Qumica Biolgica para Farmacia y Medio Ambiente Curso 2008

TRABAJO PRCTICO: CUANTIFICACIN DE PROTENAS

La determinacin de protenas que se realizar en el TP se har por dos mtodos: el de Lowry. Mtodo de Bradford: (Bradford, M. Anal. Biochem., 72:248, 1976), el mismo est basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este compuesto interacciona con aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos. Esta unin del colorante con las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la protena. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595465nm).

Estructura qumica del colorante Coomassie brilliant blue G-250.

Algunas ventajas y/o desventajas del Mtodo La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y aromticos. El complejo colorante-protena tiene un alto coeficiente de extincin lo cual es imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medicin de protenas. La unin colorante-protena es un proceso muy rpido (2min) y el complejo permanece estable durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo de este un proceso muy rpido, y que no requiere un tiempo crtico para el ensayo. Se pueden utilizar un gran nmero de muestras (muy reproducible) y es adaptable a la automatizacin. Las interferencias o no existen o son mnimas por cationes tanto sodio como potasio y carbohidratos como la sacarosa. Otras sustancias que interfieren en

el ensayo son los agentes fuertemente alcalinos (fcilmente solucionable con la utilizacin de buffers). Los nicos componentes encontrados que dan una excesiva interferencia en el color del ensayo, son altas concentraciones de detergentes como el SDS, Triton X-100, etc. Mtodo de Lowry: (1951) es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. Bajo condiciones alcalinas el Cu++ forma un complejo con los enlaces peptdicos de las protenas y se reduce a Cu +. El Cu+ as como los grupos R de Tirosina, Triptofano y Cisteina reaccionan con el reactivo de Folin. Este reactivo reacciona primero produciendo un producto inestable que se reduce lentamente a azul de molibdeno/tungsteno esta reaccin ocurre en medio cido. Comentarios: aquellos agentes que acidifican las soluciones (por ejemplo: cidos fuertes o buffers), los quelantes de Cu (por ej. EDTA) o los reductores de Cu (por ej.: mercaptoetanol, ditiotreitol, fenoles) sern interferentes de la reaccin. Las protenas producirn distintas intensidades de color dependiendo primariamente de su contenido de Tyr y Trp.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
En el trabajo prctico usted realizar una curva de calibracin con alguno de los mtodos anteriores y con el mismo determinar la concentracin proteica de una muestra problema. A- MTODO DE LOWRY Preparacin de reactivos Reactivo A = Na2CO3 2% P/V en NaOH 0,1N. Reactivo B = CuSO4 0.5% P/V en tartrato de sodio y potasio 1% P/V. Reactivo C = 50 ml de A + 1 ml de B. Reactivo D = Folin diluido al medio con H2O bidestilada (HCl 0,2N) Solucin stock de seroalbumina bovina (BSA)

Se prepara un patrn stock de BSA pesando la misma y se lleva a volumen con agua, hasta obtener una concentracin final de 1,0 mg/ml. Curva de calibracin: Completar la siguiente tabla antes de comenzar con el trabajo experimental para la curva de calibracin: Tubos Cantidad de l de sol. Stock de BSA protena (g) 1, 2 3, 4 5, 6 7, 8 9,10 0 25 30 45 50 l de H2O l de solucin C 500 500 500 500 500 l de solucin D 50 50 50 50 50

Procedimiento experimental 1) A 100 l de muestra agregar 0,5 ml de solucin C. 2) Mezclar bien e incubar 10 minutos a temperatura ambiente. 3) Agregar 50 l de solucin D. Homogeneizar inmediata y vigorosamente en vortex. 4) Incubar 30 minutos a Temperatura ambiente, cargar 250 l de cada tubo en microplaca y leer Absorbacia a 700 nm. Utilizar el mismo procedimiento para la determinacin de protenas en la muestra problema.

B-MTODO DE BRADFORD Preparacin del colorante Azul Brillante de Coomasie G-250 (100mg) es disuelto en 50 ml de etanol 95%. A esta disolucin se le aade 100ml de cido fosfrico 85% p/v. La solucin resultante se diluye llevndola hasta un litro de volumen final. La concentracin en la disolucin final es 0,01% p/v de azul, 4,7% p/v de etanol y 8,5 % p/v de cido fosfrico. Solucin stock de BSA Se utilizar la misma que en el Mtodo de Lowry. Curva de calibracin El rango lineal para este mtodo en microplaca es 0.05 mg/ml a 0.5 mg/ml A-Calcule el volumen a utilizar del Solucin stock BSA para obtener el siguiente rango de concentraciones: 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.5 mg/ml. Complete la siguiente tabla de referencia con lo calculado. Tubos Concentracin Final (mg/ml) Volumen de stock sol. BSA Volumen de H2O Volumen final (l) 1, 2 0,0 3, 4 0,2 5, 6 0,3 7, 8 0,5

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B) Procedimiento experimental a) Agregar 200 l del reactivo Bradford diluido 1/5 a cada pocillo. b) Colocar 10 l de cada patrn (o de muestra) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. (Realizar duplicados para cada muestra). Mezclar cuidadosamente con la micropipeta evitando la formacin de burbujas. c) Incubar a temperatura ambiente por lo menos 5 minutos (no ms de una hora, la absorbancia aumentar con el tiempo). d) Medir la absorbancia a 595-465 nm en un lector de microplacas. Utilizar el mismo procedimiento para la determinacin de protenas en la muestra problema.

C-SEMINARIO 1-Graficar la curva de calibracin de BSA, Absorbancia (595-465 nm o 700 nm segn corresponda) vs Concentracin de BSA para cada mtodo. 2-Utilizando la recta obtenida, calcular la concentracin para cada muestra testeada. 3-Graficar adems para cada mtodo: una curva de Absorbancia a 595-465 nm vs mg de BSA. 4-Comparar los resultados obtenidos con cada Mtodo.

Uso de las pipetas automticas

Las pipetas automticas son instrumentos delicados y costosos, que deben cuidarse dado que de ellos depende gran parte de nuestro trabajo. Dichas pipetas son muy precisas si se las utiliza correctamente. Existen varios tipos de pipetas y cada marca provee un juego para diferentes rangos de volmenes. Cada pipeta est rotulada en el mbolo y posee un color distintivo, para su funcionamiento la mayora tiene caractersticas anlogas. A continuacin se ejemplifican dos tipos de pipetas. Ante la menor duda, consulte antes de usar. Es preferible preguntar lo mismo veinte veces antes que romper una pipeta. Juego de pipetas tipo A Una pipeta rotulada P-20 mide entre 2 l y 20 l. Una pipeta rotulada P-200 mide entre 20 l y 200 l. Una pipeta rotulada P-1000 mide entre 200 l y 1.000 l 0,2 y 1,0 ml. Juego de pipetas tipo B Una pipeta de botn rojo mide con precisin entre 1 l y 5 l. Una pipeta de botn verde mide con precisin entre 5 l y 50 l. Una pipeta de botn marrn mide con precisin entre 50 l y 250 l. Una pipeta de botn azul mide con precisin entre 200 l y 1.000 l 0,2 y 1,0 ml. Para poder tomar lquido con estas pipetas, deben tener en su extremos las puntas plsticas descartables (tips), amarillas para P20 y P-200, y azules para P-1000. Antes de utilizar la pipeta asegrese conocer cmo fijar el volmen. La P-20 mide hasta la dcima de microlitro. En la P-20 los dos nmeros superiores indican el volumen en microlitros, en tanto que el nmero inferior es la cantidad fraccional La P200 y P-1000 miden hasta el microlitro por lo tanto, el nmero superior de la P-200 nunca debe superar el 2. Por ejemplo:

En una p20 equivalen a 3,8ul

En una p200 equivalen a 38ul

En una p1000 equivalen a 380ul

Recuerde que las micropipetas tienen dos topes, antes de tomar un volumen solamente debe bajar hasta el primero, y cuando baje el volumen hgalo hasta el primer tope, en caso de que aun quede solucin en el tips puede bajar hasta el segundo tope.

NUNCA 1- Nunca forzar la pipeta por encima del volumen indicado por su nombre. No mide ms de lo establecido y descalibrar o romper la pipeta. 2- Nunca utilice la pipeta para medir un volumen menor a la dcima parte de su nombre. No es precisa. 3- Nunca utilice una pipeta sin su punta (tips) amarilla o azul. 4- Nunca utilice la pipeta con soluciones cidas concentradas. Los vapores pueden oxidar las partes metlicas interiores de la pipeta.