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Microscopia confocal

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA FACULTAD DE INGENIERÍA, ARQUITECTURA Y DISEÑO

Microbiología Dra. Ma. Victoria Orozco Borbón

Exposición 4 “Microscopio Confocal”
Alberto Abaroa Villanueva Omar Morales Rodríguez Jhordan Ojeda Gonzales Bioingeniería 631
2013/10/04

Helio-Neón (633nm). mayor resolución vertical y horizontal.2 Microscopio Confocal INTRODUCCIÓN Historia La microscopía láser confocal es una nueva técnica de observación microscópica que está logrando excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina. Esta ranura sólo permite el paso de la luz reflejada por el plano focal.) y. Ranura detectora Pinhole. Diodo azul (405 nm). FUNCIONAMIENTO Componentes Fuente luminosa. 488. eliminándose los haces procedentes de los planos inferiores y superiores. a la posibilidad de obtener "secciones ópticas" de la muestra. Refleja totalmente la luz que incide con un ángulo de cerca de 45°. A mayor intensidad del láser tendremos mayor emisión de fluorescencia. Omar Morales R.) Su éxito se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a la microscopía óptica tradicional (imágenes de mayor nitidez y contraste. Es la propiedad de presentar de manera alternativa dos coloraciones según la dirección de los rayos de luz incidentes. sobre todo. geología. Normalmente un microscopio confocal viene con varios láser que tienen una o varias líneas de emisión: Argon (458. Láser (Light amplification by stimulated emission of radiation). . etc. Helio-Neón (543nm). Luz amplificada por emisión estimulada de radiación. Para ello se ilumina una pequeña zona de la muestra y se toma el haz luminoso que proviene del plano focal. Jhordan Ojeda G. Alberto Abaroa V. lo que permite su estudio tridimensional. etc. etc. 496 y 514nm). microbiología. 1957). 476. pero también se nos producirá un mayor photobleaching (disminución de la fluorescencia con el tiempo). biología. Principio Básico El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de foco. su gran aceptación y espectacular desarrollo no ha tenido lugar hasta hace unos pocos años con el desarrollo del láser y de los ordenadores personales. Espejo dicroico. Aunque el principio de la microscopía confocal fue patentado hace varios años (Marvin Minski.

Detector. Permite enfocar el rayo de luz reflejado por el espejo dicroico hacia el plano focal de la muestra. En general no son adecuados los fijadores como el glutaraldehído. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA La preparación de las muestras varía según los procedimientos y las estructuras que se deseen visualizar. Un aumento excesivo de la ganancia se traduce en una pérdida de calidad de la imagen debido al ruido electrónico que se genera. Omar Morales R. porque exageran la autofluorescencia de la muestra. en cuanto a los métodos de fijación y la tinción o marcaje. Recibe el haz de luz y genera una imagen.3 Microscopio Confocal Lente objetivo. Es importante tener en cuenta algunos aspectos. Sin embargo. Atenuación de la fluorescencia Se debe limitar el tiempo de observación. Jhordan Ojeda G. . Ajusta la amplificación de la señal eléctrica generada a partir de los fotones emitidos por la muestra. y son adecuados el paraformaldehído (4% en solución salina isotónica) y metanol o acetona fríos (-20°C). Fijación Cuando es necesaria se deben respetar los lugares de reconocimiento del anticuerpo y minimizar la presencia de artefactos. Conservación de las muestras Deben ser protegidas de la luz. Secciones Histológicas El grosor depende de la distancia de trabajo propia de cada objetivo. de la penetrabilidad del anticuerpo o de los fluorocromos empleados en la tinción y de las propiedades de transparencia de los tejidos que conforman la muestra. la preparación de las muestras es igual a la utilizada para microscopía de fluorescencia convencional y/o citometría de flujo. analizadas rápidamente y almacenadas en frío. Alberto Abaroa V. puesto que los radicales libres que se producen durante el tiempo de excitación de los fluorocromos dañan las células y los tejidos no fijados. Si la intensidad de luz emitida por la muestra es débil deberemos de aumentar la ganancia para poder obtener la imagen.

4 y una longitud de onda de 442 nm es posible alcanzar resoluciones de 0. para mejorar su calidad. Posibilidad de realizar secciones ópticas: Variando el plano de enfoque el sistema es capaz de tomar imágenes a diferente profundidad. Mayor contraste: Debido a que se elimina la luz procedente de las zonas Microscopía láser confocal fuera de foco.14 µm en horizontal y 0.       El sistema de barrido punto a punto (scan) utilizado en los microscopios confocales de tipo CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) comporta una serie de ventajas adicionales como son:    Posibilidad de obtener imágenes perpendiculares al plano XY tomando la misma línea a diferentes profundidades. medida de intensidades.23 µm en vertical (Wilson. . Imágenes Lambda: Si el equipo cuenta con un detector espectral podremos tomar imágenes a diferentes longitudes de onda (lambda scan) y a partir de ellas deducir el espectro de emisión de un fluorocromo determinado. etc. medidas morfométricas. Lo que permite obtener información tridimensional de la muestra. Fijar el láser sobre un punto o una pequeña zona de la muestra y tomar imágenes a diferentes tiempos para observar los efectos del láser sobre esa zona. La velocidad de formación de la imagen depende también del número de puntos que tomemos por imagen. Reconstrucción 3D: A partir de las secciones ópticas es posible aplicar técnicas de reconstrucción 3D que nos permitan visualizar las estructuras. Alberto Abaroa V. combinación de imágenes para comparar cambios en el tiempo. Análisis de imágenes: Al obtenerse la imagen de modo electrónico es posible digitalizarla y aplicar sobre ella toda una serie de técnicas de análisis de imágenes como: realce de imágenes. Es posible programar el equipo para obtener imágenes durante un periodo de tiempo determinado. así es mayor en imágenes de 512 x 512 píxeles que en imágenes de 1024 x 1024 píxeles. Aumentar la resolución mediante zoom del área a barrer tomando mayor número de puntos en áreas más pequeñas. Omar Morales R.4 Microscopio Confocal VENTAJAS  Mayor resolución: Para un objetivo de inmersión en aceite con una apertura numérica de 1. Imágenes multidimensionales: El microscopio confocal nos permite estudiar imágenes en 2 y 3 dimensiones a lo largo del tiempo. Jhordan Ojeda G. 1990).

medida de actividad intracelular (pH e iones). Un fondo con ruido debido a una alta amplificación de la señal puede ser corregido mediante promedio de varias imágenes. Técnicas de análisis de imágenes como clasificación. Una de las grandes cualidades es que permite la visualización en tres dimensiones incluyendo el interior y permite registrar procesos de secreción en células vivas con marcadores como el FM1-43. operaciones morfológicas y cuantificación de componentes. pueden ser aplicadas a las imágenes de microscopía confocal para realzarlas. Alberto Abaroa V. Por ejemplo el movimiento del Calcio. APLICACIONES DE LA MICROSCOPÍA CONFOCAL La microscopía confocal es muy útil para el estudio de muchos problemas en biología. por ejemplo. Entre otras aplicaciones la microscopía confocal se utiliza en: estudios de estructura celular y cito esqueleto. medidas de colocalización de marcadores. permitiendo un nuevo conocimiento de la estructura celular y sus procesos. superposición de imágenes obtenidas por diferentes técnicas. Jhordan Ojeda G. siendo muy útil en investigación biomédica. como realce de contornos. Omar Morales R. . producción de reconstrucciones tridimensionales.5 Microscopio Confocal UTILIDADES Este tipo de técnica sirve para estudiar la estructura de materiales biológicos. imágenes laterales del objeto. reconstrucciones en 3D. Otras técnicas. En estudios de cinética celular los cambios experimentados en un determinado componente (Ca++. pueden ser utilizadas para la realización de mediciones morfométricas y den sito métricas de determinados parámetros presentes en la imagen. Permite además localizar anticuerpos para estudios de inmunocitoquímica con mayor resolución que la microscopía convencional. por ejemplo) pueden visualizarse mediante sustracción de imágenes tomadas a diferentes tiempos.. etc. realizar hibridación histoquímica in situ de alta resolución con procedimientos no isotópicos para localizar la posición de las secuencias de los ácidos nucleicos en las células. PROCESO DE IMÁGENES Y MICROSCOPÍA CONFOCAL El hecho de que la mayoría de los microscopios láser confocal utilicen un sistema informático para digitalizar las imágenes facilita la aplicación de técnicas de proceso y análisis de imágenes. Permite monitorizar los movimientos de las moléculas dentro de las células. La visualización de muestras con fluorescencia débil puede ser mejorada mediante la acumulación de un determinado número de imágenes. contenido en DNA de núcleos teñidos con un determinado fluorocromo. Con el uso de software y posterior al procesamiento de la imagen permite realizar colecciones de secuencias seriadas. filtros. etc.

Esta mejora es más evidente cuanto mayor es el espesor de la muestra a estudiar. 2-verde y 3-rojo) en un mismo canal (canal 4-mezcla). . Imágenes de una muestra con auto fluorescencia o que están teñidas con un único marcador fluorescente. Omar Morales R. La eficiencia es máxima cuando la longitud de onda del láser coincide con el pico del espectro de excitación del fluorocromo. Usando un máximo de 4 marcajes/canales simultáneos:     Rojo Verde Infrarrojo Dapi (azul) La colocalización permite determinar si una molécula de interés se expresa simultáneamente en una misma región de nuestra preparación y se pone de manifiesto mediante la visión de la mezcla de colores de los diferentes fluorocromos/marcadores (canales -dapi. mientras que en una muestra de más de 20 micras la calidad de la imagen confocal es muy superior a la de la imagen de Microscopio de Fluorescencia. Mediante microscopía Confocal son posibles estudios de coexpresión de proteínas u otro tipo de moléculas en una misma célula /preparación. visualizadas con microscopía confocal presentan una considerable mejora en relación a la misma imagen visualizada con microscopía de fluorescencia convencional. Alberto Abaroa V. La intensidad de la señal fluorescente será mayor cuanto más próxima esté la línea del láser al pico de excitación del fluorocromo. Imágenes teñidas con un marcador fluorescente (single labeling). Las principales aplicaciones de la microscopía confocal son entre otras: A. En muestras con espesores inferiores a 10 micras apenas hay diferencia entre una imagen de fluorescencia y una imagen confocal. b.6 Microscopio Confocal Para trabajar con microscopía de fluorescencia. Por lo tanto antes de decidirnos a utilizar un fluorocromo determinado debemos de estar seguros de que alguna de las líneas de láser de nuestro microscopio confocal coincide con su espectro de excitación. Análisis de colocalización. se ha de tener en cuenta que la longitud de onda de la fuente de iluminación (el láser en el caso del confocal) se corresponda con la longitud de onda de excitación del fluorocromo utilizado. Imágenes teñidas con varios marcadores fluorescentes (multiple labeling). Jhordan Ojeda G. ya sea convencional o confocal. a.

localizaciones celulares y subcelulares. Mediante Microscopía Confocal es posible la recogida de una secuencia de cortes ópticos como un lote de imágenes y su posterior procesamiento digital lo que presenta la ventaja de que este bloque de datos de varias dimensiones permite generar una imagen bidimensional calculada (proyección) o una representación reducida en 3 dimensiones de la muestra con el software apropiado. El uso de marcadores específicos permite poner de manifiesto moléculas específicas en nuestra preparación basada en la interacción Ag-Ac y la emisión de fluorescencia.expresión de proteínas. Mediante ensayos multicolor basados en el uso de fluorocromos/marcadores específicos para hasta 4 marcajes simultáneos (ej: fluorocromos Rojo. Omar Morales R. estudios de difusión . . B. Realización de secciones transversales (x-z). El número de cortes y calidad de la reconstrucción 3D depende del grosor de la muestra por lo que no es adecuada para muestras/células con bajo volumen. Series Z (Reconstrucciones 3-D). Con el microscopio óptico siempre observamos la muestra en el plano X-Y. a. donde cada fluorocromo marca una determinada estructura o sirve como indicador de determinados procesos celulares. Alberto Abaroa V. Inmunofluorescencias y detección de sondas. El microscopio confocal suele venir equipado con uno o varios láseres que emiten en diferentes longitudes de onda pudiendo utilizarse varias de ellas como fuente de iluminación de la muestra.Verde. Si tenemos una muestra con dos o tres marcadores fluorescentes podremos recoger simultáneamente su señal en diferentes fotomultiplicadores. Dapi ) y aplicables a numerosos estudios( apoptosis y proliferación celular. Jhordan Ojeda G. etc).Infrarrojo. Las Series Z realizan una serie de capturas en los diferentes planos de la muestra que posteriormente pueden ser integrados para obtener una reconstrucción 3D de la muestra. Una característica interesante del microscopio confocal es la posibilidad de realizar secciones transversales de la muestra que nos permiten observar como es su estructura interna sin necesidad de realizar complejas preparaciones.7 Microscopio Confocal Múltiples estructuras de una célula o tejido pueden ser observadas simultáneamente tiñendo la muestra con dos o más marcadores fluorescentes. C.

2 micras. Reconstrucción tridimensional. Como se ha mencionado anteriormente una de las mayores ventajas de la microscopía confocal es la posibilidad de estudiar tridimensionalmente la muestra a partir de secciones ópticas de la misma. además la posibilidad de programar el barrido del láser permite tomar imágenes del mismo plano focal a distintos tiempos. . durante los últimos 10 años. Para ello se fija la posición de barrido del microscopio en un extremo de la estructura a medir y se van tomando imágenes.8 Microscopio Confocal Para realizar secciones transversales de calidad necesitamos contar con una platina motorizada de alta precisión que nos permita realizar desplazamientos verticales en intervalos muy pequeños. El desarrollo. c. Estudios de actividad intracelular (ph e iones). Información tridimensional de la muestra. del orden de 0. Omar Morales R. Alberto Abaroa V. Jhordan Ojeda G. de indicadores fluorescentes que responden selectivamente a iones biológicos ha permitido a los investigadores medir el flujo de estos iones en células vivas. hasta llegar al otro extremo. La imagen estereoscópica suministra información tridimensional de la muestra desde un punto de vista estático y en una determinada dirección. correspondientes a diferentes secciones de la misma. D. b. Indicadores fluorescentes han sido descritos para la mayoría de los más importantes iones biológicos. La mayor resolución y contraste de la microscopía confocal permite obtener imágenes de actividad iónica o PH mucho más claras que las que se observan con microscopía de fluorescencia. Fijando el haz de barrido del láser en el punto en el que queremos realizar la sección y desplazando la muestra verticalmente iremos obteniendo un corte transversal de esa zona. Un método mejor para analizar y estudiar las complejas relaciones espaciales es la realización de reconstrucciones tridimensionales donde el volumen de datos puede ser visualizado desde varios ángulos. pudiendo estudiarse la propagación de un determinado Ion (por ejemplo la expansión de la ola de calcio después de aplicar un estímulo sobre la célula). aunque los usados más ampliamente son los indicadores de PH y calcio intracelular.

hay ligeras variaciones entre el espectro teórico y el real debidas principalmente a variaciones en el PH al preparar la muestra o a variaciones de temperatura. La técnica FRET (Transferencia de Energía por Resonancia Fluorescente) es una técnica usada para la visualización y detección de moléculas biológicas (proteínas. La Microscopía Confocal permite la captura de imágenes de la preparación a intervalos definidos (ms. FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Una área específica de la muestra se quema mediante la acción del laser confocal. Alberto Abaroa V. La molécula “donante “puede ser excitada a una longitud de onda especifica y a su vez. F. Aunque existen múltiples tablas de los espectros de emisión de los fluorocromos. lípidos o ácidos nucleicos) El FRET es una técnica importante para investigar una gran variedad de fenómenos biológicos que implican la proximidad entre dos moléculas y que permite caracterizar con enorme precisión la distancia entre 2 moléculas. G. Determinación de espectros de fluorescencia (lambda scan).seg. la pérdida y recuperación de fluorescencia es utilizada entonces para determinar cómo se recupera esta fluorescencia que se relaciona con la difusión y/o desplazamiento de la molécula “fotoquemada”. Jhordan Ojeda G.min) y el posterior procesado de las imágenes para la obtención de una película que permita observar la evolución de la muestra en el intervalo de tiempo definido. El mecanismo se basa en la presencia de 2 moléculas fluorescentes: un donante y un aceptor. Si el sistema cuenta con un detector espectral es posible utilizarlo para obtener el espectro real de emisión del fluorocromo con que hemos marcado nuestra muestra.9 Microscopio Confocal E. H. Time Series (Series Temporales). FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching). El método de Recuperación de Fluorescencia Tras Fotoquemado es una técnica para la observación del movimiento intracelular mediante quemado de la fluorescencia de una zona o molécula de interés. . Omar Morales R. provocar la excitación de la molécula “aceptora “que a su vez emitirá en una fluorescencia detectable.

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