos entre hospedero-ambiente (en gran parte propiciado por los seres humanos), todo ello de gran interés tanto ecológico como médico. IRMA ROSAS, ALEJANDRO CRAVIOTO Y EXEQUIEL EZCURRA

B ACTERIAS

EN LA ATMÓSFERA

Irma Rosas, Eva Salinas, Leticia Martínez, Carlos Eslava y Alejandro Cravioto

1. INTRODUCCIÓN
UNA GRAN VARIEDAD de organismos que cambian su localización geográfica durante su ciclo de vida, lo hacen a través de la atmósfera. Por tal motivo, las partículas biológicas están siempre presentes en dicho ambiente, aunque su número y viabilidad cambien con las horas del día, las condiciones del tiempo, las estaciones del año y su ubicación geográfica. El tamaño de la biota que fluye en la atmósfera varía desde micrómetros, como en el caso de virus, bacterias, esporas y polen, hasta milímetros, como las semillas y los insectos sin alas. Se pueden encontrar cerca del suelo o a grandes alturas, pero su presencia mas allá de la tropósfera no se ha determinado con precisión. La aerobiología es una disciplina relativamente nueva, surgida alrededor de 1930 y que se encarga de estudiar el aerotransporte pasivo de los microorganismos, su identificación, comportamiento, movimientos y supervivencia, conjuntando los conocimientos de la microbiología, la meteorología, la física de los aerosoles y la química atmosférica. La atmósfera en general no se considera un hábitat de los microorganismos, ya que sólo algunos de ellos son capaces de reproducirse allí.1 Durante su transporte bajan su tasa metabólica y se recuperan hasta que se impactan sobre un organismo o un medio con las condiciones óptimas para crecer o infectar. Sin embargo, su presencia en la atmósfera tiene gran relevancia desde el punto de vista ecológico, por el grado de dispersión que pueden adquirir y que difícilmente lograrían, siendo su hábitat primario terrestre o acuático.2 Considerando la física atmosférica, las aerobacterias se asocian con los núcleos de condensación, los núcleos de congelación y con su enriquecimiento por efecto de la niebla.3,4 Los estudios aerobiológicos se iniciaron como resultado de un interés epidemiológico, para tratar patógenos de animales, plantas o del hombre. Re[15]
Bacterias en la atmósfera 15

Microbiología ambiental 16

cientemente este tipo de investigaciones se han incrementado en el área agrícola, incluyendo plaguicidas microbianos, actividades de composteo y daño por heladas, entre otros. Asimismo, en zonas urbanas se ha registrado la introducción de microorganismos a la atmósfera asociada a la turbulencia vehicular y a la gran densidad poblacional, lo que ha dado lugar a un campo de estudio específico. Actualmente, en respuesta a la problemática del terrorismo, se ha desarrollado infraestructura para la detección y dispersión de armas biológicas. La mayoría de las bacterias que entran a la atmósfera provienen de fuentes naturales como la vegetación, el suelo y los cuerpos de agua, y en menor proporción de las actividades antropogénicas; su supervivencia y distribución están moduladas por factores biológicos, meteorológicos (como el viento, la radiación solar, la temperatura, la humedad relativa) y por la química atmosférica. Su presencia en la atmósfera ha sido demostrada por su crecimiento en medios de cultivo (denominándose cultivables); sin embargo, se considera que esto representa sólo una pequeña fracción de la población que llega a la atmósfera, de forma tal que la mayoría podría estar muerta o encontrarse en forma viable no cultivable.

2. LA ATMÓSFERA COMO PARTE DEL HÁBITAT
El continuo intercambio entre agua, aire y suelo nos obliga a incluir a la atmósfera como parte del hábitat de los organismos y a descubrir en ella diversos factores que determinan su distribución, en donde la dispersión juega un papel muy importante. Es un hecho que sólo para ciertos organismos la atmósfera será eficiente, y para otros resultará un medio hostil en el cual sólo algunos podrán soportar la presión, por lo que se le considera un medio selectivo. Por las dimensiones de este fluido de gases y partículas que rodea a la superficie terrestre, es necesario describir a la atmósfera considerando sus diferentes capas cuya altura esta relacionada con la temperatura, la presión barométrica y la densidad del aire. A la tropósfera o atmósfera baja (que comprende los primeros diez kilómetros), por su cercanía a los ecosistemas terrestres y acuáticos, llegarán las diversas partículas biológicas en sus formas esporuladas o vegetativas, por mecanismos activos o pasivos; se distribuirán vertical y horizontalmente, dependiendo de la energía disponible (viento, corrientes de convección, remolinos locales, etc.) lo que les proporcionará flotación y movimiento. En esta atmósfera baja encontraremos diversas capas asociadas a las condiciones del tiempo, como noches claras, días nublados o soleados. Así la capa límite laminar podrá tener una altura que va de pocos centímetros hasta alcanzar varios metros; una vez que las partículas biológicas entran a la capa de los

remolinos locales y a la capa turbulenta, podrán llegar a zonas cuyas barreras geográficas no lo permiten. En las noches la condición isoterma o la inversión térmica determinarán la estabilidad de la atmósfera, de tal forma que las partículas introducidas a la troposfera permanecerán en algunas ocasiones cerca del suelo (figura 1). Es importante considerar que las dimensiones y la dinámica en cada capa atmosférica dependerán en parte de la orografía, del tipo de suelo y dosel del lugar; es por ello que se habla de lo contrastante entre el comportamiento de una atmósfera urbana respecto de una rural (figura 2). Para el caso de las concentraciones de aerobacterias registradas durante el día se reporta: urbana> bosques> rural> zona costera.

FIGURA. 1. LAS CAPAS DE LA ATMÓSFERA
Y LA DISPERSIÓN DE LAS PARTÍCULAS BIOLÓGICAS

Noche despejada

Estratosfera Troposfera Capa de convección

Día soleado

Capa de mezcla
Cumulus

Capa límite turbulenta

Capa límite laminar

Capa límite laminar

Velocidad del viento en aumento Día nublado

>
Aire caliente

Condiciones estables
Fuente: 5.

17

Bacterias en la atmósfera

Este enriquecimiento de partículas biológicas en la zona urbana está asociado a diversas fuentes antropogénicas, pero principalmente a la contaminación del suelo aunado a la turbulencia, que facilita la introducción de partículas a la atmósfera a diferentes alturas.

3. LAS FUENTES DE LAS AEROBACTERIAS
A la atmósfera se pueden introducir una gran variedad de partículas de origen biológico, como granos de polen, esporas fúngicas, bacterias, algas, protozoarios, insectos y, ocasionalmente, virus. En general, las partículas predominan en las partes bajas de la atmósfera cerca de las fuentes locales de generación. Sin embargo, algunas esporas de hongos y bacterias pigmentadas se han recuperado a 48-77 km de altura.6 Las bacterias constituyen uno de los grupos más abundantes en el ambiente. En condiciones naturales se les encuentra en el suelo, el agua, y las plantas, principalmente como organismos saprobios. Debido a que carecen de mecanis-

Microbiología ambiental

FIGURA 2. COMPARACIÓN DE LAS DIVERSAS CAPAS ATMOSFÉRICAS
EN UNA ZONA URBANA Y UNA RURAL

18

Siglas: CLP (capa límite planetaria), CLU (capa límite urbana), CLR (capa límite rural), CDU (capa del dosel urbano).

CUADRO 1. FUENTES NATURALES Y ANTROPOGÉNICAS QUE CONTRIBUYEN
A INCREMENTAR LA CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS A LA ATMÓSFERA

FUENTE Naturales Costa Bosques Pastizales Matorral desértico Antropogénicas Zona urbana Calles transitadas Parques Estación de transferencia de basura Planta recicladora de basura Planta de composteo Planta de tratamiento de aguas residuales Zona rural Campo agrícola Empacadora de algodón

CONCENTRACIÓN (UFC M-3)

ND – 560 385 – 1.2x103 127 – 587 2 – 283

539 – 7.2x103 100 – 13x103 100 – 2.5x103 350 – 14x103 1.1x103 – 2.8x107 1x103 – 11x106 1x102 – 2x105 202 – 3.4x103 46 – 6.5x103 3.3x106 – 19x106

UFC: Unidades formadoras de colonias.

ND: No detectable.

19

Bacterias en la atmósfera

mos activos de liberación, son introducidas a la atmósfera por procesos mecánicos, directamente por la acción del viento y la lluvia sobre el suelo, los cuerpos de agua y la superficie de las hojas, e indirectamente por la acción de las olas y la formación de burbujas sobre los sistemas acuáticos. Las actividades antropogénicas, como el tráfico vehicular, las plantas de tratamiento de aguas residuales, los centros de manejo de desechos sólidos, el movimiento de los animales en suelos expuestos, las prácticas agrícolas y la manipulación de composta7, 8, 9 entre otros, liberan una gran cantidad de bacterias a la atmósfera, produciendo la contaminación de las áreas circundantes (cuadro 1). Las bacterias suspendidas en la atmósfera generalmente se encuentran asociadas a partículas, por lo que su concentración aumenta durante la época de secas, debido al transporte convectivo de las partículas provenientes de las superficies secas. Durante la época de lluvias su número disminuye significativamente debido al lavado de la atmósfera.10 Las plantas, al ser un hábitat natural de muchos microorganismos (saprobios o patógenos), entre los que se incluyen las bacterias, contribuyen de manera

importante a incrementar el número de éstas suspendidas en el aire, por la acción del viento y de la lluvia, así como por el roce entre las mismas hojas.11 Durante la época húmeda del año la vegetación puede liberar una mayor carga bacteriana a la atmósfera que el suelo. La superficie de los vegetales se considera un sistema abierto, en continuo intercambio con la atmósfera. Este hábitat aéreo, cercano a la superficie de las plantas y con el que se mantiene cierta relación, se conoce con el nombre de filosfera, y sus habitantes son llamados epífitos.12 En gran parte el interés por el estudio de la filosfera se deriva de la necesidad de conocer el comportamiento (dispersión, colonización, sobrevivencia y patogenicidad), así como el control de los fitopatógenos, que son abundantes en este ambiente. La comunidad bacteriana que compone la filosfera es muy amplia y en realidad se conoce muy poco acerca del número y especies que la integran, debido a que muchos de sus miembros se encuentran dentro del grupo de organismos no cultivables. Recientemente se han desarrollado técnicas moleculares para tratar de conocer la identidad de los miembros que integran a la comunidad de bacterias epífitas. Entre éstas se presenta una alta tasa de transferencia de plásmidos, a la vez que la abundancia de fagos encontrados sobre las plantas sugiere que la transducción también puede prevalecer. Por otra parte, la superficie de las hojas se considera como un medio de colonización hostil para las bacterias, debido a los frecuentes cambios en la disponibilidad de agua, incidencia de la radiación y baja disponibilidad de nutrimentos, por lo que dichas cepas pueden servir como fuente de genes que codifiquen para tolerar condiciones de estrés. Esto sugiere que la superficie de las hojas puede considerarse un área importante para la diseminación horizontal de genes y por lo tanto un sustento para la diversificación microbiana.12 Por otra parte, los animales y el hombre también constituyen una fuente importante de bacterias patógenas. Las bacterias contenidas en la saliva se liberan a la atmósfera al hablar, toser y estornudar; la descamación de la piel y el cabello es una fuente constante de generación de virus, bacterias y hongos; las heces de animales y humanos pueden contaminar el suelo con microorganismos potencialmente patógenos, y existe la posibilidad de que sean suspendidos posteriormente en la atmósfera. En diversas muestras de polvo urbano y casero de la Ciudad de México (datos no publicados) se ha aislado la bacteria Escherichia coli, indicadora de contaminación fecal, y que constituye el 40% del total de bacterias coliformes aisladas en el polvo,13 lo que indica un riesgo potencial de contaminación por ésta y otras bacterias patógenas, así como por virus o parásitos. Se reconoce que las bacterias están presentes en la atmósfera de ambientes extramuros, y que su inhalación representa un riesgo para la salud, ya sea en su forma vegetativa o parte de sus compuestos estructurales denominados “compuestos biogénicos”, como son los lipopolisacáridos de la membrana externa de las bacterias Gram negativas y los ácidos teicoicos de las Gram positivas.

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Microbiología ambiental

4. MUESTREADORES
Existen diferentes tipos de muestreadores para colectar las partículas suspendidas en la atmósfera así como para determinar su distribución por tamaño. Algunos se han diseñados para el muestreo de polvo o partículas no viables, mientras que otros se usan exclusivamente para la colecta de bioaerosoles o microorganismos. A continuación se describirán algunos de los muestreadores cuyo uso es más frecuente en el área de la aerobiología para el aislamiento de bacterias.

IMPACTADORES
El principio de colecta por impactación se basa en la tendencia de una partícula a desviarse del flujo de aire debido a la inercia, cuando la corriente de aire se curva al pasar por una superficie sólida o semisólida. Las partículas se separan de la corriente de aire y se impactan sobre la superficie.
Impactador de cascada

Dentro de esta clase de muestreadores el más usado en los estudios aerobiológicos es el impactador para partículas viables Andersen (Graseby, Atlanta, GA.). Este equipo está constituido por una serie de seis placas de aluminio, cada una con 400 orificios cuyo diámetro disminuye sucesivamente, por lo que la velocidad del aire se incrementa de una etapa a la siguiente. Succiona un flujo de aire de 28.3 L min.-1 (1 pie3) por medio de una bomba de vacío. Las partículas que son acarreadas en la corriente de aire, con un diámetro aerodinámico entre >15 a 1 µm, son separadas por su tamaño en seis fracciones al pasar por las placas perforadas. Las partículas de una masa mayor son depositadas en la etapa superior, mientras que las partículas más pequeñas, capaces de mantenerse en el flujo de aire a baja velocidad, son transportadas sucesivamente a mayor velocidad y se impactan sobre la superficie de colecta de las siguientes etapas.14 Bajo cada placa se coloca una caja Petri con agar, en cuya superficie se desarrollarán las partículas viables (figura 3). Existe una versión del impactador de cascada Andersen de dos etapas, cada una con 200 orificios. Al igual que el muestreador anterior, succiona un flujo de aire de 28.3 L min-1 y las partículas son separadas en las fracciones respirable y no-respirable. La etapa superior corresponde a las placas 1 y 2 del muestreador de seis etapas y la inferior a las etapas 3 a 6 (figura 3).

21

Bacterias en la atmósfera

FIGURA 3. MUESTREADORES DE CASCADA ANDERSEN DE DOS Y SEIS ETAPAS

Microbiología ambiental

Muestreadores de una etapa

22

Existen diferentes modelos de muestreadores de una etapa. El muestreador portátil Burkard (Rickmansworth, England) colecta las partículas suspendidas con un flujo de aire de 10 L min.-1 a través de una placa perforada con 100 orificios. Se recomienda el uso de este equipo para la colecta de partículas < 5 µm de diámetro, con una eficiencia > 95%. El muestreador N6-Andersen, el cual es una adaptación del equipo de seis etapas, sólo usa la sexta etapa del muestreador. El uso de los impactadores de una etapa es más económico en términos del número de placas de agar requeridas y del tiempo empleado en el procesamiento de las muestras; sin embargo, presenta la desventaja de no fraccionar la muestra por tamaños.
Impactadores en líquido (Impingers)

En este equipo de muestreo el aire succionado con una bomba de vacío se colecta directamente sobre un medio líquido. La mayoría de los impingers están hechos de vidrio Pyrex, con una sola cámara de colecta y un conducto para la succión del aire, el cual cuenta con un orificio crítico que determina la velocidad del flujo de aire.

Foto: Omar Rojas

Uno de los modelos es el AGI-30 (all-glass impinger), en el cual el flujo de aire llega a 30 mm de la base del muestreador. Esto incrementa la eficiencia del muestreo de partículas viables, ya que reduce la velocidad a la que son impactadas y disminuye el daño causado por el contacto con la base del muestreador. Este equipo funciona con un flujo de aire de 12.5 L min-1 y generalmente se usan 20 mL de medio de colecta. La ventaja de este muestreador es que se puede realizar una serie de diluciones del líquido de colecta cuando la concentración de microorganismos es muy alta. El empleo de este tipo de equipo no se ha reducido únicamente a la colecta de partículas fúngicas y bacterias suspendidas en el aire, se ha empleado exitosamente en la colecta de algas, amibas de vida libre,15 virus y recientemente se ha utilizado el líquido de colecta en la detección de diversos microorganismos por medio de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).16 El método de PCR es rápido y sensible, por lo que puede ser usado como una alternativa para la evaluación de la calidad del aire.
Impingers con fraccionamiento de tamaño
Bacterias en la atmósfera 23

En 1960 May diseñó un muestreador que combina las ventajas de colectar las partículas suspendidas dentro de un medio líquido, con la de fraccionar las partículas por su tamaño.17 Este muestreador es conocido como MSLI (multistage all glass liquid impinger) y se presenta en tres tamaños que colectan 55, 20 y 10 L min-1 por medio de una bomba de vacío. Las partículas suspendidas en la corriente de aire se separan en tres fracciones, que corresponden por su tamaño, a la depositación en la región extra-torácica, bronquial y alveolar del tracto respiratorio (figura 4). Una alternativa al uso del MSLI, es el impactador en líquido Burkard, el cual al igual que el muestreador anterior separa las partículas en tres fracciones (>10 µm; 10-4 µm; <4 µm) con base en su diámetro aerodinámico (DA). La ventaja de este equipo es que está fabricado en aluminio, por lo que su diseño es más exacto, y existe un riesgo menor durante los muestreos ya que es menos frágil (figura 4).
Muestreadores de centrífuga

La colecta de microorganismos por centrifugación permite la creación de un torbellino que produce que las partículas suspendidas en el aire se impacten sobre la superficie de colecta. El muestreador más común de este tipo es el Biotest RCS (Reuter Centrifugal Air Sampler, Alemania). El aire es succionado

FIGURA. 4. MUESTREADORES EN FASE LÍQUIDA CON FRACCIONAMIENTO DE TAMAÑO

Microbiología ambiental

por el rotor del muestreador, que al girar crea una fuerza centrífuga y ocasiona la impactación de las partículas. Sobre las paredes de la cámara se coloca una tira plástica con agar en la que se desarrollarán las colonias de microorganismos, después de ser retirada del equipo e incubada a la temperatura adecuada. El motor funciona con baterías y succiona un flujo de aire de 40 L min-1 (figura 5). Es un equipo pequeño y de fácil manejo, por lo que su uso se ha popularizado especialmente en la evaluación de la calidad microbiológica de ambientes hospitalarios.18 Sin embargo, no es un equipo recomendado para el muestreo de ambientes ocupacionales ya que la superficie de las tiras de agar se saturan fácilmente.

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5. DISTRIBUCIÓN TEMPORAL Y ESPACIAL DE LAS AEROBACTERIAS
Las bacterias son menos numerosas en la atmósfera que los hongos, aunque algunas veces pueden encontrarse en la atmósfera como células independientes, generalmente lo hacen asociadas a partículas que varían en tamaño de <0.65 a >7.0 µm DA, excepto en zonas costeras donde los aerosoles bacterianos son de menor tamaño. En esta área más del 84% de las partículas transportadoras de bacteria tienen un tamaño promedio de 3.6 µm DA. La razón de este tamaño se

Foto: Omar Rojas

FIGURA 5. MUESTREADOR DE CENTRÍFUGA BIOTEST

Foto: Omar Rojas

debe a que las bacterias se asocian a materiales amorfos de plantas, a escamaciones dérmicas, suelos, hongos, aerosoles marinos, núcleos de condensación o bien pueden ser introducidas a la atmósfera en conglomerados bacterianos, protegidos por solutos o sustancias mucosas.19 La figura 6 muestra la distribución de las aerobacterias por tamaño, en muestreos realizados en la Ciudad de México a las 10:00 h. durante la época de secas.10 Estas partículas se encuentran en una compleja dinámica establecida entre la atmósfera, el suelo, los cuerpos de agua y el dosel que forman los edificios o los diferentes tipos de vegetación, influenciada por procesos de depositación húmeda y seca, viento y corrientes de convección por mencionar algunos. Estos factores serán de gran importancia para la distribución de las aerobacterias cerca del suelo o a grandes distancias, en una zona costera, en los polos, en una zona rural o una urbana. Por esta complejidad es natural esperar que la concentración de las aerobacterias presente una gran variabilidad, tanto diurna como estacional. Los resultados obtenidos sobre la cuantificación de aerobacterias en un valle localizado entre dos montañas, sujeto a condiciones meteorológicas locales y de mesoescalas, se comportaron bajo el siguiente patrón diurno: en la noche se registró la mínima concentración y al amanecer la máxima, debido probablemente a la dispersión de lo acumulado cerca del suelo del día anterior; durante el día el calentamiento promueve el flujo de bacterias a grandes alturas y confor-

25

Bacterias en la atmósfera

FIGURA 6. DISTRIBUCIÓN DE LAS AEROBACTERIAS ASOCIADAS
A PARTÍCULAS DE DIFERENTES TAMAÑOS

100 80
PORCENTAJE Microbiología ambiental

60 40 20 0

<0.65

1.1 2.1 3.3 4.5 TAMAÑO DE PARTÍCULAS (µM)

≥7.0

me se va estabilizando la atmósfera éstas se acumulan nuevamente cerca de la superficie del suelo. Durante la tarde la entrada de aire y la brisa limpian el valle, y finalmente en la noche, el aire que baja por la pendiente de las montañas termina por desplazar lo acumulado durante el día.19 Se considera que el proceso de las primeras horas de la mañana (dilución) y el de la tarde (acumulación) se da en diversas localidades (bosque, urbano y rural), mientras que los otros procesos dependen de la cercanía a océanos o montañas (figura 7). Se cuenta con poca información acerca de la variación estacional de las aerobacterias; sin embargo, en algunos lugares de Europa, Estados Unidos y Canadá se han encontrado altas concentraciones de éstas en verano y bajas en invierno, asociadas con períodos polvosos de sequía durante la primera temporada, mientras que en primavera e invierno la lluvia y la nieve permiten la disminución de la concentración de aerobacterias. Se tiene información de que el tipo de aerobacterias varía con las horas del día. En la noche las Gram positivas esporuladas presentan su concentración mínima (17%) y las Gram negativas su máxima (22%); durante el día se invierte el proceso con 35% y 12%, respectivamente. También se ha evaluado la proporción de bacterias pigmentadas: durante el día disminuye la proporción de bacterias no pigmentadas debido a su sensibilidad a la radia-

26

FIGURA.7 DISTRIBUCIÓN HORARIA DE LAS AEROBACTERIAS
DURANTE LA ÉPOCA DE SECAS

400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 5 10 15 HORA DEL DÍA 20
Bacterias en la atmósfera 27

Fuente: 19.

ción solar, por lo que se registra una mayor proporción de aerobacterias pigmentadas.20 La distribución espacial de las aerobacterias es dependiente de los flujos y la modulación meteorológica. El flujo es definido como el número de bacterias que pasan a través de una unidad de área por una unidad de tiempo (UFC m3 s-1) y esto a su vez, está determinado por la dinámica atmosférica. Sin embargo, se tienen pocos datos al respecto. En un matorral desértico,21, 22 se han encontrado 4.7 UFC m3 s-1, 75 UFC m3 s-1por encima de campos de trigo, y 543 UFC m3 s-1 en campos de alfalfa.23, 24 Diferentes observaciones señalan que estos flujos varían durante el día a pesar de que se considera que la tasa de crecimiento de las bacterias epífitas se mantiene constante. En general puede mencionarse que: · · · · Las aerobacterias decrecen con la altura (la capa de inversión representa una barrera para la dispersión de las bacterias). La concentración de aerobacterias cambia dependiendo de las características de la superficie por la que atraviesa la masa de aire. Los sistemas climáticos frontales con vientos en ráfaga pueden incrementar la concentración, mientras que disminuyen con la lluvia. Las actividades en zonas urbanas y rurales pueden aumentar la entrada de bacterias a la atmósfera.

BACTERIAS TOTALES (UFC M-3)

·

El efecto de la contaminación atmosférica puede afectar su viabilidad y por lo tanto su distribución espacial.

Algunas bacterias pueden viajar grandes distancias y otras pueden afectar solamente a nivel local y su supervivencia es por corto tiempo. Las aerobacterias son más numerosas en las ciudades (4000 UFCm-3, promedio 850) que en áreas rurales (3400 UFCm-3, promedio 99).25, 26, 27 Hasta este momento, utilizando el mismo muestreador y las mismas condiciones de cultivo, se obtuvieron los siguientes datos: las bacterias Gram positivas (73-90%) son el grupo predominante entre las aerobacterias, siendo abundantes las Micrococaceas y los Staphylococcus; las formas esporuladas registran altas concentraciones en los bosques, entre intermedias y altas en zonas rurales, y bajas proporciones en zonas costeras.21 No ha sido posible identificar aproximadamente 21% de las Gram positivas cultivables. Las Gram negativas representan una baja proporción de la población de las aerobacterias, donde los grupos representativos son las Pseudomonas (5.5-10.7%), principalmente en zonas rurales, y las Xanthomonas (0-7.6%) en zonas costeras (cuadro 2). En la atmósfera de zonas marinas se han registrado concentraciones de aerobacterias de 1-32 UFC m-3, incluyendo Micrococcus, Sarcina, Bacillus, Corynebacterium, bacilos pleomórficos, Gram positivos y formas esporuladas. En la estratosfera (18–27 km), no se ha determinado cuál es la mejor técnica para hacer un muestreo, sin embargo, se han logrado aislar micrococos, bacilos Gram positivos, negativos y bacterias difteroides.28

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Microbiología ambiental

6. VIABILIDAD DE LAS AEROBACTERIAS
Cuando los organismos son estresados por aerosolización, frío, calor, congelación, radiación, contaminación química o choque osmótico, pueden morir o ser dañados, aunque otros pueden permanecer aparentemente sin resentir sus efectos. Las bacterias dañadas son importantes ya que no son capaces de crecer en medios de cultivo (viables no cultivables) como lo harían las especies no dañadas; sin embargo, éstas se podrían reproducir al encontrar un ambiente adecuado, obteniendo suplementos metabólicos que les permitirían reparar el daño sufrido y así poderse reproducir. De tal forma que la supervivencia de una bacteria al ser estresada, dependerá de su capacidad de reparar sus funciones biológicas afectadas y podría mencionarse de manera general que lo realizan a través de dos tipos de procesos: 1) Físico-químicos 2) Enzimático (dependiente de energía)

CUADRO 2. BACTERIAS CULTIVABLES AISLADAS DE LA ATMÓSFERA
DE AMBIENTES EXTRAMUROS

MICROORGANISMO

UBICACIÓN

PORCENTAJE
DEL TOTAL

Bacillus Arthrobacter Clavibacter Curtobacteruim Rhodococcus Micrococcus Pseudomonas Xanthomonas Staphylococcus Micrococcus Corynebacterium Brevibacterium Listeria Bacillius Escherichia coli Serratia Enterobacter Aeromonas Klebsiella No fermentadoras

Oregon, EE.UU. (Bosque, costa, urbano, rural)

16.92 1.22 1.92 8.06 0.84 1.46 2.46 2.24 30.5 7.15 12.85 10.9 30.3 51.3 4.9 2.1 46.4 5.5 1.0 32.0

Beijing, China

Ciudad de México (zona urbana)

Debe mencionarse que las diferentes estructuras y compuestos de las bacterias no presentan la misma estabilidad termodinámica, siendo menos estables las membranas que los ácidos nucleicos; consecuentemente la molécula dañada dependerá de la energía del factor estresante. Tal es el caso de la desecación que cuenta con menos energía que la radiación ultravioleta (UV), por lo que la primera afectará más fácilmente a las membranas.29 En el cuadro 3 se presentan las moléculas blanco asociadas con los factores estresantes, lo que resulta importante porque nos da idea del tipo de proceso que se deberá llevar a cabo durante la reparación. La reparación de estructuras superficiales es necesaria ante el estrés por deshidratación o rehidratación, los cuales producen daño a estas estructuras y a las membranas; una forma en que este daño se expresa es a través de la afectación de enzimas hidrolíticas; metales como el Mg, Fe, o Zn son importantes en los me-

29

Bacterias en la atmósfera

canismos de reparación, pero se ha observado que una completa reparación tiene lugar sólo en presencia de fuentes de carbón. La congelación y la descongelación producen este mismo tipo de daño y se ha registrado una recuperación favorable con péptidos. La reparación del transporte activo es un proceso que llevan a cabo algunas bacterias afectadas por deshidratación. El mecanismo de reparación se debe en parte por un incremento del α-metil glucósido, aunque el mecanismo completo de reparación aún no se conoce. El oxígeno, el ozono, los diferentes contaminantes ambientales y la radiación exacerban la desecación de las bacterias debido a la formación de radicales libres, los cuales oxidarán principalmente a los lípidos, afectando la fluidez de la membrana. La reparación del daño por radiación UV induce en el ácido desoxirribonucleico (ADN) un dímero ciclobutano pirimidina, cercano a las uniones citosina o timina, formando un anillo ciclobutano. Muchas bacterias poseen una enzima muy específica capaz de separar este dímero, restaurando así la secuencia de bases; esta enzima tiene requerimientos estrictos de luz. La reparación también puede ser por corte del dímero de la pirimidina, completándose el espacio por la acción de la ADN-polimerasa usando la banda complementaria de ADN como molde. Se conoce que el gen rulAB, presente en plásmidos de bacterias que habitan en la filosfera, y el gen umuDC, presente en cromosoma de bacterias entéricas, están involucrados en la reparación del ADN después de la exposición a radiación ultravioleta.30 De lo anteriormente descrito, se desprende que los microorganismos que cuentan con grandes reservas de adenosin trifosfato (ATP) y trehalosa, entre otros, serán capaces de reparar los daños causados por el estrés de la aerosolización.

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Microbiología ambiental

CUADRO 3. MOLÉCULAS BLANCO AFECTADAS
POR FACTORES AMBIENTALES ESTRESANTES

FACTOR ESTRESANTE Humead relativa y temperatura Oxígeno Ozono Factor aire libre (ozono+olefins) Rayos γ, rayos X y UV

MOLÉCULA BLANCO Fosfolípidos de membrana, proteínas Fosfolípidos, proteínas Fosfolípidos, proteínas Fosfolípidos, proteínas y ácidos nucléicos Fosfolípidos, proteínas y ácidos nucléicos

Fuente: 29.

7. RELACIÓN DE LAS AEROBACTERIAS CON LAS FASES DE TRANSICIÓN
EN LA ATMÓSFERA Las partículas solubles e insolubles, orgánicas e inorgánicas, naturales o antropogénicas, participan en las fases de transición vapor-líquido, vapor-sólido (hielo) y líquido-sólido. Está bien documentado el hecho de que las aeropartículas actúan como núcleos de condensación en la formación de nubes. Sin embargo, la mayoría de ellas requieren de temperaturas de aproximadamente –10oC. La peculiaridad de algunas partículas biológicas, principalmente bacterias, es que tienen la capacidad de inducir congelación a temperaturas de –2oC, aunque la mayoría lo hacen a – 4oC. Esto significa que si el agua que las rodea está fría, el proceso de formación de la nube puede ser inducido por estas partículas biológicas como núcleos activos de congelación. Algunos organismo han desarrollado mecanismos mediante los cuales minimizan el daño debido a la congelación, mediante la formación de hielo extracelular. Específicamente las bacterias sintetizan proteínas con diferentes funciones:31 · · · Proteínas núcleo de hielo, actúan como soporte para formar hielo. Proteínas anti-núcleo, inhiben la formación del núcleo de hielo, por medio de una partícula extraña en la gota de agua. Proteínas anticongelantes, disminuyen las temperaturas de congelación, modifican o inhiben el crecimiento de los cristales de hielo y su recristalización, y protegen a la membrana celular de los daños inducidos por el frío.

Los genes involucrados en la formación de núcleos de congelación han sido secuenciados para Erwinia ananas (inaA) y para varias especies de Pseudomonas (inaW, inaZ); la alta homología y su posible ancestro común aún es tema de discusión.32 Se conoce poco del papel de las partículas biológicas en la formación de núcleos de condensación de nubes, aunque se especula que ciertas partículas con gran afinidad por el agua podrían tener un papel activo. Datos experimentales señalan que los granos de polen presentan propiedades higroscópicas, ya que adquieren agua de la atmósfera a una humedad relativa menor al 100%.33 Por otro lado, es importante mencionar que se considera que la niebla actúa como una fuente generadora de bioaerosoles secundarios, ya que algunas aerobacterias se duplican durante los eventos con niebla.4

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Bacterias en la atmósfera

8. AEROBACTERIAS PATÓGENAS
FITOPATÓGENOS
Para los microorganismos la dispersión es una oportunidad para que muchos de sus propágulos se distribuyan amplia y azarosamente entre áreas y hospederos, principalmente inhóspitos. Uno de los mecanismos utilizados en la dispersión consiste en la formación de propágulos resistentes y la liberación de cantidades considerables de esporas, situación que incrementa notablemente la colonización de un hábitat. Tal es el caso de numerosos hongos fitopatógenos transportados por el aire. Puccinia graminis es capaz de liberar millones de esporas por m3 en un campo de trigo, su liberación puede realizarse en períodos cortos o hasta por seis meses y no requiere de ningún otro vehículo o vector para su diseminación.34 En el caso de las bacterias, muchas de éstas provienen de la filosfera35 y su dispersión se ve favorecida durante las primeras horas de la mañana de días soleados, cuando las hojas están secas y la velocidad del viento supera 1 ms-1, lo que permite que se efectúe el transporte de alrededor de 100 UFCm3s-1; sin embargo, esta concentración puede ser muy variable.23 La inmigración y emigración de fitopatógenos también puede ocurrir durante la lluvia, la irrigación de los cultivos y su cosecha, a través de aerosoles generados y transportados por el viento o cuando las gotas de lluvia golpean la superficie de hojas infectadas.36 Sin embargo, este mecanismo también puede reducir rápidamente las poblaciones de bacterias, debido al efecto de lavado que ejerce sobre ellas. Finalmente los patógenos son depositados en el suelo, el cual constituye una fuente de microorganismos que pueden ser nuevamente suspendidos en la atmósfera, siempre que la velocidad del viento sea mayor a 0.2 ms-1, y el suelo se encuentre lo suficientemente seco.23, 37 Otro mecanismo de dispersión se presenta a través de vectores, como algunos insectos y aves, los cuales transportan hongos y bacterias epífitas en sus extremidades.38, 39 El transporte aéreo es extremadamente deletéreo, ya que las células son expuestas a radiación UV, desecación y altas temperaturas; no obstante, algunas bacterias pueden tolerar dichas condiciones. La dispersión de los fitopatógenos puede ser local, si se realiza dentro del mismo cultivo, o de forma global, como ocurre durante las tormentas de polvo. Un ejemplo de transporte a grandes distancias lo representa Puccinia graminis, el cual fue transportado del norte de México y el sur de Texas al norte de los Estados Unidos de América y Canadá durante la primavera, haciendo un recorrido similar en sentido contrario durante el verano y otoño. Se han registrado transportes a través de los océanos de fitopatógenos que van de Australia a Sudáfrica, de Angola a Brasil y de África al Caribe y América.40, 41, 42 Se requiere del diseño de modelos donde los eventos de

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Microbiología ambiental

liberación, dispersión y depositación en el hospedero estén interconectados con los fenómenos de turbulencia atmosférica y de esta forma poder predecir cómo, cuándo y dónde serán transportados los fitopatógenos.43

EFECTO DE LOS MICROORGANISMOS EN LAS PLANTAS
Las plantas superiores sirven como un ambiente donde pueden desarrollarse poblaciones y comunidades microbianas, que incluyen bacterias, levaduras y hongos. Las bacterias constituyen uno de los colonizadores más numerosos, registrando concentraciones de 107 bacterias cm-2.12, 44 Las actividades de las plantas, la nutrición y los componentes celulares proveen una fuente de nutrimentos para dichos microorganismos, estos a su vez, son la causa de respuestas morfológicas, bioquímicas o patológicas en el individuo con el cuál están asociados. Esta relación entre macro y microorganismos es altamente interdependiente, debido a la proximidad física tan estrecha que presentan.34 Las relaciones microbianas pueden ocurrir en la rizósfera, en la filosfera o en el suelo, a una distancia cercana de la planta. El interés por dichas relaciones, se debe al impacto económico de los fitopatógenos en la producción agrícola, con una clara necesidad de entender su comportamiento y control. Estudios sobre la diversidad de bacterias realizados con las secuencias del ácido ribonucleico ribosomal (ARNr) del 16S revelan comunidades más complejas a las reportadas con anterioridad.45 En el cuadro 4 se enlistan algunas de las especies fitopatógenas frecuentemente aisladas en hospederos con importancia económica. Las bacterias pueden afectar el desarrollo y la productividad de una planta por diferentes mecanismos: disminuyendo la eficiencia del proceso fotosintético, como patógenos, actuando como núcleos de congelación y por la producción de fitohormonas. Sin embargo, poco se conoce sobre el papel de colonizadores no patógenos; Pseudomonas fluorescens y Pantoea agglomerans son dos especies epífitas que inhiben la colonización de fitopatógenos y actualmente son explotadas comercialmente.12, 46, 47 Los factores que participan en la relación planta-bacteria son la distribución geográfica y clima, la fenología y edad de la planta, y la genética de las bacterias. Dentro de las características de los fitopatógenos se encuentra la abundancia de formas pigmentadas, como Erwinia herbicola, que confieren ventajas selectivas para colonizar ambientes expuestos a radiación solar intensa.48 Otro de los habitantes comunes en las hojas es Pseudomonas syringae, cuyo éxito en la colonización se debe a su capacidad para utilizar como fuente de energía y carbono compuestos como el metanol y metilaminas, los cuales se encuentran disponibles en la superficie de las hojas y constituyen una de las principales fuentes de emisión de metanol a la atmósfera.49 Esta característica le permite a la bacteria

33

Bacterias en la atmósfera

parasitar más de 80 especies de plantas, causando lesiones necróticas. Otro mecanismo de daño es su participación como núcleo de congelación.50 CUADRO 4. BACTERIAS AISLADAS DE LA FILOSFERA
DE ESPECIES DE IMPORTANCIA ECONÓMICA

Microbiología ambiental

HOSPEDERO: CENTENO Pseudomonas fluorescent Xanthomonas campestris Flexibacter spp. Listeria spp. Staphylococcus saprophyticus Klebsiella spp. Acinetobacter spp. Erwinia herbicola Pseudomonas spp. Staphylococcus spp. Bacillus spp. Micrococcus luteus Aislados no identificados HOSPEDERO: PERA Y MANZANO Erwinia amylovora Pseudomonas fluorescens Pantoea agglomerans HOSPEDERO: OLMO Bacillus megaterium HOSPEDERO: FRIJOL Curtobacterium citreum HOSPEDERO: ARROZ Curtobacterium albidum

HOSPEDERO: OLIVO Pseudomonas syringae Xanthomonas campestris Erwinia herbicola Acinetobacter aceti Gluconobacter oxydans Pseudomonas fluorescens Bacillus megaterium Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus plantarum Curtobacterium plantarum Micrococcus luteus Arthobacter globiformis Klebsiella planticola Streptococcus faecium Clavibacter sp. Micrococcus sp. Serratia marcescens Bacillus subtilis Cellulomonas flavigena Erwinia sp. Zymomonas mobilis Bacillus sp. Alcaligenes faecalis Erwinia carotovora Pseudomona aeruginosa
OSPEDER EDERO PLANT ANTAS HOSPEDERO: DIVERSAS PLANTAS Sphingomonas pruni

34

BARRERAS PARA LA COLONIZACIÓN
La filosfera puede ejercer una acción selectiva sobre los fitopatógenos. Las condiciones químicas, físicas y biológicas determinan cuáles células sobrevivirán,

proliferarán o morirán, y aunque existen diversas especies con distribución global, algunas pueden ser excluidas debido a una o más propiedades del hábitat potencial. La condición que evita la presencia de otras especies es considerada una barrera, aunque no necesariamente debe ser un obstáculo físico, ya que pueden ser sustancias u organismos los que pueden evitar la colonización microbiana. En el caso específico de las plantas, éstas poseen cubiertas que protegen los sitios potenciales de colonización y reducen la difusión de nutrimentos, limitando el crecimiento bacteriano. Tal es el caso de la cutícula externa de los frutos, la cera de las hojas, los exudados de resina, gomas y taninos.51 Existen también compuestos fenólicos y glucósidos fungistáticos, y la presencia de diferentes enzimas como la peroxidasa, involucrada en la resistencia contra hongos patógenos.34 Estos microorganismos también están sujetos a condiciones extremas de desecación, radiación UV, cambios de temperatura, humedad relativa, velocidad del viento, y lluvia ácida, características por las que se considera a la filosfera como un ambiente estrés.46

GENES ASOCIADOS CON LA PATOGENICIDAD
Se han identificado numerosos genes que capacitan a una bacteria fitopatógena en el proceso de colonización. Durante el contacto entre una planta y un microorganismo patógeno se produce una cascada de eventos, dentro de los cuales se distinguen dos tipos de respuesta. La primera requiere de un receptor que interactúe con alguna proteína de la bacteria, desarrollando una reacción protectora inmediata de la planta; en esta situación, la bacteria es denominada avirulenta para un genotipo específico.52, 53 En el otro tipo de respuesta existen proteínas virulentas que afectan a la planta produciendo radicales libres en el sitio de penetración del patógeno, generando la muerte de las células infectadas. En ambos casos se requiere de la transcripción de genes que confieran características de resistencia a las bacterias. Tal es el caso del incremento de polisacáridos extracelulares que fortalecen las paredes, la producción de pigmentos como la melanina y la expresión de genes rulAB, responsables de mecanismos de reparación de ADN, características que les permiten a las bacterias resistir condiciones de desecación y tolerar la radiación UV. La utilización de diferentes compuestos orgánicos como sustratos, motilidad, osmotolerancia y la capacidad para adherirse a superficies, son también adaptaciones de fitopatógenos. Algunas de estas características las codifican genes comunes, y otras genes patógenos, como es el caso del gen gae que codifica un pili tipo IV que participa en la adherencia de las bacterias.54 El modelo mejor estudiado es hrp (reacción de hipersensibilidad y patogenicidad) de

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Bacterias en la atmósfera

Pseudomonas syringae, presente en la mayoría de las bacterias fitopatógenas Gram negativas y responsable de la necrosis de células vegetales. Algunos genes similares a hrp han sido identificados de especies no patógenas, en donde funcionan como promotores de crecimiento en la rizósfera. Dentro de las funciones de las proteínas codificadas por los genes hrp se encuentran la regulación de la transcripción, la síntesis de los componentes de una vía de secreción y la síntesis de proteínas de secreción de esta vía, lo que conforma un sistema de secreción tipo III, similar al que utilizan los patógenos de animales como Yersinia, Shigella y Salmonella spp.55, 56, 57 En otros fitopatógenos se han caracterizado nueve genes que muestran gran similitud con las secuencias de hrp altamente conservados, denominados hrc. Otro grupo de genes requeridos en la formación de lesiones y producción de toxinas es gacS (activador global del sensor cinasa) y gacA. En este sistema las proteínas cinasas codificadas por gacS sirven como un sensor de estímulos ambientales, en donde la señal es transmitida por fosforilación de un regulador citoplásmico, que induce cambios en la transcripción del gen gacA responsable de la producción de numerosos metabolitos que contribuyen al biocontrol de hongos de la rizósfera; ambos genes también influyen en la producción de proteasas extracelulares. 58 El gen ice presente en cepas de Pseudomonas syringae es el responsable del daño por congelación, ya que muestra una correlación positiva entre la temperatura de congelación y el tamaño de la población de cepas ice +. Actualmente una estrategia de control de daño es la utilización de cepas recombinantes ice –.12 Los genes asociados a procesos fitopatógenos continúan siendo estudiados en otras especies, con la finalidad de esclarecer el comportamiento de la microbiota presente en la filosfera. La figura 8 nos muestra cómo un fitopatógeno (Pseudomonas syringae) puede ser dispersado a partir de una semilla infectada y llegar hasta la superficie de la hoja; su desarrollo depende de la susceptibilidad y estado vegetativo de la planta, la intensidad de la lluvia y del establecimiento de poblaciones numerosas. En caso contrario, si las condiciones que prevalecen son de desecación y calor, aunado al arribo a una planta desfavorable, solamente sobrevivirá el fitopatógeno. Durante la colonización es necesaria la expresión tanto de genes ordinarios como de genes patógenos (gac, hrp, ice), los cuales favorecen el incremento de la población. En esta etapa las bacterias pueden producir lesiones, que constituyen espacios donde el organismo patógeno puede sobrevivir durante condiciones climáticas desfavorables. Después de este evento el patógeno está preparado para la emigración y dispersión de la enfermedad. Si la planta llega a un estado maduro y logra producir semillas, el patógeno puede permanecer en ellas hasta que sean sembradas y así iniciar un nuevo ciclo.46

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Microbiología ambiental

FIGURA 8. COMPORTAMIENTO DE UN FITOPATÓGENO

^

Nueva planta contaminada por bacterias

PATÓGENOS DE HUMANOS
La presencia de las bacterias en la atmósfera ha sido investigada principalmente por su potencial patógeno en plantas y animales, incluyendo al hombre, ya que tanto las estructuras aéreas vegetales como el tracto respiratorio se consideran sistemas abiertos, en continuo intercambio con la atmósfera. En general puede mencionarse que la concentración de bioaerosoles en extramuros es mayor que la existente en intramuros; a pesar de ello la posibilidad de infección para la población general en los ambientes externos es menor. Sin embargo, la entrada de bioaerosoles a los ambientes intramuros59 representa un peligro importante principalmente en los hospitales, en los que los pacientes con problemas inmunes pueden ser afectados tanto por los microorganismos patógenos como por los oportunistas presentes en estos. Recientemente se ha investigado la diseminación de patógenos a través de los océanos, analizando la dispersión de nubes de polvo de los desiertos africanos.

37

Bacterias en la atmósfera

Semillas con bacterias

^

^

Baj a pr oba bili dad

gacS salA

^

Inmigración Formación de semillas
^ ^
^

Comunidad bacteriana

↓ ↓

Genes patógenos

{

Ordinarios hrp gac ice

Emigrac ión
^
Susceptibilidad de la planta ↓ Inmigración Resistencia ↓ Viento ↓

^

^

Planta enferma
^

Dependiendo de los vientos y la época del año, las nubes de polvo pueden llegar al norte de Europa, América del Norte, Sudamérica, América Central y el Caribe. Aunque durante mucho tiempo se consideró que la transmisión de microorganismos patógenos por esta vía era poco factible, principalmente por el tiempo que tienen que permanecer expuestos a la luz ultravioleta durante el viaje (5-7 días para cruzar el Atlántico y 7-9 días para el Pacífico), se ha mostrado que diferentes microorganismos, incluidos algunos patógenos para humanos, pueden realizar este recorrido y sobrevivir.42 Se cuenta con información42 que señala que existen billones de microorganismos por tonelada de polvo; sin embargo, el mismo estudio refiere que con los métodos de cultivo tradicionales se puede aislar únicamente el 1% de los microorganismos asociados a muestras de polvo. Por otro lado, dicho trabajo considera que la concentración de patógenos es muy baja para causar infección en humanos, aunque es importante tomar en cuenta que un individuo con respuesta inmune deficiente puede infectarse inclusive con dosis bajas y constituirse en una posible fuente de transmisión en ambientes cerrados. Las principales fuentes de bacterias en el aire son originadas por el hombre, siendo las más importantes las aguas negras y los desechos de origen animal. La degradación y digestión de los desechos produce aerosoles que contienen bacterias, algunas de las cuales pueden ser patógenas como es el caso de los estreptococos y las coliformes fecales. El viento y las corrientes turbulentas de aire tienen enorme influencia sobre la distancia que recorren las partículas después de ser liberadas. Un estudio realizado en la ciudad de Marsella60 mostró que el número de bacterias se incrementaba con la temperatura y la velocidad del viento. La identificación de las bacterias mostró que la localización geográfica tenía influencia cualitativa y cuantitativa sobre la biota del aire, observándose un incremento global de los microorganismos, en particular de las bacterias Gram negativas, sobre todo en el área urbana. Las bacterias pueden producir endosporas que le confieren resistencia contra los cambios ambientales, la temperatura y la congelación. Aunque la mayoría de las bacterias esporuladas son anaerobios estrictos (Clostridium), las hay facultativas como en el caso de Bacillus. Las esporas pueden ser transportadas a grandes distancias y dispersadas por el viento, por lo que en los últimos años han adquirido gran relevancia ante la inminencia de atentados bioterroristas. Los virus, al igual que las bacterias, normalmente son introducidos a la atmósfera a través de desechos de origen humano y animal. Sin embargo, su presencia como partículas individuales en el aire es rara. Su detección e identificación en muestras de aire es complicada, por lo que la evidencia de su presencia en bioaerosoles se ha establecido mediante estudios epidemiológicos en veterinaria. No obstante, existen reportes de la presencia del virus de la rabia en grutas

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Microbiología ambiental

habitadas por murciélagos, y de grupos de enterovirus como: echovirus, poliovirus y coxsackievirus provenientes de muestras de aire obtenidas en sitios de riego con aguas negras. El efecto más importante en la población humana (desde el punto de vista económico y por el número de personas afectadas), atribuido a los aerosoles de origen extramuros, son los problemas de hipersensibilidad, en particular la rinitis alérgica, el asma, así como algunas infecciones. Un ejemplo al respecto lo constituye la legionelosis, padecimiento cuyo agente etiológico es Legionella pneumophila. Se ha descrito que el principal mecanismo de infección en este caso es la transmisión directa del medio ambiente por la inhalación de gotas de agua aerosolizadas o partículas que contienen Legionella viable; la bacteria se deposita posteriormente en los alvéolos de los pulmones ocasionando una enfermedad respiratoria severa.

COMPONENTES DE LAS BACTERIAS IMPLICADOS EN EL DAÑO A HUMANOS
La presencia en los bioaerosoles de componentes de la pared celular de bacterias, como es el caso de la endotoxina de las Gram negativas y los ácidos lipoteicoicos de las Gram positivas, representa un problema de salud. La inhalación de estos compuestos causa reacciones febriles y una respuesta inflamatoria intensa en los individuos expuestos.61 Uno de los componentes principales, responsable de dicho efecto son las endotoxinas, término empleado para describir el lipopolisacárido (LPS) de la membrana externa de las bacterias Gram negativas, el cual produce un efecto tóxico. El lípido A del LPS es químicamente distinto de otros lípidos de las membranas biológicas y es el responsable de la actividad tóxica de la molécula.62 Las endotoxinas son ubicuas, dada la naturaleza cosmopolita de las bacterias Gram negativas. En ambientes extramuros se ha encontrado un patrón estacional en la concentración de endotoxinas presentes en el aire, siendo superior durante el verano.63 Sin embargo, las concentraciones más altas en la atmósfera (2-7 µg m-3) se han obtenido en ambientes ocupacionales, como son las fábricas donde se procesan fibras vegetales (como el algodón), plantas de tratamiento de aguas residuales y bioterios, entre otros.64, 65, 66 La respuesta inflamatoria inducida por la endotoxina provoca la liberación de citocinas a través de un receptor de membrana denominado CD14 y una proteína de unión al LPS (LBP) presente en el suero. Aunque se creía que CD14 era un receptor específico para la endotoxina, ahora se sabe que también los peptidoglucanos y los ácidos lipoteicoicos de la pared celular de las bacterias Gram positivas son capaces de estimular macrófagos alveolares, a través de un mecanismo dependiente de CD14.67 Sin embargo, CD14 no es un receptor que
Bacterias en la atmósfera 39

funcione como transductor de señales, y requiere de otras proteínas receptoras, como TLR (toll like receptor), que controlan la señalización. El resultado es la activación del factor nuclear NF-κβ responsable de la transcripción de genes encargados de la producción de citocinas. La endotoxina durante la señalización utiliza una proteína TLR4, mientras que los peptidoglucanos y los ácidos lipoteicoicos requieren de TLR2; ambas proteínas, de manera independiente o combinada, están involucradas en la respuesta inflamatoria. Las partículas actúan como transportadores de compuestos biogénicos así como de microorganismos y alergenos. Diversos estudios epidemiológicos han demostrado que el incremento de aeropartículas menores a 10 µm (PM10), consideradas como partículas inhalables, afecta la salud de niños y adultos. Esta situación se ve reflejada en un aumento en las ausencias escolares por infecciones respiratorias como la bronquitis, la exacerbación asmática, etc. Tal situación incrementa las visitas a hospitales e incluso la tasa de mortalidad.68, 69, 70 Las evidencias epidemiológicas antes mencionadas sólo comprometen el tamaño y la concentración de las partículas; sin embargo, la composición de las mismas tiene un papel muy importante en el tipo de respuesta desarrollada. Alfaro-Moreno et al.71 demuestran que las partículas ambientales de origen industrial con concentraciones elevadas de metales de transición, colectadas en la zona norte de la Ciudad de México, son capaces de inducir apoptosis y daño al ADN en macrófagos y fibroblastos. En cambio, partículas colectadas en la zona centro, un área donde se combina el tráfico vehicular y la contaminación biológica, son responsables de una respuesta inflamatoria más significativa. Otros investigadores, como Soukup y Becker72 y Becker et al.73 han demostrado que bacterias ambientales, como Pseudomonas sp. y Staphylococcus lentus, asociadas a las aeropartículas, son las responsables de la producción de citocinas en macrófagos y células CHO transfectadas con CD14, ya que su producción puede ser reducida hasta en un 50% cuando se utilizan inhibidores de endotoxina como la polimixina B o bloqueando el receptor CD14. Este tipo de respuesta es tres veces más alto con bacterias Gram negativas; sin embargo, éstas se presentan en menor concentración en la atmósfera. Osornio-Vargas et al.74 reportaron resultados similares en donde la producción de citocinas se ve disminuida por la proteína neutralizante de endotoxina (PNEr); sin embargo, no se observa una completa inhibición, lo que sugiere la participación de otros componentes presentes en las partículas durante la respuesta inflamatoria. El aire de ambientes urbanos registra concentraciones relativamente altas de bacterias y endotoxina asociadas a partículas, por lo que su inhalación constituye un riesgo para la salud.

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Microbiología ambiental

BIBLIOGRAFÍA
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Microbiología ambiental

Vibrio cholerae: UNA

BACTERIA AMBIENTAL

CON DIFERENTES TIPOS DE VIDA
Carlos Eslava, Irma Rosas, Martha Solano, Gabriela Delgado, Maritoña Ramírez, Jorge Villaseca y Alejandro Cravioto

1. INTRODUCCIÓN
géneros cuyas especies fueran oxidasa positiva y móviles por un flagelo polar. La familia está constituida por los géneros Vibrio, Photobacterium, Aeromonas y Plesiomonas. El género Vibrio incluye 35 especies de las cuales 26 se han identificado como agentes etiológicos de enfermedad en humanos, de éstas, Vibrio cholerae es una de las especies con mayor importancia clínica y epidemiológica.1 Los vibrios son proteobacterias-gama, heterótrofas, cuyo hábitat primario son los ecosistemas acuáticos salobres y marinos, en donde ocupan una gran diversidad de nichos. Están presentes en la columna de agua y en el sedimento, por lo que se les puede encontrar como bacterias de vida libre, comensales, saprobias o parásitas.2 Las bacterias de este género son bacilos curvos o rectos, Gram negativos, anaerobios facultativos, móviles por flagelos polares y no esporulados. Para estimular el crecimiento de Vibrio spp. se requiere de 5 a 15 mM de NaCl. Sin embargo, V. cholerae puede crecer sin la adición de NaCl al medio y en un pH alcalino (10-6.0); con menor de 6.0 su crecimiento se inhibe.3
47 Vibrio cholerae

EN 1965, VÉRON propuso crear la familia Vibrionaceae para agrupar aquellos

2. EL COMPORTAMIENTO DE VIBRIO EN ESTADO DE VIDA LIBRE
Cuando los vibrios se encuentran en su forma de estado libre (planctónica) queda claro que las condiciones en este hábitat son extremas, ya que el material suspendido en la columna de agua, así como el contenido de nutrimentos en general, es bajo.4 En tal situación adopta una condición morfológica diferente a la que se conoce, disminuye su tamaño (pueden pasar filtros de hasta 0.2 mm), por lo que en este estado se denominan microvibrios.5
[47]

en los sistemas salobres y marinos, ya que forma parte del exoesqueleto de crustáceos como la jaiba y el camarón, por lo que representa una fuente muy rica de carbono y nitrógeno.

3. Vibrio: MICROORGANISMO PATÓGENO EN SU HÁBITAT
Es importante analizar los casos en que los vibrios pueden actuar como patógenos de organismos acuáticos de importancia comercial, o bien que estos organismos puedan ser un vector de patógenos para el hombre. Al respecto se ha estudiado la relación entre Vibrio y los copépodos; por un lado, la bacteria utiliza la quitina de estos últimos como sustrato y por otro, dado que uno de los sitios de colonización es el saco ovígero, cuando el copépodo libera los huevos fertilizados al ambiente estos se convierten en un vehículo para la diseminación de los vibrios.7 Con respecto a su participación como patógeno, se ha reportado que V. anguillarum, V. alginoliticus y V. splendidus son responsables de ocasionar la muerte de larvas de ostión. El estudio del posible mecanismo mediante el cual colonizan y producen la muerte de dichas larvas, señala que un estado de estrés del hospedero da lugar a una respuesta neuroendócrina que incrementa los niveles de noradrenalina induciendo la liberación de hierro, elemento importante para la reproducción de los vibrios.10 Se ha establecido que ciertos factores ambientales afectan el comportamiento de la bacteria. Por ejemplo diversos estudios muestran cómo el incremento de la temperatura influye en el comportamiento patógeno de diferentes especies de Vibrio sobre ciertos organismos acuáticos.11

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V. coralliilyticus: Pocillopora damicornis V. splendidus: larvas Crassostrea gigas V. carcharine: Haliotus tuberculata V. vullneficus: Angulla anguilla V. peneaicid: camaron V. parahaemolyticus: peces

4. TRANSMISIÓN DE Vibrio A LOS A SERES HUMANOS
Los organismos acuáticos, principalmente los bentónicos filtradores que se consumen crudos, pueden ser vectores de vibrios patógenos para el hombre. En las costas del Golfo de México V. vulnificus alcanza concentraciones de hasta 105

49 Vibrio cholerae

6. Vibrio cholerae, BACTERIA ADAPTADA PARA SOBREVIVIR EN
DISTINTOS HÁBITATS El comportamiento epidémico de V. cholera, en su estadio de patógeno de seres humanos, se ha asociado con los florecimientos de plancton, componente biótico del ambiente acuático que le permite mantenerse y reproducirse. Durante su estancia en su habitat primario, la bacteria presentan gran capacidad para responder a cambios ambientales como la temperatura y la salinidad, variaciones cualitativas y cuantitativas de nutrimentos, presencia de depredadores y/o competidores, así como a la existencia de tóxicos tanto antropogénicos como biogénicos. La propiedad que ha desarrollado el género Vibrio para detectar y responder ante situaciones emergentes es de gran importancia para su supervivencia y transmisión. Diferentes estudios han conducido a la identificación de algunos mecanismos con los cuales la bacteria puede sobrevivir en situaciones extremas.17,18 Cambios morfológicos ante la disminución de nutrimentos. El proceso que adoptan las bacterias ante la falta de un sustrato generador de energía se denomina

51 Vibrio cholerae

(basados en las diferencias de los componentes del polisacárido del antígeno somático) designadas como Ogawa, Inaba e Hikojima según su formula antigénica AB, AC y ABC, respectivamente. Además Vibrio cholerae O1 se divide en dos biotipos: Clásico y El Tor, que difieren entre sí por pruebas de hemoaglutinación de eritrocitos de pollo, hemólisis de eritrocitos de carnero, sensibilidad a los bacteriófagos IV (Clásico) y (V) El Tor, la reacción de Voges–Proskauer (VP) y susceptibilidad a la polimixina B.3 Los Vibrios que no aglutinan con el suero anti O1 se denominan genéricamente como no-O1 o no aglutinables (NAG). En 1994 el esquema de tipificación por serología reconocía hasta el serogrupo O140, incluyendo dos particularmente importantes, O139 Bengal, causante de una epidemia parecida al cólera en el sureste asiático a finales de 1992, y el serogrupo O140 o Hakata, que posee solamente el factor antigénico C (presente en serotipo Inaba), pero carece del factor A, el cual es específico para el Vibrio cholerae O1, el esquema actual incluye aproximadamente 200 diferentes variedades antigénicas.13 La diseminación de la enfermedad en India y Bangladesh, causada por el serotipo O139 o Bengal, marcó por primera vez que una cepa de Vibrio cholerae no-O1 haya sido asociada a grandes epidemias,14 aunque continúa estando confinada al Sur-Este Asiático. Vibrio cholerae O139 es responsable de aproximadamente el 15% de los casos de cólera confirmados en uno de los países endémicos de Asia.15, 16

presencia como organismo autóctono en áreas endémicas durante periodos libres de cólera, su existencia en periodos inter-epidémicos, los factores ambientales que contribuyeron a su re-emergencia en América Latina,24 así como a los componentes ambientales que contribuyen a su permanencia en regiones endémicas de cólera. En años recientes se encontró que el genoma de V. cholerae y otros integrantes del mismo género, presenta 4,033,460 pares de bases (pb), constituido por dos cromosomas circulares,25 de 2,961,146 pb (cromosoma 1) y 1,072,314 pb (cromosoma 2). En conjunto ambos codifican para 3,885 marcos de lectura abierta. La mayoría de los genes que son esenciales para las funciones básicas de la bacteria (replicación, transcripción y traducción del ADN y biosíntesis de la pared celular), así como de patogenicidad (toxinas y adhesinas), se localizan en el cromosoma mayor. Por otro lado, el cromosoma pequeño contiene 59% de genes hipotéticos, mientras que en el mayor el 42% de estos no tiene una función conocida. La mayoría de los genes requeridos para el crecimiento y la viabilidad de la bacteria están ubicados en el cromosoma 1 aunque también, y solo presentes en el cromosoma 2, hay genes que pueden ser esenciales para el funcionamiento normal de la célula (dsdA, thrS, genes que codifican para las proteínas ribosomales L20 y L35 y otros que codifican para diferentes intermediarios de rutas metabólicas). La secuencia del genoma de V. cholerae permitió confirmar la presencia de un sistema de captura de genes (isla de integración) localizado en el cromosoma 2 (125.3 kbp). Entre los genes presentes en esta isla se encuentran tres que codifican para productos involucrados en la resistencia a los antimicrobianos (cloramfenicol acetiltransferasa, proteína para resistencia a la fosfomiocina y la glutation transferasa), varias enzimas del metabolismo del ADN (MutT, transposasa y una integrasa), genes de virulencia (hemaglutininas y lipoproteinas) así como tres genes que codifican para productos similares a las proteínas de adicción del hospedero (higA, higB y doc), utilizados por los plásmidos para la selección y el mantenimiento en las células del hospedero. El análisis de la secuencia del genoma de V. cholerae mostró que la mayoría de los genes presentaban gran similitud con los de E. coli (1,454 MLA (marcos de lectura abierta)). También se encontró que 499 (12.8%) de los MLA tenían alta similitud con otros genes, lo cual sugiere la existencia de duplicaciones recientes. La mayoría de los MLA duplicados codifican para productos involucrados en funciones de regulación, quimiotaxis, transportes y adherencia, transposición y patogenicidad. De un total de aproximadamente 105 duplicaciones, por lo menos un MLA se encuentra en cada cromosoma, lo que sugiere que se han presentado entrecruzamientos recientes entre ambos. La extensa duplicación de genes involucrados principalmente en mantener la homeostasis de la bacteria (quimiotaxis y transporte de solutos), apoya la im-

53 Vibrio cholerae

En el ambiente acuático, la quitina representa una fuente de carbono y nitrógeno. Esta fuente de energía es importante para V. cholerae cuando está asociado con el zooplancton, el cual tiene un exoesqueleto quitinoso.27,28 Para el transporte de molibdeno, fosfato y sulfato existen genes en uno o ambos cromosomas. Los involucrados en el transporte del molibdeno se localizan en el cromosoma pequeño, y los encargados del transporte del sulfato se alojan en el cromosoma mayor. Sin embargo, en ambos cromosomas existen copias de los genes para los transportadores del fosfato, los cuales son diferentes en cada cromosoma, lo que indica que no son consecuencia de una duplicación reciente.

9. REGULACIÓN INTERCROMOSOMAL
Las vías de regulación activadas en respuesta a señales ambientales y patogénicas se codifican entre los dos cromosomas. Lo anterior incluye procesos para la supervivencia durante periodos de inanición, censado por mayoría (quórum sensing) y expresión de la hemolisina (HlyA). En los periodos de carencia de nutrimentos, V. cholerae y otras bacterias Gramnegativas entran inicialmente en una fase estacionaria y posteriormente al estado VBNC. El factor sigma j38 (rpoS) es importante para la supervivencia de V. cholerae pero no para su patogenicidad, lo que sugiere que dicho factor tiene una función muy importante en la iniciación del estado VBNC. Existe una copia de rpoS, localizada en el cromosoma 1, cerca de oriC RpoS que regula la expresión de proteínas como la catalasa, ciclopropano-grasoacil-fosfolípido sintetasa y HA/proteasa, las cuales se encuentran en ambos cromosomas. Los genes implicados en quorum sensing, una regulación dependiente de la densidad celular, se encuentran también sobre ambos cromosomas. El conocimiento de la secuencia del genóma de V. cholerae está permitiendo entender, de manera más clara, cómo una bacteria de vida libre emerge como patógeno de enormes consecuencias para los seres humanos.

10. GENES IMPLICADOS EN LA VIRULENCIA DE V. cholerae
El proceso infeccioso causado por V. cholerae es bastante complejo e involucra un gran número de factores; este patógeno se ayuda de ellos para establecerse y colonizar el epitelio intestinal, para lo cual expresa diversos factores de colonización así como varias enterotoxinas potentes. Los genes cuyos productos actúan como factores de virulencia se encuentran formando parte de agrupamientos (clusters). Anteriormente se creía que estos genes formaban parte del cromosoma bacteriano de las cepas toxigénicas, pero hoy se sabe que son parte del genoma de fagos de tipo filamentoso.29,30

55 Vibrio cholerae

FIGURA 3. REPRESENTACIÓN GRÁFICA DEL FAGO CTX

ace cap RS1 RS2 orfU zot

ctxA

ctxB

RS1

La liberación de CTXF, al igual que en otros fagos filamentosos, puede inducirse con luz ultravioleta o con mitomicina C.34 Una característica observada en este fago es que pude insertarse a una secuencia de 18 pb denominada attRS (sitio de ligamiento), presente en el cromosoma de algunas cepas de V. cholerae, o bien no integrarse y comportarse como un plásmido. La parte central (core) se encuentra flanqueada por una o más copias de la región llamada RS; esta es una secuencia de repetidos que se ha dividido en RS1 y RS2 de 2.7 y 2.4 kb, respectivamente. Esta región codifica para un sistema de integración sitio específico, presentando por lo menos 4 MLA. Se ha observado duplicación en tándem del RS y en algunas de todo el elemento CTX. Kimsey y colaboradores35 encontraron que RS1 y RS2 presentan diferencias en sus secuencias, lo que conlleva a diferencias funcionales entre los profagos encontrados en las cepas Clásica y El Tor. En las cepas de V. cholerae O1 del biotipo Clásico hay una copia del profago CTX en cada uno de los dos cromosomas, mientras que en las cepas del biotipo El Tor el profago está arreglado en tándem en los dos cromosomas. En las cepas El Tor el genoma del fago a menudo se encuentra flanqueado por una copia adicional de RS1, la cual contiene genes adicionales a RS2.34,35

13. VPI : CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONES
Para la introducción de CTX en las cepas de V. cholerae es necesaria la presencia de TCP que, como ya se mencionó, es un componente necesario para la colonización intestinal. Recientemente se ha propuesto que TCP también es codificado por un fago filamentoso denominado VPI.30 El fago filamentoso VPI codifica para TCP (figura 4), el cual es un importante factor de virulencia así como receptor del fago CTX. Al igual que CTX , VPI posee ADN de cadena sencilla y positiva, y el genoma de este fago contiene los clusters TCP y ACF, los cuales contienen genes cuyos productos actúan como importantes factores de virulencia.

57 Vibrio cholerae

mas de regulación en V. cholerae conducen a una variación en la expresión de los genes de virulencia optimizando su permanencia en diferentes ambientes tales como el intestino humano y el hábitat marino.

15. EVENTOS INVOLUCRADOS EN LA GENERACIÓN DE CEPAS EPIDÉMICAS
Los mecanismos involucrados en la emergencia de nuevas clonas no han sido explicados, auque se considera que la combinación entre cambios genéticos y la selección natural causada por factores ambientales no identificados, así como el estado inmune de la población, influyen de manera importante en este proceso. Además de determinar la importancia de los factores ambientales dentro de la ecología de V. cholerae, se requiere conocer más con respecto a los mecanismos utilizados por los fagos filamentosos (CTX y VPI ) en la transferencia de genes de virulencia. La existencia de epidemias ocasionadas por V. cholerae O139, de brotes debidos a cepas O37, así como el hallazgo de los genes ctxA, tcpA y toxR en cepas no O1 ambientales, apoya la hipótesis de que la transferencia horizontal de CTX puede presentarse entre cepas O1 ctxA¯ tcpA+ o ctxA+ tcpA¯ y no-O1 ctxA+ or tcpA+, las cuales coexisten en el ambiente acuático.40,41,42 Se ha mencionado que la infección de V. cholerae por CTX, requiere la presencia de TCP, por lo que se propuso un sistema secuencial de dos pasos para la evolución de cepas epidémicas. Lo anterior sugiere que las bacterias inicialmente tienen que adquirir TCP a través de la infección por VPI , para posteriormente ser infectadas por CTX . Se sabe que los cultivos de V. cholerae que contienen al fago en cualquiera de sus formas (lisógenos o plásmidos) producen altos títulos del fago en sus sobrenadantes, por lo que la propagación del CTX puede estar asociada a eventos de transferencia horizontal dando lugar a nuevas cepas toxigénicas.42 Estudios en nuestro laboratorio (datos no publicados) permitieron observar cómo el sobrenadante del cultivo de la cepa epidémica O37 ctxAB+ tcpA+ toxR+ (aislada en Sudan en 1969), expuesto a la luz solar durante varios minutos, liberaba partículas de CTX. Por otro lado, al incubar una cepa O1 El Tor (274080) ctxAB¯ tcpA+ att+ con estos sobrenadantes, se permitió encontrar que se recuperaban lisógenos 2740-80 ctx+. Estos resultados sugieren que cepas de V. cholerae no-O1 ctxA+ pueden ser inducidas naturalmente para liberar viriones CTXΦ, y de la misma manera lisogenizar cepas O1 no toxigénicas. Gracias a este tipo de mecanismos las propiedades de virulencia pueden evolucionar a grandes pasos a través de la transferencia horizontal de grandes bloques de material genético más que a la acumulación de mutaciones de nucleótidos. Estos eventos de transferencia horizontal de genes probablemente se presentan en la naturaleza y es así como contribuyen de manera importante al mantenimiento de las áreas endémicas de cólera.

59 Vibrio cholerae

origen de la cepa que ocasionó el nuevo brote de cólera en América es un misterio rodeado de especulaciones. Se ha propuesto que el microorganismo fue importado por viajeros procedentes de áreas donde el cólera es endémico, pero, por otro lado también se sugiere que la bacteria era un microorganismo de vida libre nativo de las costas de Perú, el cual emergió por efecto de algún factor ambiental como un patógeno infeccioso con alto potencial epidémico. En contraste con lo reportado anteriormente sobre las cepas de Vibrio cholerae O1, las cepas de Vibrio cholerae no-O1 no presentaban importancia médica o epidemiológica ya que se creía que eran responsables únicamente de casos esporádicos de diarrea en humanos. En octubre de 1992 un importante brote de una enfermedad parecida al cólera, causada por un serogrupo de Vibrio cholerae noO1, apareció en India y Bangladesh y rápidamente se diseminó a Pakistán, Nepal, Tailandia, Malasia y China.14,15 Estudios serológicos identificaron a estas cepas con el serogrupo O139 con el sinónimo Bengal (lo que indicó el lugar de aislamiento de las primeras cepas, las ciudades costeras de la bahía de Bengala). Estas cepas producían cantidades similares de toxina colérica a las observadas con V. cholerae O1, por otro lado, también hibridizaban con sondas específicas para los genes ctxA y ctxB y las características clínicas de la enfermedad causada por estas eran indistinguibles del cólera.16,45,46 Ensayos con el método de enzimas multilocus demostraron que diferentes cepas de V. cholerae O139 aisladas en el Sureste Asiático mostraban un perfil electroforético idéntico al del Vibrio cholerae O1 Ogawa biotipo El Tor aislado en México durante la epidemia.47 Resultados similares se obtuvieron al analizar cepas representativas del serogrupo O139, aisladas en diferentes lugares del mundo desde su aparición en 1992, y al compararlas con las de una colección de V. cholerae O1, no-O1 y noO139, aisladas entre 1969 y 1999. Lo anterior permitió sugerir que V. cholerae O139 incluye cepas epidémicas y no epidémicas que evolucionaron de diferentes linajes y derivan de V.cholerae O1 o no-O1 respectivamente. El análisis de 397 aislados de V. cholerae O1, O139 y otros serogrupos no O1, mostró, por un lado, la diversidad genética de la bacteria y por otro la relación genética entre las clonas epidémicas O1 y O139 y serogrupos no O1, así como su estructura poblacional.48 Los resultados mostraron además que las cepas O1 y O139, pandémicas junto con una clona del serogrupo O37 (que en la década de 1960 demostró tener potencial epidémico), conforman un grupo relacionado genéticamente, sugiriendo que estas clonas aparecen por modificación del linaje que ya era epidémico o muy relacionado genéticamente al de las clonas epidémicas. La inferencia, por lo menos en este grupo de cepas, es que la tasa de transferencia horizontal y/o eventos de recombinación de genes del metabolismo básico son suficientemente altas para prevenir el desarrollo y el mantenimiento a largo plazo de alelos distintivos. Aún así los linajes clonales que se observaron pueden persistir durante periodos largos (hasta décadas). Los ejemplos más obvios

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9. Platt, M.R., M.D. Rich y J.C. Mclaughlin. 1995. The role of chitin in the thermoprotection of Vibrio cholerae. Journal of Food Protection 58: 513-514. 10. Chen, D. y P.J. Hanna. 1992. Attachment of Vibrio pathogens to cells of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Journal of Fish Diseases 15:331-333. 11. Enger, O., B. Husevag y J. Goksoyr. 1991. Seasonal variation in presence of Vibrio salmonicida and total bacterial counts in Norwegian fish-farm water. Canadian Journal of Microbiology 37: 618-623. 12. Colwell, R.R. 1996. Global climate and infectious diseases: The cholerae paradigm. Science 274: 2025-2031. 13. Shimada, T., E. Arakawa, K. Itho, T. Okitsu, A. Matsushima, Y. Asai, S. Yamai, T. Nakazato, G.B. Nair, M.J. Albert y Y. Takeda. 1994. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Current Microbiology 28: 175-178. 14. Ramamurthy, T., S. Garg, R. Sharma, S.K. Bhattacharya, G.B. Nair, T. Shimada, T. Takeda, T. Karasawa, H. Kurazano, A. Pal y Y. Takeda. 1993. Emergence of novel strain of Vibrio cholerae with epidemic potential in southerm and eastern India (letter). Lancet 341: 703-704 15. Swerdlow, D. y A. Ries. 1993. Vibrio cholerae non-O1- the eighth pandemic? Lancet 342: 382-3. 16. Berche, P., C. Poyart, E. Abachin, H. Lelievre, J. Vandepitte, A. Dodin y J.M. Fournier. 1994. The novel epidemic strain O139 is closely related to the pandemic strain O1 of Vibrio cholerae. The Journal of Infectious diseases 170: 701-4. 17. Salyers, A. y D. Whitt. 1994 Cholera (Vibrio cholerae). En: A. Salyers y D. Whitt. Bacterial pathogenesis. A molecular approach. American Society for Microbiology, Washington D.C., EE.UU. Pp 141-156. 18. Wachsmuth, K., Ø. Olsvik, G. M. Evins y T. Popovic. 1994. Molecular epidemiology . of cholera. En I. K. Wachsmuth, P. A. Blake y Ø. Olsvik (ed.). Vibrio cholerae and cholera: molecular to global perspectives. American Society for Microbiology, Washington, D.C. Pp. 357-370. 19. Ravel, J., T. Knigt, E.C. Monahan, T.R. Hill, R.R. Colwell. 1995. Temperature induced recovery of Vibrio cholerae from the viable but nonculturable state: growth or resuscitation?. Microbiology 141: 337-83. 20.Davies, D.G., M.R. Parsek, J.P. Pearso, B.H. Iglewski, J.W. Costerton y E.P. Greenberg. 1998. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science 280: 295-8. 21. Elasri, M. y R.V. Miller. 1999. Study of the response of a biofilm bacterial community to UV radiation. Applied Environmental Microbiology 65: 2025-31. 22. Donlan, R.M. y J.W. Costerton. 2002. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical. Microbiology Review 15: 167193. 23. Byrd, J.J., H.S. Xu y R.R Colwell. 1991. Viable but Nonculturable bacteria in drinking water. Applied Environmental Microbiology 57: 875-878.

63 Vibrio cholerae

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65 Vibrio cholerae

LA ECOLOGÍA DE LAS AMIBAS
PATÓGENAS DE VIDA LIBRE EN AMBIENTES ACUÁTICOS
Patricia Bonilla, Elizabeth Ramírez, Ricardo Ortíz y Carlos Eslava

LAS AMIBAS DE VIDA LIBRE (AVL) son protozoos cosmopolitas que habitan ambientes húmedos como el suelo y el agua, aunque también se pueden encontrar en el aire, vehículo que utilizan como medio de dispersión. En los ecosistemas acuáticos desempeñan un papel muy importante en el mantenimiento del flujo de energía y el reciclado de los nutrimentos. Su eficiencia en el uso de los recursos los convierte en un enlace fundamental entre los organismos desintegradores y aquellos pertenecientes a niveles tróficos superiores. A mediados del siglo XX se descubrió que algunas amibas pequeñas del suelo y del agua, que hasta entonces se consideraban inocuas, podían invadir a los seres humanos así como a otros animales, pudiendo causarles la muerte o un daño cerebral irreversible. Debido a su habilidad para vivir como organismos de vida libre y como endoparásitos, a las amibas se les conoce también como organismos anfizoicos. Algunas son patógenas por sí mismas pero también pueden actuar como vectores de bacterias patógenas como Legionella pneumophila y Vibrio spp. Las AVL patógenas son más frecuentes en cuerpos de agua con temperatura por arriba de los 25 ºC y aguas naturales de los trópicos y subtrópicos. A la fecha se han descrito las especies Naegleria fowleri, Balamuthia mandrillaris y algunas del género Acanthamoeba. Naegleria fowleri es capaz de producir en el hombre meningoencefalitis amibiana primaria (MEAP), enfermedad fulminante y mortal. Balamuthia mandrillaris y varias especies del género Acanthamoeba pueden provocar encefalitis amibiana granulomatosa (EAG). Acanthamoeba spp. también puede provocar infecciones severas en pulmón, oídos, nariz y queratitis amibiana (QA) en ojos. En comparación con otras enfermedades causadas por protozoos, las infecciones causadas por AVL destacan por su amplia distribu[67]

67

La ecología de las amibas patógenas

1. INTRODUCCIÓN

ción, extrema virulencia y falta de tratamiento efectivo. El primer caso clínico producido por AVL fue descrito en Australia en 1965 y a partir de entonces se han registrado casos en todo el mundo, lo que demuestra su amplia dispersión y sugiere la posibilidad de que muchos casos hayan pasado inadvertidos por la falta de conocimiento acerca de este grupo de organismos.

2. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
El trofozoíto de Naegleria presenta una forma alargada característica, por lo que se le conoce como amiba limax, mide entre 15 y 25 µm, su locomoción es por medio de lobópodos y se reproduce por fisión nuclear (promitosis). El quiste es esférico, mide de 8 a 12 µm de diámetro, cuenta con una pared doble lisa y con uno o dos poros planos. Las amibas de este género presentan una forma flagelada piriforme, que es fácilmente reversible a la etapa de trofozoíto.1, 2, 3 El trofozoíto de Acanthamoeba es más grande que el de Naegleria (entre 24 y 56 µm), se caracteriza por presentar seudópodos finos llamados acantópodos, se divide por fisión binaria por medio de una mitosis típica. El quiste es ornamentado, mide entre 11 y 25.3 µm de diámetro, presenta una pared doble y poros en la unión del ectoquiste y el endoquiste.1, 2, 3 . El trofozoíto de Balamuthia mandrillaris es el más grande de los tres géneros patógenos, mide entre 12 y 60 µm, tiene forma irregular, algunas veces presenta la forma limax y en otras adopta una forma de araña con seudópodos no ramificados. El quiste mide entre 6 y 30 µm, su pared densa está compuesta por tres capas y no presenta poros.4

68

Microbiología ambiental

ETAPA DE TRANSICIÓN ENTRE AMIBA Y FORMA FLAGELADA CON

FIGURA 1. Naegleria: A) TROFOZOÍTO LIMAX CON LOBÓPODO ANCHO Y UROIDE; B) 2 FLAGELOS Y LOBÓPODO; C) QUISTE CIRCULAR CON DOBLE PARED LISA. CONTRASTE DE FASES. 400 ×.

A

B

C

FIGURA 2. Acanthamoeba: A) TROFOZOÍTO CON ACANTÓPODOS. CONTRASTE DIFERENCIAL DE INTERFERENCIA; B) QUISTE CON ENDOQUISTE ESTRELLADO; C) QUISTE CON ENDOQUISTE POLIGONAL Y D) QUISTE CON ENDOQUISTE SEMICIRCULAR. CONTRASTE DE FASES. 400 ×. a: ACANTÓPODOS: n: NÚCLEO; nu: NUCLÉOLO; pa: PARED; po: PORO; ec: ECTOQUISTE; en: ENDOQUISTE

a n

po

en

ec

nu

A

B
en ec en

po

ec po

C

D

FIGURA 3. Balamuthia: A) TROFOZOÍTO ALARGADO (LIMAX) Y B) QUISTE CON PARED DENSA. CONTRASTE DE FASES. 400 ×. pa: PARED; l: LOBÓPODO; u: UROIDE

u pa 1

A

B

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La ecología de las amibas patógenas

3. HÁBITAT
Como ya se hizo referencia, las AVL presentan en general una distribución cosmopolita y son ubicuas en la naturaleza. Las especies patógenas son termotolerantes, aunque no todas las termotolerantes son patógenas.5 Su hábitat principal es el suelo y desde ahí pueden llegar a los cuerpos de agua arrastradas por escurrimientos o a través del aire.6, 7 En el agua desempeñan un papel fundamental en el flujo energético y en el reciclado de los nutrimentos. Su crecimiento rápido, el uso eficiente de los recursos comparado con formas superiores de vida, así como el hecho de ser un enlace fundamental entre desintegradores y niveles tróficos superiores, los convierten en un eslabón importante en las cadenas alimentarias acuáticas.8 Las AVL se encuentran en mayor proporción en la microcapa superficial, debido a la abundancia de nutrimentos y al establecimiento de quistes aéreos, y se hallan en menor proporción en los sedimentos.9 El análisis por género nos muestra que Naegleria vive principalmente en el suelo y ambientes acuáticos calentados natural o artificialmente,10 aunque también se puede establecer en estanques, cascadas, manantiales, lagos y ríos con temperaturas menores.1, 11 Naegleria se ha aislado de agua de grifo, piscinas, aguas termales, aguas de desecho, canales de riego, tinas de hidroterapia, lagos artificiales y efluentes calientes de plantas termoeléctricas.12, 13 Las especies patógenas se observan con mayor frecuencia en cuerpos de agua con temperaturas por encima de los 30 ºC y aguas naturales de los trópicos y subtrópicos. En países templados y fríos las amibas patógenas proliferan mejor durante los meses más cálidos, lo que lleva a pensar en un patrón estacional.5,1 Algunos investigadores han propuesto que el incremento brusco de temperatura, más que una temperatura elevada constante, es lo que realmente favorece la predominancia de las naeglerias patógenas.14 Los factores ambientales favorables para el desarrollo de este género de amibas son intervalos de temperatura entre 30 °C y 45 °C, niveles óptimos de oxígeno, pH cercano a la neutralidad, alimento suficiente (bacterias y materia orgánica) y un mínimo de humedad; sin embargo, pueden soportar variaciones amplias. En piscinas, la presencia de cloro libre residual en concentraciones de 2 mg L-1 puede inhibir su presencia.2 Acanthamoeba se encuentra distribuida en todos los ambientes,1, 10 y probablemente es la amiba con mayor distribución en la naturaleza, debido a la gran resistencia de sus quistes.15 Como consecuencia de su distribución cosmopolita el contacto con el ser humano es constante y probablemente es la razón de la presencia de anticuerpos de Acanthamoeba y de Naegleria en suero humano.10 Acanthamoeba se ha aislado de diversos tipos de agua: natural superficial (estanques, lagos y ríos), subterránea, marina, de grifo, piscinas, aguas termales, agua

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Microbiología ambiental

mineral embotellada, agua de desecho, canales de riego, tinas de hidroterapia, lagos artificiales, efluentes calientes de plantas termoeléctricas e incluso de agua congelada.13, 11, 16, 17 También se ha aislado de diferentes tipos de suelo, sedimento oceánico, sedimento de lagos, lodos resultantes del tratamiento del agua de desecho, polvo de casas-habitación y de composta.1, 2, 18 De las AVL potencialmente patógenas Acanthamoeba es la única que se ha aislado de muestras de aire extra e intramuros, así como de conductos de aire acondicionado. Se considera que debido a las condiciones extremas en ese ambiente, el aire solo les sirve como medio de dispersión. 1, 6, 18 Dos fuentes de donde aisló Acanthamoeba, el agua de grifo y lentes de contacto, están muy relacionadas con la incidencia de la queratitis amibiana. Algunas especies también se han aislado de recipientes para lavado de ojos.10, 2 Debido a que Balamuthia mandrillaris solo se puede desarrollar en cultivos de tejido y en un medio axénico muy específico, su búsqueda en el ambiente se ha restringido y no se conoce exactamente su hábitat. Se aisló por primera vez de un mandril y posteriormente de pacientes con EAG,4 aunque recientemente se reportó lo que se considera el primer aislamiento ambiental (suelo).19 Por otro lado, se ha demostrado que Acanthamoeba y Naegleria, entre otras AVL, participan como vectores de diferentes especies bacterianas.20 Legionella pneumophila es capaz de multiplicarse dentro de la célula amibiana, causar lisis y liberarse nuevamente en el ambiente. V. cholerae sobrevive dentro de los quistes de Naegleria y puede recuperarse después de que la amiba exquista. En este caso las AVL, ayudan a mantener a V. cholerae en aguas naturales en partes del mundo donde no hay asociación evidente con casos de cólera clínico. También algunas bacterias coliformes y Mycobacterium avium sobreviven dentro de las amibas aunque sin multiplicarse. De esta manera, el quiste amibiano no solo ofrece a las bacterias un mecanismo de protección para evadir ambientes hostiles, sino también les proporciona un medio para transportarse y colonizar nuevos hábitats aprovechando los mecanismos de dispersión de las AVL.

4. CICLO DE VIDA
El ciclo de vida de las AVL (figura 4) comprende una fase activa, llamada trofozoíto y una forma quística en latencia, presentándose además en Naegleria, una forma flagelada.2, 10 Naegleria presenta tres fases en su ciclo de vida: trofozoíto, quiste y flagelado (figuras 1 y 4). La forma de quiste es la fase de resistencia en la cual la amiba se mantiene en latencia y puede resistir largos períodos en condiciones adversas como la desecación, bajas concentraciones de oxígeno, escasez de alimento, etc.2 En los cultivos de laboratorio se ha observado que el quiste de Naegleria es menos resistente que el de Acanthamoeba.

71

La ecología de las amibas patógenas

Microbiología ambiental 72

En el ciclo de vida de Naegleria se destaca su capacidad para cambiar a la forma flagelada, la cual se presenta cuando la amiba se encuentra en un medio sin nutrimentos. En el laboratorio se induce la forma flagelada incubando la amiba en agua destilada o en una solución búffer. En forma transitoria, el organismo no se alimenta ni se divide y después de un tiempo, cuando la amiba encuentra nuevamente un ambiente adecuado, regresa a su forma amibiana.2 Este proceso se realiza en cuestión de minutos; en el laboratorio es posible observar por unos segundos a la amiba presentando al mismo tiempo seudópodos y flagelos (figura 1b). Las diversas especies de Acanthamoeba y la única especie de Balamuthia (B. mandrillaris) presentan solamente dos etapas en su ciclo de vida, la etapa de trofozoíto y la forma quística (figuras 2, 3, 4). La etapa de trofozoíto, igual que Naegleria, es la forma en la que la amiba realiza todas sus funciones. La forma de quiste es la estructura de resistencia, la cual regresa a su forma vegetativa cuando las condiciones son favorables. En el laboratorio se ha observado que el trofozoíto de Acanthamoeba puede permanecer algún tiempo sin enquistarse aunque las condiciones no sean tan favorables y en medio líquido se redondea y presenta prolongaciones citoplasmáticas similares a la forma flotante de otras amibas pequeñas de vida libre (por ejemplo, Vannella y Platyamoeba). El quiste de Acanthamoeba es muy resistente y puede permanecer viable en los cultivos por meses e incluso años; probablemente a esto se debe su amplia distribución y alta incidencia en el ambiente.15

5. LA IMPORTANCIA MÉDICA DE AVL
Naegleria fowleri causa una infección aguda que afecta al sistema nervioso central (SNC) llamada Meningoencefalitis amebiana primaria (MEAP) o naegle) riosis. El mayor número de casos se presenta en niños y jóvenes previamente sanos con antecedente de haber nadado durante el verano en cuerpos de agua naturales contaminados o artificiales inadecuadamente clorados. La ruta de invasión de N. fowleri es a través de la aspiración por las fosas nasales del agua contaminada (figura 4); los trofozoítos invaden la mucosa olfatoria, atraviesan el nervio olfatorio, la lámina cribiforme y llegan al espacio subaracnoideo. Las amibas producen edema y necrosis hemorrágica en el tejido cerebral mediante la producción de hidrolasas lisosomales y fosfolipasas que degradan la mielina y provocan daños graves e irreversibles en el individuo infectado. También se han descrito otras enzimas como aminopeptidasas, hidrolasas, esterasas, fosfatasas ácidas y alcalinas, que directa o indirectamente dañan al SNC.2, 3, 21 La enfermedad se caracteriza por cefalea intensa, fotofobia, fiebre, náusea, vómito en proyectil y rigidez de cuello; coma, convulsiones y finalmente la muerte. La

FIGURA 4. CICLO DE VIDA DE Naegleria fowleri Y Acanthamoeba SPP.

Naegleria fowleri

Acanthamoeba spp.

Aire Trofozoíto Esquistamiento

Agua destilada Forma flagelada Trofozoíto Quiste Polvo ambiental Vía neuroepitelio olfatorio Quiste Queratitis Neumonitis Dermatitis E A G (huésped inmunocomprometido) Quistes todo el año Exquistamiento

EAG subaguda o crónica Dispersión vía sanguínea Úlceras en la piel

Quistes en verano

MEAP

Formas flageladas Trofozoíto

45 °C

Suelo y agua

25-30 °C Traumatismo en córnea Uso de lentes de contacto Soluciones contaminadas polvo-agua

Trozofoito/quiste

Individuos sanos y jóvenes Natación o inhalación Neuroepitelio olfatorio

Queratitis

Individuos inmunocomprometidos Pulmones Cerebro EAG

Cerebro (MEAP)

Fuente: 3.

mayoría de los individuos mueren en la primera o segunda semana después de la manifestación de los primeros síntomas, dependiendo del manejo y resistencia del paciente, así como de la virulencia de las amibas.3

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El diagnóstico se realiza observando preparaciones de líquido cefalorraquídeo (LCR) en vivo o teñidas con Wright, Giemsa o Hematoxilina y Eosina.22 Sin embargo, uno de los principales problemas para identificar a las amibas es que pueden confundirse con macrófagos, células epiteliales o pasar inadvertidas como simples partículas de sedimento del LCR. En las muestras clínicas, el diagnóstico se confirma con el aislamiento de trofozoítos (nunca quistes, ni flagelados) en agar no nutritivo (NNE) con bacterias.15 La MEAP es muy semejante a la meningitis bacteriana y los resultados de laboratorio son muy similares, pero los cultivos para bacterias son negativos. El único fármaco contra N. fowleri es la Anfotericina B, pero solamente es efectivo cuando se administra al inicio de la infección.3 Balamuthia mandrillaris y Acanthamoeba spp son organismos oportunistas capaces de producir encefalitis amibiana granulomatosa (EAG) o acantamoebosis, una enfermedad subaguda o crónica. Se presenta en individuos inmunosuprimidos o inmunodeficientes, como alcohólicos crónicos, embarazadas, VIH positivos, enfermos con SIDA, con lupus eritematoso sistémico o cáncer.3 También se han descrito casos de EAG sin ninguna predisposición. La puerta de entrada al torrente sanguíneo puede ser a través de los pulmones vía neuroepitelio olfativo y lesiones de la piel. Las lesiones que produce Acanthamoeba son granulomatosas, encontrándose en ellas trofozoítos y quistes. Los datos clínicos comparados con los que provoca Naegleria son menos intensos y de un curso más lento. Las principales manifestaciones clínicas son dolor de cabeza, cambios de personalidad, fiebre leve, convulsiones, hemiparesia, nivel deprimido de la conciencia y coma. El cuadro clínico puede confundirse con tuberculosis cerebral, encefalitis viral, cáncer y con un absceso cerebral. El diagnóstico clínico es difícil; de hecho, la mayoría de los casos han sido diagnosticados post mortem. No obstante, es posible realizar un diagnóstico rápido buscando trofozoítos en el LCR o trofozoítos y quistes del tejido cerebral. Acanthamoeba también puede cultivarse en medio NNE con bacterias. En estudios in vitro el ketoconazol y clotrimazol han mostrado cierta efectividad, aunque no se ha confirmado su efectividad en humanos. En casos clínicos se han utilizado con cierto éxito itraconazol, miconazol, sulfametazina, pentamidina y gluconato de cloroexidina.2 Un cuadro muy similar al descrito para Acanthamoeba es producido por B. mandrillaris. Sin embargo, no está claro si Balamuthia se comporta como organismo oportunista o si es un patógeno primario letal, que no depende del estado del hospedero. La información al respecto es escasa y los cuadros observados se han presentado principalmente en individuos inmunocompetentes. B. mandrillaris tiene requerimientos muy especiales para su cultivo. Crece en cultivos de células Vero (riñón de mono verde africano) y en el medio axénico BM.3, 4, 19 Otra infección importante causada por Acanthamoeba spp. es la Queratitis amebiana (QA). Esta es una inflamación crónica en la córnea que puede

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Microbiología ambiental

causar la pérdida del ojo. Las amibas invaden el estroma corneal por una solución de continuidad del epitelio, debido a un traumatismo menor o abrasión de la córnea. Se caracteriza por severo dolor ocular asociado con fotofobia, generalmente unilateral, visión borrosa y congestión de la conjuntiva. Existe un anillo de infiltrado estromal y lesión de la córnea. Los principales factores de riesgo son el uso de lentes de contacto suaves, uso de soluciones salinas caseras, exposición a agua contaminada y traumatismos menores del ojo.3, 23 Otros factores que favorecen el establecimiento de la QA son la producción de lágrimas con baja actividad microbiana y la contaminación bacteriana secundaria. 3, 23 La QA se confunde frecuentemente con queratitis causada por hongos o por Herpes simplex. Se puede realizar un diagnóstico rápido usando un raspado de la córnea y tiñendo el material con Giemsa tricrómica, Wright, Hemacolor y examinando con microscopía óptica de luz. También se puede usar la tinción blanco de Calcofluor y anticuerpos fluorescentes en raspados y secciones de tejido de la córnea.2 Acanthamoeba puede ser cultivada, colocando parte del raspado corneal en medio NNE.23 El tratamiento no es sencillo debido a la resistencia de estos organismos a la mayoría de los fármacos usados contra bacterias, hongos, protozoos y virus. No obstante algunos pacientes han sido tratados con éxito usando ketoconazol, miconazol, isotionato de propamidina y biguamida de poliexametileno.3 El conocimiento de los mecanismos que utilizan las AVL patógenas para evadir la respuesta inmune es muy escaso, no obstante, se sabe que en este proceso participan las células fagocíticas, especialmente los glóbulos blancos, la producción de enzimas que sintetizan células del sistema inmunológico (linfocitos) y la producción de enzimas que destruyen las amibas.3, 21 Por otro lado, se ha demostrado la presencia de anticuerpos en suero humano normal contra Acanthamoeba y Naegleria. Adicionalmente, es posible que la exposición a otro grupo de amibas genere alguna protección contra las AVL patógenas, ya que se ha demostrado que existe reacción cruzada con antígenos de Entamoeba histolytica.24 Prevención. Para evitar la naegleriosis se recomienda la educación al público, difundir el conocimiento entre la comunidad biomédica, la limpieza y la cloración del agua de albercas (concentraciones de cloro libre residual de 1.0 a 2.0 mg L-1 de agua y a 26° C) y el mantenimiento adecuado de abastecimientos públicos de agua. Para prevenir la QA se deben seguir las recomendaciones del fabricante de lentes de contacto y no usarlos durante la práctica de deportes acuáticos. En el caso de la EAG, es más difícil prevenirla debido a que Acanthamoeba es oportunista, por lo que la única recomendación es evitar los factores de riesgo, especialmente si se sabe que se está inmunosuprimido o inmunocomprometido.

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6. EPIDEMIOLOGÍA
Hasta la fecha, a nivel mundial, se tiene conocimiento de 196 casos de MEAP, 125 de EAG por Acanthamoeba, 93 de EAG por B. mandrillaris y más de 1,350 de QA.3, 25 Estas cifras seguramente están subestimadas, ya que en muchos países la realización de autopsias es mínima o no se lleva a cabo y porque el médico general y el personal de laboratorio no están entrenados para diferenciar una meningoencefalitis viral o bacteriana de una infección por AVL. Aunque las infecciones producidas por las AVL son consideradas raras, se han registrado casos en diferentes partes. La mayoría procede de países desarrollados como Australia, Estados Unidos de América y Gran Bretaña.3, 7 En México se han registrado en total 29 casos de MEAP: 23 en Mexicali, B. C., tres en Sonora; uno en Monterrey, N. L., uno en Huetámo, Mich. y uno en de Tamaulipas. De 12 casos de EAG causados por B. mandrillaris, cuatro son del Distrito Federal, cuatro de Jalisco, dos de Guanajauato, uno del Edo. de México y uno de Puebla.25 Existe registro de un caso de EAG por Acanthamoeba spp., que sobrevivió.26 Otro de una infección cerebral mixta que involucró a Acanthamoeba sp. y Aspergillus sp.27 y tres casos de QA por Acanthamoeba.23 Además, se han detectado Naegleria, Acanthamoeba y Hartmannella en pacientes asintomáticos; N. lovaniensis no patógena en un infante; en pacientes con quemaduras infectadas y rinitis;13 Hartmannella asociada a un caso de meningoencefalitis28 y amibas de la familia Leptomyxidae vinculada a un caso de anemia aplástica grave.29 El impacto de las infecciones causadas por las AVL en la salud humana no debería subestimarse, no solo por su potencial patógeno, sino también porque pueden interactuar con especies bacterianas y por su capacidad para servir como vectores para otros patógenos humanos.

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Microbiología ambiental

7. CARACTERIZACIÓN DE LAS AMIBAS DE VIDA LIBRE
Cultivo monoxénico. Las muestras de agua o LCR colectadas se centrifugan a 2,500 rpm durante 10 min. El concentrado se distribuye en medio NNE.15 La observación de las placas de NNE se realiza en un microscopio invertido a 10x y 20x para verificar el crecimiento amibiano. En las placas con amibas se marca la zona de mayor abundancia y se corta un trozo de agar de aproximadamente un cm2, y se transfiere a otra placa con medio NNE fresco y se incuba a la temperatura a la cual fue aislada durante 48 horas. Cultivo axénico. De los cultivos monoxénicos se selecciona una zona con crecimiento amibiano en estado de trofozoíto y se transfieren trozos de agar a los medios PBSGM30 y BC5 y se incuban a 30 º C.

Después de obtener cultivos axénicos, se realiza la identificación morfológica, la prueba de patogenicidad en ratones, análisis de isoenzimas30 y/o técnicas inmunológicas.22 Identificación morfológica. Se realizan preparaciones in vivo de cultivos axénicos de los trofozoítos y quistes en diferentes fases de maduración y usando las claves taxonómicas de Pussard y Pons31 y Page.15 Tolerancia a la temperatura. Esta prueba se realiza para determinar la temperatura máxima y óptima de las amibas, ya que se ha demostrado que las AVL patógenas son termotolerantes. Los aislamientos se siembran por cuadriplicado en medio axénico o monoxénico y se incuban a temperatura ambiente, 37 °C, 42 °C y 45 °C. Se observan durante una semana para verificar la temperatura óptima de crecimiento. Prueba de patogenicidad. La prueba se lleva a cabo por vía intracerebral (IC) y por instilación nasal (IN) en grupos de ratones machos, de tres semanas de edad a partir de cultivos axénicos.32 Los trofozoítos en crecimiento exponencial, se ajustan a una cuenta de 1x104 – 1x106 por ml. De este concentrado se inoculan 0.02 ml a través de la articulación interparietal. Para la IN, se aplica la misma dosis a través de los orificios nasales y como control, se inocula un grupo de ratones con medio de cultivo sin amibas. Y se mantienen bajo observación 21 días. A los animales que mueren durante dicho período, se les extrae el cerebro, el hígado, los pulmones y los riñones, y se colocan en placas con medio NNE y para incubarlos 30º C durante 24 - 48 h. Los animales que sobreviven los 21 días y el grupo control se sacrifican y se sigue el mismo procedimiento que los anteriores. Técnicas inmunológicas. Las pruebas serológicas no han sido útiles en el diagnóstico de N. fowleri, debido a que la mayoría de los pacientes mueren demasiado rápido para producir anticuerpos y las infecciones por Acanthamoeba generalmente se han diagnosticado post mortem usando técnicas de inmunofluorescencia indirecta y de inmunoperoxidasa.22 Análisis de isoenzimas y proteínas totales. Para realizar este análisis se usa la técnica de isoelectroenfoque (IEF), que consiste en la separación de los componentes de una enzima, presentes en el extracto crudo de cada amiba, sobre un sustrato de agarosa con un anfolito. El análisis se lleva a cabo por comparación de los zimogramas de las amibas a identificar contra cepas de referencia.33 Identificación por el ADN. En los últimos años se han desarrollado diferentes métodos moleculares como la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR (por sus siglas en inglés). Ésta es una herramienta muy útil, rápida y precisa, siempre y cuando se haya descrito previamente la secuencia específica del organismo a determinar. En el caso de las AVL, se ha utilizado principalmente para identificar amibas patógenas de muestras clínicas y muy pocos trabajos se han enfocado a muestras ambientales.34, 35 En el caso de agua, recientemente se ha implementado la técnica de PCR para identificar Acanthamoeba en este ambiente.36 Las muestras de

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agua se filtran con una membrana Millipore. La membrana se coloca en un tubo estéril y se adiciona solución SET (sacarosa EDTA), se resuspende, se retira la membrana y se congela la suspensión a -20° C, hasta que se realiza la extracción del ADN mediante los métodos descritos por Vodkin et al.34, 35, 37

8. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
El interés en las AVL se ha incrementado en los últimos años, sin embargo, la mayor parte de los estudios se han enfocado principalmente al grupo de las especies patógenas para el hombre. El estudio de las AVL (patógenas y no patógenas) desde el punto de vista ecológico es sumamente escaso, ya que aunque se conoce de manera general su distribución en el ambiente y las condiciones ambientales que las pueden afectar, es necesario realizar más estudios para identificar aspectos detallados de su relación con los factores bióticos y abióticos en el ambiente. La carencia de formas fijas en su morfología causa confusión en el estudio de estos protozoos, por lo que se ha recurrido al uso de técnicas y herramientas específicas como la microscopía electrónica y de barrido, así como de técnicas inmunoenzimáticas, entre otras. La aplicación de técnicas de biología molecular en el estudio de las AVL ha permitido identificar nuevas especies relacionadas con los géneros Naegleria y Acanthamoeba, así como identificar nuevas especies patógenas para el ser humano. Las preguntas que surgen a este respecto son ¿las nuevas amibas detectadas son nuevas especies o solo variedades?, ¿cuál va a ser el límite para determinar si cada amiba aislada es una nueva especie? En el aspecto epidemiológico hay todavía preguntas que resolver: por ejemplo, ¿por qué a pesar de la amplia distribución de estas amibas en el ambiente y su constante contacto con los seres humanos, el número de casos es relativamente bajo, si se compara con otros organismos patógenos? y ¿el contacto con amibas no patógenas o con amibas de baja virulencia confieren a los humanos cierta inmunidad? Otro problema importante que se tiene que resolver es la carencia de fármacos eficientes para tratar las infecciones producidas por este grupo de amibas, especialmente en el caso de la EAG, causada por algunas especies de Acanthamoeba y la especie Balamuthia mandrillaris.

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Microbiología ambiental

9. BIBLIOGRAFÍA
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Microbiología ambiental

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La ecología de las amibas patógenas

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Microbiología ambiental

CIANOBACTERIAS,

MICROORGANISMOS

DEL FITOPLANCTON Y SU RELACIÓN CON LA SALUD HUMANA
Pedro Ramírez, Evaristo Martínez , María Dolores Martínez y Carlos Eslava

1. INTRODUCCIÓN
experimentan actualmente la denominada eutrofización antrópica (como resultado de la actividad humana) por el aumento poblacional la urbanización, la agricultura, la minería y el aporte de aguas residuales y desechos de la industria alimentaria. Uno de los fenómenos más frecuentes en los lagos y reservorios eutróficos es la presencia en muchas partes del mundo, de cambios evidentes relacionados con el aspecto y la calidad del agua. Tales alteraciones están asociadas principalmente con una alta concentración de nutrimentos, como el fósforo y el nitrógeno. Los microorganismos fotosintéticos que pueblan todas las aguas del planeta y que son el inicio de la cadena alimentaria se conocen como fitoplancton. Entre los más antiguos identificados en estos ambientes se encuentran las cianobacterias que forman grandes colonias, principalmente en cuerpos de agua con altos niveles tróficos. Las cianobacterias son consideradas una liga entre los procariotes y los eucariotes fotosintéticos con la capacidad de sintetizar clorofila. Como característica particular se ha identificado su habilidad para sintetizar los pigmentos ficobilina y ficocianina, que en altas concentraciones, les confiere el color característico que ha dado lugar a la denominación de algas azulverde o cianobacterias. Estos organismos tienen una larga historia evolutiva, por lo que la mayoría de geólogos y geoquímicos están de acuerdo en que su origen se extiende 3,500 millones de años en la era Proterozoica (2,500 a 570 mA), conocida también como era de las cianobacterias.1 Las cianobacterias se aprecian a simple vista como manchas incrustadas sobre la superficie húmeda de las rocas, del suelo o de los árboles; pueden ser de color verde azuladas, pardas o negras y presentarse en forma de almohadillas macroscópicas o en capas viscosas. También pueden vivir flotando libremente
DE AGUA

MUCHOS CUERPOS

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Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton

(planctónicas) en cualquier tipo de medio acuático.2 Son organismos móviles, Gram-negativos,3 cuya velocidad y dirección de movimiento dependen de la iluminación y de la temperatura en la que se encuentren. A pesar de que presentan características de una bacteria Gram-negativa, poseen una capa de peptidoglucanos más gruesa y componentes no comunes en dicho grupo.4 Las cianobacterias muestran una amplia diversidad morfológica, ya que pueden, ser unicelulares (Chroococcus) o filamentosas; éstas últimas, en ocasiones presentan ramificaciones (Anabaena). Pueden aparecer aisladas o agrupadas en colonias (Schizothrix) y cuando las colonias se agrupan pueden observarse como manchas o puntos cafés en las rocas sumergidas (C. fuscus). La estructura colonial se mantiene por un exo-polisacárido que se aprecia como un mucílago o una vaina firme. Otra de las estructuras presentes en las cianobacterias son las vacuolas de gas que les ayudan a la flotación y que se encuentran en especies de muy diferentes géneros (Anabaena). Todas las especies que forman filamentos verdaderos presentan hormogonias, definidas en 1959 por Desikachary,5 como cadenas cortas y móviles. Sin embargo, no todas las hormogonias caen exactamente dentro de esta definición; esencialmente son filamentos modificados relacionados con la reproducción y la dispersión del microorganismo, con altos niveles de nitrógeno, fósforo y otros nutrimentos. Las colonias de algunos géneros (Rivularia) están constituidas por la agregación de numerosas hormogonias, mientras que otras (Nostoc) se originan de una hormogonia simple. Las interacciones simbióticas entre las cianobacterias y otros organismos son diversas. Muchas cianobacterias simbiontes comparten características que incluyen la formación de hormogonias, que a menudo actúan como agente infectivo. Algunas plantas producen señales químicas que inducen a la cianobacteria a formar hormogonias o como quimio-atrayente para guiar a la hormogonia al interior de la planta. Un gran número de cianobacterias, capaces de fijar nitrógeno atmosférico cuando el ambiente está muy oxigenado, presentan heterocistos,6 células con una pared celular delgada y generalmente con un nódulo de cianoficina, polímero de dos aminoácidos situados en uno o en ambos lados de la célula. La presencia o ausencia de heterocistos es una característica importante para diferenciar entre géneros. Cuando los lagos se tornan eutróficos, la diversidad del fitoplancton disminuye, lo que conduce a que las prevalezcan cianobacterias. Diferentes factores ambientales favorecen el predominio de estas últmas, las temperaturas elevadas (18 y 20 ºC), las condiciones de luz-energía (óptimas de la primavera al otoño), la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, un pH alto (6.5 a 8.5), una baja tasa de filtración por el zooplancton y la formación de vesículas de gas.7 Aunque la diversidad y abundancia de las cianobacterias son mayores a valores altos de pH existen excepciones al respecto, tal es el caso de las picocianobacterias planctó-

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Microbiología ambiental

FIGURA 1. FILAMENTOS DE Anabaena SP.
MODIFICADAS GENÉTICAMENTE PARA QUE LOS HETEROCITOS EXPRESEN UNA PROTEÍNA FLUORESCENTE

FIGURA 2. Anabena SP. UTCC-426

Foto: Mary Olaveson.

Foto: Dr. Bill Buikema, Universidad de Chicago, EE.UU.

nicas (< 2 µm de diámetro) y las cianobacterias filamentosas ramificadas que se desarrollan a pH por debajo de 4.5 y 4, respectivamente. El florecimiento se describe como el incremento, significativamente mayor al promedio, en la biomasa del fitoplancton. El florecimiento de las poblaciones de cianobacterias se ha estudiado ampliamente ya que representa un problema para los cuerpos de agua de uso doméstico, industrial y de recreo, debido principalmente al incremento en la producción de metabolitos tóxicos, los cuales tienen un efecto letal sobre los diversos organismos habitantes de dichos cuerpos.8 El que estos florecimientos generen sustancias tóxicas plantea su importancia como un problema ambiental con repercusiones sobre la salud. A pesar de que se ha generado una gran cantidad de información sobre las toxinas producidas por cianobacterias, no es fácil predecir su toxicidad durante cada florecimiento particular; sin embargo, su detección oportuna permite minimizar su efecto.9 Los florecimientos pueden ser superficiales ("florecimientos de agua") y están restringidos a aquellos organismos que pueden flotar o que presentan movilidad.10 Algunas especies que no pertenecen a las cianobacterias, como Botryococcus braunii, también pueden dar lugar a florecimientos debido a la producción o almacenamiento de aceites, así como algunos flagelados como Euglena. Los florecimientos generalmente están relacionados con una o dos especies y se identifican por el tipo de

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Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton

FIGURA 3. ASPECTO QUE PRESENTAN LOS FLORECIMIENTOS (BLOOMS)
DE CIANOBACTERIAS EN LOS CUERPOS DE AGUA EUTROFIZADOS

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Microbiología ambiental

fitoplancton dominante. De esta manera se tienen florecimientos de cianobacterias, de diatomeas o de Anabaena. Las toxinas pueden ser dañinas dependiendo de su concentración y su capacidad para originar efectos agudos y crónicos en el hombre, en animales y en vegetales. Skulberg et al.11 describen cerca de 40 especies toxigénicas de cianobacterias basándose en una taxonomía morfológica. La mayoría de las especies y cepas toxigénicas pertenecen a géneros filamentosos multicelulares: Anabaena, Oscillatoria, Nostoc, Aphanizomenon y Cylindrospermopsi.12, 13 Otras especies producen compuestos citotóxicos que aunque no son tóxicos para mamíferos, sí lo son para aves y peces, algas, bacterias y virus o bien tienen un efecto sobre las células tumorales de mamíferos, lo que ha permitido su empleo como antibióticos o anticarcinógenos. De las especies de cianobacterias unicelulares Microcystis causa la mayoría de los problemas de toxicidad, probablemente por ser la más cosmopolita de las cianobacterias. Esto es particularmente evidente durante el verano cuando Microcystis domina la sucesión anual de cianobacterias. Se considera que existe un florecimiento en el agua para uso potable o recreativo, cuando las concentraciones celulares calculadas están en niveles de

MICROFOTOGRAFÍAS DE LUC BRIENT, RENNES, FRANCIA

Anabaena sp.

Microcystis wesenbergii

Correo-e de Luc de Brient: luc.brient@univ-rennes1.fr.

20,000 células ml-1, lo que corresponde a 10mg m-3 de clorofila-a. La aparición de este fenómeno depende tanto de las condiciones ambientales como de los requerimientos específicos del organismo. 14,15 Los florecimientos de cianobacterias tienen un registro histórico reciente,10 y han adquirido importancia por su impacto económico. La preocupación por los efectos de las cianobacterias en aguas continentales, principalmente por repercusión sobre la calidad de la misma, se intensificó en las décadas de 1980 y 1990 debido a la información acumulada sobre la potencia de sus toxinas.16, 17, 18, 19, 20 Desde hace tiempo se tiene conocimiento de la presencia de toxinas cianobacterianas, pero éstas sólo se habían asociado con la muerte de animales domésticos.21 Recientemente, en Brasil la muerte de 88 personas y el daño renal en 50 pacientes que requirieron hemodiálisis, se asoció con la presencia de cianotoxinas en el agua de consumo.22, 23 Lo anterior apoya el efecto dañino de estas toxinas y plantea la necesidad de reevaluar si su presencia en las fuentes de abastecimiento de agua para consumo humano constituye un peligro para la salud, y si además son un factor de riesgo para animales silvestres y/o domésticos que puedan estar en contacto con este tipo de aguas.24 Aunque no todos los florecimientos de cianobacterias son tóxicos, cuando estos se relacionan con la producción de toxinas su repercusión es alarmante, como se ha reportado en diferentes países (cuadro 1).

87

Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton

CUADRO 1. PORCENTAJE DE TOXICIDAD POR FLORECIMIENTOS
DE CIANOBACTERIAS EN DIFERENTES PAÍSES

PAÍS

NÚMERO
DE SITIOS

TOXICIDAD

REFERENCIA

Inglaterra Escandinavia Finlandia Mar Báltico
EE.UU.

Microbiología ambiental

Países Bajos Países Bajos Hungría Alemania (Ex RDA) Alemania 1995-96 Dinamarca Fuente: 25.

78 51 188 25 102 10 29 35 6 80 96

70% 59% 44% 72% 27% 90% 79% 82% 67% 90% 72%

Reporte NRA 1990 Cood y cols. 1989 Sivoen y cols. 1990 Sivoen y cols. 1989Wisconsin, Rapavich y cols. 1990 Leeuwang y cols. 1983 RIZA 1994 Törökné-Kozma y Gábor 1988 Henning y Khol 1981 Fastner y cols. 1998 Henriksen 1997

2. FACTORES INVOLUCRADOS EN LA PRODUCCIÓN DE TOXINAS POR
CIANOBACTERIAS DURANTE LOS FLORECIMIENTOS En las últimas décadas se ha presentado un incremento aparente en la ocurrencia de florecimientos de cianobacterias, lo que aunado a la posible presencia de cepas productoras de toxinas, ha dado lugar a que se estudien los posibles factores ambientales que favorecen la presencia y el incremento de las cianobacterias. Aunque éstas generalmente son comunes en los diferentes sistemas acuáticos, presentan diferencias en la densidad de células, composición de especies, distribución vertical y longevidad de la población, dependiendo del tipo de sistema. Lo anterior se puede explicar por el grado de estratificación y mezclado, así como por la disponibilidad de nutrimentos y de luz que prevalecen en cada sitio, características determinadas por las condiciones climáticas de cada región. El tamaño y profundidad de las cuencas lacustres se han modificado en tamaño y profundidad durante miles de años, como resultado de eventos climáticos y geológicos y por los mismos procesos biológicos. El "envejecimiento" o eutrofización es el resultado del incremento en los nutrimentos y la acti-

88

vidad biológica (productividad), así como de la acumulación de sedimentos y materia orgánica que arrastran las corrientes de agua que llenan la cuenca de un lago. La progresión natural en los lagos es unidireccional y va de la oligotrofia (pobreza en nutrimentos) a la eutrofia (riqueza en nutrimentos y por lo tanto alta productividad). La eutrofización cultural (producida por la actividad humana) se ha convertido en un factor significativo en el envejecimiento de los cuerpos de agua en el mundo. El término hipereutrófico surge como resultado del efecto de las actividades humanas sobre los cuerpos de agua.26 La información obtenida de diversas áreas geográficas muestra que la eutrofización cultural, tanto en aguas continentales como marinas, es originada por las descargas domésticas, industriales y aguas de retorno agrícola. Las algas y las macrofitas se utilizan frecuentemente como indicadores de la eutrofización de los cuerpos de agua. Se llevan a cabo análisis cualitativos y cuantitativos así como medición de su biomasa mediante la determinación de la concentración de la clorofila, cuyos valores se han estimado de acuerdo con las condiciones tróficas de un cuerpo de agua, por lo que se considera que en un lago oligotrófico van de 1.5 a 10.5 µg L-1 mientras en un lago eutrófico pueden llegar hasta 300 µg L-1.27 El incremento en la biomasa, además de ocasionar problemas estéticos como la presencia de espumas y olores desagradables, también altera el sabor del agua potabilizada para el suministro humano. El proceso de descomposición de los florecimientos acuáticos causa desoxigenación alterando la química del agua, cambios que influyen en la supervivencia de los animales acuáticos. La producción de metabolitos secundarios bioactivos, como las hepatotoxinas y las neurotoxinas, representan un riesgo para la salud humana.28 Las toxinas son péptidos cíclicos que incluyen potentes alcaloides neurotóxicos (que se dividen en dos grandes grupos: anatoxina y saxitoxina) y hepatotóxicos (microcistinas, nodularinas y cilindrospermopsina). Las microcistinas son producidas tanto por cianobacterias filamentosas (Anabaena, Oscillatoria, Nostoc, Hapalosiphon) como coloniales (Microcystis). Los géneros Anabaena y Oscillatoria producen anatoxina, que actúa como un bloqueador neuromuscular. También producen dos tipos de anatoxina: anatoxina-a y anatoxina-a(s), que no están estructuralmente relacionadas y presentan diferentes efectos fisiológicos, la segunda de éstas es un compuesto organofosforado producido por el género Anabaena, el único que se conoce en estado natural. La estructura química de este compuesto es similar a la que tienen los insecticidas sintéticos como el paratión-malatión, y al igual que éste, bloquea la actividad de la acetilcolinesterasa.17

89

Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton

3. COMPORTAMIENTO DE Microcystis PRODUCTORA DE
MICROCISTINA EN EL AMBIENTE Microcystis se encuentra comúnmente en cuerpos de agua eutróficos e hipereutróficos y puede constituir el fitoplancton dominante; a menudo, dependiendo de las condiciones climáticas, puede estar presente durante todo el año. La microcistina se identificó inicialmente en el género Microcystis y a la fecha se han descrito aproximadamente 50 tipos de esta toxina relacionados en su mayoría con casos de envenenamiento humano y animal. Aunque Microcystis únicamente produce microcistina, ésta siempre es toxigénica, a diferencia de otras cianobacterias planctónicas que pueden producir tanto microcistina como anatoxina, como en el caso de Anabaena y Oscillatoria o microcistina y citotoxina producidas por Hapalosiphon. Rinehart et al. 29 refieren la existencia de al menos 47 variedades de microcistinas, 32 se identificaron en florecimientos de Microcystis en agua y en algunos aislados de laboratorio. Con respecto a las otras microcistinas, ocho se identificaron en Anabaena, seis en Nostoc y una en Oscillatoria. A excepción de la microcistina-HtyR, las microcistinas producidas por géneros diferentes a Microcystis contienen modificaciones en los aminoácidos dos y cuatro, sitio donde se encontraron la mayoría de los cambios. La toxicidad de las microcistinas se ha evaluado mediante bioensayos en modelos animales y por una prueba de inhibición de la actividad de la fosfatasa 1 o 2A. La dosis letal media (LD50) de la microcistina administrada por vía intraperitoneal en ratones es de 50 a 100 µg kg-1.30

90

Microbiología ambiental

4. EFECTO DE LAS MICROCISTINAS SOBRE LA SALUD ANIMAL
Aunque la mayoría de los envenenamientos por microcistinas se presentan en animales terrestres después de ingerir agua de suministros infestados con cianobacterias, los animales marinos, y particularmente los peces en cultivo, también pueden verse afectados.31 La muerte por microcistinas se presenta como consecuencia de un shock hipovolémico secundario o hemorragia del hígado. El estudio post mortem muestra incremento en el peso del hígado y en la concentración de hemoglobina hepática y de hierro. En los animales que no mueren rápidamente se observa hipercalemia y/o hipoglucemia, insuficiencia hepática y la muerte en pocos días. En el envenenamiento por microcistina, uno de los primeros efectos (15 a 30 minutos.) es la elevación en la concentración de ácidos biliares, fostafasa alcalina, gama-glutamil-transferasa y la aspartato amino-transferasa. La cuenta

de glóbulos blancos se incrementa (leucocitosis), se activan factores que promueven la formación de coágulos y puede presentarse diarrea acuosa y/o con sangre. La muerte puede darse en un lapso de algunas horas (4 a 24 h) o días, dependiendo del individuo afectado y generalmente es precedida por una respuesta neuro-muscular.

5. EFECTOS EN LA SALUD HUMANA
La información con respecto al daño en humanos ocasionado por microcistinas es escasa. 32,33 Las principales fuentes de exposición son lagos y ríos durante su uso recreativo (ruta oral o dérmica) y el consumo de agua potable y tabletas alimenticias de concentrados de algas (ruta oral). Una ruta de exposición de menor importancia la constituyen las regaderas durante el baño (inhalación). En países como Estados Unidos y Canadá el periodo de exposición durante el año es menor ya que el crecimiento de los florecimientos de algas son más cortos (3 a 5 meses), comparado con el de países con climas cálidos como Australia o Sudáfrica (6 a 10 meses). Los síntomas observados en las personas que sufren intoxicación por microcistinas incluyen irritación de piel y ojos, síntomas parecidos a los producidos por la fiebre del heno, disnea, fatiga y gastroenteritis aguda. La toxicidad letal en humanos no se presenta con mucha frecuencia, principalmente porque los diferentes procesos de tratamiento en los suministros de agua contribuyen a disminuir el número de cianobacterias tóxicas y por ende la concentración de toxinas. Sin embargo, en ocasiones los florecimientos presentan niveles de microcistina mayores a 1 mg g-1 de células, lo que muestra el efecto que pueden llegar a tener las cianobacterias en la salud del ser humano y de otros animales. Reportes en Estados Unidos y Australia señalan la presencia de casos al ingerir agua proveniente del suministro municipal. Esto se produjo al pretender eliminar con sulfato de cobre las células durante un florecimiento, lo que suscitó la liberación de altos niveles de toxinas hacia el sistema de distribución, ocasionando la intoxicación de varios individuos. Solo en casos como el antes referido se podría alcanzar una dosis letal para los humanos. En estos y otros casos de ingestión accidental los síntomas reportados incluyen dolor abdominal, náusea, vómito, diarrea, dolor faríngeo, tos seca, dolor de cabeza, úlceras en la boca, neumonía atípica y elevación de las enzimas hepáticas en el suero (especialmente en la gama-glutamil transferasa). Otro aspecto importante en relación con las cianotoxinas es el efecto cancerígeno de las microcistinas y nodularinas debido al efecto de inhibición de las proteín-fosfatasas. Este factor adicional de riesgo (promoción de tumores), se ha determinado mediante las observaciones hechas en animales expuestos

91

Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton

y a datos toxicológicos y químicos. Aunque no han sido determinados los niveles de toxinas que ocasionen efectos adversos, algunos países han propuesto concentraciones que pueden considerarse como aceptables, para evitar riesgos a la salud. En 1994, Falconer et al.34 utilizaron diferentes procedimientos para establecer que 1.0 µg l-1 es la concentración máxima de microcistina o nodularina aceptable para prevenir la inducción de tumores. Dicha concentración de toxina corresponde a 5,000 células de Mycrocistis ml-1, determinada en experimentos con cerdos. Un estudio similar en Canadá reportó 0.5 µg L-1 para microcistinaLR (la más común de las microcistinas encontradas en suministros de agua), o 1 µg l-1 del total de microcistinas en agua potable. Este valor es el que actualmente considera la Organización Mundial de la Salud (OMS) como valor guía a nivel internacional.35

Microbiología ambiental 92

6. ESTRUCTURA QUÍMICA Y CARACTERÍSTICAS
Bishop et al.36 realizaron el primer reporte de una hepatotoxina de la cepa NRC1 de Microcystis aeruginosa identificada como un péptido. Esta toxina fue denominada microcistina por Konst et al.37 y Carmichael et al.38 Posteriormente se realizaron otros aislamientos de microcistinas a partir de la misma cepa,39, 40 y de florecimientos de M. aeruginosa en Sudáfrica41 y en Australia.42 Botes et al.43 aislaron varias microcistinas de cepas de M. aeruginosa en Sudáfrica y fueron los primeros en determinar la estructura de una de ellas (denominada cómo cianoginosina) en 1984; al siguiente año el mismo grupo publicó la estructura de las demás toxinas (figura 1). Una vez que se determinó la estructura básica, aparecieron rápidamente muchos reportes de microcistinas, a la fecha se han aislado más de 50 microcistinas (cuadro 2).

7. RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y TOXICIDAD
La relación entre las modificaciones estructurales y la hepatotoxicidad de las microcistinas se estableció por observaciones en diferentes investigaciones.43,47,48,49 en las cuales se encontró que existen modificaciones en diferentes sitios de la molécula de microcistina (cuadro 3), como es el caso de dos Laminoácidos variables; grupos Metil en Mdha y/o β-Me-Asp; Adda; Glu y Mdha.

FIGURA 1. ESTRUCTURA DE CINCO MICROCISTINAS
Esterificado CO3 o H Glu (Iso) H OH2 OAc 18 Isómeros geométricos H 8 9 7 HN 11 H3C 1 O H 2 H 3 4 NH 5 H H R2 O CH2 o H CO2H R4 N O O NH H R3 H3C H H N R1 O CH2

^

^
Hidratado (Ser) Ala

15

Adda

H CO2H β-Me-Asp (Iso)

Fuente: 44.

FIGURA 2. TOXINA DE CIANOBACTERIA (Microcystis), FOSFATASA-1/-2A INHIBIDOR, NMR MOLÉCULA: MICROCISTINA-LR

Fuente: 46.

93

Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton

^

H 10

OCH3

6

^
^

Mdha

^

CUADRO 2. VARIACIONES ESTRUCTURALES DE MICROCISTINAS
AISLADAS Y SUS PESOS MOLECULARES

R1 Microcistina LA Microcistina LR Microcistina YR Microcistina RR Microcistina YM Microcistina YA Microcistina LY Microcistina FR Microcistina Laba Microcistina HtyR Microcistina AR Microcistina M(O)R Microcistina WR 3-desmetilmicrocistina LR 7-desmetilmicrocistina LR 3,7-didesmetilmicrocistina LR 3-desmetilmicrocistina YR 7-desmetilmicrocistina YR 3-desmetilmicrocistina RR 7-desmetilmicrocistina RR 3,7-didesmetilmicrocistina RR 3-desmetilmicrocistina HtyR 7-desmetilmicrocistina HtyR 3,7-didesmetilmicrocistina HtyR 7-desmetilmicrocistina HphR (Mser7)microcistina LR (Ser7)microcistina LR (Ser7)microcistina RR (Ser7)microcistina HtyR [Ser7)3-desmethytmicrocistina XR (DMAdda) microcistina LR (ADMAdda) microcistina LR (ADMAdda)3desmetilmicrocistina LR (ADMAdda) microcistina LHar (ADMAdda,Mser7) microcistina LR D-Glu(CH30)estermicrocistina LR D-Glu(CH3O)ester 3desmetilmicrocistina LR Leu Leu Tir Arg Tir Tir Leu Fe Leu Hty Ala Met(O) Tir Leu Leu Leu Tir Tir Arg Arg Arg Hty Hty Hty Hph Leu Leu Arg Hty X Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

R2 Ala Arg Arg Arg Met Ala Tir Arg Aba Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Har Arg Arg Arg

R3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 H H CH3 H CH3 H H CH3 H CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 CH3 H CH3 CH3 CH3 H

R4 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H H CH3 H CH3 H H CH3 H H H CH3 H H H H CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

R5 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H COCH3 COCH3 COCH3 COCH3 CH3 CH3

PM

909 994 1044 1037 1019 959 1001 1028 923 1058 953 1028 1067 980 980 966 1030 1030 1023 1023 1009 1044 1044 1030 1028 1012 998 1041 1062 998 980 1022 1008 1036 1040 1008 994
(Continúa)

94

Microbiología ambiental

CUADRO 2. VARIACIONES ESTRUCTURALES DE MICROCISTINAS
AISLADAS Y SUS PESOS MOLECULARES

R1 D-Glu(C3H7O2)ester microcistina LR Toxin#3 (D-Ser1,ADMAdda) microcistina LR Leu Leu

R2 Arg Arg

R3 CH3 CH3

R4 CH3 CH3

R5 CH3 COCH3

PM

1052 1014 1038

Fuente: 45.
Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton 95

CUADRO 3. RELACIÓN ENTRE LA ESTRUCTURA Y HEPATOTOXICIDAD DE MICROCISTINAS

LD50 (µG KG-1 INTRAPERITONEAL EN RATÓN) L-AMINOÁCIDOS (R1, R2) Microcistina-LR, microcistina-YR, microcistina-LA Microcistina-WR Microcistina-RR, microcistina-M(O)R G RUPOS METIL EN MDHA Y/O -ME-ASP 3-desmetilmicrocistina-LR (-RR) 7-desmetilmicrocistina-LR (-RR) 3, 7-didesmetilmicrocistina-LR ADDA O-demetil-Adda-microcistina-LR O-acetil-O-demetil-Adda-microcistina-LR 6(Z)-Adda microcistina-LR (RR) ESTER D-Glu(C3H7O) ester microcistina-LR D-Glu (CH3O) ester microcistina-LR MDHA Dihidromicrocistina-LR microcistina-LR-GSH Fuente: 45.

<100 100-400 400-800

100-400 100-400 100-400

<100 <100 >800

>800 >800

100-400 400-800

8. ESTABILIDAD
Las microcistinas son heptapéptidos cíclicos muy estables y resistentes a la hidrólisis enzimática, y su vida media es de alrededor de tres semanas en solución a pH 1 y 40 °C. Para degradarlas completamente se requiere un tratamiento a reflujo con ácido 6N-hidroxiclórico y ácido trifluroacético. Sin embargo, en mediciones en campo se encontró que la degradación primaria de la microcistinaLR ocurrió en una semana.50 Experimentos realizados en laboratorio para determinar la velocidad de degradación tanto de nodularina como microcistinas, mostraron que la primera era más resistente a la degradación.51 Para evaluar las implicaciones que tienen las microcistinas sobre la salud es necesario realizar estudios de campo. Para establecer la pérdida de toxicidad de estos metabolitos se deben tomar en cuenta los siguientes factores:
Microbiología ambiental

• • • • •

Dilución Adsorción Descomposición térmica con ayuda del pH Fotolisis Degradación biológica

9. REMOCIÓN DE CIANOTOXINAS MEDIANTE LOS PROCESOS DE
TRATAMIENTO DE AGUAS Los procesos que se combinan para eliminar las microcistinas de aguas contaminadas son: coagulación-filtración, oxidación con cloro y ozono y, por último, la adsorción con carbón activado (cuadro 4). Aunque previamente se había demostrado que la cloración era ineficiente para eliminar las toxinas provenientes de las algas,52,53,54 estudios más recientes señalan que las microcistinas y las nodularinas son destruidas rápidamente con una solución de cloro e hipoclorito de calcio y con menor efectividad con hipoclorito de sodio. El cloro y el hipoclorito de calcio en una concentración de 1 mg L-1 eliminaron cerca del 95% de las toxinas en 30 minutos. Por otro lado el hipoclorito de sodio a la misma concentración solo quitó el 40% y con 5 mg L-1 o más, del 70% al 80%.55 El ozono es uno de los oxidantes más poderosos que se conocen y se ha utilizado efectivamente para la desinfección y oxidación de una amplia gama de compuestos en el tratamiento del agua. Keijola et al.53 mostraron que la preozonización a 1 mg l-1 fue suficiente para eliminar completamente la toxicidad

96

CUADRO 4. REMOCIÓN DE MICROCISTINAS POR DIFERENTES PROCESOS
DE TRATAMIENTO DE AGUA

PROCESO DE TOXINA DETECCIÓN CONDICIÓN DEL TRATAMIENTO (AGENTE, CONCENTRACIÓN, TIEMPO DE CONTACTO)

TRATAMIENTO

RESULTADO REFERENCIAS (% DE ELIMINACIÓN)

Floculación FeCl3-floculación Filtro de arena Al2 (SO4)3-floculación más filtros de arena (+Cl2) Cruda Cruda Cruda Bioensayo en ratón HPLC HPLC, Bioensayo en ratón Cruda HPLC Cruda Bioensayo en ratón

x

Hoffman 1976

Filtración

x 11-18% x 11-18% >95%

Keijola et al. 1988 Himberg et al. 1989 Hoffman 1976 Keijola et al. 1988 Himberg et al. 1989 Nicholson et al. 1994

Cloración Ca (OCl)2-5 mg1-1, 30 min. pH 8.5, NAOCl-0.5 mg L-1, 20 min, pH5.5-6.6 (+floculación +filtro de arena) Cl2, Ca (OCl)2-1 mg L-1, 30 min. NaOCl-5mg·1–1, 30 min. >0.5 mg l-1 (después de la reacción), <pH8 Cruda

70-80% >95% HPLC, Bioensayo en ratón 17% Nicholson et al. 1994

Cloraminación 20 mg l-1, 5d

(Continúa)

97

Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton

98

Microbiología ambiental

CUADRO 4. REMOCIÓN DE MICROCISTINAS POR DIFERENTES PROCESOS
DE TRATAMIENTO DE AGUA

PROCESO DE TOXINA DETECCIÓN CONDICIÓN DEL TRATAMIENTO (AGENTE, CONCENTRACIÓN, TIEMPO DE CONTACTO)

TRATAMIENTO

RESULTADO REFERENCIAS (% DE ELIMINACIÓN)

Ozonización Cruda LR Cruda Extracto Cruda LR HPLC HPLC HPLC Bioensayo en ratón Bioensayo en ratón 1 mg L-1 30 min. (+ floculación + filtro de arena + Cl2) 0.1 mg L-1 15 s HPLC

100% 99%

Keijola et al. 1988 Himberg et al.1989 Drikas et al. 1994 Hoffmann 1976 Falconer et al. 1989 Keijola, et al. 1988 Himberg et al. 1989 Drikas et al. 1994 (O) (O) >90% >90% 20-34% 100% 98%

Adsorción con carbón activado PAC*200 mg L-1 GAC**3.7x13 cm PAC 100 mg L-1 GAG 70 x 7 – 8 cm PAC 5 mg L-1 (+floculación+filtro de arena +Cl2) GAC3 x12 cm (+floculación+filtro de arena +Cl2) PAC (lana), 25 mg L-1 30 min.

* Polvo de carbón activado ** Carbón activado granular. HPLC: Cromatografía de líquidos a alta presión, por sus siglas en inglés HPLC (High Performance Liquid Chromatographic) LR: Leucina-Arginina, aminoácidos que participan en la estructura de la Microcistina-LR. Fuente: 45.

causada tanto por las hepatotoxinas como por la anatoxina-a. Himberg et al.54 observaron posteriormente que la eficiencia de eliminación dependía de la concentración de ozono. Aunque la degradación de microcistina-LR y nodularina da como resultado productos inactivos, es necesario asegurarse de que no se formen productos nocivos durante este proceso. El carbón activado es una medida efectiva para remover una gran variedad de contaminantes, incluyendo las toxinas de las algas acuáticas. Sin embargo, su efectividad depende de factores como la presentación (polvo o granular) y el método de adición del mismo.

10. LA EXPERIENCIA EN MÉXICO
A la fecha existe una gran cantidad de información sobre los daños ocasionados por cianobacterias tóxicas (no todos los géneros de cianobacterias son tóxicas) presentes tanto en cuerpos de agua con fines recreativos como en aquellos que sirven de suministro para consumo humano. Sin embargo, este problema es poco atendido en los países latinoamericanos. Con relación a la presencia de florecimientos de cianobacterias en fuentes de abastecimiento de agua para consumo humano en México, se ha reportado su presencia en el Lago de Chapala, en el estado de Jalisco y en Valle de Bravo, en el Estado de México. De esta última zona se tienen registros de florecimientos de 1998 a la fecha y de la presencia de microcistina-LR. La presa Valle de Bravo y los diferentes cuerpos de agua que conforman el sistema Cutzamala proveen cerca del 30% del agua potable a los habitantes (aproximadamente 6,000,000) de la Ciudad de México. En estos sitios, durante casi seis meses al año se aprecia la presencia de cianobacterias con florecimientos durante el verano y se detectó la presencia de microcistina-LR en los meses de junio, septiembre y noviembre de 1999. Las concentraciones más altas se observaron en el mes de junio con valores de 2,551 mg kg-1, peso en base seca. El valor más bajo se determinó en noviembre, cuando aparentemente el florecimiento había desaparecido; en este mes el valor máximo fue de 109 mg kg-1, peso en base seca (figura 4).56, 57 En el año 2000 no se registraron florecimientos de cianobacterias, pero durante 2001 1as concentraciones de microcistina-LR se incrementaron de enero a julio y la mayor concentración fue de 3,761 µg de toxina g-1. Aunque en agosto se identificó un decremento en la concentración de microcistina-LR, los niveles observados en julio se alcanzaron en septiembre y octubre, para disminuir nuevamente en noviembre (figura 5). Una situación similar podría presentarse en otros cuerpos de agua eutrofizados en nuestro país, como es el caso del Lago de Chapala. Ante esta evidencia surge la necesidad de establecer un programa de vigilancia y monitoreo
Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton 99

FIGURA 3. Anabaena sp. (40X) EN CULTIVO DE LABORATORIO (MEDIO BG-11)

Microbiología ambiental

Microfotografía: Nancy García Roa. Cyma-Lab. Bacteriología UNAM-FESI Correo-e: roa_nan@yahoo.com.mx.

100

en los cuerpos de agua, ya que debido a los procesos de eutrofización es factible la presencia de florecimientos de cianobacterias con niveles de microcistina-LR por arriba del valor guía recomendado por la OMS de 1 µg L-1.35 También es importante diseñar estrategias adecuadas de remoción de toxinas y de control de cianobacterias, en el proceso de tratamiento del agua con el fin de proteger a la población a la exposición aguda o crónica. Por otro lado, se requiere hacer un inventario a nivel nacional de los florecimientos de cianobacterias y establecer el número de géneros productores de toxinas y sus diferentes tipos que podrían liberarlas al ambiente acuático, para tomar medidas preventivas de acuerdo al uso al que se destine el cuerpo de agua. Se requiere el establecimiento de una método estandarizado para la identificación y la cuantificación de las toxinas, incluyendo aquéllas que se han identificado recientemente.58 Finalmente, se debe informar al público usuario de los cuerpos de agua, tanto de uso recreativo como de abastecimiento, sobre los riesgos que implica el hacer uso del agua con evidente presencia de cianobacterias tóxicas.

FIGURA 4. VALORES DE MICROCISTINA OBTENIDOS EN 1999 EN LA PRESA DE VALLE DE BRAVO

300 250
ppm

200 150 100 0 Punto 3 Punto 5
PUNTO 3

Punto 6

Punto 7
PUNTO 5

Junio 1999 Septiembre1999 Noviembre 1999
PUNTO 6 30 653 683 PUNTO 7 93 199 2,551

Noviembre Septiembre Junio

109 No detectable No detectable

No detectable 651 923

FIGURA 5. VALORES DE MICROCISTINA OBTENIDOS EN 2001 EN LA PRESA DE VALLE DE BRAVO
4,000 3,500 3,000 2,500
ppm

2,000 1,500 1,000 500 0
ENE 01 MAR 01 MAY 01 JUN 01 JUL 01 AGO 01 SEP 01 OCT 01 NOV 01 48 1,270 2,509 3,761 59 2,951 3,102 12

µgg-1 140

101

Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton

50

BIBLIOGRAFÍA
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Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton

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Microbiología ambiental

LA

ECOLOGÍA MICROBIANA:

UNA NUEVA CIENCIA PARA UN NUEVO SIGLO
Valeria Souza, Ana Escalante, Ana Noguez, Laura Espinosa-Asuar, René Cerritos y Luis Eguiarte

1. ¿QUÉ ES LA ECOLOGÍA MICROBIANA Y QUÉ ESTUDIA?
LA VISIÓN GENERAL SOBRE LA ECOLOGÍA es meramente antropocéntrica y está relacionada con los problemas de contaminación, y en el mejor de los casos con la interacción que el hombre tiene con su ambiente. Sin embargo, las relaciones de los organismos con su entorno comenzaron desde el origen de la vida y han moldeado a nuestro planeta. Por esto entender el pasado y el futuro evolutivos de la vida en la Tierra requiere de una compensión de la naturaleza de la vida y de los modos en los que ésta ha surgido y evolucionado en el ambiente con sus componentes bióticos y abióticos. En este sentido, para los ecólogos bacterianos la tarea principal es tratar de discernir porqué los organismos están en un sitio dado con ciertas abundancias en un tiempo determinado. Dentro del marco de estudio de la ecología es importante evaluar la diversidad, la abundancia y la distribución de los organismos a diferentes escalas que van desde el paisaje, el ecosistema, las comunidades y, finalmente, las poblaciones de las diversas especies. ¿Por qué es importante estudiar la ecología? Analizar la ecología de cualquier organismo nos permite entender muchos aspectos, no sólo relacionados con el organismo en cuestión sino del ecosistema al que pertenece, los datos ecológicos nos dan información sobre la historia de los organismos y de su entorno así como sobre las cadenas tróficas y los procesos demográficos. Todo esto permite formular teorías sobre los cambios ecológicos que ha sufrido y sufrirá nuestro planeta. En otras palabras, entender la ecología ayuda a comprender cómo interaccionan los organismos con su ambiente y cómo ambos cambian debido a estas interacciones; significa entender los sutiles cambios en el tiempo que constantemente llevan a la adaptación de los organismos. Así, comprender la ecología es entender, en parte, la evolución.
[107]
La ecología microbiana 107

Sin embargo, si este tema es tan importante ¿por qué hay tan poca información para los microorganismos? La principal razón es que ver, caracterizar y contar bacterias no es tan fácil como estudiar plantas o mamíferos. Sin embargo, gracias al descubrimiento de diferentes estrategias moleculares que permiten identificar a los microorganismos a partir de su ADN, ahora es posible caracterizar y contar bacterias casi tan fácilmente como lo hace un ecólogo de plantas o animales. Además, los métodos moleculares han abierto nuevas posibilidades de análisis de la función bacteriana. En este capítulo se verá cómo se ha avanzado en algunos de los aspectos que consideramos más interesantes de la ecología microbiana en los albores del siglo XXI.

2. DIVERSIDAD Y COEXISTENCIA
Se estima que la biomasa de microorganismos terrestres en la superficie de nuestro planeta es igual a la de todas las plantas marinas y terrestres y tal vez sea el constituyente principal de la biomasa de nuestro planeta.1, 2 A pesar de que la diversidad ecológica de los microorganismos en el agua y en el suelo puede ser distinta, el número máximo de individuos que integran el taxón dominante es similar: ˜ 104-105 individuos por gramo o mililitro. Este hallazgo sugiere que deben existir mecanismos que controlan la densidad de los taxa y que deben funcionar de manera más o menos similar en todos los ambientes, mientras que los que controlan la diversidad total de la comunidad bacteriana trabajan de modos distintos en el agua y el suelo. Existen algunas ideas sobre los mecanismos que controlan la diversidad procarionte y ambas tienen que ver con la ecología.
Microbiología ambiental 108

INTERACCIONES TRÓFICAS
Hutchinson3 se preguntaba por qué hay tantas especies de fitoplancton en un medio aparentemente homogéneo, en donde todas las especies presentes parecen competir por el mismo tipo de nutrimentos. Dentro de los procariontes los competidores pueden coexistir si hay algún mecanismo de pérdida selectiva de especies que evite que los competidores más exitosos concentren todos los recursos.4, 5, 6 Por ejemplo, existe depredación selectiva en tamaño, llevada a cabo por protozoarios, lo que permite la coexistencia de bacterias y fitoplancton de diferentes tallas; esta interacción determina cómo se distribuye la biomasa en grupos funcionales. Otra interacción frecuente en el mundo de las comunidades microscópicas es la que se da entre virus y bacterias, este parasitismo es generalmente específico y ello permite la coexistencia de varios taxa de bacte-

rias en una comunidad. Este tipo de interacción ha sido asociado con la especiación dentro de grupos funcionales,7 pues la transferencia horizontal mediada por fagos favorece la diversificación.

B. HETEROGENEIDAD AMBIENTAL
La complejidad estructural del suelo y los sedimentos es importante para la diversificación a nivel de poblaciones ya que permite que los recursos sean fraccionados, y de esta manera se creen nuevos nichos con los que se incrementa la especialización y la división en especies ecológicas nuevas.7 La mayoría de las comunidades terrestres sufren perturbaciones intermitentemente como: escasez de alimento, sequía, congelamiento/descongelamiento o los resultados de la actividad humana. Estas condiciones ambientales alteradas y los recursos que se liberan crean oportunidades para que se establezcan nuevas especies. Así, la perturbación asegurará que las comunidades incluyan una mezcla de los diferentes estadios de sucesión.8 Sin embargo, cambios fuertes y frecuentes causarán la desintegración de los microhabitats y la disrupción de los límites entre poblaciones, lo que permitirá que los recursos locales estén disponibles para una mayor proporción de la masa microbiana total7 es decir, más individuos pero menos especies.

ECOLOGÍA MICROBIANA Sin embargo, si se quiere hacer ecología microbiana se tendrá que identificar y contar a los microbios ¿Cómo se podra “ver” lo invisible y contar lo que no se puede cultivar? Este es el problema fundamental de la ecología microbiana. A continuación se presenta diversas técnicas para resolver estos problemas.

CULTIVAR O NO CULTIVAR
El número de especies microbianas existentes ha sido estimado entre 105 y 106;9 sin embargo, sólo se han aislado, descrito o caracterizado algunos miles. Esto se debe, en parte, a que sólo unos cuantos organismos de las muestras ambientales crecen en medios nutritivos en cajas de Petri.10, 11, 12, 13 Se han hecho muchos intentos para mejorar la recuperación en cultivo, consistentes, de manera general, en manipular cuidadosamente los medios de

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3. UNA SOLUCIÓN MOLECULAR PARA DESHACER EL NUDO DE LA

La ecología microbiana

cultivo y aumentar el número de interacciones entre especies dentro de una misma caja14 pero el éxito ha sido moderado y el problema del mundo no cultivable sigue siendo un reto importante de la microbiología .10 Kaeberlein et al.14 probaron si los organismos no cultivables crecerían si se les proveía de los componentes químicos de su ambiente natural. Para permitir el acceso a estos componentes, colocaron a los microorganismos en cámaras de difusión, mismas que se incubaron en un acuario que simulaba el lugar nativo de estos organismos (figura 1). Con este método lograron recuperar en cultivo alrededor del 40% del inóculo original (se contó el número de colonias formadas en relación al número de células inoculadas), lo cual representa una recuperación órdenes de magnitud mayor que en los intentos tradicionales de cultivo. Además de esta extraordinaria recuperación “primaria” en cultivo, se intentó aislar colonias de la comunidad cultivable y con este experimento se logró el resultado más significativo del trabajo. La mayoría de las colonias aisladas transferidas a cajas de Petri no crecieron (86%) y las microcolonias que lograron crecer (14%) eran cultivos mixtos. Unas pocas colonias grandes y que crecieron rápidamente fueron puras y representaron el 0.054% del inóculo original, lo cual es consistente con lo reportado previamente en relación con la recuperación en cultivo. Esta información lleva a conclusiones interesantes sobre la ecología de los microorganismos, pues parece resaltar la importancia de posibles señales específicas originadas por los organismos vecinos que indican la presencia de un ambiente familiar. Esto significa que los microorganismos no crecerán en un ambiente extraño (sin sus vecinos) aunque existan los nutrientes apropiados.14 Lo que podría explicar el por qué no es posible aislar a la mayoría de los microorganismos en medios artificiales como cultivos puros. No obstante, aquí habría que abrir la discusión sobre si realmente son los vecinos o hemos sido incapaces de determinar los micronutrientes necesarios para lograr cultivos puros de la mayoría de los microorganismos.

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Microbiología ambiental

4. ¿COMO HACER ECOLOGÍA DE COMUNIDADES SIN OBTENER CULTIVOS PUROS DE LA MAYORÍA DE LOS MICROORGANISMOS? (MÉTODOS
MOLECULARES PARA EL ANÁLISIS DE LO NO CULTIVABLE)

PFLA (PHOSPHOLIPID FATTY ACID ANALYSIS)
En todos los microorganismos encontramos fosfolípidos, principalmente en las membranas celulares, las cuales pueden ser degradadas fácilmente dejando libre el componente fosfolipídico. Los fosfolípidos de las membranas son indicadores

TÉCNICAS BASADAS EN ÁCIDOS NUCLÉICOS
De entre todas las moléculas probadas hasta ahora, los ácidos nucléicos han demostrado ser las moléculas más útiles, pues han contribuido con una nueva perspectiva y entendimiento sobre la estructura de las comunidades. Una de las principales ventajas asociadas a los métodos moleculares con ácidos nucléicos es que puede analizarse a la comunidad microbiana en su totalidad, incluyendo a aquellos organismos que no han podido ser cultivados en el laboratorio. Es por ello que estos métodos se han vuelto cada vez más importantes en la ecología microbiana.22,23,24,25 Aún los análisis de baja resolución y amplia escala, como la reasociación de ADN, permiten la determinación una aproximación de la diversidad genética total de la comunidad bacteriana.26 La electroforesis de productos de PCR (por las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction) de genes de rARN en geles desnaturalizantes de gradiente (DGGE) permite tener mayor resolución y provee información sobre cambios en el grueso

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importantes de la biomasa microbiana activa y además se sabe que existen lípidos únicos en grupos específicos de organismos, por lo que este análisis ha sido usado para determinar la diversidad y abundancia microbianas.15, 16 El PFLA requiere que la muestra ambiental de estudio sea analizada cuantitativamente por cromatografía de gases (GC) y espectrometría de masas (MS), lo que genera datos sobre la presencia y abundancia de diferentes fosfolípidos.17, 18 Los datos obtenidos sobre los ácidos grasos de las muestras pueden ser comparados con bases de datos públicas18 lo que permite la asociación de ciertos PFLA con organismos o grupos específicos. Las diferencias en los patrones de PFLA pueden ser interpretadas con relación a cambios en la composición de las comunidades. Este método ha sido utilizado con éxito en estudios que demuestran grandes cambios en comunidades micro-bianas asociadas a prácticas de manejo de suelos.19, 20 A pesar de la utilidad de este método de análisis existen algunas limitaciones importantes.21 La primera es que no se conocen los patrones de ácidos grasos para todos los organismos, por lo que los datos obtenidos de muchas muestras no pueden relacionarse con algún grupo de microorganismos. La segunda limitación es que los patrones de ácidos grasos son muy susceptibles a cambios no necesariamente debidos a la composición de la comunidad, por lo que pueden obtenerse patrones falsos que originen interpretaciones incorrectas. La tercera restricción es que bacterias y hongos producen diferentes cantidades de ácidos grasos dependiendo de las condiciones de crecimiento o estrés, por lo que a pesar de que los patrones de PFLA puedan correlacionarse con la presencia de algunos organismos, esto no significa necesariamente que esos patrones sean únicos para esos grupos en todas las condiciones.

La ecología microbiana

de la estructura de la comunidad.27 Cuando se combinan análisis de genes de rARN en DGGE con hibridación, usando sondas filogenéticas o secuenciando, se obtiene la afiliación filogenética de los miembros dominantes en número que se encuentran en la comunidad.28 La hibridación fluorescente in situ (FISH) de células microbianas con sondas filogenéticas provee información acerca de la composición taxonómica de la comunidad.29,24 Finalmente, la clonación de productos de PCR de genes de rARN de la comunidad arroja información específica de la comunidad microbiana no cultivable. Esta estrategia también permite la comparación de la estructura de la fracción cultivable con respecto a la no cultivable.30 De esta manera, los ácidos nucléicos se han utilizado de diferentes maneras para caracterizar a las comunidades. A continuación ampliaremos la descripción sobre las estrategias mencionadas.
Cinética de reasociación de ADN
Microbiología ambiental 112

El ADN de una comunidad microbiana es una mezcla de genomas de diferentes especies que están presentes en diferentes proporciones. Una curva de reasociación de ADN nos da una idea de que tan compleja es esa mezcla. La técnica consiste en desnaturalizar con calor la mezcla total de ADN y mediante la lectura de un espectrofotómetro (la monohebra de ADN y el ADN de doble cadena tienen picos de absorbancia a diferentes longitudes de onda),31 lo que permite generar una cinética de reasociación de ADN, que es de segundo orden y cual quiera de este tipo de curvas tiene una constante de reasociación C0t1/2. Bajo condiciones definidas, C0t1/2 es proporcional a la complejidad del ADN. (heterogeneidad). 32 Estos valores son siempre relativos a la cinética de reasociación de ADN de una sola especie (ADN de Escherichia coli); esta se considera la curva ideal y una curva de una comunidad siempre tendrá pendientes menores a la ideal (ver figura 2). Aunque en estos experimentos C0t1/2 no tiene un significado preciso, este valor ha sido usado como similar a índices de diversidad de especies.31
RAPD´s (Random Amplified Polymorphic ADN)

El fingerprint o huella de ADN puede obtenerse de diferentes maneras, una de ellas es la conocida como RAPD. Dentro de los métodos de huellas de ADN basados en PCR quizás sea este el más ampliamente usado. El PCR de RAPD utiliza oligonucléotidos de 10 a 12 pares de bases para amplificar segmentos al azar de ADN. Este método funciona porque sólo un pequeño número de fragmentos (de 5 a 10) se amplificarán en un rango de longitud que puede ser

fácilmente amplificado por PCR (comúnmente menor a 3 o 4 kilobases).33 Cuando el ADN que se encuentra entre las secuencias amplificadas consta de repeticiones en tandem y hay variaciones en su longitud, el fragmento amplificado será de longitud variable o polimórfico en la población o comunidad (ver figura 3). Esta estrategia puede servir para dar un primer vistazo a la composición de distintas comunidades; sin embargo, debemos mencionar que esta técnica es poco reproducible debido a que cualquier variación mínima en las condiciones de PCR o del ADN original puede generar cambios en los patrones, por lo que es recomendable utilizar técnicas adicionales para fortalecer los datos sobre la estructura de las comunidades.
Técnicas relacionadas con la diversidad de genes de rARN (SSU)

De las diferentes técnicas que usan ácidos nucléicos para estimar la diversidad de comunidades microbianas, la más útil y ampliamente utilizada es la determinación de secuencias o patrones del gen que codifica para la subunidad pequeña de los ribosomas (16S para procariontes y 5S o 18S para eucariontes).34 Esta subunidad pequeña (SSU) de rARN es adecuada para este tipo de estudios por varias razones. La primera es que se encuentra en los tres dominios de la vida conocidas: bacteria, Archaea y Eucarya.35 La segunda es que son moléculas que tienen regiones altamente conservadas y regiones con variación considerable en su secuencia,36 y debido a estas tasas de evolución diferentes se pueden establecer relaciones a diferentes niveles jerárquicos en un análisis comparativo de secuencias.15 La tercera razón es que el rADN puede amplificarse fácilmente por PCR y ser secuenciado. Varios estudios han demostrado que más del 90% de los microorganismos que pueden observarse microscópicamente in situ pueden ser extraídos y analizados,37, 38, 39, 40, 41, 42 en comparación con menos del 0.1% que pueden cultivarse.15 Una vez amplificado el gen de rARN por PCR es posible analizar la diversidad de este gen en la comunidad para tener una idea de la complejidad de la misma, siguiendo diferentes estrategias que se explicarán a continuación.
DGGE/TGGE (Denaturing Gradient/ Temperature Gradient Gel Electrophoresis)

Esta técnica permite separar mezclas de productos del PCR que son de la misma longitud pero que difieren en secuencia. El poder de separación de este tipo de electroforesis se basa en que el comportamiento de desnaturalización del ADN está determinado de manera importante por la secuencia de nucléotidos. Al

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La ecología microbiana

correr el ADN en el gel, la molécula se mantiene como doble cadena hasta que alcanza la concentración o temperatura desnaturalizante, reduciendo su movilidad en el gel.15 En teoría, cualquier gen de rARN que se encuentre en el ADN total de la comunidad puede ser amplificado por PCR y resuelto en un gel DGGE/TGGE, ya que en este tipo de análisis cada banda en el gel es considera como una especie distinta en la comunidad y la intensidad de las bandas es tomada como un reflejo de la abundancia de esa secuencia en la comunidad (figura 4). Existen algunas consideraciones importantes sobre esta técnica y tienen que ver con la interpretación de los datos obtenidos. En particular, es posible que diferentes especies generen una misma banda por lo que los estimados de diversidad serán subestimaciones. Por ello lo ideal es hacer estimaciones de diversidad relativa entre comunidades y considerar “filotipos” o OTU (unidades taxonómicas operacionales) en lugar de especies.
Microbiología ambiental

T-RFLP´s (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)

El análisis de fragmentos de restricción terminales es actualmente uno de los métodos más poderosos que existen dentro del campo de la ecología microbiana para comparar rápidamente la diversidad de secuencias de ADN bacteriano amplificado por PCR de muestras ambientales.43, 44. El método se basa en la variación en la posición de sitios de restricción entre las secuencias y en la determinación de la longitud de fragmentos terminales de restricción (TRF) marcados con fluorescencia y analizados por medio de electroforesis en geles de alta resolución en secuenciadores de ADN.45, 46 El resultado es una distribución de abundancia de fragmentos de diferentes tamaños (figura 5). Dentro de las características más importantes de este método está la gran velocidad de análisis de las muestras, lo que permite hacer réplicas de los experimentos y con ello lograr análisis estadísticos.47 El método de TRF puede ser usado para identificar diferenciación de comunidades, para comparar ha riqueza relativa de filotipos y estructura de comunidades, y para identificar organismos específicos en una comunidad,47 a partir de la clonación y secuenciación de fragmentos específicos de 16S rARN de dicha comunidad. A pesar de que éste es un método rápido de análisis comparativo de comunidades tiene relativamente baja resolución. Esto se debe a que existe cierta probabilidad de que varios filotipos se encuentren representados por un solo tamaño de fragmento y representen un solo pico en la distribución; esto puede llevar, nuevamente, a subestimar la riqueza de especies, la cual puede ser calculada por otros métodos con mayor resolución filogenética, pero a mucho mayor costo. Esta situación fue puesta a prueba por Dunbar,47 al comparar los estima-

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dos de riqueza obtenidos de una librería de clonas de 16S y de TRFLP obtenidos de la misma muestra de donde se construyó la librería. Dunbar et al. concluyeron que los patrones de TRFLP subestiman la riqueza relativa del total de los filotipos; sin embargo, permite descubrir similitudes entre comunidades y tiene una buena sensibilidad (detecta genomas que se encuentran en concentraciones tan bajas como el 1% del total de la comunidad). Es por ello que este método se recomienda como útil para análisis rápidos de muestras de campo que quieran compararse en cuanto a su composición y es una herramienta útil para investigaciones de ecología microbiana.
ARDRA (Amplified Ribosomal ADN -Restriction Análisis)
ARDRA es una técnica de fingerprint o huella de ADN que se usa para caracterizar comunidades y poblaciones. Consiste en amplificar por PCR el gen de 16S rARN de la comunidad total, aislar las diferentes copias que se encuentran

en la mezcla y, posteriormente, someter a cada una de las copias a digestiones enzimáticas (restricción); también puede digerirse la muestra total (sin separar las copias).48 La manera más común de separar las diferentes copias del el 16S rARN (o cualquier otro ) de la comunidad es clonando los diferentes fragmentos en cepas especiales de Escherichia coli que son capaces de transformar e incorporar el fragmento en un plásmido con marcadores moleculares de color (i.e., operon lactosa) y resistencia a múltiples antibióticos. Esto se hace al mezclar el PCR total con bacterias susceptibles a adquirir ADN extraño (competentes); de esta manera, cada bacteria obtendrá una sola copia del gen y así quedarán separadas las diferentes copias de la mezcla total. Las bacterias que contienen los fragmentos se dejan crecen en cajas de Petri con antibióticos y posteriormente se aisla el ADN plasmídico junto con el gen de interés que se puede separar del ADN bacteriano. Cada gen obtenido de esta manera se somete a una digestión enzimática que da como resultado un patrón de bandas en electroforesis en geles de agarosa (figura 6). Los patrones de restricción permiten identificar diferentes grupos (diferentes patrones de restricción no significan necesariamente especies diferentes) o identificar comunidades distintas. Si el ARDRA se hace con copias separadas del gen 16S rRNA, el análisis de los diferentes patrones permite hacer estimaciones de diversidad y/o elegir representantes de los patrones distintos para obtener las secuencias e identificar los grupos taxonómicos específicos a los que pertenecen o con los que se relacionan. El problema principal de esta técnica es que dado el número de clonas que se deben obtener por comunidad para determinar su diversidad y abundancia por restricción, los costos son casi iguales que si se secuencia la comunidad completa.

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Secuencias

Cualquiera de las estrategias de ácidos nucléicos mencionadas puede concluir con la secuenciación de una muestra de las copias del gen 16S rARN por sitio. Sin embargo, se pueden evitar los análisis antes mencionados y hacer el PCR del ADN total, e inmediatamente después secuenciar todas las copias con clonación previa. El análisis de secuencias en comunidades microbianas requiere siempre separar las diferentes copias de la muestra, ya sea por clonación o cortando las diferentes bandas de geles TGGE. Obtener la secuencia de 16S rARN de los diferentes organismos de la muestra tiene varias ventajas. Una de ellas es que se construye una librería de clonas que mantiene las copias separadas y listas para otros análisis en el futuro. Otra ventaja, y quizás la más importante para el análisis de comunidades microbianas, es que la obtención de secuencias de librerías de clonas es la única manera de contar con estimados robustos sobre diversidad de comunidades complejas (como muchas comunidades microbianas).49 La principal limitante encontrada hasta ahora para la aplicación general de análisis de comunidades con secuencias es su costo (el cual está reduciéndose constantemente debido a la gran demanda de estos métodos) y el tiempo que la técnica requiere, ya que cada una de las secuencias debe de ser “curada”, es decir, confirmar que cada pico del electrofenograma sea el correcto. Posteriormente, las secuencias deben ser sometida a Blast con el GenBank y alineadas considerando la estructura terciaria del 16S.
Técnicas relacionadas con la expresión de genes (rARN)

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Varios análisis se han enfocado recientemente a la caracterización de comunidades microbianas del suelo basándose en la expresión del rARN en contraste con los genes que codifican para el ribosoma: el rADN.50, 51, 52, 53, 54, 55 Al igual que el rADN, el ARN tiene regiones tanto variables como muy conservadas que permiten la discriminación de taxa a diferentes niveles taxonómicos. Además, el uso de ARN directo ofrece varias ventajas principales sobre el uso de técnicas con rADN. La primera ventaja es que, debido a que los ribosomas son el sitio de síntesis de proteínas, el contenido de ARN se correlaciona con la actividad metabólica y la tasa de crecimiento,56 lo que significa que una alta proporción de las secuencias detectadas en las muestras corresponderán a microorganismos metabólicamente activos, en crecimiento y probablemente importantes ecológicamente.53, 57, 58 La segunda ventaja es que debido a que las secuencias de rARN normalmente se encuentran en las células en más copias que las secuencias de rADN teóricamente deben ser más fáciles de detectar. La tercer ventaja es que cuando los ribosomas se

extraen directamente de las muestras ambientales solo se incluyen en el estudio a los microorganismos vivos y activos. Al igual que con el rADN, cuando los ampliaciones de rARN se separan en geles DGGE/TGGE, el patrón de bandas sirve como una huella digital de la comunidad microbiana. Si se supone que no hay sesgo en la amplificación, la intensidad de las bandas indica la abundancia en la comunidad de la secuencia de rARN correspondiente.50 Sin embargo, un factor importante que complica las interpretaciones sobre la abundancia de un taxon es que el número de operones de rARN dentro de un genoma puede variar entre los grupos taxonómicos59 por ello es posible que exista heterogeneidad en las secuencias de rARN dentro de una misma cepa y, en consecuencia, no puede suponerse que cada producto de PCR en el gel corresponda a un organismo diferente, y un mismo organismo puede estar representado por varias secuencias distintas.15 Por otro lado, la intensidad de la banda puede deberse a muchas copias de una misma secuencia en el mismo organismo o a que existen muchas células del organismo que posee la secuencia. Una manera de distinguir entre estas dos posibilidades es mediante hibridización in situ.60 Otra forma es correr el mismo gel con productos de PCR de rARN y rADN y comparar la intensidad de las bandas para determinar si esta se encuentra relacionada con el número de copias del gen.57 A pesar de que esta técnica puede ser muy útil para estudiar comunidades microbianas, existen limitaciones técnicas en ella debido a lo lábil que es el ARN. Por lo tanto es necesario tener mucho cuidado con el almacenamiento y procesamiento de las muestras ambientales, ya que cualquier mínimo cambio en las condiciones ambientales originales puede alterar la actividad metabólica de los microbios.61Esto se puede evitar con el procesamiento inmediato o congelamiento de las muestras. Otra restricción se presenta con respecto a la eficiencia de extracción52 y amplificación de rARN.62, 63, 61 Existe la posibilidad de que la amplificación sea sesgada por mayor abundancia de algunas secuencias en el rADN original o por mayor homología de ciertas secuencias por los oligonucleótidos del PCR. La mayoría de los estimados son en procariontes y, aunque en teoría debería poder analizarse la comunidad eucarionte de rARN de la misma manera que procarionte, los ribosomas eucariontes parecen ser más complejos en cuanto a los genes que los codifican y su regulación, además de que las bases de datos públicas con secuencias de rARN prácticamente no tienen representantes eucariontes, por lo que resulta problemático identificar especies eucariontes con las secuencias de su rARN.15
FISH (Fluorescent in situ hybridization)
FISH es un método usado principalmente con comunidades procariontes y permite la identificación y cuantificación directas de grupos taxonómicos ge-

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nerales o específicos dentro de su ambiente natural.24, 64, 65, 66 Con FISH todas las células son fijadas y su 16S o 23S rARN se hibridiza con sondas de oligonucleótidos de un taxón específicos y marcados con fluorescencia. Posteriormente, las células que hibridaron y quedaron marcadas pueden verse en un microscopio óptico de fluorescencia. Con este método y gracias a que las células completas se hibridan, se evitan artefactos generados por sesgos en la extracción de ADN, amplificación por PCR y clonación.67, 68, 58 FISH puede usarse para observar organismos no cultivados y es útil para estudiar la distribución ecológica de los organismos a través de habitats diversos.67, 69, 70 Tal vez el aspecto en el que se debe tener más cuidado cuando se utiliza el FISH es en el diseño de la secuencia de las sondas de hibridación, ya que de ello depende que se logre una buena caracterización de la comunidad. Es necesario hacer una selección cuidadosa de las secuencias de los organismos representativos del taxón o taxa que se desea visualizar, pues la sonda será tan buena como lo sea esta selección.24 Errores en este diseño podría ocasionar que no puedan observarse organismos no cultivables que pertenezcan al grupo de interés o que se den hibridaciones cruzadas con organismos de otros grupos.29, 65, 58

5. Y AHORA QUE SE PUEDE CONTAR ¿QUÉ ES LO QUE SE CUENTA?
Ya que puede estimar indirecta y directamente la diversidad y abundancia de las especies de los microbios en las comunidades llegamos a un problema difícil de resolver ¿qué es una especie bacteriana? Esto no es trivial y adquiere rápidamente tintes filosóficos que se revisarán más adelante. En términos más prácticos, Hughes et al.,71 publicaron recientemente una revisión sobre el problema que implica determinar el número de especies en una comunidad, y evaluaron el tamaño de muestra que en general se requiere para tener un estimado útil sobre la diversidad de las comunidades. Además analizaron la utilidad de varios estimadores de diversidad para el caso de comunidades bacterianas. La relación entre el número de tipos (OTU = Operational Taxonomic Unit, un eufemismo para no explicar si lo que se analizan son especies, clonas, filotipos u otra categoría taxonómica jerárquica) observados y el esfuerzo del muestreo nos proporciona información sobre el total de la diversidad de la comunidad que ha sido muestreada. Este patrón puede visualizarse graficando una curva de acumulación que consiste en relacionar el número acumulativo de OTU observados contra el esfuerzo de muestreo. Este tipo de curvas revelan la calidad del muestreo, ya que, como todas las comunidades por definición deben de tener un número finito de especies, si se continúan muestreando individuos, las curvas eventualmente tenderán a esta valor máximo, es decir alcanzarán una asíntota en el valor real del número total de OTU en la comunidad.

En la gran mayoría de las comunidades microbianas revisadas en el estudio de Hughes,72 no se alcanza la asíntota de las curvas debido a la gran diversidad que existe. Sin embargo, aunque sería útil conocer la diversidad total real de las comunidades microbianas, la mayor parte de las preguntas relacionadas con la diversidad se refieren a cambios en ésta que suceden por alteraciones ambientales bióticas o abióticas, por lo que las respuestas a estas preguntas requieren únicamente estimados de diversidades relativas. De esta manera, se encontró que aunque los valores dependen del tamaño de la muestra, la mayoría de los estimadores de riqueza se estabilizan con los tamaños de muestra que, en general, tienen estos estudios, esto es con muestras de 200 a 1,000 clonas, que sugieren comunidades con sólo cientos a pocos miles de especies importantes (no miles o millones, como se había sugerido previamente). Es importante señalar que todas las estimaciones estadísticas presentan limitaciones y una de las más importantes y frecuentes es que no existe rigor en la definición de los OTU que se analizan ni de su relación con las especies reales,73 por lo que diferentes estudios que calculan los mismos estimadores generalmente no son del todo comparables. De igual manera, la mayoría de estas aproximaciones requieren datos sobre frecuencias relativas de los diferentes OTU y muchos estudios han revelado que los análisis genéticos de diversidad microbiana van acompañados de sesgos de muestreo. Sin embargo, el hecho de que la mayoría de las preguntas sobre estructura y función de las comunidades requieran comparaciones relativas sobrepasa muchos de los problemas sobre definición de especies y sesgos de muestreo.71 Mientras que la unidad de medida sea definida y constante, puede compararse la diversidad entre sitios o tratamientos. De igual manera, para minimizar el efecto del sesgo de muestreo se pueden usar varias técnicas o genes que fortalezcan las comparaciones. De aquí deriva el problema de fondo en la ecología bacteriana. Un OTU analizado ¿es una especie, parte de una especie o varias especies relacionadas? ¿Qué es una especie bacteriana y cuáles son sus límites? Resolver este problema es fundamental para estimar la diversidad y sus patrones geográficos. Históricamente, el concepto de especie que se aplica en microbiología ha sido más práctico que natural. La práctica ha llevado a considerar especies estáticas, cuyas características son atributos típicos o esenciales, y por tanto, supone que el fenotipo y genotipo son iguales para todos los organismos pertenecientes a la especie. En este caso, las características que se toman pueden ser morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e incluso genéticas. Por otro lado, el concepto natural de especie pretende ser reflejo de una población en donde hay dinamismo y en donde existe cohesión debido a una organización interna.74 El concepto natural de especie más usado en sistemática es el biológico, el cual supone la existencia de entrecruzamiento entre los miembros de una misma especie, de tal manera que al existir tal entrecruzamiento se asegura, de manera indirecta, que entre ese

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conjunto de organismos haya cohesión y por tanto se supone que el investigador se encuentra ante una especie natural. La desventaja que tiene este concepto es que no es aplicable para todos los organismos, principalmente para aquellos que tienen reproducción asexual (Fungi, Protoctista, Archaea, Bacteria). Desarrollar un concepto natural de especie para organismos con reproducción asexual es uno de los mayores retos en sistemática microbiana. En la actualidad se reconocen dos tipos de especie natural, la especie genética o genoespecie y la especie evolutiva o filoespecie. La primera usa como carácter único los índices de hibridación. El establecimiento de similitud en la secuencia del ADN de dos organismos se logra mediante análisis de reasociación de ADN y de secuencias del gen 16SrARN. En el caso de reasociación de ADN, si las secuencias de las dos muestras de ADN son homólogas, se formarán hélices dobles híbridas. Únicamente las muestras que tengan 70% de reasociación bajo condiciones moderadamente restrictivas pueden considerarse como una especie genética.75, 76 Si hablamos de secuencias de 16SrADN el porcentaje de similitud de organismos de una misma especie es mayor a 97%. El concepto de genoespecie ha sido muy cuestionado. La idea de tener un 70% de reasociación o 97% de similitud en 16SrADN es muy ambigua, sobre todo si se quiere extrapolar a macroorganismos. Por ejemplo, si se toma la definición del 70% de homología genómica, todos los primates podrían ser considerados miembros de una sola especie.73 Además, se ha encontrado que en especies procariontes la frecuencia de transferencia horizontal, así como de eventos parasexuales es muy alta y por tanto podría dar resultados filogenéticamente erróneos al influir en el grado de reasociación del ADN,77 y en la secuencia de genes como 16SrARN. En este punto comienza la discusión acerca de la importancia de la recombinación genética (homóloga y no homóloga) en la dinámica evolutiva de las poblaciones. La recombinación genética homóloga presenta dos efectos fundamentales en las poblaciones: impide la divergencia entre subpoblaciones, las homogeniza y, al mismo tiempo, aumenta la diversidad de genotipos en la población. Por otro lado, los efectos de la recombinación no homóloga originan nuevas variantes y, potencialmente, nuevas especies. La adquisición de nuevos genes que sean funcionales y de carácter adaptativo en el ambiente puede producir especiación express en los organismos; se ha sugerido que tal es el caso de Yersinia pestis y Y. tuberculosis. Cuando la frecuencia de la recombinación homóloga y no homóloga es muy alta en un grupo de poblaciones naturales, el efecto combinado puede ser muy diferente a las consecuencias planteadas previamente. En este caso las especies pueden presentar una gran cantidad de nichos producto de la adquisición de nuevas funciones; sin embargo, como la recombinación homóloga es alta, las poblaciones de la especie se mantienen homogéneas. Escherichia coli y Vibrio cholerae son ejemplos de este caso.

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Como podemos observar, la delimitación de las especies microbianas no es un asunto trivial y la practicidad no va acompañada de grupos naturales. Sin embargo, en términos de comparación y estimaciones aproximadas de la diversidad y distribución de microorganismos, el uso de marcadores moleculares como el 16S rADN u otros genes particulares a ciertos grupos resuelve el problema inmediato sobre la estimación de la diversidad, siempre que haya consistencia en cómo se define la unidad de análisis u OTU.

6. LOS PATRONES EN COMUNIDADES BACTERIAS: ¿EXCEPCIONALES O
COMUNES? Dejando a un lado los problemas taxonómicos en el caso de las bacterias, los datos ecológicos sobre microorganismos aún son escasos lo que ha generado diversas especulaciones sobre la posibilidad de que los microorganismos sean organismos de excepción. En otras palabras, los pocos datos han generado un fuerte debate en cuanto a la universalidad de las reglas ecológicas, esto es, si los microorganismos se distribuyen y organizan de manera similar o al menos siguen las mismas “reglas” o principios ecológicos que los organismos grandes como plantas y animales. Esta discusión resulta extraordinariamente relevante ya que, como se menciono, hoy en día los principios y reglas ecológicas se fundan en observaciones hechas en macroorganismos, y el hecho de que estos pudieran ser distintos implicaría que más de dos terceras partes de la vida en la Tierra se rige por otros principios ecológicos. Se cree que los microorganismos deben regirse básicamente por los mismos principios ecológicos que los macroorganismos, ya que que siguen los mismos principios evolutivos y biológicos. De cualquier manera, los resultados que se obtengan con las herramientas moleculares actuales nos permitirán comparar la ecología del mundo macroscópico y microscópico y evaluar la universalidad de las reglas ecológicas. Algunos autores defienden que todos los organismos pequeños son muy abundantes y se distribuyen por todo el mundo, sin barreras ecológicas. Esto puede ser cierto para algunos microorganismos, como con adaptaciones extraordinarias para la dispersión y gran resistencia a cambios en el ambiente (protozoarios, diatomeas, bacterias formadoras de esporas, hongos, bacterias marinas). También parásitos humanos que pueden generar epidemias mundiales pueden encontrase casi en todas partes (Escherichia coli, Vibrio cholerae). Sin embargo, existen otras observaciones que apuntan a la existencia de fuertes barreras ecológicas que limitan la dispersión de los microorganismos, generando divergencias genéticas entre poblaciones de las mismas especies debido al aislamiento, lo cual se ajusta más a los principios ecológicos y evolutivos observados en macroorganismos.

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La aparición de las herramientas moleculares ha dejado abierta la puerta a estudios ecológicos como los que se han realizado durante décadas con macroorganismos. Recientemente, han aparecido varios trabajos en donde se evalúa la diversidad y distribución de microorganismos usando modelos desarrollados especalmente para este grupo. Los resultados de dichos estudios han conducido al debate sobre la posibilidad de distribuciones biogeográficas en microorganismos (distribución geográfica asociada a ciertas condiciones ecológicas) y sobre las barreras reales a la dispersión de microorganismos. Mientras que algunos autores presentan resultados en donde no hay asociación obvia entre la distribución de los microorganismos y la geografía, otros parecen demostrar lo contrario. Estos estudios contradictorios plantean la pregunta de si existen realmente patrones de distribución en microorganismos. Hillebrand y colaboradores,78 comparan la diversidad en diferentes organismos, desde protistas hasta vertebrados, bajo la visión de relaciones que han sido estudiadas en macroorganismos (relación entre el número de especies y el área de estudio, entre el número de especies y de individuos). La conclusión del estudio es que no hay razón para pensar que existan límites para la dispersión de microorganismos; es decir, pueden existir en todo el mundo, como ha sido sugerido por Finlay.79 Sin embargo, este tipo de trabajos no son concluyentes ni absolutos debido a la falta de consideración de los diferentes hábitos y formas de vida de los microorganismos. No es lo mismo un organismo de vida libre con capacidades extraordinarias de dispersión (como formadores de esporas), que un organismo parásito y ni qué decir de los microorganismos altamente especializados y con capacidad limitada de dispersión, como los que habitantes de las ventilas hidrotermales en el fondo del mar o simbiontes estrictos asociados a organismos sésiles, como a gusanos lofoforados de fondos marinos o en corales. Apenas comienzan a plantearse preguntas sobre la distribución geográfica de los microbios y las respuestas pueden ser muy interesantes, tanto para los ecólogos de organismos macroscópicos como para los ecólogos de microorganismos. En el primer caso, las respuestas pueden contribuir al enriquecimiento de la teoría existente y en segundo las respuestas pueden llevar a la introducción de un soporte teórico sólido.

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7. ECOLOGÍA EXTREMA: CICLOS BIOGEOQUÍMICOS Y ECOLOGÍA FUNCIONAL
BACTERIANA El hecho de que los procariontes hayan sido de los primeros pobladores terrestres y que hayan vivido en un inicio en condiciones extremas (luz ultravioleta, temperaturas extremas, condiciones anóxicas y un ambiente químico cambiante), les

confirió una serie de estrategias metabólicas que les ha permitido vivir en muy diversas condiciones ambientales. Estas estrategias los conservan íntimamente involucrados en el movimiento y la transformación (ciclos biogeoquímicos) de las diferentes formas químicas de muchos elementos, pero especialmente de aquellos esenciales para la vida como: el oxígeno (O), el carbono (C), el nitrógeno (N), el azufre (S) y el fósforo (P). A continuación se explican algunos de ellos. Desde el inicio de la vida en la Tierra, los procariontes (Bacteria y Archaea) han jugado un papel preponderante, moldeando las características físico-químicas del ambiente que nos rodea. La formación de la atmósfera en la Tierra fue un proceso que duró varios millones de años y se cree que las cianobacterias (únicos organismos capaces de tomar la energía del sol y el bióxido de carbono para transformarlos en azúcares liberando oxígeno la fotosíntesis aerobia fueron las responsables, en un inicio, de la producción del oxígeno atmosférico, hace aproximadamente 2.3 millones de años. Por su capacidad para vivir tanto en condiciones anaeróbicas, como aeróbicas y de fijar en nitrógeno insoluble del aire a nitrógeno soluble como amonio, las cianobacterias fueron los organismos predominantes del mar Precámbrico durante miles de millones de años, creando a su paso gran cantidad de fósiles conocidos como estromatolitos. Con el paso del tiempo la atmósfera se fue enriqueciendo con el oxígeno de la fotosíntesis, lo que dio paso a un cambio en su composición química y en las condiciones climatológicas prevalecientes; es decir la Tierra dejó ser un planeta anaranjado cálido con una atmósfera de metano y bióxido de carbono para convertirse en un planeta azul donde el oxígeno predomina y donde la capa de ozono protege al planeta de los rayos ultravioleta. Aún hoy la fotosíntesis, y en consecuencia la producción de oxígeno en los sistemas terrestres que se lleva a cabo por las plantas superiores, es realizada exclusivamente por los cloroplastos, los cuales son producto de la endosimbiosis con cianobacterias.80 Sin embargo, este oxígeno liberado a la atmósfera por los sistemas terrestres es consumido nuevamente mediante la respiración. De tal forma que las cianobacterias fotosintéticas marinas son las responsables en gran medida del mantenimiento del oxígeno atmosférico. Este cambio atmosférico realizado por las bacterias a escala geológica tal vez sea el más evidente. Pero los cambios físicos y químicos han sido muchos y de diferentes magnitudes, y resultan esenciales para la vida, ya que procesos como la fijación de nitrógeno, y el ciclo de carbono son parte esencial del reciclamiento de nutrientes y sólo realizan los procariontes. Asimismo, los cambios en las condiciones químicas de los cuerpos de agua, la intemperización y la precipitación de minerales y la remineralización del carbono orgánico también son responsabilidad de las bacterias. El carbono es un elemento esencial para la formación de compuestos orgánicos y la obtención de energía la concentración más grande de este elemento se

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encuentra en la corteza terrestre en forma de carbonato de calcio y de magnesio. La tasa de cambio de este almacén es extremadamente lenta, por lo que es el carbono (C) orgánico (proveniente de los restos de vegetales, animales, microorganismos y la respiración) el que tiene importancia dentro de nuestra escala temporal. Los productores primarios, es decir, las plantas superiores, las cianobacterias fotosintéticas y procariontes quimioautótrofos son los encargados de transformar el CO2 existente en la atmósfera en materia orgánica (principalmente polisacáridos). El C incorporado puede regresar nuevamente a la atmósfera como CO2 o CH4 (metano), formar parte de la biomasa microbiana del suelo o ser mineralizado por los microorganismos. Además los polisacáridos producidos por los microorganismos son un elemento de cohesión muy importante de las partículas del suelo, que les dan estructura, resistencia y capacidad de almacenamiento de nutrientes, necesarios para el crecimiento de las plantas. El nitrógeno es un elemento clave en las células ya que forma parte de los aminoácidos, de ciertas vitaminas, enzimas, proteínas y del ADN. El nitrógeno constituye aproximadamente el 79% de la atmósfera y se encuentra en una forma muy estable (N2). Esto implica que molecularmente se requiere mucha energía para su rompimiento y aprovechamiento. Sin embargo, la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico es exclusiva de algunas bacterias. Especies como Azotobacter, Azomonas, Klebsiela, Citrobacter, Thiobacillus son capaces de fijar N atmosférico en forma aeróbica; Clostridium, Desulfovibrio, Chromatium, Thiocapsa, Heliobacillus y Heliobacterium, entre otras, lo hacen en forma anaeróbica. Existen también algunas especies de bacterias (Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium) que fijan N y viven en forma simbiótica con algunas plantas, muchas de ellas leguminosas. Una vez fijado, el N es transformado en amonio (NH4), forma química que puede ser aprovechada por las plantas y otras bacterias. El amonio también es transformado por bacterias del género Nitrosomonas en nitritos (NO2-) y posteriormente en nitratos (NO3-), proceso a cargo de las bacterias del género Nitrobacter. El nitrato formado puede ser lavado a capas inferiores del suelo y alcanzar el manto freático y eventualmente el mar o utilizado por Pseudomonas y Achromobacter (bacterias denitrificantes). Durante el proceso de denitrificación se produce óxido nitroso (N2O) que puede ser liberado a la atmósfera o ser reducido nuevamente a N2. Las emisiones volcánicas, la lluvia y los desechos gaseosos producidos por la industria son fuente de diferentes compuestos del azufre (H2S, SO4, SO2). Este elemento forma parte de aminoácidos y vitaminas como la cisteína, la metionina, la biotina y la tiamina, como grupo sulfhidrilo (-SH). Sin embargo, para su absorción debe encontrarse en forma de sulfato (SO42-) o tiosulfato (S2O32-). Tal vez el azufre (S) es el elemento con uno de los ciclos biogeoquímicos más complicados debido al gran número de pasos en su oxidación y reducción,

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todos realizados por bacterias, que pueden ser aerobias (Thiobacillus, Beggiatoa) o anaerobias (Desulfovibrio, Desulfobacter, Desulfomonas). El fósforo es un elemento primordial para los seres vivos, pues a diferencia del O, N, S y N carece de fase gaseosa. Gran parte del P utilizado por las plantas proviene de la mineralización de rocas sedimentarias. El ciclo del fósforo es muy parecido al ciclo del N y del S, en el que los microorganismos, junto con los agentes ambientales físicos y químicos, realizan la mayor parte de la mineralización de este elemento. Como ya se mencionó, las bacterias fueron los primeros productores de materia orgánica, por lo que forman la base original de la cadena alimenticia, permitiendo la evolución de nuevas especies que utilizaban esta materia como fuente de energía, creando así las primeras redes tróficas. En todos los ecosistemas existentes la cadena trófica varía en su longitud y complejidad, pero en todos empieza por los productores primarios que capturan la energía del sol (fotosíntesis aeróbica o anaeróbica) o la energía química de los compuestos inorgánicos de los minerales y termina con los degradadores de detritus y de la materia muerta. En ambos extremos de la cadena las bacterias son predominantes, inclusive es tal el acoplamiento existente entre las diferentes comunidades bacterianas que los productos de desecho de algunos microorganismos constituyen la fuente nutrimental de otros. Estos productos de desecho también pueden acumularse en los ecosistemas produciendo cambios físicos y químicos graduales. En el mar se han encontrado algunos ejemplos interesantes de estas cadenas alimenticias, donde las bacterias también tienen papeles importantes al inicio y al final de las cadenas, ya que contribuyen a la producción de alimento a partir de sustratos orgánicos disueltos en el agua y son las responsables de romper la materia orgánica, regresando así los nutrientes al mar.81 En el fondo del mar también cumplen funciones que comienzan a entenderse, formando parte de las cadenas que involucran oxidar o reducir moléculas inorgánicas.82 Estos descubrimientos han sido sorprendentes, ya que el mar era un ambiente poco estudiado y donde se pensaba encontrar poca diversidad de bacterias en las costas; por otra parte, en las zonas alejadas y de gran profundidad no era imaginable encontrar habitantes, debido a las altas concentraciones de sal, la poca cantidad de luz, oxígeno y nutrientes. Las nuevas técnicas moleculares a las que ya se ha hecho referencia han permitido descubrir, contrario a lo que se creía, que incluso en el mar profundo existen una gran cantidad de bacterias, distintas entre sí, con novedosas y raras propiedades. En las costas se halla una gran diversidad y mayor proliferación de distintos tipos de microorganismos, ya que en la superficie hay disponibilidad de oxígeno y la cercanía con la tierra las hace ricas en nutrientes, como resultado predominan sobre todo bacterias que utilizan la luz como energía para producir materia

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orgánica (esto es, fotosintéticos) y que pueden vivir con oxígeno (también llamados aeróbicos), por ejemplo las algas eucarióticas y las cianobacterias. También se han encontrado arqueas, hasta hace poco conocidas únicamente como microorganismos exclusivos de ambientes muy especializados; por ejemplo, hay arqueas que se creían exclusivas de ambientes muy calientes (Cenarchaeum symbiosum) de las que se han encontrado parientes cercanos que viven en las aguas del Antártico a -1.5º.83 Si no hay corrientes que revuelvan el agua y la hagan homogénea, en el fondo cercano a la costa existe menos oxígeno, por lo que allí se han encontrado principalmente bacterias fotosintéticas anaeróbicas. Por otra parte, en las capas superiores del mar profundo hay luz y oxígeno, pero hay pocos nutrientes por la lejanía de las costas y del suelo. En esta zona, el fondo del mar se caracteriza por una reducida cantidad de nutrientes, la presión es extremadamente alta, no hay luz ni oxígeno y la temperatura es muy fría. Con estas características, en un principio se creía que mar adentro no se encontrarían microorganismos, o se hallabán pocos capaces de vivir en la superficie o en el fondo. Sorprendentemente los hay, y uno de los ejemplos más comunes son las bacterias adaptadas a altas presiones, conocidas como barofílicas. Otros ambientes marinos muy interesantes en este sentido son las ventilas hidrotermales y las chimeneas negras, zonas en el mar a gran profundidad en las que existen salidas de agua que ha estado en contacto con magma y basalto, por lo que brota mezclada con minerales calientes, dando lugar a temperaturas tibias o calientes dentro del agua marina (de 6 ºC a 23 ºC en las ventilas, y 270 ºC a 380 ºC en las chimeneas). En estos ambientes sin luz, con grandes presiones, sin oxígeno y altas temperaturas se han encontrado invertebrados y distintas variedades de microorganismos adaptados a vivir en estos sitios.84 Incluso se les ha encontrado viviendo dentro de los mismos invertebrados en asociaciones muy específicas, por lo cual es muy posible que existan procesos coevolutivos entre los invertebrados y sus bacterias simbiontes.

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8. PRÁCTICAS DE LA ECOLOGÍA MICROBIANA
Pero el papel de las bacterias no termina aquí, la disciplina de la bioremediación se basa en la diversidad de especies y metabolismos microbianos. La capacidad que tienen las bacterias para alimentarse de los compuestos químicos más recalcitrantes las ha convertido en los candidatos perfectos para resolver desde problemas de contaminación (derrames petroleros) hasta de purificación de ciertos metales de importancia minera. La concentración de uranio, cobre y oro en yacimientos con bajos contenidos, se puede llevar a cabo utilizando bacterias acidófilas. Algunas otras especies bacterianas logran separar de los minerales, los metales pesados que contienen, como el mercurio, el cobalto, el zinc, el

níquel y el molibdeno. Con el advenimiento de la Revolución verde el uso de pesticidas se convirtió rápidamente en un problema, ya que su permanencia en los suelos puede ser de varias semanas o de varios años. Aunque parte de sus compuestos se pierden en forma volátil o como lixiviados, existen microorganismos que los pueden degradar fácilmente. Por otra parte, con el estudio de bacterias marinas es posible descubrir nuevas moléculas o procesos que tienen aplicaciones útiles para la medicina o la industria. Por ejemplo en el caso de las bacterias que viven a muy bajas temperaturas el objetivo es encontrar moléculas con propiedades anticongelantes o biocatalizadores activos a bajas temperaturas. Como son bacterias o archaeas que viven en concentraciones de sal muy altas (por ejemplo, en el Mar Muerto) una meta posible es aislar metabolitos halotolerantes.84 De las bacterias marinas también ha sido posible aislar nuevos compuestos con propiedades antibióticas, antivirales, anticancerígenas y farmacológicas. Muchos de estos compuestos se presentan acumulados en invertebrados como esponjas o moluscos, y tienen gran similitud con metabolitos de bacterias, por lo que se cree que son compuestos producidos por simbiontes bacterianos de estos organismos.85 Recientemente, se ha reportado que además de existir actinomicetos terrestres (el 70% de los antibióticos en el mundo se originan de estas bacterias), existen otro tipo de actinomicetos adaptados específicamente al mar. Trabajando con los actinomicetos terrestres, la industria farmacéutica ha estado reaislando el mismo tipo de compuestos, sin poder encontrar distintos, y el descubrimiento de los actinomicetos marinos abrió un nuevo campo de estudio para obtener otro tipo de drogas, diferentes a las que hoy se conocen, como son los compuestos anticancerígenos.86

9. PERSPECTIVAS
La microbiología ha tenido un pasado tortuoso; hubo años donde no se abrió la materia de microbiología en varias universidades de los EE.UU. y no se impartía en la facultad de ciencias de la UNAM; pero ahora tiene un futuro prometedor y resulta especialmente luminoso para la ecología microbiana. Las aplicaciones biomédicas y biotecnológicas en donde las bacterias son las pequeñas industrias del futuro, productoras de medicinas y de procesos industriales en condiciones extremas, se hallan a la vuelta de la esquina. Las bacterias también son un especie de vórtice de conocimiento ya que de su estudio podemos saber más acerca de ellas mismas; la biotecnología nos da productos que nos ayudan a entenderlas mejor y por lo tanto producir nuevos productos que cada vez hacen el conocimiento más fácil y rápido de adquirir. Un claro ejemplo de esto fue el descubrimiento de la Taq polimerasa en una poza termal en Yellowstone, sin la

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cual la biología molecular asociada al ADN sería imposible. Más aún, son los consorcios bacterianos los que nos permiten revertir la contaminación producida por las industrias. Por otro lado, las bacterias son los enemigos acérrimos de la humanidad cada vez hay bacterias resistentes a nuevos antibióticos y hay cada vez más posibilidades de una guerra bacteriológica. Pero el lector pensaría que ninguna de esas maravillas o pesadillas implica saber de ecología microbiana. Se equivoca cada vez más investigadores están convencidos de que las bacterias interaccionan entre ellas y con el ambiente y esa es la razón de las enfermedades o de que funcione un proceso industrial. Son consorcios de micorrhizas y bacterias las que pueden ayudar a mejorar un suelo erosionado y son los productos de la competencia natural entre patógenos (colicinas) los que nos pueden librar de enfermedades crónicas como la cistitis causada por Escherichia coli. También desde el punto de vista teórico, la incorporación gradual de las bacterias al paradigma de la ecología a todos los niveles (evolutivo, eco-fisiológico, funcional y de poblaciones, comunidades y ecosistemas) permitirá entender de manera jerárquica el papel de la diversidad microbiana en la variedad de macroorganismos. Y ayudará a resolver, a través del uso de modelos más sencillos, cómo se arma la enorme complejidad del mundo en que vivimos. Todo esto gracias a que las herramientas moleculares hacen posible «ver» a las bacterias.

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Microbiología ambiental se terminó de imprimir en los talleres gráficos de la empresa Programe, S.A. en diciembre de 2004. Se tiraron 1,000 ejemplares.

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