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Tema 7. Determinacion de Vitaminas

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ANÁLISIS DE VITAMINAS EN ALIMENTOS

ANÁLISIS DE VITAMINAS EN ALIMENTOS
1. 2. 3. 4. 5. Introducción. Toma de muestra para el análisis de vitaminas Procedimientos de extracción de las vitaminas Métodos de cuantificación de vitaminas Ejemplos

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1. Introducción.

Compuestos de (relativamente) bajo peso molecular que el ser humano requiere en pequeñas cantidades para el funcionamiento normal del metabolismo

VITAMINAS
CLASIFICACIÓN: - Liposolubles - Hidrosolubles INTERÉS DE SU ANÁLISIS: - Caracterización de la composición de los alimentos -Valoración del poder nutritivo del alimento. -Alimentos enriquecidos - Estimación de pérdidas nutricionales en un p g de un p producto a lo largo proceso industrial - Control del fraudes, comprobación etiquetas..

-Papel esencial y específico en el metabolismo -No pueden ser sintetizadas por el organismo. -Su deficiencia provoca enfermedades

CONTENIDO EN LOS ALIMENTOS: - Frutas ↑↑: Varía según el zumo<pulpa<piel - Carne: depende de la parte (músculo, grasa, vísceras...) - Cereales: ↓↓ contenido - Lácteos: ↓ en general por tratamientos.

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D. Tóxicas si se consumen en exceso.E. VITAMINAS HIDROSOLUBLES (B1. Se disuelven en compuestos apolares (grasas.B6.Fólico) Se disuelven en agua (pueden pasar al agua del lavado o de la cocción de los alimentos) Son coenzimas o precursores de coenzimas necesarias para reacciones químicas del metabolismo. No se almacenan en el organismo (necesario el aporte regular) No son tóxicas porque se excretan por la orina.CLASIFICACIÓN DE LAS VITAMINAS en función de su comportamiento físico: VITAMINAS LIPOSOLUBLES (A. aceites. solventes) Se almacenan en el hígado y en los tejidos grasos (no es necesario tomarlas todos los días).B2.C.K) Se consumen junto con alimentos que contienen grasa.B3.B5. VITAMINAS LIPOSOLUBLES (retinol) (tocoferol) 3 .B12.Biotina.

hidratos de carbono y grasas 4 .VITAMINAS HIDROSOLUBLES VITAMINAS HIDROSOLUBLES de proteínas.

usda.VITAMINAS HIDROSOLUBLES (B9) CARACTERIZACIÓN ALIMENTOS TABLAS DE COMPOSICIÓN USDA (Depto Agricultura USA) http://www.nal.usda.nal.gov/ndb/foods/show/2141?fg=Fruits+and+Fruit +Juices&man=&lfacet=&format=&count=&max=25&offset=&sort=&qlo okup= 5 .gov/fnic/foodcomp/search/ Ej: j Composicicón p Manzana http://ndb.

Toma de muestra 6 . VALORACIÓN DEL PODER NUTRITIVO B3 2.ETIQUETAS.

.TOMA DE MUESTRA DEPENDENCIA DEL TIPO DE ENSAYO PUNTOS DE VISTA TECNOLÓGICO Y LEGAL: -Plan de Muestreo Normalizado -Muestra representativa -Precauciones: labilidad PROCEDIMIENTO .Almacenamiento en frascos de plástico (-20ºC) (Vit.) ¡¡¡ T !!! .Trituración de muestra (picadora mecánica. Procedimientos de extracción 7 . C no se almacena) 3..Separación de la parte no comestible .Toma de sub-muestra (~500 g) .Homogeneización de la sub-muestra .

A Empleo de éter etílico en lugar de éter de petróleo Rotavapor 8 . E y D Uso de KOH etanólica para saponificar Vit. de lípidos) Embudo de decantación MÉTODOS QUÍMICOS Neutralización con HCl Extracción del insaponificable con éter de petróleo ó n-hexano Fase orgánica Concentración Cuantificación Fase acuosa Adición de antioxidantes para inhibir la oxidación Vit.EXTRACCIÓN: Ó específica para cada vitamina ► VITAMINAS LIPOSOLUBLES ► VITAMINAS HIDROSOLUBLES VITAMINA C RESTO DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES ANÁLISIS CUANTIFICACIÓN EXTRACCIÓN DE VITAMINAS LIPOSOLUBLES Procedimiento general Adecuado para todo tipo de alimentos MODIFICACIONES ▼▼ Saponificación con NaOH (elim.

5 Hidrólisis con enzimas (amilasa.) ↓ Dilución del sobrenadante con ácido perclórico (0.C) Adecuado para todo tipo de alimentos Romper estructuras celulares: Tratamiento con HCl (30 min/100ºC) ▼▼ MÉTODOS QUÍMICOS Ajustar pH a 4.EXTRACCIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES Procedimiento general (excepto vit. takadiastasa) para eliminar macromoléculas y liberar la vitamina de sus formas fosforiladas (12 h/37 ºC) C) Filtrar y diluir con H2O Cuantificación EXTRACCIÓN DEL ÁCIDO ASCÓRBICO (VIT HIDROSOLUBLE) Muestra de alimento ↓ Molienda (10 – 20g) ↓ Tamizado (Malla 40 mesh) ↓ Extracción de la vitamina C con ácido metafosfórico (4-6%): agitación a 25°C ↓ Centrifugación (10 min/4000 r.005M) ↓ Filtración ↓ Determinación por HPLC 9 .m.p.

B12 Y D) . ESPECTROFOTOMETRÍA. Métodos analíticos de cuantificación MÉTODOS ANALÍTICOS .FISICOQUÍMICOS miden la cantidad total presente en una muestra: CROMATOGRAFÍA. ESPECTROFOTOMETRÍA FLUOROMÉTRIA. FLUOROMÉTRIA METODOS ENZIMÁTICOS… 10 .4.MICROBIOLÓGICOS se sigue el crecimiento de microorganismos como una función de la concentración de ciertas vitaminas (Sólo hidrosolubles) .BIOLÓGICOS: BIOENSAYOS miden la cantidad de nutrientes aprovechables por un animal (métodos de referencia p para la determinación de vit.

El crecimiento del microorganismo se mide en términos de turbidez. Observación del efecto final Glóbulos rojos Músculos 5. -Tienen la ventaja de que no se requiere la etapa de extracción 1. Principio: el crecimiento de un determinado microorganismo es proporcional a su requerimiento de una vitamina específica→ Comparar el crecimiento del microorganismo en la muestra y en cantidades conocidas de vitamina. Curva estándar de respuesta MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS (vitaminas hidrosolubles) -Son métodos muy sensibles y específicos para cada vitamina. B6 B12 11 . gravimetría… Piridoxal piridoxamina poridoxina El método se basa en medir la turbidez producida por el crecimiento de microorganismos (saccharomyces carlsbergensis.MÉTODOS BIOLÓGICOS O BIOENSAYOS -Requieren mucho tiempo -Su uso se limita a casos en los que no hay métodos alternativos de análisis o cuando se requiere información sobre el valor biológico o la biodisponibilidad de la vitamina. La turbidez del medio producida por los microorganismos es proporcional a la concentración de vitamina B6 o B12 presente. Aplicación de sustancias que queremos estudiar (a unos animales sí y a otros no) 3. uvarum…) cuando se inoculan en un medio que contiene vitaminas. producción de ácido. Selección de diferentes grupos de animales 1 raza 2. Aplicación de dosis con contenido creciente 4. -Requieren tiempo de incubación y seguir estrictamente el protocolo analítico.

.Aplicables para la cuantificación de la mayoría de vitaminas y gran variedad de matrices biológicas (pequeñas adaptaciones) .Clásicos: volumetría .Instrumentales: Espectrofotometría Fluorimetría Cromatografía .HPLC Polarigrafía 12 . exactos y precisos (sobre todo los métodos cromatográficos).MÉTODOS FISICOQUÍMICOS -Son más simples.Se requiere etapa previa de extracción .GC .

D3 y sus metabolitos E(tocoferol) ( f ) Método más utilizado Espectrofotometría (450 nm) HPLC HPLC GC Espectrofotometría p f HPLC GC Espectrofotometría (585 nm) K MÉTODOS FISICOQUÍMICOS Vitamina hidrosoluble B1 Riboflavina metabolitos E(tocoferol) PP B6 B12 C Método más utilizado Espectrofotometría Fluorimetría HPLC HPLC GC Fluorimetría HPLC HPLC Espectrofotometría(325 nm) HPLC HPLC Volumetría Espectrofotometría 13 .MÉTODOS FISICOQUÍMICOS Vitamina liposoluble A (retinol) y carotenoides D2.

GRÁFICAS DE ABSORBANCIA log ε vs λ .ESPECTROFOTOMETRÍA DATOS ESPECTRALES DE ABSORCIÓN EN EL UV-VISIBLE A . Establecer condiciones de trabajo 2. Medir muestra e interpolar. Preparar curva de calibración que relacione A con C: 3.LEY DE LAMBERT-BEER: * LAMBERT: A α c * BEER: A α l A = log Po/P = ε c l λ Procedimiento 1. A C 14 .

Ventajas: * Sensibilidad (límites de detección de partes por billón) * Selectividad * Gran intervalo lineal de concentraciones Desventajas: * Es limitado el número de sistemas que presentan luminiscencia RELACIÓN ENTRE INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA Y CONCENTRACIÓN 15 .FLUORIMETRÍA Método luminiscente molecular: Las moléculas de analito se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisión va a dar información para realizar un análisis cualitativo y cuantitativo.

16 .POLAROGRAFÍA Permite determinar la cantidad y el tipo de sustancias electroquímicamente activas durante una reacción de oxidación o reducción en función del comportamiento tensión-corriente de un electrodo polarizable.

I(μA) patrones Muestra Altura del pico E(V) patrones CROMATOGRAFÍA 17 .

En Cromatografía: .disolviéndose en ella .Componentes que se desean separar deben ser solubles en la fase móvil .adsorbiéndose .Deben ser capaces de interaccionar con la fase estacionaria: .reaccionando de forma química CONSECUENCIA durante la separación los componentes se distribuyen en ambas fases CLASIFICACIÓN 18 .

-sólido 19 .

CROMATOGRAMA EJEMPLOS DE LA DETERMINACIÓN DE ALGUNAS VITAMINAS 20 .

250x4mm. exc:330 nm em: 470 nm Trans-retinol 21 . 7μm Fase móvil: hexano/éter Fluorescencia.DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA VITAMINA A (Liposoluble) PRECURSOR FORMAS ACTIVAS DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA VITAMINA A (Liposoluble) Cristales de retinol vistos con Luz polarizada HPLC-UV Columna: C8. HPLC-FD Columna: Sílice. 250x4mm. 5μm Fase móvil: metanol/agua (92:8) UV absorbancia a 330 nm UV.

7mm Fase móvil: MeOH. absorbancia a 288 nm HPLC-FD Columna: Sílice. ec: 360 nm em: 435 Tiamina Tiamina 22 . 250x4mm.H MeOH H2O.acético O acético Fluorescencia.DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA VITAMINA E (Liposoluble) HPLC-UV Columna: C8. exc:290 nm em: 330 nm DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA VITAMINA B1 (Hidrosoluble) HPLC-FD Columna: Sílice. 7μm Fase móvil: hexano/isopropanol p p (99:1) ( ) Fluorescencia. 250x4mm. 250x4mm. 5μm Fase móvil: metanol/agua (92:8) UV.

6 diclorofenolindofenol) Oxidación de la vit C Disolución patrón de Ascórbico (250 ppm) Zumo con contenido en Ascórbico desconocido Vindicador=5.DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA VITAMINA C (Hidrosoluble) Degradación oxidativa del AA: AA: ácido ascórbico AH-: monoanión ascorbato ADA: ácido dehidroascórbico DCG: ácido 2.6-dicloroindofenol 2 6 di l i d f l Reductor: Vitamina C Punto final: exceso de reactivo valorante (rosa púrpura a pH<4) DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA VITAMINA C (Hidrosoluble) Indicador (2.6 diclorofenolindofenol) Oxidación de la vit C Indicador (2.3-dicetogulónico Volumetría redox Oxidante: O id 2.5 mL ⇒ ¿1mL? Vindicador= 2 mL 23 .

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