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Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa

Bioquímica

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica PRÁCTICA DE LABORATORIO N°

PRÁCTICA DE LABORATORIO N° 03

INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA UREASA ( E.C. 3.5.1.5) Y DEL SUCCINATO DESHIDROGENASA (E.C. 1.3.99.1)

I.

INTRODUCCIÓN.

En la presente experiencia de práctica investigaremos la inhibición de la actividad enzimática por productos químicos específicos, los llamados Inhibidores. El inhibidor específico usado será bisulfato de sodio y el malonato. Se conoce que el bisulfito se combina con la ureasa inhibiendo la actividad enzimática de modo reversible.

Una molécula inhibidora afecta la actividad enzimática de dos modos: por Inhibición competitiva e inhibición no competitiva. La inhibición competitiva tiene lugar cuando una molécula que es estructuralmente similar al sustrato para una reacción particular, compite por una posición en el sitio activo de la enzima. Esto hace que la enzima no esté disponible al sustrato. La inhibición competitiva puede invertirse si se eleva la concentración del sustrato a niveles suficientemente altos mientras la concentración del inhibidor se mantiene constante.

En la inhibición no competitiva, el inhibidor se une a la enzima en un sitio que no es el sitio activo. Siendo así, cambia la naturaleza de la enzima para que pierda sus propiedades catalizadoras. Esto sucede de dos maneras. El inhibidor no competitivo bloquea físicamente el acceso al sitio activo, o causa un cambio conformacional en la proteína, inactivándola. Porque las moléculas del sustrato no pueden invertir la posición de un inhibidor no competitivo y aumentar la concentración del sustrato no invertirá la inhibición.

El objetivo de la presente experiencia es demostrar el efecto inhibidor de algunas sustancias sobre la velocidad de reacción enzimática, utilizando para ello bisulfito de sodio y malonato, como inhibidores de la ureasa y succionato deshidrogenasa, respectivamente.

II.

MATERIALES.

  • Gradillas.

  • Baño María a 37°C.

  • Tubos de ensayo 15x 125 mm.

  • Tubos de ensayo 13 x 100 mm.

  • Juego de pipetas 10, 5, 2 y 1 ml.

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica PRÁCTICA DE LABORATORIO N°

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa

Bioquímica

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica  Espectrofotómetro.  Fotocolorímetro.
  • Espectrofotómetro.

  • Fotocolorímetro.

  • Buffer fosfato de 0.1M pH 7.

sodio

  • 2.6 diclorofenolindofenol

  • Malonato 0.1M.

  • Homogenizado hepático

  • Buffer Tris 0.05M pH 7.

  • Úrea 0.1M en buffer Tris 0.05 pH 7.

0.02%.

  • Bisulfito de Sodio 0.1M.

  • Succinato 0.1M.

  • Ureasa 0.1%.

III. PROCEDIMIENTO.

Prepare el

siguiente esquema de tubos y siga las indicaciones que

se

muestra a

continuación:

  • A. INHIBICIÓN DE UREASA.

    • 1. SISTEMA DE INCUBACIÓN.

COMPONENTES (mL) Y

TUBO 1

TUBO 2

TUBO 3

TUBO 4

 

PROCESO

 

Buffer Tris 0.05 M PH 7.0

2.0

 
  • 1.0 1.0

----

   

Úrea 0.1 M en buffer Tris 0.05 M pH 7.0

2.0

 
  • 2.0 3.0

2.0

 

Bisulfito de Sodio 0.1 M

----

 
  • 1.0 1.0

1.0

 

Pre Incubar a 37°C por 5 minutos.

   

Ureasa 0.1%

0.5

 
  • 0.5 0.5

----

 

Incubar a 37°C por 15 minutos.

 

Añadir dos gotas de HgCl 2 a cada tubo para detener la reacción.

   

Ureasa 0.1%

----

----

-----

0.5

 

Mezclar, preparar y seguir con el siguiente sistema.

   
  • 2. Evaluación del efecto inhibidor del bisulfito de sodio: Cuantificación del producto formado por colorimetría (Reacción de Nessler). Transferir 0.1 mL de cada uno de los tubos de ensayo de la parte 1 a sus correspondientes en la parte 2.

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica  Espectrofotómetro.  Fotocolorímetro.

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Bioquímica

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica COMPONENTES BLANCO I II

COMPONENTES

BLANCO

I

II

III

IV

 

TUBO 1 (Parte 1)

----

0.1

----

----

----

 

TUBO 2 (Parte 2)

----

----

0.1

----

----

 

TUBO 3 (Parte 3)

----

----

----

0.1

----

 

TUBO 4 (Parte 4)

----

----

----

----

0.1

 

Agua destilada

4

 
  • 3.9 3.9

3.9

 

3.9

 

Reactivo de Nessler

0.5

 
  • 0.5 0.5

0.5

 

0.5

 

Dejar en reposo por 5 minutos. Leer en fotocolorímetro con filtro verde o bien en espectrofotómetro a 540 nn. Restar la lectura del tubo 4 de las lecturas de los otros tubos. Determinar la actividad enzimática en cada uno de los tubos de incubación. Para lo cual deberá multiplicar la lectura de cada tubo por un factor:

F R = 37 mg NH 3 / ml, para espectrofotómetro y 0.006 mg NH 3 / ml, para fotocolorímetro.

  • B. INHIBICIÓN DE SUCCINATO DESHIDROGENASA. 1.

SISTEMAS DE INCUBACIÓN Y EVALUACIÓN DEL EFECTO INHIBIDOR DEL MALONATO.

COMPONENTES (ml)

TUBO 1

TUBO 2

TUBO 3

TUBO 4

TUBO 5

 

Buffer fosfato de Sodio 0.1 M pH 7.4

1.5

 
  • 1.2 1.0

0.8

0.3

 

2.6 diclorofenolindofenol

1.0

 
  • 1.0 1.0

1.0

1.0

 

Succinato 0.5 M

----

----

----

----

0.7

 

Malonato 0.1 M

----

----

       

Homogenizado hepático

----

0.5

0.5

0.5

0.5

 

Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente. Observar y anotar los resultados según el color de cada un de los tubos.

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica COMPONENTES BLANCO I II

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa

Bioquímica

IV. CUESTIONARIO.
IV.
CUESTIONARIO.
  • 1. ¿Qué se entiende por modificadores de la actividad enzimática?

MODIFICADORES DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Tipos:

  • a) Temperatura: Las enzimas son inactivadas por e calor a temperaturas de 50ªC- 60ªC inactivan rápidamente la mayor parte de las enzimas. Esta inactivaron es irreversible, pues al enfriar no se obtiene actividad otra vez. Esto explica que casi todos los organismos resulten muertos a una exposición a temperatura elevada: Sus enzimas se inactivan y resultan incapaces de reanudar su metabolismo. Las Enzimas no son inactivadas por la congelación; las reacciones que producen tienen a lugar muy lentamente a temperaturas bajas, o se detienen, pero la actividad catalítica reaparece si la temperatura vuelve a su estado normal

  • b) Acidez: Las enzimas son sensibles a los cambios de PH o sea de acidez o alcalinidad en el medio. La mayor parte de enzimas intracelulares tienen PH óptimos cerca de la neutralidad, por lo que no actúan en medios ácidos ni alcalinos, los ácidos y bases enérgicos las inactivan irreversiblemente.

  • c) Concentración de Enzima, substrato y Cofactor: Si el PH y la temperatura de un sistema enzimático se mantiene constante pero hay exceso de substrato, la intensidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima presente.

  • d) Venenos Enzimáticos: Algunas enzimas resultan muy sensibles a ciertos venenos como el acido cianuro fluoruro lewisita etc. Resultan inactivadas aun frente a concentraciones bajas de estos venenos Aun las enzimas pueden actuar como venenos si se encuentran en lugar in adecuado. Varios tipos de venenos que vienen de los animales como la de la serpiente abeja y escorpión deben su poder letal a las enzimas que destruyen glóbulos rojos y otros tejidos.

  • e) PH: Los cambios de PH alteraran considerablemente la naturaleza iónica de los enzimas se sabe poco de las variaciones del PH en las enzimas.

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica IV. CUESTIONARIO. 1. ¿Quécalor a temperaturas de 50ªC- 60ªC inactivan rápidamente la mayor parte de las enzimas. Esta inactivaron es irreversible, pues al enfriar no se obtiene actividad otra vez. Esto explica que casi todos los organismos resulten muertos a una exposición a temperatura elevada: Sus enzimas se inactivan y resultan incapaces de reanudar su metabolismo. Las Enzimas no son inactivadas por la congelación; las reacciones que producen tienen a lugar muy lentamente a temperaturas bajas, o se detienen, pero la actividad catalítica reaparece si la temperatura vuelve a su estado normal b) Acidez : Las enzimas son sensibles a los cambios de PH o sea de acidez o alcalinidad en el medio. La mayor parte de enzimas intracelulares tienen PH óptimos cerca de la neutralidad, por lo que no actúan en medios ácidos ni alcalinos, los ácidos y bases enérgicos las inactivan irreversiblemente. c) Concentración de Enzima, substrato y Cofactor: Si el PH y la temperatura de un sistema enzimático se mantiene constante pero hay exceso de substrato, la intensidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima presente. d) Venenos Enzimáticos : Algunas enzimas resultan muy sensibles a ciertos venenos como el acido cianuro fluoruro lewisita etc. Resultan inactivadas aun frente a concentraciones bajas de estos venenos Aun las enzimas pueden actuar como venenos si se encuentran en lugar in adecuado. Varios tipos de venenos que vienen de los animales como la de la serpiente abeja y escorpión deben su poder letal a las enzimas que destruyen glóbulos rojos y otros tejidos. e) PH : Los cambios de PH alteraran considerablemente la naturaleza iónica de los enzimas se sabe poco de las variaciones del PH en las enzimas. Ingeniería Agroindustrial Página 4 " id="pdf-obj-3-54" src="pdf-obj-3-54.jpg">

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Bioquímica

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica 2.- ¿Qué se entiendealostéricos son zonas de la enzima con capacidad de reconocer y unir determinadas moléculas en la célula. Las uniones a las que dan lugar son débiles y no covalentes, y generan un cambio en la conformación estructural de la enzima que repercute en el sitio activo, afectando así a la velocidad de reacción de la enzima. Las interacciones alostéricas pueden tanto inhibir como activar enzimas, y son una forma muy común de controlar las enzimas en las células. 5. ¿Qué es un inhibidor competitivo? El inhibidor es una molécula que presenta un cierto parecido estructural con el sustrato, de manera que puede competir con él por acceder al centro activo, pero que no posee ningún enlace susceptible de ser atacado por el enzima. 6.- ¿Que efecto tiene el aumento de la concentración del sustrato sobre la inhibición competitiva de una reacción enzimática? Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas son aplicables a las reacciones catalizadas por los enzimas, pero estos muestran también una rasgo característico que no se observa en las reacciones no enzimáticas: la saturación con el sustrato. Ingeniería Agroindustrial Página 5 " id="pdf-obj-4-6" src="pdf-obj-4-6.jpg">

2.- ¿Qué se entiende por un inhibidor? Cuál es su mecanismo general de acción?

Los Inhibidores enzimáticos son moléculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Sin embargo, no todas las moléculas que se unen a las enzimas son inhibidoras; los activadores enzimáticos se unen a las enzimas e incrementan su actividad.

El mecanismo de acción de los inhibidores enzimáticos consiste en inhibir o bloquean la enzima para y disminuyen su actividad.

3.

¿Qué

relación

hay

entre

los

términos

desnaturalización de una enzima?

inhibición,

inactivación

y

La relación es que en la inhibición está relacionado con la actividad enzimática y en la inactivación y desnaturalización no hay actividad enzimática; más bien se relaciona con la velocidad de la reacción enzimática.

  • 4. ¿Qué se entiende por sitio alostérico?

Los sitios alostéricos son zonas de la enzima con capacidad de reconocer y unir determinadas moléculas en la célula. Las uniones a las que dan lugar son débiles y no covalentes, y generan un cambio en la conformación estructural de la enzima que repercute en el sitio activo, afectando así a la velocidad de reacción de la enzima. Las interacciones alostéricas pueden tanto inhibir como activar enzimas, y son una forma muy común de controlar las enzimas en las células.

  • 5. ¿Qué es un inhibidor competitivo?

El inhibidor es una molécula que presenta un cierto parecido estructural con el sustrato, de manera que puede competir con él por acceder al centro activo, pero que no posee ningún enlace susceptible de ser atacado por el enzima.

6.- ¿Que efecto tiene el aumento de la concentración del sustrato sobre la inhibición competitiva de una reacción enzimática?

Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas son aplicables a las reacciones catalizadas por los enzimas, pero estos muestran también una rasgo característico que no se observa en las reacciones no enzimáticas: la saturación con el sustrato.

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica 2.- ¿Qué se entiendealostéricos son zonas de la enzima con capacidad de reconocer y unir determinadas moléculas en la célula. Las uniones a las que dan lugar son débiles y no covalentes, y generan un cambio en la conformación estructural de la enzima que repercute en el sitio activo, afectando así a la velocidad de reacción de la enzima. Las interacciones alostéricas pueden tanto inhibir como activar enzimas, y son una forma muy común de controlar las enzimas en las células. 5. ¿Qué es un inhibidor competitivo? El inhibidor es una molécula que presenta un cierto parecido estructural con el sustrato, de manera que puede competir con él por acceder al centro activo, pero que no posee ningún enlace susceptible de ser atacado por el enzima. 6.- ¿Que efecto tiene el aumento de la concentración del sustrato sobre la inhibición competitiva de una reacción enzimática? Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas son aplicables a las reacciones catalizadas por los enzimas, pero estos muestran también una rasgo característico que no se observa en las reacciones no enzimáticas: la saturación con el sustrato. Ingeniería Agroindustrial Página 5 " id="pdf-obj-4-57" src="pdf-obj-4-57.jpg">

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Bioquímica

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica En general, podemos decirunión del inhibidor a la enzima y al complejo enzima-sustrato, y sus efectos en las constantes cinéticas de la enzima. En el esquema clásico de Michaelis- Menten mostrado abajo, una enzima (E) se une a su sustrato (S) para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En la catálisis, este complejo se rompe para liberar el producto (P) y la enzima (E). El inhibidor (I) puede unirse tanto a (E) como a (ES) con las constantes de disociación K o K ', respectivamente 8.- Existe corrientemente algún tipo de relación entre la estructura química del sustrato y del inhibidor competitivo de una reacción enzimática. ¿Es esta una condición necesaria para este tipo de inhibidores? El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como es mostrado en la figura de la izquierda. Ingeniería Agroindustrial Página 6 " id="pdf-obj-5-6" src="pdf-obj-5-6.jpg">

En general, podemos decir que al aumentar la concentración de sustrato en el medio, la velocidad de reacción de un enzima aumenta; por tanto, la influencia de la concentración de sustrato tiene un efecto positivo en la catálisis enzimática. Esto es debido, simplemente, a que al aumentar el número de sustratos en el medio, será mayor la cantidad de producto producido por la reacción enzimática. Sin embargo, llega un momento en que la velocidad de la reacción enzimática no aumenta aunque aumentemos la concentración de sustrato, lo cual es debido a que en ese momento todos los enzimas presentes están actuando a pleno rendimiento y ya no pueden aumentar la producción de producto. En ese momento se dice que el enzima está saturado por el sustrato.

7.- ¿Cómo se explica que la inhibición competitiva sea reversible?

La inhibición reversible puede ser descrita cuantitativamente en términos de la unión del inhibidor a la enzima y al complejo enzima-sustrato, y sus efectos en las constantes cinéticas de la enzima. En el esquema clásico de Michaelis- Menten mostrado abajo, una enzima (E) se une a su sustrato (S) para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En la catálisis, este complejo se rompe para liberar el producto (P) y la enzima (E). El inhibidor (I) puede unirse tanto a (E) como a (ES) con las constantes de disociación K i o K i ', respectivamente

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica En general, podemos decirunión del inhibidor a la enzima y al complejo enzima-sustrato, y sus efectos en las constantes cinéticas de la enzima. En el esquema clásico de Michaelis- Menten mostrado abajo, una enzima (E) se une a su sustrato (S) para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En la catálisis, este complejo se rompe para liberar el producto (P) y la enzima (E). El inhibidor (I) puede unirse tanto a (E) como a (ES) con las constantes de disociación K o K ', respectivamente 8.- Existe corrientemente algún tipo de relación entre la estructura química del sustrato y del inhibidor competitivo de una reacción enzimática. ¿Es esta una condición necesaria para este tipo de inhibidores? El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como es mostrado en la figura de la izquierda. Ingeniería Agroindustrial Página 6 " id="pdf-obj-5-27" src="pdf-obj-5-27.jpg">

8.- Existe corrientemente algún tipo de relación entre la estructura química del sustrato y del inhibidor competitivo de una reacción enzimática. ¿Es esta una condición necesaria para este tipo de inhibidores?

El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como es mostrado en la figura de la izquierda.

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica En general, podemos decirunión del inhibidor a la enzima y al complejo enzima-sustrato, y sus efectos en las constantes cinéticas de la enzima. En el esquema clásico de Michaelis- Menten mostrado abajo, una enzima (E) se une a su sustrato (S) para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En la catálisis, este complejo se rompe para liberar el producto (P) y la enzima (E). El inhibidor (I) puede unirse tanto a (E) como a (ES) con las constantes de disociación K o K ', respectivamente 8.- Existe corrientemente algún tipo de relación entre la estructura química del sustrato y del inhibidor competitivo de una reacción enzimática. ¿Es esta una condición necesaria para este tipo de inhibidores? El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como es mostrado en la figura de la izquierda. Ingeniería Agroindustrial Página 6 " id="pdf-obj-5-33" src="pdf-obj-5-33.jpg">

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Bioquímica

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica Esto generalmente ocurre cuando

Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima donde el sustrato también se une; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibición se puede superar con concentraciones suficientemente altas del substrato, es decir, dejando fuera de competición al inhibidor. Los inhibidores competitivos tienen comúnmente Los inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al substrato verdadero

9.- ¿Cómo puede reconocerse experimentalmente que la inhibición de una reacción enzimática es competitiva?

Por ello este tipo de inhibición se caracteriza en que puede disminuirse considerablemente aumentando la concentración de sustrato.

En este tipo de inhibidores se incluyen sustancias que estructuralmente son muy parecidas al sustrato y que por lo pueden ocupar el lugar que ocuparía el mismo sobre la enzima pero que no pueden ser atacas por la misma.

Este tipo de inhibición es el de la inhibición de la succinato deshidrogenasa, enzima que tiene por sustrato el ácido succínico, por otras sustancias estructuralmente parecidas al ácido succínico, como el ácido malónico, el ácido oxálico, y el ácido glutárico

10.- ¿De que factores depende el grado de inhibición logrado por un inhibidor competitivo?

El inhibidor sólo se une al complejo enzima - sustrato, que ya no formará producto, por lo que la velocidad bajará. El inhibidor no se une al centro activo sino a cualquier otro sitio, lo que hace que cambie la conformación y el enzima ya no es tan efectivo.

K´ I = [E]. [I]/ [ESI]
K´ I = [E]. [I]/ [ESI]

No se puede superar la inhibición aumentando la concentración de sustrato. La V con inhibidor (V I ) será más pequeña.

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica Esto generalmente ocurre cuando

El K m será más pequeño, como si tuviera más afinidad:

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica Esto generalmente ocurre cuando
Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica Esto generalmente ocurre cuando

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa

Bioquímica

El resultado es una recta nueva que corta en un valor más grande de
El
resultado
es
una recta
nueva que
corta en
un
valor más grande
de

ordenadas y con pendiente igual. Si aumentamos la concentración de inhibidor obtenemos una familia de rectas con pendiente igual y corte en ordenadas más grande.

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica El resultado es una
  • 11. ¿En que circunstancia puede el sustrato de una enzima actuar como inhibidor

competitivo de la misma enzima?

El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como se muestra en la figura de la derecha. Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima en el que también se une el sustrato; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibición se puede superar con concentraciones suficientemente altas del sustrato, es decir, dejando fuera de competición al inhibidor. Los inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al sustrato.

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica El resultado es una

12.- ¿Qué tipo de inhibidor es el bisulfito de sodio 0.1M?

Es un inhibidor no competitivo

13.- ¿Qué tipo de inhibidor es el malonato 0.1M?

Es un inhibidor competitivo

  • 14. ¿Que se entiende por inhibidor no competitivo?

Inhibición no competitiva: Es una forma de una inhibición mixta donde la unión del inhibidor con la enzima reduce su actividad pero no acepta la unión del sustrato. El grado de inhibición depende de su concentración.

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica El resultado es una

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa

Bioquímica

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica Tienen afinidades idénticas por

Tienen afinidades idénticas por (E) y (ES) (K i = K i '). La inhibición no competitiva no cambia la K m (es decir, no afecta a la unión del sustrato) pero disminuye la V max (es decir, la unión del inhibidor obstaculiza la catálisis).

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica Tienen afinidades idénticas por

15. ¿Qué efecto tiene el aumento de la concentración del sustrato sobre la inhibición no competitiva de una reacción enzimática?

No tiene ningún efecto.

¿Cómo puede explicar este fenómeno?

El grado de inhibición en este caso depende solamente de la concentración de inhibidor y no de la concentración del sustrato. Este tipo de inhibición no es reversible cuando aumenta la concentración del sustrato.

16.-

¿Que

podría

decir

respecto

a

la

especificidad

de

los

inhibidores

no

competitivos.

 

Las moléculas del sustrato se unen a un sitio particular en la superficie de la enzima, denominada sitio activo, donde tiene lugar la catálisis. La estructura tridimensional de este sitio activo, donde solo puede entrar un determinado sustrato (ni siquiera sus isómeros) es lo que determina la especificidad de las enzimas. El acoplamiento es tal que E. Fisher (1894) enunció: "el sustrato se adapta al centro activo o catalítico de una enzima como una llave a una cerradura"

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica Tienen afinidades idénticas por

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa

Bioquímica

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica 17. ¿Existe corrientemente algún. El mecanismo de la inhibición parcialmente competitiva es similar al de la inhibición no competitiva, excepto que el complejo EIS tiene actividad catalítica, la cual decrece o incluso aumenta (activación parcialmente competitiva) en comparación al complejo enzima-sustrato (ES). Esta inhibición suele exhibir un valor más bajo de V , pero un valor de K inalterado. Ingeniería Agroindustrial Página 10 " id="pdf-obj-9-6" src="pdf-obj-9-6.jpg">

17. ¿Existe corrientemente algún tipo de similitud entre la estructura química del inhibidor no competitivo y la del sustrato natural de la enzima? ¿Ésta es una condición necesaria para este tipo de inhibidores?

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica 17. ¿Existe corrientemente algún. El mecanismo de la inhibición parcialmente competitiva es similar al de la inhibición no competitiva, excepto que el complejo EIS tiene actividad catalítica, la cual decrece o incluso aumenta (activación parcialmente competitiva) en comparación al complejo enzima-sustrato (ES). Esta inhibición suele exhibir un valor más bajo de V , pero un valor de K inalterado. Ingeniería Agroindustrial Página 10 " id="pdf-obj-9-10" src="pdf-obj-9-10.jpg">
Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica 17. ¿Existe corrientemente algún. El mecanismo de la inhibición parcialmente competitiva es similar al de la inhibición no competitiva, excepto que el complejo EIS tiene actividad catalítica, la cual decrece o incluso aumenta (activación parcialmente competitiva) en comparación al complejo enzima-sustrato (ES). Esta inhibición suele exhibir un valor más bajo de V , pero un valor de K inalterado. Ingeniería Agroindustrial Página 10 " id="pdf-obj-9-12" src="pdf-obj-9-12.jpg">

Como se observa en la imagen no existe similitud entre la estructura química del inhibidor no competitivo y el sustrato de la enzima, a diferencia del inhibidor competitivo que en relación a él si existe una similitud entre ambos

Ésta si es una condición necesaria para los inhibidores no competitivos, ya que el sustrato se enlaza a la enzima en un lugar diferente del centro activo.

18.- ¿Cómo puede reconocerse experimentalmente que la inhibición de una reacción enzimática es no competitiva?

Los inhibidores no competitivos tienen afinidades idénticas por (E) y (ES) (K i = K i '). La inhibición no competitiva no cambia la K m (es decir, no afecta a la unión del sustrato) pero disminuye la V max (es decir, la unión del inhibidor obstaculiza la catálisis). 3

El mecanismo de la inhibición parcialmente competitiva es similar al de la inhibición no competitiva, excepto que el complejo EIS tiene actividad catalítica, la cual decrece o incluso aumenta (activación parcialmente competitiva) en comparación al complejo enzima-sustrato (ES). Esta inhibición suele exhibir un valor más bajo de V max , pero un valor de K m inalterado.

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica 17. ¿Existe corrientemente algún. El mecanismo de la inhibición parcialmente competitiva es similar al de la inhibición no competitiva, excepto que el complejo EIS tiene actividad catalítica, la cual decrece o incluso aumenta (activación parcialmente competitiva) en comparación al complejo enzima-sustrato (ES). Esta inhibición suele exhibir un valor más bajo de V , pero un valor de K inalterado. Ingeniería Agroindustrial Página 10 " id="pdf-obj-9-49" src="pdf-obj-9-49.jpg">

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa

Bioquímica

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica 19.- Anotar sus observaciones

19.- Anotar sus observaciones en la sección Resultados, y explicarlos en la Discusión.

  • INHIBICION DE LA UREASA

TUBO

COLOR

EXPLICACIÓN

 

Tubo Blanco

Amarillo claro

No hubo reacción

 

Tubo 01

blanco

Si hubo reacción por ausencia de

 
 

inhibidor

Tubo 02

blanco

No hubo reacción por inhibidor

 
 

Tubo 03

Blanco

Si hubo reacción por mayor

 
 

concentración de sustrato

Tubo 04

Blanco

No hubo reacción por inhibidor

 
 
  • Al analizar los resultados utilizando el método de colorimetría observamos diferencia de color en las muestras 1 y 3. En el primer caso el color indica formación de producto debido a que no hay presencia de inhibidor; en el otro caso también se produce reacción pues al aumentar la cantidad de sustrato no se desplaza al inhibidor, solo se disminuye la velocidad de reacción.

    • Los tubos 2 y 4 presentan el mismo color que el tubo blanco debido a que en el segundo tubo el inhibidor bloquea la reacción impidiendo así la formación de producto; en el tubo no hay formación de producto debido a que no hay presencia de enzima durante la reacción.

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica 19.- Anotar sus observaciones

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa

Bioquímica

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica  INHIBICION DE SUCCINATO
  • INHIBICION DE SUCCINATO DESHIDROGENASA

TUBO

EXPLICACIÓN

Tubo 01

Solo presenta el color del indicador no hay variación

 

Tubo 02

Solo observa el color del indicador no hay cambio.

 

Tubo 03

Este tubo presenta sustrato, enzima y el indicador y se observa

 
 

cambio

de color

Tubo 04

Este tubo presenta sustrato, enzima e indicador pero el color

 
 

no varia ya que se presenta un inhibidor que bloquea y hace que el color se mantenga igual al indicador

Tubo 05

Este tubo presenta sustrato enzima e indicador pero también

 
 

presenta el inhibidor pero es muy bajo comprado con el Succinato y no existe un bloqueo por eso el color varia

     
  • Podemos observar cambio de color en las muestras 3 y 5: En el primer caso la muestra no contiene malonato (inhibidor), por lo tanto se ha producido reacción; en la segunda muestra se incrementó la concentración de sustrato y se produce flujo de e- que son absorbidos por el indicador, el inhibidor es desplazado debido a que es competitivo.

  • En los tubos 1,2 y 4 las muestras mantienen el color azul del indicador lo cual indica que no se produjo reacción debido a que en el tubo 1 no hay sustrato, el segundo tubo no contiene enzima y en el tubo 4 la reacción es bloqueada por la presencia del inhibidor.

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Bioquímica

V. ANEXOS.
V.
ANEXOS.
A. INHIBICIÓN DE UREASA. Fig. 1 Sistema De Incubación
A.
INHIBICIÓN DE UREASA.
Fig. 1
Sistema
De Incubación
Fig. 2 Tubo blanco: 4 ml. de Agua destilada y 0.5 de Reactivo de Nessler
Fig. 2
Tubo blanco: 4
ml.
de Agua
destilada y 0.5 de Reactivo de
Nessler
Fig. 2 Se transfirió 0.1 mL de c/u de los tubos de la parte 1 a
Fig. 2
Se transfirió 0.1 mL de c/u de los
tubos
de
la
parte
1
a
sus
correspondientes en la parte 2
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Fig. 4 Se le añadió 3.9 ml de Agua destilada y 0.5 ml de Reactivo de
Fig. 4
Se
le
añadió
3.9
ml
de
Agua
destilada y 0.5 ml
de Reactivo de
Nessler y se dejó reposar por 5 min.
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Bioquímica

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica A. INHIBICIÓN DE SUCCINATO
  • A. INHIBICIÓN DE SUCCINATO DESHIDROGENASA.

Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica A. INHIBICIÓN DE SUCCINATO
Inhibición de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa Bioquímica A. INHIBICIÓN DE SUCCINATO
Fig.5 Sistema de incubación y evaluación del efecto inhibidor del malonato
Fig.5
Sistema
de
incubación
y
evaluación del efecto inhibidor
del malonato

Fig. 6 Se le añade el Homogenizado Hepático por eso el tubo 3 y 5 cambian de color

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