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Espectroscopía de Absorción y leyes

Espectroscopía de Absorción y leyes

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Espectroscopía de Absorción

En los métodos de absorción la base de información es la magnitud del poder radiante proveniente de una fuente externa que es absorbido por la especie analizada. Aquí la absorción de radiación por la especie, va acompañada por la excitación del analito.

Espectroscopía de Absorción
Es el fenómeno que ocurre cuando una radiación electromagnética interactúa con la materia traspasando parte de su energía a los átomos o moléculas presentes en la materia que pasan de un estado energético menor a estados de mayor energía, o estados excitados.

Ejercicio
¿en cuántos kJ/mol aumenta la energía de OZ cuando absorbe radiación UV de longitud de onda de 147 nm?

022 x 1023 moléculas/ mol) – = 814 kJ/mol Esta energía es suficiente para romper el enlace O=O del oxígeno.Desarrollo E = h c / l 2.626 x 10 Js) -------------------- 8 (147 nm) (10-9 m/nm) – = 1. .998 x 10 m/s -34 = (6.35 x 10-18 J/molécula – = (1.35 x 10-18 J/molécula) (6.

Si una molécula emite un fotón.Absorción de la Luz Cuando una molécula absorbe un fotón. su energía disminuye El estado de mínima energía de una molécula se llama estado fundamental . su energía aumenta. Se dice que ha pasado a un estado excitado.

Como la muestra puede haber absorbido algo de luz. La potencia radiante. la potencia radiante del haz de luz disminuye. la potencia radiante del haz que emerge por el lado opuesto de la muestra es P. incide en una muestra de longitud b. La luz monocromática con una potencia radiante P0 . La radiaciòn es monocromática. es la energía por segundo y por unidad de área del haz de luz La luz se hace pasar a través de un monocromador para seleccionar una longitud de onda.Medida espectrofotométrica Cuando una muestra absorbe luz. P ≤ P0 . P.

se define como la fracción de la luz incidente que pasa a través de la muestra. . P Transmitancia: T = ----P0 T puede valer de 0 a 1 El porcentaje de transmitancia es simplemente 100 T y puede valer desde 0 a 100 %.Transmitancia La transmitancia. T.

es directamente proporcional a la concentración? .01 % T = T*100 100 10 1 A 0 1 2 ¿Cual.1 0.= .log10 ---. A o T.Absorbancia A = .log T P0 P Relación entre transmitancia y absorbancia T= P/P0 1 0.

Absorbancia Cuando no se absorbe luz. – P= P0/10 y A= 1 Si solamente se transmite el 1 % de luz. – A= 2 La Absorbancia a veces también se llamaba densidad óptica . – P= P0 y A=0 Si se absorbe el 90 % y se transmite el 10 %.

Absorbancia La absorbancia es importante porque es directamente proporcional a la concentración. de la especie que absorbe la luz en la muestra. . c.

Leyes de la Absorción Cuando un haz de radiación monocromática. con una potencia P0. puede ocurrir que: . incide sobre una cubeta conteniendo una solución.

Leyes de la Absorción Po = Pt + Pd + Pa Cubeta Pd Po Pt Pt < Po Pa .

. Parte de la radiación incidente sea reflejada: – dependiendo de la especie absorbente o. – de las diferencias entre  del medio de propagación de la radiación y el  del medio que esta siendo analizado.Leyes de la Absorción Parte del haz de radiación sea absorbido por el medio que está siendo analizado.

siendo su potencia menor a la potencia de la radiación inicial o incidente.Leyes de la Absorción Parte de la radiación incidente sea dispersada: – Dependiendo del medio: no sea transparente ni homogéneo Parte de la radiación incidente sea transmitida. .

.Potencia Reflejada Puede ser minimizada: – Uso de medidas relativas y. – Cubetas con paredes homogéneas. de menor espesor y de caras paralelas – Una cubeta conteniendo la muestra y otra cubeta conteniendo todos los componentes de la cubeta anterior menos la sustancia de interés.

Potencia Reflejada La medida del haz transmitido por la segunda cubeta servirá de referencia para calibrar el instrumento. . antes de la medida de la potencia transmitida por la cubeta que contiene el material a analizar.

Potencia Reflejada Como vemos es necesario usar: – Cubetas prácticamente idénticas – De espesor reducido y – De caras paralelas .

Potencia Dispersada Normalmente los procedimientos involucrados en la absorción de luz. de modo que la potencia de la radiación dispersada puede despreciarse . son realizados en soluciones homogéneas y transparentes.

Pt .Leyes de la Absorción Por lo anterior podemos considerar que: – PO = Pa + Pt Las potencias incidente y transmitida pueden ser medidas directamente. – Pa = Po . y La potencia absorbida puede determinarse como la diferencia entre P 0 y P t.

llegando a enunciar dos leyes fundamentales que caracterizan al proceso de absorción: . LAMBERT (1760).Leyes de la Absorción Investigaciones sobre la relación entre las potencias de radiación incidente y transmitida fueron realizadas por Pierre BOUGUER (1729) y por Johann H.

Leyes de la Absorción “La intensidad o potencia de luz monocromática transmitida por un medio homogéneo es proporcional a la intensidad o potencia de luz incidente” Pt = k P o ( I t = k Io ) .

Leyes de la Absorción: Ley de Lambert “La intensidad o potencia de luz monocromática transmitida disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente el espesor del medio absorbente” Pt = Po e-kb ( It = Io e-kb ) .

denominada coeficiente de absorción .Leyes de la Absorción: Ley de Lambert Pt = P o e -kb b = espesor del medio absorbente k = constante para la longitud de onda y el medio absorbente.

4343 kb Po 10 k’ = k/2.3206 = k * 0.Leyes de la Absorción: Ley de Lambert Pt Pt = = Po e-kb -0.4343 Pt = Po 10-k’b .

Leyes de la Absorción: Ley de Lambert Pt = Po 10.k’b Pt − k 'b = 10 PO .

Leyes de la Absorción: Ley de Lambert .log Pt =k'b PO Pt / Po = Transmitancia. fracción de la luz incidente transmitida por un espesor b .

la potencia radiante disminuye logarítmicamente a medida que la longitud del paso óptico aumenta aritméticamente”. de concentración constante. .Bouguer “Cuando una radiación monocromática proveniente de una onda plana pasa a través de un medio capaz de absorber radiación.Ley de Lambert .

Descubrió que existe la misma relación entre la transmisión y la concentración que la descubierta por Lambert entre la transmisión y el espesor del medio absorbente: .Leyes de la Absorción: Ley de Beer August Beer (1852) estudió la influencia de la concentración del componente absorbente en la transmisión y absorción de la luz.

Leyes de la Absorción: Ley de Beer “La intensidad o potencia de un haz de luz monocromática transmitido disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente la concentración de la especie absorbente” Pt = Po e-kc .

4343kc k/2.4343 Pt = Po 10-k’’c .Leyes de la Absorción: Ley de Beer Pt = Po e k’’ = -kc Pt = Po 10-0.3206 = k * 0.

Leyes de la Absorción: Ley de Beer Pt = Po 10 -k’’c Pt − log = k'' c P0 como Pt A = − log P0 .

Leyes de la Absorción: Ley de Beer Pt − log = k'' c P0 .

Ley de Lambert – Bouguer .Beer Pt = Po 10 Pt = Po 10 -k’’c -k’b Pt = Po 10-k’k’’bc .

Beer definiendo una constante a a = k’ * k’’ P t y como A = − log P0 tenemos .Ley de Lambert – Bouguer .

L g-1 cm-1 – c = concentración.Beer LEY DE BEER A = abc – A = Absorbancia – b = trayecto óptico. g/L . cm – a = absortividad.Ley de Lambert – Bouguer .

Ley de Lambert – Bouguer – Beer LEY DE BEER A = ε bc –A = Absorbancia – b = trayecto óptico –  = absortividad molar – c = concentración molar .

Leyes de la Absorción: Ley de t-Beer A =  bc  = absortividad Molar = M-1 cm-1 c = moles/L b = cm la absorción de varias especies  permite comparar cuantitativamente .

Leyes de la Absorción: Ley de Lambert-Beer La absortividad Molar – – – –  depende de: La sustancia absorbente Longitud de onda Temperatura de medición Solvente A mayor ε mayor nivel de absorción observado por lo que más sensible el método espectrométrico .

Ley de Beer A = abc o A = ε bc Esta ecuación demuestra la relación lineal entre la A y la concentración c .

Ley de Beer Por lo que manteniéndose constante el camino óptico. es posible determinar la concentración de una especie en solución a través de una medida de absorbancia .

Ley de Beer “Cuando un haz de radiación monocromática proveniente de una onda plana. la potencia radiante disminuye logarítmicamente a medida que aumenta la concentración aritméticamente” . pasa a través de un medio capaz de absorber radiación. contenido en una celda de paso óptico constante.

Alcances de la Ley de Beer
Mayoritariamente se aplica en las regiones UV, VIS, IR cercano, R. X. Aplicable a especies químicas: iones, moléculas y átomos. Aplicable a soluciones diluidas, y matrices sin gran complejidad. Aplicable a niveles de detección de analitos del orden ppm o menores.

Alcances y Aplicaciones de la Ley de Beer
Absorción radiación UV-VIS por compuestos orgánicos Absorción radiación UV-VIS por compuestos Inorgánicos

Aplicaciones de la Ley de Beer
Determinación de un constituyente absorbente presente en una muestra Determinación de dos o más especies absorbentes presentes en una muestra. Valoraciones fotométricas en cuyo sistema participa una o más especies absorbentes. Cinética de reacciones químicas

Cinética de reacciones químicas .Aplicaciones de la Ley de Beer Determinación de un constituyente absorbente Determinación de dos o más especies absorbentes Valoraciones fotométricas en cuyo sistema participa una o más especies absorbentes.

Aplicaciones de la Ley de Beer Determinación de un constituyente absorbente presente en una muestra: – Medición directa de la muestra y un patrón con lectura próxima a la muestra: – Mediante Curvas de Calibración .

Aplicaciones de la Ley de Beer – Medición directa de la muestra y un patrón con lectura próxima a la muestra: AX C X = CR AR .

CURVAS DE CALIBRACIÓN: el concepto Indirecto o de Calibración externa: externa las muestras contienen un cantidad desconocida del analito y los patrones tienen una cantidad perfectamente conocida de analito. El analito de la muestra es empleado en el protocolo de calibración. Patrón Interno : previo a la determinación se añade una cantidad conocida de una sustancia similar al analito (patrón interno) . Los patrones contienen al analito pero éste es EXTERNO al analito de la muestra Adiciones Patrón o Calibración Interna: Interna el analito en sí mismo es usado para la calibración interna.

el gráfico es una opción válida. grafique la curva y elija la mejor opción para interpolar los valores de las muestras.Construcción de la Curva de Calibración Restar el blanco de las señales o asuma un intercepto distinto de cero en la curva – Sustraer el blanco de las señales es la práctica más común en los laboratorios asegurase que las señales de las muestras queden en el intervalo de las señales de los estándares La curva de calibración calculada con su pendiente e intercepto permite obtener la concentración de las muestras desconocidas Debe estar seguro que la relación entre la señal y la concentración es lineal antes de aplicar los mínimos cuadrados para encontrar la recta – Si matemáticamente la relación no es conocida. .

Curva de Calibración externa –Obtención de la recta: Representación gráfica: A vs cc –Completamente lineal .

mass.1976x Calibration curve (n=4 measurments/ std) .Gráfica de los puntos 3.5 3 Signal response 2.5 1 0.5 2 1. etc 12 14 16 y = 0.5 0 0 2 4 6 8 10 conc.

1976x Calibration curve (n=4 measurments/ std) .500 3. etc 12 14 16 y = 0.Gráfica de los promedios con rango de error ± 1 3. mass.000 0 2 4 6 8 10 conc.500 1.000 Signal response 2.000 0.500 2.500 0.000 1.

000 0 2 4 6 8 10 conc.500 1.1976x Calibration curve (n=4 measurments/ std) .500 0.000 0.500 3.500 2. mass.000 Signal response 2.Gráfica de promedios con error indicando un intervalo de confianza de 95 % 3.000 1. etc 12 14 16 y = 0.

Curva de Calibración externa –Recta: Completamente lineal –la lectura de la muestra se interpola en la recta obteniéndose la concentración de la solución de muestra .

pero requiere mayor número de patrones en esa zona .Curva de Calibración externa – Recta: Rango lineal y región no lineal – lectura muestra rango lineal: interpolación en la recta – lectura muestra en rango no lineal: interpolación en región no lineal.

Curva de Calibración externa – Recta: Puntos distribuidos no linealmente pero con una tendencia lineal manifiesta – Elevar número de datos – establecer la mejor recta que pasa por los puntos ecuación de los mínimos cuadrados residuos cuyo error corresponde a errores aleatorios de la medida y no a la concentración .

Curva de Calibración externa La efectividad y confiabilidad de sus resultados depende de la exactitud en las concentraciones de los patrones y la mínima diferencia entre la matriz de los patrones y de la muestra. .

– 100 mL de solución patrón de 100 ppm de Ca – 100 mL de solución patrón de 80 ppm de Ca – 100 mL de solución patrón de 60 ppm de Ca – 100 mL de solución patrón de 40 ppm de Ca – 100 mL de solución patrón de 20 ppm de Ca – 100 mL de solución patrón de 10 ppm de Ca – 100 mL de solución patrón de 5 ppm de Ca .EJEMPLO A partir de una solución patrón de 1000 ppm de Ca prepare la siguiente C. de C.

Una muestra de disolución de KMnO4.0 cm: – – – – ¿qué Absorbancia presenta la disolución? ¿a qué valor cambia el % T si la disolución se midiera en cubetas de 2 cm? ¿cuál es la absortividad molar del compuesto a 525 nm? ¿qué concentración presenta una disolución desconocida de analito si al medirse en las mismas condiciones que la muestra dio una lectura de 48.6 %T cuando se mide a 525 nm en cubetas de 1. 1 * 104 M presenta un 36.3 % T? .

.

Igualdad de matrices Opciones Prácticas – Separar el analito de la matriz de la muestra permite el uso de las curvas de calibración externas – Uso de las Curvas de calibración de Adición Estándar .

En este sentido los efectos de matriz son igualados en los patrones al igual que existen en la muestra.PROTOCOLOS DE CALIBRACIÓN: adiciones estándar El empleo más habitual del Método de las Adiciones Patrón es para eliminar la existencia de errores sistemáticos generados por el efecto de matriz por parte de la muestra. .

. antes de efectuar la medida.Curva de Calibración de Adición Estándar Formas de aplicación de la Adición Estándar: – Adicionar diferentes volúmenes de disolución patrón a varias alícuotas de muestra del mismo tamaño. requiere el control del volumen total en cada incremento. Después cada disolución se lleva a un volumen fijo. – Adicionar incrementos sucesivos de volúmenes del patrón sobre un volumen fijo de muestra exactamente medido.

reactivos apropiados y diluir hasta el volumen determinado VT. de la disolución problema con concentración cX volúmenes variables de una disolución patrón de analito que tiene una concentración cS. VX.Curva de Calibración de Adición Estándar – Preparación de la serie de disoluciones: – Preparar una serie de matraces aforados de volumen VT y añadir alícuotas idénticas. y – medir la Señal S .

5 Std vol. 0 Total vol.Curva de Adición Estándar Uso: minimizar interferencias Preparación de los patrones •En cada matraz vierta el mismo volumen de muestra •Agregue cantidades o volumenes creciente de patrón o estándar •Diluya a volumen conocida e igual todas las solucioneste ejemplo Solución no. 1 Muestra vol. 10 2 5 1 10 3 5 3 10 4 5 4 10 solvent e estánd ar muestr a Std Conc=10 ppm .

10 2 x = 4.20 ppm 2 0 2 4 .Adición Estándar Para calcular la concentración de la muestra x = 2.

PROTOCOLOS DE CALIBRACIÓN: adiciones estándar .

Pendiente Calibración Externa= Pendiente Adiciones Patrón No hay efectos de matriz Pendiente Calibración Externa < Pendiente Adiciones Patrón Sí hay efectos de matriz: calibrado interno revela exaltación de la sensibilidad Pendiente Calibración Externa> Pendiente Adiciones Patrón Sí hay efectos de matriz: calibrado interno revela inhibición de la sensibilidad .

PROTOCOLOS DE CALIBRACIÓN: adiciones estándar Dos diseños incorrectos en Calibración Interna Intervalo de concentraciones demasiado grande Intervalo de concentraciones demasiado pequeño .

Protocolos de Calibración Método de las adiciones estándar Cada muestra requiere su propia calibración. En términos estadísticos es menos preciso porque la determinación se realiza por extrapolación. Se necesitan grandes cantidades de muestra. . La automatización es difícil.

Curva de Calibración por Adición Estándar La concentración de la muestra viene dado por: bcs Cx = mVX .

.Curva de Calibración de Patrón Interno – Se basa en la medida de la respuesta del analito y de otra sustancia empleada como patrón interno. – Para esto se preparan una serie de patrones con cantidades variables y exactamente conocidas de analito y de patrón interno y se mide la respuesta del analito y del patrón interno.

para cada uno de los patrones.Curva de Calibración de Patrón Interno – Para construir la curva de calibración se representa el cuociente de las respuestas entre el analito y el patrón interno. . respecto al cuociente de las concentraciones. Ra/Rpi. Ca/Cpi.

. se calcula la relación de las respuestas y se determina la relación de concentración por interpolación en la recta de calibración.Curva de Calibración de Patrón Interno – A continuación se le agrega una cantidad conocida de patrón interno a la muestra y se miden sus señales.

que no interactúan entre sí. la absorbancia total de la solución corresponde a la suma de las absorbancias de las especies absorbentes” Ley de Beer: – AT = A1 + A2 + A3 – AT = a1bc1 + a2bc2 + a3bc3 .Principio de aditividad de la Ley de Beer Sistemas multicomponente : “Si una solución contiene dos o más sustancias absorbentes.

2.500 0.500 1. y d) elegir una longitud de onda y un rango de concentración para la curva de calibración que permita medir muestras cuyos contenidos del compuesto absorbente se encuentra entre 10 y 70 ppm.000 1.500 . c) seleccionar el rango de concentraciones para las curvas de calibración. Las medidas se resumen en el siguiente gráfico.000 0. b) comprobar si se cumple la Ley de Beer a las longitudes de onda seleccionadas.500 50 ppm 25 ppm 10 ppm 2.EJEMPLO Para obtener el espectro de un compuesto absorbente.000 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 -0. se prepararon tres soluciones de distintas concentraciones y se midieron sus A entre los 300 nm y 820 nm. a) elegir tres longitudes de onda de trabajo.

Principio de aditividad de la Ley de Beer – AT = A1 + A2 – AT = a1bc1 + a2bc2 Si se miden las A a las  de máxima absorción para cada especie y calculando previamente las absortividades a esas  y manteniendo b constante. se pueden obtener las concentraciones de la mezcla por medio de un sistema de ecuaciones: .

Principio de aditividad de la Ley de Beer Para una mezcla de dos componentes absorbentes: c1 + c2 AT = a1bc1 + a2bc2 a11bc1 + a21bc2 = A T  a12bc1 + a22bc2 = A T  1 para c1 2 para c2 .

Cuando los espectros están bien resueltos – Los valores de se aplican a cada especie para cada longitud de onda. y se miden por separado – Es posible determinar X e Y despejando las incógnitas en la ecuación: A’  ’y b ’x b A’ A’’ ’’y b ’’x b A’’ – X = ----------------------’x b ’y b ’’x b ’’y b Y = --------------------’x b ’y b ’’x b ’’y b  Cada símbolo a b es un determinante = ad – bc c d .

559 a 327 nm. .Ejemplo – Si las  de los compuestos X e Y determinadas con compuestos puros son 272 nm 327 nm  M-1 cm-1 x 16440 3990 y 3870 6420 – Una mezcla de los compuestos X e Y en una celda de 1.00 cm tiene una absorbancia de 0. Hallar las concentraciones de X e Y en la mezcla.957 a 272 nm y de 0.

957 a 272 nm y de 0.Principio de aditividad de la Ley de Beer Una mezcla de los compuestos X e Y en una celda de 1.559 a 327 nm. .00 cm tiene una absorbancia de 0. Hallar las concentraciones de X e Y en la mezcla.

Resultados X = 4.95 x 10-5 M .43 x 10-5 M Y = 5.

Principio de aditividad de la Ley de Beer Mezcla de tres componentes absorbentes: c1 + c 2 + c 3 AT = 1bc1 +  2bc2 +  3bc3 b cte A1 = 11c1 + 21c2 + 31c3 A2 = 12c1 + 22c2 + 32c3 A3 = 13c1 + 23c2 + 33c2 para 1 para 2 para 3 .

Principio de aditividad de la Ley de Beer Mezcla de tres componentes absorbentes: Resolución: matriz [3*3] -1 c1 c2 c3 = A1 A2 A3 11 12 13 21 22 23 3 1 32 33 .

. mediante modulación de la longitud de onda.Aplicaciones de la Ley de Beer: aditividad Espectrofotometria de derivadas Una de las dificultades mayores es la selección de las longitudes de onda para las mediciones. esto puede minimizar mediante: – Uso de la espectrofotometría de derivadas – Uso de longitud de onda dual. fuente de corriente alterna.

Principio de aditividad de la Ley de Beer: uso de espectrofotometría de derivadas Espectro normal: A :  A   Espectro derivado:  •Se grafica la primera derivada en función de la longitud de onda .

Titulación Fotométrica A + B C + D Especies Absorbentes: – Analito – Reactivo o Titulante – Producto .

Titulaciones Fotométricas
Absorbe el analito solamente

A

Peq.

mL Titulante

Titulaciones Fotométricas
Absorbe el titulante solamente

A

Peq.

mL Titulante

Titulaciones Fotométricas
Absorbe el producto solamente

A

Peq.

mL Titulante

mL Titulante .Titulaciones Fotométricas Absorbe el analito y el titulante A Peq.

mL Titulante .Titulaciones Fotométricas Absorbe el producto y el titulante. pero el primero el doble que el segundo A Peq .

01 M) de la mayoría de las sustancias – Para soluciones de bajo contenido iónico – Para soluciones con bajo contenido de grandes especies moleculares de gran tamaño que puedan afectar electrostáticamente a la especie absorbente. – Para soluciones cuyas concentraciones no modifiquen grandemente el índice de refracción de las soluciones . – La Ley de Beer se cumple para una radiación monocromática que atraviesa una disolución diluida. Limitaciones : – Sólo para soluciones diluidas (≤0. cuando la especie absorbente no participa en un equilibrio que depende de su concentración.Limitaciones y Desviaciones de la Ley de Beer – La Ley afirma que la A es proporcional a la concentración de la especie absorbente.

disiociaciones. Por cambios en el equilibrio químico de la especie absorbente.Limitaciones y Desviaciones de la Ley de Beer Desviaciones : – Químicas: Por asociaciones. temperatura. solubilidad. . normalmente por causa de las diluciones. por efecto de cambios de pH. y/o reacciones entre los componentes de la muestra con el analito. entre el analito y el solvente.

Por la presencia de radiaciones parásitas. Esta radiación se produce por efectos de dispersión de los diferentes componentes ópticos del sistema monocromador. radiación que contamina la radiación separada por el sistema selector de longitud de onda.Limitaciones y Desviaciones de la Ley de Beer Desviaciones : – Instrumentales: Por el no cumplimiento de hacer incidir sobre la muestra un haz verdaderamente monocromático como lo contempla la Ley. .

Efecto de la utilización de longitudes de onda que correspondan a los extremos útiles de los espectrofotómetros.Limitaciones y Desviaciones de la Ley de Beer Desviaciones : – Instrumentales: Efecto del ancho de banda. .

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